CN103336121A - 猪流感病毒h3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒，包括检测试纸，所述检测试纸包括PVC底板、滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫胶体金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有单克隆抗体1F6和3D1的检测线和包被有抗鼠IgG抗体的质控线。本发明的试剂盒能直接对猪流感病毒H3亚型的临床样品进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短等特点。

Description

猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及动物传染病学检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和在猪流感病毒H3亚型抗原体外检测中的应用。

背景技术

猪流感病毒（SIV）可以感染人，并且可致人死亡。最早有SIV报道的是在1918年西班牙大流感时，当时报道的流行地区主要有匈牙利、美国及中国。在上个世纪，流感约引起0.2-0.4亿人死亡，这可能是由AIV和人流感病毒基因发生重组引起的。

目前在猪群中主要是H3N2、H1N1、H1N2三个亚型的猪流感病毒流行，当然也有从猪身上分离到H9N2、H1N7、H3N1、H5N1、H2N3、H3N6及H4N6的报道。猪流感病毒的宿主很广泛，可以感染猪、水貂、马、人、鸟类等。猪流感一般有两种流行方式:一种是全球大流行，感染猪呈现不明显的临床症状，发病率高，可达100%；另一种是地方流行，病毒快速在一个小区域内传播，在没有继发感染的情况下，病猪很快康复。

免疫胶体金技术大量应用于快速检测病毒抗原及抗体中。胶体金技术自1971年人类首次利用胶体金建立检测沙门氏菌的胶体金检测方法以来，得到了快速的发展。胶体金发展到投射电镜、彩色免疫金银染色、蛋白质转移电泳、扫描电镜等领域。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

申请人通过对实验室现有的及NCBI在1990-2011年间收录的猪流感病毒H3亚型的血凝素蛋白序列进行进化分析，筛选出两株实验室现有的猪流感病毒H3亚型毒株GD3、HN3作为免疫原，用HI方法筛选，得到4株能分泌抗猪流感病毒H3亚型血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D1、2B8、4H9、1F6，于2013年5月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号依次为CCTCCNO：C201374、CCTCC NO：C201375、CCTCC NO：C201376、CCTCCNO：C201377。经试验测定，此4株单克隆抗体只与猪流感病毒H3亚型发生反应，而不与其他亚型的流感病毒发生反应，具有良好的特异性。

一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒，包括检测试纸，所述检测试纸包括PVC底板、滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于PVC底板上，所述免疫胶体金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有单克隆抗体1F6和3D1的检测线和包被有抗鼠IgG抗体的质控线。

申请人用该试剂盒检测200份猪临床肺脏样品，检出了7份阳性肺脏样品，对检测样品进行病毒分离证明其特异性为100%。用此试剂盒对引起猪常见病毒病的病原进行检测，如PRV、PCV2、PRRSV、CSFV，结果显示均为阴性；并且用此试剂盒对其它亚型的流感病毒进行检测，如：H1亚型、H5亚型、H9亚型、H10亚型的流感病毒，结果显示均为阴性。此试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性高等优点。

所述的免疫胶体金垫可参考以下方法制备得到：

1）胶体金的制备：量取120mL超纯水加入到250mL蓝盖瓶中，然后加入1%氯金酸1.0mL，轻轻盖上瓶盖（保证能透气，别拧紧）于微波炉中加热至沸腾，迅速加入1.8mL 1.0%的柠檬酸三钠，继续加热10分钟。室温冷却，加入超纯水定容至100mL, 4℃保存备用。

2）胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9的制备：取胶体金溶胶100mL，调pH至9.0，放在磁力搅拌器上边搅拌边加入适量纯化后的单克隆抗体2B8或4H9，搅拌90min,然后加入终浓度为1%的PEG20000, 继续搅拌60min。将标记好的金标复合物于4℃以3000r/min离心12min，弃沉淀，上清在4℃以8000r/min离心30min，弃上清，用10mL金标抗体保存液重悬沉淀。

