KR101171821B1 - 호랑나비 유충으로부터 분리된 파필리오신 1 펩타이드 및 그의 항균, 항염제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나비목 곤충에 속하는 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 분리된 신규한 펩타이드 및 그의 용도 및 작용기작에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균 등에 항균 활성을 나타내고 염증 유도물질 나이트라이트 옥사이드와 사이토카인의 생성을 억제함으로 항염활성을 나타낸다. 또한 본 발명의 펩타이드는 세포 독성이 거의 없으므로 인체에 안전한 항생제와 염증 치료제로 쓰일 수 있다.

호랑나비, 항균펩타이드, 항염펩타이드

Description

호랑나비 유충으로부터 분리된 파필리오신 1 펩타이드 및 그의 항균, 항염제로서의 용도{A Papiliocin 1 peptide isolated from Papilio xuthus larva and A use of the peptide as antibacterial and antiinflammatory agent}

본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부터 분리된 Papiliocin 1 항생펩타이드 및 그의 항생제 및/또는 항염제로서의 용도에 관한 것이다.

페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균을 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). 페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화 학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G. J Intern Med. 2003, 254(3), 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395).

넓은 의미로서 면역반응으로 불리어지는 항원항체 반응은 인간을 포함한 무척추동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충은 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 곤충의 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 물질을 획득한다는 것이다. 그 중에서도 항균성 펩타이드를 중심으로한 항미생물작용을 가진 펩타이드나 단백질은 우리 인간을 포함한 가축등의 질병 방제에 대해서 이용 가능성 높다. 이러한 곤충유래 항병원성 단백질은 인간 및 가축의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

항생 펩타이드는 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형 (helical)의 양친매성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이나 트립토판등의 특정 아미노산이 풍부한 (proline-rich, Trp-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu, D.; Rivas, L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 멜리틴 (melittin)이나 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 α-나선형을 형성하는 구조이다.

현재까지 발견된 곤충의 항균단백질 및 펩타이드는 Boman 박사 연구팀에 의해 세크로피아나방에서 세크로핀이 최초로 보고된 이래 약 200여종이 곤충으로부터 분리되어졌는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다.

세크로핀류는 31 -39개의 아미노산으로 구성된 염기성 단백질로 N-말단의 양친매성 나선구조를 포함한 α-helix-hinge-α-helix 구조를 가지면 열에 안정하고 넓은 항균 활성을 나타낸다(Boman and Hultmark, Annu. Rev. Micrbiol., 41: 1003-126, 1987).

주요 곤충유래 항균 단백질로는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 sacotoxin Ⅲ(Baba et al., Biochem., 102:69-74, 1987) 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 diptericin(Wicker et al., Biol. Chem., 265:2249322498, 1990) 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18:1049-1052, 1995), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 218:6-11, 1996), 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 Defensin, Coleoptericin A and B(Miyanoshita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 220:526-531, 1996; Sakisaca et al., Insect Mol. Biol., 10:293-302, 2001) 담배나방아과의 Heliothis virescens에서 발견된 heliomicin(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274:9320-9326, 1999), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 Rhinocerosin, Scarabaecin(Yang J et al., European Journal of Biochemistry, 255(3):734-738, 1998; Tomie et al., Biochemical Biophysical Research Communications, 307(2):261-266, 2003), 매미아과의 Cicada flammata에서 발견된 cicadin(Wang and Ng, Peptides, 23:7-11, 2002), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 Cecropin(saito et al., Comp. Biochem. Physiol., B142 :317323, 2005), 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 Moricin analogue(Oizumi Y et al., Biochimica Biophysica Acta., 1752(1):83-92, 2005)등이 밝혀져 있다. 그러나, 호랑나비 유충에서 항균활성을 나타내는 항균단백질 및 펩타이드에 대한 보고는 전무한 상태이다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항균 활성을 가지는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항염증활성을 가지는 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1에 기재되는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 표피세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 서열번호 1에 기재되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 그람양성균, 그람 음성균, 또는 항생제 내성균주인 것이 바람직하고, 상기 그람양성균은 B. subtilis, S. aureus, 또는 S. epidermidis이고, 그람 음성균은 E. coli, P. aeruginosa, 또는 S. typhimurium이며, 상기 항생제 내성균주는 MRSA(3089, 3090, 3108, 3114, 3126), MDRST(8003, 8007, 8009), 또는 MDREC(1229)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항균용 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 상피세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하다.

