KR101615551B1 - 흰점박이꽃무지 유충 유래의 항균 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지 유충 유래의 항균 펩티드, 상기 항균 펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩티드 및 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 흰점박이꽃무지 유충 유래 디펜신-유사 유전자로부터 코딩되는 항균 펩티드는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내므로, 항균제를 포함하는 항생제 등으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

흰점박이꽃무지 유충 유래의 항균 펩티드 및 이의 용도{Antimicrobial peptide from Protaetia brevitarsis seulensis larva and uses thereof}

본 발명은 흰점박이꽃무지 유충 유래의 항균 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

곤충은 미생물의 침입에 반응하는 효과적인 고유의 면역 반응을 가지고 있는데, 이것은 세포 반응 및 체액 반응과 관련이 있다. 방어의 첫 번째 라인인 큐티클을 통하여 미생물이 곤충 혈체강을 침입할 때, 세포 반응(식균 작용, 근류 형성 및 피막 형성) 및 체액 반응은 조직 혈체강에서 시작되고, 병원균 및 기생충의 소멸을 야기한다(Kocks et al. 2005 Cell 123:11-22). 이러한 체계적인 항균 반응에서 곤충의 항균 펩티드(체액 반응)는 병원균 및 기생충의 소멸에 중요한 기능을 수행하며 상기 펩티드는 지방체 및 혈구와 같은 특정 조직에서 합성된다. 항균 펩티드를 코딩하는 많은 유전자가 곤충뿐만 아니라 척추동물에서 확인되었다. 그러한 펩티드는 양서류, 조류, 어류, 인간을 포함하는 포유류에서 분리되었고, 클로닝되었다(Bulet et al. 2004 Immunol Rev 198:169-184). 항균 펩티드를 중심으로 한 항균 작용을 가진 펩티드 또는 단백질은 우리 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제에 대해서 이용 가능성이 높다. 이러한 곤충 유래 항병원성 단백질은 인간 및 가축의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

모기(Aedes aegypti), 파리(hymenopteran insect), 꿀벌(Apis mellifera), 딱정벌레(coleopteran insect), 쌀벌레(Tribolium castaneum)와 같은 쌍시류 곤충(dipteran insects)을 포함한 다양한 곤충류에서 면역 관련 유전자 및 유전자 패밀리가 미생물 챌린지(microbial challenge)에 반응하는 글로벌 유전자 발현 분석으로 조사되었다(Tanaka et al. 2008 Insect Biochem Mol Biol 38:1087-1110). 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서는 병원균 인식 유전자, 세포 외 신호 전달 유전자, 세포사멸-관련 유전자 및 단백질 분해효소-관련 유전자를 포함하여 268개의 면역 관련 유전자가 발견되었으며, 미생물 챌린지를 수행한 곤충에서는 병원균에 의해 직접적으로 영향을 받은 약 20개의 유전자가 드로조마이신(drosomycin), 디펜신(defensin), 드로조신(drosocin), 디프테리신(diptericin), 세크로핀(cecropin) 및 아타신(attacin)과 같은 펩티드를 코딩하는 항균 펩티드 유전자로 발견되었다(De Gregorio et al. 2001 Proc Natl Acad Sci USA 98:12590-12595). 쌀벌레(T. castaneum)에서는 아타신, 세크로핀, 콜레오프테리신(coleoptericin) 및 디펜신과 같은 유전자들의 mRNA 수준이 미생물 챌린지 후에 급격히 증가하였다(Zou et al. 2007 Genome Biol 8:R177). 모기(A. gambiae)에는 약 10개의 항균 펩티드 유전자를 포함하여 297개의 면역 관련 유전자가 발견되었다(Tanaka et al. 2008 Immunol Rev 198:169-184).

