CN107299084A - 发生上皮间质化的循环肿瘤干细胞在肺癌增殖、耐药及转移疾病中的应用 - Google Patents
发生上皮间质化的循环肿瘤干细胞在肺癌增殖、耐药及转移疾病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及发生上皮间质化的循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌增殖、耐药及转移疾病中的应用。其优点表现在:本发明建立了一种提取并体外培养获得发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的方法,并建立了相关非小细胞肺癌发生上皮间质化的循环肿瘤细胞系,为研究非小细胞肺癌转移提供了新的研究手段和方法。通过体外和体内实验检测了该细胞系在肿瘤增殖、迁移、侵袭和耐药中的作用,表明上皮间质化在肿瘤生长和转移过程中扮演着重要的角色。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体地说,是发生上皮间质化的循环肿瘤干细胞在肺癌增殖、耐药及转移疾病中的应用。
背景技术
近5年中因恶性肿瘤造成的死亡在全球死亡疾病谱中一直居于首位,而因恶性肿瘤死亡的患者中又以肺癌患者人数居多。根据病理类型可将肺癌分为两大类,分别是小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。众所周知,癌症患者往往死于癌症转移所造成的并发症,而不是原发肿瘤本身。既往临床资料表明,不止中晚期的肺癌患者会出现转移,即使是接受过根治性治疗的早期肺癌患者,仍会有很高的概率出现复发和转移。
癌症的转移是一个包含了很多关键事件复杂过程:理论上肿瘤细胞需要首先从原发病灶中分离,突破基底膜结构,然后通过自身发生变形迁移进入血液循环;或者由于其他原因直接进入血管或淋巴系统,之后还需要在血液中成功存活并停留在靶器官处,重新进行自我复制并最终形成临床可见的远处转移病灶。随着实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)、流式细胞术、密度梯度离心、免疫磁珠分选等技术的出现,人们在大多数癌症患者的外周血中检测出了肿瘤细胞,并把这种存在于血液循环中的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumorcells,CTCs)。CTCs的发现部分验证了关于肿瘤转移机制的“种子与土壤”的假说,并促使我们从一个新的视角对肿瘤转移这个概念进行思考,循环肿瘤细胞是联系肿瘤原发灶和转移灶之间的桥梁,通过对肿瘤循环肿瘤细胞进行研究,可以对肿瘤转移的生物学机制获得更好的认识。
研究者认为,即使不是全部,肿瘤原发灶也是CTCs的重要来源之一,据估算,癌症患者体内大约存在有8000~120000个循环肿瘤细胞。患者外周血中CTCs数量越多,患者生存时间越短。但这些CTCs的性状之间存在着较大的差异,有的是单个细胞,有的是细胞团,有的与血细胞之间关系密切,还有一部分是没有活力的死细胞。考虑到CTCs数量与临床转移灶之间的巨大差距,有理由推测,真正能成功定植在靶器官并最终成为新的转移灶的CTCs应该只是这些细胞中某种亚型。因此肿瘤干细胞的学说近来逐渐引起研究者们的重视,该理论认为,不是所有的肿瘤细胞都有形成肿瘤的能力,肿瘤组织的不断增长是由于肿瘤干细胞自我复制和分化的结果。目前,这一猜测已在动物模型上得到了部分验证,实验结果表明,大部分CTCs在进入循环系统不久之后便已死亡,只有约0.01%-2.5%的CTCs可以形成转移灶。而某些表达正常干细胞标志的如CD44、CD133的乳腺癌细胞亚群则拥有与正常干细胞相似的特性,并且具有更强的成瘤能力。
临床检测结果表明,在非小细胞肺癌患者外周血中的一部分循环肿瘤细胞发生了上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。EMT是指上皮细胞间紧密连接蛋白表达量减少,细胞微丝、骨架蛋白表达量增加;同时细胞形态由上皮细胞形态(细胞间紧密连接,有极性)向间质细胞形态(细胞便为纺锤形,变形和移动能力增强)转变。现有结果表明,当肿瘤细胞发生EMT后,其侵袭转移能力增加、凋亡减少、对常规化疗药物或靶向治疗药物的抵抗性均明显增强。
根据上述理论和实验结果,我们推测,这些NSCLC患者外周血中发生了EMT的循环肿瘤细胞亚群很可能是就是肺癌肿瘤干细胞所在的亚群。如果能对此种细胞进行表型和基因型特性的深入研究,可以极大的促进我们对肿瘤转移相关机制的认识,并为新的抗癌药物的研发提供潜在的治疗靶点。但由于此类细胞数量稀少,受目前技术手段和伦理的限制,我们难以获得足够的样本或对临床患者进行长期的连续观测。因此,我们尝试制作一种可连续观测肿瘤进展情况的人肺腺癌原位移植动物模型。从模型上分离发生EMT的CTCs,检测并比较其与原始肿瘤细胞的生物学特性和基因差异,探究EMT和CTCs在肺癌转移过程中所扮演的角色和作用。为CTCs和EMT的研究提供新的研究思路和方法,并对肺癌的诊断和治疗提供一定的理论基础和研究方向。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的建立方法。
本发明的第二个目的是,提供一种肺腺癌循环肿瘤细胞的制备方法。
本发明的第三个目的是,提供一种肺腺癌发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的制备方法。
