CN107217060A

CN107217060A - Kdm1a的用途

Info

Publication number: CN107217060A
Application number: CN201710549257.6A
Authority: CN
Inventors: 范志朋; 王利军; 郑颖; 王松灵
Original assignee: Beijing Stomatological Hospital
Current assignee: Beijing Stomatological Hospital
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2037-07-07
Also published as: CN107217060B

Abstract

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及KDM1A的用途。本发明研究结果表明，KDM1A能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响根尖牙乳头干细胞向成骨、成牙的分化，从而影响根尖牙乳头干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有KDM1A基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

Description

KDM1A的用途

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及KDM1A的用途。

背景技术

牙髓和牙本质均起源于外胚间充质(ectomesenchyme)，由牙乳头发育而来。成人牙髓组织被坚硬的牙本质包绕，一旦牙髓出现炎症，易向坏死方向发展，实现功能性牙髓再生还存在一定的困难。目前，在干细胞介导的牙髓组织再生研究中，通过加入外源性干细胞及支架材料和生长因子后能够在牙髓腔内形成软组织影像。但组织学水平研究发现，牙髓腔新生的软组织类似于牙周组织，而非牙髓组织。如何精确控制干细胞的分化是目前尚未解决的难题。因此揭示调控干细胞的定向分化及组织再生效能的分子机制是组织工程研究中的重要问题。

表观遗传修饰与间充质干细胞的分化关系密切，绝大多数机体细胞的分化是通过表观遗传修饰调控的，极少数可能由于DNA发生突变。表观遗传修饰包括：DNA甲基化和组蛋白修饰两方面作用，其中组蛋白修饰主要发生在组蛋白的-N末端，这些修饰作用继而对染色质结构以及转录过程发生影响，使这些位点上的基因可以单独或以联合的方式作用于下游基因。组蛋白可受到甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、多聚ADP、糖基化等多种修饰，这些修饰作用既能影响染色质的结构和功能，也可以阻遏或促进基因的转录。其中的一种修饰方式-组蛋白甲基化通常发生在组蛋白N末端的赖氨酸残基或精氨酸残基上，最终体现为包括转录激活、抑制等在内的多种效应。通过查阅文献我们发现，组蛋白能够通过不同位点的甲基化和去甲基化来调控干细胞的增殖、分化、迁移等，从而达到促进组织再生的效能。组蛋白甲基化修饰的调控取决于作用的不同位点以及不同的甲基化状态，甲基化位点包括H3K:4,9,27,36,79；H4K30和H4R3等，甲基化状态则包括单甲基化，双甲基化和三甲基化((mono-,di-,or tri-methylation—me1,me2or me3)。一般认为发生在H3K4、H3K36、H3K79位点的甲基化修饰与转录激活以及TrxG(Trithorax-Group proteins)蛋白家族有关，而发生在H3K9、H3K27、H4K20位点的甲基化则与基因沉默和PcG蛋白家族(Polycomb-groupproteins)有关。

组蛋白去甲基化酶1-KDM1A是位于细胞核上的一种黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavinadenine dinucleotide，FAD)依赖性单胺氧化酶，是胺氧化酶家族中的一员。2004年Shi Y等第一次发现了组蛋白去甲基化酶1-(KDM1A)，打破了人们对于组蛋白甲基化不可逆的认知。研究表明，在FAD的参与下，KDM1A可以特异性的催化组蛋白H3K4me1/2和H3K9me1/2去甲基化，发挥基因转录，受体激活等作用，从而调控细胞的增殖、分化、迁移等作用。KDM1A缺失的小鼠胚胎发生早期死亡，胚胎干细胞中KDM1A的缺失将导致生长缓慢或胚胎死亡，因此KDM1A对早期发育也具有重要作用。随着研究的深入，研究者们逐渐发现KDM1A能够通过不同的信号途径调控不同来源的成体干细胞如：胚胎干细胞，脂肪干细胞，神经元干细胞以及造血干细胞等的增殖与分化。但是KDM1A在牙源性干细胞中的作用以及其作用机制尚不明确。而阐明间充质干细胞的分化再生功能和作用机制将有助于促进牙齿组织再生的效率，为临床转化应用提供依据。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供KDM1A的用途。本发明对KDM1A和PLOD2对根尖牙乳头干细胞骨向/牙向分化过程中的作用进行验证。

本发明提供了KDM1A在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨相关基因表达的制剂中的应用；所述成牙相关基因和/或成骨相关基因为BSP、OCN、DSPP和/或DMP-1。

所述调控具体为：抑制KDM1A基因后，BSP、OCN、DSPP和/或DMP-1的表达得到促进。

本发明提供了KDM1A在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙关键转录因子和/或成骨关键转录因子表达的制剂中的应用；所述成牙和/或成骨关键转录因子为OSX、RUNX2和/或DLX2。

所述调控具体为：抑制KDM1A基因后，转录因子OSX、RUNX2和/或DLX2的表达被抑制。

本发明提供了KDM1A在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

本发明所述调控包括：调控碱性磷酸酶表达、调控根尖牙乳头干细胞体外矿化能力、调控根尖牙乳头干细胞钙离子水平和/或调控SCAPs形成类骨质的能力。

所述调控具体为：抑制KDM1A基因导致：ALP的表达被抑制，根尖牙乳头干细胞体外矿化能力被抑制、根尖牙乳头干细胞钙离子水平下降、SCAPs形成类骨质的能力降低。

本发明所述KDM1A为KDM1A蛋白、KDM1A基因序列、能够过表达根尖牙乳头干细胞中KDM1A基因的物质，或者能够敲除或敲低根尖牙乳头干细胞中KDM1A基因的物质。

所述能够过表达根尖牙乳头干细胞中KDM1A基因的物质为包含KDM1A基因的表达载体；或者由包含KDM1A基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pQCXIN。

所述能够敲除根尖牙乳头干细胞中KDM1A基因的物质为KDM1A的shRNA，序列为AAATAAAGGTTTGACTCGTGG。或者为将KDM1A的shRNA插入慢病毒的shRNA载体上构建而成KDM1A的shRNA质粒。

本发明选取牙源性干细胞中自我更新和增殖能力均较强的根尖牙乳头干细胞作为种子细胞。通过对敲减KDM1A的SCAPs的成骨诱导发现敲减KDM1A后SCAPs碱性磷酸酶活性和体外矿化能力降低。碱性磷酸酶作为成骨早期分化指标，提示KDM1A可能作为调控SCAPs成骨分化的关键基因之一。

