CN101491498B

CN101491498B - 一种aFGF脂质体、制备方法及其应用

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Publication number: CN101491498B
Application number: CN2008100260022A
Authority: CN
Inventors: 黄亚东; 李校堃; 项琪; 苏志坚; 赵文; 张卉
Original assignee: Medical And Biological Technology Research And Development Center Jinan Univ G
Current assignee: Medical And Biological Technology Research And Development Center Jinan Univ G
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2028-01-25
Also published as: CN101491498A

Abstract

本发明涉及药物制剂及化妆品领域，具体涉及一种aFGF脂质体、制备方法及其应用。该aFGF脂质体包括以下组分及含量(重量百分数)：aFGF 1.2％～3.5％，保护剂20％～25％，大豆磷脂4.5％～6.5％，胆固醇2.3％～3.3％。此种aFGF脂质体可作为半成品制备成各种药用的剂型或添加到不同剂型的美容护肤品中，与现有技术相比，本发明产品可明显提高aFGF稳定性，促进皮肤对aFGF的吸收和利用，具有与人体同源性高，安全性高，亲和力强，无毒副作用，适用范围广的优越特点。用于急慢性创面修复，烧伤等开放性创伤、溃疡、褥疮、糖尿病或感染等原因造成的难愈性创面的治疗，同时也适用于粘膜创伤、烫伤及皮肤美容治疗后的修复。

Description

一种aFGF脂质体、制备方法及其应用

背景资料：

人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞，具有广泛的生物学活性，主要分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨等器官或组织内，在其它组织中含量很少。FGF可促进血管生成、创伤愈合、骨骼修复、溃疡愈合、眼晶状体再生、神经组织修复、神经突起的生长以及胚胎的发育与分化。创伤愈合在临床上经常遇到的难题是，烧伤等开放性创伤、溃疡、褥疮、糖尿病或感染等原因常会造成创面愈合障碍。因此，如何缩短治疗时间、提高愈合质量是目前临床上待解决的课题。研究证实，aFGF和bFGF可促进各种组织损伤的修复，改善伤口的愈合。此外，与表皮生长因子(EGF)相比较，EGF可促进I型胶原的合成，导致瘢痕疙瘩形成；而FGF能通过对α I型前胶原基因表达的下行调节作用，抑制成纤维细胞的胶原合成，减少成纤维细胞的胶原蛋白的过量沉积，有助于防止瘢痕疙瘩的产生。因而应用aFGF和bFGF治疗烧伤创面和慢性难愈性伤口(如：褥疮、慢性感染的伤口，糖尿病、营养缺乏症、类固醇化病人的伤口，以及放射性伤口等)，有着广阔的前景，可提高这类病人的伤口愈合速度和质量，进而提高患者的生活质量。

aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)是一种多功能强力的细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。临床试验证明：aFGF对皮肤光泽、滋润、柔软、减皱等综合效果评价，其有效率达到93％，对祛粉刺、祛色斑、增白、改善皮肤弹性、损伤皮肤修复等综合效果评价，有效率达到95％。如果体内或皮肤组织中细胞因子缺乏或者失去生理平衡，不但会促进和加快皮肤老化的过程，而且还会使正常皮肤组织出现一系列生理功能障碍，甚至诱导病理性皮肤问题的出现。正是由于aFGF的独特生理作用和生物效应，使它成为最有潜力的新型产品，为美容业带来了极其广阔的美好前景。

但是，由于aFGF本身具有常温稳定性差，易降解，易失活；生物利用度低、半衰期短、代谢迅速等缺点，在常规剂型应用中存在诸如稳定性差、给药方式单一、用药损伤大、生物利用度低等众多缺点。现今市售的aFGF主要有冻干制剂和液体制剂，尚未见其他剂型报道。脂质体做为多肽、蛋白类药物的载体，具有众多优点和用途，已被广泛应用于制药和化妆品中。现今，国外许多知名企业纷纷以不同方式介入脂质体药物的市场开发，并涌现了一批专门从事脂质体研究开发的公司如：INEX公司、Biomira公司等，它们均拥有自己的脂质体专利技术和产品。与此同时，各类脂质体新药纷纷上市，并迅速扩大国际医药市场。近年来，伴随生物技术的蓬勃发展，多肽、蛋白类药物脂质体产品的开发也取得了巨大的进步，如BemaBiotech公司采用Virosome技术，在脂质体的磷脂双分子层上嵌入病毒膜蛋白，制备脂质体疫苗。已经成功开发Inflexal V流感疫苗和Epaxal甲肝疫苗两个产品。是奥地利的Polymun 公司，以交叉流注射(cross-flow injection)技术研究了可产业化的人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体。在我国，多肽蛋白类药物脂质体的开发也取得了可喜的成就，截至到2006年，我国已经先后批准口服尿激酶脂质体冻干品、人降钙素基因相关肽脂质体注射液、重组干扰素α2b脂质体乳膏和注射用尿激酶脂质体冻干品等四个多肽、蛋白类药物脂质体产品。

