KR102250981B1 - 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체 - Google Patents

항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 Coprisin 유래 CopW 펩타이드(LLWIALRKK-NH2)를 기반으로 한 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

Description

항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체 {Antimicrobial peptide derivatives with improved antimicrobial activity, hemolytic stability and serum stability}
본 발명은 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 Coprisin 유래 CopW 펩타이드(LLWIALRKK-NH2)를 기반으로 한 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 2018년 7월 10일자 대한민국 특허출원 제10-2018-79780호 '생체 이용률 및 혈청 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체'의 국내 우선권을 주장한다.
페니실린이 발명된 이후 많은 항생제가 개발되고 보고되었으나 1980년부터 다양한 항생제에 내성을 나타내는 병원균이 보고되면서 이들 내성균을 치료할 수 있는 새로운 항생제에 대한 개발의 필요성이 대두되었다. 항균 펩타이드는 기존의 항생제와 달리 병원균의 지질막을 공격하여 항균 활성을 나타내는 특징을 지닌 항생제 내성균을 치료할 수 있는 신규 항균 물질로 주목을 받고 있다.
항균 펩타이드는 박테리아, 무척추 동물, 척추 동물, 식물에 이르는 다양한 생명체에서 발견이 되는 선천 면역의 일부로 대개 50개 이하의 아미노산으로 구성되어 있으며 다수의 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘을 포함하고 있어 전체적으로 양전하를 띠며 30% 정도의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다. 이러한 특징으로 인해 항균펩타이드는 음전하를 띤 세균 세포막과 접촉하게 되면 양친매성 α-나선구조(amphipathic α-helix) 혹은 β-병풍구조(β-sheet)를 형성하여 세포막 속으로 끼어 들어가 세포막의 전위를 변화시키거나 세포막 자체에 구멍을 내어 세포막을 파괴함으로써 세균을 사멸시키는 것으로 알려져 있다.
항균 펩타이드의 작용기전과 선택성은 세균의 막과 상호 작용하는 방식에 따라 달라진다. 일반적으로 펩타이드는 그람 음성 박테리아 표면상의 LPS (lipopolysaccharide)와 작용하여 자가 유도된 수득 과정을 통해 유입된다. 이 과정의 첫 단계는 펩타이드가 세포 표면의 LPS에 존재하는 2가 양이온의 결합부위에 작용하는 것이며, 두 번째 단계는 세포막으로 삽입되어 채널을 형성하는 것이다.
첫 번째 단계에서 펩타이드는 Mn2+나 Mg2+ 같은 2가 이온보다 적어도 3배 이상 높은 친화력으로 LPS에 결합할 수 있기 때문에, 경쟁적으로 2가 이온들을 대체할 수 있으므로 외막의 정상적인 세포막의 특성을 상실하게 한다. 상기와 같이 영향 받은 세균막은 일시적으로 틈새를 만들게 되어 소수성 물질, 작은 단백질 혹은 항생제들이 통과하게 되며(Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316) 특히 펩타이드 자체를 받아들이는 효과가 증대된다.
두 번째 단계에서 펩타이드가 세포막에 삽입되어 채널을 형성하는 과정에 있어서 양이온 펩타이드 자신이 음전하의 세균막과 작용하게 되면 그 다음 소수성 부위는 막 쪽으로 향하고, 친수성 부위는 채널을 형성하기 위해 안쪽으로 향하게 된다. 이때 막 전위차가 클 때, 음전하 지질의 양이 많을 때 및 콜레스테롤의 양이 적을수록 채널이 잘 형성되며, 막 구조가 무너져서 세균이 사멸하게 된다(Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303).
이에 반해 많은 양의 콜레스테롤과 약간의 음이온 지질을 갖고 있는 진핵 세포의 경우에는 펩타이드가 효과적으로 작용을 하지 못하게 되므로 항균 펩타이드는 박테리아와 같은 원핵생물에 높은 선택적 활성을 지닌다. 또한 항균 펩타이드는 세포독성이 매우 적은 항생제로써 주목받고 있다.