本申请还在mRNA水平检测成骨关键基因BSP和OCN以及成牙关键基因DSPP和DMP-1表达上调。BSP是骨基质中重要的蛋白之一，BSP在成骨细胞分化早期分泌的细胞外基质中表达较高，随后成骨标志基因OCN表达逐渐升高。DMP-1和DMP-1为成牙分化标志基因，DSPP是人类和小鼠牙本质形成过程中的关键基因，并且有研究发现DSPP是DMP-1能够有效调控DSPP的表达。这些发现揭示了KDM1A在调控SCAPs成骨/成牙分化的中晚期发挥重要作用。另外由于干细胞体外分化环境较为简单，机体内干细胞的增殖和分化功能还依赖于干细胞的微环境，包括与干细胞相邻的支持细胞，黏附分子或细胞外基质等。

为了验证KDM1A调控SCAPs成骨/成牙分化的功能，设计了敲减KDM1A组合对照组细胞的裸鼠体内回植实验。回植8周后通过HE染色发现KDM1Ash和Scramsh组均有类骨质形成，KDM1Ash组新形成的类骨质明显较Scramsh组增多。

本申请还发现敲减KDM1A后能够激活转录关键因子：OSX、RUNX2以及DLX2的表达。RUNX2能够激活OSX从而促进成骨/成牙分化，而DLX家族的转录因子则能够诱导RUNX2和OSX的表达，因此我们猜测KMD1A可能是通过激活RUNX2、OSX和DLX2的表达从而促进SCAPs成骨/成牙分化，提示KDM1A在诱导SCAPs成骨/成牙分化过程中发挥重要作用。

本发明提供了一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，包括KDM1A表达抑制剂或能够敲除、敲低KDM1A基因的物质。

本发明实施例中，促进根尖牙乳头干细胞成骨分化的制剂包括能够敲除或敲低KDM1A基因的物质。能够敲除KDM1A基因的物质为KDM1A的shRNA插入慢病毒的shRNA载体上构建而成KDM1A的shRNA质粒。具体的，慢病毒载体为pLKO.1。

本发明提供了一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，包括KDM1A蛋白或能够表达KDM1A基因的物质。

本发明实施例中，促进间充质干细胞成牙分化的制剂包括能够过表达KDM1A基因的物质。具体的为：由包含KDM1A基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pQCXIN。

本发明提供了一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，敲除或敲低间充质干细胞的KDM1A基因，或以含有KDM1A表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明提供了一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，过表达间充质干细胞的KDM1A基因，或以含有KDM1A的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

促进根尖牙乳头干细胞成牙分化亦可称为促进牙组织再生；促进根尖牙乳头干细胞成骨分化可称为促进骨组织再生。

本发明提供了KDM1A在制备与PLOD2相互作用的物质中的应用。

本发明通过蛋白质免疫共沉淀的方法，发现了若干可能与KDM1A结合的蛋白，接着我们利用蛋白质谱分析，根据结果中各个蛋白的肽段覆盖率及分子量的大小筛选出PLOD2，接着再次采用蛋白质免疫共沉淀的方法验证了PLOD2确实能够与KDM1A形成蛋白复合体。

本发明提供了PLOD2在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨相关基因表达的制剂中的应用；所述成牙相关基因和/或成骨相关基因为BSP、OCN、DSPP和/或DMP-1。

所述调控具体为：抑制PLOD2基因后，BSP、OCN、DSPP和/或DMP-1的表达得到促进。

本发明提供了PLOD2在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙关键转录因子和/或成骨关键转录因子表达的制剂中的应用；所述成牙和/或成骨关键转录因子为OSX、RUNX2和/或DLX2。

所述调控具体为：抑制PLOD2基因后，转录因子OSX、RUNX2和/或DLX2的表达被抑制。

本发明提供了PLOD2在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

本发明所述调控包括：调控碱性磷酸酶表达、调控根尖牙乳头干细胞体外矿化能力和/或调控根尖牙乳头干细胞钙离子水平。

所述调控具体为：抑制PLOD2基因导致：ALP的表达被抑制，根尖牙乳头干细胞体外矿化能力被抑制、根尖牙乳头干细胞钙离子水平下降。

本发明所述PLOD2为PLOD2蛋白、PLOD2基因序列、能够过表达根尖牙乳头干细胞中PLOD2基因的物质，或者能够敲除或敲低根尖牙乳头干细胞中PLOD2基因的物质。

本发明实验表明，敲减PLOD2后SCAPs的成骨/成牙诱导，发现敲减PLOD2后SCAPs的ALP活性降低，茜素红染色较OCNsh组减弱，这揭示了敲减PLOD2抑制SCAPs早期成骨分化和体外矿化能力。接着Real TimeRT PCR检测了BSP、OCN、DSPP和DMP1的表达水平，发现PLOD2能够负向调控SCAPs中晚期体外成骨/成牙分化；并且对PLOD2sh中成骨/成牙关键转录因子OSX、RUNX2、DLX2的表达也较OCNsh组中明显上调。以上这些实验结果与敲减KDM1A后SCAPs成骨/成牙分化表型一致。这提示KDM1A能够与PLOD2形成蛋白复合体共同调控根尖牙乳头干细胞的骨向/牙向分化

本发明提供了一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，包括PLOD2表达抑制剂或能够敲除、敲低PLOD2基因的物质。

所述能够敲除根尖牙乳头干细胞中PLOD2基因的物质为PLOD2的shRNA，序列为GGATAATGGCTGCACTCTTTG。或者为将PLOD2的shRNA插入慢病毒的shRNA载体上构建而成PLOD2的shRNA质粒。

本发明提供了一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，包括PLOD2蛋白或能够表达PLOD2基因的物质。

所述能够过表达根尖牙乳头干细胞中PLOD2基因的物质为包含PLOD2基因的表达载体；或者由包含PLOD2基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pQCXIN。

本发明提供了一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，敲除或敲低间充质干细胞的PLOD2基因，或以含有PLOD2表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明提供了一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，过表达间充质干细胞的PLOD2基因，或以含有PLOD2的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明研究表明：

1、KDM1A在体外正向调控SCAPs早期成骨/成牙分化指标-ALP活性及体外矿化功能，负向调控SCAPs体外晚期成骨/成牙分化指标及关键转录因子的表达。敲减KDM1A促进SCAPs体内成骨/成牙功能。

2、PLOD2是KDM1A的共结合蛋白，在体外正向调控SCAPs早期成骨/成牙分化指标-ALP活性及体外矿化功能，负向调控SCAPs体外晚期成骨/成牙分化指标及关键转录因子的表达。

