CN109504710A - Kdm4d的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及KDM4D的用途。本发明研究结果表明，KDM4D能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响间充质干细胞向成骨、成牙的分化，并影响干细胞的迁移趋化能力，从而影响间充质干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有KDM4D基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

Description

KDM4D的用途

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及KDM4D的用途。

背景技术

牙齿缺失是目前较为普遍的现象，针对牙齿缺失，目前的修复方法主要有义齿修复和种植牙修复，而这些传统的修复方法均存在各种不足，这使得人们将目光集中在“牙齿再生”领域，牙再生为临床牙齿缺失的修复开辟了新的途径,而制约牙再生研究的关键问题之一是牙再生种子的来源和干细胞定向分化机制。

在牙再生研究领域中，干细胞是重要的种子细胞来源，干细胞是一类未分化的细胞，具有自我复制能力及向多分化潜能。目前主要用于牙齿组织工程的牙源性干细胞有成人牙髓干细胞、乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、根尖乳头干细胞、牙囊细胞。其中根尖牙乳头干细胞(SCAP)存在于牙齿根尖孔的牙乳头组织中，具有多向分化潜能，在体外可以诱导分化为成牙本质细胞、脂肪细胞及软骨细胞等，在体内可以形成牙髓—牙本质复合体样结构，SCAP在根部牙本质形成过程中发挥重要作用，是一种较好的牙齿组织工程种子细胞，可用于牙髓牙本质和生物学牙根的再生，具有良好且广阔的临床应用前景。同时牙髓中存在牙髓干细胞(DPSC)，牙髓干细胞能再生出牙髓牙本质样复合体，其中的矿化基质与其中的牙本质小管及包含血管的纤维组织按照正常人体的牙髓-牙本质复合体层次排列。并且细胞具有显著自我更新能力和多方向分化能力，能在体内异位形成牙本质，还可分化成脂肪样细胞和神经样细胞。2003年Miura等首次发现并报道了从人的脱落乳牙中分离到的一种具有多分化潜能的干细胞。并将该干细胞命名为乳牙牙髓干细胞(SHED)。这类细胞同样具有高度增殖能力、一定的多向分化潜能和自我更新能力等生物学特性，可以向成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化。

牙周膜干细胞是来源于牙周膜的成体干细胞，能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用，牙周膜干细胞不仅能分化为成牙骨质细胞样细胞和成骨细胞样细胞，形成牙骨质样和骨样组织；而且还可分化为成纤维样细胞，形成类似天然牙周膜样的结缔组织，能形成组织形态、空间排列上类似于天然牙周膜牙骨质复合体的结构，提示这是一种可用于牙再生医学的有效骨再生的自体干细胞。

牙囊是包绕成釉器周围的疏松结缔组织，起源于外胚间充质，在牙齿萌出过程中发挥着重要的作用。牙根形成时期，牙周组织(如牙骨质、牙周膜和牙槽骨)由牙囊前体细胞形成，牙囊干细胞可以分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞。在找到可能的种子细胞之后，间充质干细胞定向分化的分子机制仍不清楚，这也限制了间充质干细胞的潜在应用。

表观遗传修饰与干细胞定向分化关系密切。其中组蛋白去甲基化酶属于表观遗传学中重要的修饰酶，能通过改变组蛋白甲基化修饰状态参与基因表达的调控。牙齿发育、形成机制是牙再生研究的基础，因此，对KDM4D基因在间充质干细胞骨向、牙向分化及迁移趋化过程中的调控方法进行了研究。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供KDM4D的用途，本发明证明，KDM4D基因能够调控通过调控与成骨、成牙相关基因的表达，实现对间充质干细胞成骨/成牙定向分化的调控。

本发明提供了KDM4D在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨相关基因表达的制剂中的应用。

本发明实施例中，所述成牙和/或成骨相关基因为DSPP、BSP和/或DMP1。

本发明所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。一些实施例中，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞。

所述调控具体为：过表达KDM4D基因，促进DSPP基因和/或DMP1基因的表达；敲除KDM4D基因，抑制DSPP基因和/或DMP1基因的表达；敲除KDM4D基因，抑制DSPP蛋白、DMP1蛋白和/或BSP蛋白的表达。

本发明所述KDM4D为KDM4D蛋白、KDM4D基因序列、能够过表达间充质细胞中KDM4D基因的物质，或者能够敲除或敲低间充质细胞中KDM4D基因的物质。

所述KDM4D基因核苷酸序列的登录号为NM_018039，所述KDM4D蛋白氨基酸序列由登录号为NM_018039的核苷酸序列编码。

本发明提供了KDM4D在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。所述调控具体为过表达KDM4D基因促进间充质干细胞的体外矿化能力，而降低KDM4D基因表达抑制间充质干细胞的体外矿化能力。所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞。所述矿化指钙化结节的形成。

