KR101193398B1 - 프로태티아마이신 항생펩타이드 유도체로부터 설계된 신규한 항균, 항진균 펩타이드 유도체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항생 펩타이드 9Pbw 2,3의 거울상 이성질체(D form) 펩타이드인 항균, 항진균 활성을 가지는 신규한 9Pbw 2D또는 3D 펩타이드 및 그의 용도 및 작용기작에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 펩타이드는 탁월한 항균 활성 및 항진균 및 항비듬균 활성을 나타내고 세포 독성이 항균, 항진균 활성을 가지는 농도에서 없으므로 인체에 안전한 항균제, 항진균제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프로태티아마이신 항생펩타이드 유도체로부터 설계된 신규한 항균, 항진균 펩타이드 유도체 및 그 용도{Antibiotic peptide analogues with high antibacterial and antifungal activities designed from Protaetiamycine and use of the same}

본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 흰점박이꽃무지유충으로부터 분리된 프로태티아마이신 유도체 항생펩타이드 및 그의 항생제 및/또는 항진균, 항비듬균제로서의 용도에 관한 것이다.

페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균을 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa ) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). 페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G. J Intern Med. 2003, 254(3), 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395).

지난 몇 년간 진균에 대한 감염이 급격하게 증가되고 있는 실정이며, 주된 곰팡이 감염은 아스페르길루스(Aspergilus)나 칸디다 종 (Cadida)곰팡이병원균으로 알려져 있으나 병원성 곰팡이균의 스펙트럼의 변화와 다양성이 증가하고 있는 실정이다 (Denning, D.W. J. Antimicrob. Chemother. 1991, 28 Suppl B, 1-16.; Ellis, M., Richardson, M. & de Pauw, B. Epidemiology. Hosp. Med. 2000, 61, 605-609 ; Odds, F. C. Brown, A. J. and Gow, N.A., Trends Microbiol. 2003, 11, 272-279) 항진균 치료제로 스테롤 형성을 억제하는 아졸(Azoles)이나 세포막 스테롤에 붙는 폴리엔(ployenes)이 주로 사용되고 있으나 독성이 강하고 내성을 가진 병원균이 발견되면서 새로운 항진균 치료제의 개발이 시급한 실정이다.(Kullberg, B.J. and de Pauw, B.E. Neth. J. Med. 1999, 55, 118-127 ; Sheehan, D.J., Hitchcock, C.A. and Sibley, C.M., Clin. Microbiol. Rev. 1999. 12, 40-79 ; Alexander, B.D. and Perfect, J.R., Drugs, 1997, 54, 657-678 ; Mukherjee, P.K., Chandra, J., Kuhn, D.M., and Ghannoum, M.A. Infect. Immun. 2003 71, 4333-4340; Kontoyiannis, D.P., Mantadakis, E., and Samonis, G., J. Hosp. Infect., 2003, 53, 243-258 ).

Malassezia 는 이스트(yeast) 강(class)에 속하는 곰팡이에 관련된 속(genus)의 한 종류로서 사람이나 동물의 피부 표면에서 주로 발견되며, Malassezia furfur.는 비듬을 일으키는 원인균으로 알려져 있다. (Inamadar AC, Palit A, Indian J Dermatol Venereol Leprol, ,2003, 69 (4), 265) 최근 피부질환 및 비듬에 관련된 문제가 심각하게 대두 되고 있는 실정이며, 국내에 비듬치료용 샴푸로 니조랄(2% 케토코나졸(ketoconazol)의 항진균 성분 포함), 세비프록스(1.5% 시클로피록스 올아민(Ciclopirox Olamine)의 항진균 성분 포함) 등이 널리 이용되고 있는 실정이다. 항생펩타이드의 항생제로서의 역할 뿐만 아니라 항진균제로의 활성을 보이며 항생펩타이드에 대한 항진균제로의 연구는 인체에는 무해하면서도 탁월한 능력을 가지는 치료제 후보물질로 제안될 수 있다.