3、KDM1A与PLOD2通过形成蛋白复合体共同调控SCAPs成骨/成牙分化与再生功能。

综上，本发明研究结果表明，KDM1A能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响根尖牙乳头干细胞向成骨、成牙的分化，从而影响根尖牙乳头干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有KDM1A基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

附图说明

图1裸鼠皮下回植示意图；

图2示Real Time RT-PCR鉴定KDM1A敲减效率；

图3示Western Blot鉴定KDM1A敲减效率；

图4示敲减KDM1A后，SCAP体外碱性磷酸酶活性降低；

图5示敲减KDM1A后，SCAPs体外矿化能力降低；其中，图5-a示SCAPs成骨/成牙本质向诱导第2周，KDM1Ash茜素红染色较Scramsh组降低；图5-b示SCAPs成骨/成牙本质向诱导第2周，KDM1Ash组钙离子浓度显著降低(P<0.05)；

图6示敲减KDM1A促进BSP、OCN、DSPP、DMP1表达上调；图6-a示在诱导1周时，KDM1Ash组中BSP表达较对照组升高；图6-b示2周时KDM1Ash组OCN的表达才逐渐升高(p＜0.05)；图6-c示KDM1Ash组在诱导1W、2W时DSPP表达明显上调(p＜0.05，p＜0.01)；图6-d示KDM1Ash组在诱导1W、2W时DMP1表达明显上调(p＜0.05，p＜0.01)；

图7示敲减KDM1A后促进OSX、RUNX2、DLX2的表达上调；

图8示KDM1A敲减后SCAPs回植8周后标本HE染色及硬组织的定量分析；其中，图8-a的放大倍数为100倍，标尺长50μm；图8-b的放大倍数为200倍，标尺长100μm；图8-c的放大倍数为100倍，标尺长50μm；图8-d的放大倍数为200倍，标尺长100μm；图中B示骨/牙样组织；HA示羟基磷灰石；CT示结缔组织；

图9示骨样/牙样硬组织定量分析；

图10示KDM1A过表达效果鉴定，β-actin为内参；

图11示蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)发现KDM1A共结合蛋白PLOD2；其中，图11-a示考马斯亮蓝染色发现KDM1A共结合条带；图11-b示Co-IP验证共结合蛋白PLOD2；

图12示10×显微镜下观察到慢病毒整合到SCAP内，绿色荧光蛋白在细胞内表达；

图13示Western Blot在蛋白质水平检测显示PLOD2有效敲除；

图14示敲减PLOD2后，SCAPs碱性磷酸酶活性及茜素红染色减弱；图14-a示成骨/成牙分化诱导第5天时检测PLOD2sh和OCNsh组SCAPs碱性磷酸酶活性，结果显示PLOD2sh组ALP活性减弱；图14-b示成骨/成牙分化诱导第14天时检测SCAPs茜素红染色，结果显示PLOD2sh组染色较OCNsh组弱；

图15示敲减PLOD2促进SCAPs BSP、OCN、DSPP、DMP-1相关成骨/成牙基因的表达上调；其中，图15-a示敲减PLOD2的SCAPs中BSP的表达；图15-b示敲减PLOD2的SCAPs中OCN的表达、图15-c示敲减PLOD2的SCAPs中DSPP的表达、图15-d示敲减PLOD2的SCAPs中DMP-1的表达；

图16示敲减PLOD2后SCAPs成骨/成牙分化转录关键因子OSX、RUNX2、DLX2表达上调。

具体实施方式

本发明提供了KDM1A的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1KDM1A对SCAPs骨向/牙向分化影响

通过构建敲减KDM1A的SCAPs，分别进行体外成骨诱导，及体内裸鼠皮下移植的成骨研究。

1材料和设备

1.1实验材料

人根尖牙乳头组织来自于首都医科大学附属北京口腔医院口腔颌面外科门诊拔除的第三磨牙，患者知情同意，年龄16～20岁，无全身系统性疾病，无龋病及牙周病。

1.2主要试剂

α-MEM培养基：(GIBCO，美国)、胎牛血清：(GIBCO，美国)、L-谷氨酰胺：(invitrogen，美国)、L-抗坏血酸2-磷酸：(sigma，美国)、青霉素、链霉素：(invitrogen，美国)、Dispase：(sigma，美国)、I型胶原酶：(sigma，美国)、0.25％胰蛋白酶：(invitrogen，美国)、PBS：(GIBCO，美国)、DMSO：(北京天根生化科技公司)、成骨诱导培养基(GIBCO，美国)、地塞米松：购自美国Sigma公司、维生素C：购自美国Sigma公司、β-甘油磷酸钠：购自美国Sigma公司、质粒小提试剂盒(Promega公司)、单克隆抗体CD34，CD45，CD105(Biolegend,圣地亚哥,美国)、异丙醇(国药前景，中国)、乙醇(国药前景，中国)、甲醛(国药前景，中国)、丙酮(国药前景，中国)、MgCl₂(Sigma-aldrich，美国)、CaCl₂(Sigma-aldrich，美国)、NP40(Sigma-aldrich，美国)、ALP缓冲液(Sigma-aldrich，美国)、碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-aldrich cat#86C，美国)、茜素红(Sigma-aldrich，美国)、CPC(Sigma-aldrich，美国)、引物(上海生工生物工程有限公司，中国)、QuantiTect SYBRGreen PCR试剂盒：(Qiagen，德国)、逆转录试剂盒(Promega，美国)、定量PCR试剂盒(ABI，美国)、Scramble shRNA(Scramsh)(Addgene，美国)、KDM1AshRNA(KDM1Ash)(Addgene，美国)、慢病毒包装试剂盒(Addgene，美国)、polybrene(Sigma-Aldrich,圣路易斯，美国)、常规HE染色试剂(北京益利精细化学品有限公司，中国)、HA-TCP(羟基磷灰石晶体)(四川大学华西口腔医学院，中国)

1.3主要设备

二氧化碳细胞培养箱：上海Heal Force90型、倒置显微镜及照相系统：日本Olympus公司、电动移液器：德国EPPENDORF公司、台式高速冷冻离心机:Thermo公司MR23型、超净工作台：哈尔滨东联公司FCL-3型、-20℃和4℃冰箱BCD-303W：北京雪花制冷设备公司、-80℃超低温冰箱925：美国Forma Scientific Inc公司、液氮罐：四川乐山东亚机电工贸有限公司、电热恒温水浴箱：北京长风仪器仪表公司、自动细胞计数仪(TC10TM,Bio-RadLaboratories,USA)、酶标仪：美国Molecular Devices公司、GeneAmp PCR System9700：美国Applied Biosystems公司、Mx3005P Real-Time PCR仪：美国Stratagene公司、电子天平和分析天平：德国Sartorius、75cm²细胞培养瓶：美国BD公司、细胞培养皿：美国Costar公司、自动包埋机：美国Leica TP1020、自动切片机：美国Leica RM2255、展片机：美国LeicaHI1210、自动染片机：美国Leica ST5020、显微镜(OLYMPUS)及图像采集系统(Image pro6.0)

