KR101247350B1

KR101247350B1 - 신규한 항염증 펩타이드 유도체 및 그 용도

Info

Publication number: KR101247350B1
Application number: KR1020100113182A
Authority: KR
Inventors: 김양미; 황재삼; 이은정; 김진경
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2013-03-25
Also published as: KR20120051862A

Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)유충으로부터 분리된 프로태티아마이신의 α-helix영역의 9개 잔기서열을 바탕으로 설계된 항생 펩타이드 9Pbw 3, 또는 9Pbw3D(각각 서열번호 3 및 4)의 항염 활성에 대한 용도 및 작용기작에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 염증 유도물질 나이트라이트 옥사이드와 사이토카인의 생성을 억제함으로 항염활성을 나타내며 항염활성을 나타내는 농도범위에서 세포 독성이 없으므로 인체에 안전한 염증치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 항염증 펩타이드 유도체 및 그 용도{Antibiotic peptide analogues with high anti-inflammatory activities and uses thereof}

본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 흰점박이꽃무지유충으로부터 분리된 프로태티아마이신 유도체의 항염증 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균을 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis ) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa ) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).

페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M., Curr Opin Immunol, 1992, 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 1991, 65, 205; Boman, H. G., J Intern Med., 2003, 254, 197-215; Hancock, R. E. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 8856-8861; Zasloff, M., Nature, 2002, 415, 389-395).

다양한 항균 펩타이드는 숙주의 감염반응이나 다양한 염증반응에 관련성에 대한 연구가 많이 진행되어졌다. (Elsbach, P., The Journal of Clinical Inv., 2003, 111, 1643-1645) 양이온성 항균펩타이드는 lipopolysaccharide(LPS)와 높은 친화력을 가지는 것으로 알려져 있으며(Nagaoka, I. et al Clin Diagn Lab Immun, 2002, 9, 972-982; Bowdish, D. M. et al, Antimicrob Agents., 2005, 49, 1727-1732; Nell, M. et al, Peptides., 2006, 27, 649-660), 이들 항균펩타이드와 LPS와의 상호작용에 관한 생물리학적 특성은 그들의 생물학적 기능과 박테리아에 대한 감수성 및 면역시스템의 활성에 대한 LPS 능력을 결정할 수 있다고 알려져 있다. LL-37, Indolicidin, bactenecine과 같은 몇 몇 cathelicidin 항균펩타이드는 LPS와 결합하거나 LPS-binding protein과 LPS와의 결합을 막음으로써 LPS에 의해 유도된 celluar cytokine과 NO의 방출을 억제하는 능력을 가진다고 알려져 있다(Bowdish, D. M. et al, Antimicrob Agents., 2005, 49, 1727-1732; Zughaier, S. M. et al, Cell Microbiol., 2005 7, 1251-1262; Rosenfeld, Y. et al, Biochim Biophys Acta., 2006, 1758, 1513-1522; Rosenfeld, Y. et al, J. Biol Chem., 2006, 281, 1636-1643).

항생 펩타이드는 내독소충격의 치료제뿐 아니라 그람음성 박테리아에 의한 패혈증 치료에 탁월한 능력을 가지는 치료제 후보물질로 제안될 수 있다.

넓은 의미로서 면역반응으로 불리어지는 항원항체 반응은 인간을 포함한 무척추동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충은 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 곤충의 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 물질을 획득한다는 것이다. 그 중에서도 항균성 펩타이드를 중심으로한 항미생물작용을 가진 펩타이드나 단백질은 우리 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제에 대해서 이용 가능성 높다. 이러한 곤충 유래 항병원성 단백질은 인간 및 가축의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

항생 펩타이드는 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형 (helical)의 양친매성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이나 트립토판등의 특정 아미노산이 풍부한 (proline-rich, Trp-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int . J. Antimicrob . Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu , D.; Rivas , L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 멜리틴 (melittin)이나 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 α-나선형을 형성하는 구조이다.

