WO2017043920A1 - 피부 투과성 펩티드 및 그 이용방법 - Google Patents

피부 투과성 펩티드 및 그 이용방법 Download PDF

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WO2017043920A1
WO2017043920A1 PCT/KR2016/010176 KR2016010176W WO2017043920A1 WO 2017043920 A1 WO2017043920 A1 WO 2017043920A1 KR 2016010176 W KR2016010176 W KR 2016010176W WO 2017043920 A1 WO2017043920 A1 WO 2017043920A1
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protein
peptide
egfp
rptp
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PCT/KR2016/010176
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최제민
김원주
구자현
김지윤
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한양대학교 산학협력단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a skin permeable peptide or derivative thereof that can penetrate the skin and deliver a biologically active substance, a pharmaceutical composition for external preparation for skin containing the peptide or derivative thereof, and a cosmetic composition comprising the peptide or derivative thereof.
  • Skin is a tissue that is always in contact with the outside environment and serves as a protective barrier against fluid leakage, infection, and loss of moisture.
  • stratum corneum of the epidermis is located on the outermost surface of the skin and prevents the loss of moisture and electrolytes outside the skin, preventing drying of the skin and providing an environment for normal biochemical metabolism of the skin. It protects the human body from substances and plays an important role in preventing the invasion of bacteria, fungi and viruses into the skin (Bouwstra J. A, Honeywell-Nguyen PL Gooris GS and Ponec M. Prog Lipid Res. 42: 1-36 (2003).
  • TDD transdermal drug delivery
  • peptides having cell permeability has several advantages, mainly due to the various modifications that can be made to the peptide sequence at all times. It can designate different subcellular domains and allows manipulation of carriers that can carry various forms of cargo molecules.
  • HIV-1 Human immunodeficiency virus-1
  • TAT a representative cell membrane permeable peptide
  • Peptides are the most applied and active research is underway (Mann, DA et al., Embo J 10: 1733-1739, 1991).
  • TAT peptides have been used to transfer ⁇ -galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE) into cells, and their function and intracellular localization have been studied (Fawell, S. et al.
  • TAT peptides were found to be due to endocytosis involving Lipid Raft, which occurs after interaction with Heparan sulfate in cell membranes (Jehangir SW et al., Nature Med 10: 310-315, 2004).
  • VP22 a protein expressing HSV-1 (Herpes simplex virus type 1), a cell-penetrating peptide called Penetratin (Antp) consisting of 16 amino acid sequences derived from Antennapedia homeoprotein, an essential transcription factor for the development of fruit flies.
  • Cell-permeable peptides such as VP22, an artificially synthesized 27-amino acid sequence, transportan, and poly-Arginine, which is an artificially repeated arginine that is expected to play the most important role in cell-penetrating peptides.
  • peptide a protein expressing HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)
  • HSV-1 Herpes simplex virus type 1
  • Adp cell-penetrating peptide called Penetratin (Antp) consisting of 16 amino acid sequences derived from Antennapedia homeoprotein, an essential transcription factor for the development of fruit flies.
  • Cell-permeable peptides such as
  • Such conventional cell-penetrating peptides are sequences derived from viral proteins such as HIV-1, those derived from proteins expressing other species such as fruit flies, or the amino acid sequence analysis of the conventional cell-penetrating peptides. In view of the fact that the amino acid sequence was selected and artificially synthesized, it may cause side effects such as an immune response when applied to a human body.
  • the peptide sequence derived from the human ASTN1 (Astroractin 1) protein which is one of the neural proteins involved in developing the cerebellum and neuronal movement, is epidermal cells or TAT, which is a cell permeable peptide, or a skin permeable peptide.
  • the present invention has been completed by demonstrating that the penetration efficiency of skin tissue is remarkably good.
  • the present invention is a skin permeable peptide for efficiently introducing skin bioactive molecules into skin cells which are difficult to deliver through the skin due to the size of the molecular weight or the intrinsic properties of the stratum corneum. It is to provide a skin permeable peptide that exhibits a low, significantly improved skin permeability.
  • the present invention solves the problem of preventing or treating inflammatory skin disease, which is difficult to achieve through direct administration to the skin surface due to the size of the conventional molecular weight or the intrinsic properties of the stratum corneum, and at the same time generates an immune response compared to the conventional peptide. It is to provide a peptide fusion that is less likely and exhibits significantly improved skin permeability.
  • the present invention is to provide a cosmetic composition that can effectively treat or prevent skin diseases through the skin, especially the stratum corneum or a pharmaceutical composition for external application for skin for the treatment and prevention of skin inflammatory diseases.
  • the present invention provides a skin permeable peptide having a sequence of (X1) n -X2- (cysteine)-(X3) m .
  • N is an integer of any one of 3 to 14
  • m is an integer of any one of 4 to 14, wherein X1 and X3 are each independently arginine, lysine or histidine, and X2 is alanine, glycine, proline, Tryptophan, phenylalanine, leucine, isoleucine, methionine, valine, arginine, lysine or histidine.
  • the present invention provides a fusion in which the skin permeable peptide and a biologically active substance are bound.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising a gene encoding the fusion.
  • the present invention provides a cosmetic composition comprising the fusion as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for external application for skin containing the fusion as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating skin inflammatory diseases, comprising applying an effective amount of the pharmaceutical composition for external application for skin to the skin of an individual.
  • Dermal permeable peptides of the present invention can effectively deliver proteins into epidermal cell lines, dermal cell lines and skin tissues, and can deliver proteins with higher efficiency when compared to conventional TAT peptides or skin permeable peptides, and are delivered through the skin to treat It can also be useful for the delivery of biologically active substances such as proteins, genetic materials, chemical compounds, etc. that can be used for the purpose.
  • the fusion according to the present invention can be effectively delivered into epidermal cell lines, dermal cell lines and skin tissues, it can simultaneously inhibit T cell activity and proliferation as well as various inflammatory cytokine signals causing skin diseases, thereby preventing inflammatory skin diseases or conditions. It is very effective in treating, preventing or ameliorating.
  • the peptide fusion of the present invention is very excellent in stability and permeability of the skin, and because of this property can be very advantageously applied to medicines, quasi-drugs and cosmetics.
  • FIG. 1 is a photograph confirming a double chain DNA fragment of 789 bp, which is a PCR product encoding AP and EGFP (AP-EGFP) to which it is linked by 1% agarose gel electrophoresis.
  • Figure 3 is transformed into a DH5 ⁇ Escherichia coli strain pRSET-b vector inserting the DNA fragment encoding the AP-EGFP of Preparation Example 3 and incubated in plate LB medium and incubated by incubating the selected colonies in liquid LB medium plasmid 1% agarose gel electrophoresis of DNA isolated from the Mini preparation process.
  • Figure 4 shows that the isolated plasmid DNA of Preparation Example 3 was composed of a DNA fragment encoding AP-EGFP (789 bp) and a pRSET-b vector (2.9 Kb), followed by enzymatic reaction using NheI and HindIII restriction enzymes. The photo was confirmed by Ross gel electrophoresis.
  • Figure 5 is a schematic diagram showing the structure of the pRSET-b vector inserted AP-EGFP of Preparation Example 3.
  • FIG. 6 shows the purified AP-EGFP protein of Preparation Example 4, the EGFP protein which is not linked to the cell-penetrating peptide corresponding to the negative control, and the TAT-EGFP protein which is the most widely known cell-penetrating peptide corresponding to the positive control group.
  • the image was confirmed by% SDS gel electrophoresis.
  • FIG. 7 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis using flow cytometry that AP-EGFP protein was delivered concentration-dependently and time-dependently into Jurkat cells in Experimental Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis using flow cytometry that AP-EGFP protein was delivered concentration-dependently and time-dependently into Jurkat cells in Experimental Example 1.
  • FIG. 8 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of AP delivery of protein into Jurkat cells in Experimental Example 2 through flow cytometry using conventional cell-penetrating peptides as positive controls.
  • FIG. 8 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of AP delivery of protein into Jurkat cells in Experimental Example 2 through flow cytometry using conventional cell-penetrating peptides as positive controls.
  • FIG. 9 is an intracellular fluorescence intensity analysis graph comparing the efficiency of AP delivery of protein into Jurkat cells in Experimental Example 3 using a flow cytometry using conventional skin-penetrating peptides as positive controls.
  • FIG. 10 is a graph of intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of delivering proteins into HaCaT cells, which are AP epidermal cell lines in Experimental Example 4, using conventional cell permeation peptides as a positive control group by flow cytometry to be.
  • FIG. 11 is a graph of intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of delivering proteins into NIH3T3 cells, which are AP dermal dermal cell lines in Experimental Example 4, using conventional flow-permeable peptides as a positive control group using flow cytometry. to be.
  • HaCaT cells which are AP epidermal cell lines in Experimental Example 5, using conventional skin permeable peptides as a positive control group by flow cytometry to be.
  • FIG. 13 is a graph of intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of delivering proteins into NIH3T3 cells, which are AP dermal dermal cell lines in Experimental Example 5, using conventional flow-permeable peptides as positive controls and using flow cytometry. to be.
  • FIG. 14 compares the effect of arginine, which is the amino acid sequence occupying the largest portion of AP, to the delivery of proteins into the cells of AP in Experimental Example 6 by setting a control group to remove arginine one by one using flow cytometry;
  • FIG. 15 is substituted with alanine to confirm the effect of tryptophan (X2), cysteine, and lysine (the first amino acid of X3), which are the amino acid sequences constituting the AP, in Experimental Example 6 in transferring proteins into cells of the AP. Intracellular fluorescence intensity analysis graph analyzed by flow cytometry (flow cytometry).
  • FIG. 16 is substituted with arginine to confirm the effects of tryptophan (X2), cysteine, and lysine (the first amino acid of X3), which are the amino acid sequences constituting the AP, in the experimental example 6 in transferring proteins into cells of the AP; Intracellular fluorescence intensity analysis graph analyzed by flow cytometry (flow cytometry).
  • FIG. 17 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis comparing changes in AP intracellular delivery efficiency according to changes in temperature and serum concentrations in Experimental Example 7 using conventional cell-penetrating peptides as positive controls. .
  • FIG. 19 is a fluorescence micrograph showing that AP-EGFP was delivered into HeLa cells in Experimental Example 9.
  • FIG. 19 is a fluorescence micrograph showing that AP-EGFP was delivered into HeLa cells in Experimental Example 9.
  • Figure 20 Comparison of the intracellular fluorescence intensity analysis and cellular location via the 0 seconds point microscope AP sets a skin epidermal cell line, HaCaT cells, efficiency of the conventional cell permeable peptide to deliver the protein within a positive control in Experimental Example 10 Image.
  • FIG. 21 shows intracellular fluorescence intensity analysis and intracellular location in which Example AP was compared with confocal microscopy to determine the efficiency of delivering proteins into NIH3T3 cells, which are dermal dermal cell lines, by using conventional cell-penetrating peptides as positive controls. Image.
  • FIG. 22 is a fluorescence micrograph showing that AP-EGFP was delivered into each organ cell of the rat in Experimental Example 11.
  • FIG. 22 is a fluorescence micrograph showing that AP-EGFP was delivered into each organ cell of the rat in Experimental Example 11.
  • FIG. 23 is a fluorescence micrograph of Comparative Example 12 using the AP-EGFP-derived transfection efficiency as a positive control group in the transdermal efficiency of AP-EGFP.
  • FIG. 24 is a fluorescence micrograph of Comparative Example 13, which analyzes the transfer efficiency of a protein between AP-dTomato and rat skin permeable peptides to rat skin.
  • FIG. 25 is a confocal micrograph to confirm that AP-dTomato was delivered to the skin of the green fluorescent protein-targeted rat in Experimental Example 14.
  • FIG. 25 is a confocal micrograph to confirm that AP-dTomato was delivered to the skin of the green fluorescent protein-targeted rat in Experimental Example 14.
  • FIG. 26 is an enlarged photograph of FIG. 25.
  • FIG. 27 is a photograph confirming the AP-EGFP protein purified from Preparation Example 4 and the AP-rPTP protein purified in Preparation Example 7 by 12% SDS gel electrophoresis.
  • 29 is a graph for confirming the phosphatase activity of the AP-EGFP protein and AP-rPTP protein in Experimental Example 17.
  • FIG. 30 is an intracellular fluorescence intensity analysis graph of the efficiency of delivering protein into HaCaT cells, which are the skin epidermal cell lines, in Experimental Example 18 through flow cytometry.
  • FIG. 31 is a graph illustrating intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of AP-rPTP transfer of proteins into HaCaT cells, which are skin epidermal cell lines, by flow cytometry in Experimental Example 19.
  • FIG. 31 is a graph illustrating intracellular fluorescence intensity analysis comparing the efficiency of AP-rPTP transfer of proteins into HaCaT cells, which are skin epidermal cell lines, by flow cytometry in Experimental Example 19.
  • FIG. 32 is an image showing the effect of cytokine stimulation on mouse splenocytes treated with AP-rPTP protein in Experimental Example 20.
  • FIG. 32 is an image showing the effect of cytokine stimulation on mouse splenocytes treated with AP-rPTP protein in Experimental Example 20.
  • Figure 33a, b is a graph measuring the proliferation in NA or PBS treated primary mouse CD4-T cells ('NA' and ' ⁇ -CD3 ⁇ CD28 + PBS') in Experimental Example 21,
  • Figure 33c is This is a graph showing the investigation of CD4 T cell proliferation when AP-rPTP protein was treated in primary mouse CD4-T cells.
  • cytokine expression levels (IL-17 (a), IL-13 (b), IFN- ⁇ (c) and IL2 (in mouse spleen cells according to AP-rPTP and AP-EGFP proteins in Experimental Example 22).
  • d) is a graph showing the result of measurement.
  • 35 is a view showing a Oxazolone induced contact dermatitis animal model plan of Experimental Example 23.
  • FIG. 36 is a photograph showing that the morphological appearance of the ear induced contact dermatitis 6 days after sensitization in Experimental Example 23 was inhibited inflammation of the rat ear of the AP-rPTP treatment group.
  • FIG. 37 is a graph showing that the ear thickness of the rat group treated with AP-rPTP in Experimental Example 23 was reduced compared to the PBS treated rat group as a control group.
  • FIG. 38 is a graph showing that the ear weight of the rat group treated with AP-rPTP in Experimental Example 23 was decreased compared to the PBS treated rat group as a control group.
  • FIG. 39 is an image of the ears of the rat group treated with AP-rPTP and the ears of the mouse group treated with PBS as a control group, stained by H & E staining method, using an optical microscope.
  • FIG. 40 is a graph showing the measured and quantified mRNA expression levels of cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6) from the skin of an animal model of Oxazolone induced contact dermatitis in Experimental Example 24.
  • FIG. 40 is a graph showing the measured and quantified mRNA expression levels of cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6) from the skin of an animal model of Oxazolone induced contact dermatitis in Experimental Example 24.
  • FIG. 41 is a graph showing the measurement and quantification of mRNA expression levels of chemokines (CXCL2, CXCL5) from the skin of Oxazolone induced contact dermatitis animal model in Experimental Example 24.
  • FIG. 42 is a diagram showing an Ovalbumin (OVA) induced chronic dermatitis animal model plan of Experimental Example 25.
  • OVA Ovalbumin
  • FIG. 43 is an image of the ears of the rat group treated with AP-rPTP and the ears of the rat treated with PBS as a control group in the Experimental Example 25 by H & E staining to observe the difference in ear thickness using an optical microscope.
  • FIG. 44 is a graph showing a comparison of total histological values of the H & E staining result of FIG. 43.
  • FIG. 45 is a graph of a comparative analysis of the amount of IL-13 mRNA expression from skin tissue of an animal model in Experimental Example 25.
  • FIG. 45 is a graph of a comparative analysis of the amount of IL-13 mRNA expression from skin tissue of an animal model in Experimental Example 25.
  • FIG. 46 is a diagram showing a psoriasis-like dermatitis animal model plan induced by imiquimod of Experimental Example 26.
  • FIG. 47 is a graph showing measurement of ear thickness during treatment of AP-rPTP and AP-EGFP for 6 days in an animal model of psoriasis-like dermatitis induced by imiquimod in Experimental Example 26.
  • FIG. 47 is a graph showing measurement of ear thickness during treatment of AP-rPTP and AP-EGFP for 6 days in an animal model of psoriasis-like dermatitis induced by imiquimod in Experimental Example 26.
  • FIG. 48 is an image of the ear group of the rat group treated with AP-rPTP or AP-EGFP and the negative control group (Sham) stained by H & E staining in Experimental Example 26 to observe the difference in ear thickness with an optical microscope.
  • Figure 49 shows cytokine (IL-7A, IL-17F, IL-6) mRNA expression measured in ear and negative control group (Sham) ear tissue cells of the rat group treated with AP-rPTP or AP-EGFP in Experimental Example 26 A graph showing the amount quantified.
  • Figure 50 shows the quantification of the antimicrobial peptide (S100A8, S100A9) mRNA expression measured in the ear and negative control group (Sham) ear tissue cells treated with AP-rPTP or AP-EGFP in Experimental Example 26 It is a graph.
  • Figure 51 is a photograph confirmed by the 12% SDS gel electrophoresis of the AP-rPTP protein expressed and purified from Preparation Example 7.
  • FIG. 52 shows the structure of a fusion of a recombinant peptide (rPTP) and a skin permeable peptide (AP) designed from PTPN2 protein (TC-PTP).
  • rPTP recombinant peptide
  • AP skin permeable peptide
  • the present invention provides a skin permeable peptide having a sequence of (X1) n -X2- (cysteine)-(X3) m .
  • N is an integer of any one of 3 to 14, preferably an integer of any of 3 to 6
  • m is an integer of any one of 4 to 14, preferably an integer of any of 4 to 7. to be.
  • the skin permeable peptide is preferably composed of 9 to 14, more preferably 9 to 12, most preferably 9 to 10 amino acids. Below the lower limit, the cell permeation efficiency decreases rapidly, and when the upper limit is exceeded, the possibility of causing an immune response increases.
  • X1 and X3 are each independently one of the positively charged amino acids, arginine (Arg, R), lysine (Lys, K) or histidine (His, H), preferably arginine or lysine.
  • Arg, R arginine
  • Lys, K lysine
  • His, H histidine
  • arginine or lysine are each independently one of the positively charged amino acids, arginine (Arg, R), lysine (Lys, K) or histidine (His, H), preferably arginine or lysine.
  • (X1) n is a combination of n positively charged amino acids corresponding to X1, n amino acid includes not only n the same amino acid, but also includes the presence of n different positively charged amino acids.
  • (X3) m includes the presence of m different positively charged amino acids.
  • X2 is either apolar or positively charged amino acid, and alanine (Ala, A), glycine (Gly, G), proline (Pro, P), tryptophan (Trp, W), phenylalanine (Phe, F) , Leucine (Leu, L), isoleucine (Ile, I), methionine (Met, M), valine (Val, V), arginine (Arg, R), lysine (Lys, K) or histidine (His, H) And preferably alanine, tryptophan or arginine.
  • the skin permeable peptide is more preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 12.
  • the present invention provides a fusion in which a skin-penetrating peptide and a biologically active substance are bound.
  • the biological activity is an activity associated with a physiological phenomenon or an activity associated with a therapeutic purpose that is delivered through the skin into cells or in vivo.
  • the biologically active substance is also called a cargo because it is delivered through the skin permeable peptide of the present invention, and may be a protein, genetic material, fat, carbohydrate and chemical compound.
  • Proteins that bind to the skin permeable peptides include, for example, cytokines and their receptors, as well as chimeric proteins including cytokines or their receptors, such as tumor necrosis factor alpha and beta, their receptors and derivatives thereof; Lenin; Growth hormones such as human growth hormone, bovine growth hormone, methion human growth hormone, des-phenylalanine human growth hormone, and porcine growth hormone; Growth hormone releasing factor (GRF); Parathyroid and pituitary hormones; Thyroid stimulating hormone; Human pancreatic hormone releasing factor; Lipoprotein; Colchicine; Prolactin; Corticotropin; Thyroid stimulating hormone; Oxytocin; Vasopressin; Somatostatin; Refreshin; Panriermin; Leuprolide; Alpha-1-antitrypsin; Insulin A-chain; Insulin B-chain; Proinsulin; Hair follicle stimulating hormone; Calcitonin; Progesterone; Luteinizing hormone releasing hormone (LHRH); LHRH
  • the protein is a growth hormone such as human growth hormone (hGH), recombinant human growth hormone (rhGH), bovine growth hormone, methion human growth hormone, des-phenylalanine human growth hormone and porcine growth hormone; Insulin, insulin A-chain, insulin B-chain and proinsulin; Or growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), converting growth factor (TGF) And insulin-like growth factor-I and -II (IGF-I and IGF-II).