그 중 디펜신(defensin)은 3개의 이황화 결합(disulfide bond)으로 안정화된 베타-시트 구조를 가진 항균 펩티드로서, 포유류로부터 분리된 대부분의 디펜신은 병원성 세균과 곰팡이에 대해 항균 활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 포유류의 디펜신은 6개의 시스테인 사이의 길이에 따라 구조상 알파, 베타, 쎄타의 3개로 나뉘어져 있으며, 알파와 베타-디펜신은 3개의 이황화 결합을 가진 베타-시트로 구성되어 있고 쎄타-디펜신은 9개의 아미노산이 연결된 구조로 되어있다. 이에 반해 곤충의 디펜신은 알파-나선구조와 3개의 시스테인(1-4, 2-5, 3-6)이 연결된 베타-시트로 구성되어 있으며, 포도상구균(Staphylococus aureus)을 포함한 그람 양성균을 효과적으로 저해하는 것으로 알려져 있다. 상대적으로 곤충의 디펜신은 좁은 범주의 항균 스펙트럼과 비용 대비 상업적 규모의 생산 비용이 높아서 산업적 적용에 제한적이라는 문제점이 있다.

흰점박이꽃무지(white-spotted flower chafer, Protaetia brevitarsis seulensis)는 딱정벌레목(Coleoptera) 꽃무지과(Cetoniinae)에 속하는 곤충으로서 한국, 일본, 대만, 중국, 유럽에 분포하며 알, 유충, 번데기, 성충의 시기를 거치는 완전변태를 하는 곤충이다. 흔히 굼벵이로 알려져 있는 흰점박이꽃무지 유충은 현재 농가에서 널리 사육되어져 한방이나 민간요법에 사용되고 있다. 이처럼 민간요법으로 사용되는 흰점박이꽃무지 유충의 약효와 관련한 과학적 접근은 거의 이루어지지 않고 있으므로 흰점박이꽃무지 유충의 효능 및 새로운 용도에 대한 연구가 필요한 실정이다. 항균 펩티드에 관하여, 흰점박이꽃무지에 대한 연구는 면역을 유도한 유충으로부터 프로태틴 1, 2, 3(Protaetin 1, 2, 3)이 보고된 바 있지만, 아직까지 흰점박이꽃무지 유래의 항균 펩티드에 대한 연구는 미비한 실정이다. 이에 본 발명자는 흰점박이꽃무지 유래의 항균 활성을 가지는 디펜신-유사(defensin-like) 유전자를 동정하여 상기 유전자로부터 항균 펩티드를 개발하고자 하였다.

