CN103169658A - 成纤维细胞生长因子-10脂质体制备及在毛发再生中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有成纤维细胞生长因子一10的脂质体的制备方法及其在治疗脱发疾病中的应用。本法采用薄膜分散一冻干再水化法，将FGF—10包裹起来，增加了蛋白稳定性和其对皮肤渗透力，提高其在体内生物利用度。涂抹给药后可透皮吸收直接作用于毛囊生长的关键部位达到治疗效果，更有利于脱发疾病的治疗。该脂质体还可用于生物美容及烧烫伤、难愈性溃疡的治疗。

Description

成纤维细胞生长因子-10脂质体制备及在毛发再生中的应用

技术领域

本发明涉及一种含有成纤维细胞生长因子一10(FGF—10)蛋白的，用于治疗脱发疾病的脂质体的制备及应用，属生物医药领域。 

背景技术

作为皮肤的附属器官，毛发具有重要的生理学与社会学功能。毛发缺失或异常分布尽管没有生命之忧，但因其严重影响患者的外观形象，会导致患者心理负担过大，使得他们在激烈的社会竞争和人才竞争中处于非常不利的地位，对社会交往和患者心理健康的影响不容否认。随激烈的社会竞争和环境日益恶化，毛发疾病呈上升势态。据世界毛发再生协会发布的对全球80多个国家的调查显示，全球大概有27．3％的人面临着头发再生障碍问题困扰，发达国家高于世界平均水平。欧洲最高达到44．3％，而亚洲国家中，中国比率高达36．8％，位居亚洲各国之首。 

脱发治疗类药物市场分析研究报告表明在全球OTC市场上，生发剂治疗用药占皮肤外用药总体市场份额的7％，已达4．8亿美元，其年均增长率达17％，高于世界OTC药物市场8％的年均增长率。目前国内外用于治疗脱发的药品主要有以下三种，米诺地尔溶液剂、安体舒通乳液、非那雄胺片。其中米诺地尔是唯一被美国FDA批准治疗脱发的OTC药物。该药物经头皮吸收后可以扩张头皮下血管，改善毛囊周围的微循环，减少毛囊周围的炎症细胞浸润，延缓上皮基质细胞的衰老，从而使萎缩的毛囊肥大并促进毛发的生长，使毳毛变成终毛。但它主要是针对雄激素性脱发有较好的疗效，且具有一定的副作用包括刺激皮肤、可能引致皮肤红疹、痕痒等。其它生发产品包括中药及化妆品类等治疗效果不明显，主要原因是药物或其他产品透皮吸收性能差，作用物质到达不了病灶部位或浓度极其微量，治疗效果甚微甚至无效。 

随基因工程技术的日益发展，发现成纤维细胞生长因子-10(Fibroblast GrowthFactor-10，FGF-iO)等生长因子类蛋白在人体外实验和动物体内外实验中对毛发的生长有明显的调节作用，己成为该领域研究的热点。成纤维细胞生长因子一10是由成纤维细胞和其它间充质来源的细胞分泌，能与表达于上皮细胞激酶受体FGFR2IIIb和FGFRiIIIb相结合，通过问质上皮相互作用的旁分泌方式发挥作用。其专一靶细胞是表皮细胞，能刺激所有皮肤内的表皮基本单位包括头发毛囊、皮脂腺、汗腺生长。FGF一10在人体外实验和动物体内外实验中对毛发的生长有明显的调节作用。但在应用时，即使毛囊细胞仍然存在的情况下，生物活性 物质的作用总是不理想。主要原因是毛囊生长的关键部位在毛母质和毛乳头，但生物活性物质稳定性差，并在皮肤局部外用难以穿透皮肤角质层及毛囊细胞膜到达毛囊毛球部发挥其作用。因此，如何解决蛋白类药物的稳定性及透皮吸收达到促毛囊生长的有效部位是开发此类药物的关键性问题。 