넓은 의미로서 면역반응으로 불리어지는 항원항체 반응은 인간을 포함한 무척추동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충은 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 곤충의 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 물질을 획득한다는 것이다. 그 중에서도 항균성 펩타이드를 중심으로한 항미생물작용을 가진 펩타이드나 단백질은 우리 인간을 포함한 가축등의 질병 방제에 대해서 이용 가능성 높다. 이러한 곤충유래 항병원성 단백질은 인간 및 가축의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

항생 펩타이드는 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형 (helical)의 양친매성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이나 트립토판등의 특정 아미노산이 풍부한 (proline-rich, Trp-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int . J. Antimicrob . Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu , D.; Rivas , L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 멜리틴 (melittin)이나 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 α-나선형을 형성하는 구조이다.

현재까지 밝혀진 곤충유래 항균 단백질로서는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 sacotoxin Ⅲ(Baba et al, 1987), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 diptericin(Wicker et al 1990), 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18:1049-1052, 1995), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:6-11, 1996), 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 Defensin, Coleoptericin A and B(Miyanoshita et al., 1996 ; Sakisaca et al., 2001) 담배나방아과의 Heliothis virescens에서 발견된 heliomicin(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274:9320-9326, 1999), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 Rhinocerosin, Scarabaecin(Yang et al., 1998 ; Tomie et al., 2003), 매미아과의 Cicada flammata에서 발견된 cicadin(Wang and Ng, Peptides, 23:7-11, 2002), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 Cecropin(saito et al., 2005), 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 Moricin analogue(Orizumi et al., 2005)등이며, 본 발명자들은 면역유도시킨 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 면역화 유도후 cDNA 유전자 은행을 제작하여 기 보고된 항균 관련 유전자와 상동성이 높은 항진균 펩타이드 유전자를 선발하고, 프로태티아마이신 항균펩타이드의 아미노산 서열을 밝힌바 있다(특허출원번호: 10-2008-0109281).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 인체무독성인 항균, 항진균, 항비듬균 활성을 가지는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항균, 항진균, 및/또는 항비듬 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 2에서 선택된 어느 하나의 펩타이드의 D 폼의 거울상 이성질체 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명의 상기 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 표피세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균, 항진균, 또는 항비듬균용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 그람양성균, 그람 음성균, 항생제 내성균주, 진균, 또는 비듬균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 미생물은 그람양성균은 B. subtilis, S. aureus, 또는 S. epidermidis이고, 그람 음성균은 E. coli, P. aeruginosa, 또는 S. typhimurium이며, 상기 항생제 내성균주는 반코아미신내성황색포도상구균(MRSA), 암피실린, 클로람페니콜, 그리고 트리메토프림 설파메톡사졸 배합제에도 내성을 보이는 다제내성 S. typhimurium(MDRST), 또는 항생제내성 대장균(MDREC)이며, 진균은 M. globosa, M. sympodialis, M. pachydermatis, M. sloofiae, M. dermatis, M. yamatoensis, 또는 Candida albicans이고, 비듬균은 Malassezia furfur인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 상기 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 면역유도시킨 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 면역화 유도후 cDNA 유전자 은행을 제작하여 기 보고된 항균 관련 유전자와 상동성이 높은 항진균 펩타이드 유전자를 선발하고, 프로태티아마이신 항균펩타이드의 아미노산 서열을 밝힌바 있다(대한민국 특허출원번호: 10-2008-0109281). 본 발명에서는 프로태티아마이신 항균펩타이드 helix영역의 아미노산 서열에 기반하여 높은 항생활성을 가져 특허 출원된 (특허출원번호: 10-2008-0111748) 9Pbw2와 9Pbw3의 잔기서열에 기반하여 이들의 거울상 이성질체(D form)인 펩타이드를 설계하여 인간의 세포에는 무독하고 높은 항균활성을 가지는 박테리아 선택적 유도체를 설계하고 항균, 항진균, 항비듬균 활성을 측정하여 인체의 항균, 항진균, 항비듬균치료제로 응용될 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 단계에 따라 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 분리된 항균펩타이드 프로태티아마이신 서열을 기반으로 한 2종의 유사체인 9Pbw2와 9Pbw3의 거울상 이성질체(D form)인 2종의 유사체를 합성하여 6종의 박테리아에 대한 항생활성을 검정하였다. 그 결과 9Pbw2, 9Pbw3, 9Pbw2D, 9Pbw3D 네 종의 펩타이드 모두 공시한 6종의 균들의 생장을 매우 효과적으로 억제하였다. 특히 거울상 이성질체(D form)인 9Pbw2D와 9Pbw3D 두 개의 유사체는 MIC분석 방법을 통해서 그람음성균인 P. aeruginosa를 제외한 5종균에 대해 대조군인 벌독유래 항균펩타이드 멜리틴과 보다 높은 항균활성을 나타나는 것을 확인하였다. 한편 항균 활성이 있는 상기 펩타이드들에 대해 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 적혈구의 파괴능을 조사한 결과, 9Pbw2D는 펩타이드 농도 100μM에서 0% 용혈활성을 보여 뛰어난 항균 활성을 가지면서도 세포 독성이 적은 높은 선택성을 보임을 확인할 수 있었고, 비교펩타이드인 9Pbw3는 25μM에서 10% 미만의 용혈활성을 보이나 그의 거울상이성질체인 9Pbw3D는 50μM에서도 5% 미만의 용혈활성을 가져 더 좋은 선택성을 가짐을 확인 할 수 있었다.

