CN109100513A - 一种筛选促血管生成的间充质干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种以GREM1为标志物应用于筛选具有促进血管生成能力的间充质干细胞，本发明通过筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞，筛选出具有促进血管生成能力较强的间充质干细胞。本发明通过在氧浓度为1‑5％条件下和/或细胞倍增时间在25h以下的培养筛选手段，提高间充质干细胞对GREM1的表达，从而得到性能优良的促进血管生成的间充质干细胞，本发明提供的方法操作简单，成本低，不需要耗费细胞，减少浪费细胞成本，精准度高，省时省力，实践性强。

Description

一种筛选促血管生成的间充质干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种筛选促血管生成的间充质干细胞的方法。
背景技术
心脑血管的相关缺血性疾病如今已成为临床上一类严重危害健康，降低患者生活质量，致死、致残率高的疾病，主要包括心肌梗塞、脑卒中、肢体性周围血管疾病等。它们共同的发生机理是病理或外力损伤导致动脉或静脉的血流急剧降低或中断阻塞，远端动脉血运和氧供差，使相应的组织或器官出现严重的持久性缺血缺氧损伤，导致组织或器官的功能丧失、发生坏死甚至危及生命。如《中国心血管病报告2016》报道，我国每年患心血管疾病的人已经上升约至2.9亿人，而且城市地区心血管病死亡率为264.84/10万人，其中心脏病死亡率为136.61/10万人、脑血管病死亡率为128.23/10万人，其中脑梗死、颅内出血、急性心肌梗死等心血管疾病的发病率不断上升。除此之外，自从2013年国际糖尿病联盟(IDF)公布的我国成为世界糖尿病第一大国以来，我国糖尿病患者因下肢血管闭塞、溃疡坏死常导致大非创伤性截肢的已占50％-60％，而且截肢后总死亡率依旧高达25％-50％。由此可见，血管性相关疾病已成为我国重大的公共卫生问题，防治心血管病刻不容缓。
理想条件下，治疗血管生成其目标主要是通过诱发其中的一种或多种过程，产生新生血管，参与微循坏的形成、血管旁路的发生和血管新生，从而恢复血流和氧代谢。这种血管新生主要有3种形式，即血管发生(vasculogenesis)、血管生成(angiogenesis)和动脉形成(arteriogenesis)。迄今为止，临床传统治疗血管相关疾病的方法主要包括内科药物治疗和外科的血流重建，都难以从机体本身诱导血管新生。再加上心血管疾病的患者以老年体弱者居多，常伴有多种心脑血管病变，多数无法承受手术搭桥等刺激，故以上传统治疗显然存在一定局限性，不能从根本上解决问题，难以取得令人浦意的疗效。因此临床迫切希望探索新的治疗手段改善心血管功能、甚至重建血运改善缺血。
目前，申请号为：201610321976.8，发明名称为“PDGFR-p作为促进血管生成的间充质干细胞亚群的标志物的应用”的专利公开：PDGFR-p在骨髓来源的MSCs及脂肪来源的MSCs都有很高的表达量，如PDGFR-p在胎盘来源的MSCs表面表达量有25％左右，而且随传代培养表达量发生变化。而且他们通过体外、体内两方面的实验寻找PDGFR-p阳性表达的MSCs的作用和功能；体外实验发现PDGFR-p阳性的MSCs表达血管生成相关因子水平大幅提高；体内实验通过将PDGFR-p阳性表达的MSCs和PDGFR-p阴性表达的MSCs应用于小鼠皮肤伤口模型，发现PDGFR-p阳性表达的MSCs血管生成能力明显增强，细胞在伤口中的存活性和迁徙能力都比较强，促进伤口愈合效果很好。因此认为PDGFR-p可作为筛选促血管生成的间充质干细胞标志物。“PDGFR-p作为促进血管生成的间充质干细胞亚群的标志物的应用”：虽然公开了PDGFR-p可作为筛选促进血管生成的间充质干细胞亚群的标志物，但是PDGFR-p作为一种细胞膜受体，要对这类膜受体进行细胞筛选，均采用免疫磁珠的方法；但是免疫磁珠分选的方法费用昂贵，同时PDGFR-p在大多数间充质千细胞表达仅占25％作用，要在分选前对细胞进行PDGFR-p的表达进行重复评估和鉴定，只能采用流式细胞分析或者qRT-PCR或者westernblot等技术对其的表达进行鉴定，这类的方法共同点均是需要消化一定数量的细胞，才能进行检测。所以所采用的设备需求相对较多，实验成本相对较高。其他的则是通过基因编辑技术或者生物医学工程构建特异性的可以促进血管生成的间充质干细胞技术，而不涉及相关可评估间充质干细胞具有促血管生成的的任何生物标记物。
