KR101465098B1

KR101465098B1 - 융합 항균펩타이드 ｐａｊｅ 및 이를 합성하는 방법

Info

Publication number: KR101465098B1
Application number: KR1020120085187A
Authority: KR
Inventors: 김성렬; 박승원; 구태원; 강우석; 최광호
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2014-11-25
Also published as: KR20140018689A

Abstract

본 발명은 융합 항균펩타이드 PAJE 및 이를 합성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE은 서열번호 3으로 표현되는 신규 물질로써, 그 합성방법은 서열번호 1로 표현되는 파필리오신의 아미노산 서열 중 1-7 아미노산 영역 및, 서열번호 2로 표현되는 젤레인의 아미노산 서열 1-8 아미노산 영역을 접합시켜 융합 항균펩타이드 PAJE를 합성하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 기존의 항균펩타이드보다 항균활성이 높은 융합 항균펩타이드 PAJE 및 이를 합성하는 방법이 제공된다.

Description

융합 항균펩타이드 ＰＡＪＥ 및 이를 합성하는 방법{CONVERGENCE ANTIBACTERIAL PEPTIDE PAJE AND PROCESS TO SYNTHESISIZE IT}

본 발명은 융합 항균펩타이드 PAJE 및 이를 합성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기존의 항균펩타이드보다 항균활성이 높은 융합 항균펩타이드 PAJE 및 이를 합성하는 방법에 관한 것이다.

페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨지고 있다.

곤충은 다양한 환경에서 생존하기 위해서 외부 미생물 및 바이러스의 침입에 효과적으로 대항할 수 있는 생체방어 시스템을 소유하고 있다. 즉, 고등동물이 지닌 후천적 면역인자와는 달리 무척추동물과 같은 세포성 면역과 체액성 면역반응을 포함하는 선천적 면역인자를 분비함으로써 자신을 효과적으로 보호하는 면역체계를 가지고 있다.

이와 같은 선천적 면역은 곤충을 포함한 무척추동물에 있어서 초기감염에 대한 효과적인 방어인자로 중요한 역할을 한다. 곤충의 선천성 면역반응에서 세포성 면역은 세균, 곰팡이, 선충을 포함한 원생동물에 대한 식균작용, 결절형성과 캡슐형성을 포함하며, 체액성 면역반응에서는 병원체의 침입으로 인해 다양한 종류의 단백질 및 펩타이드가 지방체 및 혈구세포에서 합성되어 혈림프로 분비되는데 이들은 병원체에 대한 강력한 방어인자로 이용된다.

이와 같이 곤충의 체액성 면역반응의 일환으로 분비되는 항균성 단백질 및 펩타이드들은 천연항생제로 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제에 대해서 이용 가능성이 높다.

이러한 곤충 유래 항병원성 단백질은 인간 및 가축의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

항균펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균펩타이드인 멜리틴(melittin)이나 세크로핀(cecropin)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파-나선형을 형성하는 구조이다.

현재까지 발견된 곤충의 항균단백질 및 펩타이드는 세크로피아나방에서 세크로핀이 최초로 보고된 이래 약 200여종이 곤충으로부터 분리되어졌는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다.

관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-1099558호(등록일: 2011년 12월 21일, 명칭: 호랑나비 유충에서 분리된 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드)와 대한민국등록특허 제10-1150281호(등록일: 2012년 05월 08일, 명칭: 파필리오신 하생펩타이드로부터 설계된 신규한 항균, 항염활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도)가 있다.

본 발명의 목적은 인체 및 동물에 발생하는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 개발을 위해서 기존의 항균펩타이드보다 항균활성이 높은 융합 항균펩타이드 PAJE 및 이를 합성하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE은 서열번호 3으로 표현되는 신규 물질이다.

상기 융합 항균펩타이드 PAJE는 상기 항균펩타이드 PAJE는 그램음성균, 그램양성균, 또는 캔디다를 유발하는 진균 중 어느 하나 이상에 대해 항균활성을 갖는 것으로써, 상기 그램 음성균은 대장균(E.coli), 폐렴막대균(K.pneumoniae), 녹농균(P.aeruginosa)이며, 그램 양성균은 포도상구균(S. aureus), 고초균(B. subtilis), 장내 구균(E. faecalis)이며, 상기 캔디다를 유발하는 진균은 캔디다 알비칸스(C.albicans)인 것이 특징이다.

상기의 융합 항균펩타이드 PAJE은 세균성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 사료용 조성물의 유효성분으로 포함된다.

