CN106491486A - 一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液及其制备方法和在化妆品中的应用 - Google Patents

一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液及其制备方法和在化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，包括如下步骤：S1：通过剖腹产手术分娩的脐带血获取自体血浆，分离单个核细胞并冷冻备用；S2：将步骤S1制备的物质进行细胞裂解、去除细胞碎片制备脐带血干细胞衍生液；S3：对步骤S2制备的脐带血干细胞衍生液进行质量检测，选取无病毒的脐带血干细胞衍生液；S4：称取卵磷脂、胆固醇、S‑80乳化剂于梨形瓶内混匀后，加入乙醚制备成干膜；再加入吐温80、脐带血干细胞衍生液、磷酸盐缓冲液，制备得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液。其优点是：从脐带血中提取脐带血干细胞衍生液，再采用脂质体包裹技术，将脐带血干细胞内的活性因子封装于类脂双分子层内形成微型泡囊体，提高活性因子的稳定性。

Description

一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液及其制备方法和 在化妆品中的应用
技术领域
本发明属于护肤品技术领域，具体地说是一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液及其制备方法和在化妆品中的应用。
背景技术
随着社会生活水平的不断提高，人们对自身美的追求也不断提高，尤其是日常生活护肤美容愈加重视；而市场上所出售的护肤品不具有生物活性，不能从根本上改善表皮细胞的生存环境和新陈代谢，对于外界因素造成的皮肤损害没有修复作用，尤其不适宜皮肤敏感或孕妇使用，再者，其中多含有乙醇、着色剂、铅汞等对人体皮肤有害的物质；
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，脐带血中含有大量的干细胞，干细胞是生命的种子，它会分化成人体的各种细胞——血液细胞，神经细胞，骨骼细胞等等；干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体，其通过分裂维持自身细胞的特性和数量，也可进一步分化为各种组织细胞，在组织修复等方面发挥积极作用；
因此，如何将脐血干细胞应用至护肤品中，同时解决现有技术中，干细胞活性因子在加工、储存、运输过程中，易导致蛋白降解，因子失活的问题，是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是研制易于皮肤吸收、全面补充细胞营养，使处于休眠、损伤的成纤维干细胞被激活并修复成熟分化大量成纤维细胞，增加胶原分泌，改善皮肤弹性的一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液及其制备方法和在化妆品中的应用；
一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，包括如下步骤：
S1：通过剖腹产手术分娩的脐带血获取自体血浆，分离单个核细胞并冷冻备用；
S2：将步骤S1制备的物质进行细胞裂解、去除细胞碎片制备脐带血干细胞衍生液；
S3：对步骤S2制备的脐带血干细胞衍生液进行质量检测，选取无病毒的脐带血干细胞衍生液；
S4：按照4:1：0.1～0.5的质量比称取卵磷脂、胆固醇、S-80乳化剂于梨形瓶内混匀后，加入乙醚制备成干膜；再加入吐温80、步骤S3制备的脐带血干细胞衍生液、磷酸盐缓冲液，制备得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液。
一种通过上述制备方法制备的含脐带血干细胞衍生物的脂质体混悬液。
一种上述含脐带血干细胞衍生物的脂质体混悬液在化妆品中的应用。
本发明一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液及其制备方法和在化妆品中的应用，其优点是：