专利号为CN102641294B，“一种制剂在制备治疗缺血性心血管疾病的药物中的应用”、专利号为CN102641293B：“用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法”公开了治疗缺血性心血管疾病的制剂均为间充质干细胞的条件培养基浓缩的冻干粉作为可用于缺血性心血管疾病治疗的制剂。
虽然分泌多种细胞因子活性物质，但是若每次对这些间充质干细胞进行多种细胞因子检测，不仅成本高，耗时长，不同批次干细胞的因子分泌差别大。
最后我们还发现，虽然众多文献报道通过改进工艺或者培养条件可提高间充质干细胞的大量扩增，同时通过各种亚群或者生物标志物能评估或者筛选“优质的”干性强的间充质干细胞的，但这些细胞大量的扩增培养不可避免的会发生复制性衰老。但却没有人针对细胞的复制性衰老提出有效的确切“量化指标”，仅是通俗的通过细胞代次来描述间充质干细胞的使用是不太客观的。
发明内容
为了解决现有技术中缺乏高效、便捷、低成本的评价间充质干细胞具有治疗血管性疾病的标志物，本发明以GREM1为标志物应用于检测间充质干细胞促血管生成能力，通过在低氧和/或较短的细胞倍增时间培养筛选高表达GREM1的间充质干细胞，筛选出具有较强的促血管生成能力的间充质干细胞，这种方法操作简单，特异性强，经济实惠。
本发明的目的是本发明的目的是提供一种GREM1在筛选具有促进血管生成的间充质干细胞中的应用。
本发明的另一目的是提供一种筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法。
本发明的再一目的提供一种筛选得到的促进血管生长的间充质干细胞在制备治疗血管性疾病的药物中的应用。
目前现有技术中虽有PDGFR-p作为筛选促进血管生成的间充质干细胞的标志物，但是如上说述，PDGFR-p作为标志物筛选促血管生成的间充质干细胞成本较高，目前仍然缺乏便捷、低成本、高效筛选促血管生成的间充质干细胞的方法。本发明研究发现GREM1是VEGFR-2的促进剂，可通过BMP非依赖方式同VEGFR2结合，诱导血管再生。发明人采用慢病毒的方法构建过表达GREM1的MSC进行小鼠下肢动脉缺血损伤治疗发现，过表达GREM1的MSC可以加速促进小鼠下肢缺血损伤的修复和血流的恢复，还能避缺氧坏死组织内氧化应激环境对MSC诱导的损伤。为了筛选适于治疗血管性疾病的间充质干细胞(MSCs)，有效解决MSCs移植后的存活效率以治疗心血管疾病等重大问题，以研究结果为依据，本发明将GREM1作为标志物应用于筛选具有促进血管生成饿间充质干细胞。本发明提供一种筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：检测间充质干细胞中GREM1的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞，得到促进血管生成能力强的间充质干细胞。
筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，具体地，包括以下步骤：
(1)培养间充质干细胞，然后处理间充质干细胞，得到间充质干细胞的待检测样品；
(2)利用吸光度法测定步骤(1)中处理过的间充质干细胞的待检测样品的中GREM1的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞。
更加具体的方法为采用ELISA检测间充质干细胞上清液中的GREM1含量，从而确定间充质干细胞的促进血管生成能力。由于间充质干细胞分泌的GREM1是一种可溶性因子，通过ELISA方法检测不同培养条件、不同来源以及不同代次的MSC培养基上清的GREM1的表达量，通过评估GREM1的含量推测间充质干细胞促血管生成和修复的能力。
具体步骤如下：
(1)当间充质干细胞长满细胞培养瓶50％～60％时，分别弃掉培养基，按照实验体系更换成无血清的基础培养基(可为不同品牌的DMEM/F12或者a-MEM培养基)继续培养细胞48h(一般T75体积为10ml，T175体积为25ml)，然后收上清，4℃下3000rpm离心20分钟收上清液，弃沉淀；最后将上清液样品冻存于-80度备用；
(2)分别采购包被好的GREM1ELISA试剂盒，加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔；在酶包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(3)温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟；