본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 합성방법은 서열번호 1로 표현되는 파필리오신의 아미노산 서열 중 1-7 아미노산 영역 및, 서열번호 2로 표현되는 젤레인의 아미노산 서열 1-8 아미노산 영역을 접합시켜 융합 항균펩타이드 PAJE를 합성하는 것이 특징이다.

상기 파필리오신은 호랑나비 유충에서 분리되며, 상기 젤레인은 로얄제리에서 분리된 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 기존의 항균펩타이드보다 항균활성이 높은 융합 항균펩타이드 PAJE 및 이를 합성하는 방법이 제공됨으로써, 동물 성장촉진용 천연항생제, 세균성 질환 예방에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대되고, 사료 첨가제로도 개발 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 공간적 구조를 나타낸 도면이다.
R¹, S¹², K⁶, K¹⁰, K³, H¹⁴, K⁷: 소수성 잔여물(hydrophobic residues)
I¹¹, I⁴, L¹⁵, P⁸, F⁵, F⁹, W², I¹³: 친수성 잔여물(hydrophilic residues)
도 2는 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 항균활성을 나타낸 도면이다.
(A) 대장균(E. coli KACC 1039), (B) 포도상구균(S. aureus KACC 10196)
1: PAJE 160 ㎍/㎖
2: PAJE 80 ㎍/㎖
3: PAJE 40 ㎍/㎖
4: PAJE 20 ㎍/㎖
5: 젤레인(Jellerine) 160 ㎍/㎖
도 3은 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 처리시간에 따른 대장균(E. coli KACC 1039)에 대한 살균력을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 처리시간에 따른 황색포도상구균(S. aureus KACC 10196)에 대한 살균력을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 농도에 따른 살균력을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

본 발명은 기존의 항균펩타이드보다 항균활성이 높으며, 천연항생제로써 인체 및 동물에 발생하는 세균성 질환을 예방하거나 동물 성장촉진용 천연항생제 개발을 위한 목적으로, 기존에 보고된 곤충 유래 항균펩타이드(파필리오신 등)를 기반으로 크기, 소수성(hydrophobicity), 회전성(helicity), 플러스 전하(net positive charge)등을 고려하여 기존의 항균펩타이드보다 항균활성이 높은 새로운 융합 항균펩타이드를 개발한 것이며, 이를 "항균펩타이드 PAJE"라고 명명한다.

설명하면, 본 발명의 항균펩타이드 PAJE는 기존에 알려진 호랑나비 유충에서 분리된 파필리오신(Papiliocin)의 아미노산 서열을 토대로 나선 구조의 1-7 아미노산 영역과 로얄제리에서 분리한 젤레인(Jelleine)의 아미노산 서열 1-8 아미노산 영역을 접합시켜 새롭게 디자인한 것이다.

상기 항균펩타이드 파필리오신 유전자는 본 발명자가 선출한 "특허출원 10-2009-0019022 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드 유전자"인 것으로서, cDNA 전체 크기는 503bp이며, 94번째 염기에서 개시되어 283번째 위치에서 종결되는 암호화 영역을 가지는 62개의 아미노산으로 구성되어 있다.

상기 항균펩타이드 파필리오신의 아미노산 구조는 알파-헬릭스-힌지-알파-헬릭스로 구성된 전형적인 세크로핀류의 염기성 단백질이다.

본 발명에서는 이러한 파필리오신의 아미노산 서열 중 N말단 부위의 1-7 아미노산 영역(RWKIFKK)에 기존의 항균펩타이드로 많이 알려진 로얄제리에서 분리한 젤레인(Jelleine)의 아미노산 서열 1-8 아미노산 영역(PFKISIHL)을 접합시켜 기존의 항균펩타이드들 보다 높은 항균활성을 나타내는 새로운 형태의 항균펩타이드를 개발하게 된 것이다.

이와 같이 설계된 본 발명의 항균펩타이드 PAJE는 아미노산 서열이 RWKIFKKPFKISIHL으로총 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 분자량은 1939.5이다.

본 발명의 항균펩타이드 PAJE는 대장균(E.coli)등 그램음성 세균에서 젤레인에 비해 8배, 멜리틴에 비해 4배 이상의 탁월한 항균 활성을 나타내었고, 포도상 구균(S. aureus) 등 3종의 그램 양성 세균 및 캔디다증을 유발하는 진균(C. albicans)에서는 젤레인에 비해 4배 이상 증가된 활성을 나타냄이 확인되었다.

또한, 본 발명의 항균펩타이드 PAJE는 그램음성 및 그램양성 세균 모두에서 매우 높은 살균력 및 멜리틴과 유사한 살균 속도를 나타내는 것이 확인되었다.