2实验方法

2.1SCAPs取材、培养、传代

麻醉下无菌拔除阻生第三磨牙，取出根尖牙乳头组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和Dispase(4g/L)的消化液、37℃消化1h，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于直径35mm细胞培养皿中，在间充质干细胞专用培养基中37℃、5％CO₂培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1：2消化传代。

2.2SCAPs的冻存及复苏

细胞的冻存：观察细胞生长状态，细胞融合至80％左右加入胰蛋白酶消化。1100rpm离心5min，弃上清液。向离心管中加入冻存液，将细胞吹打混匀；向每个冻存管中加入1ml细胞悬液，拧紧盖子。将冻存管依次放入4℃冰箱1h，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜；放入液氮罐中保存。

细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存管置于37℃水浴中快速振荡融化，将冻存管中的液体，轻轻吹打混匀，吸出置于离心管中，1100rpm离心5min，弃上清液，加入间充质干细胞培养基吹打混匀，移入100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后换液。

2.3根尖牙乳头干细胞敲减KDM1A

(1)质粒构建与病毒包装收集

将带有目的基因KDM1A互补序列的shRNA克隆到pLKO.1慢病毒质粒中。病毒包装按照厂家说明书(Addgene)进行，病毒质粒及包装质粒在293T细胞进行转染，转染48h后，收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存于-80℃冰箱。购买商品化的ScrambleshRNA(Scramsh)作为KDM1Ash的对照。

KDM1AshRNAs的目的序列为：5’-AAATAAAGGTTTGACTCGTGG-3’(SEQ ID NO:1)

(2)病毒转染

根尖牙乳头干细胞铺板过夜，慢病毒在6μg/ml polybrene(聚凝胺)作用下转染根尖牙乳头干细胞12h；转染后48h，用1ug/ml的嘌呤霉素筛选7天后，得到KDM1Ash稳定转染的根尖牙乳头干细胞，用real-time PCR在mRNA水平检测KDM1Ash敲减效率；转染空载体的Scramsh的SCAPs作为对照组。

2.4Real-time RT-PCR检测基因表达

2.4.1引物设计

(1)引物设计，Primer 3及oligo 6等生物软件。

(2)RT-PCR引物序列:(表1)

2.4.2细胞总RNA的提取

按试剂说明书进行操作，具体操作如下：

(1)取出培养的6孔板细胞，用PBS漂洗细胞两遍，吸干后每孔加入500μl Trizol，反复吹打混匀，液体由粘稠状变为澄清后转移至DEPC处理的1.5ml EP管中，室温静置5分钟；

(2)加入1/5体积的氯仿(100μl)，剧烈混匀15秒，室温静置10分钟待其分层；

(3)4℃，12000g离心15分钟；

(4)小心吸取上层水相(一般为300μl)，转移至另一DEPC处理的1.5ml EP管中；

(5)加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀后静置，室温孵育10分钟；

(6)4℃，12000g离心10分钟；

(7)弃上清，加入预冷的75％乙醇(DEPC水配制)，颠倒混匀，4℃，7500g离心5分钟，弃上清，瞬时离心；

(8)吸净残留液体，室温干燥5-10分钟，DEPC水(加入50或100ul，根据RNA量多少加入)溶解RNA，-70℃保存收获的RNA待用；

(9)紫外分光光度计测定总RNA浓度及纯度：在紫外分光光度仪下分别测定260nm和280nm吸光度值，计算A260：A280比值，比值在1.8～2.0之间，说明所提取的RNA样品纯度较高；

(10)总RNA电泳鉴定：电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和比值。可见28S和18S条带明亮、清晰、锐利，并且28S的亮度约为18S条带的两倍以上，表明抽提的RNA纯度高且无降解。

表1RT-PCR引物序列

2.5.3反转录cDNA

(1)、Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15μl(表2)；

表2RNA/引物混合液配制

模板RNA	3μl
		Oligo(dT)12-18Primer(50μM)	0.5μl

(2)、70℃保温5分钟后迅速在冰上冷冻2分钟以上；

(3)、离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部；

(4)、在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，于42℃保温2小时；(表3)；

(5)、95℃保温15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液。

2.4.4Real-time PCR

配置Real-time PCR反应体系如下(表4～5)：

表3反转录反应液配制

试剂名称	使用量
		上述模板RNA/引物变性溶液	3.5μL
5×M-MLV Buffer	5μl
		dNTP Mixture(各10mM)	1.25μl
RNase Inhibitor(40U/μl)	25U
		M-MLV(200U/μl)	200U
RNase free dH₂O	up to 25μl

表4Real-time PCR反应体系

反应体系成分	体积(μl)
		5×SYBR Mix	5
PCR Primer(5pmol)	0.5
		ddH₂O	5
cDNA	10.5
		Total	21

表5Real-time PCR反应步骤

2.5蛋白质印迹法(Weston-blot，WB)

2.5.1细胞总蛋白的提取

(1)用4℃预冷的PBS漂洗细胞两次，吸净PBS后，加入2ml PBS用细胞刮将细胞完全刮于培养皿一侧，吸入15ml离心管，2ml PBS冲洗培养皿两次，冲洗液均吸入离心管。4℃，1100rpm离心3min，弃上清。

(2)1ml PBS重悬细胞吸于1.5ml EP管中，4℃，7200rpm离心2min，弃上清。

(3)滴入蛋白裂解(RIPA:PMSF＝100:1)100μl吹打混匀，冰上反应15min，期间每3min震荡混匀。4℃，14000rpm离心20min。

(4)取上清液，转入另一EP管中，-80℃保存，用于测定蛋白浓度和SDS-PAGE电泳。

2.5.2BCA法测定蛋白浓度

(1)根据样品和标准品数量，按每孔加200ul BCA Solution，4ul 4％CupricSulfate(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀；