3）所述的金标抗体保存液配方：20mMTris-Cl、5%海藻糖，调pH至9.0。

4）胶体金垫处理液的制备：20mMTris-Cl、1%PVP-40、0.5%Trion-100，调pH至9.0。

5）胶体金垫处理：将胶体金垫浸泡在胶体金垫处理液中4℃过夜，37℃烘干，将金标抗体涂布在已预处理的胶体金垫上，置于干燥机中抽干，4℃干燥保存。

所述的滤样纸按以下方法制备：

1）滤样纸处理液的制备：20mMTris-Cl、0.5%PVP-40、2%蔗糖、1%NaCl、1%酪蛋白，调pH至9.0。

2）滤样纸处理：将滤样纸浸泡在滤样纸处理液中4℃过夜，37℃烘干，加干燥剂密封存放。

在1F6和3D1喷膜时本人将它们混合喷膜和先喷一种单克隆抗体再喷另一种单克隆抗体都出现很强的非特异性，最终通过探索采用先将1F6喷于硝酸纤维素膜上，隔0.3mm喷3D1，这样既不影响眼观对结果的判读，又成功的避免了非特异性。

本发明的猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒在胶体金垫上需要涂布两株金标单克隆抗体2B8、4H9，而这两株金标单克隆抗体在胶体金垫上是会相互影响的，因此本发明在以下几个方面进行探索：①将两株单克隆抗体先混合再标金，然后涂布到胶体金垫上。②将两株单克隆抗体分别先标金，再涂布到不同的胶体金垫上，最后把两个涂有不同金标单克隆抗体的结合垫捆绑组装成试剂盒。③将两株单克隆抗体分别先标金再混合涂布到胶体金垫上。研究发现第③种方法效果最好。

不同的免疫胶体金垫和滤样纸处理液直接影响试剂盒的敏感性和特异性，本发明的胶体金检测试剂盒中应用了4株单克隆抗体，它们之间的相互影响很大，消除非特异性是本发明的胶体金检测试剂盒的关键，本研究通过往滤样纸处理液中添加酪蛋白来封闭，起到了很好的效果。

本发明检测试剂盒的检测方法：

1、待检样品的处理

1）猪鼻试纸样品的处理：每份猪鼻试纸样品加入200μLPBS缓冲液（pH7.4）,室温下涡旋震荡，在4℃条件下放置1h，8000r/min 4℃离心2min，取上清做备检抗原。

2）猪肺脏样品的处理：每克肺脏加入200μLPBS缓冲液（pH7.4），充分研磨，室温下涡旋震荡，在4℃条件下放置1h，8000r/min 4℃离心5min，取上清做备检抗原。

