CN107328942A - 一种荧光定量检测papp‑a的免疫层析试剂条及其制备方法 - Google Patents

一种荧光定量检测papp‑a的免疫层析试剂条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸及其制备方法，本发明属于免疫诊断技术领域，本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，本发明采用以下技术方案：一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸条，由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接在PVC底板上构成，标记垫上喷涂有亲和素；质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。本发明有如下优点：本发明用于评估和监测体内妊娠相关蛋白A的水平，所述试剂具有操作简单、方便快捷、经济、准确定量等优点，更适用于在各医疗机构广泛开展。

Description

一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试剂条及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种荧光定量检测妊娠相关蛋白A（PAPP-A）的免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
妊娠相关蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是由胎盘衍生出来的一种大分子糖蛋白，由胎盘合体滋养层细胞，蜕膜细胞及正常月经周期子宫内膜间质细胞合成并分泌到血清中，它的浓度随着孕周增加而升高，直至足月。已经证明在孕早期怀有唐氏综合症（DS）胎儿的孕妇血清中PAPP-A浓度显著下降，因此PAPP-A被广泛认可为DS筛查的有效指标，它的浓度降低提示新生儿患唐氏综合征风险增高。
目前有资料表明另外一种形式的PAPP-A蛋白大量存在于不稳定冠状动脉粥样硬化斑块中。同时，PAPP-A在心血管疾病的诊断和急性冠脉综合症（ACS）患者预后判断方面也具有一定价值。研究显示 PAPP-A 参与血管的修复过程及动脉粥样硬化损伤的进展, 并与斑块的不稳定性和破裂密切相关。因此患者血液中PAPP-A的检测将可能对动脉粥样硬化斑块破裂的早期预测非常有帮助。
PAPP-A可广泛用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科和治疗实验室等。
目前临床上PAPP-A的检测方法有放射免疫检测（RIA）、酶联免疫法（ELISA）和化学发光法等，这些方法都有各自的优点和不足。放射免疫检测灵敏度高、特异性强，但该方法对人体有放射性损伤，目前在临床应用已较少。ELISA法检测步骤多、耗时长，操作过程的影响因素较多，易造成假阳性和假阴性结果。因此目前逐步被化学发光法替代，但这类方法为全封闭系统，价格昂贵，需要专门培训仪器使用人员，维修及检测成本高，并且不适合单人份和小批量检测用，目前不利于PAPP-A检测在国内的广泛开展。
鉴于目前尚无快速、准确的定量检测PAPP-A的方法，本发明的目的是提供一种可用于快速定量检测PAPP-A的免疫层析试纸条，用于评估和监测体内妊娠相关蛋白A的水平，所述试剂具有操作简单、方便快捷、经济、准确定量等优点，更适用于在各医疗机构广泛开展。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种操作简单、方便快捷、经济、测定准确的PAPP-A检测试纸条。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸条，由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接在PVC底板上构成，所述标记垫上喷涂有荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；所述包被膜包含检测线和质控线，所述检测线包被有与所述荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体处于不同表位的另一种PAPP-A单克隆抗体。所述质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
优选地，所述荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体的浓度为0.1~1.0 mg/mL，稀释比例为5%~20%。所述荧光微球标记的亲和素的浓度为0.1~1.0 mg/mL，稀释比例为0.5%~5%。所述含荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素的标记垫处理液的喷量为3~6 μL/cm。
优选地，所述荧光微球的粒径为100~500 nm。所述荧光微球的激发波长为310~550nm，发射波长为340~ 620 nm。