Coprisin은 배설물 딱정벌레 Copris tripartitus에 의해 생성된 43-mer 곤충 방어 펩타이드이다. 그람 음성균 및 그람 양성균에 대한 강력한 살균 활성을 나타내며 3차원 구조는 곤충 방어선에서 빈번히 관찰되는 보존된 시스테인-안정화 알파-나선/베타-시트 모티브의 존재를 나타낸다.
이에 본 발명자들은 Coprisin의 알파-나선형 영역에서 유래된 짧은 노나펩타이드(nonapeptides)인 CopA3(LLCIALRKK-NH2)과 CopW(LLWIALRKK-NH2)가 실질적으로 강력한 항균 활성을 나타냄을 보고한 바 있다. 또한 CopA3로부터 유래된 시스테인 잔기를 지니지 않는 노나펩타이드인 CopW는 암피실린과 유의미한 시너지 효과를 나타내며 진균류에 대해서도 높은 항진균 활성을 나타냄을 보고한 바 있다(김재일 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 443 (2014) 483-8).
그러나 상기 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 경우 체내에 투입시 생리적 염 농도에서 불활성화 되기 쉽고 혈청내에 존재하거나 병원균이 분비하는 단백질 분해효소에 의해 혈청 내 분해되어 그 혈청 내 안정성이 저하되기 때문에 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 인체 내 생체이용률이 저하되는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 상기 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 체내 생리적 염 농도에서의 불활성화 및 혈청 내 분해 등과 같은 안정성 저하 문제를 해결하기 위해 노나펩타이드 골격의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형 및 Coprisin 유래 노나펩타이드의 일부 아미노산 치환을 통해 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 개발하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 체내 생리적 염 농도에서의 불활성화 및 혈청 내 분해 등과 같은 안정성 저하 문제를 해결하기 위한 것으로 노나펩타이드 골격의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형 및 Coprisin 유래 노나펩타이드의 일부 아미노산 치환을 통해 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)
l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)
상기 식에서
l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,
a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
이때 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 한다.
l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)
l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
상기 식에서
l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
Kyn은 Kynurenine 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
또한 상기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지님을 특징으로 한다.
이때 상기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지님을 특징으로 한다.
한편 상기 식 1 및 식 2의 항균 펩타이드 유도체는 8.0 % 적혈구 용액과 1시간 인큐베이션시 5.0 % 이하의 적혈구 용혈만을 야기시켜 높은 적혈구 용혈 안정성을 지님을 특징으로 한다.
또한 상기 식 1 및 식 2의 항균 펩타이드 유도체는 배지 내에서 25 % 인간 혈청과 함께 6시간 인큐베이션시 항균 펩타이드 유도체의 90 중량% 이상이 잔존하는 혈청 내 안정성을 지님을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 ⅰ) Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계; ⅱ) 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계; ⅲ) C-말단 카르복실기에 아민기를 도입하는 단계; 및 ⅳ) 역상 HPLC를 사용하여 항균 펩타이드 유도체를 분리 정제 수득하는 단계;를 포함하는 식 1로 표시되는 항균 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 ⅰ) Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계; ⅱ) 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계; 및 ⅲ) 역상 HPLC를 사용하여 항균 펩타이드 유도체를 분리 정제 수득하는 단계;를 포함하는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적 목적은 상기 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 효과는 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 체내 생리적 염 농도에서의 불활성화 및 혈청 내 분해 등과 같은 안정성 저하 문제를 해결하기 위한 것으로 노나펩타이드 골격의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형 및 Coprisin 유래 노나펩타이드의 일부 아미노산 치환을 통해 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균 등에 대하여 강력한 항박테리아 또는 항진균 작용을 나타내므로 상처 치료 촉진제, 외상 치료제, 구강 청정제 및 안약 등의 새로운 항박테리아 또는 항진균제로서 이용 가능한 유용한 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
도 1은 주사전자현미경을 이용한 그람 음성균, 그람 양성균 표면을 관찰한 것이다. 양이온 조절 Muller Hinton 브로스에서 최소 성장 억제농도(MIC)의 8배를 처리하였다. 세포를 고정화시킨 후 백금으로 코팅시켜 세포 표면을 관찰하였다. 시험군에는 대장균과 포도상구균을 P11 펩타이드 유도체로 처리한 결과를 나타내었으며 대조군에는 펩타이드 없이 처리한 결과를 나타내었다.
