CN114533569A - 适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液及其制备方法和在制备护肤品中的应用。以质量百分比计，该脂质体乳液的原料组成包括：经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体20％～30％，赋形剂0.1％～1％，透皮吸收促进剂0.5％～3％，水66％～79.4％。制备方法包括：取类脂、细胞穿膜肽材料、磷脂聚合物、调节剂溶于溶剂中，加入透皮吸收促进剂得到溶液A，另取活性成分加入到溶液A中并使活性成分充分溶解，再去除溶剂，得到薄膜；取赋形剂、水混匀后，与薄膜混合并使薄膜充分溶解，然后进行高压均质处理，得到脂质体乳液。

Description

适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳 液及其制备和应用
技术领域
本发明涉及脂质体技术领域，具体涉及一种适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液及其制备和应用。
背景技术
目前随着人们对皮肤护理的重视，护肤品功效越来越追求再生和健康功效。
眼周皮肤是人体皮肤最薄的部位，只有面部皮肤1/4的厚度，因此比较脆弱更容易受到外界的伤害。
眼部皮下几乎没有皮脂腺和汗腺分布，能供给的油脂相对要少得多，导致眼部皮肤极易衰老，产生皱纹；眼部大量的毛细血管的管壁非常薄，易充血、积水，产生黑眼圈、眼袋、以及炎症、眼外伤、血管性病变等各种原因引起的眼部不适。
皮肤护理设计的关键点是在于表皮基底层、甚至真皮层，需要活性成分深入才能发挥效果。由于眼周皮肤的特点，对一般皮肤护理中的有效成分吸收效果不佳。因此目前市场上针对眼部的护肤品主要难题是提高胞内递送效率。
脂质体作为活性成分载体可以有效解决传统护肤品的缺点。
脂质体成分温和透皮，不破坏角质层屏障结构，可以数倍的增加活性分子的皮肤吸收效果。
脂质体还具有缓释放效应，在进入皮肤层后，活性成分可持续地释放，提高生物利用度，以达到长效和降低刺激性的目的。但是目前制备的脂质体化妆品在皮肤中的渗透作用有待提高，特别是眼部皮肤的限制，由于其角质层薄且汗毛孔少，更需要生物相容性好的护肤品成分，以促进透皮效果。
儿茶素是一组存在于茶树叶片中的黄酮类化合物，在体外和体内均表现出抗氧化和抗炎活性，可治疗眼角膜上皮细胞损伤。
亚麻籽油这种天然的植物油，具有抗皮肤衰老和防晒的功能，还可保护泪液蒸发并滋养由干眼症导致的脂质层损伤。
维生素A和维生素B12在抗痘、控油、淡斑、抗老、修复光老化的功效广泛应用于化妆品领域，在医药方面参与新陈代谢、生长和分化眼表上皮细，可以改善严重干眼病患者的症状。
上述儿茶素、亚麻籽油、维生素A和维生素B12等活性成分或是不稳定，较难储存，或是皮肤不易吸收。
因此，如何提高上述活性成分的稳定性和递送效率，提高其应用价值，值得深入研究。
发明内容
为弥补上述脂质体技术的缺点，针对眼周皮肤娇嫩的特性，解决现有眼部护理的需求，提高活性成分的稳定性、递送和吸收效率以及应用价值，本发明提供一种特别适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体护理品，是一种胞内递送效率高、可防止肌肤衰老、可预防和治疗眼部疾病的脂质体护肤品，护肤美容和药用功效相辅相成，是一种疗效显著的护肤品，其关键成分为一种适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液。
具体技术方案如下：
一种适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液，以质量百分比计，原料组成包括：
Figure BDA0003506501400000021
所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体(示意图如图1所示)，以质量百分比计，原料组成包括：
Figure BDA0003506501400000022
Figure BDA0003506501400000031
在一优选例中，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体，以质量百分比计，原料组成包括：