(4)配液：将n倍浓缩洗液用蒸馏水n倍稀释后备用，n为任意正数；
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；
(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
(7)显色：每孔加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
(8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色变黄色)；
(9)测定：以空白调零，450nm播出依序测量各孔的吸光度，测定在加入终止液15min内进行；
(10)结果分析：根据吸光度(OD值)和标准品绘制标准曲线，换算待测样品的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞。
进一步优选地，采用低氧培养技术，即在氧浓度为1-5％的低氧培养箱下对间充质干细胞进行培养，确保间充质干细胞在大量扩增培养时，减缓复制性衰老的过程，促进间充质干细胞的GREM1基因表达产生更多的GREM1，从而筛选培养出高表达GREM1的间充质干细胞。进一步优选地，筛选间充质干细胞的GREM1的基因相对表达量为常氧浓度的8.8倍以上的促进血管生成间充质干细胞，其中常氧浓度为21％，这样的促进血管生成的间充质干细胞中的GREM1基因得到更大程度的表达，产生更多的GREM1，通过这样的方式，能够筛选培养出更加适宜的促进血管生成的间充质干细胞。
虽然间充质干细胞为血管性疾病的治疗开辟了新道路，但实际治疗应用中的疗效存在差异。因为根据目前分离MSCs的方法，MSC仍存在异质性，是一群表现和功能上多样性的混合干细胞。根据本发明上述的研究发现，GREM1高表达的间充质干细胞具有较强的促进血管生成的能力，为了实现培养筛选高表达的间充质干细胞，本发明通过检测间充质干细胞的群体倍增时间(Popμlation Doubling Time，PDT)这种简单易操作的方式进行筛选，根据间充质干细胞这些特性，发明人前期也开展不同培养体系或和同一培养体系下，不同PDT的脐带间充质干细胞(UC-MSC)分泌GREM1的表达情况。通过采用qRT-PCR基因检测方法发现：①同一代次，低氧条件下培养的MSCs增殖能力强，进而PDT比常氧培养条件下的MSCs的PDT小。经检测的低氧MSCs(PDT为18h)，同代次条件下，常氧培养的MSCs(PDT为25h)，基因检测结果发现：低氧培养的MSC的GREM1基因的表达量是常氧间充质干细胞的8倍。②同时，我们还筛选低氧和常氧培养条件下，PDT相同的MSCs，我们发现当同时筛选PDT均为25h的MSCs进行qRT-PCR检测时，这两种细胞的GREM1基因表达无显著性差异。这些结果说明，无论采用什么培养体系，当能维持间充质干细胞的PDT在一定合理范围内，间充质干细胞则具有良好的自我更新和分化潜能，因此可通过筛选同一来源MSCs代次的PDT时间也能评估间充质干细胞表达GREM1的强弱。因此，优选的，间充质干细胞的倍增时间在25h以下，间充质干细胞具有较强的促进血管生成能力。
优选地，本体系中还能够采用细胞倍增时间评价的间充质干细胞的促进血管生成能力，筛选出具有良好的促进血管生成的间充质干细胞，
包括以下具体步骤：
培养间充质干细胞，连续检测多天细胞倍增数目，每天在固定时间进行细胞消化，计数，根据公式计算倍增时间，
PDT＝(ΔT×log2)/(logNt-logN0)，
其中，PDT为细胞倍增时间，ΔT为隔天数，Nt为对数生长期任一点的理论观察者，N0为对数生长期理论初始值，N0在接种细胞24小时后进行计算群体倍增时间；
筛选出细胞倍增时间小于25h的间充质干细胞。
更加具体的方法包括以下步骤：
(1)将消化下来的间充质干细胞，根据细胞悬液密度，对细胞进行6孔板铺板，细胞数为：5×103个/孔，每孔总体积v＝2ml/孔；
(2)连续检测6天细胞倍增数目，每天进行三个复孔重复实验；
(3)每天在指定时间点进行细胞消化，细胞仪计数，并比较三个复孔间的细胞数；
(4)待6天细胞群数目检测完毕，根据公式计算倍增时间；
PDT＝(ΔT×log2)/(logNt-logN0)，其中，ΔT为隔天数，Nt为对数生长期任一点的理论观察者，N0为对数生长期理论初始值，一般N0在接种细胞24小时后进行计算群体倍增时间；
由于不同来源的间充质干细胞PDT不同，一般PDT<25h细胞增殖能力强，更合适用于治疗和研究，因此筛选出PDT<25h的间充质干细胞。
