CN104380112B - 妊娠期糖尿病的母体生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本文的实施方案涉及用于胎儿/母体健康的筛查工具的领域，并且，更具体地，涉及妊娠期糖尿病的生物标志物。在多个实施方案中，所述方法可提供用于妊娠期糖尿病的无创和微创筛查工具，其包括检测相对于参照样品，测试样品的蛋白质组图谱的改变。在具体的实施方案中，所述方法可包括确定来自所述受试者的测试样本的蛋白质组图谱是否包括至少一种妊娠期糖尿病特有的表达特征，其中所述蛋白质组图谱包含糖基化的纤连蛋白和糖基化的PSG的表达信息，例如纤连蛋白‑SNA或纤连蛋白抗体复合物以及PSG‑AAL或PSG抗体复合物的水平的信息。在一些实施方案中，所述蛋白质组图谱还可包含脂连蛋白、性激素结合球蛋白(SHBG)、C‑反应蛋白(CRP)的表达信息、人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例、或其组合。

Description

妊娠期糖尿病的母体生物标志物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年4月13日提交的，题为“妊娠期糖尿病的母体生物标志物”的美国临时申请No.61/623,690的优先权，所述申请的整个公开内容以引用的形式全文纳入本文。
技术领域
本文的实施方案涉及用于胎儿/母体健康的筛查工具的领域，并且，更具体地，涉及妊娠期糖尿病的生物标志物。
背景技术
在美国和全球，在过去的20年内，肥胖症和糖尿病的比率已迅速增长。伴随着肥胖症和2型糖尿病的总体上升，妊娠期糖尿病(GDM)的发病率也在不断增加。预期采用基于最近的高血糖症和不良妊娠结局(HAPO)研究的新的诊断标准能够将GDM的患病率提高到约所有孕妇的18％。根据这样的事实——即可单独使用生活方式疗法来管理80-90％的患有GDM的妇女，GDM的普遍筛查逐渐被认为是合理的。
GDM是妊娠的严重并发症，其可增加多种母婴疾病(包括巨大儿、肩难产或产伤、早产、先兆子痫)的风险。除了与妊娠和分娩有关的并发症的风险增加以外，还有与GDM相关的严重产后并发症。例如，发现5-10％的患有GDM的妇女在怀孕后立即患上糖尿病，并且已经患有GDM的妇女在接下来的10-20年内发展成糖尿病的可能性高10倍。患有GDM的母亲的孩子在以后的生活中发展成2型糖尿病风险高8倍。因此，无论是短期和长期，未经治疗的GDM都会增加总的糖尿病人群。
普遍或甚至广泛的GDM筛查受到以下事实的阻碍，即所述糖尿病和糖尿病前期的标准评估(例如空腹胰岛素/葡萄糖和HbA1c)并不被推荐用于筛查GDM。相反，所推荐的参数是口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，所述试验成本昂贵且具有侵入性，需要医院就诊和多次抽血。
附图说明
通过以下的详细描述并结合附图将很容易理解实施方案。附图中的实施方案仅作示例而非限制性说明。
图1示出了对照和GDM母体血清样本的二维差异胶内凝胶电泳(2D-DIGE)分析，其中多个实施方案中，取决于过低或过高丰度的程度，丰度不同的蛋白质(箭头)呈现为绿色或红色斑点。
图2示出了依据多个实施方案的接收者操作特征(ROC)曲线，所述曲线证明了纤连蛋白和妊娠特异性糖蛋白(PSG)糖基化区分来自具有和不具有妊娠期糖尿病的孕妇的样本的能力。
图3示出了依据多个实施方案的ROC曲线，所述ROC曲线证明了作为单独分析物以及作为多分析物模型的每一种蛋白质和蛋白糖基化模式的分类性能。