毛发疾病的治疗主要存在两个重要问题，一方面病变局限于有毛部位，若全身给药到达皮肤局部的药物浓度极其有限，而若要使局部达到理想治疗浓度，势必会引起全身毒副作用；另一方面局部给药，由于透皮吸收性能差，药物到达不了病灶部位或浓度极其微量，治疗效果甚微甚至无效。因此兴起研究具有良好透皮性能的外用药物制剂如脂质体剂型，它能够介导各种分子特异性进入皮肤和细胞膜，使外源蛋白直接到达病灶部位，充分发挥其功效。本研究首次将FGF-IO制备成脂质体新剂型，用于脱发疾病的治疗，不仅可以透皮吸收直接作用于毛囊生长的关键部位毛母质和毛乳头，达到治疗效果，同时还延长外源蛋白的稳定性及在体内的作用时间。结果表明，对脱发疾病具有巨大的潜在治疗价值，可开发成为针对雄激素性脱发、斑秃、脂溢性脱发及放化疗后的脱发等修复治疗作用的产品。发明内容 

本发明通过利用脂质体制剂能介导各种分子特异性进入皮肤和细胞膜的特性，增加了脂质体结合的生物活性蛋白FGF-iO在体内外稳定性及其对皮肤渗透力，提高了其在毛囊生长的关键部位毛母质和毛乳头的生物利用度。本项目旨在提供一种制备方法简单、治疗周期短、效果显著的治疗脱发疾病的方法。 

本发明目的是提供FGF-iO脂质体制备方法。 

本发明进一步目的是在于提供FGF-iO脂质体在脱发疾病中的应用。 

本发明还可应用于生物美容及烧烫伤、难愈性溃疡的临床治疗。 

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的： 

本发明FGF—10脂质体成冻干粉状态，有助于生物蛋白及脂质体的稳定性。应用时加缓冲溶液使其变成脂质体溶液后涂抹，易在皮肤上滞留，并具缓释作用。同时本产品对皮肤无刺激性及无毒副作用。 

本发明提供了一种重组人成纤维细胞生长因子一10脂质体的制备方法。按照发明的实施例方案，大豆磷脂重量(g／m1)1．0％～5．0％、胆固醇重量(g／m1)0．25％～1．25％，优选大豆磷脂2．0％、(g／m1)胆固醇O．5％(g／m1)制备磷脂膜。低分子量肝素重量(mg／m1)O．1％～1．O％，优选0．5％(mg／m1)作为保护细胞活性，并减缓其释放。作为磷脂溶解剂无水乙醇体积为(ml／m1)100％～200％，优选100％(ml／m1)。作为冻干过程中的赋形剂和保护剂，甘露醇重量 (g／m1)2％～10．0％，优选5％(g／m1)。缓冲溶液可选择pH6．5左右的0．9％生理盐水或20miVlPBS溶液。 

在本发明的脂质体剂型中，重组人成纤维细胞生长因子-10每lOOml含量为lmg～lOmg，优选5mg／100ml。 

本发明还提供了脂质体的制备方法，包括通过旋转蒸发制备磷脂膜及0．9％生理盐水或20mMPBS溶液水化洗膜后4。C孵育过夜；采用微射流法，使脂质体粒径均匀，并通过滤膜整粒，制备成空白脂质体；将空白脂质体溶液与FGF-iO、低分子量肝素混合，37℃水浴旋转孵育，0．22社m滤膜除菌过滤加入5％甘露醇作为赋形剂混和均匀，分装，冻干，制备成成纤维细胞生长因子-10脂质体剂型。 

本发明具有以下优点： 

1．本发明采用薄膜分散一冻干再水化法制备成纤维细胞生长因子-10脂质体剂型，能够提高大分子生物蛋白的包封率，更好地保持蛋白的稳定性。 

2．本发明脂质体制剂用缓冲液溶解后易在皮肤上滞留，并具有良好透皮性能，能够介导FGF-IO蛋白特异性进入皮肤和细胞膜，使其直接到达病灶部位，充分发挥其功效，并在一定程度上起到缓释作用，延长药物的半衰期，使其作用更加持久。 

3．本发明产品可直接涂抹于脱发的部位，无需进行微创导入，减轻了患者使用时的顾虑，增加患者的依从性和便于使用。 

4．本发明配伍合理，可达到稳定负载FGF-iO蛋白于脂质体中，并保持其生物活性、延缓释放的作用，促进毛囊的生长。采用的组分均对皮肤无毒副作用、无刺激性，便于清洁。 