펩타이드	아미노산서열
서열번호1 :9Pbw2D	rlwlaikrr-NH2
서열번호2 :9Pbw3D	rlwlaiwrr-NH2
비교펩타이드서열번호3 : 9Pbw2	RLWLAIKRR-NH2
비교펩타이드서열번호4 : 9Pbw3	RLWLAIWRR-NH2

상기 표1은 기존 9Pbw2, 3로부터 항균 및 항진균, 항비듬균 활성이 증대되도록 설계된 D-amino acid를 가진 본 발명의 서열번호 1-2로 기재되는 고기능성 펩타이드 유도체 2종의 잔기서열과 비교펩타이드의 잔기서열이다.

우선, 본 발명의 항균 펩타이드 9Pbw2D, 3D가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드및 대조군 펩타이드에 대하여 그람-음성균 (3종류의 균주), 그람-양성균 (3종류의 균주), 진균(8종류의 균주)에 대하여 항균 및 항진균 활성을 측정하였다.

항균 및 항진균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 (minimal inhibitory concentration: MIC), 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, E. faecalis를, 그람 음성균으로써 Escherichia coli, Psedomonas aeruginosa, K. pneumoniae를, 진균으로써 Malassezia furfur (KCTC7743), M. globosa (KCTC7846), M. sympodialis (KCTC7985), M. pachydermatis (KTCT17008), M. sloofiae(KTCT17431), M. dermatis (KTCT17610), M. yamatoensis (KTCT17656)과 Candida albicans(KCTC7270)를 그 대상으로 하였다.

9Pbw2D, 3D 항생펩타이드들은 모두 대조군인 9Pbw2, 3 보다 월등한 항생활성을 나타냈다. 특히9Pbw2D, 3D는 대조군 펩타이드인 멜리틴과 비교했을 때 P. aeruginosa 를 제외한 5종균에 대해서 더 높은 활성을 보였으며 대조군 펩타이드인 9Pbw2, 3 보다 2~4배 정도 강한 항균활성을 나타내었다. (표 2 참조).

항생펩타이드 9Pbw2D, 3D들은 내성균주 9종에 대해서도 대조군인 9Pbw2, 3 보다 2~4배 뛰어난 항생활성을 나타냈다. 특히 9Pbw2D, 3D는 대조군 펩타이드인 멜리틴과 비교했을 때 더 높거나 비슷한 활성을 보였다. (표 3 참조).

