KR101931572B1 - 융합 항균펩타이드 파제인 또는 이를 합성하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 융합 항균펩타이드 파제인(Pajein) 또는 이를 합성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 파제인은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균활성이 우수하다.
상기 파제인은 기존에 개발된 융합 항균펩타이드 PAJE(대한민국 등록특허 제10-1465098호)를 기반으로 하여 제조된 것이며, 아미노산 서열 WKIKFKPFKISIHL-NH2로 총 14개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 6개의 소수성 아미노산 잔기와 8개의 친수성 아미노산 잔기가 상보적으로 대치된 나선 구조 형태로 설계되어 펩타이드의 세포막 파괴에 있어 PAJE보다 용이하게 작용할 것으로 기대된다.

Description

융합 항균펩타이드 파제인 또는 이를 합성하는 방법 {Convergence antibacterial peptide Pajein and process to synthesize it}
본 발명은 융합 항균펩타이드 파제인 또는 이를 합성하는 방법에 관한 것이다.
페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨지고 있다.
곤충은 다양한 환경에서 생존하기 위해서 외부 미생물 및 바이러스의 침입에 효과적으로 대항할 수 있는 생체방어 시스템을 소유하고 있는데, 세포성 면역과 체액성 면역반응을 포함하는 선천적 면역인자를 분비함으로써 자신을 보호하는 면역체계를 가지고 있다. 선천적 면역은 곤충을 포함한 무척추동물에 있어서 초기감염에 대한 효과적인 방어인자로 중요한 역할을 한다. 곤충의 선천성 면역반응에서 세포성 면역은 세균, 곰팡이, 선충을 포함한 원생동물에 대한 식균작용, 결절형성과 캡슐형성을 포함한다. 체액성 면역반응에서는 병원체의 침입으로 인해 다양한 종류의 단백질 또는 펩타이드가 지방체 및 혈구세포에서 합성되어 혈액 또는 림프로 분비되는데 이들은 병원체에 대한 강력한 방어인자로 이용된다. 곤충의 체액성 면역반응의 일환으로 분비되는 항균성 단백질 또는 펩타이드는 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제에 대한 천연항생제로서의 이용 가능성이 높다. 또한 이러한 항균성 단백질 또는 펩타이드는 인간 및 가축의 질병에 대한 치료 뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지에도 유용하게 사용될 수 있다.
현재까지 발견된 곤충의 항균성 단백질 및 펩타이드는 세크로피아나방에서 세크로핀(cecropin)이 최초로 보고된 이래 약 200여종이 곤충으로부터 분리되었는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다. 이들 중 가장 흔한 것으로는 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파-나선형을 형성하는 구조를 갖는 멜리틴(melittin)이나 세크로핀과 같은 항균펩타이드가 있다.
본 발명자들은 파필리오신(Papiliocin)(대한민국 등록특허 제10-1099558호) 및 이로부터 설계된 신규 항균펩타이드(대한민국 등록특허 제10-1465098호)에 관한 연구를 수행한 바 있다. 상기 파필리오신은 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드로서, 상기 항균펩타이드 유전자의 cDNA 전체 크기는 503bp이며, 94번째 염기에서 개시되어 283번째 위치에서 종결되는 암호화 영역을 가지는 62개의 아미노산으로 구성되어 있다. 상기 항균펩타이드 파필리오신의 아미노산 구조는 알파-헬릭스-힌지-알파-헬릭스로 구성된 전형적인 세크로핀류의 염기성 단백질이다. 이 외에도 본 발명자들은 파필리오신 유래 융합펩타이드로서 파필리오신의 아미노산 서열을 바탕으로 N말단 나선 구조의 1-7 아미노산 영역에 로얄제리에서 분리한 젤레인의 아미노산 서열을 접합시킨 PAJE 펩타이드를 개발한 바 있다.