현재까지 밝혀진 곤충유래 항균 단백질로서는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 sacotoxin Ⅲ(Baba et al, 1987), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 diptericin(Wicker et al 1990), 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18:1049-1052, 1995), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:6-11, 1996), 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 Defensin, Coleoptericin A and B(Miyanoshita et al., 1996 ; Sakisaca et al., 2001) 담배나방아과의 Heliothis virescens에서 발견된 heliomicin(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274:9320-9326, 1999), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 Rhinocerosin, Scarabaecin(Yang et al., 1998 ; Tomie et al., 2003), 매미아과의 Cicada flammata에서 발견된 cicadin(Wang and Ng, Peptides, 23:7-11, 2002), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 Cecropin(saito et al., 2005), 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 Moricin analogue(Orizumi et al., 2005)등이며, 흰점박이꽃무지에 대한 연구는 면역을 유도한 유충으로부터 Protaetin 1,2,3가 보고된 바 있다 (Yoon et al., Archives of Insect Biochemistry and Physiology 52:92-103, 2003).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 인체무독성인 항염증 활성을 가지는 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3에 기재되는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 4에 기재되는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 포유류 정상세포에 대하여 안전성을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항염증 활성은 유도물질 나이트레이트 옥사이드 또는 사이토카인의 생성을 억제함으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 서열번호 3에 기재되는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 4에 기재되는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4에 기재되는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에 있어서, 상기 항염증용 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 포유류 정상 세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 면역유도시킨 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 면역화 유도후 cDNA 유전자 은행을 제작하여 기 보고된 항균 관련 유전자와 상동성이 높은 항진균 펩타이드 유전자를 선발하고, 프로태티아마이신 항균펩타이드의 아미노산 서열을 밝힌바 있다(대한민국 특허출원번호: 10-2008-0109281). 본 연구진은 프로태티아마이신 항균펩타이드 helix영역의 아미노산 서열에 9Pbm6의 잔기서열에 기반하여 인간의 세포에는 무독하고 높은 항균활성을 가지는 박테리아 선택적 유도체를 설계하고 활성을 측정하여 인체의 항균치료제로 응용에 관한 내용을 밝힌 바 있다(특허출원번호: 10-2008-0111748).

본 발명에서는 항균 및 항진균 활성이 뛰어난 효능을 보이는 9Pbw2, 9Pbw2D, 9Pbw3, 9Pbw3D(본 명세서에서 '2D' 및 '3D'는 각각 9Pbw2와 9Pbw3의 전체 L-형태 아미노산을 D-형태 아미노산으로 변환시킨 것을 의미한다)에 대해 포유류의 정상세포에서 독성 여부를 판단하고, 염증유발 물질 nitrite oxide와 사이토카인의 생성 억제기작 활성을 확인함으로서 이들의 항염증 치료제로 응용될 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 단계에 따라 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 분리된 항균펩타이드 프로태티아마이신 서열을 기반으로 한 2종의 유사체인 9Pbw2와 9Pbw3의 거울상 이성질체(D form)인 2종의 유사체를 합성하여 항염증 활성을 검정하였다. 그 결과 서열번호 3, 4에 해당하는 9Pbw3 및 9Pbw3D는 pathogen인 LPS로 자극된 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에서 생성되는 염증 유발 물질 nitric oxide (NO)와 염증 유도 사이토카인을 탁월하게 억제하였다. 한편 항염증 활성이 있는 상기 펩타이드들에 대해 정상세포인 마우스의 대식세포(RAW264.7 Cell)에 대하여 세포 독성을 나타내는지 확인하기 위해 세포독성을 조사한 결과 서열번호 3, 4에 해당하는 9Pbw3 및 9Pbw3D는 항염증 활성을 보이는 범위 농도에서 높은 생존율을 보임을 확인하였다.

펩타이드	아미노산서열
서열번호1 : 9Pbw2	RLWLAIKRR-NH2
서열번호2 :9Pbw2D	rlwlaikrr-NH2
서열번호3 : 9Pbw3	RLWLAIWRR-NH2
서열번호4 :9Pbw3D	rlwlaiwrr-NH2

상기 표 1은 기존에 발명된(특허출원번호: 10-2010-0060068) 펩타이드이고, 표에서 소문자로 표시된 것은 각각 서열번호 1과 3의 펩타이드의 D-형태로 전환된 펩타이드를 의미한다.

표 1로부터 유래한 펩타이드를 통해서 본 발명에서는 고기능성 펩타이드의 항염증 활성에 대하여 확인하였다.

