CN101373188A - 肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明提供了一种肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括:1)CA19-9校准品;2)CA19-9单克隆抗体包被载体;3)CA19-9单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记物;以及4)化学发光底物。进一步,根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤:1)以CA19-9纯品配制校准品;2)以CA19-9单克隆抗体包被载体;3)以辣根过氧化物酶标记CA19-9单克隆抗体;4)配制化学发光底物;5)分装上述CA19-9校准品、酶标记物和化学发光底物;以及6)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明提供了一种肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病。WHO指出及早诊断和治疗是对抗肿瘤的有效手段之一。
目前发现的肿瘤标志物已经有一百多种,由于大多数情况下体内肿瘤标志物的含量都非常低,一般的检测方法很难对其进行精确的定量。肿瘤相关抗原19-9(CA19-9)是一种黏液型糖蛋白,其对胰腺、胃、结肠等消化系统肿瘤的诊断有较高的价值。因此,如何能够有效地在肿瘤诊断中应用CA19-9一直是人们关注并希望解决的问题。
1979年Koprowski将人的结肠癌细胞株sw1116细胞表面分离出来的单唾液酸神经节糖苷脂(monosiloganglioside)作抗原,制成相应的单克隆抗体1116-Ns-19-9,用此单克隆抗体识别的肿瘤相关抗原即称为CA19-9。血清CA19-9可作为胰腺癌、胆囊癌、胃癌、结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的辅助诊断指标。胚胎期胎儿的胰腺、胆囊、肝、肠等组织存在这种抗原;正常人体组织中含量很低;在消化道恶性肿瘤,尤其是胰腺癌、胆囊癌病人血清中,CA19-9含量明显增高,但早期诊断价值不大,主要作为病情监测和预示复发的指标。此外,对消化道疾病鉴别诊断,如急性胰腺癌、胆囊炎、肝炎等CA19-9也有不同程度的升高。CA19-9是胰腺癌的敏感标志物,与CEA联用对胃肠道肿瘤的诊断更有价值。CA19-9在卵巢癌、淋巴瘤、胃癌、肺癌、食道癌和乳腺癌的阳性率约30%。大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平明显增高;肝胆系癌、胃癌、结直肠癌的CA19-9水平也会升高。
近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速,已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟,实用性强,易于推广的主要有:放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些检测技术的基本理论大体相同,但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同,因此各有优缺点。其中,放射免疫分析法灵敏度高,但存在操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染等缺点。酶联免疫分析克服了放射免疫分析的很多局限性,但灵敏度不够高。
现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统,需要昂贵的全自动化学发光测量仪,从而限制了推广使用,无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明是在酶免疫分析的基础上应用酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物,因而其灵敏度大大提高,并且操作简便适用性广,既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪,也可用于全自动的测量系统,可实现大批量快检测,使用成本低,更易推广应用。
发明内容
本发明同时解决了上述问题,即将化学发光检测技术与CA19-9的免疫分析学有效地结合,提供了一种能够简便、快速、灵敏、特异、稳定地检测CA19-9的试剂盒,该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。
本发明的目的是提供一种肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
根据本发明的试剂盒包括:1)肿瘤相关抗原19-9校准品;2)包被有肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体的固相载体;3)辣根过氧化物酶标记的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体;以及4)上述酶所作用的化学发光底物。
根据本发明的试剂盒,其中,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
根据本发明的试剂盒,其中,所述化学发光底物为鲁米诺或鲁米诺的衍生物。
优选地,上述试剂盒中,所述鲁米诺的衍生物为异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼。
进一步,本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法,包括以下步骤:
1)以肿瘤相关抗原19-9纯品配制肿瘤相关抗原19-9校准品;
2)以肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体包被固相载体;
3)以辣根过氧化物酶标记肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体;
4)配制化学发光底物;
5)分装上述肿瘤相关抗原19-9校准品、辣根过氧化物酶标记的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物;以及
6)组装为成品。
根据本发明的方法,优选,所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤:
1)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
2)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及
3)封闭
配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g BSA和1mL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
具体地,所述包被方法可以包括:
1)包被