本专利将酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)制备成脂质体，可作为原料，辅以其他的活性物质及辅料，制备成常用的药剂形态发挥aFGF的药效，或者与其他生物美容活性物质如透明质酸等一起，通过相应的制备工艺，制成水剂、霜剂、乳剂等护肤品，达到皮肤损伤的快速修复，皱纹的修复与祛皱，防晒、辐射检验后的护理，敏感性皮肤护理、各类疤痕的祛除修复等功效。

发明内容：

本发明的一个目的是利用脂质体对aFGF进行保护。脂质体包裹aFGF进入脂质囊泡后，可有效避免aFGF与外界环境(如酸碱度等)的直接接触失活。对aFGF起到较好的保护作用。

本发明的另一个目的是利用脂质体的细胞亲和性与生物相容性提高aFGF的利用率。脂质体囊泡具有类似生物膜脂质双分子层结构，对正常细胞和组织无损害和抑制作用，并可长时间吸附于靶细胞周围，使aFGF能向靶细胞透过，aFGF脂质体也能通过融合进入细胞内，经溶酶体消化释放出aFGF，提高疗效。

本发明的另一个目的是利用脂质体缓慢释药的特性实现aFGF的长效作用。脂质体的脂质囊泡具有贮存药物的作用，制成aFGF脂质体后给药，药物的释放需要先透过磷脂膜因此释放缓慢持久。

本发明提供了一种aFGF脂质体，包含1.2％～3.5％重量的aFGF、4.5％～6.5％重量的磷脂、2.3～3.3％重量的胆固醇、和20～25％重量的保护剂。

在本发明中，所述的aFGF选自基因工程发酵纯化提取的aFGF，其宿主菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)rosatta、BL21(DE3)plyss，优选BL21(DE3)菌株。

按照本发明，所述的磷脂为天然大豆磷脂、氢化磷脂、合成磷脂双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)等，优选氢化磷脂或DSPE-PEG2000。

本发明的脂质体可以为混悬液的形式，进一步包含高分子材料如0.5％～3％的PVP作为助悬剂。其中所述的脂质体平均粒径为100-300nm，优选200nm。

本发明的脂质体可以为冻干产品的形式，进一步包含甘露醇。

本发明还提供了一种根据权利要求1所述的aFGF脂质体的制备方法，包含以下步骤：

(1)利用LB培养液发酵，菌体破碎液通过阳离子交换层析、肝素亲和层析柱、HPLC进行分离，收集的aFGF蛋白；

(2)加入磷脂与胆固醇混匀后，加无水乙醇溶解得脂质溶液，蒸发，制成脂质薄膜；

(3)脂质薄膜水溶液水合，震荡，或将(2)中的脂质溶液直接与水溶液震荡混合，制成脂质分散水溶液；

(4)将脂质分散水溶液经超声、乳化、过滤；

(5)调节脂质分散水溶液pH值至6.8，与aFGF及蛋白保护剂孵育，滤膜过滤，得aFGF脂质体溶液。

本发明还涉及aFGF脂质体在制备用于治疗急慢性创面修复，烧伤等开放性创伤、溃疡、褥疮、糖尿病或感染等原因常会造成创面愈合药物制剂中的应用。按照本发明，所述的药物制剂优选为透皮药物制剂。

本发明还涉及上述的aFGF脂质体在美容中的应用。

实例一aFGF脂质体的制备(一)

称取一定量的大豆卵磷脂和胆固醇，溶于无水乙醇中，于50℃恒温水浴减压旋转蒸发，抽至无水乙醇挥尽，形成均匀薄膜，加入一定浓度的柠檬酸溶液适量，50℃恒温水浴温育2h，间歇超声分散，过0.22μm微孔滤膜整粒，适量aFGF原液与保护剂混合后加入，溶液调pH为6.8，37℃孵育20min，即得。

实施例二aFGF脂质体的制备(二)

将脂质体成膜剂(磷脂和胆固醇按照重量比4∶1)加入烧杯中，加入2-6倍量的氯仿溶解，将溶液加入茄形瓶中，在35-45℃水浴中加热减压旋转干燥，挥尽有机溶剂，加入含有aFGF、右旋糖苷和PEG4000的缓冲盐溶液(pH 6.8)，4℃水化12h，冰浴下间断超声10min，0.22μm微孔滤膜超滤，分装，加入甘露醇冻干，即得。