우선 서열번호 1~4로 기재되는 본 발명의 항균 펩타이드가 정상세포인 마우스의 대식세포(RAW264.7 Cell)에 대하여 펩타이드 농도에 따른 생존율을 확인하여 모든 펩타이드가 12.5μM 농도 이하에서 100% 생존율을 보임을 확인하였다. (도 1 참조)

서열번호 1~4로 기재되는 본 발명의 항균 펩타이드가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드에 대하여 pathogen인 LPS로 자극된 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에서 생성되는 염증 유발 물질 nitric oxide (NO)억제효과를 확인하였다. 9Pbw3, 3D는 세포독성이 없는 펩타이드 농도 10μM에서 NO를 효과적으로 억제함을 확인하였다. (도 2 참조)

9Pbw3, 9Pbw3D는 세포독성이 없는 펩타이드 농도 10μM에서 NO를 효과적으로 억제함을 확인하였다. (도 2 참조)

염증 유발 물질 nitric oxide (NO)를 효과적으로 억제하는 펩타이드 9Pbw3, 9Pbw3D의 항염증 활성을 더 조사하기 위해 염증 유도 사이토카인의 억제를 조사한 결과 9Pbw3, 9Pbw3D가 염증 유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-알파에 대해 탁월한 억제 능력을 가짐을 확인하였다. (도 3 참고)

상기 서열번호 3,또는 4로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 0.01 내지 10 ㎎/㎏ 체중이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 체중이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 3, 또는 4으로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 펩타이드를 항염증용 화장용 조성물로 피부 등에 국소로 사용하는 경우에는 추가 보조제 및 첨가제로서, 온화한 계면활성제, 오일성분, 에멀션화제, 진주 광택 왁스, 점성 인자, 증점제 (thickener), 과지방제 (superfatting agents), 안정화제, 중합체, 실리콘 화합물, 지방, 왁스, 레시틴, 인지질, 생물기원 작용제 (biogenic agent), 자외선 보호 인자, 산화방지제, 탈취제, 발한방지제 (antiperspirant), 필름 형성제 (film former), 팽윤제, 방충제, 자기태닝제, 티로신 억제제 (색소침착억제제), 굴수성 유발 물질, 가용화제, 보존제, 향유, 염료 등을 함유할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 펩타이드의 α-helix 영역의 잔기서열을 기반으로 설계된 본 발명의 서열번호 3, 또는 4로 기재되는 펩타이드는 항염증 활성에 대한 효능을 나타내며 그 활성을 나타내는 범위에서 독성을 나타내지 않음으로써 안전한 항염증 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1~4 항생 펩타이드를 마우스 대식세포(RAW264.7 cell)에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survival rate로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.
도 2는 서열번호 1~4 항생 펩타이드를 처리한 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)로 자극을 주어 생성되는 염증 유발 물질 nitric oxide (NO)양을 펩타이드 농도에 따라 측정하였다.
도 3은 서열번호 3~4 항생 펩타이드를 처리한 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에 염증을 일으키는 pathogen인 LPS의 자극에 의해 분비되는 염증유도 사이토카인 mTNF-알파(도 3a)와 mMIP-2(도 3b)의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 펩타이드들의 합성 및 분리정제

서열번호 1-4로 기재되는 항균 펩타이드들은 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC)를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H₂O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로 부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다. 이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C₁₈ _, 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH₃CN (acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun . Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실험예 1: 마우스 대식세포에 대한 세포독성 측정

서열번호 1~4에 해당하는 펩타이드에 대해 다음과 같은 방법으로 세포독성을 측정하였다. 마우스 대식세포(RAW264.7 cell line)은 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bivine serum)을 포함하는 RPMI1640 배양액으로, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2Ｘ10⁴ 세포수가 되도록 RPMI1640 배양액 100μl씩 분주한다. 세포가 분주된 플레이트를 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한 후, 배지를 제거한 플레이트에 100부터 2배의 농도로 희석한 펩타이드를 분주한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한다. 이때 음성 대조군으로는 펩타이드를 처리한지 않고 배양액만을 넣은 것으로 비교하였다. MTT [3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20μl씩을 플레이트 각 웰에 분주하고 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan에 100μl의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 처리한 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 측정하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 1~2에 비해 7번 라이신을 트립토판으로 치환하여 소수성을 증가시킨 9Pbw3와 9Pbw3D가 더 높은 세포독성을 보였다. 하지만 본 펩타이드들은 모두 12.5μM 이하 농도에서는 100% 생존율을 보임으로써 세포독성을 전혀 보이지 않았다.

