CN105567639A - 人肺腺癌细胞lc-21细胞及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学领域，公开了一种人肺腺癌细胞LC-21细胞，其特征在于，该人肺腺癌细胞LC-21细胞在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC？NO？C201287。本发明的优点在于：(1)通过反复的体外筛选，成功建立了人肺腺癌细胞LC-21细胞系模型及人肺腺癌细胞LC-21细胞系，其转移率高、转移稳定、直观性好、靶向性强。(2)利用本发明的人肺腺癌细胞LC-21细胞系，为肺癌的防治研究及抗转移治疗提供了理想的模型。

Description

人肺腺癌细胞LC-21细胞及用途

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及人肺腺癌细胞LC-21细胞及用途。

背景技术

人源性的肺癌细胞株是肺癌基础与临床研究的必备实验材料和实验工具。我国的肺癌发病率和死亡率均较高，建立具有中国人种特点的肺癌细胞株对于肺癌的诊断、治疗、转移分子机制等研究都具有重要意义。但目前国内、外已有的人肺癌细胞株数量不多，且各细胞株之间的生物学特性差异较大，远远不能满足研究需要，因此，急需建立更多、更为理想的肺癌细胞株。

发明内容

本发明的目的在于提供一株人肺腺癌细胞LC-21细胞。

本发明另一目的在于提供该人肺腺癌细胞LC-21细胞的用途。

在本发明的第一方面，提供一种人肺腺癌细胞LC-21细胞，于2012年6月19日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNOC201287。

在本发明的一个优选实施例中，所述人肺腺癌细胞LC-21细胞的形态：该原代细胞早期培养时呈肿瘤细胞、成纤维细胞、少量血细胞混杂生长状态，随着传代次数增加，细胞形态逐渐均一，多为多边形或圆形，可见多核巨细胞存在。

在本发明的第二方面，提供所述人肺腺癌细胞LC-21细胞的用途，用于筛选肺癌转移相关基因。

在本发明的第三方面，提供所述的人肺腺癌细胞LC-21细胞的用途，用于筛选抗肿瘤转移药物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为LC-21细胞的形态学观察示意图。

图2为LC-21细胞的体外生长曲线示意图。

图3为LC-21细胞的体外迁移与侵袭能力分析示意图。

图4为LC-21细胞的细胞周期分析示意图。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和反复的筛选，找到一种肺癌转移率高且恶性程度高的人肺腺癌LC-21细胞系，所述的人肺腺癌LC-21细胞系是一种理想的研究肿瘤转移的模型。基于此完成了本发明。

本发明旨在明确人肺腺癌LC-21细胞系的生长及转移特性。本发明将该细胞系定名为人肺腺癌LC-21细胞系，于2012年6月19日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNOC201287，中国典型培养物保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学。

在体外建立人癌细胞是研究人类肿瘤的一个重要手段。肿瘤细胞的体外培养建株式一项难度较大的工程，原发瘤组织直接用于体外建系的成功几率较低。本发明从一个临床肺腺癌患者的胸水中原代分离、培养了一株新的细胞系，经体外连续传代培养，获得稳定细胞株。在建系的过程中，本发明人不断摸索和调整培养条件和培养方法，同时保证培养环境的相对稳定，成功地建立了人肺腺癌LC-21细胞系，至今已传至30代以上。

细胞形态分析证实：所述人肺腺癌细胞LC-21细胞的形态特征：该原代细胞早期培养时呈肿瘤细胞、成纤维细胞、少量血细胞混杂生长状态，随着传代次数增加，细胞形态逐渐均一，多为多边形或圆形，可见多核巨细胞存在。所述的人肺腺癌LC-21细胞系生长速度较快，细胞的倍增时间为(39.85±1.92)h。

人肺腺癌细胞LC-21细胞系应用

本发明还提供了人肺腺癌细胞LC-21细胞系的用途，包括但不限于用于：研究肿瘤(特别是肺癌)转移和/或侵袭的机制；筛选潜在的肺癌转移相关基因；筛选抗肿瘤(特别是肺癌)转移的药物等。

本发明的优点在于：

(1)通过体外原代细胞分离，成功建立了人肺腺癌细胞LC-21细胞系模型及人肺腺癌细胞LC-21细胞系，其生长及转移特性稳定。

(2)利用本发明的人肺腺癌细胞LC-21细胞系，为肺癌的防治研究及抗转移治疗提供了理想的模型。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(NewYorK：ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