또 본 발명은 서열번호 1에 기재되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 물질에 대한 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항염증 활성은 유도물질 나이트레이트 옥사이드와 사이토카인의 생성을 억제함으로 수행되는 것을 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항염증용 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 상피세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 호랑나비 유충으로부터 항균 펩타이드 유전자를 분리하기 위하여 먼저 호랑나비 유충에 그람음성균(Escherichia coli JM109)을 주사하여 면역을 유도 한 후 cDNA 유전자 은행을 제작하여 기 보고된 항균 관련 유전자와 상동성이 높은 항진균펩타이드 유전자를 선발하고, 파필리오신 항균펩타이드의 아미노산 서열을 밝힌바 있다 (대한민국 특허출원번호: 10-2009-19022). 본 발명에서는 38개 잔기를 가지는 항균펩타이드 파필리오신를 화학 합성하여 이차구조를 예측하며, 다양한 표준균주(6종) 및 내성 균주(9종)에서의 항균활성과 인간의 정상세포에서 독성 여부를 판단하고, 염증유발 물질 nitrite oxide와 사이토카인의 생성억제기작 활성을 확인하였다.

이하 본 발명을 단계에 따라 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 나비목 곤충에 속하는 호랑나비(Papilio xuthus) 유충으로부 터 분리된 항균펩타이드 Papiliocin 1을 합성하여 6종의 박테리아에 대한 항생활성을 검정하였다. 그 결과 항균 펩타이드 Papiliocin 1 처리시 공시한 6종의 균들의 생장이 억제되었다. 특히 MIC분석 방법을 통해서 E.coli 등의 그람음성균에 대해 대조군인 벌독유래 항균펩타이드 멜리틴과 보다 높은 항균활성을 나타나는 것을 확인하였다. 한편 항균 활성이 있는 상기 펩타이드에 대해 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 적혈구와 표피세포 파괴능을 조사한 결과, 양성 대조군으로 사용한 벌독유래 항생펩타이드 멜리틴에 비해 Papiliocin 1 펩타이드는 그람 음성균에 대해 더 높은 활성을 나타내고 그람 양성균에 대해서는 더 낮은 활성을 가지는 것을 확인 할 수 있었다.

펩타이드	아미노산서열
서열번호 1: Papiliocin 1	RWKIFKKIEKVGRNVRDGIIKAGPAVAVVGQAATVVKG-NH2

상기 표 1은 서열번호 1로 기재되는 Papiliocin 1의 잔기서열이다.

우선, 항균 펩타이드 Papiliocin 1이 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 항균 펩타이드 Papiliocin 1및 대조군 펩타이드에 대하여 그람-음성균 (3종류의 균주), 그람-양성균 (3종류의 균주) 및 내성균주(9종류의 균주)에 대하여 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 (minimal inhibitory concentration: MIC, 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis를, 그람 음성균으로써 Escherichia coli, Psedomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium를 내성균주로써 MRSA(3089, 3090, 3108, 3114, 3126), MDRST(8003, 8007, 8009), MDREC(1229)를 그 대상으로 하였다. 대조 펩타이드로 melittin의 활성을 함께 관찰하였다.

Papiliocin 1 항생펩타이드는 모든 균에 대해 항생활성을 가졌으며 특히 그람음성균에 대해서는 높은 항생활성을 나타내었다. 대조군인 멜리틴과 비교 했을 시 그람음성균에 대해서는 보다 높은 항생활성을 나타냈다. 특히 그람음성 내성균주에서도 탁월한 항생활성을 보였다(표 2, 3 참조).

항균 펩타이드 Papiliocin 1의 숙주세포에 대한 독성을 조사한 결과 대조군인 멜리틴은 독성이 높은 반면 Papiliocin 1 펩타이드는 고농도에서도 용혈활성과 세포독성을 거의 나타내지 않았다 (도 2, 3 참조).

