KR102243335B1

KR102243335B1 - 흰점박이꽃무지 유래 항균 펩타이드인 프로테티아마이신-3 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102243335B1
Application number: KR1020190148662A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 김인우; 김미애; 서민철; 김선영; 김성현; 이준하
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-04-23

Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지로부터 유래한 신규한 항균 또는 항진균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흰점박이꽃무지로부터 유래한 프로테티아마이신-3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로테티아마이신-3은 항균 및 항진균 효과가 우수하며 세포 독성이 없는바, 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용될 수 있다.

Description

흰점박이꽃무지 유래 항균 펩타이드인 프로테티아마이신-3 및 이의 용도{Antimicrobial peptide, Protaetiamycine 3 derived from protaetia brevitarsis seulensis and uses thereof}

본 발명은 흰점박이꽃무지로부터 유래한 신규한 항균 또는 항진균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흰점박이꽃무지로부터 유래한 프로테티아마이신-3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물에 관한 것이다.

페니실린 이후 많은 항생제들이 개발되어 생체 외부로부터 침입한 세균 퇴치에 사용되어 왔지만, 최근 항생제의 오남용으로 인해 항생제 내성균이 급격히 증가하고 있다. 이러한 항생제 내성균에 의한 질병을 치료하기 위해 많은 신규 항생제가 개발되고 있으나 항생제 대부분은 기존의 항생제와 유사한 작용 기전을 가지며, 항생작용 후 분해되지 않고 체내에 잔류함으로써 지속적인 항생제 내성 문제를 일으키고 있다. 또한 기존의 항생제는 내성을 유발할 뿐만 아니라, 비특이적인 항균작용으로 정상세균총을 파괴하여 다른 질병의 원인이 된다. 특히 항생제 복용으로 인한 장내 정상세균총의 파괴로 발생하는 항생제 연관 장염(Clostridium difficile infection, CDI)은 대표적인 항생제의 부작용으로 떠오르고 있으며, 화상 치료에 사용되는 광범위 항생제 역시 피부 정상세균총을 억제하여 곰팡이 감염의 원인이 된다. 따라서 기존의 항생제를 대체할 새로운 패러다임의 감염 치료제 개발이 절실한 실정이며, 기존의 문제점을 해결할 수 있는 방안으로 항균 펩타이드가 주목 받고 있다.

항균 펩타이드는 자연면역체계(innate defense system)의 하나로 모든 생물체가 가지고 있는 10~50개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드로서 생물체가 병원균에 감염되었을 때 1차 방어물질로 작용한다. 항균 펩타이드는 전체적으로 양전하 (+2~+9)를 띠며, 30% 정도의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다. 이러한 특징으로 인해 항균 펩타이드는 음전하를 띤 세균 세포막과 접촉한 뒤 양친성 α-나선구조 (amphipathic α-helix) 혹은 β-병풍구조 (β-sheet)를 형성하여 세포막 속으로 끼어 들어가 세포막의 전위를 변화시키거나 세포막 자체에 구멍을 내어 세포막을 파괴함으로써 세균을 죽인다. 또한 일부 항균 펩타이드는 세포 내로 들어간 다음 세포 내 타겟을 공격하여 세포 기능을 마비시킴으로써 항균 활성을 나타낸다. 그러므로 항균 펩타이드는 특정 수용체를 타겟으로 하는 기존의 항생제에 비해 내성을 유발할 가능성이 현저히 낮다. 또한 항균 펩타이드는 신속한 작용 기전, 기존 항생제 내성균에 작용, 항 내독성 (anti-endotoxicity) 등의 특징을 가지고 있어 신규 감염치료제로서 개발하기에 적합하다.

한편, 곤충들은 살아가는 환경에 적응하고 생존하기 위해서 그들만의 특별한 생리조절 기전 및 물질들을 확보하는 방향으로 진화해 왔는데, 최근 곤충의 생리활성 물질들을 이용한 새로운 약물후보물질 개발 연구가 활발히 진행되고 있다[Insect Biochem. Mol. Biol. 41, 747-769].