1、从脐带血中提取脐带血干细胞衍生液，再采用脂质体包裹技术，将脐带血干细胞内的活性因子封装于类脂双分子层内形成微型泡囊体，提高活性因子的稳定性；
2、由于脐带血干细胞分泌的各种生长因子能渗透到胶原纤维变形断裂的地方，并作用于真皮层的成纤维干细胞，以补充细胞营养，因此，将脐带血干细胞衍生液应用到化妆品当中，可使得处于休眠、损伤的成纤维干细胞被激活、修复并成熟分化大量的成纤维细胞，增加胶原分泌，改善皮肤弹性；
3、将脐带血干细胞衍生液制备为脂质体的形式，再应用至化妆品中，便于存储、运输，同时，可增加皮肤纤维原细胞制造的胶原蛋白与纤维原细胞的体积。
附图说明
图1为脐带血干细胞衍生液的SDS-PAGE蛋白胶电泳图；
图中M为未添加脐带血干细胞衍生液的样品，
1为脐带血干细胞衍生液；
2为含二分之一脐带血干细胞衍生液样品，
3为含四分之一脐带血干细胞衍生液样品，
图2为不同浓度脐带血细胞衍生液对皮肤生纤维细胞增殖的影响；
图3为脐带血细胞衍生液对紫外光损的皮肤成纤维细胞修复的影响
且图2、图3中a、b、c、d、e、分别表示如下含义：
a、空白对照组，b、培养基阴性对照组，c、1％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组，d、3％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组，e、10％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组；
图2中横坐标上的数字表示天数；
图4为紫外光损的皮肤成纤维细胞加入各浓度脐带血细胞衍生液24h照片；
图5为脐带血细胞衍生液活性成分的透皮吸收能力测定，
其中，f为未加入天然促渗剂冰片的脐带血细胞衍生液的上清蛋白浓度；
g为加入1‰浓度天然促渗剂冰片的脐带血细胞衍生液的上清蛋白浓度。
具体实施方式
一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，包括如下步骤：
S1：通过剖腹产手术分娩的脐带血获取自体血浆，分离单个核细胞并冷冻备用；
优选地，步骤S1中，包括如下步骤：
S11：取脐带血于离心管内，离心、灭活补体、水浴，再离心去除纤维蛋白，转移上清液至另一无菌离心管，即获得自体血浆，--20°C保存备用；
进一步地，步骤S11中，在2400～2600rpm的转速下离心8～13min后，在53～70℃条件下灭活补体27～35min，再水浴10～20min；
进一步地，通过2400～2600rpm的转速离心去除纤维蛋白。
S12：加入PBS稀释步骤S13制备的自体血浆；再取稀释后的自体血浆至含聚蔗糖的离心管内1500～2120rpm离心28～35min，离心后吸取白膜层至装有PBS的离心管中，再离心两次以去除血小板，沉淀、重悬，获得单个核细胞血浆重悬液，冷冻备用；
优选地，步骤S12中，离心两次具体为：2110rpm*15min第一次洗涤离心，1500rpm*10min第二次洗涤离心；
优选地，步骤S12中，冷冻温度为－80℃；
S2：将步骤S1制备的物质进行细胞裂解、去除细胞碎片制备脐带血干细胞衍生液；
优选地，步骤S2中，包括如下步骤：
S21：将步骤S1制备的物质置入37℃水浴锅中充分融化、-80℃环境下冷冻至少1h，重复3～5次，使样品中的细胞完全裂解，释放出细胞内的各种活性物质；
S22：将步骤S21经裂解、冻融后的物质离心去除细胞碎片，取上清液过0.22μm滤膜除菌后冷冻备用，获得脐带血干细胞衍生液。
优选地，步骤S22中在2400～2600rpm的转速下离心8～13min；优选为2500rpm*10min。
优选地，冷冻温度为-80℃。
S3：对步骤S2制备的脐带血干细胞衍生液进行质量检测，选取无病毒的脐带血干细胞衍生液；
优选地，步骤S3中，所述的质量检测为无菌检测、总蛋白检测等；
优选地，步骤S31中，无菌检测为：用无菌水稀释5倍脐带血干细胞衍生液，再将稀释后的脐带血干细胞衍生液涂步无抗性的LB平板和血液琼脂平板，48h后观察结果；