图4示出了依据多个实施方案在35例非糖尿病对照中的整个孕期间对纤连蛋白-SNA的连续测量，其中，直线代表所述GDM研究小组的第25和第75百分位数。
图5是依据多个实施方案的接收者操作特征(ROC)曲线，所述曲线说明了孕期前3个月纤连蛋白-SNA预测后续产生妊娠期糖尿病的能力。
图6是依据多个实施方案的接收者操作特征(ROC)曲线，所述曲线说明了纤连蛋白和PSG糖基化区分在妊娠的中间3个月和后3个月内的非糖尿病患者和妊娠期糖尿病患者的能力。
图7是依据多个实施方案的接收者操作特征(ROC)曲线，所述曲线说明了作为单独分析物以及作为多分析物模型的每一种蛋白质和蛋白糖基化模式的分类性能。
图8A和8B示出了依据本文公开的多个实施方案可使用的侧流免疫测定(图8A)以及侧流检测装置(图8B)的实例的示意图。
图9是示出了依据多个实施方案，将纤连蛋白ELISA结果和FNLFIA测试结果进行比较的曲线图。
具体实施方式
在以下的详细说明中，参考了构成本说明书的一部分的附图，并且在所述附图中通过举例说明的方式示出了可实施的实施方案。应理解，可使用其他实施方案并且可进行结构上或符合常理的改变，而不偏离本发明范围。因此，以下的详细说明不应以限制性含义来理解，并且实施方案的范围由所附权利要求及其等价物来限定。
各种操作可以以依次的多个独立操作进行描述，这种方式可以有助于理解实施方案；但是，描述的顺序不应被解释为意味着这些操作的顺序是确定的。
本说明书可使用基于视角的描述，例如上/下、后/前以及顶部/底部。这些描述仅为便于讨论，并不意欲限制所公开的实施方案的应用范围。
可使用术语“偶联”和“连接”以及它们的派生词。应理解，这些术语不意味着是彼此的同义词。而是，在具体的实施方案中，“连接”可用于指示两个或多个元件彼此直接物理接触或电接触。“偶联”可意指两个或多个元件直接物理或电接触。但是，“偶联”还可意指两个或多个元件彼此不直接接触，但仍然彼此协作或相互作用。
出于描述的目的，以“A/B”或“A和/或B”形式表示的短语意指(A)、(B)或(A和B)。出于描述的目的，以“A、B和C中的至少一个”形式表示的短语意指(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)或(A、B和C)。出于描述的目的，以“(A)B”形式表示的短语意指(B)或(AB)，即，A是可选元件。
本说明书可使用术语“实施方案”、“多个实施方案”，这些术语可各自指代一个或多个相同或不同的实施方案。另外，如实施方案所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”等等都是同义词。
本文在多个实施方案中公开了无创和微创方法，所述方法可用于妊娠期糖尿病的广泛筛查。在多个实施方案中，所述方法可包括通过以下方式来确定来自受试者的测试样本的蛋白质组图谱是否包括至少一种妊娠期糖尿病特有的表达特征：例如通过对糖基化的纤连蛋白进行检测和/或定量(如通过对纤连蛋白-黑接骨木凝集素(SNA)或纤连蛋白-抗体复合物进行检测/定量)，和/或通过对糖基化的妊娠特异性糖蛋白(PSG)进行检测和/或定量(例如通过对妊娠特异性糖蛋白-橙黄网胞盘菌凝集素(PSG-AAL)或PSG-抗体复合物进行检测/定量)，其中所述蛋白质组图谱包括糖基化的纤连蛋白的表达信息。在一些实施方案中，所述蛋白质组图谱还可包括脂连蛋白、性激素结合球蛋白(SHBG)、C-反应蛋白(CRP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例、或者它们的组合(例如脂连蛋白、SHBG、CRP、以及hCG和胎盘催乳素的比例中的两个、三个或全部四个)的表达信息。