한국등록특허 제1153455호에는 '흰점박이꽃무지유충으로부터 분리한 신규한 항진균 펩타이드 유전자 및 상기 항진균 펩타이드 및 그 유도체'가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2010-0052872호에는 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 프로태티아마이신이 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 흰점박이꽃무지 유충 유래의 항균 펩티드 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충에서 디펜신-유사 유전자를 분리동정하여 상기 유전자를 발현벡터에 삽입하여 생산한 재조합 단백질이 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항균 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충 유래의 항균 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 코당하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 코당하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 흰점박이꽃무지 유충 유래 디펜신-유사 유전자로부터 코딩되는 항균 펩티드는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내므로, 항균제를 포함하는 항생제 등으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 흰점박이꽃무지 유충 유래의 디펜신 유사 유전자인 Psdefensin의 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열은 시그널 펩티드(1~20), 프로-프로테인(pro-protein)(21~36) 및 성숙 펩티드(mature peptide)(37~79)를 포함한다. 성숙 펩티드는 밑줄로 나타내었다. 총 6개의 시스테인(39, 56, 60, 70, 75 및 77번째 위치)은 이중 밑줄로 나타내었다.
도 2는 흰점박이꽃무지 유충 유래의 디펜신 유사 펩티드인 Psdefensin의 아미노산 서열 정렬(A) 및 계통수(B)를 나타낸다. (A) NCBI 데이터베이스에서의 BLASTX 검색으로 상동성이 높은 다른 종의 아미노산 서열이 정렬을 위해 사용되었다. 파란색으로 표시한 아미노산 잔기는 전체 서열에서 동일하였다. 서열에서 갭(-)은 상동성을 최대화하기 위해 도입되었다. (B) 계통수는 디펜신 중 진화관계를 조사하기 위해 Mega4(NJ(neighbour joining) 알고니즘; bootstrap trials = 1000)를 사용하여 생성시켰다. bootstrap 추리는 Psdefensin이 다른 딱정벌레 종의 Defensin 단백질과 클러스터링되는 것을 나타낸다.
도 3은 Psdefensin의 성숙 펩티드 영역의 이차 및 삼차 구조를 나타낸다. Psdefensin 구조의 프로파일은 거짓쌀도둑거저리(T. castaneum), 남방장수풍뎅이(O. rhinoceros), 초파리(D. melanogaster) 유래의 다른 디펜신과 비교되었다. 전형적이고 예상되어지는 Defensin 모티프는 Pfam 서버(http://pfam.sanger.ac.uk/) 및 Phyre² 서버(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)를 이용하여 결정되었다; α-helices; 원기둥, β-strand; 화살표, coil;직선.
도 4는 Psdefensin의 미생물 챌린지 후 Psdefensin mRNA 유도 결과(A) 및 조직-특이적 mRNA 발현(B)를 나타낸다. (A) 박테리아 챌린지 후 0~48시간 동안(0, 4, 8, 12, 24 및 48시간) Psdefensin mRNA 발현을 RT-PCR 방법으로 측정하였다. *는 미생물 챌린지 전(0시간)과의 유의적 차이를 표시한다(P<0.05). (B) Psdefensin mRNA은 RT-PCR에 의해 결정되었다. 레인 1; 지방체(fat body, Fb), 레인 2; 내장(intestine, In), 레인 3; 뇌(brain, Br), 레인 4; 혈구(hemocytes, He). β-actin은 대조구로 사용되었고, 그것의 발현은 하단 패널에 보여준다.
도 5는 Psdefensin 단백질 유도(A) 및 방사 확산 분석법(radial diffusion assay)에 의한 세균에 대한 Psdefensin의 항균 활성(B)을 나타낸다. (A) Psdefensin 단백질 유도 결과를 나타낸다. M; 단백질 마커, C; 유도 전 대장균(E. coli Shuffle cell) 내 단백질 추출물, I; 유도 후 대장균 내 단백질 추출물. (B) 대장균(E. coli DH5α)(그람 음성균) 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)(그람 양성균)에 대한 Psdefensin의 항균 활성을 나타낸다. (+);항생제 대조구 암피실린(0.1 μg), (1); Psdefensin 무처리, (2); Psdefensin 처리.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충 유래의 항균 펩티드를 제공한다.

본 발명자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지 유충 유래 디펜신-유사 유전자를 최초로 분리 동정하여 이를 Psdefensin으로 명명하였으며, 이로부터 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Psdefensin의 발현을 확인하였다.

본 발명에 따른 항균 펩티드의 범위는 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 Psdefensin 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 항균 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 Psdefensin의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 Psdefensin 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

본 발명의 Psdefensin은 79개의 아미노산 서열(서열번호 2)로 이루어져 있으며, N-말단으로부터 1 내지 20번째 아미노산 서열의 신호 펩티드, 21 내지 36번째 아미노산 서열의 프로-펩티드 및 37 내지 79번째 아미노산 서열의 성숙 펩티드의 세 영역으로 분류된다. 신호 펩티드 코딩 영역은 서열번호 1의 1 내지 60번째 염기서열이며, 프로-펩티드 코딩 영역은 61 내지 108번째 염기서열이며, 성숙 펩티드 코딩 영역은 109 내지 237번째 염기서열이다.