本发明的第四个目的是,提供一种发生上皮间质化的循环肿瘤细胞。
本发明的第五个目的是,提供一种发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的应用。
本发明的第六个目的是,提供一种抑制肺癌转移的药物。
本发明的第七个目的是,提供检测发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的试剂的一种新用途。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:一种人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的建立方法,所述的建立方法包括以下步骤:(1)制备肺腺癌高转移细胞/基质胶混合物,(2)麻醉BCLB/c裸鼠,(3)经过BCLB/c裸鼠的肋骨间隙注射肺腺癌高转移细胞与基质胶的混合物。
步骤(1)为:基质胶提前一天由-20℃保存至4℃,并在冰盒上进行下述操作:倒置相差显微镜下观察见细胞系占培养瓶底面积80-90%时,消化并使用1×PBS重悬细胞,计数后与基质胶按照1:2的比例进行混合,使细胞终浓度为105/20μl。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:一种肺腺癌循环肿瘤细胞的制备方法,所述的制备方法包括以下步骤:(1)利用绿色荧光蛋白(GFP)标记标记肿瘤细胞;(2)建立人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型;(3)在BCLB/c裸鼠外周血中获得循环肿瘤细胞。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:一种肺腺癌发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的制备方法,所述的制备方法包括以下步骤:(1)建立人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型;(2)在BCLB/c裸鼠外周血中获得循环肿瘤细胞;(3)利用流式细胞仪分离获得发生上皮间质化的循环肿瘤细胞。
步骤(2)为:在荷瘤成功7天后,对BCLB/c裸鼠取血,并裂解和去除红细胞。
步骤(3)为:加入EPCAM抗体,室温避光孵育20分钟,期间每隔10分钟重悬细胞1次,随后使用流式细胞仪进行检测、分选出EPCAM(-)/GFP(+)的细胞亚群。
为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:上述制备方法制得的发生上皮间质化的循环肿瘤细胞。
为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:所述的发生上皮间质化的肿瘤循环细胞作为肿瘤干细胞的应用。
为实现上述第六个目的,本发明采取的技术方案是:一种抑制肺癌转移的药物,所述的药物可抑制上皮间质化的循环肿瘤细胞。
为实现上述第七个目的,本发明采取的技术方案是:检测发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的试剂在制备预测肺癌的耐药、复发或转移的试剂中的应用。
本发明优点在于:
1、本发明建立了可重复检测外周血中CTCs的肺原位移植瘤BCLB/c裸鼠模型。
2、本发明在BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤外周血中分离出发生了EMT的肺癌细胞PC-9EMT并成功进行了体外培养。
3、本发明通过细胞学实验证明PC-9EMT细胞同时具有间质细胞和干细胞的特征。
附图说明
附图1:稳定表达GFP荧光蛋白的PC-9H细胞的获得和人肺腺癌原位移植小鼠模型的建立。A:稳定表达GFP荧光蛋白的PC-9H细胞。B-D:人肺腺癌原位移植小鼠模型的建立过程。
附图2:利用PC-9H(GFP)细胞建立的人肺腺癌原位移植BCLB/c裸鼠模型肿瘤生长情况的连续观测。
附图3:人肺腺癌原位移植BCLB/c裸鼠模型在不同时间段利用流式细胞仪对外周血中循环肿瘤细胞的进行检测与分选。A:BCLB/c裸鼠荷瘤后7天。B:BCLB/c裸鼠荷瘤后14天。C:BCLB/c裸鼠荷瘤后21天。D:对BCLB/c裸鼠外周血中发生EMT的循环肿瘤细胞进行分选。
附图4:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞在倒置相差显微镜下分别在放大40倍、100倍和200倍时的的形态。
附图5:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞成瘤在BCLB/c裸鼠体内成瘤能力的比较。
附图6:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞EPCAM蛋白表达水平免疫荧光实验结果。
附图7:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞CDH1蛋白表达水平免疫荧光实验结果。
附图8:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞VIM蛋白表达水平免疫荧光实验结果。