附图说明

图1  C57BL／6小鼠在给药第13天毛发生长状况 

图2 C57BL／6小鼠在给药第18天毛发生长状况 

图3 C57BL／6小鼠在给药第13天脱毛区皮肤组织病理学检查 

图4C57BL/6小鼠在给药第18天脱毛区皮肤组织病理学检查 

A：正常对照组  B：rhFGF-10脂质体组(50μg/ml)  C：rhFGF-10脂质体组(10μg/ml) 

D：rhFGF-10溶液组(50μg/ml)  E：rhFGF-10溶液(10μg/ml)  F：阳性对照组(5％米诺地尔溶液组) 

G：0.9％生理盐水对照组  H：空白脂质体对照组 

1：rhFGF-10脂质体组(50μg/ml)2：rhFGF-10脂质体组(10μg/ml) 

3：阳性对照组(5％米诺地尔溶液组)4：rhFGF-10溶液组(50μg/ml) 

5：rhFGF-10溶液(10μg/ml)6：0.9％生理盐水对照组 7：空白脂质体对照组 

具体实施方式

实施例1 生产加载FGF-10的脂质体

[0025] 称取大豆卵磷脂、胆固醇，加乙醇并加热至55。C超声，使其充分溶解，移入茄型瓶中， 55。C，减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在茄型瓶侧壁，并使乙醇溶剂完全挥发。为将生物蛋白包裹在脂质体中，常压下，加一定比例的生理盐水(或20mIMPBS溶液)，通过旋转洗膜至水合完全，并4。C孵育过夜。采用微射流法，开始时控制压力为50-60 MPa(粒径较大，故压力小些)，第2次开始，压力增加至120 MPa，反复操作，使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再依次通过0．45扯m，0．22 u m滤膜整粒、除菌。将空白脂质体溶液与FGF-iO、低分子量肝素混合，37。C水浴旋转孵育30min，并过O．22 p m滤膜。加入终浓度为5％的甘露醇作为赋形剂混和均匀，分装，冻干即得。加入低分子量肝素是因为FGF-IO为肝素亲和性生长因子，具有特异的糖胺聚糖一蛋白质相互作用，可达到稳定负载于载体材料中，并保持其生物活性、延缓释放的作用，对细胞的生长、迁移具有调节作用。 

实施例2测定脂质体的大小和粒径分布 

采用透射电镜法对脂质体样品进行观察，发现脂质体形状较规则，呈圆球形或椭圆球形颗粒，大小较均一。使用自动激光粒度分析仪，采用激光衍射法进行脂质体粒度分析可知，粒子平均直径约为176nm，绝大部分分布在150～200nm之间。粒径形态与分布完全符合脂质体的相关要求。 

实施例3测定脂质体中FGF-iO的包封率 

采用凝胶色谱法(葡聚糖凝胶Sephadex G5)，即利用脂质体与游离药物分子粒径大小的差异进行分离，在波长280nm处测定脂质体和游离药物吸光度。腊质体粒径较大先被洗脱，游离的药物粒径较小后被洗脱从而达到分离效果。通过对径高比、洗脱流速、上样量等影响分离条件的优化，使脂质体达到最大程度的分离。对空白脂质体对照液进行回收率试验，回收率为99．5％，含药脂质体的回收率为100．3％，显示该方法能准确的测定游离药物的量。计算得到样品平均包封率为78．5％±2．8％。 

实施例4测定脂质体中FGF-IO的生物学活性 

采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定脂质体活性。收集培养至对数期的NIH 3T3细胞，调整细胞悬液浓度，接种于96孔细胞培养板中，使待测细胞密度为8000—10000个／孔。37℃、5％C02培养箱中孵育至细胞贴壁，换饥饿培养基(低糖DMEM+O．5％PBS)，饥饿培养18 h。加入标准品溶液、含药脂质体样品及空白脂质体做阴性对照，37。C、5％C02培养箱中孵育48小时。每孔加入25弘l MTT溶液(5 mg／m1)，继续培养4 h。倒掉液体，每孔加150社1二甲基亚砜混匀后，在酶标仪上以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，计算供试样品的生物学活性。 

