CN101446591A

CN101446591A - P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒

Info

Publication number: CN101446591A
Application number: CNA2008101976839A
Authority: CN
Inventors: 邹先进; 丁莉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-11-15
Filing date: 2008-11-15
Publication date: 2009-06-03

Abstract

P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，包括亲和素－过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释液、浓缩洗涤液，其特征在于它还有P16^INK4a多克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的P16^INK4a单克隆抗体。优点是：采用P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒进行宫颈癌筛查，其敏感性为87.80％，特异性为92.43％，总体符合率为91.59％，阴性预测值为97.16％。使用简便，检测结果快速、准确、客观，能同时检测大量样本，适用于大样本人群的癌症筛查，检测成本比传统的癌症筛查方法低。

Description

P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫试剂产品领域。

背景技术

P16^INK4a蛋白是抑癌基因产物，但在多种人体肿瘤中过度表达，特别是在宫颈癌及癌前病变中几乎100％的表达，而在正常的宫颈上皮细胞不表达。同时，P16^INK4a也在肺癌、食道癌等多种肿瘤中表达。P16^INK4a是多种人类肿瘤相关标志物。近些年国内外是在病理组织切片上，采用免疫组织化学方法检测P16^INK4a，将其用于科学研究或用于辅助病理诊断。目前国内外有酶联免疫吸附检测试剂盒，它包括亲和素—过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释液、浓缩洗涤液，但其用于癌症筛查敏感性、特异性、准确性不够高。

发明内容

本发明的目的就是针对现有酶联免疫吸附检测试剂盒用于癌症筛查敏感性、特异性、准确性不够高之不足，而提供将一种敏感性、特异性、准确性高的P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒。

P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，包括亲和素—过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释液、浓缩洗涤液，它还有P16^INK4a多克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的P16^INK4a单克隆抗体。

本发明的优点是：我们将P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒在小样本的人群筛查中应用已经获得成功。我们用P16^INK4a酶联免疫吸附检测试剂盒检测20例肺癌患者痰标本，其中8例阳性，对照的15例正常人痰标本均为阴性。我们在1356例宫颈标本中，采用P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒进行宫颈癌筛查，其敏感性为87.80％，特异性为92.43％，总体符合率为91.59％，阴性预测值为97.16％。P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒用于宫颈癌筛查其敏感性和特异性均高于目前临床广泛应用的细胞学筛查结果，两者相比差异有显著性。证明P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒可以用于癌症筛查。本发明使用简便，检测结果快速、准确、客观，能同时检测大量样本，适用于大样本人群的癌症筛查，检测成本比传统的癌症筛查方法低。

具体实施方式

一、材料与方法：

1、标本收集：收集宫颈标本1356例。接受实验妇女年龄在24—70之间，均已婚且无宫颈手术史。所有病例首先用无菌棉签拭子在宫颈口旋转2周提取脱落细胞，然后用无菌细胞刷获取宫颈脱落细胞行新柏氏液基细胞学(TCT)检查。棉签拭子提取的宫颈脱落细胞与TCT保存液固定的宫颈脱落细胞均采用P16^INK4a酶联免疫吸附试剂盒，检测p16^INK4a蛋白的表达。在阴道镜下行宫颈活体组织取材行病理组织学检查。收集20例肺癌患者痰标本，15例正常人痰标本。

2.脱落细胞中P16^INK4a蛋白提取：汲取细胞保存液5ml，用生理盐水离心洗涤2次，加入300.1蒸馏水于-20℃充分冻融2次以裂解细胞，离心取上清-20℃保存备用。

3.P16^INK4a酶联免疫吸附试剂盒检测p16^INK4a的表达：用P16^INK4a多克隆抗体包被酶标板4℃过夜，用5％脱脂牛奶(PBS配制)于37℃封闭2小时。检测时取出标本蛋白样品并于酶标板中每孔加入100.1于4℃反应过夜，然后加入酶标P16^INK4a单克隆抗体于37℃孵育1小时，四甲基联苯二胺(TMB)显色液，450/620nm双波长测定吸光度。每个样本设2个重复孔，用已知免疫组织化学方法检测p16^INK4a蛋白表达强阳性的宫颈癌新鲜细胞样本设为阳性对照，用已知免疫组织化学方法检测p16^INK4a蛋白表达阴性的宫颈炎新鲜细胞样本及PBST为阴性对照。

4.结果判读：P16^INK4a酶联免疫吸附试剂盒检测宫颈脱落细胞中P16^INK4a蛋白结果判读：以新柏氏液基细胞学检查判读为无宫颈上皮内瘤变或恶性肿瘤，病理诊断为宫颈炎的150例新鲜宫颈脱落细胞标本吸光度平均值记为M_OD，标准差记为SD。统计学显示，个体样本的吸光度(OD_i)落在M_OD±3SD的可能性为99％，我们以OD_i<M_OD+3SD判读为阴性，M_OD+3SD.OD_i<M_OD+6SD判读为弱阳性(+)，M_OD+6SD.OD_i<M_OD+9SD判读为中等阳性(++)，OD_i.M_OD+9SD判读为强阳性(+++)。

5.统计学处理：采用二分法进行计数统计，P16^INK4a酶联免疫吸附试剂盒检测P16^INK4a蛋白以弱阳性(+)为阈值。采用SPSS10.0统计学软件进行统计学分析，以p<0.05判断为差异具有显著性。

二、实验结果：

1、P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋白的宫颈脱落细胞中p16INK4a蛋白表达敏感性为87.80％，特异性为92.43％。用P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测CIN1级宫颈脱落细胞标本p16INK4a的表达敏感性为83.2％，而CIN2、CIN3和宫颈癌标本p16INK4a的敏感性达到92.56％，两者相比差异有高度显著性(p<0.001)。P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测p16INK4a在CIN及宫颈癌脱落细胞标本中的表达强度明显高于炎性病变标本(p<0.001)。

P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋白的宫颈脱落细胞中p16^INK4a蛋白表达敏感性为87.80％，TCT的敏感性为82.93％，两者相比差异有显著性(p＝0.023)；P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋白的宫颈脱落细胞p16^INK4a蛋白表达特异性为92.43％，TCT的特异性为88.11％，两者相比差异有高度显著性(p<0.001)

2、P16^INK4a酶联免疫吸附检测试剂盒检测20例肺癌患者痰标本，其中8例阳性，对照的15例正常人痰标本均为阴性。

三、结论：

P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋白的脱落细胞中p16^INK4a蛋白，用于筛查宫颈癌敏感性和特异性均优于TCT检测。P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒用于癌症筛查具有准确、快速、方便、价格低廉的优势，且能够用仪器操作并给出客观的判读结果而不受检查医师的主观因素影响，更适用于大规模的人群筛查。

Claims

1、P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，包括亲和素—过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释液、浓缩洗涤液，其特征在于它还有P16^INK4a多克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的P16^INK4a单克隆抗体。