S4：按照4:1：0.1～0.5的质量比称取卵磷脂、胆固醇、S-80乳化剂于梨形瓶内混匀后，加入乙醚制备成干膜；再加入吐温80、步骤S3制备的脐带血干细胞衍生液、磷酸盐缓冲液，制备得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液。
优选地，步骤S4中，加入的吐温80的量与所添加的S-80乳化剂的质量比为1：1～2；
优选地，步骤S4中加入的脐带血干细胞衍生液的量为0.1～1ml；
优选地，步骤S4中加入的磷酸盐缓冲液的量为2～10ml；
优选地，步骤S4中，干膜的制备具体为，加入乙醚后振摇，于旋转蒸发仪上30℃蒸干成膜；
优选地，步骤S4中，加入磷酸盐缓冲液后，旋转10～20min，使膜溶解，再超声15～30min使溶液透明，加入PBS至10.00ml后，置入-20℃环境下12h以上后取出，使其自然融化后再超声5～10min，即获得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液；进一步地，加入PBS的pH为6.5。
以下就实施例对上述方法作进一步说明：
实施例一：
一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，包括如下步骤：
S1：
采集剖腹产手术分娩的脐带血(每份约100～200ml)；每管30ml平均分装到1支50ml离心管中离心2500rpm*10min，快升慢降；在56℃条件下灭活补体30min，再水浴15min，2500rpm*20min离心去除纤维蛋白，转移上清液至另一无菌离心管，即获得自体血浆，--20°C保存备用；每管加25mlPBS稀释自体血浆，留样作乙肝五项、梅毒、艾滋、丙肝检测；
再取30ml稀释后的自体血浆至含15ml聚蔗糖的离心管内2110rpm*30min，快升慢降，再用巴氏管吸取白膜层至装有30ml PBS的离心管中，2110rpm*15min第一次洗涤离心，留样计数；1500rpm*10min第二次洗涤离心(去除血小板)，由此获得较纯的脐带血单个核细胞；
再将上述获得的脐带血单个核细胞(含干细胞)沉淀，每管用制备好的3ml血浆重悬，一份脐带血最终可获得10～20ml单个核细胞血浆重悬液，集合到一个50ml离心管中冻存于-80℃冰箱备用。
S2：收集25～50份脐带血(传染病检测为阴性)的单个核细胞血浆重悬液，从-80℃冰箱中取出后置于37℃水浴锅中，完全融化后再冻于-80℃冰箱至少1个小时，如此反复3～5次，使样品中的细胞完全裂解，释放出细胞内的各种活性物质。冻融完成后，2500rpm*10min去除细胞碎片。上清过0.22μm滤膜除菌，每管4ml分装冻存于-80℃冰箱中备用，即为脐带血干细胞衍生液。
S3：
对上述所获得的每批次干细胞衍生液都需取一支冻存样品进行质量控制：
无菌检测：样品用无菌水稀释5倍后涂布无抗性的LB平板和血液琼脂平板，48h后观察结果。
总蛋白检测：从-80℃冰箱取出样品后，加入等体积2×Loading Buffer。充分震荡混匀后放入干式加热槽中100℃加热5-15min，进行SDS-PAGE蛋白胶电泳，电泳结果如图1所示，衍生液的主要活性成分为小分子蛋白质，易于被皮肤吸收；(如图1)
同时，用BCA法测每批次的总蛋白含量，干细胞衍生液蛋白浓度约为3～10mg/ml。
S4：按照体积比4:1：0.1～0.5称取卵磷脂、胆固醇、S-80乳化剂于梨形瓶内混匀后，加入10ml乙醚、振摇，于旋转蒸发仪上30℃蒸干成膜；再加入吐温80，且S-80乳化剂与吐温80的比例为1：1～2、加入0.1～1ml步骤S3制备的脐带血干细胞衍生液、2～10mL磷酸盐缓冲液，旋转15min,使膜溶解,超声20min使溶液透明,最后补充pH 6.5的PBS至10.00ml，制备得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液。
实施例二、将采用上述方法获得的脐带血干细胞衍生液对皮肤成纤维细胞增殖影响的测定
具体方法如下：
皮肤成纤维细胞按1×104/孔接种于96孔板，6复孔接种，分为：空白对照组a、培养基阴性对照组b、1％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组c、3％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组d组、10％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组e五组；共接种3块96孔相同的培养板，观察3天，每天检测一块板。空白对照组不接种细胞，仅加无血清培养液，阴性对照组为细胞加无血清培养液；