본 발명자들은 곤충 유래 항균 펩타이드에 대한 연구를 계속하던 중, 흰점박이꽃무지로부터 유래한 신규한 펩타이드인 프로테티아마이신-3이 항균 및 항진균 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 항균/항진균 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 또는 항진균 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 식품 방부제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 화장품 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 의약품 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 흰점박이꽃무지로부터 신규하게 분리한 펩타이드인 프로테티아마이신-3은 항균 및 항진균 효과가 우수하며 세포 독성이 없는바, 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 프로테티아마이신-3의 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균에 대한 항균 및 항진균 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 프로테티아마이신-3이 랫트 적혈구 세포에 미치는 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 또는 항진균 펩타이드를 제공한다. 상기 서열번호 1은 다음과 같이 표시된다.

STLTKTKKPNFKWKGIKKIFKKKKEALAS

본 발명에서 용어, “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성 기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항균 또는 항진균 펩타이드는 흰점박이꽃무지로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, “흰점박이꽃무지(protaetia brevitarsis seulensis)”는 딱정벌레목 꽃무지과의 곤충으로, 몸 길이는 17~22mm이며 몸은 광택이 강한 녹갈색이나 구릿빛 또는 붉은빛을 띠는데 녹색, 남색, 흑남색, 흑자색 등의 변이도 있다. 후경절 안쪽의 털은 회갈색이다. 후경절 안쪽의 털은 회갈색이며, 중흉돌기의 끝은 은행모양이고, 딱지날개의 끝은 뾰족하게 돌출하였다. 수컷의 복부복판은 길이로 패였다. 교미구는 가는 직선형이며, 내판은 좁고 긴데 끝에 둥글게 돌출한 부분이 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 항균력이 감소하지 않는 한, 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열에 아미노산이 추가 또는 결실된 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 흰점박이꽃무지로부터 신규한 펩타이드를 분리하고, 이를 프로테티아마이신-3으로 명명하였으며, 상기 펩타이드가 그람음성균 및 그람양성균에 대해 항균 활성 및 진균에 대한 항진균 활성이 우수함을 확인하였다.

본 발명에서 용어, “그람음성균”은 그람염색법으로 염색했을 때 적색으로 염색되는 세균으로, 그람음성균의 세포벽은 얇고(약 10nm) 외측에 다량의 리포폴리사카라이드(LPS)를 함유하고 있는 것이 대부분이다. 상기 그람음성균에는 예를 들어, 에스케리아(Escherichia) 속, 슈도모나스 속(Pseudomonas), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira), 리케치아 속(Rickettsia) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 그람음성균의 대표 균주로 대장균(Escherichia coli)을 이용하였다.

본 발명에서 용어, “그람양성균”은 그람염색법으로 염색했을 때 세포벽이 보라색으로 염색되는 세균으로, 세포벽이 여러겹의 펩티도글리칸으로 구성되어 있다. 상기 그람양성균에는 예를 들어, 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 바실러스 속(Bacillus), 프로피온박테리움 속(Propionibacterium) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 그람양성균의 대표 균주로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 이용하였다.

상기 그람음성균 및 그람양성균은 항생제 내성균일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “진균”은 곰팡이, 효모, 버섯을 포함하는 미생물 군을 의미하는 것으로, 핵막이 있는 진핵생물에 속한다. 본 발명의 일 실시예에서는 진균의 대표 균주로 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 이용하였다.

일 양태로써, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 항균 또는 항진균용 조성물은 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항균 또는 항진균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 식품첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다. 구체적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균 목적으로 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.

이에 본 발명의 항균 또는 항진균용 조성물은 약학적 조성물인 항생제, 식품 방부제, 화장품 첨가제, 의약품 첨가제 또는 사료 첨가제의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 항균 또는 항진균용 조성물은 상기 펩타이드와 함께 항균 또는 항진균 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 항균 또는 항진균용 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분양의 적정한 방법으로 또는 Remington’s Pharmaceutical Science(최근 판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 항균 또는 항진균용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 펩타이드의 일일 투여량은 2~10 mg/kg이나 임상결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

다른 양태로써, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

상기 항생제는 약제 형태로 개체에 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 살균제 및 항균제 등과 혼용되어 사용될 수 있다.

다른 양태로써, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 식품 방부제를 제공한다.

본 발명의 항균 또는 항진균용 식품 방부제는 공지의 식품 방부제 중 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 식품 방부제로는 데히드로초산, 소르빈산칼륨, 소르빈산칼슘, 안식향산나트륨, 안식향산칼륨, 안식향산칼슘, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 프로피온산나트륨, 프로피온산칼슘 등이 사용되고 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항균 또는 항진균용 식품 방부제는 상기 펩타이드를 식품 방부제 총 중량에 대해 0.01 ~ 1 중량% 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 양태로써, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 화장품 첨가제 또는 의약품 첨가제를 제공한다.