附图9:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞中CDH1、EPCAM、VIM、蛋白表达水平的免疫印迹实验结果。
附图10:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞的Transwell实验结果。
附图11:利用CCK8原理检测并绘制的PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞在正常培养状态和加入不同浓度奥沙利铂后的增长曲线图。
附图12:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞的克隆形成实验结果。箭头处标示的是PC-9H细胞克隆形成实验中展现出间质细胞形态的克隆细胞团。
附图13:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞的成球培养实验结果。
附图14:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞周期实验结果。
附图15:PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞凋亡实验结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实验材料
雄性BCLB/c裸鼠(订购于华东师范大学动物实验中心)
稳定表达Luciferase的人肺腺癌PC-9细胞系(在本文中的名称为PC-9L)
利用PC-9L细胞对BCLB/c裸鼠进行左心室注射并挑选转移灶分离培养,反复筛选六次后得到的肺腺癌高转移细胞PC-9H
293T细胞
(一)实验仪器
液氮罐(型号:XC 20,Chart MVE公司,美国)
超净工作台(Thermo公司,美国)
温度可调节式电加热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械有限公司,中国)
37℃恒温CO2培养箱(Heraeus公司,德国)
倒置相差显微镜(型号:IX70,Olympus公司,日本)
-80℃深低温冰箱(青岛海尔公司,中国)
小型高速离心机(江苏正基仪器有限公司,中国)
高速冷冻离心机(Eppendorf公司,德国)
大型高速离心机(Eppendorf公司,德国)
小动物活体成像仪(CALPER LIFE SCIENCE公司,美国)
高通量流式细胞仪(Merck Millipore公司,德国)
全自动发光分析仪(美国,BMG Biotech公司)
小型漩涡振荡器(江苏其林医用仪器厂,中国)
高压蒸汽消毒器(上海新诺仪器厂,中国)
温度可调式恒温干燥烘箱(中国,上海通用医疗器械厂)
电子天平(中国,上海良平仪器公司)
(二)实验耗材
2ml细胞冻存管(货号:430659,corning公司,美国)
2ml纸质冻存盒(货号:BS-20-TB100S,Biosharp公司,中国)
细胞计数板(南京建成生物工程研究所,中国)
手动计数器(山东五岳体育器材有限公司,中国)
96孔板(货号:3599,Corning公司,美国)
24孔板(货号:3524,Corning公司,美国)
12孔板(货号:3513,Corning公司,美国)
6孔板(货号:3516,Corning公司,美国)
6cm培养皿(货号:430166,Corning公司,美国)
10cm培养皿(货号:4301667,Corning公司,美国)
透气可旋盖细胞培养瓶(货号:430639,Corning公司,美国)
巴氏吸管(货号:BS-QT-005,Corning公司,美国)
微量注射器(25μl,上海高鸽工贸有限公司,中国)
200μl eppendorf(EP)管(货号:PCR-05-C,Axygen公司,美国)
1.5ml eppendorf(EP)管(货号:MTC-150-C,Axygen公司,美国)
5ml eppendorf(EP)管(货号:MTC-200-C,Axygen公司,美国)
15ml离心管(货号:430791,Corning公司,美国)
50ml离心管(货号:430829,Corning公司,美国)
封口膜(货号:CZ-06720,Parafilm公司,美国)
(三)实验试剂
1640培养基(货号:31800022,GIBCO,Invitrogen公司,美国)
DMEM高糖培养基(货号:12100046,GIBCO,Invitrogen公司,美国)
胎牛血清(Fetal Bovine SerμM,FBS)(货号:S158G-500,Biowest公司,法国)
青霉素G钠盐(货号:0242-25MU,Amresco公司,美国)
硫酸链霉素(货号:0382-10G,Amresco公司,美国)
0.25%胰酶含EDTA(货号:25200,GIBCO,Invitrogen公司,美国)
GFP+Puro慢病毒(试用装,汉恒生物,中国)
LipoFiterTM脂质体转染试剂(货号:HB-TRLF-1000,汉恒生物,中国)
红细胞裂解液(产品编号C3702,碧云天公司,中国)
EPCAM抗体(货号:324208,Biolegend公司,美国)
磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(货号:G0002,谷歌生物公司,中国)
异氟烷(上海雅培制药有限公司,中国)