实例三aFGF脂质体的稳定性研究

分别将上述3批aFGF脂质体、aFGF水溶液于温度40℃、相对湿度75％条件下密闭放置。于放置后0、1、2、3月。分别用ELISA法测定脂质体和水溶液中aFGF的含量，以0月时脂质体和水溶液中aFGF含量为100％，其它各时间药物含量与之作比较，得出药物含量随时间变化百分率，结果表明，经温度40℃、相对湿度75％条件下，放置3个月，aFGF在脂质体中药物含量变化不大，而aFGF在水溶液中药物含量降低，证实aFGF用脂质体包封后，能明显提高药物的稳定性。

表1.不同条件下aFGF脂质体的包封率(％)考察

表2.不同条件下aFGF脂质体的物理稳定性考察(％)

表3.不同条件下aFGF脂质体的生物学活性考察(×10⁵IU/mL)

实施例4：aFGF脂质体对糖尿病大鼠深二度烫伤创面愈合的作用实验方法

1、实验动物及分组

SPF级SD大鼠78只，雌雄各半(广州中医药大学实验动物中心提供，合格号：SCXK(粤)2003-0001粤监证字2006A014，八周龄，体重220-270g，所有动物随机分成7组，每组12只：aFGF脂质体(实施例1)高、中、低三个剂量组；空白脂质体组(空白基质组)；aFGF原液组(阳性对照组)；生理盐水组(阴性对照组)；正常组。

大鼠于暨南大学动物饲养室适应性饲养一周，自由饮水、饮食。实验前禁食12小时，自由饮水。

2、糖尿病大鼠烫伤模型的制备

大鼠予65mg/kg体重STZ(以无菌枸橼酸-枸橼酸钠镁液配成2％溶液，pH4.5)，腹腔内一次注射诱导糖尿病，注射一周后尾静脉采血，检测随机血糖水平和体重变化；若诱导剂注射前基础血糖＜8.9mol/L，诱导后血糖水平＞11.2mol/L，大鼠体重明显下降，随机抽样的胰腺组织学观察证实胰岛细胞被破坏即可视为糖尿病模型成功。诱导成功二月后，实验大鼠经3％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(剂量：1.5mL/Kg体重)，用脱毛剂(8％Na₂S)大鼠背部净毛，面积为6cm×5cm。用自制大鼠烫伤器(铜制，直径1.8cm圆形烙铁)于100℃开水中煮沸10min后迅速在距大鼠背中部脊柱两侧1.5cm处，各烫一个圆形创面，每只大鼠两个创面，直径1.8cm，面积2.54cm²，烫伤时间30s。损伤程度为深II度。

3、给药

3.1给药方法：①取配制好的高剂量组、中剂量组、低剂量组aFGF脂质体混悬液(120μg/ml，25μg/ml，5μg/ml)，aFGF原液(25μg/ml)和空白脂质体混悬液100μL，用微量移液器均匀滴加于烫伤创面，涂抹均匀。模型组以生理盐水代替药物涂抹于创面。②上药5min后，创面用灭菌凡士林纱布包扎，各组烫伤后当天即开始给药，以后隔天换药一次，至第24天创面完全愈合。③各组动物分笼饲养，自由摄食，饮水。

4.药效学评价方法

4.1创面观察

4.1.1创面形态观察

于烫伤后第3天、7天、14天、21天、24天肉眼观察烫伤创面炎症状况。

4.1.2创面愈合时间

从烫伤后即开始计时，记录各组创面愈合时间。

4.1.2创面动态愈合率

于烫伤后第3天、7天、14天、21天、24天，采用透明膜描记称量法，计算创面愈合百分率。

4.2组织病理形态学评价

于烫伤后第7天、14天、21天处死动物，取烫伤创面全层皮肤及周围1cm²正常皮肤用10％甲醛固定，HE染色观察组织病理变化。

5、统计学分析方法

采用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学处理。结果以

表示，两因素析因设计资料

采用其方差分析进行统计分析，组间均数差异显著性以q检验判别；成组设计资料采用t检验进行统计分析。P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异非常显著。

结果

1.创面观察

1.1创面形态观察

1.1.1创面愈合基本情况：大鼠经烫伤后日常活动及饮食未见异常。1d内可见烫伤部位形成水泡，创面整体发白，组织略有淤血，但烫伤面无明显界限。第3天见烫伤面颜色加深，界限明显，并逐渐形成深色硬痂。3～5天开始痂皮边缘翘起、上翻。第7～9天开始有痂皮脱落。随着治疗的进行，烫伤面逐渐缩小至完全愈合，新生表皮组织逐渐形成。

