WO2020013527A1 - 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to antimicrobial peptide derivatives having enhanced antimicrobial activity, hemolytic stability and serum stability. More specifically, the present invention relates to an antimicrobial peptide derivative having enhanced antibacterial activity, hemolytic stability, and serum stability based on Coprisin-derived CopW peptide (LLWIALRKK-NH 2 ).
- Antimicrobial peptides unlike conventional antibiotics, are attracting attention as a novel antimicrobial material that can treat antibiotic resistant bacteria having the characteristics of antimicrobial activity by attacking the lipid membrane of the pathogen.
- Antimicrobial peptides are part of the innate immunity found in a variety of organisms, including bacteria, invertebrates, vertebrates, and plants. They are usually composed of up to 50 amino acids and contain a large number of arginine, lysine or histidine, which are generally positively charged. It contains about% hydrophobic amino acid residues. Due to these characteristics, antimicrobial peptides form an amphipathic ⁇ -helix or ⁇ -sheet when they come into contact with negatively charged bacterial cell membranes and enter the cell membranes to reduce the potential of the membranes. It is known to kill bacteria by altering or breaking holes in the cell membrane itself.
- Peptides are generally introduced through a self-derived obtaining process by interacting with lipopolysaccharide (LPS) on Gram-negative bacterial surfaces.
- LPS lipopolysaccharide
- the first step in this process is that the peptide acts on the binding site of the divalent cations present in the LPS on the cell surface, and the second step is inserted into the cell membrane to form a channel.
- the peptide can bind to LPS with at least three times higher affinity than divalent ions such as Mn 2+ or Mg 2+ , which can competitively replace divalent ions, thus reducing the normal membrane properties of the outer membrane.
- divalent ions such as Mn 2+ or Mg 2+
- Mn 2+ or Mg 2+ divalent ions
- the affected bacterial membranes temporarily create niches, allowing hydrophobic substances, small proteins or antibiotics to pass through (Piers, KL et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316). The acceptance effect is increased.
- the hydrophobic portion is then directed toward the membrane and the hydrophilic portion is inward to form the channel.
- the potential of the membrane is large, the amount of negatively charged lipids and the amount of cholesterol decreases, the channel is formed well, and the membrane structure collapses and the bacteria are killed (Falla, T. et al., J. Biol. Chem). , 1996, 271, 19298-19303.
- the peptides do not work effectively, so the antimicrobial peptides have high selective activity against prokaryotes such as bacteria. Antimicrobial peptides are also attracting attention as antibiotics with very low cytotoxicity.
- Coprisin is a 43-mer insect defense peptide produced by the dung beetle Copris tripartitus . It exhibits strong bactericidal activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria and the three-dimensional structure indicates the presence of conserved cysteine-stabilized alpha-helix / beta-sheet motifs frequently observed in insect defenses.
- CopA3 (LLCIALRKK-NH 2 ) and CopW (LLWIALRKK-NH 2 ), which are short nonapeptides derived from the alpha-helical region of Coprisin, exhibit substantially strong antibacterial activity.
- CopW a nonapeptide without a cysteine residue derived from CopA3, has a significant synergistic effect with ampicillin and has shown high antifungal activity against fungi (Kim Jae-il et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 443 (2014). 483-8).
- Copsin-derived CopW (LLWIALRKK-NH 2 ) nona peptides are easily inactivated at physiological salt concentration when introduced into the body, and are degraded in serum by proteolytic enzymes present in serum or secreted by pathogens, thereby degrading their stability in serum.
- bioavailability of Coprisin-derived CopW (LLWIALRKK-NH 2 ) nona peptide is lowered in the human body.
- the present inventors introduced D-type amino acids into amino acids of the nonapeptide backbone to solve stability degradation problems such as inactivation of physiological salt concentration of Copsin-derived CopW (LLWIALRKK-NH 2 ) nonapeptide and degradation in serum.
- Antimicrobial activity and hemolytic stability through the addition of fatty acid chains through acylation to nonapeptide C-terminal lysine residues and modification of C-terminus through introduction of amine groups (-NH 2 ) and some amino acid substitutions of nonpripeptides derived from Coprisin.
- -NH 2 amine groups
- the problem to be solved by the present invention is to solve the problem of deterioration of stability such as inactivation of Coprisin-derived CopW (LLWIALRKK-NH 2 ) nona peptide in the body physiological salt concentration and degradation in serum.
- Antimicrobial through the addition of fatty acid chains through acylation to nonapeptide C-terminal lysine residues and modification of the C-terminal through introduction of amine groups (-NH 2 ) and some amino acid substitutions of nonpripeptide-derived nonapeptides.
- -NH 2 amine groups
- l is D-Leu
- x is D-Trp or Kynurenine
- i is D-Ile
- a is D-Ala
- y is D-Lys or D-Arg
- k is D-Lys
- (Cn: 0) means Cn added as an amide bond to the n-butylamine group of D-Lys
- Cn means a fatty acid chain of C6, C8, C10, C12 or C14.
- the antimicrobial peptide derivative is characterized in that the peptide derivative of the following formula 1-1, formula 1-2, formula 1-3 or formula 1-4.
- l is D-Leu
- w is D-Trp
- i is D-Ile
- a is D-Ala
- r is D-Arg
- k is D-Lys
- Kyn is Kynurenine
- (Cn: 0) means Cn added as an amide bond to the n-butylamine group of D-Lys
- Cn means a fatty acid chain of C6, C8, C10, C12 or C14.
- the antimicrobial peptide derivatives represented by Formula 1-1, Formula 1-2, Formula 1-3, and Formula 1-4 include 2.0 to 3.0 mg / L of Ca 2+ and 1.0 to 2.0 mg / L of Mg 2+ .
- Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: KCTC 1637), Acinetobacter Baumani (Accession No .: KCCM 40203), Staphylococcus aureus (Accession No .: KCTC 1621), Enterococcus faecalis (deposited) than melittin used as a control under low salt conditions.
- KCCM 11814 multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: CCARM 2180), multi-drug resistant Acinetobacter Baumani (Accession No .: ATCC BAA 1605), methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Accession No .: KCCM 40510) Or vancomycin-resistant enterococcus faecalis (Accession No .: ACTT 51575).
- the antimicrobial peptide derivatives represented by Formula 1-1, Formula 1-2, Formula 1-3, and Formula 1-4 are control groups under high salt conditions of 50 mg / L Ca 2+ and 10 mg / L Mg 2+ .
- Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: KCTC 1637), Acinetobacter Baumani (Accession No .: KCCM 40203), Staphylococcus aureus (Accession No .: KCTC 1621), Enterococcus faecalis (Accession No .: KCCM 11814) ), Multi-drug resistant Acinetobacter Baumanis (Accession Number: ATCC BAA 1605), Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (Accession Number: KCCM 40510) or Vancomycin-Resistant Enterococcus faecalis (Accession Number: ACTT 51575) It is characterized by having a high antim
- the antimicrobial peptide derivatives of Equations 1 and 2 are characterized by having high erythrocyte hemolysis stability by causing only erythrocyte hemolysis of 5.0% or less when incubated with 8.0% erythrocyte solution for 1 hour.
- the antimicrobial peptide derivatives of Formulas 1 and 2 are characterized in that the stability in the serum at least 90% by weight of the antimicrobial peptide derivatives remaining after 6 hours incubation with 25% human serum in the medium.
- Still another object of the present invention is to prepare a nonapeptide backbone (l l x i a y y k) composed of D-amino acids by SPPS chemical synthesis using Fmoc protecting group using Wang resin and amide resin; 2) Deprotection of DDE in the presence of 4% hydrazine solvent after introduction of a DDE (1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene) ethyl) protecting group at residue 9 lysine Preparing an antimicrobial peptide derivative by introducing a C6 to C14 fatty acid chain to the aminobutyl group of the lysine residue; 3) introducing an amine group to the C-terminal carboxyl group; And 4) separating and obtaining the antimicrobial peptide derivative using reverse phase HPLC. It is to provide a method for preparing the antimicrobial peptide derivative represented by Formula 1.
- the present invention provides a method for preparing a non-peptide backbone (l l x i a y y k) consisting of D-amino acids by SPPS chemical synthesis using a Fmoc protecting group using Wang resin and amide resin; 2) Deprotection of DDE in the presence of 4% hydrazine solvent after introduction of a DDE (1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene) ethyl) protecting group at residue 9 lysine Preparing an antimicrobial peptide derivative by introducing a C6 to C14 fatty acid chain to the aminobutyl group of the lysine residue; And 3) separating and obtaining the antimicrobial peptide derivative using reversed phase HPLC.
- the method for preparing an antimicrobial peptide derivative represented by Formula 2 includes;
- the effect of the present invention is to solve stability problems such as inactivation of Coprisin-derived CopW (LLWIALRKK-NH 2 ) nona peptide at physiological salt concentration in the body and degradation in serum.
- Antimicrobial activity hemolysis through introduction and addition of fatty acid chains through acylation to nonapeptide C-terminal lysine residues and modification of C-terminal through introduction of amine groups (-NH 2 ) and some amino acid substitutions of Coprisin-derived nonapeptides, hemolysis It is to provide an antimicrobial peptide derivative having enhanced stability and stability in serum.
- the present invention exhibits strong antibacterial or antifungal action against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi, and thus provides useful antimicrobial peptide derivatives that can be used as novel antibacterial or antifungal agents, such as wound healing accelerators, trauma treatments, mouthwashes and eye drops. will be.
- Figure 1 shows the gram negative bacteria, gram positive bacteria surface using a scanning electron microscope.
- Cation-regulated Muller Hinton broths were treated with 8 times the minimum growth inhibitory concentration (MIC). The cells were immobilized and then coated with platinum to observe the cell surface.
- E. coli and Staphylococcus aureus were treated with the P11 peptide derivative, and the control group was treated without the peptide.
- FIG. 2 shows the antimicrobial peptide derivative of the present invention reacted with 25% human serum for 6 hours and purified first using a C18 cartridge, followed by reverse phase high performance liquid chromatography to quantify and quantify the percentage.
- the present invention relates to an antimicrobial peptide derivative represented by Formula 1 or Formula 2 derived from Coprisin, which exhibits high bioavailability with enhanced antimicrobial activity, erythrocyte hemolysis stability, and serum stability.
- l is D-Leu
- x is D-Trp or Kynurenine
- i is D-Ile
- a is D-Ala
- y is D-Lys or D-Arg
- k is D-Lys
- (Cn: 0) means Cn added as an amide bond to the n-butylamine group of D-Lys
- Cn means a fatty acid chain of C6, C8, C10, C12 or C14.
- the antimicrobial peptide derivative is characterized in that the peptide derivative of the following formula 1-1, formula 1-2, formula 1-3 or formula 1-4.
- l is D-Leu
- w is D-Trp
- i is D-Ile
- a is D-Ala
- r is D-Arg
- k is D-Lys
- Kyn is Kynurenine
- (Cn: 0) means Cn added as an amide bond to the n-butylamine group of D-Lys
- Cn means a fatty acid chain of C6, C8, C10, C12 or C14.
- the present invention provides a pharmaceutical composition or a cosmetic composition for skin improvement for the treatment of bacterial or fungal infection diseases containing 0.01 to 30% by weight of the antimicrobial peptide derivative as an active ingredient.
- LLCRRKK-NH 2 which is a short nonapeptides derived from the alpha-helical region of coprisin used as a nona peptide backbone in the present invention, is a peptide having strong antimicrobial activity with almost no hemolytic activity.
- the nonapeptide is easily inactivated at physiological salt concentration when introduced into the body, and is degraded in serum by proteolytic enzymes present in the serum or secreted by pathogens.
- the present invention is to improve the antimicrobial activity, erythrocyte hemolysis stability and serum stability by developing derivatives of the same skeleton in order to improve the problems of Coprisin-derived CopW (LLWIALRKK-NH 2 ) nona peptide is to enhance the bioavailability.
- the D-type amino acid is introduced into the amino acid of the nonapeptide backbone (llxialyyk), the amino acid chain is added to the nonapeptide C-terminal lysine residue, and the C-terminus is modified through the introduction of an amine group (-NH 2 ).
- an antimicrobial peptide derivative with enhanced bioavailability.
- the present invention is to provide an antimicrobial peptide derivative represented by the following formula 1 or formula 2 derived from Coprisin exhibiting high bioavailability, enhanced antimicrobial activity, erythrocyte hemolysis stability and stability in serum.
- l is D-Leu
- x is D-Trp or Kynurenine
- i is D-Ile
- a is D-Ala
- y is D-Lys or D-Arg
- k is D-Lys
- (Cn: 0) means Cn added as an amide bond to the n-butylamine group of D-Lys
- Cn means a fatty acid chain of C6, C8, C10, C12 or C14.
- the antimicrobial peptide derivative is characterized in that the peptide derivative of the following formula 1-1, formula 1-2, formula 1-3 or formula 1-4.
- l is D-Leu
- w is D-Trp
- i is D-Ile
- a is D-Ala
- r is D-Arg
- k is D-Lys
- Kyn is Kynurenine
- (Cn: 0) means Cn added as an amide bond to the n-butylamine group of D-Lys
- Cn means a fatty acid chain of C6, C8, C10, C12 or C14.