본 발명의 항균 펩티드는 전장의 Psdefensin일 수도 있으며, 신호 펩티드가 절단된 펩티드일 수도 있으며, 신호 펩티드 및 프로-펩티드가 절단된 성숙 펩티드일 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 항균 펩티드를 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서(enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균의 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파지(λ)의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균 JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X 1776, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci.,87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 1의 염기서열 중 111번 내지 238번째 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항균 펩티드를 생산하는 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection)의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 생산 방법에서는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

"항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미하며, 바람직하게는 항세균(anti-bacterial)을 의미할 수 있으며, 상기 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있으며, 바람직하게는 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이고 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 곤충 사육

흰점박이꽃무지 유충은 25±1℃, 상대습도 50~70%, 16시간 명주기와 8시간 암주기(16L:8D)로 구성된 장 광주기의 무균 실험 조건에서 살균처리한 발효된 오크우드(oakwood) 톱밥에서 사육하였다. 종령 유충(final instar larvae)이 실험에 사용되었다(MIR-553; Sanyo Electric Biomedical, 일본).

2. 면역 유도, RNA 추출, cDNA 제조 및 클로닝

흰점박이꽃무지 유충의 면역을 유도하기 위하여 유충을 차게 마취시키고(cold-anesthetized), 40㎕의 멸균수(대조구로 사용) 또는 2×10⁷의 대장균(Escherichia coli) 또는 8×10⁸의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)을 미세 유리바늘(a Haematokrit-kapillaren syringe; Hischmann laboragerate, GmBH & Co. KG, 독일)로 주입하였다. 멸균수 또는 미생물 챌린지한(microorganism challenged) 유충의 지방체의 총 RNA는 SV total RNA isolation system kit(Promega Corp., 미국)를 이용하여 분리되었고, cDNA는 SuperScript™ Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 합성되었다. 모든 버퍼는 0.1% DEPC(Diethyl pyrocarbonate) 용액을 처리하고, 멸균하여 사용하였다. Psdefensin의 전장 cDNA 염기서열을 얻기 위해, high-throughput RNA sequencing(RNA-seq) expression profiling 데이터세트를 사용하였다. 유전자 특이적 프라이머는 RNA-seq 데이터를 사용하여 설계하였으며, 설계된 프라이머로 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)를 수행하였다. 5' RACE 및 3' RACE를 위해, smart RACE cDNA amplification kit(Clonetech, 미국)를 이용하여 총 RNA의 1 ㎍을 cDNA로 제조하였다. 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 30회 반복 후, 72℃에서 5분간 최종 증폭 단계를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 산물은 pGEM-T Easy vector(Promega Corp., 미국)로 클로닝하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit 및 DNA sequencer(Applied Biosystems, 미국)로 서열 분석하였다.

3. 서열 규명, 계통 발생 분석 및 단백질 구조 예측

획득한 전장의 Psdefensin 염기서열은 Blastx (http://www.ncbi.nim.nih.gov/)에서 NCBI의 Genebank 데이터베이스 내 유사 유전자를 검색하여 비교하였다. Psdefensin 서열의 번역 및 추정된 펩티드 서열의 예측은 Translation software (http://www.bioinformatics.org/sms/)을 이용하여 수행하였다. 다양한 생명체 유래의 디펜신 아미노산 서열은 클러스터 알고리즘인(Cluster algorithm) ClustalW(ver 1.8)을 이용하여 정렬시켰고, 계통수는 MEGA4에 의한 정렬에 기초하여 구축하였다. 단백질의 삼차 구조는 Protein Structure Prediction Server(http://ps2.life.nctu.edu.tw/)를 이용하여 확인하였다.