한편, 본 발명자들은 파필리오신 유래 융합 항균 펩타이드에 대한 연구를 지속하던 중, 펩타이드의 일부 서열을 치환하여 친수성을 보다 강화시켜 항균성이 증대된 본 발명의 신규한 항균펩타이드에 관한 기술을 완성하였다.
대한민국등록특허 제10-1099558호(등록일: 2011년 12월 21일, 명칭: 호랑나비 유충에서 분리된 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드) 대한민국등록특허 제10-1150281호(등록일: 2012년 05월 08일, 명칭: 파필리오신 하생 펩타이드로부터 설계된 신규한 항균, 항염활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도) 대한민국등록특허 제10-1465098호(등록일:2014년11월19일, 명칭: 융합 항균펩타이드 PAJE 또는 이를 합성하는 방법)
본 발명의 목적은 융합 항균펩타이드 파제인 또는 이를 합성하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 서열번호 1로 표현되는 융합 항균펩타이드 파제인에 관한 것이다.
상기 항균펩타이드 파제인은 그람음성균, 그람양성균, 캔디다를 유발하는 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 융합 항균펩타이드 파제인을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 살균용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 융합 항균펩타이드 파제인을 유효성분으로 포함하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 세균성 질환은 세균성 장염, 세균성 식중독, 살모넬라병 및 캔디다증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 융합 항균펩타이드 파제인을 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인은 서열번호 1로 표현되는 하기의 아미노산 서열을 가지며, 분자량 1784.7 Da의 펩타이드이다.
서열번호 1 : WKIKFKPFKISIHL-NH2
상기 파제인 펩타이드는 기존에 개발된 융합 항균펩타이드 PAJE의 아미노산 서열을 바탕으로 크기, 소수성(hydrophobicity), 회전성(helicity), 플러스 전하(net positive charge)등을 고려하여 상기 PAJE아미노산 서열을 일부 치환하여 제조된 것으로, 파제인을 구성하고 있는 아미노산 서열은 기존 PAJE의 아미노산 서열에서 첫 번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)을 제거하여 친수성 잔기인 트립토판(W)으로 시작하게 디자인되어 있으며, 또한 소수성 및 친수성 아미노산 잔기가 상보적으로 대치된 나선 구조 형성을 위해서 4번째에 라이신(K)과 5번째에 페닐알라닌(F) 아미노산으로 치환하여 구성되어 있다(도 1).
한편, PAJE의 전체 아마노산 서열은 하기와 같다.
RWKIFKKPFKISIHL-NH2
본 발명의 항균펩타이드 파제인은 그람음성균, 그람양성균, 캔디다를 유발하는 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 그람음성균은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 그람양성균은 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 고초균(Bacillus subtilis) 중 선택된다. 또한 상기 캔디다를 유발하는 진균은 캔디다 알비칸스(Candida albicans)일 수 있다.
이에, 상기 항균펩타이드 파제인은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균활성이 있을 수 있다.
본 발명의 항균펩타이드 파제인은 그람음성 및 그람양성 세균, 캔디다 진균 모두에서 매우 높은 항균력 및 우수한 살균 속도를 나타낸다. 이에, 본 발명의 항균펩타이드 파제인은 항균 또는 살균용 조성물, 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 사료용 조성물 등으로 유용하게 이용가능하다. 상기 항균 또는 살균용 조성물, 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물로서 이용될 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 함유될 수도 있는데, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하며, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 이러한 사료용 조성물은 사료 원료에 적절하게 배합하여 사료로 제공되는데, 상기 사료 원료로는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다. 본 발명의 항균펩타이드 파제인이 함유된 사료 조성물을 동물에게 일상적으로 섭취시킬 경우 병원성 미생물에 대한 감염 등을 예방할 수 있다.
본 발명은 융합 항균펩타이드 파제인(Pajein) 또는 이를 합성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 파제인은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균활성이 우수하다.