또한 도 4,5는 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아 세포막을 모방하는 음성지질인 EYPC/EYPG (7:3, w/w)와 인간의 적혈구를 모방하는 중성지질인 EYPC/CH (10:1, w/w)리포좀에 대해 본 발명의 펩타이드 Papiliocin 1에 의한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이다. 멜리틴은 아주 저 농도에서도 100% 염료방출을 나타내 독성이 높으며, 펩타이드 Papiliocin 1은 인간의 세포막을 모방하는 중성지질에서는 멜리틴 보다 적은 염료방출을 나타내고 음성지질막에는 더 높은 염료방출을 나타내어 인간의 세포에는 독성이 적고 박테리아 세포 선택성을 가짐을 알 수 있다.

또한 그람 음성균에서 뛰어난 항균활성을 가진 Papiliocin 1은 pathogen인 LPS로 자극된 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에서 생성되는 염증 유발 물질 nitric oxide (NO)와 염증 유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a를 탁월하게 억제하였고, 이들 사이토카인을 암호화하는 mRNA발현 또한 효과적으로 억제함으로 항염증 펩타이드로서 탁월하다는 것을 증명하였다.(도 6, 7, 8 참조).

또한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체로는 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성아미노산, 및 아미노산 공중합체와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들수 있다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 펩타이드 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골,트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산 (ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 1 일당 0.01 내지 20 ㎎/㎏체중이고, 바람직하

기에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 항생 펩타이드 Papiliocin 1의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1로 기재되는 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 및 내성균주 모두에서 항균작용을 나타내고, 특히 그람 음성균에 대해서는 대조 펩타이드인 melittin 보다 높은 항균활성을 나타낸다. 상기 펩타이드는 항균활성이 탁월함과 동시에 대조 펩타이드 멜리틴에 비교했을 시 현저히 낮은 독성을 나타냄으로 박테리아 선택성이 탁월한 항생펩타이드이다. 상기 본 발명의 펩타이드는 항균활성뿐만 아니라 항염증작용 또한 대조펩타이드 LL37과 유사하게 높게 나타났다. 이것으로써 펩타이드 Papiliocin 1은 세포독성을 거의 나타내지 않고, 항균 또는 항염증작용을 하는 인체에 안전한 항생제 또는 항염증제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1:펩타이드들의 합성 및 분리정제

서열번호 1로 기재되는 항균 펩타이드는 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptidesynthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC) 를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H2O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로 부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다. 이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C18, 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH3CN(acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실험예 1: 원편광 이색성 분광법을 이용한 2차 구조 연구

서열번호 1로 표기되는 펩타이드의 2차 구조를 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 다양한 용매(100mM SDS, Sodium Dodecyl Sulfate; 50mM DPC, dodecylphosphocholine; 50%TFE/H2O, tetrafluoroethylene; H2O)에서 펩타이드는 한 시료당 100ug을 사용하였으며 각 용매 0.3ml에 녹였다. 1mm path length의 cell을 이용하여 Jasco J-720 spectropolarimeter (원편광 이색성 분광기)에서 100nm/min의 주사속도로 0.1nm마다 흡수 값이 얻어졌으며 6번의 주사가 평균이 되어 측정되었다. 원편광 이색성 분광법은 키랄성을 갖는 분자가 원편광된 빛을 파장에 따라 다른 정도로 흡수하는 것을 이용한 방법으로, 펩타이드 경우 글라이신 잔기를 제외한 모든 잔기들이 비대칭 α-탄소를 가지고 있으므로 폴리펩타이드의 주 골격의 구조에 따라 특징적인 흡수형태를 갖는데, 일반적인 흡수형태는 a-helix구조의 경우 208, 222nm 근처의 파장에서 두 개의 최소점을 가지므로 [도 1]에서 나타낸 바와 같이 Papiliocin 1항생펩타이드는 물에서는 랜덤한 구조를 가지고, 이 외에 모든 용매에서 α-helix구조를 가지며, helix한 정도는 50% TFE/H2O > 100mM SDS > 50mM DPC 로서 50% TFE/H2O에서 가장 helix한 구조임을 알 수 있다.