优选地，所述包被膜检测线上包被的PAPP-A单克隆抗体的浓度为0.5~2 mg/mL，喷量0.1~0.2μL/mm。所述质控线上包被的兔抗亲和素抗体的浓度为0.5~2 mg/mL，喷量0.1~0.2μL/mm。
本发明还提供一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸条的方法，包括以下步骤：
（1）荧光微球标记蛋白的制备
10000~15000 rpm第一次离心5~15分钟，第一次离心分离得到的沉淀物用10~100 mM、pH6.0~7.0磷酸盐缓冲液调节浓度为0.1%~1%，并超声分散；加入终浓度为0.1~5 mg/mL的碳二亚胺，混匀，再加入终浓度为0.1~5 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混匀；室温孵育20~40分钟后10000~15000 rpm第二次离心5~15分钟，第二次离心分离得到的沉淀物用10~100mM pH 6.0~7.0磷酸盐缓冲液溶解，将复溶后的荧光微球超声分散，按照0.1~1.0 mg/mL荧光微球的比例分别加入PAPP-A单克隆抗体和亲和素，混匀后室温旋转混合反应1.5~3小时，10000~15000 rpm第三次离心5~15分钟，第三次离心分离得到的沉淀物用10~40mM、pH 7.0-8.0的含10~40 mM乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的Tris-HCl复溶，超声分散后旋转混合反应0.5~1小时，10000~15000 rpm第四次离心5~15分钟，第四次离心分离得到的沉淀物用微球保存液复溶，2~8℃保存；
（2）样品垫的预处理
将样品垫用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24 h后于2~30℃密封保存。所述封闭液含0.1~1%的Triton X-100，0.1~1%的BSA，0.1~2%的PEG 6000，0.005~0.05%的鼠抗人红细胞，0.01~0.05M、pH 8.0的PBS缓冲液。
（3）标记垫的制备
将荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按5%~20%和0.5%~5%的稀释比例用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为3~6 μL/cm。所述标记垫处理液中含有0.2~2%的酪蛋白，5%~20%的蔗糖，0.1~1%的Tween-20，0.1~0.5%的PEG20000，0.02~0.05%的Proclin300，0.01~0.05M、pH 8.0的Tris-HCL缓冲液。将制备好的标记垫置于湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24 h后于2~30℃密封保存。
（4）包被膜的制备
分别将另一PAPP-A单克隆抗体和兔抗亲和素抗体用包被缓冲液调节浓度为0.5~2 mg/mL，将PAPP-A单克隆抗体喷到包被膜（3）上的检测线，将兔抗亲和素抗体喷到包被膜（3）上的质控线，所述PAPP-A单克隆抗体和兔抗亲和素抗体的用量按膜包被液量均为0.1~0.2μL/mm，检测线和质控线间隔4~8 mm，湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72 h后于2~30℃密封保存，备用。
（5）在底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，按照切割要求切割成3~4 mm宽度的试纸条。
本发明所述的PAPP-A的免疫层析试纸条的检测原理是双抗体夹心法，样本中的PAPP-A抗原在层析作用下与标记垫上荧光微球标记的PAPP-A抗体结合形成复合物，该复合物在层析作用下移动至包被膜的检测线，在包被膜检测线上包被有识别PAPP-A抗原另一表位的抗体，形成双抗体夹心复合物。复合物聚集在包被膜的检测线处，受到光源激发释放出相应波长的发射光，样本中抗原浓度越高，检测线发射光的强度越高，通过荧光检测系统将光信号转化为数字信号，以浓度点为横坐标，检测线信号值比质控线信号值（T/C）为纵坐标绘制标准曲线，从而可准确定量的计算出样本中PAPP-A的浓度。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明检测线和质控线采用独立的反应系统，互不干扰和影响，并采用T/C值的方式进行定标，保证了测试结果的准确度。
本发明采用荧光免疫层析法，该检测方法灵敏度高、操作简单、成本低。一步法直接加样，无需样本稀释液，可检测血液样本中浓度低至10 ng/mL的妊娠相关蛋白A，使用的检测仪无需专业操作人员，15分钟即可得到检测结果。
本发明将荧光免疫层析技术引入PAPP-A的检测中，结合荧光检测仪，实现PAPP-A的单人份定量检测，为临床使用提供了极大的便利。
附图说明
图1为本发明的荧光定量检测PAPP-A免疫层析试纸条的结构示意图；
附图标记：1、样品垫；2、标记垫；3、包被膜；4、吸水纸；5、检测线；6、质控线；7、底板。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细描述，应当理解为，以下实施例是为了方便本领域技术人员对本发明方案的理解，但不作为对本发明的限定。