9Pbw2D, 3D 펩타이드들은 칸디다균과 모든 말라세지아 균에서 대조펩타이드인 멜리틴과 9Pbw2, 3 보다 비슷하거나 높은 활성을 보였다. 특히나 9Pbw2D의 경우 모든 균에서 MIC값이 적게는 2~4배 이상 높은 항진균활성을 보였다. 비듬균으로 알려진 M. furfur에 대해서 아주 탁월한 억제 효과를 보여 비듬균 억제제 후보물질로 능력을 확인하였다.(표 4 참조).

본 발명의 항균 펩타이드 9Pbw2D, 3D의 숙주세포에 대한 독성을 조사한 결과 대조군인 멜리틴은 독성이 높은 반면 9Pbw2D는 고농도에서도 용혈활성을 나타내지 않았으며, 용혈활성이 25μM부터 나타나던 9Pbw3의 유도체인 9Pbw3D는 대조펩타이드와 비교했을 때 월등히 감소된 용혈활성을 나타내었다. (도 1 참조).

인간의 표피세포에 대해서 9Pbw2D, 3D 모두 활성을 가지는 농도에서 100% 의 생존률을 보였으며, 특히나 9Pbw2D는 100μM의 펩타이드 농도에서도 100%의 살아있는 것을 확인하여 인간의 표피세포에 대해서도 독성이 아주 적은 것을 확인하였다.(도 2 참조).

또한 도 3은 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아를 모방하는 음성지질인 PC/PG(7:3, w/w)리포좀(도 3a)과 인간의 적혈구를 모방하는 중성지질인 EYPC/CH (10:1, w/w)리포좀(도 3b)에 대해 본 발명의 펩타이드 9Pbw2D, 3D에 의한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이다.

멜리틴은 아주 저 농도에서도 100% 염료방출을 나타내 독성이 높으며, 발명펩타이드 중 9Pbw2D는 두 지질 조성에서 약한 염료방출을 나타내어 인간세포에 독성이 없으며, 박테리아세포막을 타겟으로 하지 않는 작용기작을 가짐을 알 수 있고, 9Pbw3D는 박테리아모방 조성에서는 강한 염료방출을 나타내는 반면, 인간 적혈구를 모방하는 중성지질에서는 염료방출을 거의 보이지 않아 박테리아에 선택적으로 작용하는 것을 알 수 있다.

또한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체로는 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산,중합체성아미노산, 및 아미노산 공중합체와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 펩타이드 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 0.001 내지 10 ㎎/㎏체중이고, 바람직하기에는 0.1 내지 1 ㎎/㎏ 체중이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 1, 및 2로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 항생 펩타이드를 첨가하여 이루어지는 사료는, 포유류, 조류,파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료로서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 사료는 개, 고양이, 쥐 등의 애완 동물용 사료, 소, 돼지 등의 가축용 사료, 닭, 칠면조 등의 가금용 사료, 도미, 방어 등의 양식어용 사료 등으로서 사용되고, 바람직하게는 애완 동물용 사료 또는 가축용 사료로서 사용된다.

본 발명의 사료는 사료 원료에 본 발명의 펩타이드를 적절하게 배합하여 만들 수 있다. 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.

곡물류로서는, 예를 들면 마이로, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수, 대두 등을 들 수 있다.

조강류로서는, 예를 들면 쌀겨, 탈지 쌀겨, 밀기울, 말분, 밀, 배아, 보리겨, 스크리닝, 펠렛, 옥수수겨, 옥수수 배아 등을 들 수 있다.

식물성 유박류로서는, 예를 들면 대두박, 콩가루, 아마박, 면실박, 낙화생 박, 홍화박, 야자박, 팜박, 호마박, 해바라기박, 유채박, 케이폭박, 겨자박 등을 들 수 있다.

동물성 사료 원료로서는, 예들 들면 어분(북양 밀, 수입 밀, 홀 밀, 연안 밀), 피쉬솔불, 육분, 어골분, 혈분, 분해모, 골분, 가축용 처리 부산물, 페더 밀, 누에, 탈지 분유, 카제인, 건조 유장 등을 들 수 있다.