- preferred antimicrobial peptide derivatives of C6, C8, C10, C12 or C14 are introduced through the amide bond of aminobutyl group in the non-peptide C-terminal lysine residue and introducing D-type amino acid into amino acid of nona peptide backbone (llxialyyk).
- Antimicrobial peptides with enhanced bioavailability by improving the antimicrobial activity, erythrocyte hemolysis stability and serum stability by introducing fatty acid chains and additionally modifying the C-terminus by introducing an amine group (-NH 2 ) to a carboxyl group within the C-terminal lysine residue. It is a derivative.
- the antimicrobial peptide derivative of the present invention has an effective antimicrobial activity against gram negative bacteria, gram positive bacteria or antibiotic resistant bacteria.
- the antimicrobial peptide derivatives represented by Formula 1-1, Formula 1-2, Formula 1-3 and Formula 1-4 of the present invention are 2.0 to 3.0 mg / L of Ca 2+ and 1.0 to 2.0 mg / L.
- Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: KCTC 1637), Acinetobacter Baumani (Accession No .: KCCM 40203), Staphylococcus aureus (Accession No .: KCTC 1621), Enterococcus than melittin used as a control under low salt conditions of Mg 2+ Packalis (Accession No .: KCCM 11814), Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: CCARM 2180), Multidrug-resistant Acinetobacter Baumanis (Accession No .: ATCC BAA 1605), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Deposit No .:
- antimicrobial peptide derivatives represented by Formula 1-1, Formula 1-2, Formula 1-3, and Formula 1-4 of the present invention are subjected to high salt conditions of 50 mg / L Ca 2+ and 10 mg / L Mg 2+ Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: KCTC 1637), Acinetobacter Baumani (Accession No .: KCCM 40203), Staphylococcus aureus (Accession No .: KCTC 1621), Enterococcus faecalis (Accession No.
- KCCM 11814 multi-drug resistant acinetobacter Baumanis (Accession Number: ATCC BAA 1605), Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (Accession Number: KCCM 40510) or Vancomycin-Resistant Enterococcus faecalis (Accession Number: ACTT 51575) has a high antibacterial activity against one or more strains selected.
- the antimicrobial peptide derivative of the present invention can be prepared by the following method.
- Step 1 Synthesis of nonapeptide skeleton (l l x i a l y y k)
- Step 2 Introduction of fatty acid chain to C-terminal lysine residue (preparation of antimicrobial peptide derivative of formula 2)
- Step 3 Introduction of an amine group to the C-terminal lysine residue (preparation of antimicrobial peptide derivative of formula 1)
- the antimicrobial peptide derivative (Formula 1 and Formula 2) prepared in Step 2 or 3 is separated and purified using reverse phase HPLC.
- the present invention provides a pharmaceutical composition or a cosmetic composition for skin improvement for the treatment of bacterial or fungal infection diseases containing 0.01 to 30% by weight of the antimicrobial peptide derivative as an active ingredient.
- composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredient for administration.
- Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, as necessary, including antioxidants, buffers, Other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
- Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
- composition of the present invention can be administered orally or parenterally according to the desired method, the dosage is depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of disease, etc. of the individual. The range varies.
- the daily dosage of the composition of the present invention is 1 to 20 mg / kg, preferably about 4 to 8 mg / kg, but may be added or subtracted according to clinical results, and is preferably administered once to several times a day.
- antimicrobial peptide derivatives P1 to P24 were prepared.
- Table 1 shows the sequence structures of the peptide derivatives P1 to P24 prepared in the preparation example.
- Non-peptide backbones consisting of L-amino acids were prepared by SPPS chemical synthesis using Fmoc protecting groups using Wang resins and amide resins, and additionally introduced with amine groups to the carboxyl groups of C-terminal lysine residues.
- Fmoc located at the N-terminus in addition to DDE is also deprotected in the subsequent deprotection process of the hydrazine solvent, so to prevent this, L / D-Leu uses Boc-L / D-Leu.
- Deprotection and cleavage of the final synthesized peptide is carried out using a solution having a volume ratio of trifluoroacetic acid: thiounisol: ethanedithiol: water of 87.5: 5: 2.5: 5.
- a nonapeptide backbone (llwialrkk) consisting of D-amino acids was prepared by SPPS chemical synthesis, and was prepared in the same manner as in P1 of Preparation Example 1.
- a nonapeptide backbone (llwialrkk) consisting of D-amino acids was prepared by SPPS chemical synthesis, except that P2 and P3 of Preparation Example 2 were prepared. In the case of P5, the fatty acid chain of C8 was introduced and in the case of P6, the fatty acid chain of C10 was introduced.
- Antimicrobial peptide derivatives were prepared in the same manner as P6, except that the following peptide backbones composed of D-amino acids of P7 to P15 were prepared by SPPS chemical synthesis using a Fmoc protecting group using Wang resin and amide resin.
- the peptide backbone of P7 was llwialkkk
- P8 was cllwialrkkc
- P9 was ll-Kyn-ialrkk
- P10 was llw-Kyn-alrkk
- P11 was llwialrrk
- P12 was llwialkkk
- P13 was kkrlaiwll
- P14 was llwialrk
- P15 was rllwialrkk.
- Non-peptide backbone consisting of L-amino acids was prepared by SPPS chemical synthesis using a Fmoc protecting group using Wang resin and amide resin.
- Fmoc located at the N-terminus in addition to DDE is also deprotected in the subsequent deprotection process of the hydrazine solvent, so to prevent this, L / D-Leu No. 1 uses Boc-L / D-Leu. Deprotection and cleavage of the final synthesized peptide is carried out using a solution having a volume ratio of trifluoroacetic acid: thiounisol: ethanedithiol: water of 87.5: 5: 2.5: 5.
- DDE (1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene) ethyl) protecting group to lysine residue 9 of the nonapeptide backbone (LLWIALRKK) prepared in Preparation Example 6
- the antimicrobial peptide derivative was prepared by introducing a C12 fatty acid chain into the C-terminal lysine residue amino butyl group while deprotecting DDE in the presence of 4% hydrazine solvent.
- a nonapeptide backbone (llwialrkk) consisting of D-amino acids was prepared by SPPS chemical synthesis, and was prepared in the same manner as P16 of Preparation Example 6.
- a nonapeptide backbone (llwialrkk) consisting of D-amino acids was prepared by SPPS chemical synthesis, and was prepared in the same manner as P17 of Preparation Example 7. For P19 a fatty acid chain of C10 was introduced.
- Antimicrobial peptide derivatives were prepared in the same manner as P19, except that the following peptide backbones composed of D-amino acids of P20 to P24 were prepared by SPPS chemical synthesis using a Fmoc protecting group using Wang resin and amide resin.
- the peptide backbone of P20 was llwialkkk, P21 was cllwialrkkc, P22 was ll-Kyn-ialrkk, P23 was llwialrrk and P24 was llwialkkk.