3）鸡胚尿囊液的处理：收取鸡胚尿囊液，8000r/min 4℃离心5min，取上清做备检抗原。

4）细胞培养物的处理：收集细胞培养物，冻融3次，室温下涡旋震荡，在4℃条件下放置1h，8000r/min 4℃离心5min，取上清做备检抗原。

2、样品检测

取70μL样品滴入滤样纸，5-20min内观察结果

3、结果判定

阳性：检测线和质控线均出现清晰红色条带。样品中猪流感病毒H3亚型含量越高，检测线红色越深。

阴性：只有质控线出现红色条带。

无效：质控线不出现红色条带。

流感病毒具有高度的变异性，要制备敏感性高的猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒，就需要制备出能特异的识别所有猪流感病毒H3亚型毒株的单克隆抗体或制备出几株通过联合作用能特异的识别所有猪流感病毒H3亚型毒株的单克隆抗体。由于流感病毒血凝素蛋白的高度变异性，要筛选到能识别所有同一亚类毒株的血凝素蛋白的单克隆抗体是几乎不可能的，因此本发明通过分析实验室现有猪流感病毒H3亚型毒株和1990-2011年NCBI收录的猪流感病毒H3亚型毒株的血凝素蛋白序列，筛选出了两株在猪流感病毒H3亚型中的血凝素蛋白同源关系较远的毒株作为免疫原，以期能筛选到几株通过联合作用能识别所有猪流感病毒H3亚型毒株的单克隆抗体。本发明以GD3毒株作为免疫原筛选出的单克隆抗体1F6、2B8识别GD3毒株，但不识别同属猪流感病毒H3亚型的HN3毒株；以HN3毒株作为免疫原筛选出的单克隆抗体3D1、4H9识别HN3毒株，但不识别同属猪流感病毒H3亚型的GD3毒株。本发明将1F6、3D1联合喷膜，4H9、2B8联合标金制成胶体金检测试剂盒，大大提高了胶体金检测试剂盒的敏感性。

本发明与现有技术相比具有如下显著优点：

1、本发明的试剂盒能直接对猪流感病毒H3亚型的临床样品进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行，不需要专业人员操作，适合在圈栏边使用的特点。

2、本发明的试剂盒适用于对猪流感病毒H3亚型进行检测，对H1N1流感病毒、H5亚型流感病毒、H9亚型流感病毒、H10亚型流感病毒、PRV、PCV2、PRRSV、CSFV等均不反应，具有很强的特异性。

3、本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在4℃条件下放置半年不会影响其敏感性和特异性。

附图说明

图1胶体金检测试剂盒的结构。图中：1－吸水纸；2－免疫硝酸纤维素膜；3－免疫胶体金垫；4－滤样纸；5－检测线；6－质控线；7－PVC底板。

图2胶体金颗粒的透射电镜照片(1：30000)。

图3不同单克隆抗体组合制备胶体金检测试剂盒的比较。

图4胶体金检测试剂盒的特异性实验结果。

图5胶体金检测试剂盒的敏感性试验结果。

具体实施方式

实施例1  免疫原的筛选

1、引物设计与合成

为了扩增H3亚型的血凝素蛋白基因，由擎科生物测序公司合成了猪流感病毒cDNA的通用引物U12及猪流感的血凝素蛋白基因全长的通用引物P1、P2，引物序列如下：

U12:5’AGCAAAAGCAGG3’

血凝素蛋白基因：P1 5’AGCAAAAGCAGGGG3’

P2 5’AGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’

2、病毒扩增

将实验室保存的H3亚型毒株GD3(H3N2)、HN3(H3N2)、HN2(H3N2)、CB(H3N8)置于4℃解冻，用1％的鸡红细胞测其血凝价，用灭菌的PBS稀释成2^-2血凝价，接种9日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚在尿囊腔中接种0.2mL，在37℃中孵育72h（在接种后12h内死亡的丢弃，每12h照一次胚，12h后死亡的鸡胚置于4℃中），测血凝价，血凝价低于2⁷的鸡胚丢弃。

3、病毒RNA的提取

取2mLH3亚型毒株的尿囊液用来提取病毒RNA。提取RNA的过程如下：

1）在1.5mL去RNA酶的EP管中，将200μL病毒尿囊液加入1mLTrizol中，室温静置5min。

2）加入200μL氯仿，盖上EP管剧烈震荡，置冰浴10min。

3）离心，12000g，4℃，10min，取上清，置于一个新EP管中。

4）上清中加入等体积的异丙醇（约500μL），轻轻混匀，室温静置10min

5）离心，12000g，4℃，10min，弃上清。

6）向5）中加入75%无水乙醇1mL，短暂离心后室温静置5min。

7）离心，12000g，4℃，5min，弃上清，室温开盖吹干（在超净台中进行，约10min）

8）用30μLDEPC水溶解。

4、病毒cDNA的合成

扩增体系：RT-PCR反应体系为：

反应条件为42℃ 60min，72℃ 15min，4℃ 10min。

5、病毒血凝素蛋白基因的合成

反应体系为：

反应条件为：98℃ 5min，94℃ 35s，58℃退火2min， 35cycles，最后72℃10min。加入5μL Loading Buffer（10×），经1%琼脂糖凝胶电泳后用DNA凝胶试剂盒回收，回收产物置于4℃备用，作为连接T载体的模板。