그 밖의 사료 원료로서는 식물 경엽류(알팔파, 헤이큐브, 알팔파잎 분말, 유사 아카시아 분말 등), 옥수수 가공 공업부산물(콘 글루텐, 밀, 콘 글루텐 피드, 콘스테이프리카 등), 전분 가공품, 설탕, 발효 공업 산물(효모, 맥주박, 맥아근,알코올박, 장유박 등), 농산 제조 부산물(감귤 가공박, 두부박, 커피박, 코코아박 등), 그 외(카사바, 잠두콩, 구아밀, 해조, 크릴, 스피룰리나, 클로렐라, 광물 등) 등을 들 수 있다.

정제품으로서는 단백질(카제인, 알부민 등), 아미노산, 당질(전분, 셀룰로오스, 슈크로우스, 글루코오스 등), 미네랄,비타민 등을 들 수 있다.

본 발명의 동물용 사료를 동물에게 일상적으로 섭취시킴으로써 병원성 미생물에 대한 감염 등을 예방할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 펩타이드의 a-helix 영역의 잔기서열을 기반으로 설계된 펩타이드 9Pbw2, 9Pbw3의 거울상이성질체(D form) 2종의 항생펩타이드의 서열을 제공한다. 이들은 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내고, 항균활성이 탁월함과 동시에 세포독성을 전혀 가지지 않는 박테리아 선택성이 탁월한 항생 펩타이드이다. 또한 항진균활성이 탁월하며 비듬균으로 알려진 Malassezia furfur의 생장을 효과적으로 억제함으로서 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드는 항균, 항진균 활성을 가지는 농도에서 세포독성을 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제, 항진균지, 항비듬균제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1~2 항생 펩타이드를 인간의 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 용혈활성을 % hemolysis로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (용혈활성을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.
도 2는 서열번호 1~2 항생 펩타이드를 인간의 각질형성세포(HaCaT cell) 에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survival rate로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.
도 3은 서열번호 1~2 항생 펩타이드에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨, 박테리아 세포를 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w) 리포좀(3a)과 인간적혈구를 모방하는 EYPC/CH (10:1, w/w)리포좀(3b)에 대한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군(세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 펩타이드들의 합성 및 분리정제

서열번호 1-4에 기재되는 항균 펩타이드들은 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다.

각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC)를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H₂O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다.

이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C_{18 ,} 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH₃CN (acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실시예 2: 항균활성의 측정

서열번호 1-4로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

그람-양성균(Gram-negative bacteria)로서는 한국생명공학연구원의 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)로부터 분양받은 그람 양성균으로써 Bacillus subtilis(KCTC 3068), Staphylococcus aureus(KCTC 1621), E. faecalis (KCTC 2011)를, 그람 음성균으로써 Escherichia coli (KCTC 1682]), Psedomonas aeruginosa (KCTC 1637), K. pneumoniae (KCTC 2242)를 그 대상으로 하였다. 세균수가 ml 당 2×10⁶ colony-forming units (CFUs)가 되도록 1% peptone으로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양 한 후 ELISA판독기 (Bio-Tek Instruments)로 620nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 최소성장억제농도 (MIC: minimal inhibitory concentration)를 결정한다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 멜리틴과 9Pbw2, 3를 사용하였다.

그 결과 9Pbw2D, 3D 두 개의 펩타이드 모두 대조군인 9Pbw2, 3보다 높은 항균활성을 가져 성공적으로 펩타이드 설계가 이루어졌음을 알 수 있었다. 또한 9Pbw2D, 3D는 Psedomonas aeruginosa균을 제외한 모든 균에 대해서 melittin보다도 높거나 비슷한 활성을 나타냈다.

이들에 대한 내성균주에 대한 활성을 측정하기 위해 서울여자대학교 Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes(CCARM) 내성균주은행에서 분양받은 MRSA ( CCARM3089 , 3090, 3108, 3114, 3126), MDRST(CCARM8003, 8007, 8009), MDREC(CCARM1229)에 대해 활성을 측정하였다.

그 결과 9Pbw2D, 3D 펩타이드는 표준균주에서의 항균활성과 마찬가지로 대조 항균펩타이드인 melittin보다 높거나 비슷한 항균활성을 가짐을 확인하였다.