通过本发明提供的方法筛选出来的间充质干细胞具有良好的促进血管生成能力，能够修复受损血管，促进形成新的血管，能够用于治疗心肌梗塞、脑卒中、糖尿病并发症等血管性疾病。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种以GREM1为标志物应用于筛选具有促进血管生成能力的间充质干细胞，本发明通过筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞，筛选出具有促进血管生成能力较强的间充质干细胞。本发明通过在氧浓度为1-5％条件下和/或细胞倍增时间在25h以下的培养筛选手段，提高间充质干细胞对GREM1的表达，从而得到性能优良的促进血管生成的间充质干细胞，本发明提供的方法操作简单，成本低，不需要耗费细胞，减少浪费细胞成本，精准度高，省时省力，实践性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是MSC在常氧和低氧培养条件下表达GREM1基因的水平图；
图2是MSC在常氧和低氧条件下分泌GREM1蛋白情况图；
图3实验组为沉默MSC表达GREM1后的条件培养基培养鸡胚尿囊膜24小时候的血管形成图像，正常对照组为MSC的条件培养基培养培养鸡胚尿囊膜24小时候的血管形成图像，右侧为左侧放大200倍的效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
MSC在常氧和低氧培养条件下，对GREM1基因表达的影响
(一)目的：评价为间充质干细胞在5％低氧培养条件和常氧(21％)条件下GREM1的基因表达水平。
(二)实验方法：
1.分别将P3代次的MSC按100个/cm2细胞密度铺于25cm2细胞培养瓶，然后分别置于常氧培养箱和5％低氧培养箱培养，长至80％～90％后同时收细胞待用。
2.分别向细胞加入1ml Trizol试剂吹打混匀，静置5min，使核蛋白充分解离；加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min；于2-8℃12000g离心15min，离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。取上清液，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。于2-8℃12000g离心10min后弃去上清。向沉淀中加入1ml 75％乙醇，轻轻混匀。于2-8℃12000g离心5min后弃上清。将RNA样品晾干(不要彻底干燥)，加入适量DEPC水溶解，NanoDrop定量。
3.逆转录：根据Takara公司的RT-PCR试剂盒，逆转录体系如下：反应体系20μl，
4.反应条件：
①总RNA于70℃孵育10min，离心后置于冰上；
②室温保温10min，然后在42℃保温15min，然后在95℃保温5min，然后在0-5℃保温5min，最后在-20℃保存。
5.将mRNA反转录成cDNA，最后做荧光定量PCR，荧光定量PCR，反应体系如下：反应体系20μl，即：
三蒸水7μl，每个样本设三个复孔。
6.扩增条件为：预变性95℃10min，进入循环，95℃15s，60℃60s，扩增40个循环。以β-actin作为内参照校正，用2△△Ct法分析基因的相对表达；以对照组表达量为1，计算其它各组相对于对照组的表达量来进行统计学分析。
7.研究中使用使用到的引物序列为：
Human-GREM1正向引物：5′TTAAGCAGACCATCCACGA3′；
Human-GREM1反向引物：5′TGTAGTTCAGGGCAGTTGAGT3′；
human-beta-actin正向引物：5′CATGTACGTTGCTATCCAGGC3′；
human-beta-actin反向引物：5′CTCCTTAATGTCACGCACGAT3′。
(三)实验结果：
结果如图1所示，与常氧MSC表达GREM1相比，5％低氧可以显著诱导MSC高表达GREM1基因，其GREM1基因相对表达量是常氧培养的8.89倍。这说明不需要借助慢病毒转染技术，即可提高GREM1的表达。
同样的方法测试MSC在低氧(1％)培养条件下GREM1基因表达，测试结果表明，在1％的低氧条件下能够更加显著的诱导MSC高表达GREM1基因，其GREM1基因相对表达量是常氧培养的10倍以上。
实施例2
MSC在常氧和低氧条件下分泌GREM1蛋白情况。
(一)实验目的：Elisa评价为间充质干细胞在5％低氧培养条件和常氧条件下GREM1因子表达情况。
(二)实验方法：
