CN107334739B - 一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉及其制备方法 - Google Patents
一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其原料组分包括成纤维细胞生长因子、丝素蛋白、磷脂、胆固醇、透皮吸收促进剂。本发明在脂质体冻干粉中添加透皮吸收促进剂，有效提高了成纤维细胞生长因子的透皮吸收，以增加毛囊药物分布，从而用于脱发的防治，同时该制剂可直接用生理盐水分散后喷雾在头皮处使用，也可加入凝胶基质中制备成脂质凝胶剂用于头皮涂抹，其具有显著的防治脱发效果。
Description
技术领域
本发明涉及精细化工领域，特别涉及一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉及其制备方法。
背景技术
皮肤由表皮、真皮、皮下脂肪以及皮肤附属器组成。皮肤主要经过三种途径吸收外界物质，即角质层、毛囊皮脂腺以及汗腺管口。正常情况下，皮肤仅吸收小分子亲脂性物质，对外界大分子蛋白类药物吸收十分有限。目前发现成纤维细胞生长因子如aFGF，bFGF，KGF，FGF-5，FGF-9等能诱导毛囊、皮脂腺、汗腺增殖再生的能力，具有防治脱发的能力。但由于其亲脂性差、分子量大，皮肤穿透性能差，不能有效达到正常皮肤组织的毛囊，使得其防治脱发效果不理想。目前尚没有bFGF的外用制剂可以使bFGF穿透皮肤角质层进入到皮肤组织。bFGF体外稳定性较差、体内半衰期短(约3min)且无特异性作用靶点，而通过增大药物剂量达到有效浓度必将导致较大的毒副作用，因此其临床应用受到了极大的限制。
脂质体可以包裹水溶性蛋白、多肽类药物，提高其稳定性、改善其脂溶性，提高组织穿透性能。在研究重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)作为口服用药时发现，以二棕榈酰磷脂酰胆碱为体制备的脂质体，抑制了酶的降解作用，而且在体内的穿透能力得到极大提高。张三泉等发表了关于鬼臼毒素经脂质体包裹后，与游离药物溶液相比能显著提高其经毛囊、皮脂腺吸收比例的报道(中国皮肤性病学杂志2003年9月第17卷第5期)。包裹生长因子的脂质体应用于皮肤时，可促进药物穿透角质层，并在皮肤中蓄积，提高局部浓度。中国专利(申请号：2012105242236.6)公开了利用薄膜水化法制备脂质体包裹表皮生长因子提高生长因子皮肤深层吸收，防治脱发。该专利配方中没有加入透皮吸收促进剂，而单纯脂质体促进生长因子皮肤渗透作用有限。
乙醇脂质体是一种生物相容性很好的表面活性剂，可改善大分子多肽、蛋白类药物在皮肤中的分配系数，使药物的经皮渗透性获得显著提高。为了促进人重组酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)在外用给药时可以穿过角质层有效地进入真皮层内，冯苏云等将rhaFGF包裹在乙醇脂质体，结合微针技术，促进酸性成纤维细胞生长因子有效地透过角质层，使rhaFGF外用给药促进皮肤增殖，加速皮瓣扩张成为可能(中国美容医学2012年7月第21卷第7期)。但在该乙醇脂质体中，乙醇体积分数高达20％以上，乙醇的存在对生物药物活性，尤其是对有机溶剂特别敏感的生长因子的影响是不容忽视的。
透皮吸收促进剂，是能够促进药物更快或更多地透入皮肤内或透过皮肤进入循环系统，从而发挥局部或全身治疗作用的一类物质。近年来使用月桂氮酮、胆酸钠、丙二醇、癸基甲基亚砜、十二烷基亚砜、二甲基亚砜、二甲替乙酰胺等透皮吸收促进剂，能改善各种物质的透皮吸收性。与此相类似的现象为电子穿孔现象，其原理是通过制造暂时开放的细胞膜裂孔，介导药物向细胞内的转入，有利于药物通过完整皮肤。其中，氮酮化学名称为：1-正十二烷基氮杂环庚烷酮-2，其在低浓度时能极大增强亲水性或疏水性的化合物的透皮作用。毛晓春等报道了氮酮能促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞，并且在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性(眼视光学杂志2007年9月第9卷第5期)。然而无法保证加入氮酮后对包裹药物仍具有良好的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种防止脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其具有良好的生长因子透皮吸收效果和稳定性，同时提供了该脂质体冻干粉的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其原料组分包括成纤维细胞生长因子、丝素蛋白、磷脂、胆固醇、透皮吸收促进剂。
作为上述方案的进一步改进，所述成纤维生长因子与丝素蛋白形成凝胶内核，所述磷脂与胆固醇构成双分子脂质膜。进一步地，所述凝胶内核与双分子脂质膜的重量比控制在0.01～100:100范围内，其优选的重量比为0.01～50:100，该重量比可使最终脂质体中成纤维细胞生长因子的高包封率兼具良好的稳定性。