Figure BDA0003506501400000032
本发明的脂质体采用一种新型合成的阳离子材料——巯醇基修饰的细胞穿膜肽进行表面修饰，使脂质体不仅可以穿过细胞膜进入细胞内，对细胞膜没有损害，而且通过巯醇基与细胞穿膜肽之间的交联增加形成的载体的稳定性，延长体内循环半衰期，从而提高活性成分的胞内递送效率。磷脂聚合物修饰具体指在脂质体表面进行“钝化”改性，以避免免疫系统的识别和降解，从而延长活性成分在人体内的滞留时间，提高缓释放效果。儿茶素、亚麻籽油、维生素A和维生素B12等可作为被包裹的活性成分。这些活性成分具有护肤和护眼双重功效，通过外敷方式对眼部皮肤进行护理，起到淡化皱纹、防止肌肤衰老的作用，还可以预防和治疗眼部疾病。
本发明对脂质体进行功能化修饰后，粒径为数百纳米的脂质体皆可直接穿透表皮细胞膜进入深层皮肤，以增加皮透效果促进活性成分的吸收。而脂质体直接进入人体后，部分会被先天免疫系统迅速识别并降解，因此本发明提出了一种磷脂聚合物，即1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)聚合物，对脂质体表面涂层策略以避免免疫系统对脂质体的识别。本发明中被包裹的活性成分，在上述改良的脂质体技术的协助下可显著提高应用价值。
本发明提供所述细胞穿膜肽材料的一种优选制备方法，包括：称取DSPE-PEG-NHS(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺，其中聚乙二醇的分子量可以根据需要进行选择，如选择分子量为2000等)和细胞穿膜肽，溶于去离子水室温下充分混合反应，DSPE-PEG-NHS作为连接剂，-NHS活化脂基团与细胞穿膜肽中裸露的氨基进行反应，所得混合反应液用截留分子量为1500Da的透析袋透析除杂，透析液为去离子水，最后冻干得到DSPE-PEG-细胞穿膜肽；分别称取含巯醇基的甘氨酸衍生物、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)震荡反应，然后向其中加入DSPE-PEG-细胞穿膜肽继续反应，之后用无水乙醚离心数次后，真空干燥生成粉末状的所述细胞穿膜肽材料。
所述细胞穿膜肽材料的制备方法中：DSPE-PEG-NHS和细胞穿膜肽的质量比优选为1:0.6～0.8；所述混合反应液中DSPE-PEG-NHS和细胞穿膜肽的总浓度优选为8～9mg/mL,硫普罗宁、DIEA和细胞穿膜肽的摩尔质量比为3～3.5:6～7:1，硫普罗宁、HOBt、HBTU的质量比为2.1～2.5:1:2.8～3.0。
所述细胞穿膜肽优选为阳离子型细胞穿膜肽，包括人类免疫缺陷病毒中的反式转录激活因子(TAT)、多聚精氨酸肽(R5、R7、R9、R11)中的至少一种。
所述含巯醇基的甘氨酸衍生物为硫普罗宁，包括R型、S型中的一种。
所述磷脂聚合物具有如下式(I)所示结构：
Figure BDA0003506501400000041
式(I)中，n为10～20的整数。
本发明所述磷脂聚合物为基于磷脂单体聚合而成的聚合物，所述单体为1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，可以DSPG-Br为引发剂利用原子转移自由基聚合法合成。
本发明提供所述磷脂聚合物的一种具体合成方法，包括步骤：
(1)将1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、三乙胺在氯仿中混匀后，加入2-溴异丁酰溴，充分反应后过滤、洗涤、去除溶剂得到引发剂DSPG-Br；
(2)将DSPG-Br的二氯甲烷溶液和DOPC的乙醇溶液混匀后，加入CuBr反应25～35min，然后加入三(2-吡啶甲基)胺(TPMA)，55～65℃充分聚合，再用装有纯水的截留分子量为3.5kDa的透析袋透析以去除杂质，最后冻干得到所述磷脂聚合物。
在一优选例中，所述赋形剂为牛磺酸、L-天门冬氨酸钾、海藻糖中的一种，具有促进有机体免疫力的增强和抗疲劳的作用，可以赋活肌肤细胞、抗氧化、抵抗外界环境对肌肤的侵袭，水溶性稳定，广泛应用于化妆品领域。
在一优选例中，所述透皮吸收促进剂包括月桂氮卓酮、有机醇和萜烯类的至少一种，包括但不限于甘油、丙二醇、柠檬烯等。
进一步优选，以所述脂质体乳液的总质量为100％计，所述脂质体乳液的原料组成中，含有月桂氮卓酮0.25％～1.5％，丙二醇0.25％～1.5％。