1.将细胞分别铺于T75(一般T75体积为10ml，T175体积为25ml)培养瓶，分成常氧对照组1瓶和5％低氧实验组1瓶，每瓶4×105个/瓶，总体积为10ml/瓶。一天后分别换成无血清的基础培养基10ml培养细胞48h，然后收上清，4℃下3000rpm离心20分钟收上清液，弃沉淀。最后将上清样品冻存于-80度备用。
2.加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔。在酶包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
3.温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟；
4.配液：将30倍浓缩洗液用蒸馏水30倍稀释后备用；
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
7.显色：每孔加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色变黄色)；
9.测定：以空白调零，450nm播出依序测量各孔的吸光度。测定在加入终止液15min内进行。
(三)实验结果：
如图2的ELISA结果显示，常氧的MSC分泌GREM1的量为1.86±0.32ng/ml；而低氧的MSC分泌GREM1的量为5.78±0.41ug/ml，显著高于常氧MSC分泌含量。
实施例3
干扰MSC表达GREM1对血管鸡胚尿囊膜血管形成实验的影响
(一)实验目的：观察沉默间充质干细胞表达GREM1后，其上清液对鸡胚尿囊血管生成的影响。
(二)实验方法：
1.将12个受精蛋分成2组，每组6个。分组为：对照组(MSC-CM组)和实验组(shGREMl-MSC-CM组)。用温水清洗2次后，分别将受精蛋置于温度38℃，湿度为60％～70％的培养箱进行孵育，气室向上，每天转动鸡蛋至少3～4次，每日在灯箱下检测胚胎发育情况。
2.在孵育的第6天，用静静消毒鸡蛋壳气室表明2cm×3cm区域，用小刀在蛋壳表明刻划出凹痕，轻轻拨去鸡蛋外壳和壳膜，轻轻市调内壳膜，此时该处CAM下陷，形成假气室，此时可见清楚的鸡胚尿囊膜。
3.shGREMl-MSC的构建：Gremlin基因干扰的慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。构建好的慢病毒载体命名为：GREMl-RNAi-LV、NC-GFP-LV。
Gremlin基因靶序列如下：
正向引物：
5′-CACCGCACTATCATCAATCGCTTCTCGAAAGAAGCGATTGATGAT AGTGC-3′；
反向引物：
5′-AAAAGCACTATCATCAATCGCTTCTTTCGAGAAGCGATTGATGATAGTGC-3′。
与gremlin基因序列无同源性的通用阴性对照：
正义链：
5′-CACCGACTACCATTACCATTGCTTCCGAAGAAGCAATGGTAATGGTAGTC-3′；
反义链：
5′-AAAAGACTACCATTACCATTGCTTCTTCGGAAGCAATGGTAATGGTAGTC-3′。
然后构建好的病毒感染MSC细胞，即用含10％FBS的1g/L葡萄糖的低糖DMEM(lowglucose，LG)培养基培养，0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化并传代。以5×l04/孔接种于6孔培养板中，37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长状态稳定，贴壁率达30％左右以利于感染。感染步骤按照上海吉凯公司慢病毒感染说明书进行，将GREMl-RNAi-LV和NC-GFP-LV分别与感染增强剂polybrene混匀，加入到细胞中，12h后更换新鲜的完全培养基，孵育48h后荧光显微镜下观察。细胞感染48h后，在荧光显微镜下计数表达绿色荧光蛋白的细胞数，同时计数明场同一视野中的总细胞数，并计算细胞感染效率，公式为：
细胞感染效率＝荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×l00％。
当带荧光的慢病毒感染效率高达90％以上，而且WB实验验证GREM1蛋白沉默效率高到70％以上，则证明沉默成功。
4.分别准备好50ml5000个/cm2的MSC或shGREMl-MSC培养密度长到第3天后收集的上清液，同时进行浓缩20倍后分别各准备l00μl备用。