(2)蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；

(3)取适量样品加入96孔板中，加标准品稀释液到25μl。每孔加入200μl BCA工作液，37℃恒温箱孵育30min；

(4)测定562nm波长的吸光度；

(5)根据标准曲线计算蛋白浓度；

(6)根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg(组别间上样体积差别较大时可用裂解液补齐)。

2.5.3聚丙烯酰胺凝胶电泳

准备玻璃板夹板，用无水乙醇将玻璃擦净，干燥；

根据下表(表6)配置分离胶(其中TEMED在最后加入)，注入玻璃板中(不要有气泡，离薄玻璃板上缘1cm左右)，加异丙醇覆盖胶面；

表6分离胶组方

1.5mol/L Tris-Cl(PH8.8)的配制方法：27.23g Tris base，80ml去离子水，6NHCl调PH值至8.8，加水至150ml，4℃保存。

0.5mol/L Tris-Cl(pH6.8)的配制方法：6g Tris base，60ml去离子水，6N HCl调pH值至6.8，加水至100ml，4℃保存。

(1)待分离胶凝固后，吸出异丙醇(将架子斜置，用吸水纸吸干)；

(2)按上表配置浓缩胶注入玻璃板中，加满，避免产生气泡，放置样品梳；

(3)待浓缩胶凝固后，拔去样品梳，将玻璃夹板固定在电泳槽上，轻轻冲洗点样孔，去除未聚合的凝胶；

(4)立即插入冰中待融化。将待测样本与5×SDS上样缓冲液按照4：1混合，95℃加热5min；

(5)以每孔20μg蛋白量上样；

(6)以60V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。

2.5.4转膜

剪取PVDF膜，使其与待电泳凝胶大小一致，在甲醇中浸泡5秒，置于转移缓冲液中；

取一托盘，倒入转移缓冲液，将凝胶、PVDF膜、纤维垫及滤纸置于其中，浸泡大约15min；

安装“三明治”转移装置(负极面、纤维垫、滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸、纤维垫、正极面)。将装置至于冰盆中，按照100V/250mA的设置电转移；

取出PVDF膜，TBS漂洗5min。

2.5.5Western blot滤膜杂交

将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉(TBST配制)室温摇床封闭1h；

将滤膜取出，放入5％BSA稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜，TBST洗膜，5min×3次；

将滤膜放入封闭液稀释的HRP标记的二抗中，37℃孵育1h，TBST洗5min×3次。

2.5.6显色

将PVDF膜胶面朝上放在保鲜膜上，加1:1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，BIO-RAD化学发生成像系统中成像并用配套Quantity One软件分析结果。

2.6成骨诱导分化

2.6.1成骨诱导培养液的配置:

10mMβ-甘油磷酸钠，10nM地塞米松，50mg/L维生素C；取第3-4代细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，换为成骨诱导培养液，分别在0w、1w、2w时用Trizol裂解细胞提取总RNA进行real-time PCR检测成骨/成牙分化标志基因的表达。

2.6.2碱性磷酸酶活性测定

准备试剂，如下表：

表7试剂配方

操作步骤

1)用标准品制作标准曲线；2)去培养基，PBS洗2次；3)加300μl裂解液，37℃摇床，15min；4)将细胞轻轻刮下，移至1.5ml EP管(置于冰上)，14000rpm，4℃离心10min；5)取上清，移至另一EP管；6)取胶囊，加入5ml纯水溶解(Stock substrate Sol.)；7)取50μl ALP缓冲液加入50μl Stock substrate Sol.，充分混匀；8)置于96孔板中，加入100μl 7)液，10μl上清液，37℃孵育15min；9)加入110μl 0.5N NaOH终止反应；10)酶标仪上读取405nm波长吸光度值(OD值)；11)本实验所用标准曲线换算公式：Y＝18.904X-0.2817Y：碱性磷酸酶ALPsigma unit/min/mg protein X:OD吸光度值要求OD>0.015(X:OD值；Y:Sigma Unit)

2.6.3茜素红染色

弃掉培养基，PBS洗2次；70％乙醇固定，4℃，1h；双蒸水洗2次；40mM茜素红溶液(pH4.2)室温染色1-10min，肉眼观察着色情况；双蒸水洗5次，轻轻吹打；PBS摇动洗15分钟,较少非特异性染色；扫描仪透射模式采集图像。

2.6.4Ca²⁺浓度检测

茜素红染色后，加入1ml 10％w/v CPC(PBS溶解)，室温放置30min(AR-S被溶解至CPC中)；

以1:10稀释溶液，取20μL溶液加入180ul纯水，在酶标仪中以562nm波长测定其吸光度值(OD)；

以AR-S标准曲线计算Ca²⁺的相对浓度，通过标准钙离子浓度曲线计算样本的钙离子浓度，总蛋白质浓度作为内参；

本实验Ca²⁺相对浓度的计算公式：y＝0.685x+0.0503

(y：Ca²⁺相对浓度，x：OD值)

2.7KDM1A敲减后SCAPs关键转录因子表达

分别提取KDM1Ash和Scramsh组细胞RNA，进行Real Time RT-PCR检测关键转录因子：OSX、RUNX2、DLX2的表达水平。

2.8KMD1A敲减SCAPs裸鼠皮下回植

(1)分别取生长状态良好的第4代上述不同分组细胞，以1×10⁵个/瓶的密度接种75cm²的培养瓶，待细胞长至80％汇合度时弃培养基，PBS漂洗(为保证细胞状态，细胞汇合度不宜过大)。

(2)每组细胞加2.5mlⅡ型胶原酶(含100ug/ml TLC)37℃孵育5min，将细胞从培养皿上洗脱，然后将细胞悬液转移至50ml的离心管中。

(3)1000rpm，4℃离心5min。

(4)用上述含20％FBS和L-谷氨酰胺的α-MEM培养基重悬细胞，计数，取1ml细胞悬液至含有20mg羟基磷灰石(HA)的2ml圆底EP管中(要保证每组细胞量一致，约2-3×10⁶个细胞/组)。

(6)37℃，5％CO₂条件下孵育1.5h。为保证细胞与HA-TCP充分结合，应在摇动的情况下孵育。

(7)短时离心，使HA-TCP沉于管底，吸上清，细胞与HA-TCP混合物置于冰上待用。

(8)裸鼠称重，1％水合氯醛腹腔注射麻醉。75％酒精消毒后背部皮肤，在后背部中线处剪一2-3cm的切口。

(9)钝性分离皮下结缔组织，按图1所示位置将细胞与HA混合物植入裸鼠皮下，每只裸鼠背部后方植入2个部位，缝合皮肤。

2.9标本处理

2.9.1标本脱钙

体内移植8周后处死(脱颈)裸鼠，取移植物经10％中性福尔马林固定后，转至PH值等于8.0的10％EDTA内，每天换液，直到针刺变软。

2.9.2组织切片制备

完全脱钙后流水冲洗24小时(除酸)进行脱水包埋。

(1)脱水：梯度乙醇脱水(70％，80％，90％，100％，100％各2小时)