作为上述方案的进一步改进，所述凝胶内核中丝素蛋白与成纤维细胞生长因子的重量比控制在10:90～99:1范围内，其优选重量比为99:1～60:40；所述双分子脂质膜中磷脂与胆固醇的重量比控制在50:50～100:0.01范围内。具体地，丝素蛋白与成纤维细胞生长因子的重量比控制在99:1～60:40范围内，可使包裹的成纤维细胞生长因子活性维持在80％以上。而磷脂与胆固醇的重量比控制在50:50～100:0.01范围内，可使制备得的脂质体具有较好的球形度。
作为上述方案的进一步改进，所述成纤维细胞生长因子选自重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组牛碱性成纤维生长因子、重组人酸性成纤维细胞生长因子中的至少一种。
作为上述方案的进一步改进，所述磷脂选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、合成磷脂中的至少一种。
作为上述方案的进一步改进，所述透皮吸收促进剂选自月桂氮酮、胆酸钠、丙二醇、癸基甲基亚砜、十二烷基亚砜中的至少一种。
作为上述方案的进一步改进，所述透皮吸收促进剂占脂质体冻干粉总重量的0.01～20％。
本发明所采取的另一个技术方案是：一种如上所述的防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉的制备方法，其包括如下工艺步骤：
1)将成纤维细胞生长因子加入到丝素蛋白水溶液中，在0～30℃温度条件下混均，后置于冷冻干燥机中冻干成粉末，保存在冰箱中备用；
2)将步骤1)所得粉末溶解于蒸馏水中，得水相，将磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂中，得油相，在0～30℃温度条件下将水相与油相混合搅拌，经超声乳化得W/O型乳液；
3)将W/O型乳液转移至旋转蒸发仪中，在5～40℃温度条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质体凝胶；
4)将步骤3)所得脂质体凝胶与生理盐水共混，在0～30℃温度条件下搅拌脱模、超声整粒，得脂质体混悬液；
5)在步骤4)所得的脂质体混悬液中加入透皮吸收促进剂，在0～30℃温度条件下高压乳匀、冻干，得脂质体冻干粉成品。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述的丝素蛋白水溶液中丝素蛋白浓度为0.01～20％，进一步地，优选丝素蛋白水溶液的浓度为0.1～5％。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述有机溶剂选自乙醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿、石油醚中的其中一种。
作为上述方案的进一步改进，步骤5)中所述高压乳匀过程中的压力控制在40～300Mpa范围内，匀质次数为3～15次。
本发明的有益效果是：
(1)本发明在脂质体冻干粉中添加透皮吸收促进剂，有效提高了成纤维细胞生长因子的透皮吸收，以增加毛囊药物分布，从而用于脱发的防治，同时该制剂可直接用生理盐水分散后喷雾在头皮处使用，也可加入凝胶基质中制备成脂质凝胶剂用于头皮涂抹，其具有显著的防治脱发效果。
(2)本发明利用丝素蛋白预先复合成纤维细胞生长因子，再以磷脂与胆固醇构成膜材，利用W/O反向胶束法，制备水相内核脂质体模板，后经在体超声处理诱导水相内核凝胶转变，制备具有凝胶内核的脂质体混悬液，从而不仅提高了最终成品的透皮吸收能力，而且提高了其包裹成纤维细胞生长因子的稳定性。
附图说明
图1a是本发明对比例制备所得的普通脂质体的粒径分布图；
图1b是本发明实施例1制备所得的脂质体冻干粉的粒径分布图；
图2a是本发明对比例制备所得的普通脂质体冻干粉的透射电镜图；
图2b是本发明实施例1制备所得的脂质体冻干粉的透射电镜图；
图3是本发明实施例1制备所得的脂质体冻干粉与对比例制备所得的普通脂质体的皮肤穿透滞留率的比较图；
图4是本发明实施例1制备所得的脂质体冻干粉的皮肤分布图；
图5是本发明对比例制备所得的普通脂质体的皮肤分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
对比例
称取磷脂90mg与胆固醇10mg，加入二氯甲烷10mL，室温溶解形成均匀的油相溶液；另将bFGF溶于4℃的磷酸盐缓冲溶液(10mM)，配置浓度为1mg/mL的bFGF水溶液作为水相；在0～30℃温度条件下将3mL水相与10mL油相混合搅拌，经超声乳化得W/O型乳液；将W/O型乳液转移至旋转蒸发仪中，在5～40℃温度条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质体凝胶；加入生理盐水5ml，在0～30℃温度条件下搅拌脱模，在0～30℃温度条件下150MPa高压乳匀7次、冻干，得脂质体冻干粉成品。
实施例
本发明中防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉的制备方法，其包括如下工艺步骤：
1)将成纤维细胞生长因子加入到丝素蛋白水溶液中，在0～30℃温度条件下混均，后置于冷冻干燥机中冻干成粉末，保存在冰箱中备用；