在一优选例中，所述类脂与皮脂相似，包括氢化大豆磷脂、大豆卵磷脂、神经鞘磷脂中的至少一种。
在一优选例中，所述活性成分包括儿茶素、维生素B12、维生素A和亚麻籽油。
进一步优选，以所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的总质量为100％计算，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的原料组成中，含有儿茶素0.3％～0.75％，维生素B12 0.1％～0.25％，维生素A0.3％～0.75％，亚麻籽油0.5％～1.25％。
在一优选例中，所述调节剂包括胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
进一步优选，以所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的总质量为100％计算，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的原料组成中，含有胆固醇4.7％～5.4％，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1.6％～2.3％。
所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中，聚乙二醇链段的数均分子量优选为2000～5000。
本发明还提供了所述的脂质体乳液的一种优选制备方法，采用逆向蒸发法，具体包括步骤：
1)取类脂、细胞穿膜肽材料、磷脂聚合物、调节剂溶于溶剂中，加入透皮吸收促进剂得到溶液A，另取活性成分加入到溶液A中并使活性成分充分溶解，再去除所述溶剂，得到薄膜；
2)取赋形剂、水混匀后，与所述薄膜混合并使薄膜充分溶解，然后进行高压均质处理，得到所述脂质体乳液。
步骤1)中，所述溶剂优选包括乙醇、氯仿、甲醇中的至少一种。
步骤2)中：
优选采用高低温循环使薄膜充分溶解，所述高低温循环具体是指在高温35～40℃、低温0～5℃之间循环，高温处理时间优选为1～5min，低温处理时间优选为4～10min。
在一优选例中，所述高压均质处理的参数条件是：300～800bar压力下，均质1～10次。
本发明还提供了所述的脂质体乳液在制备护肤品中的应用。
作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种护肤品，其原料组成中含有所述的脂质体乳液。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
(a)由于眼部皮肤有角质层薄、毛孔汗腺少等特点，所使用的护肤品或涂抹类药剂需要具有有效成分透皮效果且不破坏皮肤结构。本发明的脂质体有良好的生物相容性。脂质体包裹活性成分后，通过表面连接细胞穿膜肽富含的精氨酸的胍基与细胞膜中带负电荷的羧酸、磷酸基团能够相互作用形成双齿状氢键，可直接穿过细胞膜进入细胞内，起到透皮效果。
(b)选用具有抗氧化效果的活性成分，例如儿茶素、亚麻籽油、维生素A和维生素B12等，可以清除人体产生的自由基，抗氧化，防止细胞老化发生病变，实现护肤和护眼双重功效。
(c)活性成分被包裹进脂质体可提高其稳定性，增加水溶性。在使用过程中脂质体可递送至皮肤内并控制释放活性成分，提高活性成分的生物利用率。
(d)本发明还使用磷脂聚合物对脂质体表面进行改性处理，此聚合物具有高度亲水，可在基体材料表面进一步形成脂质双分子层涂层，以达到“钝化”表面的效果，此形成的生物惰性表面,可以阻止蛋白质和生物分子等的非特异性吸附作用,从而避免激活生物体中的一些不利反应,起到有效地抗感染和抗凝血等作用。
(e)本发明合成了一种新型的阳离子材料——巯醇基修饰的细胞穿膜肽，所用含巯基的小分子为甘氨酸衍生物硫普罗宁，采用多肽固相合成的方法，利用酰胺键将细胞穿膜肽与甘氨酸衍生物进行共价连接。用该材料制备的复合改性脂质体不仅可直接穿过细胞膜提高透皮效果，巯醇基内还具有稳定效应，经修饰能够通过巯醇基与细胞穿膜肽之间的交联增加形成的载体的稳定性，延长体内循环半衰期。
附图说明
图1为巯基修饰的细胞穿膜肽和新型磷脂聚合物复合改性眼用脂质体示意图；
图2为实施例1中制备的脂质体的粒径分布图；
图3为实施例1中制备的脂质体的zeta电位表征图；