  • hGH human growth hormone
  • rhGH recombinant human growth hormone
  • bovine growth hormone methion human growth hormone, des-phenylalanine human growth hormone and porcine growth hormone
  • Insulin insulin A-chain, insulin B-chain and proinsulin
  • growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), plate
  • the biologically active substance may be a recombinant peptide derived from the PTPN2 protein (rPTP), rPTP peptide combined with the skin permeable peptide of the present invention is applied topically to the skin to improve or treat dermatitis symptoms.
  • rPTP PTPN2 protein
  • Genetic materials associated with the skin permeable peptides include nucleic acids as well as precursors, derivatives, prodrugs and analogs thereof, such as therapeutic nucleotides, nucleosides and analogs thereof; Therapeutic oligonucleotides; And therapeutic polynucleotides.
  • the genetic material may find particular use as anticancer and antiviral agents.
  • the genetic material may include, for example, ribozyme, antisense oligodeoxynucleotide, aptamer and siRNA.
  • suitable nucleoside analogs include cytarabine (araCTP), gemcitabine (dFdCTP) and floxuridine (FdUTP).
  • genetic material is, for example, interfering RNA, such as shRNA, miRNA or siRNA.
  • Suitable siRNAs include, for example, IL-7 (interleukin-7) siRNA, IL-10 (interleukin-10) siRNA, IL-22 (interleukin-22) siRNA, IL-23 (interleukin 23) siRNA, CD86 siRNA, KRT6a (Keratin 6A) siRNA, K6a N171K (Keratin 6a N171K) siRNA, TNF ⁇ (Tumor Necrosis Factor ⁇ ) siRNA, TNFR1 (Tumor Necrosis Factor Receptor-1) siRNA, TACE (Tumor Necrosis Factor (TNF) - ⁇ Conversion Enzyme) siRNA , RRM2 (ribonucleotide reductase subunit) siRNA, and VEGF (vascular endothelial growth factor) siRNA.
  • MRNA sequences of human gene targets of these siRNAs are known in the art.
  • various methods and techniques for selecting specific mRNA target sequences during siRNA design
  • Fats associated with the skin permeable peptide include fatty acids.
  • Fatty acids are monocarboxylic acids with saturated or unsaturated fatty tails. As defined in the International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th Ed. (1997) volume 2, page 1567, fatty acids have about 7 carbon atoms or more.
  • palmitic acid is the most abundant natural fatty acid, a saturated fatty acid found in palm oil and other fats. Palmitic acid is also one of the major fatty acids of the skin produced by the sebaceous gland and is used in skin care and cosmetic preparations as a moisturizer. It stabilizes the oil balance to keep the skin normal and healthy, softens the skin and reacts like an anti-keratinizing agent.
  • Esters of palmitic acid are used to provide silky silkiness to the skin and hair.
  • the palmitic acid acts as a carrier that can penetrate the pentapeptide into the skin, is widely used as a lubricant, and is used as an emulsifier, surfactant, and formula texturizer.
  • Suitable fatty acids in the present invention include, but are not limited to, lauric acid, stearic acid, palmitic acid, undecylenic acid, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linoleic acid, arachidonic acid and erucin acid. Additional suitable fatty acids are disclosed in the International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th Ed. (1997) volume 2, page 1567.
  • Chemical compounds bound to the skin permeable peptide may include, but are not limited to, vitamins and derivatives thereof, and retinoids.
  • ascorbic acid vitamin C
  • alpha-tocopherol vitamin E
  • retinoid vitamin A
  • Ascorbic acid stimulates the synthesis of connective tissue and is particularly involved in the stimulation and regulation of collagen production. It helps to prevent or minimize other types of cellular damage due to fatty oxidation and UV exposure (Varani, J. et al., J. Invest. Dermatol. 114: 480-486 (2000), Offord, EA et al, Free, Radical Biol. & Med. 32: 1293-1303, (2002)).
  • Ascorbic acid helps to inhibit melanin formation and histamine secretion of cell membranes, compensates for vitamin E deficiency in the skin, is involved in preventing depigmentation of the skin, and has anti-free radical activity.
  • Alpha-tocopherol is an antioxidant that prevents the deleterious effects of phospholipids and free radicals on cell membranes (J.B Chazan et al. Free Radicals and Vitamin E. Cah. Nutr. Diet. 1987 22 (l): 66-76).
  • Retinoids block the mediators of inflammation in the skin and increase the production of procollagen, allowing for more production of type I and type III collagen.
  • peptide fusion refers to the N-terminal or C- of the skin permeable peptide variant in which rPTP peptide, which is a low molecular weight peptide having one or more physiological activities, is a skin permeable peptide or one or more amino acids. It refers to a peptide fusion having a new molecular structure bound to the end.
  • the skin permeable peptide may be a skin permeable peptide having a sequence of (X1) n -X2- (cysteine)-(X3) m .
  • N is an integer of any one of 3 to 14, preferably an integer of any of 3 to 6
  • m is an integer of any one of 4 to 14, preferably an integer of any of 4 to 7. to be.
  • the skin permeable peptide is preferably composed of 9 to 14, more preferably 9 to 12, most preferably 9 to 10 amino acids. Below the lower limit, the cell permeation efficiency decreases rapidly, and when the upper limit is exceeded, the possibility of causing an immune response increases.
  • X1 and X3 are each independently one of the positively charged amino acids, arginine (Arg, R), lysine (Lys, K) or histidine (His, H), preferably arginine or lysine.
  • Arg, R arginine
  • Lys, K lysine
  • His, H histidine
  • arginine or lysine are each independently one of the positively charged amino acids, arginine (Arg, R), lysine (Lys, K) or histidine (His, H), preferably arginine or lysine.
  • (X1) n is a combination of n positively charged amino acids corresponding to X1, n amino acid includes not only n the same amino acid, but also includes n different positively charged amino acids.
  • (X3) m includes the presence of m different positively charged amino acids.
  • X2 is either apolar or positively charged amino acid, and alanine (Ala, A), glycine (Gly, G), proline (Pro, P), tryptophan (Trp, W), phenylalanine (Phe, F) , Leucine (Leu, L), isoleucine (Ile, I), methionine (Met, M), valine (Val, V), arginine (Arg, R), lysine (Lys, K) or histidine (His, H) And preferably alanine, tryptophan or arginine.
  • the skin permeable peptide is more preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 12.
  • the rPTP peptide is a recombinant peptide consisting of fragments of the PTPN2 protein, which is a biologically active peptide.
  • the rPTP peptide is a peptide having an activity related to physiological phenomena or an activity related to physiological phenomena, which is delivered through the skin into the cell or in vivo.
  • PTPN2 protein is a T cell protein tyrosine phosphatase, also called TC-PTP. It is an enzyme that modulates cytokine receptor signals (JAK1, JAK3, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6) associated with the JAK-STAT pathway and also inhibits T cell receptor signaling molecules such as the Src family tyrosine kinase (Lck, Fyn). .
  • the gene encoding the PTNT2 protein is as shown in FIG. 52.
  • rPTP peptides were newly designed by combining respective nodule fragments including a catalytic domain; and a substrate binding domain that binds to an AP sequence (see FIG. 52). Bottom peptide). This designed rPTP peptide is applied topically to the skin to ameliorate or treat dermatitis symptoms.
  • the rPTP peptide of amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 20 designed in accordance with the present invention has the advantage of having an excellent therapeutic or prophylactic effect simultaneously against skin inflammatory diseases (psoriasis, allergy, chronic dermatitis, etc.).
  • the skin permeable peptide and rPTP peptide bond is characterized in that the peptide bond or chemical bond.
  • the chemical bond may be selected from the group consisting of disulfide bonds, diamine bonds, sulfide-amine bonds, carboxyl-amine bonds, ester bonds and covalent bonds. .
  • the fusion according to the invention may be an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 19, which has a significantly better prophylactic and therapeutic effect against skin inflammatory diseases than native bioactive proteins.
  • the effect on the skin inflammatory disease is significantly lower, through which the skin penetration efficiency (especially percutaneous cell penetration efficiency) and the increase in the therapeutic or prophylactic effect on the skin inflammatory disease is increased. It can be seen that it is not due to the permeable peptide or rPTP peptide intrinsic properties.
  • the peptide fusion according to the present invention not only has excellent skin permeability efficiency, but can also exhibit excellent therapeutic and prophylactic effects only by transdermal administration. Therefore, the fusion according to the present invention can be usefully used as a drug having a prophylactic and therapeutic effect against skin inflammatory diseases.
  • the fusion effectively regulated cytokine production in activated T cells and had an inhibitory effect in both prophylactic and therapeutic models of skin inflammatory diseases (psoriasis, allergic dermatitis, chronic dermatitis).
  • the skin permeable peptide and rPTP peptide are bound by covalent bonds, and include, but are not limited to, ester, amide, ether and carbamide bonds.
  • the skin permeable peptide is a very small peptide, it is possible to minimize biological interference with any active substance that may occur.
  • the fusion of the skin permeable peptide with the biologically active substance can be delivered in vivo through the skin.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant expression vector comprising a gene for coating the fusion.
  • the recombinant expression vector may comprise a sequence of the skin permeable peptide and the rPTP peptide (SEQ ID NO: 19) and a tag sequence for facilitating purification of the fusion, eg, continuous histidine codons, maltose binding protein codons and Myc. Codons, and the like, and may further include a fusion partner for increasing solubility of the fusion.
  • a spacer amino acid or a nucleotide sequence may be further included for stability of the overall structure and function of the recombinant protein or flexibility of the protein encoded by each gene.
  • spacers examples include AAY (PM Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (RPM Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) or one to many Lysine residues (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, KS Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715).
  • a sequence specifically cleaved by an enzyme to remove an unnecessary portion of the recombinant protein, an expression control sequence, and a marker or reporter gene sequence for confirming intracellular delivery are not limited thereto. no.
  • the expression control sequence used in the recombinant expression vector may be composed of a regulatory domain including a promoter specific for cells, tissues, and organs to which the target DNA and / or RNA is selectively delivered or expressed.
  • the biologically active substance bound to the skin-penetrating peptide may be effective in antioxidant activity, angiogenesis, reduction of acne symptoms, reduction of line secretion, reduction of aging effect, reduction of wrinkles, reduction of melanin production, reduction of skin inflammation or It may be a substance having an activity such as improving skin dryness.
  • the biologically active substance bound to the skin permeable peptide is peripheral nerve, adrenaline receptor, choline receptor, skeletal muscle, cardiovascular system, smooth muscle, blood circulation system, synapse site, nerve effector junction site, endocrine and hormone system, It may be a chemical compound that acts on the immune system, reproductive system, skeletal system, otatacoid system, digestive and excretory system, histamine system and central nervous system.
  • the chemical compound may include psoriasis preparations such as local anesthetics, anti-inflammatory agents, anti-infectives, acne treatments, antiviral, antifungal, topical corticosteroids.
  • psoriasis preparations such as local anesthetics, anti-inflammatory agents, anti-infectives, acne treatments, antiviral, antifungal, topical corticosteroids.
  • the chemical compound is listed below: 16-17A-epoxyprogesterone (CAS reg. No.:1097-51-4), P-methoxycinnamic acid / 4-methoxycinnamic acid (CAS reg. No .: 830-09-1 ), Octyl methoxycinnamate (CAS reg. No.:5466-77-3), octyl methoxycinnamate (CAS reg. No .: 5466-77-3), methyl p-methoxy cinnamate (CAS reg. No.:832- 01-9), 4-estrene-17 ⁇ -OL-3-one (CAS reg. No .: 62-90-8), ethyl-p-anisoyl acetate (CAS reg.
  • Atracurium besylate (CAS reg. No .: 64228-81-5), nilutamide Nilutamide (CAS reg. No .: 63612-5 0-0), 3,4-dihydroxyphenylethanol (CAS reg. No .: 10597-60-1), ketanserine tartrate (CAS reg. No .: 83846-83-7), Ozagrel (CAS reg. No .: 82571-53-7), Eprosartan mesylate (CAS reg. No .: 144143-96-4), Ranitidine hydrochloride (CAS reg.
  • Nelarabine (CAS reg. No .: 121032-29-9), Pimecrolimus (CAS reg. No .: 137071-32-0), 4-[-methoxy-7- (3-piperidin-1-ylpropoxy) quinazolin-4-yl] -N- (4-propane-2 -Yloxyphenyl) piperazine-1-carboxamide (CAS reg. No .: 387867-13-2), ritonavir (CAS reg.
  • Olopatadine HCl CAS reg. No .: 113806-05-6
  • zinc pyrithione CAS Accession number: 13463-41-7
  • olopatadine HCl CAS accession number: 140462-76-6
  • cyclosporin CAS accession number: 59865-13-3
  • botulinum toxin and its analogs and vaccine components Can be.
  • the skin permeable peptide and the biologically active substance are bound by covalent bonds, and include, but are not limited to, ester, amide, ether and carbamide bonds.
  • the skin permeable peptide is a very small peptide, it is possible to minimize biological interference with any active substance that may occur.
  • the fusion of the skin permeable peptide with the biologically active substance can be delivered in vivo through the skin.
  • the cosmetic composition of the present invention may be a fusion consisting of an rPTP peptide bound to a skin permeable peptide.
  • the fusion is included in an amount of 0.0001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • the composition may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the fusions.
  • the fusion is characterized in that the penetrating the stratum corneum, the cosmetic composition or pharmaceutical composition for external application for skin containing the same is most preferably transdermal.
  • the penetrating the stratum corneum, the cosmetic composition or pharmaceutical composition for external application for skin containing the same is most preferably transdermal.
  • it can be prepared in other formulations that utilize ointments or gels. Due to this particular property, direct administration to the site of the disease is possible and oral side effects are lower than oral administration to skin diseases, and therefore, particularly in the treatment of skin diseases, it can have a more prophylactic and therapeutic effect through transdermal administration. .
  • compositions may further comprise a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier, excipient, diluent in addition to the fusions described above for administration.
  • suitable carriers, excipients and diluents include lactose.
  • the composition may further include conventional fillers, extenders, binders, disintegrants, surfactants, anticoagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, and the like.
  • Formulations of such compositions may include solutions, emulsions (including microemulsions), suspensions, creams, lotions, gels, powders, or other typical solid or liquid compositions used for application to the skin and other tissues to which the composition may be applied. Can be.
  • compositions may comprise additional antimicrobial, moisturizing and hydrating agents, penetration agents, preservatives, emulsifiers, natural or synthetic oils, solvents, surfactants, detergents, gelling agents ( may include gelling agents, emollients, antioxidants, fragrances, fillers, thickeners, waxes, odor absorbers, dyestuffs, colorants, powders, viscosity-controlling agents and water And optionally, anesthetics, anti-itch actives, botanical extracts, conditioning agents, darkening or lightening agents, glitters, wetting agents ( humectant, mica, minerals, polyphenols, silicones or derivatives thereof, sunblocks, vitamins, and phytomedicinal.
  • gelling agents may include gelling agents, emollients, antioxidants, fragrances, fillers, thickeners, waxes, odor absorbers, dyestuffs, colorants, powders, viscosity-controlling agents and water
  • anesthetics anti-itch active
  • the dosage of the composition varies depending on the subject's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the disease.
  • the daily dosage is about 0.01 to 100 mg / kg for the compound, preferably 0.5 to 10 mg / kg, and more preferably divided once to several times a day.
  • the skin inflammatory diseases are most preferably inflammatory dermatitis, psoriasis, wounds, atopic diseases.
  • the present invention provides a method for preventing or treating skin inflammatory diseases, comprising applying an effective amount of the pharmaceutical composition for external application for skin to the skin of an individual.
  • the pharmaceutical composition for external application for skin can be injected in vivo or intracellularly through the skin, it can be effectively prevented or treated by applying it to the skin of a human or an animal other than humans, especially a diseased part.
  • the present invention comprises the steps of combining the skin permeable peptide with a biologically active material to prepare a delivery complex; And it provides a method for transdermal delivery of a biologically active substance consisting of the step of injecting the delivery complex through the skin into a living body or cells.
  • the binding of the skin permeable peptide to the biologically active substance may be by indirect linkage by cloning technique using an expression vector at the nucleotide level or by direct linkage by chemical or physical covalent or non-covalent bond of the peptide and the biologically active substance. have.
  • the biologically active substance is an rPTP peptide derived from PTPN2 protein.
  • the present invention comprises the steps of combining the skin permeable peptide with a genetic material to prepare a delivery complex; And it provides a gene therapy method comprising the step of injecting the delivery complex into the skin cells.
  • the skin-permeable peptide and the genetic material may be directly connected by chemical or physical covalent or non-covalent bonds.
  • In vivo or intracellular infusion of the delivery complex of genetic material through the skin may be administered by the same route as previously described.
  • the biologically active substance is an rPTP peptide derived from PTPN2 protein.
  • the delivery complex of genetic material is non-immunogenic, non-infectious, and is not limited in plasmid size because DNA is not packaged in vector organisms such as retroviruses or adenoviruses. Thus, it can be used in any practical size recombinant gene expression construct.
  • rPTP recombinant peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 designed from the skin permeable peptide (AP) having the amino acid sequences of SEQ ID NOs 1 to 12, 15 and 17 and the PTPN2 protein was synthesized.
  • the mixture was left at 95 ° C. for 3 minutes to remove secondary or tertiary structures formed (denaturation) at 50 ° C. and The temperature was changed to 72 ° C. to make DNA double strands. Restriction enzyme specific sequences other than sense and antisense oligodeoxynucleotides were inserted into 5 'and 3' to insert into the pRSET-b vector. It was then amplified in E. coli (transformaiton) mass amplification. Then, the integrity of the sequence was confirmed and expressed in E. coli.
  • a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-12, 15, and 17 is a recombinant peptide designed from the PTPN2 protein (hereinafter also referred to as 'rPTP') (SEQ ID NO: 20) or
  • a primer was prepared to allow EGFP to be linked to the N-terminus of AP to produce AP-rPTP or AP-EGFP gene by PCR reaction and insert it into a vector (pRSET-b). After expressing and purifying the protein in E. coli strains, an experiment was conducted to confirm the delivery efficiency in the cells.
  • a forward primer was prepared by adding a DNA nucleotide sequence encoding a peptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to a DNA nucleotide sequence encoding a portion of the N-terminus of a green fluorescent protein (hereinafter also referred to as 'EGFP').
  • the forward primer of SEQ ID NO: 13 includes a NheI restriction enzyme recognition site for DNA cloning at the 5 'end and a BamHI restriction enzyme recognition site between the base sequence of AP and EGFP.
  • reverse primers of SEQ ID NO: 14 were prepared to amplify AP-EGFP by PCR.
  • the reverse primer includes a DNA sequence encoding the C-terminal part of the EGFP, and the HindIII restriction enzyme recognition site was inserted at the 5'most end of the primer for DNA cloning.
  • PCR reactions were carried out using the primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 using the pRSETb vector containing the EGFP gene as a template.
  • Initial thermal denaturation at 95 ° C. for 3 minutes, followed by 20 seconds of heat denaturation of the template at 95 ° C., 20 seconds of polymerization reaction between the primer and the template at 50 ° C., and 30 seconds as an extension at 72 ° C. 30 cycles were performed using a PCR reactor ( Biorad ).
  • the amplified product of AP-EGFP amplified from the reaction was confirmed that 789 bp DNA fragments were amplified by 1% agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
  • a 789 bp DNA fragment prepared in Preparation Example 2 was cut into a protein expression vector pRSETb and then inserted into the vector using a ligase.
  • DNA fragments amplified in Preparation Example 2 were subjected to enzymatic reaction using NheI and HindIII ( NEB ) to make the 5 ′ / 3 ′ end of the DNA an adhesive end. Meanwhile, pRSETb was enzymatically reacted using the same two restriction enzymes to form a linear pRSETb vector having NheI and HindIII insertion sites. After each enzyme reaction, it was separated using a PCR purification kit ( Cosmogenetech ).