克隆及测序：取回收产物5μL左右上样跑琼脂糖凝胶电泳，以确定回收效果。连接T载体系为：

4℃连接过夜。取连接产物转化DH5α。

转化步骤为：将DH5α感受态细胞在冰浴中融化，加入全部连接产物，冰浴30s，42℃热击90s，冰浴2min，加入500μL LB培养基，37℃震荡培养30min，3000rpm离心5min，弃上清，加入100μL LB培养基重悬沉淀，涂布于含Amp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养24h，挑取菌落溶于20μL无菌水中，取5μL 用于PCR检测，其余菌液置于4℃中。取PCR鉴定正确所对应的菌液，加入1mL含Amp的LB培养基，37℃震荡培养12h，送上海生工生物工程公司测序。所得序列与NCBI在1990-2011年收录的猪流感病毒H3亚型血凝素蛋白序列用ClustalX2.0和TreeView软件做遗传进化分析，选择最具代表性的毒株GD3、HN3做免疫原。

实施例2  抗猪流感病毒H3亚型血凝素蛋白单克隆抗体的制备

1、免疫原的制备

将GD3、HN3两株毒株分别接种80枚9日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚在尿囊腔中接种0.2mL，在37℃中孵育72h，测鸡胚的血凝价，血凝价低于2⁵的鸡胚丢弃，无菌收集鸡胚尿囊液，测定鸡胚尿囊液血凝效价。向鸡胚尿囊液中加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，在37℃中震荡灭活24h，用三层纱布过滤以舍弃密度小于尿囊液的杂质，7500r/min离心1h，取上清，再以21000r/min超速离心1.5h，弃上清，沉淀用PBS重悬，用移液枪吹吸混匀，置4℃中过夜。在超速离心管中从下往上依次加入60%、45％、35％、20％蔗糖溶液（要缓慢加入以形成密度梯度）。将超离后的病毒加到最上层， 21000r/min，4℃超速离心1h。离心后可见4条明显的条带，分别取每条条带置于超离管中，加入PBS，21000r/min，4℃超速离心1h，弃上清，沉淀用1mLPBS重悬，用枪吹吸混匀，置4℃中过夜。分别测定每管中的血凝价，取血凝价最高的病毒作为免疫原，置-80℃中冻存。

2、小鼠免疫

分别以纯化后的猪流感GD3、HN3两株毒株作为免疫原，每个免疫原加入等体积的弗氏完全佐剂乳化，颈背部皮下免疫4-6周龄的雌性BALB/C小鼠5只，每只小鼠免疫100μg抗原，免疫的体积为1mL/只。两周后皮下免疫弗氏不完全佐剂乳化的抗原100μg/只，两周后断尾采血测抗体效价。取效价符合要求且最高的小鼠在采血14d后经腹腔加强免疫100μg（无需乳化），3d后即可取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合。

3、SP2/0骨髓瘤细胞的活化

将细胞瓶中培养的SP2/0细胞，收集起来用1mL1640基础培养基悬浮（1.5×10⁶个骨髓瘤细胞）颈背部皮下注射BALB/C小鼠。待7-14天实体瘤生长后，用来制备融合用的骨髓瘤细胞。

4、骨髓瘤细胞的制备

1)将长了实体瘤的小鼠拉颈处死，置75%酒精中浸泡10min。

2)无菌取实体瘤置匀浆器中，加5mL1640基础培养基充分研磨后，补加6mL1640基础培养基，混匀后静置3min，待较大的组织团块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于离心管中，再补加l0mL1640基础培养基重悬组织，如此重复洗涤两次，将细胞悬液1000r/min离心10min后弃上清，用15mL1640基础培养基重悬，将细胞悬液体积控制在20mL。