图4为实施例1-2、对照例3中制备的脂质体的粒径随储存时间变化图；
图5为上皮细胞对脂质体摄取情况图；
图6为蛋白质吸附脂质体情况图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在对本发明进行具体详细的说明前，对本发明涉及的各个活性成分进行说明。
儿茶素：儿茶素是一组存在于茶树叶片中的黄酮类化合物，在体外和体内均表现出抗氧化和抗炎活性。作为天然的油脂抗氧化剂，抗氧化活性比维他命E还高，并且可以清除人体产生的自由基，抑制过氧化脂质的产生，以保护细胞膜、延缓皮肤老化，还有抗辐射以及紫外线的护肤功效。其抗菌作用可以抑制引起人类皮肤病的病菌，并且对治疗皮肤湿疹有很好的疗效。儿茶素参与治疗眼部疾病的功效，在人类角膜上皮细胞中，儿茶素剂量依赖性地抑制由IL-1β或高渗压诱导的多种细胞因子。此外，在DED小鼠模型中使用表没食子儿茶素没食子酸酯治疗与角膜上皮损伤。在护肤美容的同时达到治疗皮肤疾病的效果。
亚麻籽油：亚麻籽油不饱和脂肪酸含量高，对皮肤具有优良的亲和力和渗透力，所含多种脂肪酸容易被皮肤吸收，以补充皮肤所需的脂质养分，增加皮肤细胞膜的流动性，增强表皮细胞的水合和保湿作用，使皮肤保持光滑、柔润、细嫩而富有弹性，具有抗皮肤衰老和防晒的功能。具有调节血脂、抗炎、抗过敏及抗癌等多种生理功能和药用价值，是一种具有保健、药用功能的天然植物油。医学上通过口服和皮肤外用预防和治疗由于缺乏Omega-3系脂肪酸引起的各种皮肤功能紊乱、皮肤干燥、瘙痒等问题。在眼周可以保护泪液蒸发并滋养由干眼症导致的脂质层损伤。
维生素A：是一种皮肤“正常化”的调节剂，可活化皮肤细胞、促进细胞新陈代谢、在皮肤细胞分裂和发育方面有调节作用，产生更多的表皮蛋白、改进皮肤的锁水功能、改变和调节胶原的合成，有助于保持皮肤柔软和丰满、使皮肤光滑细腻和预防皮肤癌。在体内从不同环节对抗自由基对细胞的氧化损害，加强身体的抗氧化能力，在抗痘、控油、淡斑、抗老、修复光老化的功效广泛应用于化妆品领域。维生素A还是粘膜组织、视网膜光传导、骨代谢、生殖健康所必需的免疫因素。特别是在医药方面参与新陈代谢、生长和分化眼表上皮细，可以改善严重干眼病患者的症状，用于各种眼表疾病如DED、Stevens–Johnson综合征、药物诱发的假性类天疱疮和上边缘角膜结膜炎。
维生素B12：一般被称为造血维生素，具有肌肤再生的优越效果，肌肤疲惫、暗沉、干燥等问题肌肤；淡化因年龄增加所产生的细纹和皱纹。还适用于眼疲劳等眼部不适症状，在以滴眼液或肌肉注射的形式补充维生素B12后，严重干眼病合并或不合并神经性眼痛的患者的干眼症症状会有所改善。
磷脂聚合物，即1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱聚合物：该磷脂聚合物容易自发组织形成与生物膜非常相似的微观非均相涂层结构，因此该磷脂聚合物通常具有优异的血液相容性。对人体内的生理环境稳定，在各种酶的作用下，其降解产物可直接被人体吸收。
硫普罗宁是一种新型的含巯基甘氨酸衍生物，化学名为N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸，硫普罗宁能对抗各种肝损害，稳定肝细胞膜和线粒体膜，改善肝细胞结构和功能，对加快乙醇和乙醛的降解与排泄、阻止甘油三酯在肝内的堆积和肝纤维细胞的增生有重要作用，是一个很有前途的临床治疗药物。而且硫普罗宁含有巯基，能与某些自由基可逆性结合成二硫化物，激活铜、锌-SOD酶以增强其清除自由基的作用，在体内形成一个再循环的抗氧化系统。巯醇基内具有稳定效应，经修饰能够通过巯醇基与细胞穿膜肽之间的交联增加形成的载体的稳定性，延长体内循环半衰期。
实施例1
以质量百分比计，本实施例的适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液的原料组成包括：经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体20％，牛磺酸0.1％，月桂氮卓酮0.25％，丙二醇0.25％，水79.4％。
以质量百分比计，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的原料组成包括：氢化大豆磷脂30％、细胞穿膜肽材料2.5％、磷脂聚合物0.7％、儿茶素0.3％、维生素B120.1％、维生素A 0.3％、亚麻籽油0.5％、胆固醇4.7％、DSPE-PEG2000 2.3％、水58.6％。