本文使用的术语“蛋白质组”是指在给定的时间内生物样本中的大部分蛋白质。一般而言，所述蛋白质组与基因组是根本不同的，不同在于所述基因组几乎是静态的，而所述蛋白质组则不断改变来响应内部和外部事件。因此，本文使用的术语“蛋白质组图谱”是指在给定的时间内生物样本(例如全血、血浆、血清或唾液)中的多种蛋白质的表达模式的表示形式。在多个实施方案中，例如，蛋白质组图谱可以表示为质谱，但是还包括其他基于蛋白质的任何物化或生化特性的表示形式。因此，蛋白质组图谱可例如基于如由二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)或二维差异胶内凝胶电泳(2D-DIGE)确定的蛋白质的电泳性质的差异，并且可表示为例如二维电泳凝胶中的多个斑点。在多个实施方案中，差异表达图谱可具有重要的诊断价值，并且可例如通过质谱分析、免疫印迹、ELISA测定或蛋白质微阵列来对蛋白质斑点进行检测和/或量化。在多个实施方案中，可使用侧流装置(例如用于旁床检测，以及用于抽查比色测试)对蛋白质进行检测和/或定量。
在多个实施方案中，依据本发明的蛋白质组图谱可代表或包含关于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或甚至更多种蛋白质的信息。本文使用的术语“表达特征”是指在生物样本(例如测试样本)的蛋白质组图谱中独特的蛋白表达特征或基序，所述蛋白质组图谱可能在统计学上显著不同于相应的参照样本(例如从相同类型的生物体液中获得的)的蛋白质组图谱。例如，在多个实施方案中，“妊娠期糖尿病特有的表达特征”可包括不同于正常参照样本的蛋白质组图谱的特征基序，或者其可与来自妊娠期糖尿病参照样本的蛋白质组图谱共有一个特征基序。在多个实施方案中，所述表达特征可包括两种或多种特定蛋白质的表达的增加或降低，所述特定蛋白质是例如糖基化的纤连蛋白(例如，可将其作为纤连蛋白-SNA或纤连蛋白-抗体复合物进行检测)、糖基化的PSG(例如，可将其作为PSG-AAL或PSG-抗体复合物进行检测)、脂连蛋白、SHBG、和/或CRP，和/或所述表达特征可包括两种或多种特定蛋白质的表达的比例(例如人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例)的增加或降低。对于这些蛋白质中的每一种，列出了以下的示例性的登录号：人纤连蛋白，Genbank登录号P02751；人妊娠特异性β-1-糖蛋白9，Genbank登录号gi:6093845；人性激素结合球蛋白，Genbank登录号gi:134907；人脂连蛋白，Genbank登录号gi:167077467；人绒毛膜促性腺激素β亚基，Genbank登录号gi:116184；人糖蛋白激素α链，Genbank登录号gi:121312；人胎盘催乳素，Genbank登录号gi:190034；和人C-反应蛋白，Genbank登录号gi:30224。
在一些实施方案中，所述方法包括检测增加，例如相对于参照样本的统计学显著增加，例如在糖基化的纤连蛋白(例如，可将其作为纤连蛋白-SNA或纤连蛋白-抗体复合物进行检测)和糖基化的PSG(例如，可将其作为PSG-AAL或PSG-抗体复合物进行检测)的表达上的至少10％、15％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％或甚至更大的增加，或者除了CRP和/或hCG和胎盘催乳素的比例以外，还在糖基化的纤连蛋白(例如，可将其作为纤连蛋白-SNA或纤连蛋白-抗体复合物进行检测)和糖基化的PSG(例如，可将其作为PSG-AAL或PSG-抗体复合物进行检测)的表达上的统计学显著增加。