  • AP-EGFP double-stranded DNA fragment and pRSET-b vector were enzymatically linked to T4 Ligase ( NEB ) for 2 hours at 25 ° C.
  • AP-EGFP double-stranded DNA fragments and pRSET-b vector were confirmed by their concentration through 1% agarose gel electrophoresis (Fig. 2).
  • the transgenic p-SETFP vector into which the AP-EGFP was inserted was transformed into DH5 ⁇ Escherichia coli strains, and cultured in LB plate medium containing 50 ⁇ g / ml of antibiotic ampicillin to select transformed Escherichia coli. Selected E. coli colonies were further inoculated in liquid LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and then plasmid vectors were isolated using the plasmid Mini Preparation Kit ( Cosmogenetec ) (FIG. 3).
  • the enzyme was first reacted with NheI and HindIII restriction enzymes, and then confirmed by 1% agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that the AP-EGFP DNA fragment corresponding to 789 bp is inserted into the pRSET-b vector corresponding to 2.9 kbp (FIG. 4). And this was finally confirmed through DNA sequencing ( Bionics ).
  • the structure of the pRSETb vector into which the prepared AP-EGFP is inserted is shown in FIG. 5.
  • the E. coli-expressing protein contains the 6X-His tag encoded in the pRSET-b vector in front of the AP-EGFP. The protein was purified using the following experimental method.
  • the cultures were collected by centrifugation and resuspended in lysis solution (0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0) in native condition.
  • the supernatant was separated by pulverizing and centrifuging cells using VCX-130 ( Sonics & Materials ), an ultrasonic cell crusher.
  • the separated supernatant was filtered once using a 0.45 ⁇ m filter ( Advantec ) and allowed to bind with Ni-NTA agarose ( Qiagen ) for 1 hour at room temperature. Thereafter, histidine columns (His-column, Biorad ) were used to bind only the protein product bound to Ni-NTA agarose to the column.
  • the rotational speed was further cultured for 14 hours in a shake incubator set to 150rpm.
  • the E. coli-expressing protein contains a 6X-His tag encoded in the PET28a vector in front of AP-rPTP.
  • the protein was purified using the following experimental method.
  • the cultures were collected by centrifugation and resuspended in lysis solution (0.3 M NaCl, 10 mM imidazole, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0).
  • the supernatant was separated by pulverizing and centrifuging the cells using an ultrasonic cell crusher VCX-130 (Sonics & Materials).
  • the separated supernatant was filtered once using a 0.45 ⁇ m filter (Advantec) and allowed to bind with Ni-NTA agarose (Qiagen) for 1 hour at room temperature. Thereafter, histidine columns (His-column, Biorad) were used to bind only the protein product bound to Ni-NTA agarose to the column.
  • a forward primer was prepared by adding a DNA base sequence encoding a skin-permeable peptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to a DNA base sequence encoding a portion of the N-terminal sequence of SEQ ID NO: 20 derived from rPTP.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 21 includes a NheI restriction enzyme recognition site for DNA cloning at the 5 'end and a BamHI, EcoRI restriction enzyme recognition site between the base sequence of the AP and rPTP.
  • reverse primers of SEQ ID NO: 22 were prepared to amplify AP-rPTP by PCR.
  • the reverse primer includes a DNA sequence encoding the C-terminal part of the rPTP, and inserted the XhoI restriction enzyme recognition site for DNA cloning at the 5 ′ end of the primer.
  • PCR reactions were carried out using the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 using a PET28a vector containing the rPTP gene as a template.
  • Initial thermal denaturation at 95 ° C. for 3 minutes, followed by 20 seconds of thermal denaturation of the template at 95 ° C., 20 seconds of polymerization reaction between the primer and the template at 50 ° C., and 30 seconds at extension reaction at 72 ° C.
  • One cycle was set to 30 cycles using a PCR reactor ( Biorad ).
  • the amplified product of AP-rPTP amplified from the reaction was confirmed that the DNA fragment of 945 bp was amplified by 1% agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment of 945 bp prepared in Preparation Example 5 was cut into a restriction expression enzyme in PET28a, which is a protein expression vector, and inserted into the vector using a ligase.
  • DNA fragments amplified in Preparation Example 5 were subjected to enzymatic reaction using NheI and XhoI (NEB) to make the 5 ′ / 3 ′ end of the DNA an adhesive end. Meanwhile, PET28a was enzymatically reacted using the same two restriction enzymes to produce a linear PET28a vector having NheI and XhoI insertion sites. After each enzyme reaction, it was separated using a PCR purification kit ( Cosmogenetech ).
  • AP-rPTP double chain DNA fragment and PET28a vector were enzymatically linked to T4 Ligase ( NEB ) for 2 hours at 25 ° C.
  • AP-rPTP double-stranded DNA fragments and PET28a vector were identified by 1% agarose gel electrophoresis.
  • the AP-EGFP protein purified in the process of Preparation Example 4 was delivered into the Jurkat cell line, which is a cancerous human T cell cell line, and its efficiency was confirmed.
  • Jurkat cells were cultured using RPMI medium ( HyClone ), and 100 ⁇ l of RPMI medium containing 1 ⁇ 10 6 cells in each well of a 24-well plate ( SPL lifescience ) in which 350 ⁇ l of RPMI medium was dispensed. Cells were aliquoted by addition.
  • 50- ⁇ l of D-PBS (Welgene) was mixed with a protein adjusted to an appropriate concentration so that the total volume was 500 ⁇ l and the protein was treated according to various conditions as specified.
  • the protein was treated with 5 ⁇ M of each protein in the culture medium and incubated for 1 hour at 37 ° C. in a 5% CO 2 cell incubator.
  • the concentration of AP-EGFP protein was treated to 1 ⁇ M and 5 ⁇ M, respectively, and then incubated for 1 hour at 37 ° C. in a 5% CO 2 cell incubator.
  • TEG-EGFP protein which is one of conventional cell-penetrating peptides and an EGFP protein without AP, was used.
  • the cells are harvested and transferred to a tube and the supernatant removed by centrifugation. I removed it.
  • the cells were washed with 1 ml of D-PBS, resuspended, and centrifuged twice so as not to be buried on the cell surface or to remain in the medium.
  • the cells were finally resuspended with 500 ⁇ l of D-PBS, and the intracellular fluorescence was measured by measuring the intracellular fluorescence using a flow cytometry (FACS machine, BD science FACScantoII ). It was. As a result, it was confirmed that AP-EGFP was delivered into the Jurkat cell line depending on the treatment concentration of the protein.
  • the concentration of AP-EGFP protein was maintained at 5 ⁇ M and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to 4 hours in a 5% CO 2 cell incubator. After the treatment time, the cells were washed by the method as described above, and then intracellular fluorescence was measured by flow cytometry. The results confirmed that AP-EGFP was delivered into the Jurkat cell line depending on the processing time of the protein (FIG. 7).
  • TEG-EGFP, R9-EGFP, and Hph-1 As a negative control, TEG-EGFP, R9-EGFP, and Hph-1, each using an EGFP protein with no cell-penetrating peptide linked thereto, and a positive control with EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) bound to the cell-permeable peptide, respectively. Comparison was made using EGFP. As a result, it was confirmed that the AP sequence of the present invention delivers the protein into Jurkat cells with higher efficiency than TAT (FIG. 8).
  • TDP1-dTomato and TDP2-dTomato in which a dTomato fluorescent protein was bound to a skin-permeable peptide, were compared.
  • the TDP1-dTomato is a skin permeable peptide (amino acid sequence 'NGSLNTHLAPIL', hereinafter referred to as 'peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15' or 'TDP1') disclosed in Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2013-0135207, and TDP1. It is a fusion having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 to which a linker (amino acid sequence 'GS') that a restriction enzyme can recognize at the C-terminus of the linker is bound, and a dTomato fluorescent protein is bound to the C-terminus of the linker.
  • a linker amino acid sequence 'GS'
  • the TDP2-dTomato is a skin permeable peptide (amino acid sequence 'MRAAAPAVAA', hereinafter referred to as 'peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17' or 'TDP2') disclosed in Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2013-0070607, and TDP2. It is a fusion having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 to which the linker (amino acid sequence 'GS') which can recognize a restriction enzyme at the C-terminus of the linker, and the dTomato fluorescent protein is bound to the C-terminus of the linker.
  • the linker amino acid sequence 'GS'
  • TDP1 or TDP2 known as a skin permeable peptide, had a significantly lower delivery efficiency than AP-dTomato when dTomato, a fluorescent protein having a large molecular weight, was bound (FIG. 9).
  • HaCaT cell line is a human epidermal cell line that has been used for transdermal delivery experiments and skin disease papers for in vitro delivery efficiency and mechanism identification [J Invest Dermatol. 2011 Jul; 131 (7): 1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15; 75 (6): 1348-57.].
  • NIH3T3 cell line is a rat dermal cell line, like HaCaT, is a cell line frequently used in in vitro experiments to confirm the mechanism of transdermal delivery and skin disease [J Pharm Sci. 2013 Nov; 102 (11): 4109-20; J Immunol. 2003 Jan 1; 170 (1): 548-55.].
  • the AP of the present invention is shown in FIG. 10 and FIG. 11 in comparison with the conventional cell-penetrating peptides to shear the EGFP fluorescent protein in skin cells.
  • EGFP protein without cell-penetrating peptides was used as a negative control
  • TAT-EGFP and R9-EGFP with EGFP bound to cell-penetrating peptides were used as a positive control.
  • AP C ⁇ A EGFP in which the cysteine of the AP sequence was substituted with alanine was added to the experimental group.
  • the AP of the present invention confirmed that the HaCaT cell line and the NIH3T3 cell line efficiently delivered proteins having a high molecular weight as compared to TAT or R9. It was significantly reduced by substituting for alanine.
  • the negative control group used dTomato fluorescent protein that was not linked to the cell-penetrating peptide
  • the positive control group was compared using TDP1-dTomato and TDP2-dTomato, in which the dTomato fluorescent protein was bound to the skin-permeable peptide. saw.
  • the AP of the present invention delivers high-molecular weight proteins with high efficiency in HaCaT cell lines and NIH3T3 cell lines, whereas conventional TDP1 and TDP2 skin-penetrating peptides enhance the permeation efficiency when high molecular weight proteins are combined.
  • the immune cells Jurkat cells
  • the AP of the present invention delivers high-molecular weight proteins with high efficiency in HaCaT cell lines and NIH3T3 cell lines, whereas conventional TDP1 and TDP2 skin-penetrating peptides enhance the permeation efficiency when high molecular weight proteins are combined. was insignificant.
  • arginine constituting both ends of AP is excluded at the N-terminal one (AP_D1, SEQ ID NO: 2), one at the C-terminal (AP_D2, SEQ ID NO: 3), one at each N, C-terminal (AP_D3, sequence No. 4)
  • AP_D1, SEQ ID NO: 2 one at the C-terminal
  • AP_D2, SEQ ID NO: 3 one at each N, C-terminal
  • EGFP and AP-EGFP, TAT-EGFP, and R9-EGFP were compared as controls.
  • the positively charged substituent on arginine was used as a control to compare the efficiency of R9 with 9 arginines.
  • the alanine substituent and the arginine substituent showed similar patterns. Tryptophan does not show a significant difference in efficiency from the existing AP sequence even if it is changed to other amino acids, it is confirmed that does not make a significant contribution to the functional role of the AP.
  • Arginine was confirmed that the efficiency is greatly reduced when substituted with another amino acid. It is thought that the positively charged property of arginine had a positive effect. Substitution of cysteine with other amino acids showed the most rapid decrease in efficiency, suggesting that cysteine plays a very important function and role in AP (FIGS. 15 and 16).
  • Each protein was treated with Jurkat cells so as to be 5 ⁇ M in the same manner as described above, independently at 4 ° C, 25 ° C, and 37 ° C for 1 hour. As a result, it was confirmed that the temperature is affected as in the conventional TAT. This is indirect evidence that AP is delivered in a manner similar to TAT delivered through energy-dependent endocytosis, in which cells deliver proteins intracellularly in a manner similar to what is known in the art. It was confirmed that it is a permeable peptide. In addition, it was confirmed that at each temperature, all showed higher transfer efficiency than TAT (above FIG. 17).
  • Heparin Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma
  • the Jurkat cell line was first treated for 30 minutes, and 10 ⁇ M of AP-EGFP protein was treated with D-PBS to make a final volume of 100 ⁇ l. Positive controls were compared using TAT-EGFP.
  • the cells are harvested and transferred to a tube and the supernatant removed by centrifugation. I removed it.
  • the cells were washed with 1 ml of D-PBS, resuspended, and centrifuged twice so as not to be buried on the cell surface or to remain in the medium.
  • the cells obtained after the two washing procedures were finally resuspended with 500 ⁇ l of D-PBS, and the intracellular fluorescence efficiency of the protein was measured by measuring intracellular fluorescence using a flow cytometry (FACS machine, BD science FACS Canto ). Measured.
  • AP-EGFP is expected to be affected by endocytosis associated with lipid rafts that make up the phospholipid bilayer cell membrane, thereby removing cholesterol from the cell membrane.
  • M ⁇ CD methyl-beta-cyclodextrin
  • AP-EGFP was delivered into the cervical cancer cell line HeLa cells and analyzed by confocal microscopy to directly confirm whether AP is actually delivered into the cell together with the protein.
  • a microscopic circular cover glass ( Marin field ) was placed on each well of a 12-well plate ( SPL lifescience ), and the cells of HeLa cells were dispensed at 1 ⁇ 10 5 and incubated in DMEM medium ( HyClone ) for 18 hours. The cells were then attached to the cover glass. After aspirating off all of the medium, 450 ⁇ l of new DMEM was added, and the AP-EGFP protein purified in Example 3 was adjusted to 5 ⁇ M and mixed with D-PBS to give a volume of 50 ⁇ l. It was. And incubated in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 1 hour.
  • the procedure was repeated 5 times in which the medium was aspirated to remove extracellular protein and washed with 1 ml of D-PBS.
  • the cells were fixed with 1 ml of formaldehyde (formaldehyde 37% solution, formalin, SIGMA ). After fixing, the mixture was washed five times with 1 ml of D-PBS. Afterwards, the cells were stained with 500 ⁇ l of Hoechst ( Hoechst AG ) diluted 1: 4000 to identify the cells and the location of the nucleus. Washed.
  • the prepared cover glass was mounted on a slide glass using a mounting medium ( SIGMA ) to confirm that the fluorescent glass was transferred to a cell and the location of the green fluorescent protein by a fluorescent microscope DMi-8 (Fluorescence microscope, Leica ). As a result, the AP-bound green fluorescent protein was transmitted through the cell membrane into the cell, and the intracellular location was confirmed to remain in the cytoplasm (FIG. 19).
  • SIGMA mounting medium
  • the AP-bound green fluorescent protein penetrates the cell membrane with high efficiency compared to the positive control or C ⁇ A EGFP, and is delivered into the skin cells. And stayed in the cytoplasm (FIGS. 20 and 21).
  • the 7-week-old female mouse hair of C57BL / 6 species is removed, and then the adhesive layer is removed 10 times to remove the stratum corneum.
  • 100 ⁇ g of AP-EGFP was attached to the skin using a paper patch. After 2, 4, 6 and 8 hours respectively, skin tissue was obtained and fixed with 4% paraformaldehyde, and then frozen blocks were prepared using O.C.T compounds. Then, using a cryostat (cryostat) to make a slice to a thickness of 7 ⁇ m to prepare a slide sample, and confirmed the delivery of AP-EGFP in the skin tissue through a fluorescence microscope. After the slides were stained for 15 minutes with Hoechst and compared with the fluorescent protein was confirmed whether the inside of the cell through the comparison process. TAT-EGFP bound to the conventional cell penetrating peptide was used as a positive control.
  • TAT-EGFP did not deliver green fluorescent protein into the skin tissue for up to 8 hours, but AP-linked green fluorescent protein (AP-EGFP) clearly entered well into the cells constituting the skin tissue from 2 hours. Figure 23).
  • the AP of the present invention was combined with a dTomato fluorescent protein having a high molecular weight, it was tested whether the fluorescent protein was delivered to the skin tissue in comparison with the conventional skin-penetrating peptides.
  • the negative control group was a dTomato fluorescent protein that was not linked to the cell-penetrating peptide
  • the positive control group was TAT-dTomato, TDP1-dTomato, and TDP2-dTomato which bound the skin-penetrating peptide to the dTomato fluorescent protein.
  • the experiment was performed in the same manner as in Experiment 12, but the skin tissue was obtained at 6 hours and used for the experiment.
  • AP of the present invention is delivered to skin cells in skin tissues
  • a paper patch was applied to GFP gene-targeted rat skin expressing green fluorescent protein (GFP) in all cells using the same method as that of Experimental Example 12.
  • GFP GFP gene-targeted rat skin expressing green fluorescent protein
  • dTomato fluorescent protein was attached. After 6 hours, the skin tissue was obtained, fixed with 4% paraformaldehyde, and frozen blocks were prepared using the O.C.T compound. Then, using a cryostat (cryostat) to make a slice with a thickness of 20 ⁇ m to prepare a slide sample, and confirmed the delivery of AP-EGFP in the skin tissue through a confocal microscope.
  • cryostat cryostat
  • both proteins were properly expressed from E. coli and confirmed that they were well purified.
  • the three-dimensional conformation of the AP-rPTP protein was shown to substantially maintain the original rPTP protein structure, and no rapid change in the structure was observed.
  • Figure 29 shows the measured phosphatase activity of the AP-EGFP protein purified from Preparation Example 4 and the AP-rPTP protein purified from Preparation Example 7.
  • a chromosome substrate was added to AP-EGFP protein and AP-rPTP protein, followed by pNPP ((para-nitrophenyl phosphate) phosphatase) assay (BioAssay 517 Systems, Hayward, CA, USA).
  • the data is shown as a plot of the initial ratio (V0) according to the protein concentration. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA. * P ⁇ 0.001.
  • the phosphatase activity of the AP-rPTP protein was 1.5 nmol / min / ⁇ g, but the activity of the AP-EGFP protein was not observed at all.
  • HaCaT cell line is a human epidermal cell line that has been used for transdermal delivery experiments and skin disease papers for in vitro delivery efficiency and mechanism identification [J Invest Dermatol. 2011 Jul; 131 (7): 1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15; 75 (6): 1348-57.].
  • the AP-rPTP protein of the present invention can be delivered to skin cells using the HaCaT cell line.
  • the AP-rPTP protein was stained with an anti His tag antibody, and its signal was amplified by Alexa Fluor-488-bound anti-mouse LgG antibody, and the intracellular fluorescence intensity was measured by flow cytometry. .
  • FIG. 30 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis of the efficiency of delivering AP-rPTP protein prepared in Preparation Example 7 into HaCaT cells, which are skin epidermal cell lines, by flow cytometry.
  • the x-axis MFI of the right graph means 'mean fluorescence intensity', and represents fluorescence intensity.
  • HaCaT cell line is a human epidermal cell line that has been used for transdermal delivery experiments and skin disease papers for in vitro delivery efficiency and mechanism identification [J Invest Dermatol. 2011 Jul; 131 (7): 1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15; 75 (6): 1348-57.].
  • the HaCaT cell line was treated with AP-rPTP protein for various times (0.5 to 12 hours), and then compared with the efficiency that can be delivered to skin cells.
  • the AP-rPTP protein was stained with an anti His tag antibody, and its signal was amplified by Alexa Fluor-488-bound anti-mouse LgG antibody, and the intracellular fluorescence intensity was measured by flow cytometry. .
  • FIG. 31 is a graph showing intracellular fluorescence intensity analysis of the efficiency of delivering proteins into HaCaT cells, which are the skin epidermal cell lines, prepared from Preparation Example 7 over time, using a flow cytometry.
  • the x-axis MFI of the right graph means 'mean fluorescence intensity', and represents fluorescence intensity.
  • AP-rPTP protein of the present invention can achieve sufficient intracellular delivery efficiency if the treatment time is 1 to 8 hours, but is most preferably treated for 1.5 to 3.5 hours to achieve 1.5 times or more intracellular delivery efficiency. Do.
  • splenocytes collected from 6-8 weeks old C57BL / 6 mice with PBS, AP-rPTP and AP-EGFP, respectively. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the splenocytes were activated with the following cytokines.