细胞穿膜肽材料的制备过程为：称取50mg的DSPE-PEG2000-NHS和35mg的TAT用10mL去离子水室温溶解完全，室温搅拌混合6h；将混合反应液用截留分子量为1500Da的透析袋透析70h，透析液为去离子水，在冷冻干燥后，制备得粉末状DSPE-PEG2000-TAT。分别称取硫普罗宁85.4mg、HOBt 40.5mg和HBTU114 mg，加入约2ml DMF溶解；量取100mg的DIEA加入合成管中，室温振荡反应24h。向合成管中加入80mg的DSPE-PEG2000-TAT继续反应2h，之后用无水乙醚离心数次后，真空干燥生成粉末状细胞穿膜肽材料。
磷脂聚合物的制备过程为：
(1)将1.17mmol的1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油DSPG、2.35mmol三乙胺溶解在氯仿中，在室温下搅拌0.5h后，加入1.17mmol的2-溴异丁酰溴，室温搅拌反应24h，溶液用纯水过滤洗涤数次后，减压蒸发去除溶剂制备得白色粉末状引发剂DSPG-Br；
(2)0.1mmol的DSPG-Br溶于3mL二氯甲烷中，将2.5mmol的DOPC单体溶于9mL乙醇中，将两溶液混合均匀后加入0.1mmol的CuBr继续磁力搅拌反应30min，之后快速加入0.2mmol的三(2-吡啶甲基)胺(TPMA)，在60℃下搅拌24h进行聚合，再用装有纯水的截留分子量为3.5kDa的透析袋透析三天以去除杂质，最后通过冻干得到白色粉末状磷脂聚合物。
本实施例的适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液的制备方法包括步骤：
1)取类脂、细胞穿膜肽材料、磷脂聚合物、调节剂溶于适量溶剂，加入透皮吸收促进剂，另取活性成分加入到上述溶液中，加热超声溶解后，再旋蒸蒸除溶剂，得到薄膜；
2)称取赋形剂与水混合溶解后，再将旋蒸后薄膜与其混合，经高低温循环，使产物溶解，进行高压均质处理，得到含活性成分的脂质体的水溶液，即所述适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液。
步骤2)中水合均质过程具体为：将水合后的溶液在40℃水浴加热3min、涡旋2min、再冷藏5min高低温循环，直至产物完全溶解于水中；将水合后的原液在800bar条件下，高压均质5遍，制备得到所述适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液。
实施例2
以质量百分比计，本实施例的适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液的原料组成包括：经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体30％，L-天门冬氨酸钾1％，柠檬烯1.7％，丙二醇0.9％，水66.4％。
以质量百分比计，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的原料组成包括：神经鞘磷脂28.2％、细胞穿膜肽材料2.5％、磷脂聚合物0.7％、儿茶素0.75％、维生素B120.25％、维生素A0.75％、亚麻籽油1.25％、胆固醇5.1％、DSPE-PEG2000 1.9％、水58.6％。
细胞穿膜肽材料的制备过程为：称取50mg的DSPE-PEG2000-NHS和39mg的R11用10mL去离子水室温溶解完全，室温搅拌混合6h；将混合反应液用截留分子量为1500Da的透析袋透析70h，透析液为去离子水，在冷冻干燥后，制备得粉末状DSPE-PEG2000-R11。分别称取硫普罗宁85.4mg、HOBt 40.5mg和HBTU114 mg，加入约2mlDMF溶解；量取100mg的DIEA加入合成管中，室温振荡反应24h。向合成管中加入80mg的DSPE-PEG2000-TAT继续反应2h，之后用无水乙醚离心数次后，真空干燥生成粉末状细胞穿膜肽材料。
磷脂聚合物的制备过程同实施例1。
本实施例的适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液的制备方法包括步骤：