在一些实施方案中，在糖基化的纤连蛋白和PSG(例如，纤连蛋白-SNA或纤连蛋白-抗体复合物和PSG-AAL或PSG-抗体复合物)的表达上的统计学显著增加还可伴随着统计学显著降低，例如，相对于所述参照样本，在脂连蛋白和/或SHBG的表达上至少10％、15％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％或甚至更大的降低。在具体的实施方案中，除了脂连蛋白和SHBG的表达上的统计学显著降低以外，妊娠期糖尿病特有的表达特征还可包括在糖基化的纤连蛋白(例如，作为纤连蛋白-SNA或纤连蛋白-抗体复合物被检测)、糖基化的PSG(例如，作为PSG-AAL或PSG-抗体复合物被检测)、CRP的表达上以及hCG和胎盘催乳素的比例的统计学显著增加。
在多个实施方案中，如果所述参照样本是正常或对照参照样本(如来自不具有妊娠期糖尿病的受试者的样本)，并且所述测试样本的蛋白质组图谱在至少一种妊娠期糖尿病特有的表达特征上不同于所述参照样本，则可确定所述受试者具有妊娠期糖尿病。相反，如果所述测试样本在至少一种妊娠期糖尿病特有的表达特征上与所述正常参照样本没有不同，则可确定所述受试者不具有妊娠期糖尿病。在其他实施方案中，如果所述参照样本是妊娠期糖尿病参照样本(如来自具有妊娠期糖尿病的受试者的样本)，并且所述测试样本的蛋白质组图谱在至少一种妊娠期糖尿病特有的表达特征上不同于所述参照样本，则可确定所述受试者不具有妊娠期糖尿病。相反，如果所述测试样本在至少一种妊娠期糖尿病特有的表达特征上与所述妊娠期糖尿病参照样本没有不同，则可确定所述受试者具有妊娠期糖尿病。一些实施方案可使用一种以上的参照样本，例如正常参照样本和妊娠期糖尿病参照样本。因此，所述蛋白质组图谱提供了用于妊娠期糖尿病的诊断标准。用于确定相对于参照样本，目的蛋白的丰度是否增加或降低的统计学方法是本领域熟知的，并且如下文所述。
在多个实施方案中，可使用本领域技术人员已知的多种方法进行生物液体(例如全血、唾液或血清)的蛋白质组分析。在多个实施方案中，在直接的比较分析中，可以完全相同的方式处理所述参照样本和测试样本，以正确反映蛋白质的相对丰度并获得精确的结果。例如，如以上所论述的，在多个实施方案中，可根据存在于生物样本中的蛋白质的电荷和分子量通过二维-凝胶电泳将它们分离。例如，首先可使用等电聚焦(一维凝胶电泳)，例如，使用固定pH梯度(IPG)胶条(其是可商购的)，通过蛋白质的电荷将所述蛋白质进行分离。在多个实施方案中，所述第二维度可以是SDS-PAGE分析，其中可将所聚焦的IPG胶条用作样本。二维凝胶电泳分离后，然后可使用常规染料(例如考马斯亮蓝或银染)使蛋白质显影，并使用已知的技术和设备(诸如，例如Bio-RadGS800光密度计和PDQUESTTM软件)进行成像。
在一些实施方案中，然后可将单个斑点从所述凝胶中切下、脱色、并进行胰蛋白酶消化，从而使得所述肽混合物能够通过质谱(MS)进行分析。或者，在一些实施方案中，可例如通过毛细管高压液相色谱(HPLC)分离所述肽，并可通过MS将它们单独地或混合地进行分析。如果需要的话，在一些实施方案中，可确定所述肽片段的以及它们从其中衍生的蛋白质的氨基酸序列。尽管有可能对存在于蛋白质组图谱中的所有或一些蛋白质进行鉴定和测序，但这对于所述蛋白质组图谱的诊断用途来说通常不是必需的。