金霉素眼膏(南京白敬宇制药有限责任公司,中国)
D-荧光素酶钾盐(上海AOK Chem公司,中国)
肝素钠注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司,中国)
二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(货号:SBJ-0844,南京森贝伽生物科技有限公司,中国)
基质胶(货号:356234,BD公司,美国)
实施例1:人肺腺癌PC-9H细胞系的复苏、体外传代培养与冻存
(一)PC-9H细胞系的复苏
从液氮罐中取出PC-9H细胞冻存管,在37℃恒温水浴箱中进行复温,当冻存管中内容物完全融化后,使用小型离心机122G离心6分钟。弃去上清液,使用含有10%FBS的1640培养基重悬细胞。转置于细胞培养瓶中并放入在37℃,5%CO2可调式恒温培养箱中培养。24小时后换液。
(二)PC-9H细胞系的体外传代培养
倒置相差显微镜下观察见PC-9H细胞系占培养瓶底面积80-90%时,进行传代操作。首先,丢弃细胞培养瓶中旧培养基并使用1×PBS冲洗两遍,随后加入500μl胰酶,37℃孵育3分钟,倒置相差显微镜下观察见细胞变圆或漂浮后加入500μl FBS中和胰酶,之后使用小型离心机以112G离心6分钟。丢弃上清后加入含10%FBS的1640培养基重悬细胞,按照1:2或1:3的比率加入细胞培养瓶中。之后把细胞放入37℃,5%CO2可调式恒温培养箱中培养。
(三)PC-9H细胞系的冻存
倒置相差显微镜下观察见PC-9H细胞系占培养瓶底面积80-90%时,进行冻存操作。首先,丢弃细胞培养瓶中旧培养基并使用1×PBS冲洗两遍,随后加入500μl胰酶,37℃孵育3分钟,倒置相差显微镜下观察见细胞变圆或漂浮后加入500μl FBS中和胰酶,之后使用小型离心机以112G离心6分钟。丢弃上清后加入1.5ml混合好的冻存液(含FBS和DMSO,比值为9:1)并转置到冻存管中。用封口膜封紧冻存管口并做好标记,之后把细胞放入程序性细胞降温盒中并在-80℃深低温冰箱内过夜,第二天把冻存管转置于液氮罐中,长期保存。
实施例2:GFP慢病毒感染人肺腺癌PC-9H细胞系
(一)检测GFP-Pour慢病毒滴度
1、细胞准备
倒置相差显微镜下观察见293T细胞将生长状态良好,巴氏吸管吸尽培养基,1×PBS冲洗两遍后,加入胰酶500μl,37℃消化1分钟,加入500μl FBS中和胰酶,112G离心6分钟。弃上清后用1ml含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞。利用细胞技术板计数并稀释细胞密度至1×105/ml,加入96孔细胞培养板,每孔100μl,每列6个副孔。培养板周围使用1×PBS水封后放入37℃,5%CO2可调式恒温培养箱中培养。
2、病毒感染
24小时后,准备10个EP管,每管加入90μl培养液,第一个EP管中加入10μl病毒原液,混匀后,吸取10μl加入第二个EP管。以此类推,做十个稀释度(10-10-8)。并加入细胞培养板中。每孔100μl。
3、更换细胞培养液
48小时后,弃掉细胞培养板中含有病毒的培养液,每孔再加入100μl含10%FBS的DMEM培养液。
4、观察结果与病毒滴度计算
96-120小时后在激光扫描共聚焦显微镜下观察结果。寻找带绿色荧光细胞最少的孔并依据公式计算病毒滴度。
公式:滴度(PFU/ml)=荧光细胞数×病毒稀释倍数×103。
(二)慢病毒感染PC-9H细胞
1、MOI值的选定
参考汉恒生物网站中慢病毒感染不同细胞的MOI值,选择30作为感染PC-9H细胞的MOI值。
2、细胞准备
倒置相差显微镜下观察见293T细胞将生长状态良好,巴氏吸管吸尽培养基,1×PBS冲洗两遍后,加入胰酶500μl,37℃消化1分钟,加入500μl FBS中和胰酶,1000g离心6分钟。弃上清后用1ml含10%FBS的1640培养基重悬细胞。利用细胞技术板计数并稀释细胞密度至1×105/ml,加入24孔细胞培养板,每孔500μl,放入37℃,5%CO2可调式恒温培养箱中培养。
3、病毒感染
24小时后,倒置相差显微镜下观察PC-9H细胞密度在50~70%时,即可进行病毒感染。弃去旧培养24孔细胞培养板内旧培养基并加入Polybrene浓度为6ug/ml的含10%FBS的1640培养基,每孔400μl。再加入病毒原液,每孔100μl。感染24小时后用含10%FBS的1640培养基换液。
实施例3:和带有GFP标签的PC-9H的细胞的挑选与体外培养
1、带有GFP标签的PC-9H的细胞的挑选
慢病毒感染后72小时,通过激光扫描共聚焦显微镜观察PC-9H细胞的GFP表达效率,在显微镜下用枪头挑取亮度最亮的5个细胞团转置于新的24孔细胞培养板内,含10%FBS的1640培养基在37℃,5%CO2可调式恒温培养箱中培养,取名为PC-9H(GFP)。
2、根据PC-9H(GFP)细胞生长情况对细胞进行传代并适时冻存,使用的培养基是添加了10%FBS的1640培养基,传代与冻存的方法参见实施例1。
实施例4:BCLB/c裸鼠的肺原位移植肿瘤模型的建立与观察
1、PC-9H(GFP)/基质胶混合物的制备
基质胶提前一天由-20℃保存在4℃,并在冰盒上进行下述操作:
倒置相差显微镜下观察见PC-9H(GFP)细胞系占培养瓶底面积80-90%时,消化并使用1×PBS重悬细胞,计数后与基质胶按照1:2的比例进行混合,使细胞终浓度为105/20μl。根据实验需要准备两倍体积的混合物。