본 발명의 항균 또는 항진균용 화장품 첨가제 또는 의약품 첨가제는 화장품 또는 의약품의 보존을 위해 이용되는 것을 의미한다.

상기 화장품 첨가제는 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 화장품 첨가제는 상기 펩타이드 외에 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다. 또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 상기 펩타이드를 첨가한 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 또한 화장품 첨가제에 사용되는 부형제로서 알부틴(arbutin), 코직산(kojic acid), 루시놀(rucinol), 비타민 C(vitamin C) 및 비타민 C 유도체 등을 추가로 함유할 수 있으며, 주름개선 효과를 목적으로 레티놀(retinol) 및 그 유도체, 인돌아세트산(indol acetic acid) 및 그 유도체, 아데노신(adenosin), 토코페롤(tocoperol) 및 그 유도체, 카이니틴 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 부형제에는 화장품 첨가제에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 항균 또는 항진균용 화장품 첨가제에는 상기 펩타이드를 화장품 첨가제 총 중량에 대해 0.01 ~ 1 중량%를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 양태로써, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제는 사료 원료에 적절하게 배합하여 사료로 제공되는데, 상기 사료 원료로 곡물유, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등이 사용되고 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 사료는 본 발명의 펩타이드 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 포함될 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 흰점박이꽃무지 유래 항균 또는 항진균 펩타이드 선발

흰점박이꽃무지로부터 항균 또는 항진균 활성을 나타내는 펩타이드를 선별하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 흰점박이꽃무지를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 RNA-seq 분석법을 이용하여 흰점박이꽃무지 전사체에 관한 유전자 정보를 확인하였다. 기존에 공지된 항균 펩타이드 성질을 이용하여 각각의 유전자들로부터 번역된 아미노산의 서열을 대상으로 전체를 필터링 하였으며 새로운 항균 또는 항진균 펩타이드로 예상되는 펩타이드를 선별하였다.

선별된 아미노산 서열은 STLTKTKKPNFKWKGIKKIFKKKKEALAS로 29개 아미노산으로 구성되었으며 이를 프로테티아마이신-3(Protaetiamycin-3)으로 명명하였다(표 1).

펩타이드	아미노산 서열
프로테티아마이신-3	STLTKTKKPNFKWKGIKKIFKKKKEALAS-NH₂

실시예 2. 프로테티아마이신 -3 합성 및 분리 정제

상기 실시예 1에서 선별한 흰점박이꽃무지로부터 유래한 프로테티아마이신-3 펩타이드를 합성 및 분리 정제하였다.

이를 위해, Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)을 사용하여 펩타이드를 제조하였다. 상기 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 Nα-아미노 그룹(amino group)의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실 말단이 -NH2 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 DCC(N-hydroxybenzo-triazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H2O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC(reverse phase-HPLC) 컬럼(Delta Pak, C18 300Å, 15μ, 19.0 mm×30, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

또한 합성된 펩타이드의 시퀀스(sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다.

그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 프로테티아마이신-3이 합성되었음을 확인하였다. 이를 이후 실험에 이용하였다.

실험예 1. 병원성 미생물에 대한 항균 및 항진균 활성 측정

상기 실시예 1에서 선별된 프로테티아마이신-3의 항균 및 항진균 활성을 확인하기 위하여, RDA(radial diffusion assay)를 수행하였다. 프로테티아마이신-3은 사용 전까지 -20℃에 보관하였으며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

1-1. 항균 활성 측정

먼저 박테리아 중에서 그람음성균의 대표적인 균주인 대장균(Escherichia coli), 그람양성균의 대표적인 균주인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 이용하였다. 상기 균주를 각각 3 %(w/v) TSB(tryptic soy broth) 배지에 넣은 후, 37℃, 200rpm 조건에서 18시간동안 배양하였다. 다시 동일한 조건에서 2시간 30분간 2차 배양하고 600nm에서 흡광도를 측정하여 4×10⁶ CFU(colony forming units)가 되도록 하였다. 그 후 100 mM 소디움 포스페이트/시트레이트 버퍼(9 mM sodium phosphate, 1 mM sodium citrate, pH7.4)와 1%(w/v) type Ⅰelectroendosmosis) 아가로스(agarose), 0.03 % TSB로 구성된 멸균된 언더레이 아가(underlay agar)에 배양된 균주(4×10⁶CFU)를 넣고 혼합한 뒤 사각플레이트에 부었다. 언더레이 아가가 굳으면 지름 3 mm의 구멍을 내어 농도별로 희석한 프로테티아마이신-3을 5㎕씩 구멍에 첨가하였다.

펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간동안 배양한 후, 멸균된 오버레이 아가(overlay agar; 6 % TSB, 1 % agarose) 10 ml을 붓고 37℃에서 다시 배양하여 클리어 존(clear zone)의 형성 여부를 확인하였다. 직경 측정 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 흰점박이꽃무지로부터 유래한 프로테티아마이신-3 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균 모두에 대한 항균 활성이 있음을 확인하였으며 이는 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

1-2. 항진균 활성 측정

병원성 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 이용하였다. 상기 균주를 YPD 배지(1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % dextrose)에 넣은 후, 30℃, 200 rpm 조건에서 밤새 배양하고, 이를 새 배지에 접종한 후 다시 3시간동안 배양하여 대수기가 되도록 하였다. 그 후 100 mM 소디움 포스페이트/시트레이트 버퍼(9 mM sodium phosphate, 1 mM sodium citrate, pH7.4)와 1%(w/v) type I (low electroendosmosis) agarose, 0.03% TSB로 구성된 멸균된 언더레이 아가에 배양된 세균(4×10⁶ CFU/ml)을 넣고 혼합해준 뒤 사각플레이트에 부었다. 언더레이 아가가 굳으면 지름 3 mm의 구멍을 내어 농도별로 희석한 프로테티아마이신-3을 5㎕씩 구멍에 첨가하였다.

펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간동안 배양한 후, 멸균된 오버레이 아가(6 % TSB, 1 % agarose) 10 ml을 붓고 37℃에서 다시 배양하여 클리어 존(clear zone)의 형성 여부를 확인하였다. 직경 측정 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 흰점박이꽃무지로부터 유래한 프로테티아마이신-3 펩타이드는 병원성 진균인 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 활성이 있음을 확인하였으며 이는 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

상기 실험을 통해 본 발명에 따른 프로테티아마이신-3이 유해 균주에 대한 항균제 및 항진균제로서 활용될 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2. 세포 독성 측정

상기 실시예 1에서 선별된 프로테티아마이신-3의 세포독성을 조사하기 위해 랫트 적혈구 세포 (rat erythrocytes)를 이용하였다. 프로테티아마이신-3은 사용 전까지 -20℃에 보관하였으며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

먼저, 적혈구 세포(rat erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 5.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그런 다음, 5.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후에 본 발명에 따른 펩타이드를 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다. 이어서 모든 튜브에 총액의 양이 200 ㎕가 되도록 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS)을 넣어주고, 37℃ 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 96 웰 플레이트로 옮겼다. 적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 550 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다. 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다.

이때 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

[수학식 1]

% 파괴능 = (펩타이드를 처리한 용액의 흡광도 550 nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도 550 nm)/(트리톤 X-100을 처리한 용액의 흡광도 550 nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도 550 nm) * 100

도 2에 나타낸 바와 같이, 흰점박이꽃무지로부터 유래한 프로테티아마이신-3 펩타이드는 최대 200 ug/ml까지의 농도까지 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 프로테티아마이신-3이 세포 독성이 없는 상태에서 항균 및 항진균 활성을 나타냄을 의미하는바, 안전한 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 등으로 사용가능함을 제시한다.

종합적으로, 본 발명자들이 흰점박이꽃무지로부터 신규하게 분리한 펩타이드인 프로테티아마이신-3은 항균 및 항진균 효과가 우수하며 세포 독성이 없는바, 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용될 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Antimicrobial peptide, Protaetiamycine 3 derived from protaetia brevitarsis seulensis and uses thereof <130> 1-77 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protaetiamycine 3 <400> 1 Ser Thr Leu Thr Lys Thr Lys Lys Pro Asn Phe Lys Trp Lys Gly Ile 1 5 10 15 Lys Lys Ile Phe Lys Lys Lys Lys Glu Ala Leu Ala Ser 20 25

Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 식품 방부제.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 화장품 첨가제.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균용 의약품 첨가제.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제.