4. 조직-특이적 발현 분석 및 실시간 정량 RT - PCR

Psdefensin의 조직 특이적 발현을 관찰하기 위해, 뇌, 지방 조직, 장 및 혈구와 같은 다양한 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 유충을 99.5% 디에틸 에테르(Diethyl ether)(DaeJung Chemical Metales, 한국)로 실온에서 1분간 마취시키고, 얼음에 보관한 후에, 차가운 125 mM의 NaCl 용액 내에서 잘게 절단하였다. 각 조직 유래의 총 RNA 추출은 상기 재료 및 방법(2. 면역 유도, RNA 추출, cDNA 제조 및 클로닝)에서 서술한 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 실시간 정량 RT-PCR은 72-well Rotor가 장착된 Rotor-Gene-Q(Qiagen, 미국)를 이용하여 수행하였다. 모든 샘플은 5㎕의 SYBR GreenTM master mix(Elpis-biotech, 한국), 3㎕의 cDNA 및 2.5μM의 유전자-특이 프라이머 세트(정방향 프라이머; 5'-TATCAGTTCCACTGCCCGAAGAAG-3'(서열번호 3), 역방향 프라이머;5'-CCTGCACACACAGACCCCTTGTTTAC-3'(서열번호 4))를 혼합하여 하기와 같이 RT-PCR를 수행하였다; 94℃에서 10초, 62℃에서 10초 및 72℃에서 10초의 40회 반복과 470nm 그린 채널 형광 측정. PCR 산물의 특이성은 융점 곡선(melting curve) 분석을 통해 확인하였다.

면역 유도 기간 동안 Psdefensin 유전자 발현을 조사하기 위해, 본 발명자들은 미생물 주입 후 0, 4, 8, 12 , 24 및 48시간에서의 총 mRNA를 추출하여 유전자 특이적 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)로 상기에서 기술한 RT-PCR 분석을 통해 시간별 Psdefensin mRNA 발현량을 측정하였다. 실시간 정량 RT-PCR 분석을 3회 반복하였다. 각 표적 mRNA의 후속 분석을 위해, 상대 발현량을 각각 Psdefensin 및 내부 대조군으로서의 β-액틴에 대한 밴드 강도의 비율로 평가하고, 상기 비율로 Psdefensin mRNA 발현의 그래프를 생성하였다.

5. 항균 활성 규명

재조합 Psdefensin 단백질의 제조를 위해, 전장(full-length) Psdefensin cDNA를 EcoRI 효소 부위를 포함하는 defF 프라이머(정방향 프라이머; 5'-AGTCATGAATTCGTTCCACTGCCCGAAGAAGTC-3')(서열번호 5) 및 HindIII 효소 부위를 포함하는 defR 프라이머(역방향 프라이머; 5'-AGTCATAAGCTTATTCCTGCACACACAGACCC-3')(서열번호 6)를 이용하여 PCR 증폭을 통해 획득하였다. 증폭된 Psdefensin cDNA를 pMALc2h10t 발현 벡터로 클로닝하였다. 서열을 분석한 후, 구축된 pMALc2h10t 발현 벡터를 대장균 셔플 세포(E. coli Shuffle cell)(NEB Corp., 미국)로 형질전환시켰다. 그 후 세포가 중기-로그기(OD₆₀₀=0.6)에 도달했을 때, 0.2 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Sigma-Aldrich Corp., 독일)로 Psdefensin을 포함하는 pMALc2h10t 발현 벡터를 유도시켰다. 원심분리하여 획득한 세포 펠렛은 용해 버퍼(5M NaCl, 0.5M EDTA, 2M DTT, 1M Tris-HCl 버퍼, pH 7.5)를 첨가하여 재현탁시켰다. 그 후, 생물학적 활성 측정을 위해 얼음에서 초음파 처리하여 세포를 용해시킨 후, -80℃에 보관하였다. 유도된 Psdefensin 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동하여 확인하였다. 유도된 Psdefensin 단백질의 항균 활성은 방사 확산 분석법(radial diffusion method)으로 측정되었고, 그람-양성 세균인 바실러스 서브틸리스 및 그람-음성 세균인 대장균에 대해 테스트하였다. 간단하게, 세균을 LB 배지에 도말한 후, 유도된 Psdefensin은 웰(well)에 분주하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 항균 활성을 나타내는 클리어링 존(clearing zones)이 관찰되었다.

