CN206095941U - 特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒 - Google Patents

Abstract

特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒，包括相互配合的下盒体和上盒体，下盒体内设置下填充体，上盒体内设置上填充体，下填充体上开设数个下空腔，上填充体上开设数个上空腔，下空腔与上空腔相互配合，下空腔与上空腔内设置离心管、培养皿和滴管。本实用新型的优点在于：本实用新型容纳所有检测所需器皿，方便检测时使用，各个器皿间使用填充体分隔，既能将各个器皿分离，又能够避免器皿移动过程中摇晃破裂，相比现有的检测装置，本实用新型不但检测方便，检测结果的精度也高，能第一时间发现患者的肿瘤细胞，尽早提醒患者治疗。

Description

特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒

技术领域

本实用新型涉及检测盒技术领域，具体地说是特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒。

背景技术

目前，不仅在中国，在全世界，肿瘤都是对人们的生命安全威胁最大的绝症之一，并且每年有很多很多的人患有肿瘤疾病，其中有相当多的人因此而失去宝贵的生命，而想要治愈肿瘤疾病，现有医学技术要求人们在患病第一时间发现并接受治疗，为此，各种检测装置陆续被推向市场，常见的检测装置由化学发光试剂盒和免疫分析试剂盒，这两种都有各的不足，他们要么是检测精度不高，要么是不能在第一时间检测出结果。

实用新型内容

为解决上述问题，本实用新型的目的在于克服现有技术的不足，提供特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒。

本实用新型为实现上述目的，通过以下技术方案实现：特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒，包括相互配合的下盒体和上盒体，下盒体内设置下填充体，上盒体内设置上填充体，下填充体上开设数个下空腔，上填充体上开设数个上空腔，下空腔与上空腔相互配合，下空腔与上空腔内设置离心管、培养皿和滴管。

为进一步实现本实用新型的目的，还可以采用以下技术方案：所述的下盒体内设置隔板，隔板与下盒体之间形成储物腔；所述的下盒体上部安装环形的挡板，挡板上部内侧安装环形的凸环，凸环下部设置环形的齿圈，齿圈位于挡板内侧且能相对挡板转动，上盒体下部安装环形的固定环，固定环位于凸环内且与凸环相配合，固定环上安装限位齿，下盒体、齿圈、凸环和固定环之间形成环形的限位槽，凸环上开设凹槽，限位槽与凹槽相通，限位齿能够通过凹槽进入限位槽内，限位齿与齿圈啮合，挡板内壁上开设滑槽，齿圈外壁上开设固定槽，滑槽与固定槽相通，固定槽内设置固定块，固定块能够沿固定槽与滑槽内壁滑动，固定块上安装拉杆和弹簧，拉杆端部穿出挡板，弹簧位于滑槽内。

本实用新型的优点在于：本实用新型容纳所有检测所需器皿，方便检测时使用，各个器皿间使用填充体分隔，既能将各个器皿分离，又能够避免器皿移动过程中摇晃破裂，相比现有的检测装置，本实用新型不但检测方便，检测结果的精度也高，能第一时间发现患者的肿瘤细胞，尽早提醒患者治疗；

本新型的检测原理实验使用从海肾中提取的生物体发光蛋白序列“Renillareniformis”，与抗体的单链可变片段（scFv）相连，用少量血液进行一个临床试验来检测CTCs，证实此方法安全，成本低，特异性强，以及高度敏感性。嵌合scFv-luciferase蛋白可以靶向CTC特异性细胞表面抗原，然后转变为一个放大的信号约10~100倍来进行检测。初步研究已经成功通过识别表达her2细胞表面抗原来检测乳腺癌。此方法优于现有筛查方法，其简单、快速、安全、经济、特异性强以及灵敏度高。此scFv-luciferase CTC抗原检测系统有巨大的临床应用潜能。通过scFv-luciferase 免疫沉淀反应检测CTC提供了一个创新和市场技术来对许多癌症进行检测，其有能力成为一个新的CTC生物标志物而被检测。

附图说明

图1是本实用新型结构示意图；图2是图1的A-A线剖视图；图3是图2的Ⅰ部放大图；图4为抗体的结构示意图；图5为scFv-luciferase的结构示意图；图6为Her2-scFV-luciferase融合蛋白的结构示意图；图7为不同数目的SK-BR-3和MDA-MB-231细胞分别与Her2-scFV-luciferase融合蛋白的荧光度值；图8为不同浓度的her2抗体加入10000个SK-BR-3细胞与Her2-scFV-luciferase融合蛋白的荧光度值。

附图标记：1下盒体 2上盒体 3下填充体 4上填充体 5下空腔 6上空腔 7离心管8培养皿 9滴管 10隔板 11储物腔 12挡板 13齿圈 14凸环 15固定环 16限位齿 17限位槽18凹槽 19滑槽 20固定槽 21固定块 22拉杆 23弹簧。