- the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide derivative of the present invention was measured against gram negative bacteria, gram positive bacteria and antibiotic resistant bacteria.
- Cultivation of the test strain of the present invention and measurement of MIC concentration was purchased in the strains described in Table 2 below, diluted with medium so that the number of bacteria to 1 ⁇ 10 6 colony forming unit (CFU) per ml and 50 ⁇ l each in 96-well microplate After dispensing, two-fold serially diluted solutions were added to each well in the same amount as the bacterial solution. After incubating for 18 hours at 37 °C MIC concentration was determined through the flesh. When the growth of the bacteria is inhibited or propagated at concentrations below or above the concentrations, it is indicated as below ( ⁇ ) or above (>).
- the antimicrobial activity was measured under the 1% peptone solution containing 2.3 mg / L Ca 2+ and 1.3 mg / L Mg 2+ in low salt condition.
- the antimicrobial activity of Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria and antibiotic-resistant bacteria in Muller Hinton broths containing 50 mg / L Ca 2+ and 10 mg / L Mg 2+ was measured.
- Minimum growth inhibitory concentration (MIC) was measured.
- Table 3 is a table showing the antimicrobial activity against Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria under low salt conditions and Table 4 is a table showing the antimicrobial activity against Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria under high salt conditions.
- the antimicrobial peptide derivatives represented by P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, and P24 are 2.0 to 3.0 mg / Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: KCTC 1637), Acinetobacter Baumani (Accession No .: KCCM 40203), Yellow, than melittin used as a control under low salt conditions of L Ca 2+ and 1.0-2.0 mg / L Mg 2+ Staphylococcus (Accession No .: KCTC 1621), Enterococcus faecalis (Accession No .: KCCM 11814), Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: CCARM 2180), Multidrug-resistant Acinetobacter Baumani (Accession No .: ATCC BAA
- the antimicrobial peptide derivatives represented by P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, and P24 are 50 mg / L.
- Pseudomonas aeruginosa (Accession No .: KCTC 1637), Acinetobacter Baumanis (Accession No .: KCCM 40203), Staphylococcus aureus (treatment number) than melittin used as a control under high salt conditions of Ca 2+ and 10 mg / L Mg 2+ No .: KCTC 1621), Enterococcus faecalis (Accession No .: KCCM 11814), Multidrug resistant acinetobacter Baumani (Accession No .: ATCC BAA 1605), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Accession No .: KCCM 40510) ) Or vancomycin-resistant Enterococcus faecalis (Accession Number: ACTT 51575) was confirmed to exhibit high antimicrobial activity.
- the antimicrobial peptide derivative synthesized in the present invention did not show a special antimicrobial activity against multi-drug resistant P. aeruginosa (Accession No .: CCARM 2180).
- Cytotoxicity was measured through human erythrocyte hemolysis activity against the antimicrobial peptide derivatives prepared in the preparation examples represented by P1 to P24.
- Human red blood cells were diluted with PBS buffer, centrifuged at 1000 g for 10 minutes, and washed three times. 100 ⁇ l of the 8% erythrocyte solution diluted with PBS was added dropwise to the 96-well micro titer plate, followed by 100 ⁇ l of peptide solution (200 ⁇ M) and incubated for 1 hour at 37 ° C., followed by 96-well microplate The centrifugal force was centrifuged for 5 minutes at 1000 g.
- the antimicrobial peptide derivatives represented by P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14, P15, P19, P20, P21, P22, P23, and P24 of the antimicrobial peptide derivatives synthesized in the present invention was confirmed to have high erythrocyte hemolytic stability by causing only erythrocyte hemolysis of 5.0% or less.
- the surface of Gram-negative and Gram-positive bacteria was observed using a scanning electron microscope.
- the antimicrobial peptide derivative was reacted for 1 hour after adding 8 times the minimum growth inhibitory concentration (MIC) in a cation-regulated Muller Hinton broth at high salt concentrations of 50 mg / L Ca 2+ and 10 mg / L Mg 2+ . Centrifugation was performed at 1500 g for 10 minutes.
- MIC minimum growth inhibitory concentration
- the surface of the cells was observed after coating the bacteria with platinum before scanning electron microscopy.
- E. coli and Staphylococcus were treated with the P11 peptide derivative of the present invention, and the control group was shown without the peptide.
- the E. coli and Staphylococcus coli are multiplied in the scanning electron micrograph of the control group, but in the test group to which the P11 peptide derivative of the present invention is added, the cell walls of Escherichia coli and Staphylococcus are destroyed and the bacterial strain is killed. I could confirm that.
- Serum stability tests were performed on the antimicrobial peptide derivatives prepared in the preparation examples represented by P1 to P24.
- Human serum is mixed with RPMI 1640 medium to dilute to 25% and the peptide derivative is dissolved at a concentration of 30 ⁇ g / ml (total volume 200 ⁇ l). After reacting at 37 ° C. for 6 hours, 20 ⁇ l of 1N HCl solution is added to terminate the reaction. After completion of the reaction, the solution is loaded into a C18 cartridge previously washed with methanol and water. Thereafter, 3 to 5 ml of water containing 0.1% TFA or 10% acetonitrile solution containing 0.1% TFA was distilled out to wash non-specific bound serum and medium, and 2 ml of 30% acetonitrile solution was spilled from the cartridge. The peptide derivative of the present invention is isolated.
- peptide derivatives represented by P4 and P18 composed of D-amino acids but without adding fatty acids at the C-terminus remained less than 60% after 6 hours.
- the peptide derivatives represented by P5 to P15 and P19 to P24 composed of D-amino acids and C6 to C14 fatty acid chains added to the C-terminus remained more than 90% of peptides after 6 hours.
- P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, and P24 peptide derivatives among the peptide derivatives synthesized in the present invention through the tests of Examples 1 to 4 have high antimicrobial activity, erythrocyte hemolytic stability, and serum It was selected as a peptide derivative with stability.
- antimicrobial peptide derivatives represented by Coprisin-derived llxialyyk (Cn: 0) -NH 2 (Formula 1) or llxialyyk (Cn: 0) -COOH (Formula 2) of the present invention have antimicrobial activity, erythrocyte hemolytic stability, and serum It was confirmed that the stability shows high bioavailability.
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Abstract
본 발명은 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 Coprisin 유래 CopW 펩타이드(LLWIALRKK-NH2)를 기반으로 한 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 Coprisin 유래 CopW 펩타이드(LLWIALRKK-NH2)를 기반으로 한 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다.