(2)透明：二甲苯(2次各30分钟)；

(3)包埋：将脱过水的组织转至处理好的石蜡(石蜡熔化，于60℃放置过夜)中，浸蜡(1小时×2次)，然后包埋取出标本；

(4)切片：在自动切片机上进行连续切片。切片厚度为4-6μm，60℃烤片4小时，4℃保存。

2.9.3石蜡切片HE染色步骤

二甲苯Ⅰ：10min；二甲苯Ⅱ：10min；无水乙醇Ⅰ：3min；无水乙醇Ⅱ：3min；95％乙醇Ⅰ：3min；95％乙醇Ⅱ：3min；85％乙醇：3min；75％乙醇：3min；流水冲洗：3min；蒸馏水洗：1min；苏木精液染色：2min；流水洗去苏木精液：30s；1％盐酸-乙醇：3s；流水冲洗返蓝：10min；蒸馏水洗：1min；0.5％伊红液染色：1min；蒸馏水稍洗：2s；80％乙醇：10s；95％乙醇Ⅰ：10s；95％乙醇Ⅱ：10s；无水乙醇Ⅰ：10s；无水乙醇Ⅱ：10s；二甲苯Ⅰ：2min；二甲苯Ⅱ：2min；中性树胶封固；Image Pro软件计算平均成骨面积。

3统计分析

采用SPSS 22.2统计学软件进行统计学分析，两组计量资料比较采用t检验，P<0.05有统计学意义。

3实验结果

1、检测SCAPs中KDM1A敲减效率

体外分别利用慢病毒对SCAPs进行转染，获得稳定转染的敲减KDM1A的根尖牙乳头干细胞。Real Time RT-PCR和Western Blot在mRNA水平及蛋白质水平检测敲减效率，发现可以有效的敲减KDM1A，差异有统计学意义(P<0.05)(图2～3)；图2通过Real TimeRT-PCR鉴定，KDM1A敲减效率超过60％(P≤0.05)，GAPDH为内参；图3Western Blot结果显示KDM1A有效敲减，GAPDH为内参。以上为三次独立实验重复结果。

2、敲减KDM1A对SCAPs体外成骨/成牙分化能力的影响

对敲减KDM1A的SCAPs进行成骨诱导，诱导第5天时检测KDM1Ash和Scramsh组碱性磷酸酶活性发现KDM1Ash组明显低于对照Scramsh组(图4)，差异有统计学意义(P<0.05)。

成骨诱导2周后，茜素红染色显示对照组片状红色着色，KDM1Ash组着色较浅(图5-a)，钙离子浓度检测发现KDM1Ash组较Scramsh组钙离子浓度明显降低(图5-b)，差异有统计学意义(P<0.05)；以上为三次独立实验重复结果。

成骨诱导第0天，7天，14天时提取KDM1Ash组和Scramsh组细胞RNA，Real TimePCR检测成骨/成牙相关基因：BSP(图6-a)、OCN(图6-b)、DSPP(图6-c)、DMP-1(图6-c)的表达。结果显示，实验组(KDM1Ash)与对照组(Scramsh)相比，BSP在成骨诱导1w时表达明显上调，而OCN则是在2周时表达上调，DSPP和DMP-1的表达明显增强(图6)，差异有统计学意义(P<0.05)。GAPDH为内参。以上为三次独立实验重复结果。

进而我们又检测了成骨/成牙关键转录因子OSX、RUNX2DLX2的表达。Real TimeRT-PCR结果显示OSX、RUNX2、DLX2的表达在KDM1Ash组显著高于Scramsh组(图7)，GAPDH为内参。以上为三次实验独立重复结果。差异有统计学意义(P<0.05)。

3、敲减KDM1A对SCAPs体内成骨/成牙能力的影响

(1)大体观察

8周后，裸鼠全部存活，体内移植后，裸鼠生存良好，术区无感染，移植物无炎症反应，切口愈合良好；裸鼠体内移植物HE染色结果8周后取材，脱钙，制取石蜡切片。

(2)组织病理学观察

HE染色显示KDM1A基因敲减组及对照组均有类骨质组织形成，KDM1A基因敲减组形成的类骨质组织明显多于对照组(图8)。

(3)定量分析结果。

应用IPP6.0软件对体内移植的各组样本(n＝7)的形成的类骨质面积与纤维组织面积的比值进行计算，结果显示(图9)KDM1Ash组形成的类骨质面积显著多于Scramsh组,(P<0.01)。以上研究结果表明基因敲减KDM1A可以明显促进根尖牙乳头干细胞在体内形成硬组织。

实施例2KDM1A调控SCAPs成骨/成牙向分化的作用机制

1、实验材料

应用第一部分实验中培养的根尖牙乳头干细胞及经过病毒转染稳定过表达KDM1A基因的根尖牙乳头干细胞及对照组细胞。

1.1主要试剂

α-MEM培养基：(GIBCO，美国)胎牛血清：(GIBCO，美国)L-抗坏血酸2-磷酸：(sigma，美国)L-谷氨酰胺：(invitrogen，美国)青霉素、链霉素：(invitrogen，美国)0.25％胰蛋白酶：(invitrogen，美国)PBS：(GIBCO，美国)DMSO：(北京天根生化科技公司，美国)质粒小提试剂盒(Promega公司，美国)pLKO.1慢病毒载体(Addgene,Cambridge,MA,美国)HA-KDM1A质粒(中美太和公司，中国)polybrene(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国)PIERCE HA-TAGIP/CO-IP KIT(Thermo Pierce,美国)抗KDM1A单克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)抗HA单克隆抗体(Cell Signaling Technology,美国)抗PLOD2多克隆抗体(Abnova，Taibei，Taiwan)抗β-actin单克隆抗体(Abcam,美国)辣根过氧化物酶：羊抗鼠；羊抗兔(Abcam,美国)Lysis buffer：(sigma，美国)PMSF：(sigma，美国)PIC：(sigma，美国)WB显影液：(普利来公司，中国)WB定影液：(普利来公司，中国)WB发光液：(Pierce公司，美国)胰蛋白酶(测序级)：(Promega公司，美国)LC-18SPE：(Waters公司，美国)