第二天开始检测，每孔加入CCK8 20μl，2h后酶标仪测细胞吸光值，观察细胞的生长状况。结果如图2所示：脐带血干细胞衍生液能够促进皮肤生纤维细胞的增值，随着脐带血干细胞衍生液浓度的加大，其促增殖的作用也越强。当加入10％脐带血干细胞衍生液的时候，第3天的细胞量约为阴性对照组的3倍左右；说明脐带血干细胞衍生液含有丰富的促纤维细胞生长因子，能够促进该细胞的增殖。
实施例三、脐带血干细胞衍生液对紫外光损的皮肤成纤维细胞增殖和修复的影响的测定
皮肤成纤维细胞按1×104/孔接种于96孔板，6复孔接种，分为：空白对照组a、培养基阴性对照组b、1％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组c、3％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组d组、10％浓度脐带血细胞衍生液活性成分组e五组。共接种3块96孔相同的培养板，第1块接受15分钟的紫外光照，第二块接受30分钟的紫外光照，第三块接受45分钟的紫外光照。光照完成后各组加入相对应的培养基和各浓度的脐带血细胞衍生液，空白对照组不接种细胞，仅加无血清培养液，阴性对照组为细胞加无血清清培养液，置于37℃培养箱中培养。
培养24h后进行检测，每孔加入CCK8 20μl，2h后酶标仪测细胞吸光值，观察细胞的生长状况。
结果如图3所示：加入脐带血细胞衍生液后，被紫外照射损伤的皮肤成纤维细胞增殖和修复能力显著增强，并随着脐带血细胞衍生液浓度的加大而变强。尤其在光照45min后，没有加脐带血细胞衍生液的细胞仅有少数细胞存活，而加入10％脐带血细胞衍生液的成纤维细胞能得到修复并大量增殖，是阴性对照组的6～10倍。
各组细胞加入脐带血细胞衍生液培养24h后的照片，如图4所示。
实施例四、脐带血细胞衍生液活性成分的透皮吸收能力测定
将固定有香猪皮试验片的释放池安装在单隔室的上侧，释放池内加入含10％脐带血干细胞衍生液的制剂，实验组加入1‰浓度的天然促渗剂冰片，对照组不加，留取一定样品待试验完成后检测蛋白含量。整个装置在32℃水浴中恒温12h，实验结束后吸取皮肤下隔室中被搅拌的溶液和上隔室溶液一起测定液体中蛋白质的含量。并计算得到被皮肤吸收的干细胞活性成分的量。
结果如图5所示：不加入冰片，脐带血细胞衍生液中活性因子在实验装置猪皮中的吸收效率约为0.04mg/cm2/12h，而加入冰片后，吸收效率成倍增加，可达到0.08mg/cm2/12h。(0h减去12h的差值即为吸收的蛋白浓度)
实施例五、含脐带血干细胞衍生液的脂质体悬浮液稳定性和生物学活性的检测
1、超速离心法测定干细胞活性成分脂质体的包封率
同活性成分浓度的标准品和含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液各10ml置于37℃，相对湿度75％的环境下，分别在0、1、3、5、10、30、50、70、90天取样品1ml,装于1.5mlEP管中，以12000r/min离心1h，取上清用3.2所示方法测定上清中脐带血干细胞活性成分的浓度，包封率＝(标准品干细胞活性成分浓度-上清中干细胞活性成分的浓度)/标准品干细胞活性成分浓度：(结果如表1所示)
表1.含脐带血干细胞衍生液脂质体混悬液的包封率及物理稳定性(％)结果
含脐带血干细胞衍生液脂质体混悬液的包封率和稳定性的检测结果表明经温度37℃、相对湿度75％条件下，干细胞因子标准品(即原料药)仅能放置10天，而含脐带血干细胞衍生液脂质体混悬液可放置90天甚至更长，可见制备的含脐带血干细胞衍生液脂质体混悬液能显著提高活性成分的稳定性。
2、生物学活性检测