采用1000mL的0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液包含1.59g的无水碳酸钠和2.94g的碳酸氢钠去离子水溶液制成缓冲液,与适当浓度的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
2)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及
3)封闭
配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g BSA和1mL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
在上述方法中,优选,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
在上述方法中,优选,所述化学发光底物为鲁米诺或鲁米诺的衍生物。
在上述方法中,优选,所述鲁米诺的衍生物为异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼。
具体的上述试剂盒可以包括CA19-9校准品、抗体包被板、酶标记物与化学发光底物液、洗涤缓冲液等。其中,所述CA19-9校准品的原料为标准级,纯度不低于90%;抗体包被板为48或96孔的微孔板条;标记CA19-9单抗的酶为偶联辣根过氧化物酶(HRP);化学发光底物液为鲁米诺;洗涤缓冲液为Tris-HCl。
本发明“肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒”可以特异地定量检测出病人血清中CA19-9的含量,可以根据CA19-9含量的多少判断治疗胰腺、胃、结肠等消化系统肿瘤病人药物的效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。该CA19-9定量测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。并且,根据本发明的检测系统为开放式操作,简便快速,不需要昂贵的全自动化学发光测量仪,特别适合广大的中小医院推广使用,为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
根据本发明的试剂盒,酶标记的CA19-9单抗与载体上包被的CA19-9单抗和被测样品的CA19-9抗原形成“包被抗体-待测抗原-酶标抗体”的“双抗体夹心”结构,因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式,既有效地利用了化学发光技术原理,又确保了检测的灵敏性。另外,这种模式还便于操作和生产。
本发明的试剂盒使用的是酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物,因而具有与酶免疫分析同等的特异性,而灵敏度大大提高,可为胰腺癌、结肠癌等消化系统肿瘤的诊断和预后判断提供更为特异、快速、可靠的依据。
附图说明
图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。
图2为使用本发明的试剂盒测定正常人血清中CA19-9浓度的结果散点图。
具体实施方式
实施例1制备本发明的CA19-9化学发光免疫分析定量测定试剂盒
一、酶标记CA19-9单克隆抗体的制备
辣根过氧化物酶标记CA19-9单克隆抗体的制备,具体方法如下:
溶解4.4mg HRP于1mL蒸馏水中,加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min,经1mmol/L醋酸钠缓冲液,pH4.4透析后加入8mg的CA19-9单克隆抗体,搅拌2h,最后用200mmol/L的NaBH4进行还原,经0.02M PBS缓冲液透析后,加等体积甘油,-20℃以下保存。
二、CA19-9校准品的制备
用CA19-9纯品配制,浓度分别为0、2、6、20、60、200U/mL,共6瓶。
三、酶标抗体浓度选定
采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度为1:6000。
四、固相微孔板的制备
(1)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的CA19-9单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
具体地,所述包被方法可以包括:
无水碳酸钠 1.59g
碳酸氢钠 2.94g
去离子水 1000mL
溶解混匀后,调整pH值至9.6,加入5.0mg CA19-9单克隆抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔110μL,4℃放置过夜。
(2)洗涤:用生理盐水洗三次。
(3)封闭
NaH2PO4·2H2O 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
BSA 10g
Proclin 300 1mL
双蒸水 1000mL
将上述试剂称量好放入洁净容器中,加双蒸水定容,溶解混匀,测定pH值为7.0。
每孔分别加入封闭液300μL,室温放置3小时。甩掉封闭液,在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行封袋,贴签后置2~8℃保存。
五、酶标单抗稀释液
Tris 12.120g
BSA 5g
Proclin 1mL
双蒸水 1000mL
六、化学发光底物
本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法:
A液:在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚。
B液:在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸,配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液,在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。
使用方法:使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。
七、洗涤缓冲液
Tris 24g
NaCl 160g
KCl 4g
HCl 15mL
去离子水 1000mL
调整pH值至7.4。
八、半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成肿瘤相关抗原19-9定量测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
综上,在本发明的研究过程中,本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定,包括标记抗体与包被抗体的活性、固相载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被载体的方法进行了研究,用不同的包被缓冲液和封闭液进行试验,选择出最适合的包被缓冲液和封闭液,通过抗体不同包被浓度试验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法,通过反复探索和对比试验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法,并对不同的酶稀释液进行了长期的考察试验,配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。