2)将步骤1)所得粉末溶解于蒸馏水中，得水相，将磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂中，得油相，在0～30℃温度条件下将水相与油相混合搅拌，经超声乳化得W/O型乳液；
3)将W/O型乳液转移至旋转蒸发仪中，在5～40℃温度条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质体凝胶；
4)将步骤3)所得脂质体凝胶与生理盐水共混，在0～30℃温度条件下搅拌脱模、超声整粒，得脂质体混悬液；
5)在步骤4)所得的脂质体混悬液中加入透皮吸收促进剂，在0～30℃温度条件下高压乳匀、冻干，得脂质体冻干粉成品。
根据本发明调整防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉中各原料组分配比及制备方法中的工艺参数，得到如下表1所示的实施例1～12脂质体冻干粉成品。
表1实施例1～12脂质体冻干粉成品各原料组分配比及制备方法中的工艺参数
注：PE(石油醚)；DCMS(癸基甲基亚砜)；Azone(月桂氮酮)；PG(丙二醇)；DOMS(十二烷基亚砜)
实施例13：脂质体表征
(1)粒径测定：将实施例1～12制备得的成品与对比例制备的成品分别经10mM PBS分散后，再分别利用NICOMP 380粒径测定仪与JEM-2000透射电镜测其粒径与形态，粒径结果如表2和附图1a、1b和附图2a、2b所示。可见，所制备脂质体成品粒径在99.5nm～800nm间，其中对比例制备得的成品(粒径为95.5nm)，实施例1制备得的成品具有较大的粒径，其粒径为99.8nm，透射电镜呈现出明显的凝胶内核结构。磷脂与胆固醇重量比对维持脂质体球形形态维持具有重要的影响，控制磷脂与胆固醇的重量比在50∶50～100∶0.01范围内，所制备的脂质体具有较好的球形度。
(2)包封率测定：实施例1～12制备得的成品与对比例制备的成品，10mM PBS分散后，取1mL脂质体混悬液加入到1.5ml EP管中，12000rpm离心15min，取100μL上清液，适当稀释后，ELISA分析上清液中未包裹的碱性成纤维细胞生长因子的浓度，根据以下公式计算包封率：包封率＝[(总加入的碱性成纤维细胞生长因子重量-未包裹生长因子重量)/(总加入的碱性成纤维细胞生长因子重量)]×100％。结果如表2所示，当丝素蛋白凝胶核与脂质膜材重量比在0.01∶100～50∶50时，成纤维细胞生长因子包封率在65％～99％间，尤其是当丝素凝胶与脂质膜材重量比控制在0.01∶100～50∶100时，包封率均在80％以上。
表2对比例和实施例1～12脂质体粒径、包封率实验结果
实施例14：脂质体稳定性
采用MTT法检测其37℃放置2周前后对HaCaT细胞增殖的影响，评价脂质体制剂体外活性保持百分数。其中HaCaT细胞培养液按体积比为89％RPMI-1640培养基、10％FBS和1％青-链霉素配制，细胞接种于10cm培养皿，置于温度37℃，5％CO2的培养箱内培养。取对数生长期HaCaT细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，接种于96孔板，每孔约5000个细胞，孵育24h后，分别加PBS(对照样)、对比例成品、实施例1～12成品以及bFGF溶液处理，孵育72h，对照样不予处理，对比例成品、实施例1～12成品以及bFGF溶液，培养72h后，每孔加入5.0g·L-1MTT溶液20μL，继续培养4h，吸弃上清，每孔加DMSO150μL，水平摇床混匀，与酶标仪490nm波长处测定吸光度A，以对照样细胞生存率为100％，计算其他组的细胞生存率。细胞存活率＝测试样/对照样×100％。bFGF活性保持百分数＝细胞存活率(放置2周后)/细胞存活率(放置前)×100％，其结果如下表3所示。可见，脂质体内丝素蛋白对生长因子活性维持具有重要的意义，随着丝素蛋白与成纤维细胞生长因子重量比增加，FGF活性保持百分数提高，控制丝素蛋白与成纤维细胞生长因子重量比在99:1～60:40间，其活性能维持在80％以上。
实施例15：体外促毛囊生长实验
在解剖镜下选取完整的大鼠毛囊。将分离完整的毛囊培养在35mm小培养皿内，体外培养毛囊的生长速度的检验分5组，每组10根毛囊，实验组常规培养液6～7ml(含2ml谷氨酰胺)。以实施例1～12成品直接分散在5ml 10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)作为受试组，毛囊常规培养液作为阴性对照组。加入测试溶液100μL后，31℃、一定湿度的培养箱内培养，每天在倒置显微镜下观察毛囊生长情况，拍照并测量生长长度。以培养8天后，测量的毛囊长度减去第1天毛囊长度，计算培养过程中体外毛囊生长长度(mm)，其结果如下表2所示。
实施例16：动物促毛发生长实验