세포독성 검정에서도 봉독 유래의 항균펩타이드인 멜리틴은 적혈구에 대하여 높은 용혈 활성을 나타내는 반면, 본 발명의 항균펩타이드 PAJE는 용혈 활성을 전혀 나타내지 않음을 확인한바, 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 인체에 무해하면서 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물 또는 사료용 조성물로 유용하게 이용가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

이때, 상기 약학적 조성물로 사용할 경우에는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 함유될 수도 있는데, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하며, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

이러한 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE를 사료용 조성물의 유효성분으로 사용할 경우, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료용 조성물로 사용된다.

이러한 사료용 조성물은 사료 원료에 적절하게 배합하여 사료로 제공되는데, 이때, 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.

특히, 본 발명의 항균펩타이드 PAJE가 함유된 동물용 사료를 동물에게 일상적으로 섭취시킬 경우 병원성 미생물에 대한 감염 등을 예방할 수도 있게 된다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명은 기존에 알려진 호랑나비 유충에서 분리된 파필리오신(Papiliocin)의 아미노산 서열을 토대로 N말단 나선 구조의 1-7 아미노산 영역인 RWKIFKK와 로얄제리에서 분리한 젤레인(Jelleine)의 아미노산 서열 1-8 아미노산 영역인 PFKISIHL을 접합시켜 새로운 융합 항균펩타이드 PAJE룰 디자인하였다(도 1).

상기 설계된 융합 항균펩타이드 PAJE는 자동화된 고체상 펩타이드 합성기(Pioneer Apploed Biosystems)를 이용하여 메리필드(Merrifield) 액상 고상법으로 합성하였다.

또한, 대조구로 사용된 젤레인 및 멜리틴(melittin) 펩타이드들도 상기의 방법으로 합성하였다.

제조된 펩타이드들은 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 역상(reverse phase)-HPLC 칼럼을 이용하여 정제하고 그 순도를 확인하였으며, 그 결과 95% 이상의 순도를 나타냄을 확인하였다.

또한, MALDI 질량 분석법을 이용하여 펩타이드들의 아미노산 서열과 그 특성을 확인하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 나타났다.

펩타이드 (peptide)	아미노산서열 (Amino acid Sequence)	전극 (Net charge)	소수성 (Hydro-phobicity, %)	분자량 (Molecular mass)
펩타이드 (peptide)	아미노산서열 (Amino acid Sequence)	전극 (Net charge)	소수성 (Hydro-phobicity, %)	Calculated	Observed
젤레인 (Jelleine-1)	PFKISIHL-NH₂	+1	50	954.2	952.8
본발명의 PAJE	RWKIFKKPFKISIHL-NH₂	+5	46	1941.4	1939.5
멜리틴 (Melittin)	GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH₂	+5	38	2847.5	2845.8

상기 표 1에 나타나 있듯이, MALDI 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로 계산하여 얻은 분자량과 일치함을 확인하였다.

이에 정확한 융합 항균펩타이드 PAJE가 합성되었음을 확인하였으며, 상기 PAJE의 아미노산 서열은 서열번호 3과 같이 RWKIFKKPFKISIHL-NH₂로 총 15개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 전극과 소수성 아미노산 잔기가 감소된 특성을 갖고 있음이 확인되었다.

<실시예 2> 본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE의 항균활성 측정

실시예 2에서 합성된 융합 항균펩타이드 PAJE에 대한 항균 활성을 측정하기 위해, 방사상 확산 분석(Radial Diffusion Assay)방법과 최소성장저해농도(Minimum Inhibitory Concentration)방법을 이용하였다.

1. 실험방법

(1) 각종 균주의 배양조건

항세균 활성분석(antibacterial assays)에 사용한 그램음성 세균(Escherichia coli KACC1039, Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas aeruginosa) 및 그램양성 세균(Staphylococcus aureus KACC10196, Bacillus subtilis , Enterococcus faecalis ) 들은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4 x 10⁶CFU/ml 농도가 되도록 2시간 30분 동안 2차 배양하였다.

진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 진탕배양한 후 사용하였다.

(2) RDA분석을 통한 항균 활성 검정

상기 준비해둔 균주 중 그램음성 세균으로 대장균(E. coli KACC1039)과 그램양성 세균으로 포도상구균(S.aureus KACC10196)를 대상으로 항균활성을 검정하였다.

먼저, 멸균된 RDA용 언더레이 겔(underlay gel)(9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH7.4, 1% low electroendosmosis agarose, 0.03% TSB)에 상기 배양해둔 대장균과 포도상구균을 각각 4 X 10⁶CFU/ml씩을 혼합하여 100mm 사각플레이트에 부어 굳혔다.