1)取类脂、细胞穿膜肽材料、磷脂聚合物、调节剂溶于适量溶剂，加入透皮吸收促进剂，另取活性成分加入到上述溶液中，加热超声溶解后，再旋蒸蒸除溶剂，得到薄膜；
2)称取赋形剂与水混合溶解后，再将旋蒸后薄膜与其混合，经高低温循环，使产物溶解，进行高压均质处理，得到含活性成分的脂质体的水溶液，即所述适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液。
步骤2)中水合均质过程具体为：将水合后的溶液在35℃水浴加热3min、涡旋2min、再冷藏5min高低温循环，直至产物完全溶解于水中；将水合后的原液在800bar条件下，高压均质5遍，制备得到所述适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液。
对照例1
与实施例1的区别仅在于脂质体的原料组成为：氢化大豆磷脂30％、磷脂聚合物0.7％、儿茶素0.3％、维生素B12 0.1％、维生素A0.3％、亚麻籽油0.5％、胆固醇4.7％、DSPE-PEG2000 2.3％、水61.1％。其余均相同。制备得到未经细胞穿膜肽材料修饰的脂质体乳液。
对照例2
与实施例1的区别仅在于脂质体的原料组成为：氢化大豆磷脂30％、细胞穿膜肽材料2.5％、儿茶素0.3％、维生素B12 0.1％、维生素A0.3％、亚麻籽油0.5％、胆固醇4.7％、DSPE-PEG2000 2.3％、水59.3％。其余均相同。制备得到未经磷脂聚合物修饰的脂质体乳液。
对照例3
与实施例1的区别仅在于脂质体的原料组成为：氢化大豆磷脂30％、DSPE-PEG2000-TAT 2.5％、磷脂聚合物0.7％、儿茶素0.3％、维生素B12 0.1％、维生素A 0.3％、亚麻籽油0.5％、胆固醇4.7％、DSPE-PEG2000 2.3％、水58.6％。其余均相同。制备得到细胞穿膜肽未经硫醇基修饰的脂质体乳液。
测试过程
1、粒径、zeta电位和包封率测试
取实施例1～2的脂质体乳液用去离子水稀释至10倍，用纳米粒度及zeta电位分析仪测定。
图2、图3展示了脂质体乳液的粒径分布和zeta电位表征结果。
用HPLC测定活性成分的检测波长和浓度-峰面积标准曲线，取制备的脂质体乳液用甲醇稀释超声破乳30min后，HPLC进样测定活性成分总含量W0；用超速离心法过滤后测定未被包封的活性成分含量W1，包封率＝(W0-W1)/W0×100％。
由下表1可知，脂质体粒径均在150～200nm之间，实施例1和实施例2的PDI均小于0.2，说明本发明制备的脂质体粒径较小，分散性良好，zeta电位绝对值都大于30mV，说明脂质体溶液稳定，上述方法制备得到的脂质体具有优良的包封率，均达到80％以上。而对照例3制备的脂质体中细胞穿膜肽未经巯醇基修饰，PDI值增大，且zeta电位绝对值略有减小，说明经巯醇基修饰后的细胞穿膜肽材料对脂质体改性后可能对其的稳定性能有一定的提升作用。
表1脂质体粒径、PDI、zeta电位及包封率测定结果
Figure BDA0003506501400000121
2、体外稳定性测试
图4展示了实施例1～2和对照例3脂质体乳液的体外稳定性测定，将脂质体乳液存放于棕瓶中，置于4℃冰箱保存，于第1、3、5、7、10、20、30、60天时分别测定脂质体的粒径。其中显示实施例1和实施例2的脂质体乳液在4℃下放置60天内的粒径大小微略增加，无太大变化，粒径均保持在180-210nm左右，证明在去离子水中有较好的体外稳定性。但对照例3制备的脂质体粒径变化起伏稍大，变化幅度可达40nm上下，说明未经巯醇基修饰的脂质体系统稳定性稍差，经巯醇基修饰后的脂质体稳定性能更好。
3、透皮测试
使用扩散池测定脂质体通过离体兔眼部皮肤的渗透性。将处死后的家兔眼周皮肤剪下，剪成直径约2cm的圆形小块，用手术刀去除皮下脂肪及结缔组织，放入生理盐水中4℃储存。将扩散池夹层水浴温度设定为32±0.5℃，接收液为生理盐水与乙醇以体积比为7:3的混合液将预处理好的皮肤固定于供给池和接收池之间，皮肤角质层朝向供给池，全程避光进行。
将脂质体乳液滴加到皮肤表面，接收池的磁子搅拌速度120rpm。24h后，将扩散池取出，用无水乙醇冲掉皮肤表面残留的物质，将皮肤用手术剪剪碎，用甲醇定容至25mL，超声破乳60min，测定滞留在皮肤中的活性成分含量。从接收液中取1mL，用HPLC进样法测定透过皮肤的活性成分含量。
滞留率＝滞留在皮肤中的活性成分含量/总活性成分含量×100％。