C57BL/6J小鼠脱发模型的建立用剃毛刀剃，用硫化钠涂抹于小鼠背部两侧，诱导毛发进入生长期，脱毛，诱导长除C57BL/6J小鼠背部的毛发，面积约为2cm×3cm，然后按说明书涂抹脱毛膏，去除残留的毛发，确认C57BL/6J小鼠毛发生长处于休止期(皮肤呈粉色)，以建立C57BL/6J小鼠脱发模型。C57BL/6J小鼠随机分成对照组、阳性对照组和受试脂质体组，每组10只，每日分别涂抹超纯水、5％米诺地尔酊、对比例成品一次，每次0.2mL，连续涂抹21天。以实施例1～12成品直接分散在5ml 10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)作为受试组。以无毛发生长且脱毛区皮肤呈肉色为0分，浅毛长满脱毛区且皮肤呈灰色为1分，新生毛长度与密度约为未脱毛区的一半而且脱毛区皮肤呈黑色为2分，新生长与未脱毛区无别并且脱毛区皮肤呈黑色为3分。给药21天后，取C57BL/6J小鼠背部脱毛区皮肤，用20mm打孔器于每鼠脱毛区相同位置取圆形皮片，用手术刀刮下皮片上所有体毛，分析天平称重，计算各组C57BL/6J小鼠毛发重量的均值，其结果如下表3所示。
表3脂质体稳定性、体外促毛囊生长、动物促毛发生长实验结果
实施例17：皮肤穿透滞留率测定
将实施例16中经对比例bFGF脂质体成品和实施例1成品处理过的小鼠，给药21天后取下皮肤，用生理盐水洗去残留的制剂，用滤纸吸干，剪取扩散区域的皮肤，称取100mg皮肤组织后剪碎，加入生理盐水1mL，匀浆，10000rpm/min离心10min，取上清液，ELISA测定，计算滞留在皮肤组织的bFGF的百分含量，测定结果如附图3所示，其中实施例1成品处理的皮肤穿透滞留率明显大于bFGF溶液对照组；另取小鼠背部皮肤，10％多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，bFGF抗体染色，其皮肤bFGF分布结果如附图4和附图5所示。由图可见，相比对比例bFGF脂质体处理皮肤，实施例1脂质体处理组皮肤显示出更多的bFGF分布。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (8)
1.一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其特征在于：原料组分包括成纤维细胞生长因子、丝素蛋白、磷脂、胆固醇、透皮吸收促进剂；所述成纤维细胞生长因子与丝素蛋白形成凝胶内核，所述磷脂与胆固醇构成双分子脂质膜；所述凝胶内核与双分子脂质膜的重量比为0.01～50:100；所述凝胶内核中丝素蛋白与成纤维细胞生长因子的重量比为99:1～60:40；所述双分子脂质膜中磷脂与胆固醇的重量比控制在50:50～100:0.01范围内。
2.根据权利要求1所述的一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子选自重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组牛碱性成纤维生长因子、重组人酸性成纤维细胞生长因子中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其特征在于：所述透皮吸收促进剂选自月桂氮酮、胆酸钠、丙二醇、癸基甲基亚砜、十二烷基亚砜中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉，其特征在于：所述透皮吸收促进剂占脂质体冻干粉总重量的0.01～20％。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：
1)将成纤维细胞生长因子加入到丝素蛋白水溶液中，在0～30℃温度条件下混均，后置于冷冻干燥机中冻干成粉末，保存在冰箱中备用；
2)将步骤1)所得粉末溶解于蒸馏水中，得水相，将磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂中，得油相，在0～30℃温度条件下将水相与油相混合搅拌，经超声乳化得W/O型乳液；
3)将W/O型乳液转移至旋转蒸发仪中，在5～40℃温度条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质体凝胶；
4)将步骤3)所得脂质体凝胶与生理盐水共混，在0～30℃温度条件下搅拌脱模、超声整粒，得脂质体混悬液；
5)在步骤4)所得的脂质体混悬液中加入透皮吸收促进剂，在0～30℃温度条件下高压乳匀、冻干，得脂质体冻干粉成品。
6.根据权利要求5所述的一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的丝素蛋白水溶液中丝素蛋白浓度为0.01～20％。
7.根据权利要求5所述的一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述有机溶剂选自乙醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿、石油醚中的其中一种。
8.根据权利要求5所述的一种防治脱发的成纤维细胞生长因子脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述高压乳匀过程中的压力控制在40～300Mpa范围内，匀质次数为3～15次。
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