도 2는 본 발명의 항균 펩타이드 유도체를 25% 인간 혈청에 6시간 동안 반응시키고 C18 카트리지를 이용해 1차 정제한 후, 역상 고성능 액체크로마토그래피로 남아있는 펩타이드의 양을 정량하고 백분율로 수치화한 것이다.
본 발명은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다.
l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)
l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)
상기 식에서
l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,
a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
이때 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 한다.
l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)
l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
상기 식에서
l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
Kyn은 Kynurenine 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
또한 본 발명은 상기 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 노나펩타이드 골격으로 사용된 coprisin의 알파-나선형 영역에서 유래된 짧은 노나펩타이드(nonapeptides)인 CopW(LLWIALRKK-NH2)는 거의 용혈 활성이 없는 강력한 항균 활성을 지닌 펩타이드이다. 그러나 상기 노나펩타이드는 체내에 투입시 생리적 염 농도에서 불활성화 되기 쉽고 혈청 내에 존재하거나 병원균이 분비하는 단백질 분해효소에 의해 혈청 내 분해되어 그 혈청 내 안정성이 급격히 저하되어 그 상용화에 문제가 있었다.
따라서 본 발명은 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 문제점을 개선하기 위해 동일한 골격의 유도체를 개발함으로써 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 개선시켜 생체이용률을 증진시킨 것이다.
즉 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형을 통해 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 개선시켜 생체이용률이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 개발한 것이다.
따라서 본 발명은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)
l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)
상기 식에서
l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,
a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
이때 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 한다.
l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)
l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
상기 식에서
l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
Kyn은 Kynurenine 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
즉 본 발명의 바람직한 항균 펩타이드 유도체는 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기 내의 아미노부틸기에 아마이드 결합을 통해 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 도입하고 추가적으로 C 말단 라이신 잔기 내의 카르복실기에 아민기(-NH2)의 도입을 통해 C-말단을 변형시킴으로써 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 개선시켜 생체이용률이 증진된 항균 펩타이드 유도체인 것이다.
한편 상기 본 발명의 항균 펩타이드 유도체는 그람 음성균, 그람 양성균 또는 항생제 내성균에 효과적인 항균 활성을 지닌다.
이를 자세히 살펴보면, 본 발명의 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지닌다.
또한 본 발명의 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지닌다.
본 발명의 항균 펩타이드 유도체는 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
(단계 1) 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 합성
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계이다.
(단계 2) C-말단 라이신 잔기에 지방산 사슬의 도입 (식 2의 항균 펩타이드 유도체 제조)
노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 9번 말단 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 C-말단 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계이다. 단계 2에서 식 2로 표시되는 l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH 구조의 항균 펩타이드 유도체를 제조할 수 있다.
(단계 3) C-말단 라이신 잔기에 아민기의 도입 (식 1의 항균 펩타이드 유도체 제조)
단계 2에서 제조된 l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH 구조의 항균 펩타이드 유도체(식 2)의 C-말단 라이신기 내의 카르복실기에 아민기를 도입하여 식 1로 표시되는 l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 구조의 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계이다.
(단계 4) 분리 및 정제
단계 2 또는 단계 3에서 제조된 항균 펩타이드 유도체(식 1 및 식 2)를 역상 HPLC를 사용하여 분리 정제 수득하는 단계이다.
한편 본 발명은 상기 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 1일 투여량은 1~20 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 4~8 ㎎/㎏이나 임상결과에 따라 가감될 수 있으며 하루 1회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 제조실시예 및 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 제조실시예 및 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(제조실시예)
제조실시예에서 항균 펩타이드 유도체 P1 내지 P24를 제조하였다. 제조실시예에서 제조된 펩타이드 유도체 P1 내지 P24의 서열 구조를 표 1에 나타내었다.