실험예 2: 항균활성의 측정

서열번호 1로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 한국생명공학연구원의 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)로부터 분양받은 그람 양성균으로써 Bacillus subtilis(KCTC 3068), Staphylococcus aureus(KCTC 1621), Staphylococcus epidermidis(KCTC1917)를, 그람 음성균으로써 Escherichia coli (KCTC 1682]), Psedomonas aeruginosa (KCTC 1637), Salmonella typhimurium(KCTC 1926)를 그 대상으로 하였다. 세균수가 ml 당 2×10⁶ colony-forming units (CFUs)가 되도록 1% peptone으로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양 한 후 ELISA판독기 (Bio-Tek Instruments)로 620nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 최소성장억제농도(MIC: minimal inhibitory concentration)를 결정한다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 멜리틴를 사용하였다. 그 결과 Papiliocin 1펩타이드는 그람-양성균에서는 대조 항균펩타이드인 melittin보다 훨씬 낮은 항균활성을 보였으나 그람-음성균에서는 2~4배 뛰어난 항균활성을 가졌음을 알 수 있었다.

이들에 대한 내성균주에 대한 활성을 측정하기 위해 서울여자대학교 Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes(CCARM) 내성균주은행에서 분양받은 MRSA (CCARM3089, 3090, 3108, 3114, 3126), MDRST(CCARM8003, 8007, 8009), MDREC(CCARM1229)에 대해 활성을 측정하였다.

그 결과 Papiliocin 1펩타이드는 표준균주에서의 항균활성과 마찬가지로 그람-양성내성균에서는 대조 항균펩타이드인 melittin보다 훨씬 낮은 항균활성을 보였으나 그람-음성내성균에서는 2~4배 뛰어난 항균활성을 가졌음을 알 수 있었다.

펩타이드	최소생장억제농도 MIC (μM)
	E. coli	S.typhimurium	P.aeruginosa	S.aureus	B.subtilis	S.epidermidis
서열번호 1: Papiliocin 1	1	4	4	16	16	8
melittin	1	8	8	2	2	1

표 2는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

펩타이드	MIC(uM)
	Antibiotics-resistant bacterial strain
	S. aureus 3089(R)	S. aureus 3090 (R)	S. aureus 3108 (R)	S. aureus 3114 (R)	S. aureus 3126 (R)	S. Typhimu rium 8003 (R)	S. Typhimu rium 8007 (R)	S. Typhimu rium 8009 (R)	E. Coli 1229 (R)
서열번호 1: Papiliocin 1	32	32	32	16	32	2	2	2	1
Melittin	2	2	2	2	2	4	8	8	4

표 3은 내성균주에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

실험예 3: 용혈활성의 측정

서열번호 1로 표기되는 펩타이드에 대하여, 사람의 적혈구 용혈활성을 통하여 세포독성 여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 사람의 적혈구(human erythrocytes)를 PBS(phosphate-buffered saline: 35 mM 포스페이트 완충용액/150 mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리 하는 것에 의하여 3회 세척한다. PBS로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 로딩한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간동안 배양한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트를 원심력 1000g로 5분간 원심분리 한다. 상층액 100㎕씩 취하여 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮긴 후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군 펩타이드로, 멜리틴을 사용하였다. 이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % hemolysis로서 수학식 1에 의하여 산출하였다. 여기서 A는 펩타이드 용액에서의 405 nm의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 405 nm의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 405 nm의 흡광도를 나타낸다. 이 때 대조군의 펩타이드로서 강한 용혈활성을 나타내는 항균 펩타이드로서는 멜리틴를 사용하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이 서열번호 1로 표기되는 펩타이드 Papiliocin 1은 고농도에서 거의 용혈활성을 나타내지 않았다.