최소 성장 억제 농도 MIC (μM)
펩타이드	E. coli	P. aeruginosa	S. typhimurium	B. subtilis	S. epidermidis	S. aureus
서열번호 1: 9Pbw2D	2	4	2	2	2	2
서열번호 2: 9Pbw3D	2	4	2	2	2	2
비교펩타이드 서열번호 3: 9Pbw2	4	16	4	8	4	8
비교펩타이드서열번호 4: 9Pbw3	8	16	16	8	8	8
Melittin	4	2	4	4	4	4

표 2는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

최소 성장 억제 농도 MIC (μM)
펩타이드	S. typhimurium 8003(R)	S. typhimurium 8007(R)	S. typhimurium 8009(R)	E. coli 1229(R)	S. aureus 3089(R)	S. aureus 3090(R)	S. aureus 3108(R)	S. aureus 3114(R)	S. aureus 3126(R)
서열번호 1: 9Pbw2D	4	4	4	2	2	2	2	2	2
서열번호 2: 9Pbw3D	4	4	4	4	2	1	2	4	2
비교펩타이드 서열번호 3: 9Pbw2	8	16	8	8	8	8	8	8	8
비교펩타이드서열번호 4: 9Pbw3	16	16	16	16	4	4	4	16	4
Melittin	4	8	4	4	4	4	2	4	4

표 3은 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

실시예 3: 항진균 및 항비듬균 활성의 측정

펩타이드의 항진균활성을 측정하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 칸디다균과 말라세지아의 곰팡이 균을 사용하였으며, 한국생명공학연구원의 Korean collection for Type Cultures(KTCT)로부터 분양받은 Malassezia furfur (KCTC7743), M. globosa (KCTC7846), M. sympodialis (KCTC7985), M. pachydermatis (KTCT17008), M. sloofiae(KTCT17431), M. dermatis (KTCT17610), M. yamatoensis (KTCT17656)과 Candida albicans(KCTC7270)를 대상으로 하였다.

칸디다균은 YM배지에서 24시간 동안 배양하였며, 말라세지아균은 1% 올리브유가 첨가된 Sabouraud dextrose배지에서 24시간 동안 배양한 후, 세포 농도를 hemocytometer를 이용하여 측정하여, 2Ｘ10⁴cells/ml이 되도록 1% peptone으로 희석한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 각각의 웰에 MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액을 첨가하여, MTT say 방법에 따라 ELISA Microplate Reade를 이용하여, 580nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 곰팡이에 대한 펩타이드의 최소생장억제농도(MIC: minimum inhibitory concentration)를 결정하였다.

대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 멜리틴과 9Pbw2, 3를 사용하였다. 또한 비듬 삼푸 치료제의 성분으로 알려진 시클로 피록시올아민과 케토코나졸과 함께 비교하였다. 그 결과 9Pbw2D, 3D 두 개의 펩타이드 모두 칸디다균과 모든 말라세지아 균에서 대조펩타이드인 멜리틴과 9Pbw2, 3 보다 비슷하거나 높은 활성을 보였다. 특히 9Pbw2D의 경우 모든 균에서 MIC값이 적게는 2~4배 이상 높은 항진균활성을 보였다. 비듬균으로 알려진 M. furfur에 대해서 시중에 널리쓰이는 화합물과 비교했을 때에도 아주 탁월한 억제 효과를 보여 비듬균 억제제 후보물질로 능력을 확인하였다.

최소 생장 억제 농도 MIC (μM)
펩타이드	Candida . albicans	M. pachydermatis	M. dermatis	M. sloofiae	M. yamatoensis	M. globosa	M. sympodialis	M. furfur
서열번호 1: 9Pbw2D	2	<0.06	2	0.25	0.5	1	0.5	0.5
서열번호 2: 9Pbw3 D	4	1	2	2	1	2	2	2
비교펩타이드 서열번호 3: 9Pbw2	2	2	4	1	2	2	4	2
비교펩타이드서열번호 4: 9Pbw3	4	2	8	4	>8.00	4	4	8
Melittin	4	1	4	2	1	2	4	4
ciclopirox olamine	-	100	50	100	200	100	200	200
ketoconazole	-	>10.00	>10.00	>10.00	>10.00	>10.00	>10.00	>10.00

표 4는 항진균 및 항비듬균 활성을 나타낸 표이다.