Figure 112019068539500-pat00001
(제조실시예 1) P1의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드에 아민기 부가)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 L-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)을 제조하고 C-말단 라이신 잔기의 카르복실기에 아민기를 추가로 도입하여 제조하였다. 이때 차후 진행되는 하이드라진 용매의 탈보호 과정에서 DDE외에 N-말단에 위치하는 Fmoc도 탈보호화 되므로 이를 방지하고자 1번 L/D-Leu은 Boc-L/D-Leu을 사용한다. 최종 합성된 펩타이드의 탈보호 및 절단 과정은 트리플루오로아세트산:티오에니솔:에탄디티올:물의 부피비가 87.5 : 5 : 2.5 : 5 인 용액을 사용하여 진행한다.
(제조실시예 2) P2 및 P3의 제조 (P1 C-말단에 지방산 사슬 부가)
제조실시예 1에서 제조된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)의 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호 시키면서 C-말단 라이신 잔기 아미노 부틸기에 C8 또는 C12의 지방산 사슬을 도입하고 C-말단 라이신 잔기 카르복실기에 아민기를 추가로 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다.
(제조실시예 3) P4의 제조 (D-아미노산으로 구성된 Coprisin 유래 노나펩타이드)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 1의 P1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(제조실시예 4) P5 및 P6의 제조 (P4 C-말단에 지방산 사슬 부가)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 2의 P2 및 P3와 동일한 방법으로 제조하였다. P5의 경우 C8의 지방산 사슬을 도입하였고 P6의 경우 C10의 지방산 사슬을 도입하였다.
(제조실시예 5) P7 내지 P15의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드의 골격 아미노산 치환)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 P7 내지 P15의 D-아미노산으로 구성된 하기 펩타이드 골격을 제조한 것을 제외하고는 P6와 동일한 방법으로 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다. P7의 펩타이드 골격은 llwialkkk이었고 P8은 cllwialrkkc, P9는 ll-Kyn-ialrkk, P10은 llw-Kyn-alrkk, P11은 llwialrrk, P12는 llwialkkk, P13은 kkrlaiwll, P14는 llwialrk 및 P15는 rllwialrkk 이었다.
(제조실시예 6) P16의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드의 합성)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 L-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)을 제조하였다. 이때 차후 진행되는 하이드라진 용매의 탈보호 과정에서 DDE외에 N-말단에 위치하는 Fmoc도 탈보호화 되므로 이를 방지하고자 1번 L/D-Leu은 Boc-L/D-Leu을 사용한다. 최종 합성된 펩타이드의 탈보호 및 절단 과정은 트리플루오로아세트산:티오에니솔:에탄디티올:물의 부피비가 87.5 : 5 : 2.5 : 5 인 용액을 사용하여 진행한다.
(제조실시예 7) P17의 제조 (P16 C-말단에 지방산 사슬 부가)
제조실시예 6에서 제조된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)의 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 C-말단 라이신 잔기 아미노 부틸기에 C12의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다.
(제조실시예 8) P18의 제조 (D-아미노산으로 구성된 Coprisin 유래 노나펩타이드)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 6의 P16과 동일한 방법으로 제조하였다.
(제조실시예 9) P19의 제조 (P18 C-말단에 지방산 사슬 부가)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 7의 P17과 동일한 방법으로 제조하였다. P19의 경우 C10의 지방산 사슬을 도입하였다.
(제조실시예 10) P20 내지 P24의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드의 골격 아미노산 치환)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 P20 내지 P24의 D-아미노산으로 구성된 하기 펩타이드 골격을 제조한 것을 제외하고는 P19와 동일한 방법으로 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다. P20의 펩타이드 골격은 llwialkkk, P21은 cllwialrkkc, P22는 ll-Kyn-ialrkk, P23은 llwialrrk 및 P24는 llwialkkk 이었다.
(실시예 1) 항균 활성 시험
본 발명의 항균 펩타이드 유도체가 나타내는 항균 활성을 비교하기 위하여 그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대해 본 발명의 항균 펩타이드 유도체가 나타내는 항균 활성을 측정하였다.