透过率＝透过皮肤的活性成分含量/总活性成分含量×100％。
表2脂质体透皮测定结果
Figure BDA0003506501400000131
由表2的实验结果可知，皮肤滞留率远远大于透过皮肤的量，这可能是因为本发明配方中以磷脂为载体，使脂质体具有一定的皮肤亲和性和生物相容性。而经过细胞穿膜肽修饰后的脂质体，其包裹的活性成分在皮肤中的滞留量明显大于未经修饰的，表明脂质体经过细胞穿膜肽修饰后具有更好地促进活性成分皮肤渗透的作用。综上所述，通过经细胞穿膜肽修饰的脂质体包裹后，其经皮行为整体较好，可以提高活性成分的皮肤滞留率。
4、上皮细胞对脂质体摄取情况的检测
使用尼罗红Nr对实施例1和对照例1中的脂质体进行荧光标记，制备方法只是在步骤1)旋转蒸发之前加入适量Nr于溶剂中，其它均按照实施例1、对照例1原来的步骤条件，即得到Nr标记的脂质体。
在24孔板中预先铺上无菌的圆形盖玻片，将上皮细胞在培养箱中培养24h后，换无血清培养液过夜。用PBS润洗2遍后，将含有Nr、Nr/对照例1和Nr/实施例1的无血清培养基加入24孔板中。37℃孵育3h后，用1000IU/mL肝素的PBS于冰上洗涤3次，去除细胞外未结合的物质。使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞对脂质体的摄取情况。
由显微镜图(图5)可知，各组在上皮细胞中均有荧光分布，Nr染料仅有微弱的分布，而Nr/对照例1组有少量的有色荧光，Nr/实施例1组荧光强度最强，表明本发明的脂质体包裹技术可适当提高胞内递送效率，而经细胞穿膜肽修饰后，可大大提高细胞膜的穿透效果。
5、血液中脂质体的蛋白质吸附测试
抽取适量实验兔的血液，用超速离心管离心出蛋白质血浆，将实施例1-2、对照例2制备的脂质体样品在室温血浆中孵育，脂质浓度为1mM，转速20rpm。60min后将含有脂质体的血浆转移到超速离心管中，用PBS溶液进行稀释，在4℃下10000rpm离心60min，重复洗涤3次后脂质体颗粒即分散在在PBS溶液中。使用微型蛋白检测试剂盒测定血浆中孵育的脂质体上的总蛋白浓度。
从图6中可以看出对照例2中未经磷脂聚合物修饰的脂质体蛋白质吸附量为300.6ug/mL，而实施例1-2经磷脂聚合物修饰后蛋白质吸附量明显较小，分别为91.2ug/mL和80.3ug/mL。说明脂质体进入人体后应该是被吸附的蛋白质在表面形成了软硬的蛋白质冠，而脂质体经过磷脂聚合物修饰后，可以减少与人血浆中蛋白质的结合，从而避免被吸附降解，延长体内作用时间。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种适用于眼部皮肤的细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体乳液，其特征在于，以质量百分比计，原料组成包括：
Figure FDA0003506501390000011
所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体，以质量百分比计，原料组成包括：
Figure FDA0003506501390000012
所述细胞穿膜肽材料的制备方法包括：称取DSPE-PEG-NHS和细胞穿膜肽，溶于去离子水室温下充分混合反应，DSPE-PEG-NHS作为连接剂，-NHS活化脂基团与细胞穿膜肽中裸露的氨基进行反应，所得混合反应液用截留分子量为1500Da的透析袋透析除杂，透析液为去离子水，最后冻干得到DSPE-PEG-细胞穿膜肽；分别称取含巯醇基的甘氨酸衍生物、1-羟基苯并三氮唑、N,N-二异丙基乙胺和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于无水N,N-二甲基甲酰胺震荡反应，然后向其中加入DSPE-PEG-细胞穿膜肽继续反应，之后用无水乙醚离心数次后，真空干燥生成粉末状的所述细胞穿膜肽材料；
所述细胞穿膜肽为阳离子型细胞穿膜肽，包括人类免疫缺陷病毒中的反式转录激活因子、多聚精氨酸肽中的至少一种；
所述含巯醇基的甘氨酸衍生物为硫普罗宁，包括R型、S型中的一种；
所述磷脂聚合物具有如下式(I)所示结构：
Figure FDA0003506501390000021
式(I)中，n为10～20的整数。
2.根据权利要求1所述的脂质体乳液，其特征在于，所述赋形剂为牛磺酸、L-天门冬氨酸钾、海藻糖中的一种；