상기 파제인은 기존에 개발된 융합 항균펩타이드 PAJE(대한민국 등록특허 제10-1465098호)를 기반으로 하여 제조된 것이며, 아미노산 서열 WKIKFKPFKISIHL-NH2로 총 14개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 6개의 소수성 아미노산 잔기와 8개의 친수성 아미노산 잔기가 상보적으로 대치된 나선 구조 형태로 설계되어 펩타이드의 세포막 파괴에 있어 PAJE보다 용이하게 작용할 것으로 기대된다.
또한 인체 및 동물에 발생하는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 개발이 가능해짐으로써, 항세균제, 항진균제 등의 항균용 조성물, 동물 성장촉진용 천연항생제 등의 제조, 세균성 장염, 세균성 식중독, 살모넬라병, 캔디다증 등의 세균성 질환 예방에 파제인을 유용하게 이용할 수 있으며, 파제인을 함유한 사료 첨가제의 제조가 가능하다.
도 1은 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인의 디자인 및 아미노산 구성을 나타낸 도면으로서, 소수성 잔여물(hydrophobic residues)인 K9, K2, H13, K6, S11, K4, 친수성 잔여물(hydrophilic residues)인 F8, W1, I12, F5, I10, I3, L14, P7의 위치를 나타낸다.
도 2는 역상 HPLC 이용한 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인의 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 MALDI 질량 분석법을 이용한 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인의 분자량 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 대장균에 대한 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인의 항세균 활성 검정 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인(8㎍/㎖)의 처리시간에 따른 대장균에 대한 살균력 검정 결과를 나타낸 도면이다(control:항균펩타이드 무처리군).
도 6은 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인(16㎍/㎖)의 처리시간에 따른 포도상 구균에 대한 살균력 검정 결과를 나타낸 도면이다(control:항균펩타이드 무처리군).
도 7은 대장균(E.coli) 및 포도상 구균(S.aureus) 배양물에 본 발명의 융합 항균펩타이드 파제인을 농도별로 처리하고 1시간이 지난 후에, LB 고체배지에 도말하여 생존한 대장균 및 포도상 구균의 살균력 검정 결과를 나타내는 도면이다(control: 항균펩타이드 무처리군).
도 8은 파제인 처리에 따른 대장균 세포막의 카탈라아제(catalase) 활성 검정 결과를 나타낸 도면이다(control : 무처리군).
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 펩타이드의 합성 및 분리정제>
기존에 개발된 융합 항균펩타이드 PAJE(대한민국 등록특허 제10-1465098호)는 호랑나비 유충에서 분리된 바 있는 파필리오신(대한민국 등록특허 제10-1099558호)의 아미노산 서열을 바탕으로 N말단 나선 구조의 1-7 아미노산 영역(RWKIFKK)에 로얄제리에서 분리한 젤레인(Jelleine)의 아미노산 서열(PFKISIHL)을 접합시켜 + 전극과 소수성 아미노산 잔기가 감소된 새로운 구조의 항균펩타이드로 총 15개의 아미노산 잔기(RWKIFKKPFKISIHL-NH2)로 구성되어 있다. 상기 항균 펩타이드 파제인은 PAJE의 아미노산 서열을 바탕으로 크기, 소수성(hydrophobicity), 회전성(helicity), 플러스 전하(net positive charge)등을 고려하여 상기 PAJE아미노산 서열을 일부 치환하여 제조된 것으로, 파제인을 구성하고 있는 아미노산 서열은 기존 PAJE의 아미노산 서열에서 첫 번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)을 제거하여 친수성 잔기인 트립토판(W)으로 시작하게 디자인되어 있으며, 또한 소수성 및 친수성 아미노산 잔기가 상보적으로 대치된 나선 구조 형성을 위해서 4번째에 라이신(K)과 5번째에 페닐알라닌(F) 아미노산으로 치환하여 구성되어 있다(도 1).