2、BCLB/c裸鼠的麻醉
六周龄雄性BCLB/c裸鼠使用3%浓度的异氟烷进行诱导麻醉,诱导麻醉成功后使用1.5-2%的浓度进行麻醉维持。
3、BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的建立
BCLB/c裸鼠采取左侧或者右侧卧位,在右侧肩胛骨约3mm处做一约5mm的垂直于身体长轴的横切口,用有齿镊钝性分离皮下肌肉组织,直至肋骨暴露,此时,透过肋骨间隙的胸膜和肌肉可轻易观察小鼠肺的呼吸运动,这时使用微量注射器经过肋骨间隙注射20μlPC-9H(GFP)细胞与基质胶的混合物,针尖注射深度约3mm。随后使用可吸收缝线对切口进行缝合。皮肤表面涂抹金霉素眼膏预防感染。对照组小鼠给予PBS与基质胶的混合物作为对照。
4、BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的活体成像监测。
每周采用IVIS200活体成像系统观察PC-9H(GFP)在BCLB/c裸鼠体内的生长和转移情况。称取D-荧光素酶钾盐并用无菌的1×PBS溶解,终浓度为30mg/ml。BCLB/c小鼠用异氟烷麻醉,成像前每只小鼠腹腔注射150μl,5分钟后进行显像操作。
实施例5:小鼠外周血循环肿瘤细胞的的鉴定、分离与体外培养
1、BCLB/c裸鼠的内眦取血
在BCLB/c裸鼠肺原位移植模型制造后第7天和第15天,经活体成像系统确认成功荷瘤后的BCLB/c裸鼠使用异氟烷麻醉(麻醉和活体成像操作步骤见实施例4)。麻醉成功后采集者左手捏紧BCLB/c裸鼠头部皮肤并轻轻压迫颈部两侧,使眼球向外突出,右手捏取无菌毛细玻璃管(肝素钠浸润)经内眦眼眶后壁向喉头方向旋转刺入。有突破感时稍后退,使血液经由被割裂的眼眶静脉后静脉丛滴入1.5ml EP管内(肝素钠浸润),取血量约200μl。之后拔除毛细包立管并用拧干的75%乙醇棉球压迫止血。
2、BCLB/c裸鼠外周血中循环肿瘤细胞的鉴定与分离
1、红细胞的裂解与去除
血液样本加入1ml的红细胞裂解液,轻轻吹打混匀,然后静置裂解5分钟。随后再以500g离心5分钟(4℃),弃红色上清。离心效果更佳。如果发现红细胞裂解不完全,重复上述步骤一次。随后使用1ml的1×PBS重悬洗涤细胞,500g离心3分钟,弃上清。细胞洗涤2次后,使用100μl的1×PBS重悬细胞。
2、发生EMT的PC-9H(GFP)细胞的检测与分选
实验组待测样本中加入5μl EPCAM抗体,对照组样本加入10μl EPCAM抗体,室温避光孵育20分钟,期间每隔10分钟重悬细胞1次。随后使用流式细胞仪进行检测,分选的目标亚群为EPCAM(-)/GFP(+)的发生了EMT的细胞亚群。并命名为PC-9EMT。
3、循环肿瘤细胞的体外培养。
根据PC-9EMT细胞生长情况对细胞进行传代并适时冻存,使用的是添加了10%FBS的1640培养基,传代与冻存的方法参见实施例1。
实施例6:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞肺原位注射法成瘤能力的比较
1、BCLB/c裸鼠的分组
15只六周龄雄性BCLB/c裸鼠按照1-15的顺序进行编号,利用EXCEL生成15个随机数,按照随机数由小到大的顺序将BCLB/c裸鼠分为3组,每组5只。分别为PC-9L组、PC-9H组和PC-9EMT组。
2、三组BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的建立及活体成像检测
使用PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞分别对相应组别的BCLB/c裸鼠进行造模并观察,试验方法见实施例4。
实施例7:PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞蛋白免疫印迹实验
(一)细胞总蛋白样品的制备
倒置相差显微镜下观察细胞约占培养瓶底面积80-90%时,弃掉旧培养基,使用1×PBS冲洗2遍后加入配置好的细胞裂解液1ml,冰上裂解细胞30分钟,每十分钟震荡一次,确保裂解完全,裂解完成后转置于1.5ml EP管中,1200g离心10分钟,吸取上清转置于新的1.5ml EP管内,并做好标记。裂解液配方如下:
(二)细胞总蛋白样品浓度的测定制备
1、按照说明书使用蛋白标准配置液和1×PBS对BCA蛋白定量检测试剂盒中蛋白标准品进行稀释,使用浓度为0.5mg/ml。
2、使用浓度的标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔细胞培养板,每个3副孔,并使用1×PBS补足20μl,每个浓度3副孔。
3、待测样本使用PBS稀释10倍后,加入96孔细胞培养板,每个3副孔。
4、按照说明书配置BCA工作液,每孔加入200μl,37℃恒温孵箱孵育30分钟后使用荧光计数器测量各孔在562nm处的OD值,根据标准品的OD值绘制标准曲线并根据样本的OD值计算样本蛋白浓度。
5、使用1×PBS和5*蛋白上样缓冲液稀释蛋白样品,使其终浓度为2.5ug/μl,95℃变性15分钟,-20℃保存。
(三)SDS-PAGE凝胶电泳
1、洗净WB所需玻璃板和电泳槽,晾干后进行组装,并测试水密性是否良好。