本发明提供了KDM4D在制备调控间充质干细胞迁移趋化能力的制剂中的应用。所述调控指过表达KDM4D基因促进间充质干细胞的迁移趋化能力。所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞。

本发明提供了一种促进间充质干细胞成牙分化的制剂，包括KDM4D蛋白或能够过表达KDM4D基因的物质。

本发明提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的制剂，包括KDM4D蛋白或能够过表达KDM4D基因的物质。

本发明提供了一种促进间充质干细胞迁移趋化的制剂，包括KDM4D蛋白或能够过表达KDM4D基因的物质。

所述能够过表达间充质细胞中KDM4D基因的物质为包含KDM4D基因的表达载体；或者由包含KDM4D基因的表达载体转染的逆转录病毒。本发明利用逆转录病毒转染获得稳定过表达KDM4D的根尖牙乳头干细胞。

本发明提供了一种抑制间充质干细胞成牙分化的制剂，包括KDM4D表达抑制剂或能够敲除或敲低KDM4D基因的物质。

本发明提供了一种抑制间充质干细胞成骨分化的制剂，包括KDM4D表达抑制剂或能够敲除或敲低KDM4D基因的物质。

本发明提供了一种抑制间充质干细胞迁移趋化的制剂，包括KDM4D表达抑制剂或能够敲除或敲低KDM4D基因的物质。

所述能够敲除间充质细胞中KDM4D基因的物质为KDM4D的siRNA，shRNA的目标序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’。或者为将KDM4D的siRNA插入慢病毒的shRNA载体上构建而成KDM4D的shRNA质粒。

本发明提供了一种促进间充质干细胞成牙分化、成骨分化和/或迁移趋化的方法，过表达间充质干细胞的KDM4D基因，或以含有KDM4D的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明提供了一种抑制间充质干细胞成牙分化、成骨分化和/或迁移趋化的方法，敲除或敲低间充质干细胞的KDM4D基因，或以含有KDM4D表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明中，促进间充质干细胞成牙分化亦可称为促进牙组织再生；促进间充质干细胞成骨分化可称为促进骨组织再生。

本发明研究结果表明，KDM4D能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响间充质干细胞向成骨、成牙的分化，并影响干细胞的迁移趋化能力，从而影响间充质干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有KDM4D基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

附图说明

图1示本发明实施例提供的KDM4D的过表达增强根尖牙乳头干细胞的牙向、骨向分化能力示意图；

图2示本发明实施例提供的KDM4D的低表达可抑制根尖牙乳头干细胞牙向、骨向分化能力及KDM4D的低表达减少体内矿化组织形成量示意图；

图3示本发明实施例提供的KDM4D的过表达增强根尖牙乳头干细胞的迁移趋化能力及KDM4D的低表达抑制根尖牙乳头干细胞的迁移趋化能力示意图。

具体实施方式

本发明提供了KDM4D的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

骨涎蛋白(BSP)具有促进骨的形成及分化、成骨细胞的趋化、黏附等功能,在骨转换方面起着非常重要的作用。

牙本质涎蛋白DSPP是唯一由成牙本质细胞合成和分泌的牙本质特异性非胶原蛋白，分泌至矿化前沿，起着启动牙本质矿化及调节羟基磷灰石晶体的大小和生长速度的作用。

牙本质基质酸性磷酸化蛋白1(DMP1)是骨、软骨、釉质、牙骨质和牙本质生物矿化所必需的一种酸性非胶原蛋白，DMP-1全基因序列是生物矿化的启动因子。

细胞归巢是指细胞在多种因素的作用下定向趋化性迁移至靶向组织并定植存活、发挥功能的过程。间充质干细胞参与牙再生的一个前提是其具备迁移趋化至靶向组织的能力，并可以在此基础上发挥干细胞的定向分化功能。间充质干细胞具有向损伤组织特异性归巢的特性，但最终在靶部位测到的归巢量极少，使间充质干细胞发挥的疗效受限。因此，在利用间充质干细胞诱导牙齿组织再生的过程中，存在迁移至受损部位的干细胞数量有限，影响定向分化功能的发挥、定向分化调控机制不清楚等问题亟需解决。这些问题限制了间充质干细胞参与牙齿组织再生的临床应用。寻找间充质干细胞的关键调控基因，借助细胞因子的辅助应用或基因改建使得间充质干细胞得以完成这一迁移/归巢过程，从而发挥正常的分化再生功能是关键问题之一。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、细胞培养：