3)于另一50mL离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将已重悬的全部SP2/0骨髓瘤细胞悬液轻轻地加于淋巴细胞分离液之上, 1200rpm离心10min，此时可见瘤细胞在淋巴细胞分离液与1640培养基液面分界处，小心用吸管吸取位于界面分界处的白色细胞层于另一无菌的50mL离心管中，用1640基础培养基洗涤2次（每次用30mL1640基础培养基，1000rpm 10min离心），用10mL1640基础培养基重悬，计数后备用。

5、免疫脾细胞的制备

1)取经腹腔强化免疫的BALB/C小鼠一只，眼球采血处死(收集血液分离血清，即为阳性血清)，置于75%酒精中浸泡10min。

2)将消毒好的小鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢交叉(左后肢在上)固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连在脾脏的脂肪组织，剪破脾脏外膜(剪开一个或几个小口子，尽量不要把整个脾剪断)，放入无菌的匀浆器中（所有的剪刀、镊子都应是灭过菌的）。

3)加3mL1640基础培养基于匀浆器中，研磨(不能太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，取出匀浆棒，补加7mL1640基础培养基，静置2min，吸取上层细胞悬液于一无菌的50mL离心管中，再补加10mL1640基础培养基于匀浆器中，如此重复2次。

4)1000r/min离心10min弃上清，沉淀用15mL1640基础培养基重悬。

6、饲养细胞的制备

1)取1只未免疫的Balb/C小鼠，眼球采血，收集血清为阴性血清。

2)四肢在泡沫板上固定（在泡沫板上垫一块灭菌过的纸），先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后吸2mL1640基础培养基注入小鼠腹腔，轻轻吸打几次，再将液体吸出放于一50mL离心管中，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。

3)按第5步中免疫脾细胞的制备方法操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。

4)1000r/min离心10min弃上清，沉淀用100mLHAT培养基重悬，置37℃，5％CO₂中备用。

7、脾细胞与骨髓瘤细胞融合

1)将SP2/0骨髓瘤细胞(约1-2×10⁷个)与免疫脾细胞置于50mL离心管中混匀，1000r/min，离心10min。

2)倒空上清(用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，可在超净台的边缘有孔处刮，使细胞沉淀略加松动（至转动离心管时细胞沉淀物会随管流动为止）。取一新的无菌50mL离心管，加入40mL1640基础培养基，预温至37℃。

3)将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50% PEG0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌。

4)继续搅拌30秒后静置30秒。

5)然后慢慢加入37℃预温的1640基础培养基10mL。具体方法为:在第一分钟内边搅拌边慢慢加入1mL1640基础培养基。第二分钟和第一分钟一样慢慢加入1mL1640基础培养基，第3-4分钟加3mL1640基础培养基，第5分钟加5mL1640基础培养基，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后缓慢加入30mL1640基础培养基。

6)1000r/min离心10min，弃上清，用100mL含饲养细胞的HAT培养基重悬沉淀，均匀滴加入5块96孔细胞培养板中，约200μL/孔。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

7）融合后第4天补加一滴HAT培养基/孔，第五天晚上吸弃80μL补80μL HT培养基，第六天晚上吸弃150μL补2滴HT培养基，第七天若杂交瘤细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。

8、用HI方法筛选阳性杂交瘤细胞

1)4单位病毒的稀释：在一排96孔血凝板中加25μLPBS/孔，在第一孔中加25μL病毒尿囊液，倍比稀释至第12孔，弃去25μL，每孔加入25μL1%鸡红细胞，37℃孵育45min，读取血凝价。根据血凝价，将病毒稀释成4个血凝单位

2)在96孔血凝板中用排枪加25μLPBS/孔，在第一孔中加培养上清25μL，倍比稀释至第四孔，弃去25μL，取一孔加免疫阳性血清作为阳性对照，一孔加无集落的上清液作为阴性对照。

3)每孔加入4单位病毒，摇晃均匀，再每孔加入25μL1%鸡红细胞，37℃孵育45min，读取HI价。

9、阳性杂交瘤细胞克隆化(有限稀释法)