如以上所论述的，在多个实施方案中，可基于参照样本和测试样本之间的特征相似性或差异(例如表达特征)对妊娠期糖尿病进行诊断。例如，在多个实施方案中，如果所述蛋白质组图谱以质谱的形式存在，则所述表达特征可以是性质上或数量上不同于相应正常样本的质谱的峰或峰的组合。因此，质谱中新峰的出现或新峰的组合的出现，或在现有峰或现有峰的组合的振幅或形状上的任何统计学上的显著变化，或者质谱中现有峰的消失都可被认为是表达特征。
用于比较蛋白质组图谱的统计学方法是本领域熟知的。例如，在使用质谱的多个实施方案中，可通过在沿着谱图的水平轴的关键质量/电荷(M/Z)的位置处的峰幅值定义蛋白质组图谱。因此，在多个实施方案中，可例如通过由在给定的M/Z值处的光谱振幅的组合形成的图谱来表征特征性的蛋白质组图谱。在多个实施方案中，可通过使用合适的算法将测试样本的蛋白组图谱与参照样本的蛋白质组图谱进行匹配来确定是否存在特征性表达特征或两个图谱的实质同一性。
其他实施方案可使用蛋白质阵列来检测蛋白质表达水平，能够实现高通量分析。蛋白质阵列是本领域技术人员已知的，并且通常通过使用任何本领域熟知的各种共价和非共价的连接化学作用将蛋白质(例如，特异性针对目的蛋白的抗体)固定在固体表面(例如玻璃、硅胶、硝化纤维素、或PVDF)来形成。可使用来自两种不同来源(例如，正常和测试样本)的荧光标记的蛋白质来探测所述阵列，荧光强度可反映靶蛋白的表达水平。
多个实施方案还可使用任意的用于蛋白表达水平定量的多种免疫测定形式。一般而言，免疫测定可以是均相的或非均相的。例如，在多个实施方案中，可使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来对蛋白质表达进行定量。在一个实施例中，在“夹心”测定中，固体表面可涂有固相抗体，并且可使所述测试样品与所结合的抗体反应。然后，可将任何未结合的抗原(例如，目的蛋白)洗掉，随后已知量的酶标记的抗体可进行反应。然后可将所述标记物作为对所述样本中存在的目的蛋白含量的直接量度进行定量。
在一些实施方案中，可将ELISA作为竞争性测定使用。例如，在竞争性测定中，可将含所述目的蛋白的测试样本与精确量的酶标记的目的蛋白混合，并且两者可竞争结合连接到固体表面上的抗体。在多个实施方案中，可在洗掉过量游离的酶标记的蛋白质后加入所述酶的底物，从酶-底物相互作用中产生的颜色强度可作为测试样本中目的蛋白的量的量度。
多个其他实施方案可使用酶倍增免疫测定技术(EMIT)对目的蛋白进行定量，其可包括测试样本、酶标记的目的蛋白分子、特异性针对目的蛋白的抗体、和特异性酶显色底物。在多个实施方案中，可将过量的特异性抗体加入到所述测试样本中，然后所述目的蛋白可结合到所述抗体上。在多个实施方案中，然后可将一定量的相应的酶标记的蛋白质加入到该混合物中，未被测试样本中的目的蛋白占据的抗体结合位点会被所述酶标记的蛋白质分子占据。因此，在多个实施方案中，酶活性可能会降低，这是因为只有游离的酶标记的蛋白能够作用于底物，并且转化的底物的量可反映混合物中剩下的游离酶的量。在多个实施方案中，所述样本中高浓度的目的蛋白可导致更高的吸光度读数。
多个其他实施方案包括用于对测试样本中的目的蛋白进行定量的免疫测定试剂盒。在多个实施方案中，这些试剂盒可包括：在单独的容器中的对每一种目的蛋白具有结合特异性的单克隆抗体，和，任选地，抗体免疫球蛋白，特别是经标记的抗抗体免疫球蛋白。