具体实施方式

特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒，如图1所示，包括相互配合的下盒体1和上盒体2，下盒体1内设置下填充体3，上盒体2内设置上填充体4，下填充体3上开设数个下空腔5，上填充体4上开设数个上空腔6，下空腔5与上空腔6相互配合，下空腔5与上空腔6内设置离心管7、培养皿8和滴管9。这种结构能够容纳所有检测所需器皿，方便检测时使用，各个器皿间使用填充体分隔，既能将各个器皿分离，又能够避免器皿移动过程中摇晃破裂，相比现有的检测装置，本实用新型不但检测方便，检测结果的精度也高，能第一时间发现患者的肿瘤细胞，尽早提醒患者治疗。离心管7为数个。

所述的下盒体1内设置隔板10，隔板10与下盒体1之间形成储物腔11。这种结构能够通过储物腔11存放物体，能够充分利用下盒体1的内部空间。

所述的下盒体1上部安装环形的挡板12，挡板12上部内侧安装环形的凸环14，凸环14下部设置环形的齿圈13，齿圈13位于挡板12内侧且能相对挡板12转动，上盒体2下部安装环形的固定环15，固定环15位于凸环14内且与凸环14相配合，固定环15上安装限位齿16，下盒体1、齿圈13、凸环14和固定环15之间形成环形的限位槽17，凸环14上开设凹槽18，限位槽17与凹槽18相通，限位齿16能够通过凹槽18进入限位槽17内，限位齿16与齿圈13啮合，挡板12内壁上开设滑槽19，齿圈13外壁上开设固定槽20，滑槽19与固定槽20相通，固定槽20内设置固定块21，固定块21能够沿固定槽20与滑槽19内壁滑动，固定块21上安装拉杆22和弹簧23，拉杆22端部穿出挡板12，弹簧23位于滑槽19内。这种结构能够使下盒体1与上盒体2快速安装和连接。安装时，固定环15上的限位齿16通过凹槽18进入限位槽17内，然后限位齿16与齿圈13啮合，转动固定环15直至齿圈13上的固定槽20与挡板12上的滑槽19连通，固定块21在弹簧23的作用下进入固定槽20，使固定环15通过齿圈13与挡板12固定，从而使下盒体1与上盒体2快速连接。待拆卸时，将拉杆22向外抽出，转动固定环15，使限位齿16由限位槽17进入凹槽18，并由凹槽18内脱出，从而使下盒体1与上盒体2脱离，方便拆卸。上盒体2与上填充体4能够相互转动。

本实用新型的原理是通过scFv-luciferase 免疫沉淀反应检测循环肿瘤细胞（CTC）提供了一个创新和市场技术来对许多癌症进行检测，其有能力成为一个新的CTC生物标志物而被检测。使用从海肾中提取的生物体发光蛋白序列“Renillareniformis”，与抗体的单链可变片段（scFv）相连。我们将用少量血液进行一个临床试验来检测CTCs，证实此方法安全，成本低，特异性强，以及高度敏感性。嵌合scFv-luciferase蛋白可以靶向CTC特异性细胞表面抗原，然后转变为一个放大的信号约10-100倍）来进行检测。

其中海肾中提取的生物体发光蛋白序列“Renillareniformis”的氨基酸序列为：MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGACLAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ

其中抗体的基本结构如图4所示，scFv-luciferase结构如图5所示。

具体检测步骤如下：

1.质粒构建

按照表1所示的ScFvHer2序列表所示的氨基酸序列表，在N端和C端分别引入HindIII和NheI酶切位点由英骏公司合成。Rluc片段由NheI /XbaI从pRL-TK切下来然后克隆到pcDNA3质粒上。最后将ScFvHer2通过HindIII/Nhe1位点连入带有Rluc基因的pcDNA3质粒上即为scFvHer-Rluc-pcDNA3质粒。

表1 ScFvHer2序列表

atggatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtc

M D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V

accatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaa

T I T C R A S Q D V N T A V A W Y Q Q K

ccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtccct

P G K A P K L L I Y S A S F L Y S G V P

tctcgcttctctggatccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcag

S R F S G S R S G T D F T L T I S S L Q

ccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcgga

P E D F A T Y Y C Q Q H Y T T P P T F G

Cagggtaccaaggtggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccg H chain

Q G T K V E I K R T V A A P S V F I F P

ccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc

P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F

tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc

Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S

caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctg

Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L

acgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag

T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q

ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgtggctccacctccggc

G L S S P V T K S F N R G E C G S T S G LINKER

tccggcaagcccggctccggcgagggctccaccaagggcgaggttcagctggtggagtct

S G K P G S G E G S T K G E V Q L V E S

ggcggtgggctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttc

G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F

aacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgg

N I K D T Y I H W V R Q A P G K G L E W

gttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgt

V A R I Y P T N G Y T R Y A D S V K G R

ttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgt

F T I S A D T S K N T A Y L Q M N S L R

Gctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatg Lightchain

A E D T A V Y Y C S R W G G D G F Y A M

gactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggcctccaccaagggcccatcg

D Y W G Q G T L V T V S S A S T K G P S

gtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgc

V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C

ctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacc

L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T

agcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagc

S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S

gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcac

V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H

aagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcat

K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H

gaattctctggtggtgggagcctgctagc

E F S G G G S L L

2.scFv-Luciferase质粒转染293ft细胞

①293ft细胞培养：将293ft细胞置于10cm培养皿无抗生培养基中培养至融合度在90~95%进行转染；

②准备一个离心管加入Opti-MEM reduced serum medium培养基1.5ml和转染试剂lipofectamine2000轻轻振荡混匀，室温放置5分钟；