实施例5测定加载FGF-iO的脂质体的稳定性 

通过测定脂质体的Zeta电位、不同温度及时问下包封率、生物学活性的变化情况，对脂 质体的稳定性进行测定。 

表1 FGF一10脂质体的Zeta电位测定 

结果表明：FGF-iO脂质体带负电荷，空白脂质体的Zeta电位为一27。7mY，FGF—10高低剂量脂质体的Zeta电位分别为-45．7mY和-43．3mv，体系较稳定。 

表2 F6F—lO脂质体的包封率变化 

条件

O天

1天

5天

10天

20天

30天

60天

90天

4。C

78．5

78．3

77．5

76．2

75．0

73．5

70．3

65．2

25。C

78．5

78．0

75．3

71．1

65．6

57．3

48．2

37．1

37。C

78．5

74．2

63．2

42．3

10．g

-

-

-

结果表明，含药脂质体包封率在室温或较高温度下条件下，稳定性差，包封率明显降低。低温条件对脂质体的存放无明显影响。 

表3 FGF-iO脂质体的生物学活性变化(×10⁵IlJ／mh) 

条件

O天

1天

5天

10天

20天

30天

60天

90天

4。C

5．631

5．832

5．782

5．631

5．697

5．645

5．583

5．482

25。C

5．631

5．976

5．582

5．235

4．851

4．231

2．887

0．865

37。C

5．631

4．855

3．121

1．054

0．245

-

-

-

结果表明，FGF-IO脂质体在4。C下，生物活性影响较小；室温长期放置生物活性有一定程度降低；较高温度条件对其生物活性影响较大，短时间放置即可导致FGF一10脂质体生物学活性显著降低。 

实施例6  在脱毛的C57BL／6小鼠实验模型中证明含FGF-iO的脂质体制剂对毛发的促生长作用。 

实验动物模型制备：采用7周龄的雄性C57BL／6小鼠，体重控制在2l克～23克。小鼠饲养3天适应环境后，经异氟烷吸入麻醉后，在其背部制作4×3cm²的脱毛区，先用宠物推剪将实验区毛发推短至3—5 mm，再涂抹脱毛膏，作用3 min后用刮匙轻轻(以免损伤皮肤)刮去毛发，再用纯净水清洗实验区，除去残余的脱毛膏。 

实验动物分组：造模次日，选取造模成功的小鼠和正常的小鼠称量体重，利用SPSS 18．0 统计软件根据初始体重进行随机分组。 

第1组一正常对照组，未脱毛、未治疗。 

第1I组一脂质体供试品高剂量组，脱毛，rhFGF．10脂质体(50 μg／m1) 

第1II组一脂质体供试品低剂量组，脱毛，rhFGF-10脂质体(10 μg／mi) 

第Ⅳ组一原液供试品高剂量组，脱毛，rhFGF．10原液(50μg／mi) 

第V组一原液供试品高剂量组，脱毛，rhFGF．10原液(10 μμg／mi) 

第Ⅵ组一阳性对照组，脱毛，5％米诺地尔组(50 mg／m1) 

第Ⅶ组一对照组1，脱毛，0．9％生理盐水组 

第Ⅷ组--x寸照组2，脱毛，空白脂质体组。 

每组均由8只小鼠组成，每日给药1次，连续给药18天。每次给药前先用O．g％生理盐水清洗实验区，再用无菌棉棒进行实验区皮肤涂抹给药。阳性对照组组每次涂抹lml，其余组每次涂抹300 u 1。 

测定毛发生长水平：在给药第l天，各组小鼠脱毛区皮肤光滑、红润，无红肿、损伤现象出现，无残损毛发存在；在给药第7天，C57BL／6小鼠背部皮肤变黑，第13天，大部分给药组小鼠脱毛区毛发均呈现生长状态，第18天脂质体给药组小鼠基本恢复到正常毛发长度水平，且毛发质量较未脱毛区域相比更黑、更亮、更粗壮。 

表4不同给药组C57BL／6小鼠背部皮肤变黑及长出毛发的只数的统计(第10天) 

表5不同给药组C57BL／6小鼠背部皮肤变黑及长出毛发的只数的统计(第13天) 

表中的结果表明，空白脂质体对毛发的生长与生理盐水组相仿，无促毛发生长作用；含药脂质体组与含药溶液组相比，具有显著的促进皮肤变黑及毛发生长作用：图中的结果进一步说明脂质体能介导生物活性蛋白透皮吸收直接作用于毛囊生长的关键部位，更有效地促进毛发生长(图1、图2) 