  • the cells were in PBS and RIPA buffers (Cell signaling, Becerly, MA, USA) (including 1 mM NaF, 1 mM PMSF and Halt protease and phosphatase inhibitor cocktails) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) Wash in ice bath for 30 minutes.
  • the tyrosine phosphorylation of STAT protein in each cytokine stimulation step was measured by immunoblot method. Immunoblotting was performed using PVDF membrane (Bio-Rad), and primary antibodies were phospho-Stat1 (Tyr701) rabbit mAb, phopspho-Stat3 (Tyr705) rabbit mAb, phospho-Stat6 (Tyr641) rabbit mAb. They were purchased from cellular signals and ⁇ -actin mouse mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).
  • FIG. 32 shows the effect of AP-rPTP protein on cytokine stimulation in mouse splenocytes.
  • NA is not a stimulus to activate the immune cells, which corresponds to the negative control
  • PBS was stimulated with each IFN- ⁇ , IL-6, IL-4 to activate the immune cells, which is a kind of positive Control
  • the cells were incubated with AP-rPTP or AP-EGFP protein for 1 hour and then stimulated with 60, 30, and 15 minutes in the order of IFN- ⁇ , IL-6, and IL-4.
  • the phosphorylation of STAT1, STAT3, and STAT6 was significantly reduced when AP-rPTP protein was treated.
  • the AP-rPTP protein according to the present invention can be considered to play a negative role (negatively regulates) the cytokine signal in immune cells.
  • 0.1 ug of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies are coated on a 96 well plate for 5 hours in a 37 ° C, 0.5% carbon dioxide cell incubator. Afterwards, separate the spleen cells of the isolated rats for 2.5 X 10 5 cells for each well. After treatment with PBS or AP-rPTP protein, it is incubated in a 37%, 0.5% carbon dioxide cell incubator for 3 days. Cells were then stained for 20 minutes at 4 ° C. with CFSE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fluorescence. Since CFSE signal from the cells prepared by the above-described process was analyzed by flow cytometry (FACS).
  • FACS flow cytometry
  • FIG. 33A, B are graphs measuring proliferation in NA or PBS treated primary mouse CD4-T cells ('NA' and ' ⁇ -CD3 ⁇ CD28 + PBS'), and FIG. 33C is in primary mouse CD4-T cells A graph showing the investigation of CD4 T cell proliferation when the AP-rPTP protein was treated.
  • NA is a negative control that does not stimulate T cells can be activated
  • PBS was stimulated with anti-CD3, anti-CD28 monoclonal antibody to activate T cells, which is a kind of positive control .
  • cytokine and CD4 T cell proliferation generated from activated T cells were evaluated by stimulation with anti-CD3 and CD28 antibodies, and AP-rPTP was activated T cell proliferation. It has been found to significantly reduce proliferation.
  • cytokine expression levels (IL-17 (a), IL-13 (b), IFN- ⁇ (c) and IL2 (d)) in mouse spleen cells according to AP-rPTP and AP-EGFP proteins. It is a graph showing the result of the measurement. All data are average values of those who performed at least three experiments, which represent mean ⁇ s.e.m., * denotes p ⁇ 0.05; ** is p ⁇ 0.01; *** indicated p ⁇ 0.001 and statistical analysis was performed by one-way ANOVA.
  • the ear was fixed with 4% formaldehyde for one day, and the tissue dehydrated in 30% sucrose for one day was made into frozen sections using O.C.T compounds. After the sections were prepared in 10 ⁇ m, the sections were dyed by H & E staining and observed with an optical microscope. As a result, it was confirmed that the ear thickness is reduced compared to the negative control (Fig. 39).
  • rPTP-mediated experiments were also performed with TAT-rPTP fusions or R 9 -rPTP fusions, using conventional cell permeable peptides instead of APs to impart pathological regulatory functions, but these were all pathological controls such as AP-rPTPs. It was confirmed that it does not function. In other words, no significant change was observed in comparison with the negative control group, so it was not illustrated separately.
  • cytokines IL-1 ⁇ , IL-6
  • CXCL2, CXCL5 mRNA of chemokines
  • the AP-rPTP protein can effectively control the inflammatory response to skin tissues suffering from OXA-induced acute skin inflammation.
  • Ovalbumin Ovalbumin
  • AP-rPTP protein was administered together with OVA to confirm the prophylactic effect, and AP-rPTP protein was administered only to the last OVA administration step to confirm the therapeutic effect (FIG. 42). .
  • the ears were fixed with 4% formaldehyde for one day, and then paraffin sections were made using paraffin in tissue dehydrated in 30% sucrose for one day. Sections were made to 6 mm, and the sections were dyed by H & E staining and observed with an optical microscope.
  • the negative control group Sham was confirmed that the abnormal growth of the epidermis, while the AP-rPTP according to the present invention (in prevention or treatment model) significantly reduced the thickness and inflammation (Fig. 43). .
  • FIG. 44 is a graph comparing the total histological values of the H & E staining results of FIG. 43, according to which treatment of AP-rPTP protein in the percutaneous of the mouse resulted in significant inflammatory tissue reduction in both preventive and therapeutic models. It was confirmed.
  • FIG. 45 is a graph showing the result of measuring the amount of IL-13 mRNA expression from the skin tissue of the prophylactic and treatment models. According to this, it can be seen that the expression of IL-13 mRNA is significantly reduced by the AP-rPTP treatment of the present invention. .
  • the AP-rPTP protein according to the present invention targets inflammatory cytokine signal and T cell receptor signal, it is expected to have a prophylactic or therapeutic effect not only for allergic inflammatory response but also for other skin diseases. This proved.
  • FIG. 47 is a graph showing measurement of ear thickness change during treatment of AP-rPTP and AP-EGFP for 6 days in an animal model of psoriasis-like dermatitis induced by imiquimod.
  • FIG. 48 is an image of the ears of the rat group treated with AP-rPTP or AP-EGFP and the ears of the negative control group (Sham) stained by H & E staining to observe the difference in the thickness of the ears by optical microscope.
  • FIG. 49 quantifies the cytokine (IL-7A, IL-17F, IL-6) mRNA expression levels measured in the ears of the rat group treated with AP-rPTP or AP-EGFP and in the ear tissue cells of the negative control group (Sham).
  • 50 is a graph showing the quantification of antimicrobial peptide (S100A8, S100A9) mRNA expression levels measured in the ears of rat group treated with AP-rPTP or AP-EGFP and ear tissue cells of Sham. It is a graph.
  • FIG. 49 and FIG. 50 the mRNA expression profiles of ear skin tissues were examined, and it was confirmed that IL-17A, IL-17F and IL-6 mRNA expressions were drastically reduced when AP-rPTP was transdermally administered.
  • AP-rPTP administration significantly reduced the peptides of S100A8 and S100A9 that have chemotaxis to neutrophils.
  • AP-rPTP has a very effective prophylactic and therapeutic effect against psoriasis skin disease through transdermal administration.
  • the skin permeable peptide of the present invention and a fusion conjugated with a biologically active substance using the same can be used in various fields such as cosmetics and pharmaceuticals.

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Abstract

본 발명은 새로운 피부 투과성 펩티드 및 그를 이용한 생물학적 활성 물질이 결합된 융합체, 그를 포함하는 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 피부 투과성 펩티드는 종래 피부 투과성 펩티드에 비하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮고, 현저히 개선된 피부 투과능을 나타내므로, 생물학적 활성 물질을 피부, 특히 각질층을 통해 효율적으로 전달시킬 수 있다.

Description

피부 투과성 펩티드 및 그 이용방법
본 발명은 피부를 투과하여 생물학적 활성 물질을 전달할 수 있는 피부 투과성 펩티드 또는 그의 유도체, 상기 펩티드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 약학 조성물, 및 상기 펩티드 또는 그의 유도체를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 조직으로, 체액 누출 및 감염 방지, 수분 소실을 막는 보호장벽으로서 역할은 한다. 특히 표피의 각질층은 피부에서도 가장 바깥쪽에 존재하면서 피부 밖으로의 수분과 전해질의 소실을 억제함으로써 피부의 건조를 막고, 피부의 정상적인 생화학적 대사를 할 수 있는 환경을 제공하여, 외부의 물리적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하는 중요한 역할을 한다(Bouwstra J. A, Honeywell-Nguyen P. L. Gooris G. S. and Ponec M. Prog Lipid Res. 42:1-36(2003)).
이러한 피부를 통한 흡수 경로는 각질층을 통한 흡수, 모낭과 피지선을 통한 흡수, 땀샘을 통한 흡수 등 3가지 경로가 있다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 피부를 통한 생리 활성 분자의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한을 받으며, 현재까지 알려진 바로는 각질층을 통한 흡수가 가장 중요한 흡수 경로로 알려져 있다. 특히, 피부 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 각질형성세포(keratinocyte)가 자연사 되어 피부의 최외각층에 치밀한 구조를 이루고 있으며, 수분의 증발뿐만 아니라 외부물질의 침투를 억제하며, 땀과 각종 지질 성분으로 인하여 pH 5 부근의 산성도를 보이고 있다. 이러한 각질층 장벽을 투과하기 위해서는 분자량이 500 Da 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다(Metha R. C. and Fitzpatrick R.E. Dermatol. Ther. 20:350-359 (2007)).
화장품 원료로 빈번하게 사용되는 분자량 500 Da 이하의 저분자 합성 화합물이나 천연 화합물들은 쉽게 세포 내로 전달 될 수 있다고 알려져 있으나, 피부 장벽을 구성하는 각질층의 고유 특성으로 인하여 저분자량 물질들의 투과 효율 역시 낮으며, 분자량 500 Da 이상의 단백질, 펩티드 및 핵산과 같은 거대 분자들은 분자량의 크기 때문에 이중 지질막 구조로 되어 있는 세포막 안으로 더욱더 투과하기 어렵다. 이러한 저분자 및 거대 분자들이 세포의 원형질막을 통과하는 효율을 증폭시키기 위한 방법으로서, 최근 관심이 고조되고 있는 것이 피부를 통한 투여 방법(Transdermal drug delivery, TDD)이다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 그러나, 피부를 통한 투여 방법의 가장 큰 장벽은 각질층 내의 각질형성세포와 이들 사이의 각질세포간 지질이다. 대부분의 피부에서 생리학적으로 활성을 나타내는 분자(이하, 피부 생리 활성 분자)들은 피부 각질층의 저항성 때문에 경피 투과율이 낮아지게 된다.
이러한 피부 생리 활성 분자의 경피 투과율을 촉진시킬 수 있는 다양한 방법들이 연구되어 왔는데, 최근 세포 투과성 펩티드를 이용한 전달 시스템에 많은 관심이 집중되고 있다. 세포 투과성을 갖는 펩티드의 사용은 여러 장점을 갖는데, 이는 주로 상시 펩티드 서열에 이루어질 수 있는 다양한 변형에 기인한다. 이는 다른 세포 하부 도메인을 지정할 수 있으며, 다양한 형태의 화물 분자들(cargo molecules)을 운반할 수 있는 담체의 조작을 가능케 한다.
대표적인 세포막 투과성 펩티드를 예로 들면 HIV-1(Human immunodeficiency virus-1)의 감염 기작 중 하나로 TAT라는 물질의 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질로써, 이로부터 유래한 'YGRKKRRQRRR'에 해당하는 TAT 펩티드는 가장 많이 적용되고 활발한 연구가 진행되고 있다(Mann, D. A. et al., Embo J 10 : 1733-1739, 1991). TAT 펩티드를 이용하여 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE)등을 세포 내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 localization에 대한 연구가 진행된 바 있고(Fawell, S. et al., PNAS 91 : 664-668, 1994), TAT 펩티드는 세포막에 존재하는 Heparan sulfate와의 상호작용 후 발생하는 Lipid Raft가 관여하는 엔도시토시스(Endocytosis)에 의한 것임을 밝혀졌다(Jehangir S. W. et al., Nature Med 10 : 310 - 315, 2004).
이 외에도, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin (Antp)이라는 세포 투과성 펩티드, HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포 투과성 펩티드 VP22, 인공적으로 합성해낸 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan, 세포 투과성 펩티드에서 가장 중요한 기능을 담당할 것이라고 예상되는 아르기닌을 인공적으로 반복시킨 폴리아르기닌 (Poly-Arginine) 등이 세포 투과성 펩티드로 잘 알려져 있다.
이러한 종래 세포 투과성 펩티드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포 투과성 펩티드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다.
또한 이들은 비교적 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있어서 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 크고, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.
본 발명의 발명자들은 소뇌를 발달시키고 신경의 이동에 관여하는 신경단백질의 하나인 인간 ASTN1(Astroractin 1) 단백질에서 유래한 펩티드 서열이 세포 투과성 펩티드인 TAT나 종래 공지된 피부 투과성 펩티드에 비하여 표피세포 또는 피부 조직의 투과 효율이 현저히 우수하다는 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 분자량의 크기 또는 피부 각질층의 고유 특성으로 인해 피부를 통해 전달되기 어려운 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 내로 효율적으로 도입하기 위한 피부 투과성 펩티드로서, 종래 피부 투과성 펩티드에 비하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮고, 현저히 개선된 피부 투과능을 나타내는 피부 투과성 펩티드를 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 종래 분자량의 크기 또는 피부 각질층의 고유 특성으로 인해 피부 표면에 직접적인 투여를 통해서는 달성하기 어렵던, 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료 문제를 해결함과 동시에, 종래 펩티드에 비하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮고, 현저히 개선된 피부 투과능을 나타내는 펩티드 융합체를 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 피부, 특히 각질층을 통해 효율적으로 피부 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 화장료 조성물 또는 피부 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 피부외용제용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 (X1)n-X2-(시스테인)-(X3)m의 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드를 제공한다. 상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이며, 상기 X1 및 X3은 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이며, 상기 X2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 발린, 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다.
본 발명은 상기 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질이 결합된 융합체를 제공한다.
본 발명은 상기 융합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 피부외용제용 약학 조성물의 유효량을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 피부 투과성 펩티드는 표피 세포주, 진피 세포주 및 피부 조직 내로 효과적으로 단백질을 전달할 수 있으며, 종래 TAT 펩티드 또는 피부 투과성 펩티드와 비교했을 때 더욱 높은 효율로 단백질을 전달할 수 있고, 피부를 통하여 전달되어 치료 목적으로 사용할 수 있는 단백질, 유전물질, 화학화합물 등의 생물학적 활성 물질의 전달에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 융합체는 표피 세포주, 진피 세포주 및 피부 조직 내로 효과적으로 전달되어, 피부 질환을 야기하는 각종 염증성 사이토카인 신호뿐만 아니라 T 세포 활성 및 증식을 동시에 억제할 수 있기 때문에, 염증성 피부 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘한다.
또한 본 발명의 펩티드 융합체는 안정성과 피부 투과도가 매우 우수하며, 이러한 특성으로 인해 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.
도 1은 제조예 2의 AP와 이것이 연결된 EGFP (AP-EGFP)를 코딩하는 PCR 산물인 789 bp의 이중사슬 DNA 절편을 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 2는 제조예 3의 AP-EGFP DNA 절편을 삽입하기 위하여 AP-EGFP DNA 절편 (789 bp)과 pRSET-b 벡터 (2.9 Kb)를 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 각각 효소반응 한 뒤, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 DNA의 양을 확인한 사진이다.
도 3은 제조예 3의 AP-EGFP를 코딩하는 DNA 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균주에 형질 전환시킨 후 평판 LB 배지에서 배양해 선택한 콜로니를 액체 LB 배지에 접종하여 배양한 후 플라스미드 Mini preparation 과정을 통해 분리해 낸 DNA를 1% 아가로스 젤 전기영동 사진이다.
도 4는 제조예 3의 분리한 플라스미드 DNA가 AP-EGFP를 코딩하는 DNA 절편 (789 bp)과 pRSET-b 벡터 (2.9 Kb)로 구성되었음을 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 한 뒤 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 5는 제조예 3의 AP-EGFP가 삽입된 pRSET-b 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 6은 제조예 4의 정제한 AP-EGFP 단백질과 음성 대조군에 해당하는 세포 투과 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질, 양성대조군에 해당하는 기존에 가장 널리 알려진 세포 투과 펩티드인 TAT-EGFP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 7은 실험예 1에서 Jurkat 세포 내로 AP-EGFP 단백질이 농도 의존적, 시간 의존적으로 전달되었음을 유세포분석기(flow cytometry)를 이용한 세포 내 형광 강도 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 2에서 AP가 Jurkat 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 9는 실험예 3에서 AP가 Jurkat 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 10은 실험예 4에서 AP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 11은 실험예 4에서 AP가 피부 진피 세포주인 NIH3T3 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과성 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 12는 실험예 5에서 AP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과성 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 13은 실험예 5에서 AP가 피부 진피 세포주인 NIH3T3 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과성 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 14는 실험예 6에서 AP의 가장 많은 부분을 차지하고 있는 아미노산 서열인 아르기닌이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 미치는 영향을 아르기닌을 하나씩 없애는 대조군을 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 15는 실험예 6에서 AP를 구성하는 아미노산 서열인 트립토판(X2), 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 주는 영향을 확인하기 위하여 각각 알라닌으로 치환하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 16은 실험예 6에서 AP를 구성하는 아미노산 서열인 트립토판(X2), 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 주는 영향을 확인하기 위하여 각각 아르기닌으로 치환하여 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 17은 실험예 7에서 온도 및 배지 내 혈청 (serum)농도의 변화에 따른 AP의 세포 내 전달 효율의 변화를 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 18은 실험예 8에서 Heparin과 MβCD (Methyl-beta-cyclodextrin)의 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율의 변화를 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 그래프이다.
도 19는 실험예 9에서 HeLa 세포 내부로 AP-EGFP가 전달되었음을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 20은 실험예 10에서 AP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 공초점 현미경을 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 및 세포 내 위치 이미지이다.
도 21은 실험예 10에서 AP가 피부 진피 세포주인 NIH3T3 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 공초점 현미경을 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 및 세포 내 위치 이미지이다.
도 22는 실험예 11에서 쥐의 각 장기 세포 내부로 AP-EGFP가 전달되었음을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 23은 실험예 12에서 시간에 따른 AP-EGFP의 쥐의 피부조직으로 전달 효율 변화와 종래의 세포 투과 펩티드를 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 형광 현미경 사진이다.
도 24는 실험예 13에서 쥐의 피부로의 AP-dTomato와 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교 분석한 형광 현미경 사진이다.
도 25는 실험예 14에서 녹색 형광 단백질 적중 쥐의 피부에 AP-dTomato가 전달되었음을 확인하기 위한 공초점 현미경 사진이다.
도 26은 도 25의 확대 사진이다.
도 27은 제조예 4로부터 정제한 AP-EGFP 단백질과 제조예 7에서 정제한 AP-rPTP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 28은 실험예 16에서 AP-rPTP 단백질의 3차원 구조를 예측하여 나타낸 도면이다.
도 29는 실험예 17에서 AP-EGFP 단백질과 AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성을 확인하기 위한 그래프이다.
도 30은 실험예 18에서 AP-rPTP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 31은 실험예 19에서 AP-rPTP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 시간에 따라 단백질을 전달하는 효율을 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 32는 실험예 20에서 AP-rPTP 단백질이 처리된 마우스 비장세포(splenocytes)에서 사이토카인(cytokines) 자극에 의한 영향을 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 33a, b는 실험예 21에서 NA 또는 PBS 처리한 일차 마우스 CD4-T 세포들('NA' 및 'α-CD3αCD28+PBS')에서의 증식을 측정한 그래프이고, 도 33c는 실험예 21에서 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때의 CD4 T 세포 증식을 조사하여 나타낸 그래프이다.
도 34는 실험예 22에서 AP-rPTP 및 AP-EGFP 단백질에 따른 마우스 비장세포에서의 사이토카인 발현양(IL-17(a), IL-13(b), IFN-γ(c) 및 IL2(d))을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 35는 실험예 23의 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델 계획을 나타낸 도면이다.
도 36은 실험예 23에서 감작 6일 후 접촉성 피부염을 유도한 귀의 형태적 모습을 관찰한 결과 AP-rPTP 처리군의 쥐 귀의 염증이 저해된 것을 확인할 수 있는 사진이다.