본 발명의 시험 균주의 배양 및 MIC 농도 측정은 하기 표 2에 기재된 균주를 구입하여 세균수가 ml 당 1×106 콜로니 형성 유니트(CFU)가 되도록 배지로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로 플레이트에 분주한 후, 2배 계대 희석한 용액을 각 well에 균액과 동일한 양을 첨가하였다. 이후 18시간 동안 37℃에서 배양한 후 육을 통해 MIC 농도를 결정하였다. 해당 농도 미만 또는 초과하는 농도에서 균의 성장이 억제 또는 증식될 때는 해당 값의 미만(<), 또는 초과(>)로 표기하였다.
Figure 112019068539500-pat00002
항균 활성은 저염 조건인 2.3 mg/L의 Ca2+ 및 1.3 mg/L의 Mg2+를 포함하는 1% 펩톤 용액 하에서 그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대한 항균 활성을 측정하였으며 또한 고염 조건인 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+를 포함하는 Muller Hinton 브로스에서 그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대한 항균 활성을 측정하였으며 이는 육안으로 구분했을 때 균의 성장을 억제하는 최소 성장 억제농도(MIC)를 측정하였다.
표 3은 저염 조건하에서 그람 음성균, 그람 양성균에 대한 항균 활성을 나타낸 도표이고 표 4는 고염 조건하에서 그람 음성균, 그람 양성균에 대한 항균 활성을 나타낸 도표이다.
Figure 112019068539500-pat00003
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 균주에 높은 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.
Figure 112019068539500-pat00004
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 균주에 높은 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체는 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180)에는 특별한 항균 활성을 나타내지 못하였다.
실시예 1의 항균 활성 시험을 통해 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체가 고염 및 저염 조건하에서 대조군으로 사용된 멜리틴 보다 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 1차 선별 되었다.
(실시예 2) 적혈구 용혈 독성 시험
P1 내지 P24로 표시되는 제조실시예에서 제조된 항균 펩타이드 유도체에 대해 인간 적혈구 용혈 활성을 통하여 세포독성 여부를 측정하였다.
인간 적혈구를 PBS 완충용액으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리한 후 3회 세척하였다. PBS로 희석한 8% 적혈구 용액을 96-well 마이크로 타이터 플레이트에 100 ㎕ 씩 적가시킨 후, 펩타이드 용액 (200 μM) 100㎕ 씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 96-웰 마이크로플레이트를 원심력 1000 g로 5분간 원심분리 하였다.
상층액 100㎕ 씩 취하여 다른 96-웰 마이크로플레이트에 이송시킨 후 540 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 대조군 펩타이드로 melittin을 사용하였다. 이때 0.1 % Triton X-100로 처리하였을 경우의 값을 100 % 용혈율로 계산하였다.
그 결과 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14, P15, P19, P20, P21, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 5.0% 이하의 적혈구 용혈만을 야기시켜 높은 적혈구 용혈 안정성을 지님을 확인하였다.
Figure 112019068539500-pat00005
(실시예 3) 박테리아 항균 기작의 측정
본 발명의 항균 펩타이드 유도체가 나타내는 작용 기작을 확인하기 위하여 주사전자현미경을 이용한 그람 음성균 및 그람 양성균의 표면을 관찰하였다. 항균 펩타이드 유도체를 고염 농도인 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+에서 양이온 조절 Muller Hinton 브로스에서 최소 성장 억제농도(MIC)의 8배를 첨가하고 1 시간 반응시킨 후, 원심력 1500g로 10분간 원심분리 하였다.
세포 고정화를 위해 2.5 % 글루타알데하이드로 6-8시간 동안 처리하고 PBS로 두 번 세척하였다. 탈수과정은 50, 70, 90 및 100%의 에탄올에 10분간 담가 두었다가 마지막으로 15분간 100%의 에탄올과 부탄올의 (1:1) 혼합물에 침지시켜 측정하였다.
주사전자현미경 관찰 전에 박테리아를 백금으로 코팅한 후 세포의 표면을 관찰하였다. 시험군에는 대장균과 포도상구균을 본 발명의 P11 펩타이드 유도체로 처리한 결과를 나타내었으며 대조군에는 펩타이드 없이 처리한 결과를 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 대조군의 주사전자현미경 사진에는 대장균과 포도상구균이 그대로 번식하고 있으나 본 발명의 P11 펩타이드 유도체를 첨가시킨 시험군의 경우 대장균과 포도상구균의 세포벽이 파괴되어 박테리아 균주가 사멸하는 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 4) 혈청내 안정성 시험
P1 내지 P24로 표시되는 제조실시예에서 제조된 항균 펩타이드 유도체에 대해 혈청내 안정성 시험을 수행하였다.