实验动物脱毛区皮肤组织病理学检查：通过腹膜注射过量戊巴比妥钠(250mg／Kg)将动物处死，去除脱毛区的毛发，摘除皮肤，并且在4％多聚甲醛中固定，并随后包埋在石蜡中保存。切片，进行HE染色。 

组织病理切片结果显示，在100倍光镜下，FGF-iO脂质体给药组和阳性药对照组给药第13天，真皮及皮下组织中可见大量新生毛囊及新生的内毛根鞘，无毛囊萎缩变小现象，胶原纤维正常；第18天毛囊向下生长至皮下，趋于成熟，皮肤亦无脂肪浸润及炎症现象出现。FGF一10溶液给药组真皮及皮下可见较多新生毛囊，并且在真皮及皮下的交界处有大量毛囊，说明毛囊处于新生到成熟的过度状态，还未成熟，真皮厚度由毛发快速生长期(变厚)向正常水平恢复(未恢复到正常厚度)。0．9％生理盐水组和空白脂质体对照组真皮处可见大量新生毛囊，真皮厚度处于最厚阶段(毛发快速生长期)(图3、图4)。 

Claims (7)

1.一种含有成纤维细胞生长因子-10(FGF一10)的治疗脱发的脂质体制备方法。以lOOml脂 

质体制备量计，其组成配方为： 

①大豆卵磷脂    1．Og～5．Og； 

②胆固醇    0．25～1．25 g； 

③低分子量肝素    100 μg～1000 μg； 

④乙醇    100～200ml： 

⑤FGF一10原液lmg～lOmg； 

⑥甘露醇    2．Og～10．0g 

⑦其余为0．9％生理盐水(或20mMPBS溶液)。 

2.根据专利要求1所述的含有成纤维细胞生长因子一10(FGF一10)的治疗脱发的脂质体制备优选方法，以lOOml脂质体制备量计，其组成配方为： 

①大豆卵磷脂    2．Og； 

②胆固醇    0．5 g； 

③低分子量肝素    500μg； 

④乙醇lOOml； 

⑤FGF一10原液    5mg； 

⑥甘露醇    5．Og 

⑦其余为0．9％生理盐水(或20mMPBS溶液) 。

3.根据专利要求1或2说述的含有成纤维细胞生长因子一10(FGF-IO)的治疗脱发的脂质体制备方法，其特征是所述的成纤维细胞生长因子一10选用重组人成纤维细胞生长因子-10。 

4.根据专利要求1或2所述的含有成纤维细胞生长因子一10(FGF-IO)的治疗脱发的脂质体制备方法，其特征是，所述的FGF一10脂质体剂型使其具有透皮功能。 

5.根据专利要求1或2所述的含有成纤维细胞生长因子-10(FGF一10)的治疗脱发的脂质体制备方法是： 

磷脂膜制备：称取大豆卵磷脂、胆固醇，加乙醇并加热至55°C超声，使其充分溶解，移入茄型瓶中，55。C，减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在茄型瓶侧壁，并使乙醇溶液完全挥发； 

水化：常压下，加一定比例的生理盐水，在一定温度、转数下洗膜至完全。 

孵育：4℃孵育过夜。 

空白脂质体溶液制备：采用微射流法，逐步增加压力，反复操作，使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再依次通过0．45 pm，0．22 p．m滤膜整粒、除菌。 

含药脂质体溶液制备：将空白脂质体溶液与FGF一10、低分子量肝素混合，37。C水浴旋转孵育30min，0．22 μμ滤膜过滤。 

冻干：加入甘露醇作为赋形剂混和均匀，分装，冻干。 

6.根据专利要求1～5包含常规脂质体或与该脂质体相结合的成纤维细胞生长因子-10的局部用药制剂，其中所述脂质体包括不同含药剂量，在毛发损伤区深处组织中提供高的成纤维细胞生长因子-10蛋白的生物利用度，并且可用于脱发疾病的治疗。 

7.根据专利权要求1～5所述制备的含有成纤维细胞生长因子一10(FGF-iO)的脂质体，其特征是，还可应用于生物美容及烧烫伤、难愈性溃疡的治疗。 

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