③准备另一个离心管稀释质粒：将20微克scFv-Luciferase质粒溶于1.5ml Opti-MEM reduced serum medium培养基中轻轻振荡混匀；

④孵育5分钟后，将②和③里的物质混合，轻轻混匀室温孵育20分钟，得到混合液；将该混合液逐滴加入293ft细胞中，轻轻混匀，于CO2培养箱中培养48小时。

3.48小时后，吸掉培养基，PBS轻轻洗一遍，加入10毫升passive裂解液，在摇床上室温裂解半小时，14000转/分钟离心10分钟，吸取上清至新管中，弃去细胞碎片，上机测光度值，单位为LU/微升，分装保存至-80度冰箱。

4.以Her2-scFV-luciferase为例检测her2阳性细胞或乳腺癌病人外周血单个核细胞中her2阳性循环肿瘤细胞。

①培养her2阳性细胞SK-BR-3和阴性细胞MDA-MB-231，分别取0，10，100，1000，10000个细胞加入Her2-scFV-luciferase融合蛋白（108LU）室温摇床上孵育3个小时，其中Her2-scFV-luciferase融合蛋白的结构如图6所示，3小时后，1000转/分钟离心收集细胞。PBS洗三遍，最后一遍留150微升，上机检测萤光度值。如图7所示，其中横坐标为细胞数（个），纵坐标为荧光度值；

②留取乳腺癌病人外周血10毫升加入EDTA抗凝管中，应用淋巴细胞分离液分出单个核细胞（其中包括乳腺癌循环肿瘤细胞）加入Her2-scFV-luciferase融合蛋白（108LU）室温摇床上孵育3个小时。3小时后，1000转/分钟离心收集细胞。PBS洗三遍，最后一遍留150微升，上机检测萤光度值。

③Her2抗体竞争性实验检测此方法特异性。

取五组her2抗体浓度分别为0，1:100000，1:10000，1:1000，1:100，取10微升不同浓度抗体加入10000个SK-BR-3细胞与Her2-scFV-luciferase融合蛋白（108LU）室温摇床上孵育3个小时。3小时后，1000转/分钟离心收集细胞。PBS洗三遍，最后一遍留150微升，上机检测萤光度值，如图8所示，其中横坐标为Her2抗体稀释比例，纵坐标为荧光度值。

本实用新型的技术方案并不限制于本实用新型所述的实施例的范围内。本实用新型未详尽描述的技术内容均为公知技术。

Claims (3)

1.特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒，其特征在于：包括相互配合的下盒体（1）和上盒体（2），下盒体（1）内设置下填充体（3），上盒体（2）内设置上填充体（4），下填充体（3）上开设数个下空腔（5），上填充体（4）上开设数个上空腔（6），下空腔（5）与上空腔（6）相互配合，下空腔（5）与上空腔（6）内设置离心管（7）、培养皿（8）和滴管（9）。

2.根据权利要求1所述的特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒，其特征在于：所述的下盒体（1）内设置隔板（10），隔板（10）与下盒体（1）之间形成储物腔（11）。

3.根据权利要求1所述的特异性标记循环肿瘤细胞免疫沉淀反应检测盒，其特征在于：所述的下盒体（1）上部安装环形的挡板（12），挡板（12）上部内侧安装环形的凸环（14），凸环（14）下部设置环形的齿圈（13），齿圈（13）位于挡板（12）内侧且能相对挡板（12）转动，上盒体（2）下部安装环形的固定环（15），固定环（15）位于凸环（14）内且与凸环（14）相配合，固定环（15）上安装限位齿（16），下盒体（1）、齿圈（13）、凸环（14）和固定环（15）之间形成环形的限位槽（17），凸环（14）上开设凹槽（18），限位槽（17）与凹槽（18）相通，限位齿（16）能够通过凹槽（18）进入限位槽（17）内，限位齿（16）与齿圈（13）啮合，挡板（12）内壁上开设滑槽（19），齿圈（13）外壁上开设固定槽（20），滑槽（19）与固定槽（20）相通，固定槽（20）内设置固定块（21），固定块（21）能够沿固定槽（20）与滑槽（19）内壁滑动，固定块（21）上安装拉杆（22）和弹簧（23），拉杆（22）端部穿出挡板（12），弹簧（23）位于滑槽（19）内。