2、根据目的条带的分子量大小,选择利用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒配置12%分离胶和浓缩胶,先配分离胶,灌胶后使用异丙醇压平,待分离胶凝固后再配置浓缩胶,灌胶后插入梳子。两种胶的配方如下:
3、待上层胶凝固后,拔去梳子并使用细针对上层胶进行修整,之后把变性后的蛋白样品在95℃下活化2分钟,混匀后每孔上样20μl,最边上两孔使用10μl预染蛋白marker上样。
4、使用ddH2O稀释电泳缓冲液粉末至使用浓度,加入电泳槽中,恒压80V进行电泳,直至溴酚蓝跑出凝胶。
(四)转膜
1、拆开电泳仪,在ddH2O中撬开玻璃板,除去浓缩胶并使凝胶在水中平衡30秒。
2、使用快速蛋白转膜仪,按照阴极至阳极分别是负极转膜海绵→SDS-PAGE凝胶→浸泡过电转缓冲液的PVDF膜→正极转膜海绵的顺序配置转膜三明治,放入转膜抽屉中,选择midi模式,转膜15分钟。
(五)PVDF膜的封闭、抗体孵育和显影
1、打开抽屉,可见蛋白Marker清晰转印在PVDF膜上,做好标记后使膜依次浸泡在电转缓冲液和TBST中各30秒,之后使用3%BSA在摇床上进行封闭1小时。
2、根据目的条带的位置对膜进行裁剪并做好标记后分别放入WB孵育盒中,抗体按照说明书推荐浓度用一抗稀释液稀释后分别加入对应的膜上,在摇床上4℃孵育过夜。
3、回收一抗,使用TBST洗膜三次,每次10分钟,再加入二抗稀释液稀释的相应种属的二抗。稀释浓度为1:1000,摇床上室温孵育1小时。
4、回收二抗,使用TBST洗膜三次,每次10分钟,之后把膜放在干净玻璃板上,加入配置好的ECL发光液进行显影。
实施例8:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞免疫荧光染色实验
1、于超净工作台内,打开六孔板,盖玻片使用酒精灯灭菌,冷却后放入六孔板中。
2、倒置相差显微镜下观察细胞的占培养瓶底面积80-90%时,按照实施例1的方法消化并重悬细胞,将细胞悬液滴加至盖玻片上,置于CO2浓度为5%的培养箱中于37℃培养2-4小时至细胞固着,然后再加入2ml含10%FBS的1640培养基继续培养约6小时。
3、倒去培养基,用1×PBS洗3次,每次5分钟。之后使用通用型组织固定液固定30分钟,
4、吸去固定液,使用1×PBS洗3次,每次5分钟;之后加入100μl破膜液,室温孵育10分钟;吸去破膜液,PBS洗3次,每次5分钟。
5、弃PBS后每张切片加入50μl稀释的一抗覆盖组织,4℃过夜。
6、1×PBS洗三次,每次5分钟。弃PBS后每张切片加100μl相应种属的荧光二抗,室温下避光孵育45分钟。
7、1×PBS洗3次,每次5分钟(避光)。弃PBS后每张切片加100μlHochest33258,室温下避光孵育10分钟。
8、1×PBS洗3次,每次5分钟,切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片,4℃避光拍照。
实施例9:PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞的克隆形成实验
倒置相差显微镜下观察细胞的占培养瓶底面积80-90%时,按照实施例1的方法消化并重悬细胞,之后加入6孔细胞培养板中,每孔细胞约104个,每个样本3副孔。每三天更换培养基并观察细胞状态,在10~14天后显微镜下寻找细胞数≥50个的克隆并计数。
实施例10:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞的成球培养实验
(一)肿瘤干细胞培养基的的配方如下,保存在4℃:
(二)倒置相差显微镜下观察细胞的占培养瓶底面积80-90%时,按照实施例1的方法消化并重悬细胞,之后加入低粘附性6孔细胞培养板中,每孔细胞约104个,每个样本3副孔。每三天离心管内静置15-30分钟后半量更换培养基,之后使用枪头轻微轻柔吹打数次,10~14天后显微镜下寻找细胞球,拍照并计数。
实施例11:PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞的增殖与耐药实验
(一)PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞铺板
倒置相差显微镜下观察细胞的占培养瓶底面积80-90%时,按照实施例1的方法消化并重悬细胞,计数并调整细胞密度为105/ml,之后加入96孔细胞培养板中,每孔100μl,每个样本5副孔,最外围使用1×PBS水封,之后在37℃,5%CO2可调式恒温培养箱中培养24小时。
(二)使用奥沙利铂对三种细胞进行处理
倒置相差显微镜下观察细胞贴壁后,使用添加了10%FBS的1640培养基对奥沙利铂进行稀释,使其终浓度分别为50μmol/L、10μmol/L和5μmol/L。使用上述溶液替换96孔细胞培养板中旧培养基。
(三)使用CCK8法检测检测细胞活性
在加药前和加药后24小时、48小时、72小时后各取一块板进行检测。
1、在细胞培养液中直接加入10μl Vita-Orange细胞活性检测液轻微震荡保证充分混合,避免气泡产生。
2、于37℃培养箱中培养至颜色变为橙色并分别在1小时、1.5小时和2小时用荧光计数器测量各孔在450nm处OD的值,并记录。
实施例12:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞细胞周期实验
(一)PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞样品制备