1.2实验设备

二氧化碳细胞培养箱：上海Heal Force90型倒置显微镜及照相系统：日本Olympus公司台式高速冷冻离心机:Thermo公司MR23型电动移液器：德国EPPENDORF公司超净工作台：哈尔滨东联公司FCL-3型液氮罐：四川乐山东亚机电工贸有限公司-20℃和4℃冰箱BCD-303W：北京雪花制冷设备公司-80℃超低温冰箱925：美国Forma Scientific Inc公司电热恒温水浴箱：北京长风仪器仪表公司酶标仪：美国Molecular Devices公司电子天平和分析天平：德国Sartorius细胞培养皿：美国Costar公司70μm细胞筛、24孔和96孔细胞培养板：美国FalOCN公司蛋白质谱仪Q-Exactive：美国Thermo2

2实验方法

2.1根尖牙乳头干细胞过表达KDM1A

(1)质粒的构建与病毒包装收集

通过NCBI数据库查询KDM1A的基因全场编码序列，找到KDM1A的编码区，在KDM1A的起始密码子编码区之前加上kozak序列和表面标签HA Tag，将其连接到pQCXIN逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成KDM1A的质粒，pQCXIN空载体作为对照。质粒构建由北京中美太和有限公司提供服务。

提取质粒后酶切、测序鉴定。

逆转录病毒对照空质pQCXIN，pQCXIN-HA-KDM1A及相应的包装质粒(VSVG和GPZ)在293T细胞进行转染；转染72小时，收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。

(2)病毒转染

对照质粒及过表达KDM1A的慢转录病毒在6μg/ml polybrene作用下转染根尖牙乳头干细胞12h，转染后48h，抗菌素600ug/ml neromycin筛选10天得到稳定转染细胞，用Western Blot在蛋白水平检测KDM1A的表达，得到KDM1A过表达的稳定转染细胞。

2.2蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)

(1)过表达KDM1A以及对照组细胞总蛋白的提取

1)弃培养基，用4℃预冷的5ml PBS漂洗细胞两次，加入5ml PBS后，用细胞刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1ml PBS重悬细胞，收于EP管，7200rpm离心2min；

2)弃上清，以1:5(细胞：裂解液)体积比加裂解液(100ul Co-IP+1ul PMSF+1ulPIC)，冰上15min，每2-3min混悬一次；

3)4℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中，-80℃保存；

(2)Bradford法测定蛋白浓度

1)BSA蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；

2)根据样品和标准品数量，按每孔加200ul 1X考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；

3)测定595nm波长的吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度；

4)根据蛋白浓度计算上样体积，Input组蛋白的上样量为25μg，(PBS：PMSF：PIC＝100：1:1)补齐体积至20ul；

5)Input组加入5ul 4×loading buffer，95℃-99℃加热变性10min，置于冰上10min，-20℃待用。

(3)Co-IP组蛋白处理：

1)解液加入离心柱内(蛋白量需达到400-600ug)。

2)将anti-HA的琼脂糖珠子混匀后取20ul加入离心柱内，4℃翻转摇床过夜。

3)配置清洗液：0.05％的TBS-T(TBS+0.05％Tween)；将翻转过夜的离心柱松开上部盖子，取下底部塞子，置于收集管内，离心10s，弃收集管内废液。

4)将离心柱重新置于收集管中，加入上述清洗液0.5ml，轻柔混匀，离心10s，弃收集管内废液，重复2-3次。

5)将离心柱置于新的收集管中，加入25ul 2X Non-Reducing Sample Buffer，轻柔混匀，95℃-100℃加热5分钟，离心10s，松开底部塞子将液体收集到新的收集管内，加入2ul巯基乙醇，-20℃保存待用。

(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)准备预成胶；

2)上样，以80V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到120V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳；

(5)染色

1)取出整块胶，放入1×考马斯亮蓝染色中，常温染色1小时。

2)冰醋酸脱色1小时

3)扫描仪观察共结合条带。

2.3蛋白质谱分析

(1)SDS-PAGE分离：

胶上酶解：胶粒用50μl脱色液(50％乙腈，25mmol/L碳酸氢铵)，室温放置30分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。抽真空离心干燥30分钟左右至白色颗粒状，加入2μl(浓度为10ng/μl)溶于20mM碳酸氢铵的胰蛋白酶4℃吸胀1小时，吸去多余的酶液，将管子倒置，37℃空气浴过夜。每块胶加入8μl 5％三氟乙酸，40℃1小时，与前一次的提取液合并，抽真空离心干燥。

(2)液相色谱串联质谱

纳流液相为Thermo Scientific Easy-nLC 1000，流动相A为0.1％甲酸水溶液；溶液B为0.1％甲酸乙腈溶液。液相梯度设置为：4分钟，8％B相；45分钟，30％B相；55分钟，90％B相；60分钟，90％B相。

质谱仪为Q-Exactive，碰撞能量为27％HCD，分辨率设置为一级70000m/z 200，二级17500m/z 200，母离子扫描范围为m/z 300-1800，子离子扫描范围起始位m/z 100，数据依赖模式MS/MS，隔离窗口为1.6Da，动态排除为60s；喷雾电压为2.0kV，毛细管温度为275℃，S-lens：55％。

(3)使用Proteome Discoverer1.4数据分析软件对质谱结果进行序列分析，磷酸化位点识别，数据库为Uniprot蛋白库下载的P02662和P02663(Alpha-S1-casein)和P37840(Alpha-synuclein)的氨基酸序列构建的数据库，使用Sequest搜库引擎，搜库参数设置为：酶解位点为精氨酸(R)，赖氨酸(K)，允许有两个漏切位点，允许一侧非特异性酶解，固定修饰：半胱氨酸的carbamidomethylation。可变修饰：Oxidation/+15.995Da(M)，Deamidated/+0.984Da(N，Q)，Phospho/+79.966Da(S，T，Y)。

2.4蛋白组分析验证

(1)蛋白质免疫共沉淀：同实施例1至聚丙烯酰胺凝胶电泳完毕

(2)转膜：

1)准备预成膜；2)将电泳胶转移至预成膜中，使用BioRad半干转进行转膜；3)取出PVDF(Polyvinylidene difluoride,PVDF,聚偏二氟乙烯膜)膜，TBST漂洗5min；

(3)Western blot滤膜杂交

1)将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭1小时；2)TBST漂洗10min×3次；3)取出滤膜，置于5％脱脂奶粉稀释的一抗中，4℃摇床过夜；4)TBST洗膜，10min×3次；5)将滤膜置于5％脱脂奶粉稀释的二抗中，室温摇床孵育1小时；6)TBST洗膜，10min×3次；