실시예 4: 용혈활성의 측정

서열번호 1-2로 표기되는 펩타이드들에 대하여, 사람의 적혈구 용혈활성을 통하여 세포독성 여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

사람의 적혈구(human erythrocytes)를 PBS(phosphate-buffered saline: 35 mM 포스페이트 완충용액/150 mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리 하는 것에 의하여 3회 세척한다. PBS로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 로딩한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간동안 배양한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트를 원심력 1000g로 5분간 원심분리 한다. 상층액 100㎕씩 취하여 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮긴 후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군 펩타이드로, 멜리틴과 9Pbw2 및 3를 사용하였다.

이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % hemolysis로서 수학식 1에 의하여 산출하였다. 여기서 A는 펩타이드 용액에서의 405 nm의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 405 nm의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 405 nm의 흡광도를 나타낸다. 이 때 대조군의 펩타이드로서 강한 용혈활성을 나타내는 항균 펩타이드로서는 멜리틴를 사용하였다.

[도 1]나타낸 바와 같이 서열번호 1로 표기되는 발명 펩타이드 9Pbw2D는 비교펩타이드 9Pbw2와 마찬가지로 고농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았고, 서열번호 2로 표기되는 발명 펩타이드 9Pbw3D는 비교펩타이드 9Pbw3보다 현저하게 감소된 용혈활성을 보임을 확인하여, 박테리아 활성은 증가하고, 용혈활성은 감소한 높은 선택성을 가지는 펩타이드임을 확인하였다.

실험예 5: 인간의 표피세포에 대한 독성측정

서열 1~2로 표기되는 펩타이드들에 대해 포유류 세포주에 대한 독성여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

인간의 표피세포 Haca T 세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bivine serum)을 포함하는 DEME (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양액으로 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2X10⁴ 세포수가 되도록 DEME배양액 100μL씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 펩타이드를 처리한지 않고 배양액만을 넣은 것으로 비교하였다. 세포가 분주된 플레이트를 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한 후, 배지를 제거한 플레이트에 100μM부터 2배의 농도로 희석한 펩타이드를 분주한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한다. MTT [3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20§¡씩을 플레이트 각 웰에 분주하고 37℃에서 4시간 동안 배양한다.

생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan에 100μL의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 처리한 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 측정하였다.

[도 2]에 나타난 바와 같이 9Pbw2,3 및 9Pbw2D, 3D 모두 활성을 가지는 농도에서 100% 의 생존률을 보였으며, 특히나 거울상이성질체인 본 발명 펩타이드들은 비교 펩타이드와 비교했을 때 독성이 더 낮아진 것을 확인하였다. 9Pbw2D는 100μM의 펩타이드 농도에서도 100%의 살아있는 것을 확인하여 인간의 표피세포에 대해서도 독성이 아주 적은 것을 확인하였다.

실험예 6: 박테리아세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 인공지질막에 대한 파괴능 측정

서열번호 1-2로 표기되는 펩타이드들의 항균작용이 박테리아세포막을 모방하는 음성지질과 인간의 적혈구 세포막을 모방하는 중성지질에 대해 박테리아셀 선택성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

Fluorescent dye (형광염료)인 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아 세포막을 모방하는 음성지질인 EYPC/EYPG(7:3, w/w)와 인간의 적혈구 세포막을 모방하는 중성지질인 EYPC/CH (10:1, w/w) LUVs (large unilamellar vesicle)의 리포좀을 제작하여 다음의 형광염료방출실험(dye leakage assay)을 행하였다.