1)克隆前制备小鼠饲养细胞，置于室温备用。

2)将阳性杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计活细胞数。若计数得是4.3×10⁵，则取三个无菌的EP管，在第一个管中加330μL完全1640培养基，在第二、第三个管中分别加900mL完全1640培养基，从吹起来的孔中吸100μL到第一个EP管中混匀再吸100μL到第二个EP管中，依次稀释到第三个EP管中，这样第三个EP管中就含有1000个杂交瘤细胞/mL，取两个无菌青霉素瓶，分别加3.8mL、2.4mL完全1640培养基，从第三个EP管中取200μL到第一个青霉素瓶中(此时其中杂交瘤细胞的浓度是50个/mL)，混匀从中吸1.6 mL到第二个青霉素瓶中并混匀(此时其中的杂交瘤细胞的浓度是20个/mL)，这样从第一青霉素瓶中取出液体到两列96孔细胞板中，每孔100μL，这样每孔中有5个杂交瘤细胞，从第二个青霉素瓶中取出液体到4列96孔细胞板中，每孔100μL，这样每孔中有2个杂交瘤细胞。把EP管和青霉素瓶中剩下的液体移到24孔细胞板中培养。

3)将饲养细胞加到96孔细胞板中，置37℃，5%CO₂中培养，培养第4天补液一次，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。在克隆后第7-9天，细胞长满1/4-1/2孔底时，即可检测，如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，形态良好，呈单个克隆生长的杂交瘤细胞孔，继续再克隆，一般克隆3次。3次后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔细胞板中培养。

4)待24孔细胞板中的杂交瘤细胞生长良好时，吹起细胞，1000rpm离心10min，加入细胞冻存液重悬细胞至冻存管中，放入冻存盒中置-80℃冰箱中冻存过夜，再将冻存管转至液氮中冻存。

经过3次克隆纯化，最终筛选出分泌抗猪流感病毒H3亚型血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D1、2B8、4H9、1F6，于2013年5月15日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201374、CCTCC NO：C201375、CCTCC NO：C201376、CCTCC NO：C201377。

10、单克隆抗体生产

将阳性杂交瘤细胞扩大培养，同时取6-8周龄的雌性BALB/C小鼠，每只腹腔注射弗氏完全佐剂0.5mL，3天后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁷个，7-14天待小鼠腹腔胀大后收取腹水，1200r/min离心10min取上清，用血凝抑制法（HI）测腹水效价，-70℃保存。

11、单克隆抗体的纯化

取抗H3亚型猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的腹水，采用辛酸－硫酸铵盐析法对其进行纯化，具体方法如下：

1）将腹水于4℃，12000r/min离心10min，弃杂质和油脂，取上清。

2）每1份腹水上清中加入4份醋酸缓冲液，用0.1mol/L的盐酸调pH值至4.5。

3）室温搅拌，按每毫升稀释前的腹水加33μL辛酸，搅拌30 min，4℃静置2h，12000 r/min离心30min，弃沉淀。

4）上清经滤纸过滤后调pH至7.4。

5）在4℃冰浴下于30min内缓慢加入pH为7.4的饱和硫酸铵，使硫酸铵终浓度为45％，搅拌30min，静置4-5h，过夜效果更佳。

6）4℃下12000r/min离心30min，弃上清。

7）沉淀用10mM的Tris-Cl重悬。用10mM的PH为9的Tris-Cl透析48h，每6h换一次透析液。4℃，12000r/min离心30 min，弃沉淀，分装成1mL/管，-80℃保存。