언더레이 겔에 지름 3mm의 구멍을 내어 여러 농도별로 준비한 융합 항균펩타이드 PAJE(20, 40, 80, 160 ㎍/㎖)를 각각 10㎕씩 구멍에 넣었고, 젤레인 펩타이드도 대조구(160 ㎍/㎖)로 사용하기 위해 10㎕를 구멍에 넣었다.

펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, 그 위에 RDA용 오버레이 겔(overlay gel)(6% TSB, 1% 아가로오스)을 부어 굳힌 다음 37℃에서 18시간 동안 배양하였다.

항균활성력은 세균이 자라지 못해 생기는 클리어 존(clear zone)의 크기로 확인하였다.

(3) MIC분석을 통한 항균 활성 검정

본 발명의 융합 항균펩타이드 PAJE에 대한 각종 세균의 최소성장저해농도(MIC)를 측정하기 위하여 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액(2×10⁵CFU/ml)을 넣고 융합 항균펩타이드 PAJE를 10㎕를 첨가하였다.

대조구로 젤레인과 멜리틴을 각각 10㎕를 첨가하였다.

37℃에서 18시간 배양한 후, 분광 광도계(595nm)에서 흡광도를 측정하여 융합 항균펩타이드 PAJE에 의한 세균의 생장억제 정도를 관찰하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 2와 하기 표 2와 같이 나타났다.

(1) RDA분석을 통한 항균 활성결과

도 2에 나타나 있듯이, PAJE은 대조구로 사용한 젤레인(160㎍/㎖)보다 탁월한 항균활성을 나타내었다.

또한, 20㎍/㎖의 낮은 농도에서도 대장균과 포도상구균의 병원균이 자라지 못해 생기는 클리어 존이 확인되었으므로, PAJE는 항균활성을 갖고 있음을 알 수 있었다.

(2) MIC분석을 통한 항균 활성결과

균주(Microorgaism)	최소성장억제농도 Minimum Inhibitory Concentration(MIC, μM)
균주(Microorgaism)	젤레인 Jelleine-1	항균펩타이드 PAJE	멜리틴 Melittin
그램음성세균 (Gram negative bacteria)
대장균 (E. coli KACC1039)	8	1	4
폐렴막대균 (K. pneumoniae)	8	1	4
녹농균 (P. aeruginosa)	8	1	4
그램양성세균 (Gram positive bacteria)
포도상 구균 (S. aureus KACC10196)	16	4	1.5
고초균 (B. subtilis)	4	1	1.5
장내 구균 (E. faecalis)	16	4	2
효모 곰팡이균 (Yeast fungi)
캔디다증을 유발하는 진균 (C. albicans)	16	4	2

상기 표 2에 나타나 있듯이, PAJE은 그램음성 장내세균인 대장균(E. coli), 페렴막대균(K. pneumoniae) 및 녹농균(P. aeruginosa)에서 최소성장억제농도가 1μM로 젤레인에 비해 8배 이상의 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 벌독 유래의 항균펩타이드인 멜리틴과 비교에서도 4배 이상의 탁월한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.

한편 포도상 구균(S. aureus) 등 3종의 그램 양성 세균 및 캔디다증을 유발하는 진균(C. albicans)에서도 젤레인에 비해 4배 이상의 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 3> 융합 항균펩타이드 PAJE의 처리시간 및 농도에 따른 살균력 측정

1. 실험방법

시간-살균 곡선 분석(Time-kill curve assay)을 통하여 합성 펩타이드의 대장균 및 포도상 구균에 대한 살균속도 및 펩타이드 농도에 따른 살균 활성을 측정하였다.

구체적으로, 각 균주들을 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 최종농도가 1 x 10⁷CFU/ml 농도가 되도록 2차 배양한 다음, 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액을 넣고 융합 항균펩타이드 PAJE 10㎕를 첨가하였다.

일정한 시간이 지날 때마다 배양액을 희석한 다음 LB 고체배지에 도말하였다.

37℃에서 배양기에 18 ~ 24시간 배양시킨 후 생존된 콜로니(colony) 숫자를 파악하여 펩타이드 처리 시간별 CFU를 측정하였다.

또한, 항균펩타이드 PAJE 농도에 따른 살균 활성을 측정하기 위해서 여러 농도로 희석된 항균펩타이드 PAJE를 세균 배양액(1×10⁷CFU/ml)에 첨가하였다.