페니실린이 발명된 이후 많은 항생제가 개발되고 보고되었으나 1980년부터 다양한 항생제에 내성을 나타내는 병원균이 보고되면서 이들 내성균을 치료할 수 있는 새로운 항생제에 대한 개발의 필요성이 대두되었다. 항균 펩타이드는 기존의 항생제와 달리 병원균의 지질막을 공격하여 항균 활성을 나타내는 특징을 지닌 항생제 내성균을 치료할 수 있는 신규 항균 물질로 주목을 받고 있다.
항균 펩타이드는 박테리아, 무척추 동물, 척추 동물, 식물에 이르는 다양한 생명체에서 발견이 되는 선천 면역의 일부로 대개 50개 이하의 아미노산으로 구성되어 있으며 다수의 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘을 포함하고 있어 전체적으로 양전하를 띠며 30% 정도의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다. 이러한 특징으로 인해 항균펩타이드는 음전하를 띤 세균 세포막과 접촉하게 되면 양친매성 α-나선구조(amphipathic α-helix) 혹은 β-병풍구조(β-sheet)를 형성하여 세포막 속으로 끼어 들어가 세포막의 전위를 변화시키거나 세포막 자체에 구멍을 내어 세포막을 파괴함으로써 세균을 사멸시키는 것으로 알려져 있다.
항균 펩타이드의 작용기전과 선택성은 세균의 막과 상호 작용하는 방식에 따라 달라진다. 일반적으로 펩타이드는 그람 음성 박테리아 표면상의 LPS (lipopolysaccharide)와 작용하여 자가 유도된 수득 과정을 통해 유입된다. 이 과정의 첫 단계는 펩타이드가 세포 표면의 LPS에 존재하는 2가 양이온의 결합부위에 작용하는 것이며, 두 번째 단계는 세포막으로 삽입되어 채널을 형성하는 것이다.
첫 번째 단계에서 펩타이드는 Mn2+나 Mg2+ 같은 2가 이온보다 적어도 3배 이상 높은 친화력으로 LPS에 결합할 수 있기 때문에, 경쟁적으로 2가 이온들을 대체할 수 있으므로 외막의 정상적인 세포막의 특성을 상실하게 한다. 상기와 같이 영향 받은 세균막은 일시적으로 틈새를 만들게 되어 소수성 물질, 작은 단백질 혹은 항생제들이 통과하게 되며(Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316) 특히 펩타이드 자체를 받아들이는 효과가 증대된다.
두 번째 단계에서 펩타이드가 세포막에 삽입되어 채널을 형성하는 과정에 있어서 양이온 펩타이드 자신이 음전하의 세균막과 작용하게 되면 그 다음 소수성 부위는 막 쪽으로 향하고, 친수성 부위는 채널을 형성하기 위해 안쪽으로 향하게 된다. 이때 막 전위차가 클 때, 음전하 지질의 양이 많을 때 및 콜레스테롤의 양이 적을수록 채널이 잘 형성되며, 막 구조가 무너져서 세균이 사멸하게 된다(Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303).
이에 반해 많은 양의 콜레스테롤과 약간의 음이온 지질을 갖고 있는 진핵 세포의 경우에는 펩타이드가 효과적으로 작용을 하지 못하게 되므로 항균 펩타이드는 박테리아와 같은 원핵생물에 높은 선택적 활성을 지닌다. 또한 항균 펩타이드는 세포독성이 매우 적은 항생제로써 주목받고 있다.
Coprisin은 배설물 딱정벌레 Copris tripartitus에 의해 생성된 43-mer 곤충 방어 펩타이드이다. 그람 음성균 및 그람 양성균에 대한 강력한 살균 활성을 나타내며 3차원 구조는 곤충 방어선에서 빈번히 관찰되는 보존된 시스테인-안정화 알파-나선/베타-시트 모티브의 존재를 나타낸다.
이에 본 발명자들은 Coprisin의 알파-나선형 영역에서 유래된 짧은 노나펩타이드(nonapeptides)인 CopA3(LLCIALRKK-NH2)과 CopW(LLWIALRKK-NH2)가 실질적으로 강력한 항균 활성을 나타냄을 보고한 바 있다. 또한 CopA3로부터 유래된 시스테인 잔기를 지니지 않는 노나펩타이드인 CopW는 암피실린과 유의미한 시너지 효과를 나타내며 진균류에 대해서도 높은 항진균 활성을 나타냄을 보고한 바 있다(김재일 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 443 (2014) 483-8).
그러나 상기 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 경우 체내에 투입시 생리적 염 농도에서 불활성화 되기 쉽고 혈청내에 존재하거나 병원균이 분비하는 단백질 분해효소에 의해 혈청 내 분해되어 그 혈청 내 안정성이 저하되기 때문에 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 인체 내 생체이용률이 저하되는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 상기 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 체내 생리적 염 농도에서의 불활성화 및 혈청 내 분해 등과 같은 안정성 저하 문제를 해결하기 위해 노나펩타이드 골격의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형 및 Coprisin 유래 노나펩타이드의 일부 아미노산 치환을 통해 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 개발하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 체내 생리적 염 농도에서의 불활성화 및 혈청 내 분해 등과 같은 안정성 저하 문제를 해결하기 위한 것으로 노나펩타이드 골격의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형 및 Coprisin 유래 노나펩타이드의 일부 아미노산 치환을 통해 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)
l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)
상기 식에서
l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,
a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
이때 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 한다.
l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)
l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
상기 식에서
l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
Kyn은 Kynurenine 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
또한 상기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지님을 특징으로 한다.
이때 상기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지님을 특징으로 한다.
한편 상기 식 1 및 식 2의 항균 펩타이드 유도체는 8.0 % 적혈구 용액과 1시간 인큐베이션시 5.0 % 이하의 적혈구 용혈만을 야기시켜 높은 적혈구 용혈 안정성을 지님을 특징으로 한다.
또한 상기 식 1 및 식 2의 항균 펩타이드 유도체는 배지 내에서 25 % 인간 혈청과 함께 6시간 인큐베이션시 항균 펩타이드 유도체의 90 중량% 이상이 잔존하는 혈청 내 안정성을 지님을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계; 2) 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계; 3) C-말단 카르복실기에 아민기를 도입하는 단계; 및 4) 역상 HPLC를 사용하여 항균 펩타이드 유도체를 분리 정제 수득하는 단계;를 포함하는 식 1로 표시되는 항균 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 1) Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계; 2) 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계; 및 3) 역상 HPLC를 사용하여 항균 펩타이드 유도체를 분리 정제 수득하는 단계;를 포함하는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적 목적은 상기 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 효과는 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 체내 생리적 염 농도에서의 불활성화 및 혈청 내 분해 등과 같은 안정성 저하 문제를 해결하기 위한 것으로 노나펩타이드 골격의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형 및 Coprisin 유래 노나펩타이드의 일부 아미노산 치환을 통해 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균 등에 대하여 강력한 항박테리아 또는 항진균 작용을 나타내므로 상처 치료 촉진제, 외상 치료제, 구강 청정제 및 안약 등의 새로운 항박테리아 또는 항진균제로서 이용 가능한 유용한 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
도 1은 주사전자현미경을 이용한 그람 음성균, 그람 양성균 표면을 관찰한 것이다. 양이온 조절 Muller Hinton 브로스에서 최소 성장 억제농도(MIC)의 8배를 처리하였다. 세포를 고정화시킨 후 백금으로 코팅시켜 세포 표면을 관찰하였다. 시험군에는 대장균과 포도상구균을 P11 펩타이드 유도체로 처리한 결과를 나타내었으며 대조군에는 펩타이드 없이 처리한 결과를 나타내었다.