实施例1
PAPP-A荧光免疫层析试纸条的制备：
（1）荧光微球标记蛋白的制备
取0.1mL 10%荧光微球，15000 rpm离心15分钟，沉淀物用50 mM pH 6.5 MES缓冲液调节浓度为1%，并超声分散；加入终浓度为2 mg/mL的碳二亚胺（EDC），混匀，再加入终浓度为5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混匀；室温孵育20分钟后15000 rpm离心15分钟，沉淀物用50 mM pH6.5 MES缓冲液溶解。将复溶后的荧光微球超声分散，并分两管分别加入0.2mgPAPP-A单克隆抗体和0.1mg亲和素，混匀后室温旋转混合反应2小时，15000 rpm离心15分钟，沉淀物用含30 mM乙醇胺和0.5%酪蛋白的Tris-HCl（20 mM，pH 8.0）复溶，超声分散后旋转混合反应1小时。15000 rpm离心15分钟，沉淀用微球保存液复溶，2~8℃保存。
（2）样品垫的预处理
将样品垫用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度＜20%的50℃的烘箱，干燥12 h后于20~30℃密封保存。所述封闭液含1%的Triton X-100，0.4%的BSA，0.5%的PEG 6000，0.02%的鼠抗人红细胞，0.03M pH 8.0的PBS缓冲液。
（3）标记垫的制备
将荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按10%和1%的稀释比例用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为4 μL/cm。所述标记垫处理液中含有0.5%的酪蛋白，5%的蔗糖，0.5%的Tween-20，0.3%的PEG20000，0.03%的Proclin300，0.05M、pH 8.0的Tris-HCL缓冲液。将制备好的标记垫置于湿度＜20%的50℃的烘箱，干燥24 h后于20~30℃密封保存。
（4）包被膜的制备
分别将另一PAPP-A单克隆抗体和兔抗亲和素抗体用包被缓冲液调节浓度为1.5 mg/mL，将PAPP-A单克隆抗体喷到包被膜（3）上的检测线，将兔抗亲和素抗体喷到包被膜（3）上的质控线，所述PAPP-A单克隆抗体和兔抗亲和素抗体的用量按膜包被液量均为0.15μL/mm，检测线和质控线间隔4mm，湿度＜20%的50℃的烘箱，干燥72 h后于20~30℃密封保存，备用。
（5）在底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，按照切割要求切割成4 mm宽度的试纸条。
实施例2
荧光免疫层析定量检测血样中妊娠相关蛋白A（PAPP-A）的浓度
（1）标准曲线绘制
将PAPP-A抗原用阴性血浆配制成1000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、0 ng/mL，用同一批次的试剂，每个浓度点测试6次。以检测线（T带）、质控线（C带）的荧光强度比值为纵坐标，PAPP-A参考品浓度为横坐标，建立方程并拟合成标准曲线，将标曲信息用烧录软件写到ID芯片中。
（2）样品的检测：
从试剂盒中取出检测条，撕开铝箔袋包装后，平放检测条，平衡5分钟，取100 μL样本加入加样孔中，室温避光反应15分钟。将ID芯片插入荧光检测仪，将检测卡插入荧光仪插卡口，点击“测试”，仪器通过分析软件自动计算出待测样本中PAPP-A的浓度。
（3） 与罗氏妊娠相关蛋白A检测试剂盒（电化学发光法）检测的相关性比较。
实施例3
请参照图1，一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸，所述的免疫层析试纸条包括有PVC底板7，所述的PCV底板7上依次设有样品垫1、标记垫2、包被膜3、吸水纸4，所述的标记垫2和所述的样品垫1相接，所述的包被膜3和所述的标记垫2相接，所述的吸水纸4和所述的包被膜3相接；所述标记垫2上喷涂有荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；所述包被膜3上设有检测线5和质控线6，检测线5和质控线6间隔4~8 mm，所述检测线5包被有与所述荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体处于不同表位的另一种PAPP-A单克隆抗体，所述质控线6包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
采用本发明的试纸条与罗氏妊娠相关蛋白A检测试剂盒对50例人血清样本进行检测，测定结果显示，在本试纸条检测范围内（10~1000 ng/mL），两种试剂的相关性R2＞0.95（y=0.973x+0.287）。
目前市面上PAPP-A的检测仅有适合医院检验科用于批量检测的放射免疫法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）、化学发光（CLIA），还没有适合单人份、快速检测、即时出结果的定量检测试剂。本专利所述PAPP-A检测试剂在高灵敏检测PAPP-A的同时又能大大缩短检测时间，为临床检验及使用带来极大方便，更适合临床科室操作。

Claims (7)