도 37은 실험예 23에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀 두께가 대조군인 PBS 처리 쥐 그룹에 비해 감소한 것을 나타낸 그래프이다.
도 38은 실험예 23에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀 무게가 대조군인 PBS 처리 쥐 그룹에 비해 감소한 것을 타나낸 그래프이다.
도 39는 실험예 23에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 대조군인 PBS를 처리한 쥐 그룹의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 40은 실험예 24에서 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 사이토카인(IL-1β, IL-6)의 mRNA 발현양을 측정하여 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 41은 실험예 24에서 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 케모카인(CXCL2, CXCL5)의 mRNA 발현양을 측정하여 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 42는 실험예 25의 Ovalbumin(OVA) 유도된 만성(chronic) 피부염 동물모델 계획을 나타낸 도면이다.
도 43은 실험예 25에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 대조군인 PBS를 처리한 쥐 그룹의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 44는 상기 도 43의 H&E 염색 결과의 총 조직학적 수치를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 45는 실험예 25에서의 동물모델의 피부 조직으로부터 IL-13 mRNA 발현량을 비교 분석한 결과 그래프이다.
도 46은 실험예 26의 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델 계획을 나타낸 도면이다.
도 47은 실험예 26에서 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델에 AP-rPTP와 AP-EGFP를 6일 동안 처리하는 동안의 귀 두께 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 48은 실험예 26에서 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 49는 실험예 26에서 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 사이토카인(IL-7A, IL-17F, IL-6) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 50은 실험예 26에서 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 항균(antimicrobial) 펩티드(S100A8, S100A9) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 51은 제조예 7로부터 발현 및 정제한 AP-rPTP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 52는 PTPN2 단백질(TC-PTP)로부터 설계된 재조합 펩티드(rPTP)와 피부 투과성 펩티드(AP)의 융합체의 구조를 나타낸 도면이다.
본 발명은 (X1)n-X2-(시스테인)-(X3)m의 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드를 제공한다.
상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 3 내지 6 중의 어느 하나의 정수이며, 상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 4 내지 7 중의 어느 하나의 정수이다.
상기 피부 투과성 펩티드는 바람직하게는 9 내지 14개, 더욱 바람직하게는 9 내지 12개, 가장 바람직하게는 9 내지 10개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 하한치 미만에서는 세포 투과 효율이 급격히 감소하고, 상기 상한치를 초과할 경우에는 면역 반응을 일으킬 가능성이 높아진다.
상기 피부 투과성 펩티드에서 X1 및 X3은 각각 독립적으로 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다. 상기 (X1)n은 X1에 해당하는 n개의 양전하 아미노산이 결합된 것으로, n개의 아미노산은 동일 아미노산이 n개 존재하는 것 뿐만 아니라 각기 다른 양전하 아미노산이 n개 존재하는 것도 포함한다. 마찬가지로 상기 (X3)m은 각기 다른 양전하 아미노산이 m개 존재하는 것도 포함한다.
상기 피부 투과성 펩티드에서 X2는 무극성 또는 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 로이신(Leu, L), 이소로이신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V), 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 알라닌, 트립토판 또는 아르기닌이다.
상기 피부 투과성 펩티드는 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명은 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질이 결합된 융합체를 제공한다.
상기 생물학적 활성은 피부를 통해 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성이다. 상기 생물학적 활성 물질은 본 발명의 피부 투과성 펩티드를 통해 전달되므로 화물(cargo)라고도 하며, 단백질, 유전물질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물일 수 있다.
상기 피부 투과성 펩티드와 결합되는 단백질은 예를 들어, 사이토카인 및 그의 수용체뿐만 아니라, 사이토카인 또는 그의 수용체를 포함하는 키메릭 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 알파 및 베타, 그들의 수용체 및 그들의 유도체; 레닌; 성장 호르몬, 예컨대, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 메티온 인간 성장 호르몬, 데스-페닐알라닌 인간 성장 호르몬, 및 돼지 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자(GRF); 부갑상선 및 뇌하수체 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 인간 췌장 호르몬 방출 인자; 지단백질; 콜히친; 프롤락틴; 코르티코트로핀; 갑상선 자극 호르몬; 옥시토신; 바소프레신; 소마토스타틴; 리프레신; 판크레오지민; 류프롤라이드; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 모낭 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH); LHRH 작용제 및 길항제; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대, 단백질 C; 심방성 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 조직-유형 플라스미노겐 활성화인자(t-PA) 이외의 플라스미노겐 활성화인자, 예를 들어, 우로키나제; 봄베신; 트롬빈; 조혈제 성장인자; 엔케팔리나제; RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 인간 혈청 알부민 등과 같은 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬-연관 펩타이드; 융모막 성선자극호르몬; 성선자극호르몬 방출 호르몬; 소 소마토트로핀; 돼지 소마토트로핀; 미생물 단백질, 예컨대, 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 혹은 성장 인자용의 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류머티즘 인자; 향신경성 인자, 예컨대, 골 유래 향신경성 인장(BDNF), 뉴트로핀-3, 4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대, NGF-β; 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대, 산성 FGF 및 염기성 FGF; 표피 성장 인자(EGF); 전환 성장 인자(TGF), 예컨대, TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I(골 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대, CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대, 인터페론-알파(예컨대, 인터페론α2A), -베타, -감마, -람다 및 컨센서스 인터페론; 집락 자극 인자(CSF), 예컨대, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨(IL), 예컨대, IL-1 내지 IL-10; 초과산화물 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속 인자; 바이러스성 항원, 예를 들어, HIV-1 외피 당단백질의 일부, gp120, gp160 또는 그의 단편; 수송 단백질; 귀소 수용체(homing receptor); 어드레신(addressin); 생식 억제제, 예컨대, 프로스타글란딘; 생식 촉진제; 조절 단백질; 항체(그의 단편을 포함함) 및 키메릭 단백질, 예컨대, 면역접합체(immunoadhesin); 이들 화합물의 전구체, 유도체, 전구약물 및 유사체, 그리고 이들 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 그들의 전구체, 유도체, 전구약물 및 유사체를 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 단백질은 성장 호르몬, 예컨대, 인간 성장 호르몬(hGH), 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH), 소 성장 호르몬, 메티온 인간 성장 호르몬, 데스-페닐알라닌 인간 성장 호르몬 및 돼지 성장 호르몬; 인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬 및 프로인슐린; 또는 성장 인자, 예컨대, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자(TGF), 및 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II)이다.
또한 상기 생물학적 활성 물질은 PTPN2 단백질로부터 유래된 재조합 펩티드(rPTP)일 수 있고, 본 발명의 피부 투과성 펩티드와 결합된 rPTP 펩티드는 피부에 국소적으로 적용되어 피부염 증상을 개선 또는 치료한다.
상기 피부 투과성 펩티드와 결합되는 유전물질은 핵산뿐만 아니라 그의 전구체, 유도체, 전구약물 및 유사체, 예컨대, 치료적 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 및 그의 유사체; 치료적 올리고뉴클레오타이드; 및 치료적 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
상기 유전물질은 항암제 및 항바이러스제로서의 특정 용도를 발견할 수 있다. 상기 유전물질은 예를 들어, 리보자임, 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드, 앱타머(aptamer) 및 siRNA를 들 수 있다. 적절한 뉴클레오사이드 유사체의 예로는, 시타라빈(cytarabine)(아라CTP), 겜시타빈(dFdCTP) 및 플록수리딘(floxuridine)(FdUTP)을 들 수 있다. 또한 유전물질은 예를 들어, 간섭 RNA, 예컨대, shRNA, miRNA 또는 siRNA이다. 적절한 siRNA로는, 예를 들어, IL-7(인터류킨-7) siRNA, IL-10(인터류킨-10) siRNA, IL-22(인터류킨-22) siRNA, IL-23(인터류킨 23) siRNA, CD86 siRNA, KRT6a (케라틴 6A) siRNA, K6a N171K(케라틴 6a N171K) siRNA, TNFα(종양 괴사 인자 α) siRNA, TNFR1(종양 괴사 인자 수용체-1) siRNA, TACE(종양 괴사 인자(TNF)-α 전환 효소) siRNA, RRM2(리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛) siRNA, 및 VEGF(혈관 내피 성장 인자) siRNA를 들 수 있다. 이들 siRNA의 인간 유전자 표적의 mRNA 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한, siRNA 설계 동안 특정 mRNA 표적 서열을 선택하기 위한 각종 방법 및 기술은 당업계에 공지되어 있다.
상기 피부 투과성 펩티드와 결합되는 지방은 지방산을 포함한다. 지방산은 포화 또는 불포화 지방성 꼬리를 갖는 모노카복시산이다. 국제 화장품용 성분 사전 및 핸드북(the International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th Ed. (1997) volume 2, page 1567)에서 정의된 바와 같이, 지방산은 약 7 이상의 탄소 원자를 가진다. 예를 들어, 팔미트산은 가장 풍부한 천연 지방산으로서, 팜 오일 및 다른 지방에서 발견되는 포화 지방산이다. 팔미트산은 또한 피지선(sebaceous gland)에 의해 생성되는 피부의 주요 지방산 중에 하나이며, 보습제로서 피부 관리 및 화장품 제제에 사용된다. 그것은 오일 균형을 안정화시킴으로써 피부를 정상적이고, 건강한 상태로 유지할 수 있게 하며, 피부를 부드럽게 하고 항 케라틴화제처럼 반응한다. 팔미트산의 에스테르는 피부 및 모발에 비단결 같은 부드러움(silkiness)을 공급하는데 사용된다. 상기 팔미트산은 펜타펩티드를 피부 내로 투과시킬 수 있는 담체로서 작용하며, 윤활제로서 광범위하게 사용되고, 유화제, 계면활성제 및 제형 조직화제(formula texturizer)로 사용된다.
본 발명에서 적절한 지방산은 라우린산, 스테아린산, 팔미틱산, 운데실렌산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀산, 리놀레산, 아라키돈산 및 에루신산을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 추가적인 적절한 지방산은 국제 화장품용 성분 사전 및 핸드북(the International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th Ed.(1997) volume 2, page 1567)에 개시되어 있다.
상기 피부 투과성 펩티드와 결합되는 화학화합물은 비타민 및 그의 유도체들, 레티노이드를 포함할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 의하면, 아스코르브산(비타민 C), 알파-토코페롤(비타민 E) 및 레티노이드(비타민 A)는 피부에 유익한 특성을 제공할 수 있다. 아스코르브산은 결합 조직의 합성을 자극하고, 특히 콜라겐 생성의 자극 및 조절에 관여한다. 그것은 지방 산화 및 자외선에 지속적으로 노출됨으로 인한 다른 유형의 세포 손상을 예방하거나 최소화하는 것을 돕는다 (Varani, J. et al., J. Invest. Dermatol. 114: 480-486 (2000), Offord, E. A. et al, Free, Radical Biol. & Med. 32:1293-1303, (2002)). 아스코르브산은 세포막의 멜라닌 형성 및 히스타민 분비를 억제하는 것을 도우며, 피부 내의 비타민 E 결핍을 보상하고, 피부의 탈색화 방지에 관여하고, 항-자유 라디칼(anti-free radical) 활성을 가진다. 알파-토코페롤은 세포막의 인지질 및 자유 라디칼의 해로운 효과를 방지하는 항산화제이다 (J.B Chazan 등. Free Radicals and Vitamin E. Cah. Nutr. Diet. 1987 22(l):66-76). 레티노이드는 피부 내 염증의 중개자를 차단하고, 프로콜라겐의 생성을 증가시킴으로써 타입 I 및 타입 III 콜라겐이 더 많이 생산되도록 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "펩티드 융합체 (fusion peptide)"는 하나 이상의 생리활성을 가진 저분자량의 펩티드인 rPTP 펩티드를 피부 투과성 펩티드 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 피부 투과성 펩티드 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킨 새로운 분자 구성을 가진 펩티드 융합체를 의미한다.
상기 피부 투과성 펩티드는 (X1)n-X2-(시스테인)-(X3)m의 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드일 수 있다.
상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 3 내지 6 중의 어느 하나의 정수이며, 상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 4 내지 7 중의 어느 하나의 정수이다.
상기 피부 투과성 펩티드는 바람직하게는 9 내지 14개, 더욱 바람직하게는 9 내지 12개, 가장 바람직하게는 9 내지 10개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 하한치 미만에서는 세포 투과 효율이 급격히 감소하고, 상기 상한치를 초과할 경우에는 면역 반응을 일으킬 가능성이 높아진다.
상기 피부 투과성 펩티드에서 X1 및 X3은 각각 독립적으로 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다. 상기 (X1)n은 X1에 해당하는 n개의 양전하 아미노산이 결합된 것으로, n개의 아미노산은 동일 아미노산이 n개 존재하는 것뿐만 아니라 각기 다른 양전하 아미노산이 n개 존재하는 것도 포함한다. 마찬가지로 상기 (X3)m은 각기 다른 양전하 아미노산이 m개 존재하는 것도 포함한다.
상기 피부 투과성 펩티드에서 X2는 무극성 또는 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 로이신(Leu, L), 이소로이신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V), 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 알라닌, 트립토판 또는 아르기닌이다.
상기 피부 투과성 펩티드는 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 rPTP 펩티드는 생물학적 활성을 갖고 있는 펩티드인 PTPN2 단백질의 단편으로 이루어진 재조합 펩티드로, 피부를 통해 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 갖는 펩티드이다.
PTPN2 단백질은 T 세포 단백질 티로신 포스파타아제(phosphatase)로, TC-PTP라고도 불린다. 이는 JAK-STAT pathway와 관련된 사이토카인 수용체 신호(JAK1, JAK3, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6)를 조절할 수 있는 효소로, Src 패밀리 티로신 키나아제(Lck, Fyn)과 같은 T 세포 수용체 신호 분자도 저해한다. PTNT2 단백질을 코딩하는 유전자는 도 52에 도시한 바와 같고, 이들 중에서도 촉매 도메인;과 AP 시퀀스와 결합하는 기질 결합 도메인;을 포함하는 각각의 결절 단편을 결합하여 rPTP 펩티드를 새롭게 설계하였다(도 52의 하단 펩티드). 이렇게 설계된 rPTP 펩티드는 피부에 국소적으로 적용되어 피부염 증상을 개선 또는 치료한다.
상술한 아미노산 서열이 아닌 PTPN2 단백질로부터 유래된 다른 아형은 피부 투과성 펩티드와 효율적으로 결합되기 어려워, 피부 투과 효율이 저하되거나 피부 염증성 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 저하되는 문제가 발생할 수 있다.
게다가 본 발명과 같이 설계된 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열의 rPTP 펩티드는 피부 염증성 질환(건선, 알러지, 만성 피부염 등)에 대해 동시에 우수한 치료 또는 예방 효과를 갖는다는 장점이 있다.
상기 피부 투과성 펩티드와 rPTP 펩티드 결합은 펩티드 결합 또는 화학적 결합인 것을 특징으로 한다. 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합(sulfde-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 융합체는 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열일 수 있는데, 이는 고유의 생리활성 단백질보다 피부 염증성 질환에 대해 현저히 우수한 예방 및 치료 효과를 갖는다.
아울러 피부 투과성 펩티드를 다른 종래의 펩티드를 사용할 경우, 피부 염증성 질환에 대한 효과가 현저히 낮게 나타나는데, 이를 통해 피부 투과 효율(특히 경피 세포 침투 효율) 및 피부 염증성 질환에 대한 치료 또는 예방 효과의 상승이 피부 투과성 펩티드 또는 rPTP 펩티드 고유 성질에 의한 것이 아님을 알 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 펩티드 융합체는 피부 투과성 효율이 우수할 뿐만 아니라, 경피 투여만으로도 우수한 치료 및 예방 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 융합체는 피부 염증성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 갖는 약물로써 유용하게 사용될 수 있다.
상기 융합체는 활성화된 T 세포들에서 사이토카인 생산을 효과적으로 조절하였으며, 피부 염증성 질환(건선, 알러지 피부염, 만성 피부염)의 예방적 및 치료적 모델들 모두에서 저해 효과를 나타내었다.
상기 피부 투과성 펩티드와 rPTP 펩티드는 공유 결합에 의해 결합되며, 에스테르, 아미드, 에테르 및 카르바미드 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 피부 투과성 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성 물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체는 피부를 통하여 생체 내 전달될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합체를 코팅하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.
상기 재조합 발현벡터는 상기 피부 투과성 펩티드와 상기 rPTP 펩티드의 서열(서열번호 19) 및 상기 융합체의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 재조합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 또한 상기 재조합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 피부 투과성 펩티드와 결합되는 생물학적 활성 물질은 항산화제 효능, 혈관 신생 증대, 여드름 증상의 감소, 선분비의 감소, 노화 효과의 감소, 주름 감소, 멜라닌 생성 감소, 피부 염증 완화 또는 피부 건조함 개선과 같은 활성을 갖는 물질일 수 있다.
본 발명의 피부외용제용 약학 조성물에서 피부 투과성 펩티드와 결합되는 생물학적 활성 물질은 말초 신경, 아드레날린 수용체, 콜린수용체, 골격근, 심혈관계, 평활근, 혈액 순환계, 시냅스 부위, 신경효과기 접합 부위, 내분비 및 호르몬계, 면역계, 생식기계통, 골격계, 오타코이드 계통(autacoid system), 소화 및 배설 계통, 히스타민 계통 및 중추 신경계에 작용하는 화학화합물일 수 있다.
상기 화학화합물은 국소 마취제, 항염증제, 항감염제, 여트름 치료제, 항바이러스, 항진균제, 국소 코르티코스테로이드 등과 같은 건선용 제제를 포함할 수 있다.