本文还公开了用于所述公开方法的捕获装置和样品收集试剂盒。在一些实施方案中，可使用样品捕获装置——如可使得能够对两种或多种目的蛋白进行定量的侧流装置(例如，侧流检测带)——进行所述公开方法。可获得多种不同构型的侧流装置，但是，在一个实施例中，检测带可包括从上游的样品应用区到检测位点的流动路径，例如从样本应用区通过移动区到捕获区。在多个实施方案中，所述移动区可包含可与目的蛋白相互作用的可移动的标志物，所述捕获区可包含用于检测和/或定量的结合目的蛋白的试剂。在其他实施方案中，示例性的样品收集试剂盒可包含吸收介质如滤纸，所述吸收介质可包含用于将测试样品放置在所述介质上的标记。这类试剂盒还可包括用于从受试者中获得血液样本的穿刺装置，以及任选的，用于将所述测试样品发送给医师或实验室以进行分析的邮件程序。例如，可在标准产检过程中(例如，在12周、16周、20周或24周就诊时)使用这些样品收集试剂盒，和/或可在获得用于其他标准产前测试的血液时进行样品收集。
提供如下的实施例仅为了说明目的，不应被解释为以任何方式的限制。
实施例
实施例1:受试者选择
连续共1463名处在妊娠中间3个月和最后3个月的妇女进行了75克OGTT及随后2小时血浆葡萄糖测定。2小时血浆葡萄糖>7.8mmol/L则诊断为GDM，这与WHO标准一致。将所有剩下的妇女都归类为非糖尿病患者。
从所述人群中随机选取14名非糖尿患者和15名GDM参与者。表1中描述了参与者的临床特征。
表1.根据GDM状态的参与者特征
实施例2：蛋白质组图谱
分析血清样本以获得对激素结合球蛋白(SHBG)、脂连蛋白、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胎盘催乳素、C-反应蛋白(CRP)、妊娠特异性糖蛋白(PSG-1)、和纤连蛋白、以及特定糖基化形式的纤连蛋白和PSG-1的测量结果(表2)。进行了二维差异胶内凝胶电泳(2D-DIGE)和免疫测定(ELISA)。
表2.正常孕妇和妊娠期糖尿病孕妇之间的血清分析物水平的差异
通过直接凝集素结合免疫测定确定了纤连蛋白和PSG-1的差异糖基化。将t-检验用于分析正态分布的连续变量并将Wilcoxon非参数等效检验用于带有倾斜分布的变量。将卡方检验和Fisher精确检验用于分类变量。使用参数t-检验和Wilcoxon非参数t-检验分别检测带有正态分布和倾斜分布的变量的组间差异。使用Wilcoxon非参数t-检验在所有研究小组中计算和测试了蛋白质的比例。
将从来自逻辑回归模型的预测概率产生的接收者操作特征(ROC)曲线用于评估单个分析物和多个分析物组合的分类能力。计算来自简单逻辑回归的ROC曲线下的面积(AUROC)来单独描述每一种蛋白质、比例、以及糖基化蛋白的分类能力。基于所述AUROC结果，连续加入单独的蛋白质、比例、和糖基化蛋白质来构建用于提高分类性能的多分析物模型。使用SAS软件版本9.22(SAS Institute Inc.,Cary,NC)进行所有的统计学分析。
实施例3：妊娠期糖尿病特有的表达特征的鉴定
图1说明了混合的对照和GDM母体血清的总糖蛋白部分的2D-DIGE比较，其中多个实施方案中，在对照和GDM样本中具有丰度差异的蛋白质斑点呈现为绿色或红色斑点，而以相似水平存在的蛋白质呈现为黄色。箭头指向对应于丰度不同的推定的生物标志物的单独蛋白质斑点。
选取两个特定的母体血清糖蛋白——纤连蛋白和妊娠特异性糖蛋白(PSG-1)，用于评估糖基化状态的潜在改变。凝集素反应分析表明与黑接骨木凝集素(SNA)结合相关的纤连蛋白糖基化以及和橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)结合相关的PSG-1糖基化在GDM母体血清中相对对照血清显著升高。因此，选取了这两个蛋白-凝集素对——纤连蛋白-SNA和PSG-AAL用于包含在带有其他生物标志物的多分析物面板上，所述其他生物标志物之前已被证明在GDM中显示了差异丰度，其包括脂连蛋白、性激素结合球蛋白(SHBG)、C-反应蛋白(CRP)、以及人绒毛膜促性腺激素(hCG)和胎盘催乳素的比例。对一组来自表1所述群组的对照和GDM母体血清样本中的这些分析物进行了单独和联合评估。