일정 구성비로 구성된 인지질을 10mM/ml이 되도록 클로로포름(CHCl₃)에 녹인 다음, rotary evaporator로 클로로포름을 제거하고, 하룻밤 동안 동결건조 시킨다. 건조된 지질필름(lipid films)을 트리스-완충용액 (10mM Tris-HCl/ 0.1mM EDTA /150 mM NaCl / pH 7.4) 1ml에 calcein을 70mM이 되도록 녹인다. 리포좀 용액을 액체질소로 얼림-녹임(frozen-thaw)을 10번(ten cycles) 반복하여 행하고 polycarbonate 필터 (pore size가 100 nm인 필터를 두 장을 겹친것)로 장착된 LiposoFast extruder (Avestin, Inc. Canada)장치를 이용하여 10회 통과시켜서 칼세인을 포획한 LUVs를 제작한다. 다음은 Sephadex G-50 컬럼을 이용하여 LUVs에 포획되지 않은 free calcein을 제거 하고 calcein이 포획된 리포좀을 모은다. Spectrofluorimeter (Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, Japan)의 excitation wavelength을 490nm에 emission wavelength를 520nm에 맞춘다. 트리스-완충용액 3ml을 quartz cuvette (1cm path length)에 넣고 여기에 적당량의 LUVs 용액을 넣고, 10% Triton-X₁₀₀ 20μl를 넣어 형광세기(fluorescence intensity) 가 1000을 넘지 않도록 LUVs의 양을 조절한다. 위의 조건이 확립되면 LUVs에 펩타이드를 투여한다.

여기서 100 % dye leakage는 0.01 % Triton-X₁₀₀을 넣었을 때의 형광 세기로 표시한다. 여기서 EYPC 는 egg yolk 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine의 약어이다. CH는 콜레스테롤이다. 여기서 대조군의 펩타이드로서는 멜리틴과 서열번호 3, 4의 9Pbw2, 3를 사용하여 비교하였다.

[도 3]에서 나타낸 바와 같이 대조 펩타이드인 멜리틴은 펩타이드 농도증가에 따라서 박테리아세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 리포좀에 대해 낮은 농도에서도 거의 100 %에 가까운 칼세인 방출을 일으켰다. 그러나 발명 펩타이드 9Pbw2D, 3D는 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH (10:1, w/w) 리포좀에서는 거의 칼세인 방출 (calcein leakage)이 일어나지 않아 대부분의 균에 대한 MIC이상인 8μM에서도 거의 5 % 미만의 극히 적은 칼세인 방출을 일으켜 인간의 세포에 독성이 없을것임을 보였다. 반면에 9Pbw3는 8μM에서 50%의 염료방출을 나타내 독성이 있음 알 수 있었다. 또한 박테리아 세포막을 모방하는 리포좀에 대하여 9Pbw3D는 비교펩타이드인 9Pbw3보다 많은 양의 형광 염료를 높은 항균활성을 가짐과 동시에 박테리아세포 선택성이 높아 우수한 고기능성 항균펩타이드 후보물질이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 2에서 선택된 펩타이드의 D 폼의 펩타이드.
2. 제 1 항의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균, 항진균, 또는 항비듬균용 약학 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 표피세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균, 항진균, 또는 항비듬균용 약학 조성물.
4. 삭제
5. 제 2 항에 있어서, 상기 미생물은 그람양성균, 그람 음성균, 항생제 내성균주, 진균, 또는 비듬균인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균, 항진균, 항비듬균용 약학 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 그람양성균은 B. subtilis, S. aureus, 또는 S. epidermidis이고, 그람 음성균은 E. coli, P. aeruginosa, 또는 S. typhimurium이며, 상기 항생제 내성균주는 반코아미신내성황색포도상구균(MRSA), 다제내성 S. typhimurium(MDRST), 또는 항생제내성 대장균(MDREC)이며, 진균은 M. globosa, M. sympodialis, M. pachydermatis, M. sloofiae, M. dermatis, M. yamatoensis, 또는 Candida albicans이고, 비듬균은 Malassezia furfur인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균, 항진균, 항비듬균용 약학 조성물.
7. 삭제
8. 삭제

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