도 2는 본 발명의 항균 펩타이드 유도체를 25% 인간 혈청에 6시간 동안 반응시키고 C18 카트리지를 이용해 1차 정제한 후, 역상 고성능 액체크로마토그래피로 남아있는 펩타이드의 양을 정량하고 백분율로 수치화한 것이다.
본 발명은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체에 관한 것이다.
l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)
l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)
상기 식에서
l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,
a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
이때 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 한다.
l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)
l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
상기 식에서
l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
Kyn은 Kynurenine 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
또한 본 발명은 상기 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 노나펩타이드 골격으로 사용된 coprisin의 알파-나선형 영역에서 유래된 짧은 노나펩타이드(nonapeptides)인 CopW(LLWIALRKK-NH2)는 거의 용혈 활성이 없는 강력한 항균 활성을 지닌 펩타이드이다. 그러나 상기 노나펩타이드는 체내에 투입시 생리적 염 농도에서 불활성화 되기 쉽고 혈청 내에 존재하거나 병원균이 분비하는 단백질 분해효소에 의해 혈청 내 분해되어 그 혈청 내 안정성이 급격히 저하되어 그 상용화에 문제가 있었다.
따라서 본 발명은 Coprisin 유래 CopW(LLWIALRKK-NH2) 노나펩타이드의 문제점을 개선하기 위해 동일한 골격의 유도체를 개발함으로써 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 개선시켜 생체이용률을 증진시킨 것이다.
즉 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기에 아실화를 통한 지방산 사슬의 부가 및 아민기(-NH2)의 도입을 통한 C-말단의 변형을 통해 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 개선시켜 생체이용률이 증진된 항균 펩타이드 유도체를 개발한 것이다.
따라서 본 발명은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)
l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)
상기 식에서
l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,
a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
이때 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 한다.
l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)
l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)
l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)
l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)
상기 식에서
l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,
Kyn은 Kynurenine 이고,
(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,
Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
즉 본 발명의 바람직한 항균 펩타이드 유도체는 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 아미노산에 D-형 아미노산을 도입하고 노나펩타이드 C-말단 라이신 잔기 내의 아미노부틸기에 아마이드 결합을 통해 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 도입하고 추가적으로 C 말단 라이신 잔기 내의 카르복실기에 아민기(-NH2)의 도입을 통해 C-말단을 변형시킴으로써 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 개선시켜 생체이용률이 증진된 항균 펩타이드 유도체인 것이다.
한편 상기 본 발명의 항균 펩타이드 유도체는 그람 음성균, 그람 양성균 또는 항생제 내성균에 효과적인 항균 활성을 지닌다.
이를 자세히 살펴보면, 본 발명의 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지닌다.
또한 본 발명의 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지닌다.
본 발명의 항균 펩타이드 유도체는 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
(단계 1) 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 합성
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계이다.
(단계 2) C-말단 라이신 잔기에 지방산 사슬의 도입 (식 2의 항균 펩타이드 유도체 제조)
노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)의 9번 말단 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 C-말단 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계이다. 단계 2에서 식 2로 표시되는 l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH 구조의 항균 펩타이드 유도체를 제조할 수 있다.
(단계 3) C-말단 라이신 잔기에 아민기의 도입 (식 1의 항균 펩타이드 유도체 제조)
단계 2에서 제조된 l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH 구조의 항균 펩타이드 유도체(식 2)의 C-말단 라이신기 내의 카르복실기에 아민기를 도입하여 식 1로 표시되는 l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 구조의 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계이다.
(단계 4) 분리 및 정제
단계 2 또는 단계 3에서 제조된 항균 펩타이드 유도체(식 1 및 식 2)를 역상 HPLC를 사용하여 분리 정제 수득하는 단계이다.
한편 본 발명은 상기 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 1일 투여량은 1~20 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 4~8 ㎎/㎏이나 임상결과에 따라 가감될 수 있으며 하루 1회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 제조실시예 및 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 제조실시예 및 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(제조실시예)
제조실시예에서 항균 펩타이드 유도체 P1 내지 P24를 제조하였다. 제조실시예에서 제조된 펩타이드 유도체 P1 내지 P24의 서열 구조를 표 1에 나타내었다.
(제조실시예 1) P1의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드에 아민기 부가)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 L-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)을 제조하고 C-말단 라이신 잔기의 카르복실기에 아민기를 추가로 도입하여 제조하였다. 이때 차후 진행되는 하이드라진 용매의 탈보호 과정에서 DDE외에 N-말단에 위치하는 Fmoc도 탈보호화 되므로 이를 방지하고자 1번 L/D-Leu은 Boc-L/D-Leu을 사용한다. 최종 합성된 펩타이드의 탈보호 및 절단 과정은 트리플루오로아세트산:티오에니솔:에탄디티올:물의 부피비가 87.5 : 5 : 2.5 : 5 인 용액을 사용하여 진행한다.
(제조실시예 2) P2 및 P3의 제조 (P1 C-말단에 지방산 사슬 부가)
제조실시예 1에서 제조된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)의 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호 시키면서 C-말단 라이신 잔기 아미노 부틸기에 C8 또는 C12의 지방산 사슬을 도입하고 C-말단 라이신 잔기 카르복실기에 아민기를 추가로 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다.
(제조실시예 3) P4의 제조 (D-아미노산으로 구성된 Coprisin 유래 노나펩타이드)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 1의 P1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(제조실시예 4) P5 및 P6의 제조 (P4 C-말단에 지방산 사슬 부가)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 2의 P2 및 P3와 동일한 방법으로 제조하였다. P5의 경우 C8의 지방산 사슬을 도입하였고 P6의 경우 C10의 지방산 사슬을 도입하였다.
(제조실시예 5) P7 내지 P15의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드의 골격 아미노산 치환)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 P7 내지 P15의 D-아미노산으로 구성된 하기 펩타이드 골격을 제조한 것을 제외하고는 P6와 동일한 방법으로 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다. P7의 펩타이드 골격은 llwialkkk이었고 P8은 cllwialrkkc, P9는 ll-Kyn-ialrkk, P10은 llw-Kyn-alrkk, P11은 llwialrrk, P12는 llwialkkk, P13은 kkrlaiwll, P14는 llwialrk 및 P15는 rllwialrkk 이었다.