인간 혈청을 RPMI 1640 배지와 혼합하여 25%로 희석하고 펩타이드 유도체를 30 ㎍/㎖의 농도로 용해시킨다(총 부피는 200 ㎕). 37℃에서 6시간 반응시킨 후, 반응을 종료시키기 위해 1N HCl 용액 20 ㎕를 첨가한다. 반응이 종료된 용액은 미리 메탄올과 물로 세척한 C18 카트리지에 로딩한다. 이후 0.1 % TFA가 포함된 물 또는 0.1 % TFA가 포함된 10% 아세토니트릴 용액을 3~5 ㎖를 유출시켜 비특이적 결합을 한 혈청 및 배지를 세정하고 30% 아세토니트릴 용액 2 ㎖을 유출시켜 카트리지로부터 본 발명의 펩타이드 유도체를 분리시킨다.
이후 펩타이드 유도체의 양을 정량하기 위하여 역상 고성능 액체크로마토그래피(Reverse-phase HPLC)에 펩타이드 용액 450 ㎕를 투입하고 나타나는 펩타이드의 픽(peak)의 높이를 반응 0 시간의 펩타이드 (30 ㎍/㎖)의 픽 높이와 비교하여 남아있는 잔량을 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, L-형 아미노산으로 구성된 P1 내지 P3, P16, P17로 표시되는 펩타이드 유도체는 6시간 이후 40% 미만이 잔존하였다.
또한 D-아미노산으로 구성되었으나 C-말단에 지방산을 부가시키지 않은 P4 및 P18로 표시되는 펩타이드 유도체도 6시간 이후 60% 미만이 잔존하였다.
그러나 D-아미노산으로 구성되고 C-말단에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 부가시킨 P5 내지 P15 및 P19 내지 P24로 표시되는 펩타이드 유도체는 6시간 이후 90% 이상의 펩타이드가 잔존하였다.
실시예 1 내지 4의 시험을 통해 P1 내지 P24의 본 발명에서 합성된 펩타이드 유도체 중 P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24 펩타이드 유도체가 높은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 지니는 펩타이드 유도체로 선별되었다.
또한 이를 통해 본 발명의 Coprisin 유래 l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 (식 1) 또는 l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH (식 2)로 표시되는 항균 펩타이드 유도체가 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 것을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 나타내는 Coprisin 유래 항균 펩타이드 유도체에 있어서, 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.

    l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
    l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
    l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
    상기 식에서
    l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
    Kyn은 Kynurenine 이고,
    (Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
    Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균 기탁번호: KCTC 1637, 아시네토박터 바우마니균 기탁번호: KCCM 40203, 황색포도상구균기탁번호: KCTC 1621, 엔테로코커스 패칼리스균 기탁번호: KCCM 11814, 다약제 내성 녹농균 기탁번호: CCARM 2180, 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균 기탁번호: ATCC BAA 1605, 메티실린-내성 황색 포도상구균 기탁번호: KCCM 40510 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균 기탁번호: ACTT 51575에서 선택된 1종 이상의 균주에 항균 활성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균 기탁번호: KCTC 1637, 아시네토박터 바우마니균 기탁번호: KCCM 40203, 황색포도상구균 기탁번호: KCTC 1621, 엔테로코커스 패칼리스균 기탁번호: KCCM 11814, 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균 기탁번호: ATCC BAA 1605, 메티실린-내성 황색 포도상구균 기탁번호: KCCM 40510 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균 기탁번호: ACTT 51575에서 선택된 1종 이상의 균주에 항균 활성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
  5. 삭제
  6. 제 2항에 있어서, 상기 항균 펩타이드 유도체는 배지 내에서 25 % 인간 혈청과 함께 6시간 인큐베이션시 항균 펩타이드 유도체의 90 중량% 이상이 잔존하는 혈청 내 안정성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 2항의 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물.
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