人皮肤成纤维细胞达到80～90％融合，消化，以1×104/ml的细胞密度铺96孔板，每孔100μl，12h后加10％含脐带血干细胞衍生液脂质体混悬液。37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱孵育48h每孔加入CCK8 20μl，2h后酶标仪测细胞吸光值，实验重复三次。结果如表2所示(减去培养基对照组吸光值)，表明含脐带血干细胞衍生液脂质体混悬液对人真皮成纤维细胞的促增殖作用稳定，而标准品随着放置时间变长，干细胞因子逐渐降解，其促增殖作用也越来越弱，到第30天已完全没有生物学活性。
表2.干细胞脂质体混悬液的促皮肤成纤维细胞增殖生物活性测定
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：通过剖腹产手术分娩的脐带血获取自体血浆，分离单个核细胞并冷冻备用；
S2：将步骤S1制备的物质进行细胞裂解、去除细胞碎片制备脐带血干细胞衍生液；
S3：对步骤S2制备的脐带血干细胞衍生液进行质量检测，选取无病毒的脐带血干细胞衍生液；
S4：按照4:1：0.1～0.5的质量比称取卵磷脂、胆固醇、S-80乳化剂于梨形瓶内混匀后，加入乙醚制备成干膜；再加入吐温80、步骤S3制备的脐带血干细胞衍生液、磷酸盐缓冲液，制备得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液。
2.根据权利要求1所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，包括如下步骤：
S11：取脐带血于离心管内，离心、灭活补体、水浴，再离心去除纤维蛋白，转移上清液至另一无菌离心管，即获得自体血浆，--20℃保存备用；
S12：加入PBS稀释步骤S13制备的自体血浆；再取稀释后的自体血浆至含聚蔗糖的离心管内1500～2120rpm离心28～35min，离心后吸取白膜层至装有PBS的离心管中，再离心两次以去除血小板，沉淀、重悬，获得单个核细胞血浆重悬液，冷冻备用。
3.根据权利要求2所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：步骤S11中，在2400～2600rpm的转速下离心8～13min后，在53～70℃条件下灭活补体27～35min，再水浴10～20min。
4.根据权利要求2所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：步骤S12中，离心两次具体为：2110rpm*15min第一次洗涤离心，1500rpm*10min第二次洗涤离心。
5.根据权利要求1所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：步骤S2中，包括如下步骤：
S21：将步骤S1制备的物质置入37℃水浴锅中充分融化、-80℃环境下冷冻至少1h，重复3～5次，使样品中的细胞完全裂解，释放出细胞内的各种活性物质；
S22：将步骤S21经裂解、冻融后的物质离心去除细胞碎片，取上清液过0.22μm滤膜除菌后冷冻备用，获得脐带血干细胞衍生液。
6.根据权利要求5所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：步骤S22中在2400～2600rpm的转速下离心8～13min。
7.根据权利要求1所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：步骤S4中，加入的吐温80的量与所添加的S-80乳化剂的质量比为1：1～2；
加入的脐带血干细胞衍生液的量为0.1～1ml；加入的磷酸盐缓冲液的量为2～10ml。
8.根据权利要求1所述一种含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液的制备方法，其特征在于：步骤S4中，加入磷酸盐缓冲液后，旋转10～20min，使膜溶解，再超声15～30min使溶液透明，加入PBS置入-20℃环境下12h以上后取出，融化后再超声5～10min，即获得含脐带血干细胞衍生液的脂质体混悬液。
9.用如权利要求1～8任一所述方法制备的含脐带血干细胞衍生物的脂质体混悬液。
10.根据权利要求9所述的含脐带血干细胞衍生物的脂质体混悬液在化妆品中的应用。
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