실시예 1: 흰점박이꽃무지 유충의 디펜신 -유사( Defensin - like ) 유전자 cDNA의 동정

디펜신-유사 유전자를 동정하기 위해, 본 발명자들은 면역유발된 흰점박이꽃무지 유충의 고속대량 RNA 시퀀싱 발현 프로필링(high-throughput RNA sequencing(RNA-seq) expression profiling) 데이터 세트를 검색하였다. 그 결과, 2종의 디펜신-유사 유전자를 동정하였다. 그 중 하나는 새로운 디펜신-유사 유전자로 밝혀졌다. 본 발명자는 신규 디펜신-유사 유전자를 Psdefensin으로 명명하였다. Psdefensin cDNA은 240개의 뉴클레오티드(서열번호 1)로 이루어졌고, 산출된 분자량은 8.44 kDa이고 등전점은 9.01인 79개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드(서열번호 2)를 암호화한다(도 1). 6개의 시스테인 잔기를 확인하였으며 이는 다른 곤충의 디펜신에서 보이는 바와 같이 3개의 이황화결합(disulfide bond)을 형성할 것으로 예상된다. 추론된 단백질은 유사 단백질과 마찬가지로 신호 펩티드, 프로-펩티드 및 성숙 펩티드의 세 영역으로 분류할 수 있다(도 2A). 도 2A에서 인간을 포함한 다른 곤충의 디펜신의 아미노산 서열을 비교하였을 때 신호 펩티드인 N-말단 도메인(아미노산 1-20), 프로-펩티드 영역(아미노산 21-36) 및 성숙 펩티드 영역(아미노산 37-79)을 확인하였다.

Psdefensin 및 다른 곤충의 디펜신 사이의 진화적 관계를 더 이해하기 위해, 본 발명자들은 Mega4 program을 이용하여 Psdefensin의 전체 아미노산 서열에 대하여 최대단순성(maximum parsimony) 분석을 수행하였다. Psdefensin 아미노산 서열은 다른 곤충의 것과 유사하였다. 특히, Psdefensin 서열은 구리풍뎅이(Anomala cuprea)와 높은 상동성을 나타내었다(64.6%). 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros), 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus), 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum) 및 초파리(Drosophila melanogaster)의 것에 대한 Psdefensin의 아미노산 서열의 상동성은 각각 63.3%, 62.5%, 41.2% 및 33.3%였다. 계통도에서 Psdefensin이 구리풍뎅이(Anomala cuprea)와 남방장수풍뎅이 같은 딱정벌레(beetle)의 디펜신에 상동성이 높음을 확인하였다(도 2B). Psdefensin의 2-19번째, 22-30번째 및 53-62번째 아미노산 서열이 다른 곤충의 디펜신의 α-헬릭스 구조에 일치하며, 아미노산 38-43번째 및 74-77번째 아미노산 서열이 다른 곤충의 디펜신의 β-시트 구조에 해당하였다(도 3). Psdefensin의 삼차 구조 역시 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros) 및 초파리(Drosophila melanogaster)의 것과 유사하였다(도 3). 전반적으로 Psdefensin의 성숙 펩티드 영역은 하나의 α-헬릭스 구조를 가진 샌드위치-유사 β-젤리 롤 모티프처럼 형성되어있다. 양 말단의 β-시트와 중앙의 α-헬릭스 구조가 시스테인 결합(Cys1-Cys4, Cys2-Cys5, Cys3-Cys6)으로 안정화되어 있다.