本发明所涉及的所有干细胞均遵守人类胚胎干细胞研究的行为指南，人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书；智齿在用75％酒精消毒后再用磷酸盐缓冲盐水冲洗，分离和培养鉴定根尖牙乳头干细胞，简述如下：轻轻剥离根尖牙乳头组织，用磷酸盐缓冲盐水反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和分散酶(4g/L)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液；将细胞接种于25cm²细胞培养瓶中，在培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO₂培养，每2～3天换液1次；每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况；当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1:2消化传代；2-4代的干细胞被用于之后的实验；

二、质粒构建与病毒转染：

标准方法进行质粒的构建；所有结构都通过适当的限制消化和/或测序加以验证；设计KDM4D的SiRNA，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成KDM4DshRNA的质粒；设计KDM4D基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到KDM4D的全长将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成质粒；然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80℃冰箱；病毒转染，对根尖牙乳头干细胞进行电镀过夜，然后感染逆转录病毒或慢的聚凝胺达6个小时，48小时后，用不同的抗生素筛选被转染的细胞；

shRNA的目标序列为：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

三、逆转录病毒转染：

利用逆转录病毒转染获得稳定过表达KDM4D的根尖牙乳头干细胞。

四、蛋白质印迹分析：

RIPA裂解液溶解细胞，样本用10％SDS聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转移膜装置转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)中，膜上涂抹5％脱水牛奶放置2h，然后用一抗孵育一夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底物试剂使其可视化；主要针对KDM4D是抗KDM4D多克隆抗体；

五、茜素红染色和RT-PCR：

矿化诱导液诱导根尖牙乳头干细胞，为检测矿化能力，细胞诱导2-3周后，用70％乙醇固定，2％茜素红染色；定量测定钙离子浓度，用10％的氯化十六烷吡啶溶于磷酸钠在室温下使茜素红退色30分钟；钙离子浓度是通过测量562nm的吸光度决定，并用标准曲线换算；RT-PCR：Trizon提取样本RNA,逆转录得到cDNA，通过Real-time PCR定量测量DSPP、DMP1的表达。

六、裸鼠皮下进行细胞回植：

本发明通过首都医科大学北京口腔医院动物关怀和使用委员会允许；将4.0×10⁶个细胞与40毫克的羟基磷灰石/磷酸三钙陶瓷颗粒混合，然后移植到5只10周龄裸鼠背部皮下，在每一个裸鼠，空白根尖牙乳头干细胞移植到左侧背表面皮下，而KDM4D根尖牙乳头细胞移植到右侧背表面皮下；依照动物协议批准规范进行；移植后第八周，获取移植细胞用10％福尔马林固定，10％EDTA脱钙，pH值8.0，石蜡包埋，HE染色，定性测量组织矿化量。采用免疫组织化学检测BSP、DSPP的表达。

七、细胞迁移趋化：

细胞划痕实验:细胞划痕处理记为0h,在24h,48h时在显微镜下拍摄照片，统计细胞的迁移距离并做统计学分析。Transwell实验：在小室下方放置血清进行趋化诱导，24h,48h对小室进行结晶紫染色，在正置显微镜下，计数经膜孔迁移至膜下室侧细胞。每组设3个复孔，每孔随机取5个视野观察，计算均数。

八、实验结果：

1、KDM4D过表达增强根尖牙乳头干细胞的成骨成牙分化潜能

进一步证实KDM4D在根尖牙乳头干细胞中的功能，将KDM4D序列插入一个逆转录病毒载体；这种构造通过逆转录病毒感染结合到根尖牙乳头干细胞时过量表达KDM4D；也通过蛋白质印迹实验验证KDM4D的过量表达(图片1a)；接下来，结合后的根尖牙乳头干细胞进行成骨诱导以检测其成骨成牙分化潜能，结果表明，通过茜素红染色和钙离子定量测量，过量表达KDM4D的根尖牙乳头干细胞相对于空白载体的根尖牙乳头干细胞其矿化能力增强(图片1b-c)；实时定量PCR结果也显示，在过量表达KDM4D的根尖牙乳头干细胞诱导的第7天和第21天，DSPP、DMP1的mRNA水平显著增高。(图片1d-g)；