实施例3  猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的制备

1、核心试剂配制：

1）金标抗体保存液：20mMTris-Cl、5%海藻糖，调pH至9.0。

2）胶体金垫处理液：20mMTris-Cl、1%PVP-40、0.5%Trion-100，调pH至9.0。

3）滤样纸处理液：20mMTris-Cl、0.5%（重量）PVP-40、2%（重量）蔗糖、1%（重量）NaCl、1%（重量）酪蛋白，调pH至9.0。

2、胶体金的制备

胶体金溶胶采用柠檬酸三钠还原法制备。其步骤为：量取120mL超纯水加入到250mL蓝盖瓶中，然后加入1%氯金酸1.0 mL，轻轻盖上瓶盖（保证能透气，别拧紧）于微波炉中加热至沸腾，迅速加入1.8mL 1.0%的柠檬酸三钠，继续加热10分钟。室温冷却，加入超纯水定容至100mL, 4℃保存备用。

3、金标抗体的制备

取胶体金溶胶100mL，调pH至9.0，放在磁力搅拌器上边搅拌边加入适量纯化后的单克隆抗体2B8或4H9，搅拌90min,然后加入终浓度为1%的PEG20000, 继续搅拌60min。将标记好的金标复合物于4℃以3000r/min离心12min，弃沉淀，上清在4℃以8000r/min离心30min，弃上清，用10mL金标抗体保存液重悬沉淀。

4、胶体金垫、滤样纸的预处理

将胶体金垫、滤样纸分别浸泡在相应的处理液中4℃过夜，37℃烘干，加干燥剂存放。

5、胶体金垫制备及抗体喷涂

将金标抗体涂布在已预处理的胶体金垫上，置于干燥机中抽干，4℃干燥保存。

将硝酸纤维膜放在喷膜仪上，喷浓度为1mg/mL的单克隆抗体1F6，置室温干燥3h，在间隔0.3mm处喷浓度为1mg/mL的单克隆抗体3D1,形成检测线；与检测线间距0.5cm处喷浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG，形成质控线，置室温干燥3h，4℃干燥保存。

6、免疫胶体金试纸条的组装

将滤样纸、胶体金垫、吸水纸按从上到下依次固定于自带硝酸纤维素膜的PVC底板上，用切割机裁成0.3cm宽的试纸条，装入外壳中，和干燥剂一起装入铝箔袋内，密封贮存。

7、胶体金颗粒大小的选择

分别加入1mL、2mL、2.5mL、4mL1.0%的柠檬酸三钠于100mL0.1‰的氯金酸中，制备不同大小的胶体金颗粒，4℃存放，分别过1月、3月、5月后观察是否有沉淀，同时用于标记单克隆抗体，制备胶体金试纸条，确定其敏感性，选择状态稳定且检测敏感性高的金颗粒，发现加入柠檬酸三钠的量为2mL制备的胶体金最适合，通过电镜测定其胶体金颗粒直径为35nm（图2）。

8、待标记抗体最适稳定量的测定

将待标记单克隆抗体用超纯水稀释至1mg/mL，取0、10、15、20μL加入装有1mL20nm胶体金溶胶的EP管中，往上述各管内加入0.1mL10%氯化钠，混匀静置1h。未加抗体及加入抗体量不足以稳定胶体金的EP管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入抗体过量的EP管则胶体金的红色不变。在稳定的免疫胶体金溶液所含抗体最低量的基础上再加上20%即为稳定胶体金所需蛋白质的实际用量。

9、金标抗体的稳定剂的选择

标记好单克隆抗体后，为防止胶体金聚沉，分别用聚乙二醇(PEG20000 )、BSA作稳定剂，缓慢加入2%PEG20000使其终浓度为0.08%或加入10%的BSA使其终浓度为1%。4℃放置一段时间，看它们的颜色及透明度，发现加入0.08%的PEG20000做稳定剂效果最好。