예를 들어 상기 화학화합물은 이하의 리스트: 16-17A-에폭시프로게스테론(CAS 등록 번호:1097-51-4), P-메톡시신남산/4-메톡시신남산(CAS 등록 번호: 830-09-1), 옥틸 메톡시신나메이트(CAS 등록 번호:5466-77-3), 옥틸 메톡시신나메이트(CAS 등록 번호: 5466-77-3), 메틸 p-메톡시 신나메이트(CAS 등록 번호:832-01-9), 4-에스트렌-17β-OL-3-온(CAS 등록 번호: 62-90-8), 에틸-p-아니소일 아세테이트(CAS 등록 번호:2881-83-6), 다이하이드로유라실(CAS 등록 번호: 1904-98-9), 로피나비어(Lopinavir)(CAS 등록 번호: 192725-17-0), 리탄세린(RITANSERIN)(CAS 등록 번호: 87051-43-2), 닐로티닙(Nilotinib)(CAS 등록 번호: 641571-10-0); 로쿠로늄 브로마이드(Rocuronium bromide)(CAS 등록 번호: 119302-91-9), p-나이트로벤질-6-(1-하이드록시에틸)-1-아자바이사이클로(3.2.0)헵탄-3,7-다이온-2-카복실레이트(CAS 등록 번호: 74288-40-7), 아바멕틴(Abamectin)(CAS 등록 번호: 71751-41-2), 팔리페리돈(Paliperidone)(CAS 등록 번호: 144598-75-4), 제미피옥사신(Gemifioxacin)(CAS 등록 번호: 175463-14-6), 발루비신(Valrubicin)(CAS 등록 번호: 56124-62-0), 미조리빈(Mizoribine)(CAS 등록 번호: 50924-49-7), 솔리페나신 숙시네이트(Solifenacin succinate)(CAS 등록 번호:242478-38-2), 라파티닙(Lapatinib)(CAS 등록 번호: 231277-92-2), 디드로게스테론(Dydrogesterone)(CAS 등록번호: 152-62-5), 2,2-다이클로로-N-[(1R,2S)-3-플루오로-1-하이드록시-1-(4-메틸설포닐페닐)프로판-2-일]아세트아마이드(CAS 등록 번호: 73231-34-2), 틸미코신(Tilmicosin)(CAS 등록 번호: 108050-54-0), 에파비렌즈(Efavirenz)(CAS 등록 번호: 154598-52-4), 피라루비신(Pirarubicin)(CAS 등록 번호: 72496-41-4), 나테글리나이드(Nateglinide)(CAS 등록 번호: 105816-04-4), 에피루비신(Epirubicin)(CAS 등록 번호: 56420-45-2), 엔테카비어(Entecavir)(CAS 등록 번호: 142217-69-4), 에토리코십(Etoricoxib)(CAS 등록 번호: 202409-33-4), 실니디핀(Cilnidipine)(CAS 등록 번호: 132203-70-4), 독소루비신 하이드로클로라이드(CAS 등록 번호: 25316-40-9), 에스키탈로프람(Escitalopram)(CAS 등록 번호: 128196-01-0), 시타글립틴 포스페이트 1수화물(Sitagliptin phosphate monohydrate)(CAS 등록 번호: 654671-77-9), 아시트레틴(Acitretin)(CAS 등록 번호: 55079-83-9), 리자트립탄 벤조에이트(Rizatriptan benzoate)(CAS 등록 번호: 145202-66-0), 도리페넴(Doripenem)(CAS 등록 번호: 148016-81-3), 아트라쿠리움 베실레이트(Atracurium besylate)(CAS 등록 번호: 64228-81-5), 닐루타마이드(Nilutamide)(CAS 등록 번호: 63612-50-0), 3,4-다이하이드록시페닐에탄올(CAS 등록 번호: 10597-60-1), 케탄세린 타트레이트(KETANSERIN TARTRATE)(CAS 등록 번호: 83846-83-7), 오자그렐(Ozagrel)(CAS 등록 번호:82571-53-7), 에프로사탄 메시레이트(Eprosartan mesylate)(CAS 등록 번호: 144143-96-4), 라니티딘 하이드로 클로라이드(Ranitidine hydrochloride)(CAS 등록 번호: 66357-35-5), 6,7-다이하이드로-6-머캅토-5H-피라졸로[1,2-a][,2,4]트라이아졸리움 클로라이드(CAS 등록 번호: 153851-71-9), 설파피리딘(Sulfapyridine)(CAS 등록 번호: 144-83-2), 테이코플라닌(Teicoplanin)(CAS 등록 번호: 61036-62-2), 타크롤리무스(Tacrolimus)(CAS 등록 번호: 104987-11-3), 루미라코십(LUMIRACOXIB)(CAS 등록 번호: 220991-20-8), 알릴 알코올(CAS 등록 번호:107-18-6), 보호된 메로페넴(Protected meropenem)(CAS 등록 번호: 96036-02-1), 넬라라빈(Nelarabine)(CAS 등록 번호: 121032-29-9), 피메크롤리무스(Pimecrolimus)(CAS 등록 번호: 137071-32-0), 4-[-메톡시-7-(3-피페리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린-4-일]-N-(4-프로판-2-일옥시페닐)피페라진-1-카복스아마이드(CAS 등록 번호: 387867-13-2), 리토나비어(Ritonavir)(CAS 등록 번호: 155213-67-5), 아다팔렌(Adapalene)(CAS 등록 번호: 106685-40-9), 아프레피탄트(Aprepitant)(CAS 등록 번호: 170729-80-3), 에플레레논(Eplerenone)(CAS 등록 번호: 107724-20-9), 라사길린 메실레이트(Rasagiline mesylate)(CAS 등록 번호: 161735-79-1), 밀테포신(Miltefosine)(CAS 등록 번호: 58066-85-6), 랄테그라비어 칼륨(Raltegravir potassium)(CAS 등록 번호: 871038-72-1), 나사티닙1수화물(Dasatinib monohydrate)(CAS 등록 번호: 863127-77-9), 옥소메마진(OXOMEMAZINE)(CAS 등록 번호:3689-50-7), 프라미펙솔(Pramipexole)(CAS 등록 번호: 104632-26-0), 파레코십 나트륨(PARECOXIB SODIUM)(CAS 등록 번호: 198470-85-8), 티게사이클린(Tigecycline)(CAS 등록 번호: 220620-09-7), 톨트라주릴(Toltrazuril)(CAS 등록 번호: 69004-03-1), 빈플루닌(Vinflunine)(CAS 등록 번호: 162652-95-1), 드로스피레논(Drospirenone)(CAS 등록 번호: 67392-87-4), 답토마이신(Daptomycin)(CAS 등록 번호: 103060-53-3), 몬텔루카스트 나트륨(Montelukast sodium)(CAS 등록 번호: 151767-02-1), 브린졸아마이드(Brinzolamide)(CAS 등록 번호: 138890-62-7), 마라비록(Maraviroc)(CAS 등록 번호: 376348-65-1), 독세칼시페롤(Doxercalciferol)(CAS 등록 번호: 54573-75-0), 옥솔린산(Oxolinic acid)(CAS 등록 번호: 14698-29-4), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Daunorubicin hydrochloride)(CAS 등록 번호: 23541-50-6), 니자티딘(Nizatidine)(CAS 등록 번호: 76963-41-2), 이다루비신(Idarubicin)(CAS 등록 번호: 58957-92-9), 플루옥세틴 하이드로클로라이드(FLUOXETINE HYDROCHLORIDE)(CAS 등록 번호: 59333-67-4), 아스코마이신(Ascomycin)(CAS 등록 번호: 11011-38-4), 베타-메틸 비닐 포스페이트(MAP)(CAS 등록 번호: 90776-59-3), 아모롤핀(Amorolfine)(CAS 등록 번호: 67467-83-8), 펙소페나딘(Fexofenadine) HCl(CAS 등록 번호: 83799-24-0), 케토코나졸(Ketoconazole)(CAS 등록 번호: 65277-42-1), 9,10-다이플루오로-2,3-다이하이드로-3-메-7-옥소-7H-피리도-1(CAS 등록 번호: 82419-35-0), 케토코나졸(Ketoconazole)(CAS 등록 번호: 65277-42-1), 터비나핀(Terbinafine) HCl(CAS 등록 번호: 78628-80-5), 아모롤핀(Amorolfine)(CAS 등록 번호: 78613-35-1), 메톡살렌(Methoxsalen)(CAS 등록 번호: 298-81-7), 올로파타딘(Olopatadine) HCl(CAS 등록 번호: 113806-05-6), 아연 피리티온(CAS 등록 번호: 13463-41-7), 올로파타딘 HCl(CAS 등록 번호: 140462-76-6), 사이클로스포린(CAS 등록 번호: 59865-13-3), 및 보툴리눔 독소 및 그의 유사체 및 백신 성분로부터 선택될 수 있다.
상기 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질은 공유 결합에 의해 결합되며, 에스테르, 아미드, 에테르 및 카르바미드 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 피부 투과성 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성 물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체는 피부를 통하여 생체 내 전달될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 투과성 펩티드와 결합되는 rPTP 펩티드로 이루어진 융합체일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 또는 피부외용제용 약학 조성물에서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 융합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다. 상기 조성물은 상기 융합체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 융합체는 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 하는 것으로, 이를 포함하는 상기 화장료 조성물 도는 피부외용제용 약학 조성물은 경피성인 것이 가장 바람직하다. 예를 틀어 연고 또는 젤을 혀용하는 다른 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 특별한 성질로 인해서, 피부 질환에 대한 경구 투여보다 질환 부위에 직접적인 투여가 가능하고, 부작용이 더 낮게 일어나므로, 특히 피부 질환의 치료에서 경피 투여를 통해 더 유리하게 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.
상기 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 융합체 이외에 추가적으로 약제학적이나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 용액, 에멀션(마이크로에멀션 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 본 조성물이 적용될 수 있는 피부 및 기타 조직에 적용하기 위해 이용되는 기타 전형적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 추가적인 항미생물제(antimicrobial), 보습제 및 수화제(hydration agent), 투과제(penetration agent), 보존제, 유화제, 천연 오일 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 세정제(detergent), 겔화제(gelling agent), 연화제(emollient), 항산화제, 향료, 충진제, 증점제(thickener), 왁스, 냄새 흡수제, 염료(dyestuff), 착색제, 분말, 점도-조절제(viscosity-controlling agent) 및 물을 포함할 수 있고, 선택적으로, 마취제, 항-가려움 활성제(anti-itch active), 식물 추출물(botanical extract), 컨디셔닝제(conditioning agent), 흑화제 또는 미백제(darkening or lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 운모, 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 일광 차단제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.01 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 피부 염증성 질환은 염증성 피부염, 건선증, 상처, 아토피성 질환인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 상기 피부외용제용 약학 조성물의 유효량을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
피부외용제용 약학 조성물은 피부를 통한 생체 또는 세포 내 주입이 가능하므로, 인간 또는 인간을 제외한 동물의 피부 특히 질환 부위에 이를 도포함으로써 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명은 상기 피부 투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기의 전달 복합체를 피부를 통해 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적 활성 물질의 경피 전달 방법을 제공한다.
상기 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질은 PTPN2 단백질로부터 유래된 rPTP 펩티드인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 상기 피부 투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 전달 복합체를 피부세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전자 치료 방법을 제공한다.
상기 피부 투과성 펩티드와 유전물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 유전물질의 전달 복합체를 피부를 통한 생체 또는 세포 내 주입은 앞서 기재된 것과 동일한 경로로 투여 가능하다.
상기 생물학적 활성 물질은 PTPN2 단백질로부터 유래된 rPTP 펩티드인 것이 가장 바람직하다.
상기 유전물질의 전달 복합체는 비면역원성, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노 바이러스와 같은 벡터 유기체에 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서 어떤 실용적인 크기의 재조합 유전자 발현 구조물에도 사용될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<피부 투과성 펩티드(AP) 및 PTPN2 유래의 펩티드의 제조>
제조예 1: 펩티드 합성 및 분리정제
서열번호 1 내지 12, 15 및 17의 아미노산 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드(AP)와 PTPN2 단백질로부터 설계된 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 재조합 펩티드(rPTP)를 합성하였다.
상기 아미노산 서열에 합당한 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고데옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide)를 각각 합성한 후 95℃에서 3분 방치하여 형성된 2차 또는 3차 구조를 제거하고(denaturation) 50℃ 그리고 72℃로 온도를 바꾸어 DNA 2중가닥을 만들었다. pRSET-b 벡터에 끼워 넣기 위하여 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고데옥시뉴클레오타이드 이외의 제한효소 특이 서열을 5'과 3'에 넣었다. 이후 대장균(E. coli)에 넣어(형질변화(transformaiton)) 대량 증폭하였다. 이후 서열의 온전성을 확인하고 대장균에 넣어 발현 유도하였다.
서열번호 1 내지 12, 15 및 17 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 'AP'라고도 함)를 PTPN2 단백질로부터 설계된 재조합 펩티드(이하 'rPTP'라고도 한다)(서열번호 20) 또는 녹색 형광 단백질(EGFP)과 융합하기 위하여 AP의 N-말단에 EGFP가 연결될 수 있도록 하는 프라이머를 제작하여 AP-rPTP 또는 AP-EGFP 유전자를 PCR 반응을 통해 생산하고 이를 벡터 (pRSET-b)에 삽입하여 대장균 균주에서 단백질을 발현, 정제한 후 세포 내에 전달효율을 확인하는 실험을 진행하였다.
<AP-EGFP 단백질 및 재조합 발현 벡터의 제조>
제조예 2: AP가 N-말단에 연결된 EGFP을 코딩하는 이중사슬 DNA의 제조
녹색 형광 단백질(이하, 'EGFP'라고도 함)의 N-말단의 일부를 코딩하는 DNA 염기서열에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하는 DNA 염기서열을 추가하여 포워드 프라이머를 제작하였다.
서열번호 13의 포워드 프라이머는 5′ 말단에 DNA 클로닝을 위한 NheI 제한효소 인식부위를 포함하고 있으며 AP와 EGFP의 염기서열 사이에는 BamHI 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 한편 AP-EGFP를 PCR반응으로 증폭시키기 위해 서열번호 14의 리버스 프라이머를 제작하였다. 상기 리버스 프라이머는 EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하며 프라이머의 5′ 가장 말단 부분에는 DNA 클로닝을 위하여 HindIII 제한효소 인식 부위를 삽입하였다.
PCR 반응은 EGFP유전자가 포함된 pRSETb 벡터를 주형으로 하여 상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머들을 이용하였다. 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성반응 20초, 50℃에서 프라이머와 주형이 결합하는 중합반응 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기 (Biorad)를 이용하여 수행하였다.
상기 반응으로부터 증폭된 AP-EGFP의 증폭산물은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 789 bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인하였다(도 1).
제조예 3: AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터의 제조
AP-EGFP 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 pRSETb에 상기 제조예 2에서 제조된 789 bp의 DNA 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다.
제조예 2에서 증폭된 DNA 절편을 NheI과 HindIII (NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단 (sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSETb를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSETb 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.
분리된 AP-EGFP 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응 시켰다. AP-EGFP 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 각각의 농도가 확인되었다(도 2).
이렇게 연결시킨 AP-EGFP가 삽입된 원형의 pRSETb 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 암피실린 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 암피실린 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다(도 3).
상기 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터임을 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 789 bp에 해당하는 AP-EGFP DNA 절편이 2.9 kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였다(도 4). 그리고 이것은 DNA 염기서열 분석(바이오닉스)을 통하여 최종적으로 확인할 수 있었다. 이렇게 제작된 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터의 구조는 도 5에 나타내었다.
제조예 4: 대장균에서 AP-EGFP 단백질의 발현 및 정제
상기 제조예 3의 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터를 대장균 BL21 (DE3)star pLysS 균주에 형질전환 시킨 후 항생제인 클로람페니콜 34 μg/㎖와 암피실린 50 μg/㎖가 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50㎖에 접종하여 37℃에서 10시간 배양하여 이를 새로운 액체 LB 배지 500㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 대장균의 양이 분광광도계로 배양액을 측정하였을 때, O.D 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 온도는 20℃, 회전 속도는 150rpm로 맞춰진 진탕 배양기에서 14시간을 더 배양하였다. 이렇게 대장균주가 발현한 단백질은 AP-EGFP의 앞쪽에 pRSET-b 벡터에 코딩되어 있는 6X-His tag을 포함하고 있다. 이를 이용해 하기의 실험 방법으로 단백질을 정제하였다.
배양액을 원심분리로 모은 후 native condition의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재 부유시켰다. 그리고 초음파 세포 파쇄기인 VCX-130(Sonics & Materials)을 사용해 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤 Ni-NTA agarose(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합하도록 하였다. 이후에는 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA agarose와 결합된 단백질 산물만을 column에 결합할 수 있도록 하였다. 20mM의 imidazole 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 imidazole 용액을 이용해 최종적으로 용출해냈다. 이렇게 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 AP-EGFP를 최종적으로 순수 분리 정제하였다(도 6).
제조예 7: 대장균에서 AP-rPTP 단백질의 발현 및 정제
상기 제조예 6의 AP-rPTP가 삽입된 PET28a 벡터를 대장균 Rosetta 균주에 형질전환 시킨 후 항생제인 클로람페니콜 (34 ㎍/ml)과 카나마이신 (50 ㎍/ml)이 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50에 접종하여 37에서 10시간 배양하여 이를 새로운 액체 LB 배지 500에 접종하였다. 동일한 온도에서 대장균의 양이 분광광도계로 배양액을 측정하였을 때, O.D 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside)의 농도가 0.2mM이 되도록 첨가하여 온도는 20 ℃, 회전 속도는 150rpm로 맞춰진 진탕 배양기에서 14시간을 더 배양하였다. 이렇게 대장균이 발현한 단백질은 AP-rPTP의 앞쪽에 PET28a 벡터에 코딩되어 있는 6X-His tag을 포함하고 있다. 이를 이용해 하기의 실험 방법으로 단백질을 정제하였다.
배양액을 원심분리로 모은 후 native condition의 용해용액 (0.3M NaCl, 10mM imidazole, 50mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 재 부유 시켰다. 그리고 초음파 세포 파쇄기인 VCX-130 (Sonics & Materials)을 사용해 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45 ㎛필터 (Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤 Ni-NTA agarose (Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합하도록 하였다. 이후에는 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA agarose와 결합된 단백질 산물만을 column에 결합할 수 있도록 하였다. 20mM의 imidazole 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 imidazole 용액을 이용해 최종적으로 용출 (elution)해냈다. 이렇게 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼 (Amersham Bioscience)에 적용하여 AP-EGFP를 최종적으로 순수 분리 정제하였다(도 51).
<AP-rPTP 단백질 및 재조합 발현벡터의 제조>
제조예 5: AP가 N-말단에 연결된 rPTP을 코딩하는 이중사슬 DNA의 제조
rPTP로부터 유래된 서열번호 20의 N-말단의 일부를 코딩하는 DNA 염기서열에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 피부 투과성 펩티드를 코딩하는 DNA 염기서열을 추가하여 포워드 프라이머를 제작하였다.
서열번호 21의 포워드 프라이머는 5′ 말단에 DNA 클로닝을 위한 NheI 제한효소 인식부위를 포함하고 있으며 AP와 rPTP의 염기서열 사이에는 BamHI, EcoRI 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 한편 AP-rPTP를 PCR반응으로 증폭시키기 위해 서열번호 22의 리버스 프라이머를 제작하였다. 상기 리버스 프라이머는 rPTP의 C-말단 일부를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하며 프라이머의 5′ 가장 말단 부분에는 DNA 클로닝을 위하여 XhoI 제한효소 인식 부위를 삽입하였다.
PCR 반응은 rPTP 유전자가 포함된 PET28a 벡터를 주형으로 하여 상기 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머들을 이용하였다. 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95 ℃에서 주형의 열 변성반응 20초, 50℃에서 프라이머와 주형이 결합하는 중합반응 20초, 72 ℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.
상기 반응으로부터 증폭된 AP-rPTP의 증폭산물은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 945 bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인하였다.
제조예 6: AP-rPTP가 삽입된 PET28a 벡터의 제조
AP-rPTP 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 PET28a에 상기 제조예 5에서 제조된 945 bp의 DNA 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다.
제조예 5에서 증폭된 DNA 절편을 NheI과 XhoI (NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단 (sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 PET28a를 효소 반응시켜 NheI, XhoI 삽입 부위를 갖는 선형의 PET28a 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.
분리된 AP-rPTP 이중사슬 DNA 절편과 PET28a 벡터는 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응 시켰다. AP-rPTP 이중사슬 DNA 절편과 PET28a 벡터는 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 각각의 농도가 확인되었다.
이렇게 연결시킨 AP-rPTP가 삽입된 원형의 PET28a 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 카나마이신 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 카나마이신 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다(도 3).
상기 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 AP-rPTP가 삽입된 PET28a 벡터임을 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 XhoI 제한효소를 이용해 효소 반응 시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 945 bp에 해당하는 AP-rPTP DNA 절편이 2.9 kbp에 해당하는 PET28a 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 그리고 이것은 DNA 염기서열 분석(바이오닉스)을 통하여 최종적으로 확인할 수 있었다.
실험예 1: 암화 된 인간의 T 세포인 Jurkat 세포주 안으로 AP-EGFP 단백질의 전달 효율 비교
상기 제조예 4의 과정에서 정제된 AP-EGFP 단백질을 암화 된 인간 T 세포 세포주인 Jurkat 세포주 내로 전달하고 이의 효율을 확인하였다. Jurkat 세포를 RPMI 배지(HyClone)를 사용하여 배양하고, 350㎕의 RPMI 배지를 분주해 놓은 24-well 플레이트(SPL lifescience)의 각 well에 세포수가 1×106 만큼 들어있는 100㎕의 RPMI 배지를 첨가하는 방식으로 세포를 분주했다. 그리고 50㎕안에 D-PBS(Welgene)와 적정 농도가 되도록 맞춘 단백질을 섞어 총 부피가 500㎕가 되도록 한 후에 명시한 바와 같이 다양한 조건에 맞게 단백질을 처리하였다. 이하 실험예에서 단백질의 처리 조건을 따로 명시하지 않은 경우, 배양액에 각각의 단백질을 5μM씩 처리하고 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다.
첫 번째로는 AP-EGFP 단백질의 농도가 각각 1μM과 5μM이 되도록 처리한 후 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 AP가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질과 종래의 세포 투과성 펩티드 중 하나인 TAT-EGFP 단백질을 이용하였다. 1시간이 지난 후에는 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거해 주었다. 또한 세포 표면에 묻어있거나, 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다. 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 D-PBS 500㎕로 최종적으로 재 부유 시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScantoII)를 이용해 세포 내 형광을 측정하는 방식으로 단백질의 세포 내 전달 효율을 측정하였다. 그 결과, 단백질의 처리 농도에 의존적으로 AP-EGFP가 Jurkat 세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다.