설계된 융합 항균펩타이드 파제인은 자동화된 고체상 펩타이드 합성기(Pioneer Apploed Biosystems, Foster, Caclif.)를 이용하여 메리필드(Merrifield) 액상 고상법으로 합성하였다. 제조된 펩타이드들은 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 역상(reverse phase)-HPLC 칼럼을 이용하여 정제하고 그 순도를 확인하였으며, 그 결과 95% 이상의 순도를 나타냄을 확인하였다(도 2).
또한 MALDI 질량 분석 결과, 도 3에서와 같이 파제인 분자량은 1784.7로 측정되었으며 이는 아미노산 서열로 계산하여 얻은 분자량과 일치함을 확인하였다. 이에 정확한 융합 항균펩타이드 파제인이 합성되었음을 확인하였다.
<실시예 2. 융합 항균펩타이드 파제인의 항균활성 확인>
실시예 2-1. 항균실험을 위한 각종 균주의 배양
항세균 활성분석(antibacterial assays)에 사용한 그람음성 세균(Escherichia coli, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 및 그람양성 세균(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis)은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 2×106 CFU/㎖이 되도록 2시간 30분 동안 2차 배양하였다.
진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 진탕배양한 후. 상기와 동일한 방법으로 2차 배양하여 사용하였다.
실시예 2-2. 항균활성 측정
그람음성 세균인 병원성 대장균(Escherichia coli)을 LB 액체 배지(Difco LB Broth: typtone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g/ disilled water 1ℓ)에 접종하고, 동시에 상기 실시예 1에서 합성된 융합 항균펩타이드 파제인를, 최종농도가 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 및 32㎍/㎖이 되도록 첨가한 후(무처리구-control), 18시간 동안 진탕배양을 하여 항세균 활성을 검정하였다. 그 결과, 도 4와 같이 파제인의 농도가 4㎍/㎖ 이상인 것에서 대장균이 자라지 못함을 확인하였다.
다음으로는 파제인 융합 항균펩타이드의 항균 활성을 다양한 병원균을 대상으로 하여 측정하였다. 이를 위해 각 항균활성을 최소성장저해농도(MIC, minimal inhibitory concentration) 및 세균을 완전히 치사시키는 최소살균농도(MBC, minimal bactericide concentration) 측정법으로 검정하였고 이에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
최소성장저해농도(MIC)를 측정하기 위해서는 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액(2×106 CFU/㎖)을 넣고 융합 항균펩타이드 파제인을 농도별로 10㎕씩 첨가하였다. 이를 18시간 배양한 후 분광광도계를 사용하여 O.D.(optical density) 600nm에서 흡광도를 측정하였고 펩타이드 무처리구와 비교하여 MIC50 값을 측정하였다.
최소살균농도(MBC)는 상기 최소성장저해농도 측정 방법과 동일하게 세균 배양액에 융합 항균펩타이드를 첨가하여 18시간 배양한 다음 배양액을 LB 고체배지(Difco LB agar:LB 액체배지 성분에 15g agar/ℓ 포함되어 있음)에 도말하여 다시 18시간동안 37℃ 배양기에서 배양한 후, 생존한 콜로니(colony) 숫자를 파악하여 콜로니가 전혀 형성되지 않는 농도를 계측하여 측정하였다.