(제조실시예 6) P16의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드의 합성)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 L-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)을 제조하였다. 이때 차후 진행되는 하이드라진 용매의 탈보호 과정에서 DDE외에 N-말단에 위치하는 Fmoc도 탈보호화 되므로 이를 방지하고자 1번 L/D-Leu은 Boc-L/D-Leu을 사용한다. 최종 합성된 펩타이드의 탈보호 및 절단 과정은 트리플루오로아세트산:티오에니솔:에탄디티올:물의 부피비가 87.5 : 5 : 2.5 : 5 인 용액을 사용하여 진행한다.
(제조실시예 7) P17의 제조 (P16 C-말단에 지방산 사슬 부가)
제조실시예 6에서 제조된 노나펩타이드 골격(LLWIALRKK)의 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 C-말단 라이신 잔기 아미노 부틸기에 C12의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다.
(제조실시예 8) P18의 제조 (D-아미노산으로 구성된 Coprisin 유래 노나펩타이드)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 6의 P16과 동일한 방법으로 제조하였다.
(제조실시예 9) P19의 제조 (P18 C-말단에 지방산 사슬 부가)
SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(llwialrkk)을 제조한 것을 제외하고는 제조실시예 7의 P17과 동일한 방법으로 제조하였다. P19의 경우 C10의 지방산 사슬을 도입하였다.
(제조실시예 10) P20 내지 P24의 제조 (Coprisin 유래 노나펩타이드의 골격 아미노산 치환)
Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 P20 내지 P24의 D-아미노산으로 구성된 하기 펩타이드 골격을 제조한 것을 제외하고는 P19와 동일한 방법으로 항균 펩타이드 유도체를 제조하였다. P20의 펩타이드 골격은 llwialkkk, P21은 cllwialrkkc, P22는 ll-Kyn-ialrkk, P23은 llwialrrk 및 P24는 llwialkkk 이었다.
(실시예 1) 항균 활성 시험
본 발명의 항균 펩타이드 유도체가 나타내는 항균 활성을 비교하기 위하여 그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대해 본 발명의 항균 펩타이드 유도체가 나타내는 항균 활성을 측정하였다.
본 발명의 시험 균주의 배양 및 MIC 농도 측정은 하기 표 2에 기재된 균주를 구입하여 세균수가 ml 당 1×106 콜로니 형성 유니트(CFU)가 되도록 배지로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로 플레이트에 분주한 후, 2배 계대 희석한 용액을 각 well에 균액과 동일한 양을 첨가하였다. 이후 18시간 동안 37℃에서 배양한 후 육을 통해 MIC 농도를 결정하였다. 해당 농도 미만 또는 초과하는 농도에서 균의 성장이 억제 또는 증식될 때는 해당 값의 미만(<), 또는 초과(>)로 표기하였다.
항균 활성은 저염 조건인 2.3 mg/L의 Ca2+ 및 1.3 mg/L의 Mg2+를 포함하는 1% 펩톤 용액 하에서 그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대한 항균 활성을 측정하였으며 또한 고염 조건인 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+를 포함하는 Muller Hinton 브로스에서 그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대한 항균 활성을 측정하였으며 이는 육안으로 구분했을 때 균의 성장을 억제하는 최소 성장 억제농도(MIC)를 측정하였다.
표 3은 저염 조건하에서 그람 음성균, 그람 양성균에 대한 항균 활성을 나타낸 도표이고 표 4는 고염 조건하에서 그람 음성균, 그람 양성균에 대한 항균 활성을 나타낸 도표이다.
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 균주에 높은 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 균주에 높은 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체는 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180)에는 특별한 항균 활성을 나타내지 못하였다.
실시예 1의 항균 활성 시험을 통해 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P3, P4, P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체가 고염 및 저염 조건하에서 대조군으로 사용된 멜리틴 보다 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 1차 선별 되었다.
(실시예 2) 적혈구 용혈 독성 시험
P1 내지 P24로 표시되는 제조실시예에서 제조된 항균 펩타이드 유도체에 대해 인간 적혈구 용혈 활성을 통하여 세포독성 여부를 측정하였다.
인간 적혈구를 PBS 완충용액으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리한 후 3회 세척하였다. PBS로 희석한 8% 적혈구 용액을 96-well 마이크로 타이터 플레이트에 100 ㎕ 씩 적가시킨 후, 펩타이드 용액 (200 μM) 100㎕ 씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 96-웰 마이크로플레이트를 원심력 1000 g로 5분간 원심분리 하였다.
상층액 100㎕ 씩 취하여 다른 96-웰 마이크로플레이트에 이송시킨 후 540 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 대조군 펩타이드로 melittin을 사용하였다. 이때 0.1 % Triton X-100로 처리하였을 경우의 값을 100 % 용혈율로 계산하였다.
그 결과 본 발명에서 합성된 항균 펩타이드 유도체 중 P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14, P15, P19, P20, P21, P22, P23, P24로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 5.0% 이하의 적혈구 용혈만을 야기시켜 높은 적혈구 용혈 안정성을 지님을 확인하였다.
(실시예 3) 박테리아 항균 기작의 측정
본 발명의 항균 펩타이드 유도체가 나타내는 작용 기작을 확인하기 위하여 주사전자현미경을 이용한 그람 음성균 및 그람 양성균의 표면을 관찰하였다. 항균 펩타이드 유도체를 고염 농도인 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+에서 양이온 조절 Muller Hinton 브로스에서 최소 성장 억제농도(MIC)의 8배를 첨가하고 1시간 반응시킨 후, 원심력 1500g로 10분간 원심분리 하였다.
세포 고정화를 위해 2.5 % 글루타알데하이드로 6-8시간 동안 처리하고 PBS로 두 번 세척하였다. 탈수과정은 50, 70, 90 및 100%의 에탄올에 10분간 담가 두었다가 마지막으로 15분간 100%의 에탄올과 부탄올의 (1:1) 혼합물에 침지시켜 측정하였다.
주사전자현미경 관찰 전에 박테리아를 백금으로 코팅한 후 세포의 표면을 관찰하였다. 시험군에는 대장균과 포도상구균을 본 발명의 P11 펩타이드 유도체로 처리한 결과를 나타내었으며 대조군에는 펩타이드 없이 처리한 결과를 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 대조군의 주사전자현미경 사진에는 대장균과 포도상구균이 그대로 번식하고 있으나 본 발명의 P11 펩타이드 유도체를 첨가시킨 시험군의 경우 대장균과 포도상구균의 세포벽이 파괴되어 박테리아 균주가 사멸하는 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 4) 혈청내 안정성 시험
P1 내지 P24로 표시되는 제조실시예에서 제조된 항균 펩타이드 유도체에 대해 혈청내 안정성 시험을 수행하였다.