10、猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的稳定性检测

将制备好的试纸条密封干燥避光保存，一部分置于室温，一部分置于4℃，每星期检测一次，到第24个星期其敏感性和特异性均没有降低。

11、不同单克隆抗体组合制备胶体金检测试剂盒的比较

由猪流感病毒H3亚型GD3毒株做免疫原筛选出的两株单克隆抗体1F6、2B8制成胶体金检测试剂盒（1F6喷膜、2B8标金，如图3A）；猪流感病毒H3亚型HN3毒株做免疫原筛选出的两株单克隆抗体3D1、4H9制成胶体金检测试剂盒（3D1喷膜、4H9标金，如图3B）；将1F6、3D1联合喷膜，4H9、2B8联合标金制成胶体金检测试剂盒（如图3C）。把制成的3种猪流感病毒H3亚型双抗夹心胶体金检测试剂盒分别检测GD3、HN3、甲流病毒，发现联合喷膜能扩大猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的检测范围，提高检测的灵敏性。

实施例4  猪流感病毒H3亚型胶体金检测方法的敏感性试验和特异性试验

1、特异性试验

1）检测导致猪疾病的常见病毒：PRV、PRRSV、CSFV、PCV2。结果均为阴性（图4A）。

2）检测潴流感病毒H3亚型毒株GD3、HN3、HN2均显阳性（图4B）。

3）检测H1N1、甲流、H10亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒均呈阴性（图4B）。说明本试剂盒具有良好的特异性。

2、敏感性试验

取血凝价为2⁷的猪流感病毒H3亚型倍比稀释，用猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒检测，能检测出血凝价为2²的猪流感病毒H3亚型毒株（图5）。

实施例5  猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒对临床样品的检测

用本猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒检测52份猪鼻拭纸样品，有9份是阳性，对这9份阳性样品进行病毒分离全为阳性，说明本试剂盒检测猪鼻拭纸样品的特异性为100%；对43份猪鼻拭纸阴性样品进行病毒分离，分离出了3份阳性样品，40份阴性样品，说明此试剂盒检测猪鼻拭纸样品的灵敏性为75%。

用本猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒检测检测从屠宰厂采集的200份猪肺脏样品，有7份阳性，对这7份阳性样品进行病毒分离验证，结果全部分离出了H3亚型流感病毒，说明此试剂盒检测猪肺脏样品的特异性为100%。从193份阴性样品中随机抽取40份样品接种鸡胚尿囊液分离病毒，用HA及HI试验检测，证明没有分离出H3亚型流感病毒，说明此试剂盒检测猪肺脏样品的敏感性很高。

Claims (6)

1.一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒，包括检测试纸，所述检测试纸包括PVC底板、滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于衬底上，其特征在于：所述免疫胶体金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有单克隆抗体1F6和3D1的检测线和包被有抗鼠IgG抗体的质控线，

所述单克隆抗体3D1是由杂交瘤细胞株3D1所分泌的，所述单克隆抗体2B8是由杂交瘤细胞株2B8所分泌的，所述单克隆抗体4H9是由杂交瘤细胞株4H9所分泌的，所述单克隆抗体1F6是由杂交瘤细胞株1F6所分泌的，所述杂交瘤细胞株2B8、4H9、1F6、3D1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号依次为CCTCC NO：C201375、CCTCC NO：C201376、CCTCC NO：C201377、CCTCC NO：C201374。

2.根据权利要求1所述的猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备胶体金；

2）用步骤1) 制备的胶体金分别标记单克隆抗体2B8和4H9，获得胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9；

3）免疫胶体金垫的制备：预处理玻璃纤维纸；浓缩步骤2) 获得的胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金垫；

4) 将单克隆抗体1F6、3D1和抗鼠IgG抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；

5) 将滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，切裁制得试纸条；

6) 将试纸条装入塑料盒，即获得猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述胶体金的颗粒直径为35nm。

4.根据权利要求2所述的猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤4）中先将单克隆抗体1F6喷于硝酸纤维素膜的检测线上，隔0.3毫米再将单克隆抗体3D1喷于硝酸纤维素膜的检测线上。

5.根据权利要求2所述的猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述滤样纸的处理液中含有20mMTris-Cl、0.5%PVP-40、2%蔗糖、1%NaCl、1%酪蛋白，pH值为9.0。

6.权利要求1所述的胶体金检测试剂盒在猪流感病毒H3亚型抗原体外检测中的应用。

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