2、KDM4D的减少抑制根尖牙乳头干细胞的成骨成牙分化潜能

为了进一步阐明KDM4D在根尖牙乳头干细胞中的功能，设计了一个短发卡RNA目标在于抑制KDM4D表达式并将其通过慢病毒转染引入根尖牙乳头干细胞；选择后，用免疫印迹分析检测减低的效能(图片2a)；接下来，检测是否KDM4D在本质上影响了根尖牙乳头干细胞的成骨成牙能力；根尖牙乳头干细胞在成骨培养基中培养，成骨诱导后通过茜素红染色和钙离子定量测量，抑制KDM4D的根尖牙乳头干细胞相对于空白根尖牙乳头干细胞其矿化能力明显降低(图片2b-c)；此外，在细胞培养7天后DSPP、DMP1的mRNA水平显著降低(图片2d-g)。接下来，研究是否降低KDM4D会影响根尖牙乳头干细胞在体内的骨生成；SCAP空载根尖牙乳头干细胞和载KDM4Dsh根尖牙乳头干细胞移植到裸鼠皮下；在移植后第8周，HE染色显示，在获取的KDM4Dsh根尖牙乳头干细胞移植体中的骨样矿化组织相比空白组减少(图片2h)；免疫组化染色显示：获取的KDM4Dsh根尖牙乳头干细胞移植体中的BSP、DSPP的表达相比空白组减少。(图片2i-k)因此，体内移植实验表明KDM4Dsh根尖牙乳头干细胞产生更少的骨样矿化组织相比空载根尖牙乳头干细胞；综上所述，这些结果表明，KDM4D表达促进根尖牙乳头干细胞成骨成牙分化潜能。

3、KDM4D过表达增强根尖牙乳头干细胞的迁移趋化潜能

对KDM4D过表达的根尖牙乳头干细胞进行细胞划痕实验和Transwell实验，实验结果显示，相比对照组细胞，KDM4D过表达的细胞24h,48h细胞的迁移距离和穿过Transwell小室的细胞相比对照组增加。(图3a-d)

4、KDM4D的减少抑制根尖牙乳头干细胞的迁移趋化潜能

对KDM4D减少的根尖牙乳头干细胞进行细胞划痕实验和Transwell实验，实验结果显示，相比对照组细胞，KDM4D敲除的细胞24h,48h细胞的迁移距离和穿过Transwell小室的细胞相比对照组减少。(图3e-h)综上所述，这些结果表明，KDM4D表达促进根尖牙乳头干细胞的迁移趋化能力；

九、结论

KDM4D是一种去甲基化酶，研究在根尖牙乳头干细胞分化过程中KDM4D的功能，发现在根尖牙乳头干细胞体内外分化过程中，KDM4D促进其矿化能力，这表明KDM4D可能是控制间充质干细胞成骨成牙分化潜能的一个关键因素；DSPP和DMP1是成骨成牙分化过程中表达的重要指标。接下来，检测了细胞成骨成牙诱导中DSPP、DMP1的mRNA水平，研究结果显示，KDM4D诱导DSPP、DMP1的表达；此外，裸鼠体内回植实验也表明敲除KDM4D后组织矿化量降低，同时BSP、DSPP的表达下降。这些结果表明KDM4D是细胞成骨成牙分化的一个关键的增强剂；此外，通过细胞体外迁移趋化实验表明KDM4D还能增强根尖牙乳头干细胞的迁移趋化能力。这些结果表明KDM4D是细胞迁移趋化的一个关键的增强剂。

总之，本结果发现了一个关键的成骨成牙分化及迁移趋化增强剂-KDM4D，KDM4D过表达能够增强根尖牙乳头干细胞的成骨成牙分化潜能和迁移趋化能力。

本发明中，进行实时定量PCR试验的引物如下：

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.KDM4D在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨相关基因表达的制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成牙和/或成骨相关基因为DSPP、BSP和/或DMP1。

3.KDM4D在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

4.KDM4D在制备调控间充质干细胞迁移趋化能力的制剂中的应用。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述调控具体为：

敲除KDM4D基因，抑制DSPP基因和/或DMP1基因的表达；

敲除KDM4D基因，抑制DSPP蛋白、DMP1蛋白和/或BSP蛋白的表达；

过表达KDM4D基因，促进DSPP基因和/或DMP1基因的表达；

过表达KDM4D基因促进间充质干细胞的迁移趋化能力。

6.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞。

7.一种促进间充质干细胞成牙分化、成骨分化和/或迁移趋化的制剂，其特征在于，包括KDM4D蛋白或能够过表达KDM4D基因的物质。

8.一种抑制间充质干细胞成牙分化、成骨分化和/或迁移趋化的制剂，其特征在于，包括KDM4D表达抑制剂或能够敲除或敲低KDM4D基因的物质。

9.一种促进间充质干细胞成牙分化、成骨分化和/或迁移趋化的方法，其特征在于，过表达间充质干细胞的KDM4D基因，或以含有KDM4D的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

10.一种抑制间充质干细胞成牙分化、成骨分化和/或迁移趋化的方法，其特征在于，敲除或敲低间充质干细胞的KDM4D基因，或以含有KDM4D表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。