실험예 4:포유류 세포주에 대한 독성측정

서열번호 1로 표기되는 펩타이드의 포유류 세포주에 대한 독성여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 인간의 표피세포 Haca T 세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medim) 배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2×10⁴ 세포수가 되도록 DMEM배양액 150㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, 최종 펩타이드 농도가 100μM 되게 펩타이드를 가하여 2일간 배양한다. 그 후 MTT용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20㎕을 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 배양한다. 생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan을 0.01 M염산을 포함하는 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)용액을 플레이트의 각 웰에 40㎕씩 첨가하여 하룻밤 방치하여 잘 녹인 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이 대조군 펩타이드인 melittin는 0.4μM에서 50%를, 100μM에서90% 이상의 세포를 죽이는 강력한 세포독성을 나타낸 반면에 발명 펩타 이드인 Papiliocin 1은 MIC 농도에서는 전혀 독성이 없었다. MIC보다 훨씬 높은 농도인 100μM에서도 낮은 독성 보여 높은 박테리아 세포 선택성을 가짐을 알 수 있었다.

실험예 5: 박테리아세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 인공지질막에 대한 파괴능 측정

서열번호 1로 표기되는 펩타이드의 항균작용이 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 세균을 죽이는 작용기작을 나타내는 것인지를 확인하기 위하여 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아의 세포막을 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w)로 구성된 LUVs (large unilamellar vesicle)의 리포좀(liposome)과 인간의 적혈구를 모방하는 EYPC/CH(1:10, w/w)을 제작하여 다음의 형광염료방출실험(dye leakage assay)을 행하였다. 각 구성성분의 함량대로 구성된 인지질을 10mM/ml이 되도록 클로로포름(CHCl₃)에 녹인 다음, rotary evaporator로 클로로포름을 제거하고, 하룻밤 동안 동결건조 시킨다. 건조된 지질필름(lipid films)을 트리스-완충용액 (10mM Tris-HCl/ 0.1mM EDTA /150 mM NaCl / pH 7.4) 1ml에 calcein을 70mM이 되도록 녹인다. 리포좀 용액을 액체질소로 얼림-녹임(frozen-thaw)을 10번(ten cycles) 반복하여 행하고 polycarbonate 필터 (pore size가 100 nm인 필터를 두장을 겹친것)로 장착된 LiposoFast extruder (Avestin, Inc. Canada)장치를 이용하여 10회 통과시켜서 칼세인을 포획한 LUVs를 제작한다. 다음은 Sephadex G-50 컬럼을 이용하여 LUVs에 포획되지 않은 free calcein을 제거 하고 calcein이 포획된 리포좀을 모은다. Spectrofluorimeter (Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, Japan)의 excitation wavelength을 490nm에 emission wavelength를 520nm에 맞춘다. 트리스-완충용액 3ml을 quartz cuvette (1cm path length)에 넣고 여기에 적당량의 LUVs 용액을 넣고, 10% Triton-X₁₀₀ 20μl을 넣어 형광세기(fluorescence intensity) 가 1000을 넘지 않도록 LUVs의 양을 조절한다. 위의 조건이 확립되면 LUVs에 펩타이드를 투여한다. 여기서 100 % dye leakage는 0.01 % Triton-X₁₀₀을 넣었을 때의 형광 세기로 표시한다. 여기서 EYPG는 egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol의 약어이며, EYPC 는 egg yolk 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine의 약어이다. CH는 콜레스테롤의 약자이다. 여기서 박테리아 세포막을 표적으로 하여 항균활성을 나타내는 대조군의 펩타이드로서는 melittin을 사용하여 비교하였다.

도 4와 도 5에 보이듯이 대조 펩타이드인 melittin은 낮은 농도에서도 박테리아의 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀에서 칼세인을 (calcein leakage)방출시켰으며 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH (10:1,w/w) 리포좀에서 Melittin은 0.25μM에서 100%에 가까운 칼세인 방출을 일으켜서 전혀 박테리아세포에 대한 선택성을 보이지 않았지만 서열번호 1로 기재되는 펩타이드는 박테리아 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 염료방출에 비해 선택적으로 포유동물의 적혈구 세포막을 모방하는 PC/CH (1:1, w/w) 리포좀에 대해서는 약한 염료방출을 보였다. 따라서 서열번호 1의 펩타이드는 박테리아세포에 선택성이 높을 것임을 예측할 수 있다.