本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了试验研究,最终确定了双抗体夹心一步法反应模式,并就不同的反应时间对试验结果的影响进行了试验,确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响试验表明:在加入化学发光底物液后5~30分钟之间进行测量为最佳,其结果也较为准确。
实施例2~4制备本发明的CA19-9化学发光免疫分析定量测定试剂盒
除分别以塑料珠、塑料管、磁性颗粒作为载体外,其余均以与实施例1相同的方法制备CA19-9化学发光免疫分析定量测定试剂盒。
实施例5本发明的试剂盒的使用方法
以上实施例1制备的CA19-9化学发光免疫分析定量测定试剂盒的具体操作如下:
1)自4℃冰箱中取出试剂盒,室温平衡15分钟;
2)取出包被板条,插入板架上;
3)反应孔中分别加各浓度校准品(0、2、6、20、60、200U/mL)和待测样品各25μL,每次实验设空白1孔,然后除空白孔外各孔加酶标记物100μL,用微量震荡器充分振荡混匀,37℃温育1小时;
4)甩去反应液,每孔加满稀释后的洗涤液,洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干;
5)各孔加化学发光底物液100μL,用微量震荡器充分振荡混合均匀,室温(20~25℃)避光反应5分钟;
6)必须于加化学发光底物液后的第5~30分钟内测量,在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1秒/孔;
7)以校准品浓度的对数为横坐标,RLU值的对数为纵坐标绘出校准曲线,以各待测血清RLU值在校准曲线上的位置查出该血清的CA19-9的浓度(见附图1)。
实施例6本发明的试剂盒的方法学鉴定
按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定,结果见下表1:
表1 本发明的试剂盒的方法学检定结果
检验项目 | 检验标准 | 检验结果 |
准确性 | 平均回收率在90.0-110.0% | 95.8% |
特异性 | 与其类似物的交叉反应率≤0.01% | <0.01% |
精密性CV(%) | ≤15%(n=10) | 8.9% |
灵敏度 | ≤1.00U/mL | 0.76U/mL |
稳定性 | 各试剂组分置37℃至少6天 | 符合以上指标 |
以上结果表明“肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒”的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全符合要求的。
实施例7正常人的CA19-9含量及临界值的确定
使用实施例1~4中制备的“肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒”测定400例正常人血清(结果见附图2),得出正常人血清CA19-9测定值的平均值为19.18U/mL,标准偏差为10.80U/mL。计算出的平均值加上2倍的标准偏差所对应的浓度值作为临界值,其结果为40.80U/mL。
实施例8本发明的试剂盒与国外试剂盒对正常人血样测值比较
使用本发明的试剂盒和DPC的全自动CA19-9化学发光试剂盒同时检测正常人血清400份,并且进行方法学指标(灵敏度、精密性和正常人血样界定值)的测定,对两种试剂盒进行比较,结果见下表2:
表2 本发明的试剂盒与DPC的CA19-9化学发光试剂盒的比较
从所列检测结果数据分析,本发明试剂盒的灵敏度、精密性和正常人血样界定值均与同类进口试剂盒无明显差异,安全可靠,成本低廉,更便于推广应用。
Claims (9)
1.一种肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
1)肿瘤相关抗原19-9校准品;
2)包被有肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体的固相载体;
3)辣根过氧化物酶标记的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体;以及
4)上述酶所作用的化学发光底物。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物为鲁米诺或鲁米诺的衍生物。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述鲁米诺的衍生物为异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼。
5.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)以肿瘤相关抗原19-9纯品配制肿瘤相关抗原19-9校准品;
2)以肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体包被固相载体;
3)以辣根过氧化物酶标记肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体;
4)配制化学发光底物;
5)分装上述肿瘤相关抗原19-9校准品、辣根过氧化物酶标记的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物;以及
6)组装为成品。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述包被固相载体的步骤2)采用以下方法:
1)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的肿瘤相关抗原19-9单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
2)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及
3)封闭
配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g BSA和1mL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
7.如权利要求5或6所述的方法,其特征在于,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
8.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述化学发光底物为鲁米诺或鲁米诺的衍生物。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述鲁米诺的衍生物为异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090225 |