병원균(Microorgaism) 최소성장억제농도
(MIC50, ㎍/㎖)		 최소살균농도
(MBC, ㎍/㎖)
그람음성세균(Gram negative bacteria) 대장균(Escherichia coli) 2 4
살모넬라균(Salmonella pullorum) 4 8
살모넬라균(Salmonella typhimurium) 5 8
살모넬라균(Salmonella gallinarum) 3 4
살모넬라균(Salmonella enteritidis) 3 4
그람양성세균(Gram positive bacteria) 포도상 구균( Staphylococcus aureus) 5 8
고초균(Bacillus subtilis) 2 4
효모 곰팡이균(Yeast fungi) 캔디다균(Candida albicans) 3 4
상기 표 1을 참고하면, 그람음성 장내세균인 대장균(Escherichia coli) 및 3종의 살모넬라균에 대하여 파제인의 최소생장억제농도(MIC50)를 측정한 결과, 대장균(Escherichia coli)에서는 2㎍/㎖에서, 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)에서는 각각 3~5㎍/㎖, 그람양성 세균인 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 및 고초균(Bacillus subtilis)에서는 최소생장억제농도(MIC50)가 각각 5 및 2㎍/㎖인 것으로 확인되어, 파제인 융합 항균펩타이드의 항세균 활성이 우수함을 알 수 있다. 이 외에 캔디다증을 유발하는 진균인 캔디다균(Candida albicans)에 대해서도 최소생장억제 농도(MIC50)가 3㎍/㎖로서, 항진균 효과 또한 우수함을 확인할 수 있다.
최소살균농도(MBC)을 측정한 결과에서도, 융합 항균펩타이드 파제인이 대장균, 살모넬라균, 포도상 구균 등 병원균에서 그 농도가 4~8㎍/㎖, 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)에서는 4㎍/㎖로서 강한 살균효과가 있음을 알 수 있다.
<실시예 3. 융합 항균펩타이드 파제인의 처리시간 및 농도에 따른 살균력 측정>
시간-살균 곡선 분석(Time-kill curve assay)을 통하여 융합 항균펩타이드의 대장균 및 포도상 구균에 대한 살균속도 및 펩타이드 농도에 따른 살균 활성을 측정하였다. 구체적으로, 대장균(Escherichia coli) 및 포도상 구균(Staphylococcus aureus)을 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth)(Bacto Tryptic Soy Broth - pancreatic digest of casein 17g, papaic digest of soybean 3g, dextrose 2.5g, NaCl 5g, dipotassium phosphate 2.5g/distilled water 1ℓ)에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 최종농도가 1×106 CFU/㎖이 되도록 2차 배양한 다음, 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액을 넣고 융합 항균펩타이드 파제인을 각 농도별로 10㎕를 첨가하였다. 이 후, 일정한 시간이 지날 때마다 배양액을 희석한 다음 LB 고체배지에 도말하고, 37℃에서 배양기에 18 ~ 24시간 배양시킨 후 생존된 콜로니(colony) 숫자를 파악하여 펩타이드 처리 시간별 CFU(Colony Forming Unit)를 측정하였다. 그 결과, 파제인은 그람 음성균 및 그람 양성균 모두 8㎍/㎖ 또는 16㎍/㎖에서 살균 속도가 매우 빠름을 확인할 수 있다(도 5 - 대장균 실험결과, 도 6 - 포도상구균 실험결과).
또한, 항균펩타이드 파제인 농도에 따른 살균 활성을 측정하기 위해서 여러 농도로 희석된 항균펩타이드 파제인을 대장균(Escherichia coli) 및 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 세균 배양액(1×106 CFU/㎖)에 첨가하여 1시간이 지난 후, 상기와 동일한 방법으로 LB 고체배지에 도말하여 생존한 세균 수를 측정하였다. 그 결과, 도 7에서와 같이 대장균(Escherichia coli:E.coli) 및 포도상 구균(Staphylococcus aureus:S.aureus)에 대해 32㎍/㎖(32mg/L) 이상의 농도에서 매우 높은 살균 효과가 있음을 확인할 수 있다. 일반적인 항균제의 항균활성 기작은 크게 직접적인 세포막 파괴 기작을 이용하거나, 세포막 파괴 없이 침투하여 생육 억제하는 것으로 나뉘는데, 본 발명의 항균펩타이드는 빠른 속도로 세포막 파괴 없이 각종 균들의 생육을 억제하기 때문에 이전에 합성된 파필리오신 유래 펩타이드들보다 살균 속도가 더 우수함을 알 수 있다.