실험예 6:Raw264.7 cell에서 Pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 NO(nitrite oxide)의 생산 억제 측정

서열번호 1로 표기되는 Papiliocin 1이 항균활성 뿐 아니라 항염증 활성작용에도 효과적인지 알아보기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 대식세포 Raw264.7세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% antibiotics (100U/mL penicillin, 100ug/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 1×10⁵ 세포수가 되도록 RPMI1640배양액 200㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였고, 양성 대조군은 LPS 처리한 배양액만 넣은 것을 사용하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, cell proliferation assay에 의해 펩타이드 최고농도(10uM)에서 세포독성이 전혀 없음을 확인한 Papiliocin 1을 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)에서 한 시간 반응 시키고, 이후 그람 음성균 세포벽을 구성하는 성분이며, 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)로 자극을 주어 24시간 배양한다. 24배양이후 배양 상등액 50ul와 동량의 Griess Reagent 시약으로 반응시킴으로 배양 상등액에 녹아져 있는 NO(nitrite oxide)양을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO양은 standard (NaNO₂)의 흡광도 값과 비교하여 정량한다.

도 6에서 확인 할 수 있듯이 Papiliocin 1은 LPS 처리하지 않은 control의 NO수치와 비교했을 때 1uM에서 20uM 농도까지 NO생산을 효과적으로 억제하였고, 항염증활성에 탁월하다고 알려진 대조 펩타이드 LL37과 비교했을 때 유사한 활성을 나타냈음으로 항생펩타이드 Papiliocin 1은 nitrite oxide에 의한 염증반응에 탁월한 펩타이드라고 예측 할 수 있다.

실험예 7:Raw264.7 cell에서 Pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 염증유도 Cytokine의 생산 억제 측정

서열번호 1로 표기되는 Papiliocin 1이 염증유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a을 특이적으로 억제하는지 알아보기 위해 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 대식세포 Raw264.7세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% antibiotics (100U/mL penicillin, 100ug/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 1×10⁵ 세포수가 되도록 RPMI1640배양액 200㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였고, 양성 대조군은 LPS 처리한 배양액만 넣은 것을 사용하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, cell proliferation assay에 의해 펩타이드 최고농도(10uM)에서 세포독성이 전혀 없음을 확인한 Papiliocin을 마우스 대식세포 RAW264.7 cells에서 세 시간 반응 시키고, 이후 그람 음성균 세포벽을 구성하는 성분이며, 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)를 농도별로 자극을 주어 18~24시간 배양한다. 이후 Immuno plate을 mMIP-2와 mTNF-a를 인식하는 각각의 1차 항체로 하룻밤(overnight) coating하고 washing 후 비 특이적인 반응의 정지를 위해 blocking buffer(5%BSA in PBS)로 4℃에서 blocking한다. 1차 항체로 coating처리된 플레이트에 18~24시간 배양을 끝낸 LPS자극을 받은 Raw264.7 세포의 배양 상등액을 50ul씩 따서 플레이트에 처리하고, 2시간 배양한다. 이후 mMIP-2와 mTNF-a를 인식하는 발색 가능한 2차 항체를 처리하고 두 시간 후, 발색효소(streptavidin HRP)를 붙여 40분후 TMB(3,3`,5,5`-tetramethybensidine) solution으로 발색시킨다. 발색 10~15min 진행 후 H₂SO₄로 발색정지 시킨 후 배양 상등액에 녹아져 있는 mMIP-2와 mTNF-a양을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. mMIP-2와 mTNF-a양은 standard의 흡광도 값과 비교하여 정량한다.

도 7에서 확인 할 수 있듯이 LPS 5ng/ml농도일 때 염증유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a는 Papiliocin 1에 의해 완전히 저해되는 것을 볼 수 있었으며, LPS 50ng/ml 농도에서도 mMIP-2와 mTNF-a에 대해 높은 저해정도를 보였다. 이것으로써 염증을 유도하는 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a는 Papiliocin 1에 의해 특이적으로 억제됨을 확인함으로 항염증펩타이드로 사용될 수 있다는 것을 나타내고 있다.