1、倒置相差显微镜下观察细胞的占培养瓶底面积70-80%时,按照实施例1的方法消化并使用1×PBS洗涤两次,然后使用1ml 1×PBS重悬细胞。
2、使用Cell Cycle Staining Kit进行试验,首先加入1ml DNA Stainingsolution和10μl Permeabilization solution,漩涡震荡5秒,室温避光孵育30分钟。
(二)使用流式细胞仪进行检测并绘制细胞周期图
实施例13:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞细胞凋亡实验
(一)PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞样品制备
同实施例12第(一)节。
(二)使用TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit对细胞进行处理
1、在细胞中加入5ml含1%通用型组织固定液的1×PBS,冰上放置20分钟。
2、细胞在4℃300g离心10分钟,去上清并且重悬于5ml PBS。重复洗一次并把细胞重悬在0.5ml 1×PBS中。
3、细胞置于含0.2%X-100的PBS溶液中,室温放置5分钟。
4、300g离心10分钟,弃上清后把细胞重悬于5ml 1×PBS中,相同条件下再次洗涤细胞,并使用80μl被ddH2O稀释至1×的Equilibration Buffer重悬,室温孵育5分钟。
5、冰上融解BrightRed标记混合物,并依照下表准备足量的TdT孵育缓冲液。
细胞在300g离心10分钟后去上清并把沉淀重悬在50μl TdT孵育缓冲液中。37℃孵育60分钟,避免光照。期间每隔15分钟用移液器轻轻吹打重悬
6、加入1ml 20mM EDTA终止反应。
7、细胞300g离心10分钟,去上清后把细胞重悬于1ml含0.2%X-100的PBS溶液中(含5mg/ml的BSA),重复一次。
(三)用流式细胞仪分析细胞。BrightRed的红色荧光波长为测量620±20nm
实施例14:PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞的Transwell实验
(一)PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞铺板
倒置相差显微镜下观察细胞的占培养瓶底面积80-90%时,按照实施例1的方法消化并使用不含FBS的1640培养基重悬细胞并计数,上室中每孔加入105个细胞(200μl),下室中加入含FBS的1640培养基600μl,设置3副孔。分别在24小时、48小时、72小时各取一板检测。
(二)Transwell检测
1、1×PBS冲洗上室2次,使用棉签擦洗小室上层细胞,再次用1×PBS冲洗2次。
2、使用通用型组织固定液固定20分钟,之后倒置风干10-15分钟。
3、使用0.1%龙胆紫染色15分钟,随后使用ddH2O冲洗2次。
4、吸尽上室液体并风干后镜下拍照细胞并计数。
实验结果
1、获得了发生EMT的人肺腺癌CTCs并命名为PC-9EMT
首先,我们通过GFP-Pour慢病毒感染了具有较高转移能力的人肺腺癌细胞系PC-9H,得到了可表达GFP荧光蛋白的PC-9H(GFP)细胞,随后我们利用基质胶与PC-9H(GFP)混合后,通过对BCLB/c裸鼠进行肺原位注射的方法模拟正常情况下肺癌肿瘤细胞从原发灶脱落入血形成CTCs的过程。(图1)我们通过小动物活体成像系统可以观察到,肺癌细胞在BCLB/c裸鼠的体内发生扩增与转移。
流式细胞分析结果则表明,在荷瘤成功约7天后,即可在BCLB/c裸鼠外周血中检测到循环肿瘤细胞。随着时间增加,BCLB/c裸鼠的外周血中CTCs的数量也在增加。且CTCs由两种细胞亚群细胞组成,一部分为发生了EMT的细胞亚群,另一部分为未发生EMT的细胞亚群。我们利用流式细胞仪把发生了EMT的肺癌细胞亚群进行了分选并成功进行了体外培养,命名为PC-9EMT。(图2,图3)
2、PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞形态的观察与比较
通过倒置相差显微镜观察PC-9L,PC-9H,PC-9EMT三种细胞形态,可以看出PC-9L呈现出典型的上皮细胞形态,细胞较大,成多边形,且易聚集成团;梭形或纺锤形细胞少见,呈零星分布。PC-9H细胞中则出现较多的梭形或纺锤形细胞,单个上皮样细胞体积较PC-9L细胞要小,细胞聚集程度低于PC-9L。PC-9EMT细胞则多数为间质细胞形态或处于上皮—间质细胞形态,典型上皮细胞形态少见,在细胞未长满之前较少出现细胞间紧密接触的情况。(图4)
3、PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞小鼠体内成瘤能力的比较
在获得PC-9EMT细胞后,为了比较PC-9L、PC-9H和PC-9EMT这三种细胞的恶性程度,我们把三种细胞分别接种的BCLB/c裸鼠体内,并利用活体荧光成像系统追踪它们BCLB/c裸鼠体内的生长情况,结果表明,三种细胞均有在BCLB/c裸鼠体内成瘤的能力,其在小鼠体内成瘤能力的大小由高到低分别为PC-9EMT、PC-9H和PC-9L;此外接受PC-9EMT接种的小鼠两例出现了肺内转移,一例出现了全身转移。(图5)
4、PC-9EMT细胞确实是发生了EMT的肺癌细胞