1材料

标本来源：肺癌患者，男，49岁，于上海市胸科医院诊断为肺腺癌，于胸水常规治疗时取未污染血性胸水标本100mL用于原代细胞分离、培养。

2方法

2.1细胞分离培养

100ml无污染血性胸水分装至两个50ml离心管，1500rpm离心5min,弃上清，PBS重悬沉淀清洗一次，1500rpm离心5min,PBS再次重悬沉淀备用。采用梯度离心法进行细胞分离。Percoll贮存液与1.5MPBS进行9:1混合达到生理性渗透压，此Percoll悬液用0.15MPBS进行稀释分别得到60％和40％的Percoll分离液。60％Percoll分离液、40％Percoll分离液、胸水细胞悬液按1:1:1的比例由高密度向低密度逐层配置，形成3个密度梯度，每个梯度3ml，共9ml。3000rpm离心30min，两层Percoll分离液之间的灰白色细胞层即为肿瘤细胞层。小心吸取该层细胞，用PBS洗涤离心1次，1500rpm离心5min，弃上清，用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM培养液混匀细胞沉淀，置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养。此后，根据细胞的生长满度进行常规胰酶消化传代培养。

2.2形态学观察

取对数生长期的细胞，胰酶消化，重悬细胞后接种于10cm培养皿内，当细胞生长汇合度达到80％左右，利用相差显微镜观察细胞形态并进行拍照。

2.3体外生长情况观察

细胞体外生长增殖采用cellcountingkit-8(CCK-8)试剂进行检测。96孔板每孔种植2000个细胞，三复孔，每天固定时间每孔加入10μlCCK-8与100μLDMEM试剂混合物，37℃孵育2h，检测450nm波长吸收值，连续测定6天绘制生长曲线。

2.4体外迁移和侵袭能力观察

细胞侵袭实验方法：将Matrigel胶按1:7稀释后加入到Transwell上室内膜上，每个小室40μl，37℃孵育4h。细胞消化计数，浓度调整至1×105/0.2ml，接种于各上室,在各下室加入800μl含10％FBS的DMEM培养基，37℃培养箱中孵育，22h后取出小室，固定染色，显微镜拍照计数。细胞迁移实验与侵袭实验方法基本相同，但上室不需加入Matrigel胶，细胞浓度为5×104个/0.2ml，孵育时间为16h左右。

2.5细胞周期分析

胰酶消化细胞，离心，PBS洗2次；加入预冷(-20℃)的70％乙醇混匀，-20℃固定过夜固定，第二天离心，PBS洗细胞一次,加染料，4℃避光静置30min；流式细胞仪检测细胞周期，用ModFitsoftware分析检测结果。实验共重复三次，每次三复孔。

2.6统计学分析

定量试验结果表示为means±SD。

3结果

3.1LC-21细胞的形态学观察

倒置相差显微镜下观察可以发现，该原代细胞早期培养时呈肿瘤细胞、成纤维细胞、少量血细胞混杂生长状态，随着传代次数增加，细胞形态逐渐均一，多为多边形或圆形，可见多核巨细胞存在，细胞紧紧贴于培养皿底部，增殖速度较快，每隔48h即可传代，细胞间接触抑制不明显。目前该细胞已体外传至30代以上，可持续稳定增殖，故将其命名为LC-21细胞(见图1)。

3.2体外生长增殖能力分析

采用CCK-8实验检测LC-21细胞的体外生长情况，发现LC-21细胞在第二天开始进入对数生长期，至第五天进入生长平台期，体外增殖速度有所减慢(见图2)。细胞的倍增时间为(39.85±1.92)h。

3.3体外迁移与侵袭能力观察

通过Transwell实验我们对LC-21细胞的体外迁移与侵袭能力进行分析。如图所示，迁移试验中(Migration)，16h后LC-21细胞穿过transwell的细胞数为67±11.69个，侵袭试验中(Invasion)，22h后LC-21细胞穿过matrigel的细胞数为57±3.19个(见图3)。

3.4细胞周期检测

采用流式细胞仪检测了LC-21细胞的细胞周期，经过三次重复试验发现：LC-21细胞中处于G1期的细胞比例为(62.86±0.72)％；处于G2期的细胞比例为(11.30±0.41)％；处于S期的细胞比例为(25.84±0.61)％(见图4)。

Claims (3)

1.一种人肺腺癌细胞LC-21细胞，其特征在于，该人肺腺癌细胞LC-21细胞在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNOC201287。

2.权利要求1所述的人肺腺癌细胞LC-21细胞的用途，其特征在于，用于筛选肺癌转移相关基因。

3.权利要求1所述的人肺腺癌细胞LC-21细胞的用途，用于筛选抗肿瘤转移药物。