이어서 AP-EGFP 단백질의 농도는 5μM로 유지하고 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 30분 ~ 4시간 동안 배양하였다. 해당 처리 시간이 지난 후에는 상기에 명시한 바와 같은 방법으로 세포를 세척한 후 유세포분석기로 세포 내 형광을 측정하였다. 그 결과 단백질의 처리 시간에 의존적으로 AP-EGFP가 Jurkat 세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다(도 7).
실험예 2: Jurkat 세포주 안으로 종래 세포 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
또한 종래의 세포 투과성 펩티드들과 그 효율을 비교하기 위하여 실험예 1과 같은 농도, 같은 시간 동안 위와 같은 방법으로 Jurkat 세포주 안으로 각각의 단백질을 전달하는 실험을 진행하였다.
음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드에 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein, 형광단백질)를 각각 결합한 TAT-EGFP, R9-EGFP, Hph-1 EGFP를 사용하여 비교해 보았다. 그 결과, 본 발명의 AP 서열이 TAT 보다 높은 효율로 단백질을 Jurkat 세포 안으로 전달하고 있음을 확인하였다(도 8).
실험예 3: Jurkat 세포주 안으로 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
또한 종래의 피부 투과성 펩티드들과 그 효율을 비교하기 위하여 실험예 1과 같은 농도, 같은 시간 동안 위와 같은 방법으로 Jurkat 세포주 안으로 각각의 단백질을 전달하는 실험을 진행하였다.
음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 dTomato 형광단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 피부 투과성 펩티드에 dTomato 형광단백질을 결합시킨 TDP1-dTomato, TDP2-dTomato를 사용하여 비교해 보았다.
상기 TDP1-dTomato는, 한국공개특허 제10-2013-0135207호에 개시된 피부 투과성 펩티드(아미노산서열 'NGSLNTHLAPIL', 이하 '서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 펩티드' 또는 'TDP1'이라 함)이고, TDP1의 C-말단에 제한효소가 인식할 수 있는 링커(아미노산 서열 'GS')를 결합시키고, 상기 링커의 C-말단에 dTomato 형광단백질이 결합시킨 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 융합체이다.
상기 TDP2-dTomato는, 한국공개특허 제10-2013-0070607호에 개시된 피부 투과성 펩티드(아미노산 서열 'MRAAAPAVAA', 이하 '서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 펩티드' 또는 'TDP2'라 함)이고, TDP2의 C-말단에 제한효소가 인식할 수 있는 링커(아미노산 서열 'GS')를 결합시키고, 상기 링커의 C-말단에 dTomato 형광단백질이 결합시킨 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 융합체이다.
AP에 EGFP를 결합시킨 융합체가 실험예 2에서 Jurkat 세포로 효율적으로 전달되는 것과 마찬가지로 AP에 dTomato를 결합시킨 융합체 역시 음성 대조군(dTomato 단독)에 비해 현저히 전달 효율을 향상시켰다. 또한 종래 피부 투과성 펩티드로 알려진 TDP1이나 TDP2는 분자량이 큰 형광단백질인 dTomato를 결합시켰을 때 AP-dTomato에 비해서 현저히 낮은 전달 효율을 가짐을 확인할 수 있었다(도 9).
실험예 4: 피부 세포 안으로 종래 세포 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
HaCaT 세포주는 인간 표피 세포주로서 경피 전달 실험 및 피부질환 논문에서 생체외 전달 효율 및 기작 확인을 위하여 사용되어 온 세포주이다[J Invest Dermatol. 2011 Jul;131(7):1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15;75(6):1348-57.]. 또한 NIH3T3 세포주는 쥐 진피 세포주로서 HaCaT과 마찬가지로 경피전달 및 피부질환의 메커니즘 확인을 위하여 생체외 실험에서 자주 사용되는 세포주이다[J Pharm Sci. 2013 Nov;102(11):4109-20; J Immunol. 2003 Jan 1;170(1):548-55.].
상기 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주를 이용하여 본 발명의 AP가 피부 세포에 EGFP 형광단백질을 전단할 수 있는지 종래 세포 투과성 펩티드와 비교하여 도 10 및 도 11에 나타내었다.
실험예 2와 동일하게 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드에 EGFP 를 각각 결합한 TAT-EGFP, R9-EGFP를 사용하여 비교해 보았다. 또한 추가로 AP 서열의 시스테인을 알라닌으로 치환한 AP C→A EGFP를 실험군으로 추가하였다.
본 발명의 AP가 면역세포(Jurkat 세포) 외에 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주에서도 분자량이 큰 단백질을 TAT 또는 R9에 비해서 효율적으로 전달하고 있음을 확인하였고, 또한 이러한 AP의 전달 효율은 아미노산 서열 중에 포함된 시스테인을 알라닌으로 치환함으로써 현저히 감소되었다.
실험예 5: 피부 세포 안으로 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
실험예 3의 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주를 이용하여 본 발명의 AP가 피부 세포에 dTomato 형광단백질을 전단할 수 있는지 종래 세포 투과성 펩티드와 비교하여 도 12 및 도 13에 나타내었다.
실험예 3과 동일하게 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 dTomato 형광단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 피부 투과성 펩티드에 dTomato 형광단백질을 결합시킨 TDP1-dTomato, TDP2-dTomato를 사용하여 비교해 보았다.
본 발명의 AP가 면역세포(Jurkat 세포) 외에 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주에서도 분자량이 큰 단백질을 높은 효율로 전달하는 반면, 종래 TDP1과 TDP2 피부 투과성 펩티드는 분자량이 큰 단백질이 결합된 경우 투과 효율 증대 효과가 미미하였다.
실험예 6: AP 구성 아미노산의 치환, 제거, 추가에 따른 단백질의 전달 효율 비교
AP를 구성하는 각 아미노산의 역할에 대해 알아보기 위하여 다양한 변이체 들을 만들어 비교 분석해보았다.
(1) 말단 아미노산 제거에 따른 단백질 전달 효율 비교
먼저 AP의 양 끝을 구성하고 있는 아르기닌을 N-말단에서 하나(AP_D1, 서열번호 2), C-말단에서 하나(AP_D2, 서열번호 3), N, C-말단에서 각각 하나씩 제외(AP_D3, 서열번호 4)한 변이체를 만든 뒤, EGFP와 AP-EGFP, TAT-EGFP, R9-EGFP를 대조군으로 하여 비교해 보았다.
그 결과, 아르기닌이 하나라도 없는 경우, 즉 X1이 3 미만이거나, X2가 4 미만인 경우 기존의 AP 보다 효율이 크게 감소하는 것으로 보아 AP의 세포 내 단백질 전달의 역할에 있어 X1 및 X2의 아미노산 개수 하한치의 임계적 의의를 확인하였다(도 14).
(2) X2, 시스테인, X3 아미노산의 치환에 따른 단백질 전달 효율 비교
트립토판(X2)과 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)의 역할에 대해 알아보기 위하여 각각의 아미노산을 알라닌 또는 아르기닌으로 치환한 변이체를 제작하여 비교해보았다. 알라닌은 전하를 띠지 않고 가장 간단하면서도 작은 구조이기 때문에 대조군으로 적합하다.
양전하를 띠고 있는 아르기닌으로의 치환체는 아르기닌이 9개 붙어있는 R9과의 효율을 비교하는 대조군으로 사용하였다. 결과적으로 알라닌 치환체와 아르기닌 치환체는 서로 유사한 패턴을 보였다. 트립토판은 다른 아미노산으로 바꾸어도 기존의 AP 서열과 큰 효율의 차이를 보이지 않는 것으로 보아 AP의 기능적 역할에 큰 기여를 하지는 않는 것으로 확인되었다. 아르기닌은 다른 아미노산으로 치환하게 되면 효율이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 아르기닌의 양전하를 띠는 특성이 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 시스테인을 다른 아미노산으로 치환한 경우 가장 급격한 효율의 감소를 보였는데, 이는 시스테인이 AP에 있어 매우 중요한 기능 및 역할을 하고 있음을 시사한다(도 15 및 도 16).
실험예 7: AP의 세포 투과 기작 확인
한편 AP가 기존에 가장 잘 알려진 세포 투과성 펩티드인 TAT처럼 세포내 섭취(endocytosis)과정으로 세포 내로 전달되는지 확인하기 위하여 온도에 의존한 세포 내 전달변화를 측정하였고, 배지 내의 혈청 (serum) 농도에 따라 다른 단백질의 영향을 받는지 여부를 확인해 보았다. 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP를, 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하였다.
각각의 단백질을 상기와 같은 방법으로 5μM이 되도록 Jurkat 세포에 처리하여 각각 4℃, 25℃, 37℃ 온도에서 독립적으로 1시간. 그 결과, 기존의 TAT과 같이 온도에 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 AP가 에너지에 의존하는 세포내 섭취(endocytosis)를 통해 전달되는 TAT과 비슷한 방식으로 전달된다는 것의 간접적인 증거가 되는 것으로써, AP가 기존에 알려진 방식과 비슷한 방식으로 단백질을 세포내로 전달하는 세포 투과성 펩티드임을 확인하였다. 뿐만 아니라 각각의 온도에서 모두 TAT보다 높은 전달효율을 보이는 것을 확인하였다(도 17의 위).
또한 RPMI 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 10%로 달리 했을 때 5μM이 되도록 처리한 각 단백질의 전달 효율을 분석하였다. 세포에 단백질 처리 후 1시간 동안 37℃에서 배양하였으며, 음성 대조군은 세포 투과성 펩티드가 연결되지 않은 EGFP, 양성대조군은 TAT-EGFP를 이용하였다.
그 결과, 배지의 혈청 농도가 증가할수록 AP-EGFP 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 전달되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였다. 이것 역시 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포 투과성 펩티드가 영향을 받는 것을 간접적으로 보여주는 결과로써 본 발명에서 개발된 AP가 갖는 세포 투과성 펩티드로써의 기능을 다시 확인해 주는 결과이다. 한편 각각의 혈청 농도에서 AP는 다른 양성 대조군에 비해 여전히 높은 전달 효율을 나타내고 있음을 확인하였다(도 17의 아래).
실험예 8: Heparin과 MβCD의 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 단백질 전달 효율
(1) Heparin 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 단백질 전달 효율
상기 실험예 4를 통해 AP-EGFP의 전달 효율의 기작을 확인하였던 것처럼 세포 투과성 펩티드가 세포 표면에 있는 헤파란 황산염 (heparan sulfate)과 결합하는 것을 방해할 수 있는 비슷한 구조의 heparin을 미리 처리하여 상호작용에 의해 직접적이거나 간접적인 영향을 받을 것이라는 예상을 하여 Heparin (Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma)을 0 μm/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml 4 가지 농도로 Jurkat 세포주에 30분 먼저 처리해주고 10μM의 AP-EGFP 단백질을 D-PBS로 최종 부피가 100㎕이 되도록 만들어 처리하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하여 비교하였다. 그리고 1시간 동안 37℃의 5% CO2 세포 배양기에서 배양했다. 1시간이 지난 후에는 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거해 주었다. 또한 세포 표면에 묻어있거나, 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다. 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 D-PBS 500㎕로 최종적으로 재 부유 시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACS Canto )를 이용해 세포 내 형광을 측정하는 방식으로 단백질의 세포내 전달 효율을 측정하였다.
그 결과, Heparin 처리 농도가 높아짐에 따라 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율이 현저하게 낮아지는 것을 확인하였다(도 18의 위).
(2) MβCD 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 단백질 전달 효율
또한 AP-EGFP가 세포 내로 전달되는 과정에서, 인지질 이중층 세포막을 구성하는 지질 뗏목 (lipid raft)과 연관된 엔도시토시스(endocytosis)에 영향을 받을 것이라고 예측하여, 세포막의 콜레스테롤 (cholesterol)을 제거하는 것으로 알려져 있는 MβCD(Methyl-beta-cyclodextrin)를 처리하여 지질로 인한 엔도시토시스 (endocytosis)를 미리 저해한 뒤, MβCD를 0 mM, 3 mM, 5 mM 세 가지 농도로 Jurkat 세포주에 얼음에서 20분 먼저 처리해주고, 10μM의 AP-EGFP 단백질을 한 시간 동안 처리하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하여 비교하였다. 그 결과, MβCD 처리 농도가 높아짐에 따라 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율이 확연하게 떨어지는 것을 확인하였다(도 18의 아래).
이것 역시 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포 투과성 펩티드가 영향을 받는 것을 직, 간접적으로 보여주는 결과로써 본 발명에서 개발된 AP가 갖는 세포 투과성 펩티드로써의 기능을 다시 확인해 주는 결과이다.
실험예 9: 암세포주인 HeLa 세포 안으로의 AP-EGFP의 전달
AP가 단백질과 함께 실제로 세포 내로 전달되는 것인지, 세포 내 어느 위치에 존재하는지 직접 확인하기 위하여 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 안으로 AP-EGFP를 전달하여 공초점현미경을 이용해 분석하였다.
12-well 플레이트 (SPL lifescience)의 각 well에 미리 현미경용 원형 커버글라스 (Marin field)를 깔아두고 HeLa 세포의 세포수를 1×105 으로 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지 (HyClone)에서 배양하여 세포가 커버글라스에 부착될 수 있도록 하였다. 이후 배지를 모두 흡입 (suction)하여 버린 후 새로운 DMEM 450㎕를 넣어주고, 실시예 3을 통해 정제된 AP-EGFP 단백질을 농도가 5μM이 되도록 하여 D-PBS와 섞어 부피가 50㎕이 되게 해서 처리하였다. 그리고 1시간 동안 37℃의 5% CO2 세포 배양기에서 배양했다. 1시간의 처리시간이 지난 뒤에 세포외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입하여 버린 후 1㎖의 D-PBS로 세척하는 과정을 5회 반복했다. 그리고 포름알데히드 (formaldehyde 37% solution, formalin, SIGMA) 1㎖로 세포를 고정하였다. 고정 후에도 D-PBS 1㎖를 이용해 5회 세척하였다. 이후에는 세포를 확인하고 핵의 위치를 확인하기 위하여 1:4000으로 희석한 Hoechst (Hoechst AG)를 500㎕이용해 핵이 형광을 띄도록 염색했으며 10분의 반응시간 후에 D-PBS 1ml를 이용해 5회 세척하였다. 이렇게 준비된 커버 글라스는 Mounting medium (SIGMA)을 이용해 슬라이드 글라스위에 마운팅하여 형광현미경 DMi-8 (Fluorescence microscope, Leica) 으로 녹색 형광 단백질의 위치와 세포 안으로 전달되는 것을 확인하였다. 그 결과, AP가 결합된 녹색 형광 단백질은 세포막을 투과해 세포 내로 전달되어 들어가며, 세포내 위치는 세포질 (cytoplasm)에 머물러 있는 것을 확인하였다(도 19).
실험예 10: 피부 세포주인 HaCaT 및 NIH3T3 세포 안으로의 AP-EGFP의 전달
AP가 단백질과 함께 실제로 피부 세포 내로 전달되는 것인지, 피부 세포 내 어느 위치에 존재하는지 직접 확인하기 위하여 피부 세포주인 HaCaT 및 NIH3T3 세포 안으로 AP-EGFP를 전달하여 공초점현미경을 이용해 실험예 9와 동일한 방법으로 분석하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP 및 R9-EGFP를 사용하여 비교하였다. 또한 추가로 AP 서열의 시스테인을 알라닌으로 치환한 AP C→A EGFP를 실험군으로 추가하였다.
그 결과, AP가 결합된 녹색 형광 단백질은 양성 대조군이나 C→A EGFP에 비하여 높은 효율로 세포막을 투과해 피부 세포 내로 전달되어 들어가며, 세포 내 핵 및 세포질에 머물러 있는 것을 확인하였다(도 20 및 도 21).
실험예 11 : 쥐의 각 장기 내부로의 AP-EGFP의 전달
AP가 실제 체내 조건에서도 전달되는 것인지, 전달이 된다면 어느 장기까지 얼마나 전달이 될 수 있는지 직접 확인하기 위하여 C57BL/6 종의 6주 된 암컷 쥐에 5 mg의 AP-EGFP 단백질을 복강 주사하여 2시간 후 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 장 등의 장기를 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, D-PBS로 2~3회 세척하여 O.C.T. compound를 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 6μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 형광 현미경을 통하여 여러 장기 세포 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다. 슬라이드 제작 후 Hoechst로 10분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하였다. 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되지 않은 EGFP를 사용하였다. 그 결과 EGFP에 비교하여 AP가 연결된 녹색 형광 단백질은 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 장 등의 장기를 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였다(도 22).
실험예 12 : 쥐의 피부로의 시간에 따른 AP-EGFP의 전달
본 발명의 AP가 피부조직으로도 전달되는 것인지, 전달이 된다면 어느 깊이까지 전달이 될 수 있는지 확인하기 위하여 C57BL/6 종의 7주된 암컷 쥐 털을 제거후, 테이프 접착 10회를 하여 각질층을 제거한 피부에 100 μg의 AP-EGFP를 종이패치를 이용하여 부착하였다. 각각 2, 4, 6 및 8 시간 후 피부조직을 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, O.C.T 화합물을 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 7 μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 형광 현미경을 통하여 피부조직 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다. 슬라이드 제작 후 Hoechst로 15분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하였다. 종래의 세포 투과 펩티드가 결합된 TAT-EGFP를 양성대조군으로 사용하였다.
TAT-EGFP는 8 시간까지도 피부 조직 안으로 녹색 형광 단백질을 전달하지 못하였으나, AP가 연결된 녹색 형광 단백질(AP-EGFP)은 2 시간째부터 피부조직을 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였다(도 23).
실험예 13 : 쥐의 피부로의 AP-dTomato와 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
본 발명의 AP가 분자량이 큰 dTomato 형광단백질과 결합된 경우에도 피부 조직으로 형광단백질을 전달하는지 종래 피부 투과성 펩티드들과 비교하여 실험하였다. 실험예 3과 동일하게 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 dTomato 형광단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 피부 투과성 펩티드에 dTomato 형광단백질을 결합시킨 TAT-dTomato, TDP1-dTomato, TDP2-dTomato를 사용하여 비교해 보았다. 실험예 12와 동일하게 실험하되 6 시간 째 피부조직을 얻어 실험에 이용하였다.
본 발명의 AP-dTomato 만이 피부조직 내로 dTomato 형광단백질을 전달하고 있음을 확인하였다(도 24).
실험예 14 : 녹색 형광 단백질 적중 쥐의 피부로의 AP-dTomato의 전달
본 발명의 AP가 피부조직 내 피부세포로 전달되는 것인지 명확히 확인하기 위하여 모든 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현하는 GFP 유전자 적중 쥐 피부에 실험예 12와 동일한 방법으로 종이패치를 이용하여 AP-dTomato 형광 단백질을 부착하였다. 6시간 후 피부조직을 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, O.C.T 화합물을 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 20 μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 공초점 현미경을 통하여 피부조직 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다.
슬라이드 제작 후 Hoechst로 15분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하여 도 25 및 도 26에 나타내었다. 대조군으로는 피부 투과 펩티드가 연결되지 않은 dTomato를 음성대조군으로 사용하였다.
그 결과 dTomato와 비교하여 AP가 연결된 붉은색 형광 단백질은 피부조직을 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였고(도 25), 고배율의 이미지를 통해서도 AP-dTomato 형광단백질이 GFP를 발현하는 녹색 세포 내에 잘 전달됨을 확인하였다(도 26).
실험예 15 : 대장균에서 AP-EGFP 단백질과 AP-rPTP 단백질의 발현 및 정제
제조예 4로부터 정제한 AP-EGFP 단백질과 제조예 7에서 정제한 AP-rPTP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인하였고, 이의 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이, 두 단백질 모두 대장균으로부터 제대로 발현되었으며, 잘 정제되었음을 확인할 수 있다.
실험예 16 : AP-rPTP 단백질의 3차원 구조
도 28은 제조예 7로부터 정제된 AP-rPTP 단백질의 3차원 구조를 예측하여 나타낸 도면이다. 이는 Sparks X(http://sparks-lab.org)에 의해 예측되었고, PyMOL을 사용하여 시각화하였다.
도 28에 나타난 바와 같이 AP-rPTP 단백질의 3차원 입체 구조는 원래 rPTP 단백질 구조를 거의 그대로 유지하고 있는 것으로 나타났으며, 구조의 급격한 변화는 관찰되지 않았다.