平均的参与者年龄和孕前BMI分别是24.4±3.5岁和20.3±3.3kg/m2。糖化血红蛋白测量在非糖尿病参与者和GDM参与者之间没有区别[分别为5.2％(IQR：5.0-5.4％)和5.4％(IRQ：5.1-5.8％)]。空腹血浆葡萄糖测量在小组间也是类似的[80mg/dl(IQR：77-85mg/dl)和84mg/dl(IQR：79-90mg/dl)；p＝0.20]。另外，对于测量的任何其他临床参数，在研究小组之间没有观察到统计学显著差异。
如表2所示，PSG-AAL、纤连蛋白-SNA以及hCG/胎盘催乳素比例的水平在GDM小组中均显著升高(分别为p＝0.004、p＝0.006和p＝0.03)。母体血清CRP水平的差异显示了边界显著性(p＝0.05)，其在非糖尿病参与者中的中位浓度为2.1mg/L，在GDM参与者中的中位浓度为5.7mg/L。因此，按比例组合这些蛋白质可提高辨别能力。
图2显示了依据多个实施方案的接收者操作特征(ROC)曲线，该曲线证明了纤连蛋白糖基化和妊娠特异性糖蛋白(PSG)糖基化区分来自具有和不具有妊娠期糖尿病的孕妇的样本的能力。图3显示了依据多个实施方案的ROC曲线，所述ROC曲线证明了作为单独的分析物以及作为多分析物模型的每一种蛋白质和蛋白糖基化模式的分类性能。虽然仅通过所述两种糖基化蛋白PSG-AAL和纤连蛋白-SNA的表达来检测GDM(AUROC:0.85，图2)的能力良好，但在多分析物模型(图3)中将它们与表2所述的其他分析物联合使用明显表现出优越性能(AUROC：0.97)。具体地，单独纤连蛋白-SNA和PSG-AAL的组合具有74％的检出率，假阳性率为6％(图2)，而所述多分析物模型具有显著提高的检出率(87％)，假阳性率为<1％(图3)。
因此，由母体血清中单独的蛋白质、蛋白质的比例、和特定的蛋白质糖基化模式组成的多分析物测试图谱能够鉴定出独立由OGTT区分的GDM患者。这些分析物都适于在干血斑中分析，这使得能够将微创、方便和低成本的筛查测试用于GDM，该测试尤其适用于评估在糖尿病护理上存在显著差异的缺乏医务照料的人群。
实施例4：用于预测/检测GDM的孕期前3个月血清组合(Panel)的材料与方法
使用Konelab60i临床化学分析仪(Thermo Electron Co,Finland)通过己糖激酶方法测定血浆葡萄糖。
ELISA中使用的一级抗体的来源(目录号)和工作稀释度如下：购自Abcam的稀释250倍的SHBGMAb(31401)；购自US Biologicals的稀释250倍的胎盘催乳素MAb(L1022-03G)；购自Millipore的稀释250倍的hCGMAb(MAB605)；购自R&D系统的稀释1000倍的纤连蛋白单抗(MAB1918)、稀释180倍的CRP多克隆抗体(842676)、稀释180倍的脂连蛋白单抗(840965)和稀释500倍的的PAPPA-2单抗(MAB1668)；以及购自Dako的稀释1000倍的AFP多克隆抗体(A0008)和稀释1000倍的PAPPA-1多克隆抗体(A0230)。