실시예 2: Psdefensin mRNA 발현 확인

Psdefensin의 가능한 면역 기능을 조사하기 위해, 미생물(대장균과 사카로마이세스 세레비지애)로 흰점박이꽃무지 유충을 챌린지한 후에 Psdefensin 발현을 RT-PCR 분석으로 확인하였다. Psdefensin 발현의 타임 코스는 주입 후 0 ~ 48 시간 후에 모니터링하였다. Psdefensin은 물이 주입된 대조구 유충과 비교하여 주입 4시간 후 약간 높아지다가 8시간 후 가장 높은 수준으로 발현되어 이 후 점차 감소하였다(도 4A). 또한, 다양한 조직에서 Psdefensin 전사체의 조직-특이적 차별적 발현을 시험한 결과, Psdefensin 전사체는 뇌, 지방 조직, 장 및 혈구를 포함하는 시험한 모든 조직에서 발현되는 것을 확인하였다(도 4B).

실시예 3: 재조합 Psdefensin 의 항균 활성

Psdefensin의 그람 음성균인 대장균 DH5α(KACC 10005) 및 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스(KACC 14741)에 대한 항균 활성을 방사 확산 분석법을 통하여 확인하였다. Psdefensin 단백질의 인 비트로(in vitro) 발현을 위해, 본 발명자는 pMAL^TM 발현 시스템을 이용하였다. Psdefensin 단백질은 박테리아 세포 농도가 OD₆₀₀ = 0.6 일 때, 0.2 mM의 IPTG 처리한 후 12시간 동안 30℃에서 배양하여 가장 많은 양을 획득하였다. 예상대로 Psdefensin은 51.59kDa 근처에서 뚜렷한 밴드를 확인하였다(도 5A).

Psdefensin를 과발현하는 대장균 셔플 세포의 총 단백질 추출물에 대한 항균 활성을 시험하였다. 음성 대조군으로는 유도시키지 않은 대장균 셔플 세포로부터 분리한 총 단백질 추출물을 사용하였다. 방사 확산 분석을 통해 Psdefense이 음성 대조군에 비하여 그람 음성균인 대장균 DH5α 및 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 5B).

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Antimicrobial peptide from Protaetia brevitarsis seulensis larva and uses thereof <130> PN15145 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 240 <212> DNA <213> Protaetia brevitarsis seulensis <400> 1 atggccaaaa ttatcatagt agccttgatc gttgtgatgt gcattgcgca atcattatca 60 gttccactgc ccgaagaagt cgaaggtagt ctaatcagac agaagagagt tacgtgtgat 120 ctacttagtt tgcaaattaa gggtattgca attaatgata gtgcttgtgc agcacattgt 180 ttagccatgc gacgtaaagg cggttcatgt aaacaagggg tctgtgtgtg caggaattaa 240 240 <210> 2 <211> 79 <212> PRT <213> Protaetia brevitarsis seulensis <400> 2 Met Ala Lys Ile Ile Ile Val Ala Leu Ile Val Val Met Cys Ile Ala 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Val Pro Leu Pro Glu Glu Val Glu Gly Ser Leu Ile 20 25 30 Arg Gln Lys Arg Val Thr Cys Asp Leu Leu Ser Leu Gln Ile Lys Gly 35 40 45 Ile Ala Ile Asn Asp Ser Ala Cys Ala Ala His Cys Leu Ala Met Arg 50 55 60 Arg Lys Gly Gly Ser Cys Lys Gln Gly Val Cys Val Cys Arg Asn 65 70 75 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tatcagttcc actgcccgaa gaag 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cctgcacaca cagacccctt gtttac 26 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agtcatgaat tcgttccact gcccgaagaa gtc 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agtcataagc ttattcctgc acacacagac cc 32

Claims (10)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충 유래의 항균 펩티드.
2. 제1항의 항균 펩티드를 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제4항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 항균 펩티드의 생산 방법.
7. 제6항의 방법에 의해 생산된 항균 펩티드.
8. 제7항의 항균 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며, 그람 음성균은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 조성물.

Images