5.在无菌台内分别将生理盐水和实验组的培养介质(CM)分别轻轻地道鸡胚尿囊膜表面，然后继续培养24h。
6.观察比较各组对鸡胚尿囊膜表明微血管生长的影向。
(三)实验结果：
如图3结果显示，通过采用shRNA干扰技术降低间充质干细胞表达GREM1后，其条件培养基对鸡胚的促血管生成能力显著比正常对照组低。这说明MSC表达GREM1的能力与促血管生成能力相关。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.GREM1在筛选具有促进血管生成的间充质干细胞中的应用。
2.一种筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：检测间充质干细胞中GREM1的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞，得到具有促进血管生成能力的间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养间充质干细胞，然后处理间充质干细胞，得到间充质干细胞的待检测样品；
(2)利用吸光度法测定步骤(1)中处理过的间充质干细胞的待检测样品的中GREM1的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：
①培养间充质干细胞，当间充质干细胞长满细胞培养瓶50％～60％时，分别弃掉培养基，更换成无血清的基础培养基继续培养细胞48h，然后收上清液，离心，收上清液，弃沉淀；最后将上清液样品冻存于-80度备用；
②分别采用包被好的GREM1 ELISA试剂盒，加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；在酶包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，轻轻晃动混匀；
③温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟；
④配液：将n倍浓缩洗液用蒸馏水n倍稀释后备用，n为任意正数；
⑤洗涤：揭掉封板摸，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复数次，拍干；
⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
⑦显色：每孔加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
⑧终止：每孔加终止液50μl，终止反应，得到间充质干细胞的待检测样品。
5.根据权利要求3所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养间充质干细胞的氧浓度为1-5％。
6.根据权利要求5所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，在1-5％氧浓度下培养间充质干细胞，筛选间充质干细胞的GREM1的基因相对表达量为常氧浓度的8.8倍以上的间充质干细胞。
7.根据权利要求2-5任一所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的倍增时间在25h以下。
8.根据权利要求7所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)培养间充质干细胞，连续检测多天细胞倍增数目，每天在固定时间进行细胞消化，计数；
(2)根据公式计算倍增时间，
PDT＝(ΔT×log2)/(logNt-logN0)，
其中，PDT为细胞倍增时间，ΔT为隔天数，Nt为对数生长期任一点的理论观察者，N0为对数生长期理论初始值，N0在接种细胞24小时后进行计算群体倍增时间；
筛选出细胞倍增时间小于25h的间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：
①将消化下来的间充质干细胞，对细胞进行6孔板铺板，细胞数为：5×103个/孔，每孔总体积v＝2ml/孔；
②连续检测6天细胞倍增数目，每天进行三个复孔重复实验；
③每天在指定时间点进行细胞消化，细胞仪计数，并比较三个复孔间的细胞数；
④待6天细胞群数目检测完毕，统计数据。
10.权利要求2-9任一所述的筛选具有促进血管生成的间充质干细胞的方法得到的间充质干细胞在制备治疗血管性疾病的药物中的应用。
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