<실시예 4. 파제인 처리에 따른 세포막의 카탈라아제 활성 검정>
세균의 세포막 손상시 분비되는 카탈라아제(catalase)의 활성 검정을 통하여 파제인의 항균활성 작용기작을 확인하였다.
이를 위해 대장균(Escherichia coli)을 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕 배양한 다음, 다시 동일한 조건에서 최종농도가 1×106 CFU/㎖이 되도록 2차 배양하였다. 대장균 배양액 2㎖에 100㎍/㎖ 농도가 되도록 파제인, 암피실린 및 카나마이신을 첨가한 후, 2시간 동안 37℃ 180rpm 조건으로 다시 배양한 다음, 5000rpm 조건에서 10분간 원심 분리하여 그 상등액을 수거한 후, 시그마 알드리치 사의 카탈라아제 측정 키트(CAT-100-1KT)를 사용하여 카탈라아제 활성을 측정하였다.
대장균을 대상으로 파제인, 암피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin) 및 초음파(Sonication) 처리에 의한 카탈라아제 활성 검정 결과, 파제인 항균펩타이드 처리시 직접적으로 세포막을 파괴하는 초음파 처리에 비해 기존 항생제인 암피실린 및 카나마이신과 유사하게 매우 낮은 카탈라아제 활성을 나타냈었다(도 8).
또한 파제인 항균펩타이드는 또한 직접적으로 세포막을 파괴하는 초음파 처리와 유사한 catalase 활성을 보이며, 기존 항생제인 암피실린 및 카나마이신 처리에 비해 2배 이상의 매우 높은 카탈라아제 활성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 파제인은 직접적으로 세포막 파괴를 통하여 항균 효과를 나타내는 것으로 확인된다.
<실시예 5. 파제인의 세포 독성 검정>
항균펩타이드 파제인에 대한 세포독성 여부를 판별하기 위하여 적혈구 용혈 활성을 측정하였다. 토끼의 적혈구를 PBS(Phosphate-Buffered Saline: 35mM 포스페이트 완충용액/150mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)로 희석한 후 원심력 1000g으로 10분간 원심분리를 통하여 3회 세척하였다. PBS로 희석한 8% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 1000g, 5분간 원심분리하여 상층액을 취한 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 대조구로 멜리틴을 상기 펩타이드와 동일한 조건으로 처리하여 사용하였다. 0.1% 트리톤(triton) X-100을 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % 용혈활성(Hemolysis)으로 수학식 1에 의하여 산출하였으며 그 결과는 표 2에 나타내었다.
<수학식 1>
세포파괴 정도(% Hemolysis) = (A-C/ B-C) × 100
* 상기 수학식에서 A는 펩타이드 용액에서의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 흡광도를 나타낸다.
펩타이드
처리		 용혈활성
50 μＭ 12.5 μＭ 6.25 μＭ 3.125 μＭ 1.56 μＭ 0.78 μＭ
Pajein 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 %
Melittin 100 % 100 % 100 % 95 % 93 % 31 %
표 2를 참고하면, 높은 용혈 활성을 가지는 멜리틴에 비해 파제인은 고농도에서도 용혈 활성을 나타내지 않는다. 따라서 파제인이 인체에 독성이 없이 무해한 항균펩타이드로서 그 안정성이 확인된다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Convergence antibacterial peptide Pajein and process to synthesize it <130> 0317 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pajein <400> 1 Trp Lys Ile Lys Phe Lys Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu 1 5 10

Claims (6)

  1. 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해 항균 또는 살균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 1로 표현되는 융합 항균펩타이드 파제인(Pajein).
  2. 삭제
  3. 제1항의 융합 항균펩타이드 파제인을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대한 항균 또는 살균용 조성물.
  4. 제1항의 융합 항균펩타이드 파제인을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균이 원인이 되는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항의 융합 항균펩타이드 파제인을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원에 대해 항균 또는 살균 활성을 갖는 사료 조성물.
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