인간 혈청을 RPMI 1640 배지와 혼합하여 25%로 희석하고 펩타이드 유도체를 30 ㎍/㎖의 농도로 용해시킨다(총 부피는 200 ㎕). 37℃에서 6시간 반응시킨 후, 반응을 종료시키기 위해 1N HCl 용액 20 ㎕를 첨가한다. 반응이 종료된 용액은 미리 메탄올과 물로 세척한 C18 카트리지에 로딩한다. 이후 0.1% TFA가 포함된 물 또는 0.1 % TFA가 포함된 10% 아세토니트릴 용액을 3~5 ㎖를 유출시켜 비특이적 결합을 한 혈청 및 배지를 세정하고 30% 아세토니트릴 용액 2 ㎖을 유출시켜 카트리지로부터 본 발명의 펩타이드 유도체를 분리시킨다.
이후 펩타이드 유도체의 양을 정량하기 위하여 역상 고성능 액체크로마토그래피(Reverse-phase HPLC)에 펩타이드 용액 450 ㎕를 투입하고 나타나는 펩타이드의 픽(peak)의 높이를 반응 0 시간의 펩타이드 (30 ㎍/㎖)의 픽 높이와 비교하여 남아있는 잔량을 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, L-형 아미노산으로 구성된 P1 내지 P3, P16, P17로 표시되는 펩타이드 유도체는 6시간 이후 40% 미만이 잔존하였다.
또한 D-아미노산으로 구성되었으나 C-말단에 지방산을 부가시키지 않은 P4 및 P18로 표시되는 펩타이드 유도체도 6시간 이후 60% 미만이 잔존하였다.
그러나 D-아미노산으로 구성되고 C-말단에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 부가시킨 P5 내지 P15 및 P19 내지 P24로 표시되는 펩타이드 유도체는 6시간 이후 90% 이상의 펩타이드가 잔존하였다.
실시예 1 내지 4의 시험을 통해 P1 내지 P24의 본 발명에서 합성된 펩타이드 유도체 중 P5, P6, P9, P11, P12, P19, P22, P23, P24 펩타이드 유도체가 높은 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성을 지니는 펩타이드 유도체로 선별되었다.
또한 이를 통해 본 발명의 Coprisin 유래 l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 (식 1) 또는 l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH (식 2)로 표시되는 항균 펩타이드 유도체가 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 것을 확인하였다.
Claims (9)
- 항균 활성, 적혈구 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 높은 생체 이용률을 나타내는 Coprisin 유래 하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체.l l x i a l y y k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1)l l x i a l y y k (Cn:0)-COOH ……… (식 2)상기 식에서l은 D-Leu, x는 D-Trp 또는 Kynurenine, i는 D-Ile,a는 D-Ala, y는 D-Lys 또는 D-Arg, k는 D-Lys 이고,(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
- 제 1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드 유도체는 하기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 또는 식 1-4의 펩타이드 유도체임을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.l l w i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-1)l l -Kyn- i a l r k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-2)l l w i a l r r k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-3)l l w i a l k k k (Cn:0)-NH2 ……… (식 1-4)상기 식에서l은 D-Leu, w는 D-Trp, i는 D-Ile, a는 D-Ala, r은 D-Arg, k는 D-Lys,Kyn은 Kynurenine 이고,(Cn:0)은 D-Lys의 n-부틸아민기에 아미드 결합으로 부가된 Cn를 의미하고,Cn은 C6, C8, C10, C12 또는 C14의 지방산 사슬을 의미한다.
- 제 2항에 있어서, 상기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 2.0∼3.0 mg/L의 Ca2+ 및 1.0∼2.0 mg/L의 Mg2+의 저염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 녹농균(기탁번호: CCARM 2180), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
- 제 2항에 있어서, 상기 식 1-1, 식 1-2, 식 1-3 및 식 1-4로 표시되는 항균 펩타이드 유도체는 50 mg/L의 Ca2+ 및 10 mg/L의 Mg2+의 고염 조건하에서 대조군으로 사용한 멜리틴 보다 녹농균(기탁번호: KCTC 1637), 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: KCCM 40203), 황색포도상구균(기탁번호: KCTC 1621), 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: KCCM 11814), 다약제 내성 아시네토박터 바우마니균(기탁번호: ATCC BAA 1605), 메티실린-내성 황색 포도상구균(기탁번호: KCCM 40510) 또는 반코마이신-내성 엔테로코커스 패칼리스균(기탁번호: ACTT 51575)에서 선택된 1종 이상의 균주에 높은 항균 활성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
- 제 1항에 있어서, 상기 식 1 및 식 2의 항균 펩타이드 유도체는 8.0 % 적혈구 용액과 1시간 인큐베이션시 5.0 % 이하의 적혈구 용혈만을 야기시켜 높은 적혈구 용혈 안정성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
- 제 1항에 있어서, 상기 식 1 및 식 2의 항균 펩타이드 유도체는 배지 내에서 25 % 인간 혈청과 함께 6시간 인큐베이션시 항균 펩타이드 유도체의 90 중량% 이상이 잔존하는 혈청 내 안정성을 지님을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유도체.
- 1) Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계;2) 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계;3) C-말단 카르복실기에 아민기를 도입하는 단계; 및4) 역상 HPLC를 사용하여 항균 펩타이드 유도체를 분리 정제 수득하는 단계;를 포함하는 식 1로 표시되는 항균 펩타이드 유도체의 제조방법.
- 1) Wang 레진 및 아마이드 레진을 이용하여 Fmoc 보호기를 통한 SPPS 화학합성법으로 D-아미노산으로 구성된 노나펩타이드 골격(l l x i a l y y k)을 제조하는 단계;2) 9번 라이신 잔기에 DDE(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸) 보호기를 도입시킨 후 4% 하이드라진 용매 존재하에서 DDE를 탈보호시키면서 라이신 잔기의 아미노부틸기에 C6 내지 C14의 지방산 사슬을 도입하여 항균 펩타이드 유도체를 제조하는 단계; 및3) 역상 HPLC를 사용하여 항균 펩타이드 유도체를 분리 정제 수득하는 단계;를 포함하는 식 2로 표시되는 항균 펩타이드 유도체의 제조방법.
- 제 1항 또는 제 2항의 항균 펩타이드 유도체 0.01 내지 30 중량%를 유효 성분으로 함유하는 세균 또는 진균 감염 질환 치료용 의약 조성물 또는 피부 개선용 화장료 조성물.
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CN112341524A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-02-09 | 江西中医药大学 | 一种富含正电荷的环抗菌肽类似物及其应用 |
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