실험예 8: Raw264.7 cell에서 Pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 염증유도 Cytokine 의 mRNA 억제

서열번호 1로 표기되는 Papiliocin 1이 염증유도 사이토카인을 암호화하는 mRNA를 근본적으로 억제하는지 알아보기 위해 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 대식세포 Raw264.7세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% antibiotics (100U/mL penicillin, 100ug/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 1×10⁶ 세포수가 되도록 RPMI1640배양액 2ml 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였고, 양성 대조군은 LPS 처리한 배양액만 넣은 것을 사용하였다. 6-웰 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, cell proliferation assay에 의해 펩타이드농도 5uM에서 세포독성이 전혀 없음을 확인한 Papiliocin 1을 마우스 대식세포 RAW264.7 cells에서 세 시간 반응 시키고, 이후 그람 음성균 세포벽을 구성하는 성분이며, 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)로 자극을 주어 6시간 배양한다. 이후 마우스 대식세포 Raw264.7세포를 harvest하여 Superscript III Kit (invitrogen) 이용하여 total RNA 추출한다. 추출한 RNA에 50~250ng oligo dT 15mer primer넣고 70℃에 10분 두었다가 원심분리 후 시료를 모아 5X first strand buffer, 0.1M DTT, 10mM dNTP, RTase 시약을 첨가한다. 이후 42℃에서 50~60분 반응시키고, 70℃에서 15분 두어 효소를 불활성화 시킨다. 이것으로 합성된 cDNA을 template로 하여 taq polymerase, 10X buffer, dNTP, gene specific primer 넣고 Predenaturation 단계 94℃에서 5min, 40cycle(denaturation 94℃ 1min, Annealing 55℃ 1.5min, elongation 72℃ 1min) Postelongation단계 72℃에서 5min으로 PCR수행한다. PCR로 얻은 샘플을 1% agarose gel에서 전기영동하여 mRNA 발현을 확인한다.

도 8에서 볼 수 있듯이 Papiliocin 1은 mIL-1b, mTNF-a, mMIP-1, MIP-2, mIL-6 사이토카인을 암호화하는 mRNA발현을 모두 저해함으로 Papiliocin 1의 염증유도 사이토카인의 저해활성기작을 근본적으로 밝힐 수 있다.

도 1은 다양한 용매상태에서 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1의 이차구조를 예측하기위해 주 골격의 구조에 따라 특징적인 흡수형태를 갖는 원편광 이색성 분광법 이용하며, 생체막 유사환경에서는 흡수형태는 α-helix구조 208, 222nm 근처의 파장에서 두 개의 최소점을 가지므로 α-helix구조를 가짐을 알수 있다.

도 2는 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1을 인간의 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 용혈활성을 % hemolysis로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (용혈활성을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.

도 3은 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1을 인간의 표피세포(Haca T cell)에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survival rate로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.

도 4는 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨, 박테리아 세포를 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군(세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.

도 5는 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1에 의한 형광염 료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 인간의 적혈구를 모방하는 중성지질인 EYPC/CH (10:1,w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.

도 6은 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1을 처리한 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)로 자극을 주어 생성되는 염증 유발 물질 nitric oxide (NO)양을 펩타이드 농도에 따라 측정하였다.

도 7은 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1을 처리한 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에 염증을 일으키는 pathogen인 LPS의 자극에 의해 분비되는 염증유도 사이토카인 mMIP-2와 mTNF-a의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하였다.

도 8은 서열번호 1 항생 펩타이드 Papiliocin 1을 처리한 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)에 염증을 일으키는 pathogen인 LPS의 자극에 의해 분비되는 염증유도 사이토카인을 암호화하는 mRNA발현을 억제하는 정도를 나타낸 것으로 대조군은 GAPDH를 이용하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A Papiliocin 1 peptide isolated from Papilio xuthus larva and A use of the peptide as antibacterial and antiinflammatory agent <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Ala Thr Val Val Lys Gly 35

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7. 서열번호 1에 기재되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 물질에 대한 항염증용 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 항염증 활성은 유도물질 나이트레이트 옥사이드와 사이토카인의 생성을 억제함으로 수행되는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
9. 삭제

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