실험예 2: Raw264 .7 cell 에서 Pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 NO( nitrite oxide)의 생산 억제 측정

서열번호 1~4으로 표기되는 펩타이드에 대하여 항염증 활성작용에 효과적인지 알아보기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 대식세포 Raw264.7세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% antibiotics (100U/mL penicillin, 100ug/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 1×10⁵ 세포수가 되도록 RPMI1640배양액 200㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였고, 양성 대조군은 LPS 처리한 배양액만 넣은 것을 사용하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, cell proliferation assay에 의해 펩타이드 최고농도(10uM)에서 세포독성이 전혀 없음을 확인한 서열번호 1~4에 해당하는 펩타이드를 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)에서 한 시간 반응 시키고, 이후 그람 음성균 세포벽을 구성하는 성분이며, 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)로 자극을 주어 24시간 배양한다. 24배양이후 배양 상등액 50ul와 동량의 Griess Reagent 시약으로 반응시킴으로 배양 상등액에 녹아져 있는 NO(nitrite oxide)양을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO양은 standard (NaNO₂)의 흡광도 값과 비교하여 정량한다.

도 2에서 확인할 수 있듯이 9Pbw2 및 9Pbw2D는 펩타이드를 전혀 처리하지 않은 control의 NO수치와 비교했을 때 NO생산 억제 능력을 전혀 보이지 못했다. 반면 앞의 두 펩타이드 보다 한 개의 트립토판 잔기를 더 가진 9Pbw3와 9Pbw3D는 펩타이드 농도 10uM에서 효과적으로 NO생산 억제 능력을 보였고, 특히나 D-형 아미노산으로 이루어진 9Pbw3D가 더 억제효과가 뛰어남을 보였다. 이를 통해 9Pbw3와 9Pbw3D는 nitrite oxide에 의한 염증반응에 탁월한 펩타이드라고 예측 할 수 있다.

실험예 3: Raw264 .7 cell 에서 Pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 염증유도 Cytokine 의 생산 억제 측정

서열번호 3~4으로 표기되는 펩타이드가 염증유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a을 특이적으로 억제하는지 알아보기 위해 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 대식세포 Raw264.7세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% antibiotics (100U/mL penicillin, 100ug/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640배양액으로 5% CO₂존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 1×10⁵ 세포수가 되도록 RPMI1640배양액 200㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였고, 양성 대조군은 LPS 처리한 배양액만 넣은 것을 사용하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, cell proliferation assay에 의해 펩타이드 최고농도(10uM)에서 세포독성이 전혀 없음을 확인한 서열번호 3~4에 해당하는 펩타이드를 마우스 대식세포 RAW264.7 cells에서 세 시간 반응 시키고, 이후 그람 음성균 세포벽을 구성하는 성분이며, 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)를 농도별로 자극을 주어 18~24시간 배양한다. 이후 Immuno plate을 mMIP-2와 mTNF-a를 인식하는 각각의 1차 항체로 하룻밤(overnight) coating하고 washing 후 비 특이적인 반응의 정지를 위해 blocking buffer(5%BSA in PBS)로 4℃에서 blocking한다. 1차 항체로 coating처리된 플레이트에 18~24시간 배양을 끝낸 LPS자극을 받은 Raw264.7 세포의 배양 상등액을 50ul씩 따서 플레이트에 처리하고, 2시간 배양한다. 이후 mMIP-2와 mTNF-a를 인식하는 발색 가능한 2차 항체를 처리하고 두 시간 후, 발색효소(streptavidin HRP)를 붙여 40분후 TMB(3,3`,5,5`-tetramethybensidine) solution으로 발색시킨다. 발색 10~15min 진행 후 H₂SO₄로 발색정지 시킨 후 배양 상등액에 녹아져 있는 mMIP-2와 mTNF-a양을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. mMIP-2와 mTNF-a양은 standard의 흡광도 값과 비교하여 정량한다.

도 3에서 확인 할 수 있듯이 LPS 20ng/ml농도일 때 염증유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a는 9Pbw3와 9Pbw3D에 의해서 효과적으로 저해되는 것을 볼 수 있었으며, 이것으로써 염증을 유도하는 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a는 9Pbw3와 9Pbw3D에 의해 특이적으로 억제됨을 확인함으로 이 둘 펩타이드가 고기능성 항염증펩타이드로 사용될 수 있다는 것을 나타내고 있다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Antibiotic peptide analogues with high anti-inflammatory activities and uses thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Pbw2 <400> 1 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Lys Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Pbw2D <400> 2 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Lys Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Pbw3 <400> 3 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Pbw3D <400> 4 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5

Claims

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유효량의 서열번호 3에 기재되는 펩타이드의 구성 아미노산 전체를 D-형태로 변환한 서열번호 4의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 펩타이드의 유효량은 1uM에서 10uM 인 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 펩타이드는 25uM이하에서 정상세포에 대하여 안전성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
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