실험예 17 : AP-EGFP 단백질 및 AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성 측정
도 29는 제조예 4로부터 정제한 AP-EGFP 단백질과 제조예 7로부터 정제된 AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성을 측정하여 나타낸 것이다.
AP-EGFP 단백질 및 AP-rPTP 단백질에서 phosphatase 활성을 측정하기 위하여 AP-EGFP 단백질과 AP-rPTP 단백질에 발색체 기질을 첨가한 후, pNPP((para-nitrophenyl phosphate) phosphatase) 에세이(BioAssay 517 Systems, Hayward, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
이때 데이터는 단백질 농도에 따른 초기 비율(V0)의 플롯으로 나타내었다. 통계학적 분석은 one-way ANOVA에 의해서 수행되었다. *P<0.001.
도 29에 나타난 바와 같이, AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성은 1.5 nmol/min/㎍이였으나, AP-EGFP 단백질은 활성이 전혀 관찰되지 않았다.
실험예 18 : 피부 세포 안으로 AP-rPTP 단백질의 전달 효율 확인
HaCaT 세포주는 인간 표피 세포주로서 경피 전달 실험 및 피부질환 논문에서 생체외 전달 효율 및 기작 확인을 위하여 사용되어 온 세포주이다[J Invest Dermatol. 2011 Jul;131(7):1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15;75(6):1348-57.].
상기 HaCaT 세포주를 이용하여 본 발명의 AP-rPTP 단백질이 피부 세포에 전달할 수 있는지 도 30에 나타내었다. 이때, 상기 AP-rPTP 단백질을 항 His tag 항체로 염색하였고, 이의 신호는 Alexa Fluor-488-결합된 anti-mouse LgG 항체로 증폭하였으며, 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 세포 내 형광 강도를 측정하였다.
도 30은 제조예 7로부터 제조된 AP-rPTP 단백질이 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 측정한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다. 도 30에서 우측 그래프의 x 축 MFI는 'mean fluorescence intensity'를 의미하는 것으로, 형광 강도를 나타낸다.
도 30에 나타난 바와 같이, 1 시간동안 1 또는 5 μM AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때, 이들 모두 세포 내부 전달 효과는 매우 우수함을 확인하였다.
실험예 19 : 피부 세포 안으로 AP-rPTP 단백질의 시간에 따른 전달 효율 확인
HaCaT 세포주는 인간 표피 세포주로서 경피 전달 실험 및 피부질환 논문에서 생체외 전달 효율 및 기작 확인을 위하여 사용되어 온 세포주이다[J Invest Dermatol. 2011 Jul;131(7):1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15;75(6):1348-57.].
상기 HaCaT 세포주에 AP-rPTP 단백질을 다양한 시간(0.5 내지 12 시간)동안 처리한 후, 피부 세포에 전달할 수 있는 효율을 비교하여 도 31에 나타내었다.
이때, 상기 AP-rPTP 단백질을 항 His tag 항체로 염색하였고, 이의 신호는 Alexa Fluor-488-결합된 anti-mouse LgG 항체로 증폭하였으며, 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 세포 내 형광 강도를 측정하였다.
도 31은 제조예 7로부터 제조된 AP-rPTP 단백질이 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 시간에 따라, 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 측정한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다. 도 31에서 우측 그래프의 x 축 MFI는 'mean fluorescence intensity'를 의미하는 것으로, 형광 강도를 나타낸다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 2 시간 동안 처리하였을 때가 최대 형광 강도를 나타내는 것으로 확인되었고, 이후부터 급격하게 감소하다가 12 시간부터 안정적으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 AP-rPTP 단백질은 처리시간이 1 내지 8 시간이면 충분한 세포 내 전달 효율을 달성할 수 있으나, 1.5 배 이상의 세포 내 전달효율을 달성하기 위해서는 1.5 내지 3.5 시간동안 처리되는 것이 가장 바람직하다.
실험예 20 : 비장세포 내에서, AP-rPTP 단백질의 사이토카인 신호전달 저해 효율 확인
본 실험예에서는 AP-rPTP 단백질이 사이토카인 신호를 저해하는지 여부를 확인하고자 한 것으로, 구체적으로 6-8 주령의 C57BL/6 마우스로부터 채취된 비장세포를 PBS, AP-rPTP 및 AP-EGFP로 각각 1 시간동안 37 ℃에서 배양한 후, 상기 비장세포를 다음의 사이토카인으로 활성화하였다. 재조합 마우스 IFN-γ(10 ng/㎖; BD), IL-4(20 ng/㎖; BD), IL-6(30 ng/㎖; BD). 상기 세포는 PBS와 RIPA 버퍼(Cell signaling, Becerly,, MA, USA)(1 mM NaF, 1 mM PMSF 및 Halt protease 및 phosphatase 저해제 칵테일)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 포함함)로 30 분동안 얼음 중탕에서 세척하여 준다.
각 사이토카인 자극 단계별 STAT 단백질의 tyrosine phosphorylation을 면역블롯 방법을 통해 측정하여 나타내었다. 면역블롯(immunoblotting)은 PVDF 막(Bio-Rad)를 사용하였고, 일차 항체는 phospho-Stat1(Tyr701) 래빗 mAb, phopspho-Stat3(Tyr705) 래빗 mAb, phospho-Stat6(Tyr641) 래빗 mAb를 사용하였다. 이들은 세포 신호와 β-액틴 마우스 mAb(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)로부터 구입하였다.
도 32는 AP-rPTP 단백질이 처리된 마우스 비장세포(splenocytes)에서 사이토카인(cytokines) 자극에 미치는 영향을 나타낸다. 밴드의 좌측 상단에 표기된 IFN-γ, IL-6, IL-4는 각 밴드가 해당 사이토카인으로 자극된 것임을 나타내는 것이다.
여기서 NA란 면역세포 활성화될 수 있는 자극을 주지 않은 것으로 음성 대조군에 해당하며, PBS는 면역세포가 활성화될 수 있도록 각 IFN-γ, IL-6, IL-4 으로 자극을 준 것으로, 이는 일종의 양성 대조군이고, 제시된 결과는 4회의 독립적인 실험 중 대표적인 것을 나타내었다 (n = 4).
도 32에 나타난 바와 같이, 1 시간동안 AP-rPTP 또는 AP-EGFP 단백질로 배양한 후, 이를 IFN-γ, IL-6, IL-4 순서대로 60분, 30분, 15 분으로 자극한 결과에 따른 STAT 단백질의 인산화 정도를 비교하여한 결과, AP-rPTP 단백질로 처리한 경우 STAT1, STAT3, STAT6의 인산화 반응(phosphorylation)이 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로 본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질은 면역세포에서 사이토카인 신호에 대해 음성 조절제(negatively regulates) 역할을 수행한다고 여길 수 있다.
실험예 21 : 비장세포 내에서, AP-rPTP 단백질의 CD4 T 세포의 증식 효율 확인
본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질이 T 세포 활성에서도 조절제 역할을 수행할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기 방법을 통해 분석하였다.
96 well plate에 0.1 ug의 anti-CD3, anti-CD28 antibody를 37 ℃, 0.5 % 이산화탄소 세포 배양기에서 5 시간 동안 코팅한다. 이후 분리해낸 쥐의 비장 세포를 각 well당 2.5 X 105 cell 씩 분주한다. 여기에 PBS 혹은, AP-rPTP 단백질을 처리한 뒤 3 일 동안 37 ℃, 0.5% 이산화탄소 세포 배양기에서 배양한다. 이후 세포를 CFSE(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 형광으로 4 ℃에서 20 분간 염색하였다. 이후 상술한 과정을 통해 제조된 세포로부터 CFSE 신호를 유세포분석기(FACS)를 통하여 비교 분석하였다.
도 33a, b는 NA 또는 PBS 처리한 일차 마우스 CD4-T 세포들('NA' 및 'α-CD3αCD28+PBS')에서의 증식을 측정한 그래프이고, 도 33c는 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때의 CD4 T 세포 증식을 조사하여 나타낸 그래프이다.
여기서 NA란 T 세포가 활성화될 수 있는 자극을 주지 않은 것으로 음성 대조군에 해당하며, PBS는 T 세포가 활성화될 수 있도록 anti-CD3, anti-CD28 monoclonal antibody로 자극을 준 것으로, 이는 일종의 양성 대조군이다.
도 33에 나타난 바와 같이 활성화된 T 세포로부터 생성된 사이토카인과 CD4 T 세포 증식(proliferation)을 항-CD3과 CD28 항체로 자극(stimulation)에 따라 평가한 결과, AP-rPTP는 활성화된 T 세포 증식(proliferation)을 상당히 감소시키는 것으로 확인되었다.
실험예 22 : 비장세포 내에서, AP-rPTP 단백질과 AP-EGFP 단백질의 사이토카인 발현양 비교
96 well plate에 각각 2 ㎍/㎖(BD pharmingen)의 anti-CD3, anti-CD28 antibody를 37 ℃, 0.5 % 이산화탄소 세포 배양기에서 5 시간 동안 코팅한다. 이후 분리해낸 쥐의 비장 세포를 각 well당 2.5 X 105 cell 씩 분주한다. 여기에 AP-EGFP 혹은 AP-rPTP 단백질을 처리한 뒤 3 일 동안 37 ℃, 0.5% 이산화탄소 세포 배양기에서 배양한다. 이후 세포의 배양 상충액(supernatant)로부터 IFN-γ(BioLegend), IL-2(BioLegend), IL-13(Ebioscience) 및 IL-17(Ebioscience)을 ELISA 분석을 통해 측정하여 도 34에 나타내었다. 이때 상기 ELISA는 Biolegend사에서 시판하는 kit를 이용하였으며, 이의 표준 protocol대로 수행하였다.
도 34는 AP-rPTP 및 AP-EGFP 단백질에 따른 마우스 비장세포에서의 사이토카인 발현양(IL-17(a), IL-13(b), IFN-γ(c) 및 IL2(d))을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 최소 세 번의 실험을 수행한 것들의 평균 수치이며, 상기 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타내었고, 통계학적 분석은 one-way ANOVA에 의해 수행되었다.
도 34에 나타낸 바와 같이 농도 의존성에 따라(dose-dependent manner) IL-2, IFN-γ, IL-13, IL-17을 포함하는 다양한 사이토카인의 생성도 상당히 감소하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질은, 염증(inflammatory) 사이토카인 신호뿐만 아니라 T 세포 활성 및 증식 모두를 조절하는 잠재적 면역 조절제(modulator) 역할을 수행할 수 있음을 확인하였다.
실험예 23 : Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델에서 AP-rPTP 단백질의 치료 효과 확인
암컷 7 주령의 C57BL/6 쥐의 털을 제모제를 이용하여 제거 후 다음날, 아세톤 : 올리브오일 (4:1) 용액에 섞어 만든 2% oxazolone을 쥐의 귀의 한쪽 면 당 10 ㎕씩 뿌려 감작시킨다. 감작 5일 후 1% oxazolone용액을 동일하게 뿌려 피부염을 유발한다. AP-rPTP 단백질은 감작과 유도 사이에 총 6회 종이패치를 이용하여 귀의 양쪽면에 부착 후 100 μg 씩 도포한다. 분석은 1% oxazolone 유도 다음날 진행한다(도 35).
그 결과 AP-rPTP를 도포한 쥐 그룹의 귀가 음성대조군인 PBS 처리 귀에 비해 염증이 저해된 것을 확인하였고(도 36), 마이크로미터 (mitutoyo)를 이용하여 귀 두께를 측정한 결과 AP-rPTP를 도포한 그룹의 귀 두께가 음성대조군과 비교하여 얇아졌으며(도 37), 귀 무게 또한 줄어든 것을 관찰하였다(도 38).
보다 구체적으로 확인하기 위하여 귀를 4% 포름알데하이드로 하루동안 고정한 뒤, 30% 수크로즈에 하루 동안 담가 탈수시킨 조직을 O.C.T 화합물을 이용하여 동결절편을 만들었다. 10 ㎛로 절편을 만든 후 H&E 염색기법으로 절편을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 음성대조군과 비교하여 귀 두께가 감소함을 확인하였다(도 39).
rPTP를 매개로 하여, 병리학적 조절 기능을 부여하기 위해서, AP 대신 종래의 세포 투과성 펩티드를 이용한, TAT-rPTP 융합체 또는 R9-rPTP 융합체로도 실험하였으나, 이들은 모두 AP-rPTP와 같은 병리학적 조절기능을 발휘하지 못하는 것을 확인하였다. 즉 결과 상에 있어서 음성대조군과 비교하여 큰 변화가 관찰되지 않았으므로 별도로 이를 도시화하지 아니하였다.
실험예 24 : Oxazolone(OXA) 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 사이토카인과 케모카인의 mRNA 발현 비교
실험예 23으로부터 제조된 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 사이토카인(IL-1β, IL-6)의 mRNA 발현양을 측정 및 정량화하여 도 40에 나타내었고, 케모카인(CXCL2, CXCL5)의 mRNA 발현양을 측정하여 정량화하여 도 41에 나타내었다.
흑색 그래프로 표기된 sham(모의 실험 대조군)과 비교하여 본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때(적색 그래프)가 가장 근접하게 사이토카인과 케모카인이 발현되었음을 확인하였다. 다만 AP-EGFP 단백질을 처리한 경우(초록 그래프) 사이토카인과 케모카인의 발현량이 본 발명의 AP-rPTP를 처리하였을 때 보다 현저히 증가하였을 알 수 있는데, 사이토카인은 최대 2배 이상 차이가 났고, 케모카인은 최대 3배 차이가 나는 것을 확인하였다.
다시 말해 AP-rPTP 단백질은 OXA로 유도된 급성 피부 염증을 앓고 있는 피부 조직에 대하여 염증 반응을 효과적으로 제어할 수 있음을 확인하였다.
실험예 25 : Ovalbumin(OVA) 유도된 만성(chronic) 피부염 동물모델에서 AP-rPTP 단백질의 예방 및 치료 효과 확인
암컷 7-8 주령의 BALB/c 암컷 쥐의 털을 제모제를 이용하여 제거 후 다음날, 100 ㎍ Ovalbumin(OVA)를 멸균 거즈를 이용하여 등쪽 조직에 도포하였다. 이러한 과정은 1 주간 총 3 차례에 걸쳐 진행되었고, 상기 단계 사이에는 2 주의 기일(term)을 두었다.
보다 구체적으로 예방 효과 확인을 위해서는 상기 총 3 차례의 단계마다 OVA와 함께 100 ㎍ AP-rPTP 단백질을 투여하였고, 치료 효과 확인을 위해서는 마지막 OVA 투여 단계에만 AP-rPTP 단백질을 함께 투여하였다(도 42).
보다 구체적으로 확인하기 위하여 귀를 4% 포름알데하이드로 하루동안 고정한 뒤, 30% 수크로즈에 하루 동안 담가 탈수시킨 조직을 파라핀을 이용하여 파라핀절편을 만들었다. 6 ㎜로 절편을 만든 후 H&E 염색기법으로 절편을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 음성대조군(Sham)은 표피의 이상증식이 확인되었는데 반해, 본 발명에 따른 AP-rPTP를 처리한 경우(예방 또는 치료 모델에서) 등 두께 및 염증이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 43).
도 44는 상기 도 43의 H&E 염색 결과의 총 조직학적 수치를 비교하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 마우스의 경피에 AP-rPTP 단백질을 처리함에 따라, 예방 모델과 치료 모델 둘 다에서 상당한 염증 조직이 감소되었음을 확인하였다.
도 45는 상기 예방 모델과 치료 모델의 피부 조직으로부터 IL-13 mRNA 발현량을 측정한 결과 그래프로, 이에 따르면 본 발명의 AP-rPTP 처리에 의해 IL-13 mRNA 발현이 현저히 감소하는 것을 알 수 있다.
상술한 결과를 종합하면 종이 패치를 통한 AP-rPTP의 경피 투여를 통해 급성 또는 만성 알러지 피부염의 염증을 상당히 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. 즉 피부염에 대한 예방 및 치료 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 26 : 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델에서 AP-rPTP 단백질의 예방 및 치료 효과 확인
본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질은 염증성 사이토카인 신호와 T 세포 수용체 신호를 표적으로 하고 있으므로, 알러지 염증 반응뿐만 아니라, 다른 피부 질환에 대해서도 예방 또는 치료 효과를 나타낼 것이라 예상하여, 아래와 같은 실험을 통해 이를 증명하였다.
수컷 7 주령의 C57BL/6 쥐의 털을 제모제를 이용하여 제거 후 다음날부터, 20 ㎎ Aldara cream(이미퀴모드(imiquimod) 5%)와 100 ㎍ AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 함께 매일매일 1 시간동안 종이 패치를 사용하여 쥐의 귀에 부착하였다(도 46). 매일매일 귀의 두께(thickness)를 측정하여 도 47에 나타내었다. 7일 째에 병리학적(phathology) 분석을 수행하여 그 결과를 도 48 내지 50에 나타내었다.
도 47은 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델에 AP-rPTP와 AP-EGFP를 6일 동안 처리하는 동안의 귀 두께 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 47에 나타난 바와 같이 마이크로미터 (mitutoyo)를 이용하여 귀 두께를 측정한 결과, AP-rPTP를 도포한 쥐 그룹의 귀가 음성대조군인 Sham 처리 귀에 비해 귀 두께가 크게 두꺼워지지 않는 것을 확인하였고, AP-rPTP를 도포한 그룹의 귀 두께가 AP-EGFP를 처리한 그룹의 귀와 비교하여 얇아진 것을 확인할 수 있었다.
도 48은 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 48에 나타난 바와 같이, AP-rPTP로 처리한 경우, AP-EGFP로 처리하였을 때보다 염증 세포 침투와 표피 이상증식 현상이 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다.
도 49는 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 사이토카인(IL-7A, IL-17F, IL-6) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 50은 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 항균(antimicrobial) 펩티드(S100A8, S100A9) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 49 및 도 50에 나타난 바와 같이 귀 피부 조직에 대한 mRNA 발현 프로파일을 조사한 결과, AP-rPTP를 경피 투여하였을 때 IL-17A, IL-17F 및 IL-6 mRNA 발현이 급격히 감소하였음을 확인하였다.
또한 AP-rPTP 투여를 통해 호중성 백혈구에 대해 주화성을 가지고 있는 S100A8의 펩티드와 S100A9 펩티드도 뚜렷하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 종합하면 AP-rPTP는 경피 투여를 통해 건선 피부 질환에 대해서도 매우 효과적인 예방 및 치료효과를 갖고 있음을 알 수 있다.
본 발명의 피부 투과성 펩티드 및 그를 이용한 생물학적 활성 물질이 결합된 융합체는 화장품, 의약품 등 다양한 분야에 활용이 가능하다.

Claims (17)

  1. (X1)n-X2-(시스테인)-(X3)m의 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드:
    상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고,
    상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이며,
    상기 X1 및 X3은 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이며,
    상기 X2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 발린, 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피부 투과성 펩티드는 9 내지 14개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 피부 투과성 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 X1 및 X3은 각각 독립적으로 아르기닌 또는 라이신 인 것을 특징으로 하는 피부 투과성 펩티드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 X2는 알라닌, 트립토판 또는 아르기닌 인 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩티드.
  5. 제3항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 피부 투과성 펩티드.
  6. 청구항 제1항 내지 제5항 중에서 선택되는 어느 한 항의 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질이 결합된 융합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 단백질, 유전물질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 rPTP 펩티드인 것을 특징으로 하는 융합체.
  9. 제6항에 있어서, 상기 융합체는 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 융합체.
  10. 제6항에 있어서, 상기 결합은 펩티드 결합 또는 화학적 결합인 것을 특징으로 하는 융합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합(sulfde-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합체.
  12. 청구항 제6항의 융합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  13. 청구항 제6항의 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 에멀젼, 크림, 에센스, 스킨, 리포솜, 마이크로캡슐, 복합 입자, 샴푸 및 린스로 이루어진 군으로부터 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  15. 청구항 제6항의 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체를 유효성분으로 포함하는 피부외용제용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 피부 투과성 펩티드가 결합된 생물학적 활성을 갖는 물질은 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 하는 피부외용제용 약학 조성물.
  17. 청구항 제15항의 피부외용제용 약학 조성물의 유효량을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 또는 치료방법.
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