判断细胞是否发生了EMT通常有两种方法,一种是细胞形态学层面上的鉴定,观察细胞是否具有间质细胞的形态,另一种是分生物学层面上的鉴定,即观察细胞是否低表达上皮细胞分子生物学标志如CDH1蛋白和EPCAM蛋白,并同时高表达间质细胞分子生物学标识如VIM蛋白。与PC-9L和PC-9H相比,PC-9EMT细胞在细胞形态方面更接近间质细胞形态。通过免疫荧光技术和蛋白免疫印迹对三种细胞的EPCAM、CDH1和VIM蛋白的表达量进行了检测。免疫荧光实验结果表明EPCAM和CDH1两种蛋白在PC-9L、PC-9H、PC-9EMT三种细胞中表达量是逐渐降低的(图6,图7),而VIM蛋白的表达量则逐渐升高(图8)。但在PC-9L的细胞中有零星高表达VIM蛋白的细胞存在(图8)。蛋白免疫印迹实验结果显示,与PC-9L细胞相比,CDH1蛋白表达水平PC-9H中仅略有降低,在PC-9EMT中明显降低。EPCAM蛋白则在38KD处和42KD处各有一条条带,PC-9H细胞在两处均有大量表达;PC-9L细胞在42KD处有大量表达,38KD处少量表达;PC-9EMT细胞则仅在42KD处有少量表达。三种细胞均不同程度的表达VIM蛋白,以PC-9EMT细胞表达最高,PC-9H细胞VIM蛋白表达量略低于PC-9EMT细胞,PC-9L细胞表达量最低。(图9)上述结果从分子生物学的角度再次证明了PC-9EMT细胞确实是发生了EMT的细胞。随后我们利用Transwell法检测了三种细胞的运动迁徙的能力,结果表明PC-9EMT和PC-9H细胞均具有极强的迁移能力,后者略低于前者;PC-9L细胞的迁移能力则较低。(图10)
5、PC-9EMT具有干细胞的特征
我们利用CCK8法检测了PC-9L、PC-9H和PC-9EMT三种细胞的增殖能力和对肺癌常见化疗药物奥沙利铂的敏感性。从增殖曲线图我们可以看出,在接种24小时后,三种细胞即开始出现细微差别,PC-9EMT细胞的增殖速度和对奥沙利铂的耐受力远远高于PC-9L和PC-9H细胞,PC-9H的增殖能力比PC-9L细胞略高,但仍然对奥沙利铂敏感。(图11)克隆形成实验结果表明,PC-9EMT的细胞较易形成单克隆细胞团,PC-9H细胞可以形成两种不同形态的单克隆细胞团,PC-9L只能形成少量单克隆细胞团。在成球试验中,PC-9L细胞无法形成细胞球,PC-9H细胞可以形成少量形态致密的细胞球,PC-9EMT则可以形成大量的疏松形态的细胞球。(图12,图13)从细胞周期实验结果可以看出在PC-9EMT细胞中处于S2期的细胞所占的比例要明显高于PC-9L和在PC-9H细胞。同时在正常培养的状态下PC-9L细胞的自然凋亡率要高于PC-9EMT和PC-9H细胞,PC-9EMT和PC-9H的凋亡水平无明显差异。(图14,图15)
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的建立方法,其特征在于,所述的建立方法包括以下步骤:
(1)制备肺腺癌高转移细胞/基质胶混合物,
(2)麻醉BCLB/c裸鼠,
(3)经过BCLB/c裸鼠的肋骨间隙注射肺腺癌高转移细胞与基质胶的混合物。
2.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,步骤(1)为:基质胶提前一天由-20℃保存至4℃,并在冰盒上进行下述操作:倒置相差显微镜下观察见细胞系占培养瓶底面积80-90%时,消化并使用1×PBS重悬细胞,计数后与基质胶按照1:2的比例进行混合,使细胞终浓度为105/20μl。
3.一种肺腺癌循环肿瘤细胞的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包括以下步骤:(1)利用绿色荧光蛋白(GFP)标记标记肿瘤细胞;(2)建立人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型;(3)在BCLB/c裸鼠外周血中获得循环肿瘤细胞。
4.一种肺腺癌发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包括以下步骤:(1)建立人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型;(2)在BCLB/c裸鼠外周血中获得循环肿瘤细胞;(3)利用流式细胞仪分离获得发生上皮间质化的循环肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)为:在荷瘤成功7天后,对BCLB/c裸鼠取血,并裂解和去除红细胞。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)为:加入EPCAM抗体,室温避光孵育20分钟,期间每隔10分钟重悬细胞1次,随后使用流式细胞仪进行检测、分选出EPCAM(-)/GFP(+)的细胞亚群。
7.根据权利要求4-6任一所述的制备方法制得的发生上皮间质化的循环肿瘤细胞。
8.根据权利要求7所述的发生上皮间质化的肿瘤循环细胞作为肿瘤干细胞的应用。
9.一种抑制肺癌转移的药物,其特征在于,所述的药物可抑制上皮间质化的循环肿瘤细胞。
10.检测发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的试剂在制备预测肺癌的耐药、复发或转移的试剂中的应用。
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