所述透皮吸收促进剂包括月桂氮卓酮、有机醇和萜烯类的至少一种；
以所述脂质体乳液的总质量为100％计，所述脂质体乳液的原料组成中，含有月桂氮卓酮0.25％～1.5％，丙二醇0.25％～1.5％；
所述类脂包括氢化大豆磷脂、大豆卵磷脂、神经鞘磷脂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的脂质体乳液，其特征在于，所述细胞穿膜肽材料的制备方法中：DSPE-PEG-NHS和细胞穿膜肽的质量比为1:0.6～0.8，所述混合反应液中DSPE-PEG-NHS和细胞穿膜肽的总浓度为8～9mg/mL，硫普罗宁、N,N-二异丙基乙胺和细胞穿膜肽的摩尔质量比为3～3.5:6～7:1，硫普罗宁、1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的质量比为2.1～2.5:1:2.8～3.0。
4.根据权利要求1所述的脂质体乳液，其特征在于，所述磷脂聚合物为基于磷脂单体聚合而成的聚合物，所选单体为1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱，以DSPG-Br为引发剂利用原子转移自由基聚合法合成，具体合成方法包括步骤：
(1)将1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油、三乙胺在氯仿中混匀后，加入2-溴异丁酰溴，充分反应后过滤、洗涤、去除溶剂得到引发剂DSPG-Br；
(2)将DSPG-Br的二氯甲烷溶液和DOPC的乙醇溶液混匀后，加入CuBr反应25～35min，然后加入三(2-吡啶甲基)胺，55～65℃充分聚合，再用装有纯水的截留分子量为3.5kDa的透析袋透析以去除杂质，最后冻干得到所述磷脂聚合物。
5.根据权利要求1所述的脂质体乳液，其特征在于，所述活性成分包括儿茶素、维生素B12、维生素A和亚麻籽油；
以所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的总质量为100％计算，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的原料组成中，含有儿茶素0.3％～0.75％，维生素B120.1％～0.25％，维生素A 0.3％～0.75％，亚麻籽油0.5％～1.25％。
6.根据权利要求1所述的脂质体乳液，其特征在于，所述调节剂包括胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；
以所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的总质量为100％计算，所述经细胞穿膜肽/磷脂聚合物修饰的脂质体的原料组成中，含有胆固醇4.7％～5.4％，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1.6％～2.3％；
所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中，聚乙二醇链段的数均分子量为2000～5000。
7.根据权利要求1～6任一权利要求所述的脂质体乳液的制备方法，其特征在于，包括步骤：
1)取类脂、细胞穿膜肽材料、磷脂聚合物、调节剂溶于溶剂中，加入透皮吸收促进剂得到溶液A，另取活性成分加入到溶液A中并使活性成分充分溶解，再去除所述溶剂，得到薄膜；
2)取赋形剂、水混匀后，与所述薄膜混合并使薄膜充分溶解，然后进行高压均质处理，得到所述脂质体乳液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述溶剂包括乙醇、氯仿、甲醇中的至少一种；
步骤2)中：
采用高低温循环使薄膜充分溶解，所述高低温循环具体是指在高温35～40℃、低温0～5℃之间循环，高温处理时间为1～5min，低温处理时间为4～10min；
所述高压均质处理的参数条件是：300～800bar压力下，均质1～10次。
9.根据权利要求1～6任一权利要求所述的脂质体乳液在制备护肤品中的应用。
10.一种护肤品，其特征在于，原料组成中含有权利要求1～6任一权利要求所述的脂质体乳液。
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