(4)显色

将PVDF膜放在保鲜膜上，加入显影液，BIO-RAD化学发生成像系统中成像。

2.5根尖牙乳头干细胞PLOD2敲减质粒构建与病毒转染

(1)PLOD2敲减质粒构建

由苏州吉玛公司服务构建质粒以及病毒包装，滴度测定，-80℃分装保存待用。

LV3shRNA(OCNsh)作为对照，PLOD2shRNAs的目的序列为：5’-GGATAATGGCTGCACTCTTTG-3’(SEQ ID NO:20)

(2)PLOD2慢病毒转染

对照质粒及敲减PLOD2的慢转录病毒在6μg/ml polybrene作用下转染根尖牙乳头干细胞12h，转染后48h，绿色荧光显微镜观察转染效率，抗菌素1ug/ml puromycin筛选3天得到稳定转染细胞，用蛋白质免疫印迹在蛋白水平检测PLOD2的表达，得到敲减PLOD2的稳定转染细胞。

2.6成骨/成牙诱导分化、ALP活性、茜素红染色、Real-time PCR检测成骨/成牙分化指标

方法同实施例1

3.统计分析

4、实验结果

1、SCAPs中KMD1A过表达效率

体外利用逆转录病毒对SCAPs进行转染，获得稳定转染的过表达KDM1A的根尖牙乳头干细胞。Western Blot在蛋白质水平检测效率，发现可以有效的过表达KDM1A(图10)。以上为三次独立实验重复结果

2、免疫共沉淀及蛋白组质谱分析发现KDM1A共结合蛋白

(1)考马斯亮蓝染色后可见KDM1A共结合蛋白条带(图11-a)，蛋白组质谱分析发现可能的共结合蛋白为PLOD2，分子量为80.609kDa；Score Mascot为337.4312987。

(2)利用Pierce HA-TAG IP/Co-IP试剂盒提取过表达KDM1A的SCAPs蛋白，免疫印迹验证PLOD2能够与KDM1A形成蛋白复合体(图11-b)

3、SCAPs中PLOD2的敲减效率

体外利用慢病毒对SCAPs进行转染，获得稳定转染的敲减PLOD2的根尖牙乳头干细胞，对照组空载体OCNsh组。绿色荧光显微镜下观察细胞转染情况(图12)，Western Blot在蛋白质水平检测效率,发现可以将PLOD2有效的敲减(图13)。

4、敲减PLOD2对SCAPs成骨/成牙分化能力的影响

对敲减PLOD2的SCAPs进行成骨诱导，诱导第5天时检测PLOD2sh和OCNsh组碱性磷酸酶活性发现PLOD2sh组明显低于对照LV3组(图14-a)。成骨诱导2周后，茜素红染色显示PLOD2sh组片状红色着色，较对照组弱(图14-b)；

接着分别在成骨诱导第0天，7天，14天时提取PLOD2sh组和OCNsh组细胞RNA，RealTime PCR检测成骨/成牙相关基因：BSP(图15-a)、OCN(图15-b)、DSPP(图15-c)、DMP-1(图15-d)的表达，发现：在诱导1W时PLOD2组中BSP、OCN、DMP-1、DSPP的表达均较OCNsh组增强，而在成骨/成牙诱导2W时BSP的表达在PLOD2sh和OCNsh组中无明显差异，PLOD2sh组中OCN、DSPP、DMP1的表达仍较OCNsh组明显上调(图15)，差异有统计学意义(P<0.05)。GAPDH为内参。以上为三次独立实验重复结果。

继而检测成骨/成牙关键转录因子OSX、RUNX2和DLX2的表达，Real Time RT-PCR结果显示OSX、RUNX2、DLX2在PLOD2sh组表达较OCNsh组升高(图16)，差异有统计学意义(P<0.05)。GAPDH为内参基因。以上为三次独立实验重复结果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京口腔医院

<120> KDM1A的用途

<130> MP1709585

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaataaaggt ttgactcgtg g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggaccaata cgaccaaatc cg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agccacatcg ctcagacacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcactagtg gcaggagaag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccaacaatc acatcgtcac 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caggccacga tattatcttt aca 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcctcttct tcctcctcct c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcaaaggtg cagcctttgt 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgcctgggt ctcttcact 19

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgacataggt cacaatgagg atgtcg 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgcttccag ctacttgagg tc 22

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtggacaaa gaagatagca actccacg 28

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttccggctct ctatctcaat gttt 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cctcctcagc tcaccttctc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gttgggagcc caaatagaaa 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcttagaaca aattctgccc ttt 23

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgctttggtc ttgaaatcac a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cctgagaagg aggaccttga 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttccggactt tctttggct 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggataatggc tgcactcttt g 21

Claims

1.KDM1A在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨相关基因表达的制剂中的应用；所述成牙相关基因和/或成骨相关基因为BSP、OCN、DSPP和/或DMP-1。

2.KDM1A在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙关键转录因子和/或成骨关键转录因子表达的制剂中的应用；所述成牙和/或成骨关键转录因子为OSX、RUNX2和/或DLX2。

3.KDM1A在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控包括：调控碱性磷酸酶表达、调控根尖牙乳头干细胞体外矿化能力、调控根尖牙乳头干细胞钙离子水平和/或调控SCAPs形成类骨质的能力。

5.一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其特征在于，包括KDM1A表达抑制剂或能够敲除、敲低KDM1A基因的物质。

6.一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其特征在于，包括KDM1A蛋白或能够表达KDM1A基因的物质。

7.一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其特征在于，敲除或敲低间充质干细胞的KDM1A基因，或以含有KDM1A表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

8.一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其特征在于，过表达间充质干细胞的KDM1A基因，或以含有KDM1A的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

9.KDM1A在制备与PLOD2相互作用的物质中的应用。

10.PLOD2在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨相关基因表达的制剂中的应用；所述成牙相关基因和/或成骨相关基因为BSP、OCN、DSPP和/或DMP-1。

11.PLOD2在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙关键转录因子和/或成骨关键转录因子表达的制剂中的应用；所述成牙和/或成骨关键转录因子为OSX、RUNX2和/或DLX2。

12.PLOD2在制备调控根尖牙乳头干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

13.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控包括：调控碱性磷酸酶表达、调控根尖牙乳头干细胞体外矿化能力和/或调控根尖牙乳头干细胞钙离子水平。

14.一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其特征在于，包括PLOD2表达抑制剂或能够敲除、敲低PLOD2基因的物质。

15.一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其特征在于，包括PLOD2蛋白或能够表达PLOD2基因的物质。

16.一种促进根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其特征在于，敲除或敲低间充质干细胞的PLOD2基因，或以含有PLOD2表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

17.一种抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其特征在于，过表达间充质干细胞的PLOD2基因，或以含有PLOD2的诱导液对间充质干细胞进行诱导。