1.2创面愈合时间

表4给出了不同试验组创面愈合时间数据，试验数据显示：aFGF脂质体高、中剂量组、空白脂质体(基质)组和aFGF原液(阳性对照)组的创面愈合时间较阴性对照组有显著提前(P＜0.01)，创面愈合时间较阴性对照组分别提前4.2天、5.0天、3.3天和3.8天；aFGF脂质体低剂量组的创面愈合时间与阴性对照组比较有差别(P＜0.05)创面愈合时间较阴性对照组提前2.1天；aFGF脂质体高剂量组创面愈合时间与aFGF原液(阳性对照)组相近；aFGF脂质体中剂量组的创面愈合时间较空白脂质体(基质)组有明显提前(P＜0.05)创面愈合时间较空白脂质体(基质)组提前1.7天。另外，aFGF脂质体中剂量组的创面愈合时间较高剂量组提前；显示：aFGF中剂量给药创面愈合有明显提早。

表4.创伤愈合时间(d，

)(n＝4)

与阴性对照比较：^*P＜0.05 ^**P＜0.01；与空白脂质体比较：⁺P＜0.05 ⁺⁺P＜0.01

1.3创面动态愈合率

以烫伤后第3天时的创面面积为原始创面面积，计算其他各时相点的创面愈合百分率，实验结果见表5-2。

表5.创伤愈合率(％，

)

与阴性对照比较： ^*P＜0.05 ^**P＜0.01；与空白脂质体比较：⁺P＜0.05 ⁺⁺P＜0.01

分析表5中数据可以看出：①烫伤后第7天组中，aFGF脂质体中剂量组的创面愈合率显著性高于阴性对照组(P＜0.01)和空白脂质体(基质)组(P＜0.05)的创面愈合率；②烫伤后第14天时，aFGF脂质体中剂量组、aFGF脂质体高剂量组和aFGF原液(阳性对照)组的创面愈合率显著性高于阴性对照组(P＜0.01)。aFGF脂质体中剂量组和aFGF脂质体高剂量组的创面愈合率显著性高于空白脂质体(基质)组(P＜0.01)；③烫伤后第21天时，aFGF脂质体中剂量组、阳性对照组、aFGF脂质体高剂量组、aFGF脂质体低剂量组的创面愈合率显著性高于阴性对照组(P＜0.01)。另外，空白脂质体(基质)组的创面愈合率也较阴性对照组有显著性差异(P＜0.05)；④烫伤后第24天时，给药组创面愈合基本完全，仅有阴性对照组创面尚未全愈。aFGF脂质体中剂量组、aFGF脂质体高剂量组和aFGF原液(阳性对照)组的创面愈合率显著性高于阴性对照组(P＜0.05)，aFGF脂质体中剂量组的创面愈合率显著性高于空白脂质体(基质)组(P＜0.05)。

Claims

1.一种aFGF脂质体，其用作透皮药物制剂，包含1.2％～3.5％重量的aFGF、4.5％～6.5％重量的磷脂、2.3～3.3％重量的胆固醇、和20～25％重量的保护剂。

2.根据权利要求1所述的aFGF脂质体，其中所述的aFGF选自基因工程发酵纯化提取的aFGF，其宿主菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)rosetta和BL21(DE3)plyss。

3.根据权利要求1所述的aFGF脂质体，其中所述的磷脂选自天然大豆磷脂、氢化磷脂、合成磷脂双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。

4.根据权利要求1所述的aFGF脂质体，其中所述的脂质体为混悬液的形式，进一步包含高分子材料作为助悬剂。

5.根据权利要求1所述的aFGF脂质体，其中所述的脂质体平均粒径为100-300nm。

6.根据权利要求1所述的aFGF脂质体，其中所述的脂质体为冻干产品的形式，进一步包含甘露醇。

7.一种根据权利要求1所述的aFGF脂质体的制备方法，包含以下步骤：

(1)利用LB培养液发酵，菌体破碎液通过阳离子交换层析、肝素亲和层析柱、HPLC进行分离，收集aFGF蛋白；

(4)将脂质分散水溶液经超声、乳化、过滤；

8.根据权利要求1所述的aFGF脂质体在制备用于急慢性创面修复，开放性创伤、溃疡、褥疮、糖尿病或感染原因造成的难愈性创面治疗的透皮药物制剂中的应用。

9.权利要求1所述的aFGF脂质体在美容中的应用。