1.一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸，其特征在于，所述的免疫层析试纸条包括有PVC底板，其特征在于，所述的PCV底板上依次设有样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，所述的标记垫和所述的样品垫相接，所述的包被膜和所述的标记垫相接，所述的吸水纸和所述的包被膜相接，所述包被膜包含检测线和质控线，检测线和质控线间隔4~8 mm；所述标记垫上喷涂有荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；所述检测线包被有与所述荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体处于不同表位的另一种PAPP-A单克隆抗体；所述质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
2.如权利要求1所述的免疫层析试纸,其特征在于，所述的荧光微球的粒径为100~500nm。
3.如权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于，所述荧光微球的激发波长为310~550 nm，发射波长为340~ 620 nm。
4.一种荧光定量检测PAPP-A的免疫层析试纸的制备方法,其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
（1）荧光微球标记蛋白的制备
取荧光微球，10000~15000 rpm第一次离心5~15分钟，第一次离心分离得到的沉淀物用10~100 mM、pH 6.0~7.0磷酸盐缓冲液调节浓度为0.1%~1%，并超声分散；加入终浓度为0.1~5 mg/mL的碳二亚胺，混匀，再加入终浓度为0.1~5 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混匀；室温孵育20~40分钟后10000~15000 rpm第二次离心5~15分钟，第二次离心分离得到的沉淀物用10~100 mM pH 6.0~7.0磷酸盐缓冲液溶解，将复溶后的荧光微球超声分散，按照0.1~1.0 mg/mL荧光微球的比例分别加入PAPP-A单克隆抗体和亲和素，混匀后室温旋转混合反应1.5~3小时，10000~15000 rpm第三次离心5~15分钟，第三次离心分离得到的沉淀物用10~40 mM、pH 7.0-8.0的含10~40 mM乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的Tris-HCl复溶，超声分散后旋转混合反应0.5~1小时，10000~15000 rpm第四次离心5~15分钟，第四次离心分离得到的沉淀物用微球保存液复溶，2~8℃保存；
（2）样品垫的预处理
将样品垫用封闭液浸泡后，置于湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24 h后于2~30℃密封保存，所述封闭液含0.1~1%的Triton X-100、0.1~1%的BSA、0.1~2%的PEG 6000、0.005~0.05%的鼠抗人红细胞以及0.01~0.05M、pH 8.0的PBS缓冲液；
（3）标记垫的制备
将荧光微球标记的PAPP-A单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为3~6 μL/cm，所述标记垫处理液中含有0.2~2%的酪蛋白、5%~20%的蔗糖、0.1~1%的Tween-20、0.1~0.5%的PEG20000、0.02~0.05%的Proclin300和0.01~0.05M、pH 8.0的Tris-HCL缓冲液，将制备好的标记垫置于湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24 h后于2~30℃密封保存；
（4）包被膜的制备
分别将另一PAPP-A单克隆抗体和兔抗亲和素抗体用包被缓冲液将PAPP-A单克隆抗体喷到包被膜上的检测线，将兔抗亲和素抗体喷到包被膜上的质控线，所述PAPP-A单克隆抗体和兔抗亲和素抗体的用量按膜包被液量均为0.1~0.2 μL/mm，检测线和质控线间隔4~8mm，湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72 h后于2~30℃密封保存，备用；
（5）在底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，按照切割要求切割成3~4 mm宽度的试纸条。
5.如权利要求4所述的制备方法， 其特征在于，所述荧光微球标记的亲和素的浓度为0.1~1.0 mg/mL，按照稀释比例为0.5%~5%稀释后，喷量为3~6 μL/cm喷涂至标记垫上。
6.如权利要求4所述的制备方法， 其特征在于，所述包被膜检测线上包被的PAPP-A单克隆抗体的浓度为0.5~2 mg/mL。
7.如权利要求4所述的制备方法， 其特征在于，所述质控线上包被的兔抗亲和素抗体的浓度为0.5~2 mg/mL。
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