1시간 배양한 다음 LB 고체배지에 도말하여 상기와 동일한 방법으로 생존한 세균 수를 측정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 3에 나타나 있듯이, 항균펩타이드 PAJE는 매우 높은 살균력을 보였으며 강력한 항균펩타이드로 알려진 멜리틴과 유사한 살균 속도를 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타나 있듯이, 농도에 따른 살균 활성을 측정한 결과 항균펩타이드 PAJE는 16㎍/㎖ 이상의 농도에서 대장균을 1 시간내에 거의 99.9% 치사시킴을 확인하였고, 포도상구균에서는 16~32㎍/㎖ 처리농도에서 1시간 배양시 약 50%의 치사율을 나타낸 것이 확인됨으로써 항균펩타이드 PAJE는 높은 살균력을 갖고 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4> 융합 항균펩타이드 PAJE의 세포 독성 측정

융합 항균펩타이드 PAJE에 대한 세포독성 여부를 판별하기 위하여 인간 적혈구 용혈 활성을 측정하였다.

1. 실험방법

사람의 적혈구를 PBS(Phosphate-Buffered Saline: 35mM 포스페이트 완충용액/150mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)로 희석한 후 원심력 1000g으로 10분간 원심분리를 통하여 3회 세척하였다.

PBS로 희석한 8% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다.

96-웰 마이크로적정 플레이트를 1000g, 5분간 원심분리하여 상층액을 취한 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한 대조구로 멜리틴을 상기 펩타이드와 동일한 조건으로 처리하여 사용하였다.

0.1% 트리톤(triton) X-100을 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % 용혈활성(Hemolysis)으로 수학식 1에 의하여 산출하였다.

<수학식 1>

세포파괴 정도(% Hemolysis) = (A-C/ B-C) X 100

상기 수학식에서 A는 펩타이드 용액에서의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 흡광도를 나타낸다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 하기 표 3과 같이 나타났다.

펩타이드 peptide	용혈활성 % Hemolysis(μＭ)
펩타이드 peptide	50	12.5	6.25	3.125	1.56	0.78
PAJE	0	0	0	0	0	0
Melittin	100	100	100	95	93	31

상기 표 3에 나타나 있듯이, 높은 용혈 활성을 가지는 멜리틴에 비해 PAJE는 고농도에서도 용혈 활성을 나타내지 않았다.

따라서 인체에 독성이 없이 무해한 항균펩타이드로서 그 안정성이 확인되었다.

이와 같이 본 발명에 의해, 인체 및 동물에 발생하는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 개발이 가능해짐으로써, 동물 성장촉진용 천연항생제, 세균성 질환 예방에 유용하게 이용되거나, 사료 첨가제로도 사용 가능하게 됨을 알 수 있다.

<110> MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> RECOMBINATION ANTIBACTERIAL PEPTIDE PAJE AND PROCESS TO SYNTHESISIZE IT <130> 2012-0167-10-A <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> papiliocin <400> 1 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Ala Thr Val Val Lys 35 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> jellerine <400> 2 Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> peptide PAJE <400> 3 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 1 5 10 15

Claims

서열번호 3으로 표현되는,
융합 항균펩타이드 PAJE.
청구항 1에 있어서,
상기 항균펩타이드 PAJE는 그램음성균, 그램양성균, 또는 캔디다를 유발하는 진균 중 어느 하나 이상에 대해 항균활성을 갖는.
융합 항균펩타이드 PAJE.
청구항 2에 있어서,
상기 그램 음성균은 대장균(E.coli), 폐렴막대균(K.pneumoniae), 녹농균(P.aeruginosa)이며, 그램 양성균은 포도상구균(S.aureus), 고초균(B.subtilis), 장내 구균(E.faecalis)이며, 상기 캔디다를 유발하는 진균은 캔디다 알비칸스(C.albicans)인 것을 특징으로 하는,
융합 항균펩타이드 PAJE.
삭제
청구항 1의 융합 항균펩타이드 PAJE를 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물.
서열번호 1로 표현되는 파필리오신의 아미노산 서열 중 1-7 아미노산 영역; 및,
서열번호 2로 표현되는 젤레인의 아미노산 서열 1-8 아미노산 영역을 접합시켜 융합 항균펩타이드 PAJE를 합성하는,
융합 항균펩타이드 PAJE의 합성방법.
청구항 6에 있어서,
상기 파필리오신은 호랑나비 유충에서 분리된 것이 특징인,
융합 항균펩타이드 PAJE의 합성방법.
청구항 6에 있어서,
상기 젤레인은 로얄제리에서 분리된 것이 특징인,
융합 항균펩타이드 PAJE의 합성방법.