通过夹心ELISA测定了蛋白质分析物的水平。将一级包被抗体重悬于碳酸盐缓冲液(pH9.6)，加入100μl到96孔Reactibind平板(Pierce)的每个孔中并在4℃下过夜孵育。用溶于PBS(pH7.2)的3％BSA封闭平板。加入样品并在室温下孵育45分钟后，使用Biotek板洗板机用PBST洗涤平板，然后用检测抗体在室温下孵育45分钟。再次用PBST洗涤平板，用链霉亲和素-HRP(50ng/ml，溶于PBS；Pierce)在室温下孵育45分钟，然后用PBST洗涤。加入TMB底物(Neogen)，信号产生后，通过加入2N的H2SO4终止反应。使用EPOCH平板读取器(Biotek)在490nm对平板读数，并使用Gen5软件版本1.10.8处理数据。然后如下面实施例6所述，对数据进行分析。每一个平板上都设置参照样本。对于连续测量测定运行，在同一平板上包括来自每一个参与者的孕期前、中、后3个月的样本。所有测定的组间变异系数(CV)为<10％。
对于纤连蛋白-SNA的测定，将所述纤连蛋白单抗用于包被Reactibind平板，然后如上所述对平板进行封闭。然后将所述封闭溶液除去，加入200μl/孔的氧化缓冲液(100mM高碘酸钠、50μM柠檬酸、pH4.0)并将平板孵育14分钟。然后将所述氧化溶液除去，并在加入样品之前用PBST洗涤平板。将样品稀释800倍使用，然后用PBST洗涤平板。接着将生物素缀合的SNA(Vector Labs)加入到PBS中至终浓度为0.5ng/μl。用PBST洗涤平板后，用链霉亲和素-HRP孵育平板并如上进行处理。FN-SNA的组间CV为17％。
实施例5:用于预测/检测GDM的孕期前3个月血清组合的受试者人群
芬兰产科组(the Finnish Maternity Cohort)是来自国家健康与福利研究所(芬兰)的血清库的前瞻性研究。在2004和2010年间从奥卢大学医院(奥卢，芬兰)和库奥皮奥大学医院(库奥皮奥，芬兰)地区的产科诊所中招募了参与者。
在常规产前检查的过程中抽取血清样本，并从出生登记处(the Birth Register)获得临床数据，所述出生登记处是包含母体特征信息和妊娠结局信息的计算机化数据库。
本发明分析采用了病例-对照设计，其中从所述人群中随机选取了共90例病例和92例对照。参与者需要足够量的在怀孕5周和13周期间收集的孕期前3个月血清。合格的GDM病例包括在怀孕期间产生GDM的任何妇女，通过标准的75g OGTT及随后2小时血浆葡萄糖测定来鉴定。2小时血浆葡萄糖>140mg/dl(7.8mol/L)则诊断为GDM，这与世界卫生组织标准一致。从相同的作为病例的、但是在怀孕期间不产生GDM的人群中选取非糖尿病对照。从两个小组的同一数据库中提取母体特征和妊娠结局信息。有13例非糖尿病对照未能从出生登记处提取到临床数据。具有和不具有临床数据的非糖尿病对照之间的血清分析物浓度没有实质性差异。
除了孕期前3个月血清以外，35例非糖尿病对照还具有在孕期中间3个月和后3个月抽取的血清样本。将这些参与者包括在连续测量分析中以对孕期前、中、后3个月间FN-SNA浓度的变化进行评估(图4)。
实施例6:用于预测/检测GDM的孕期前3个月血清组合的统计学分析
对每一个母体特征和血清分析物测量结果进行了彻底的描述性分析。使用用于连续变量的两侧独立t-检验和用于分类变量的卡方检验和Fisher精确检验对根据研究小组的母体特征的分布进行了比较。将Wilcoxon非参数t-检验用于在所有小组间比较带有倾斜分布的连续变量。在具有纤连蛋白-SNA的连续测量结果的参与者中，使用混合模型计算并比较了孕期前、中、后3个月的最小均方(least square means)。将纤连蛋白-SNA的连续测量结果绘制成图并使用双向混合效果组内相关系数对可重复性进行量化。
使用单变量和多变量二项逻辑回归对每一种血清分析物和GDM的后续产生之间的独立相关性进行了评估。可使用具有稳健方差估计的泊松分布从该方法中获得风险比率(RR)和95％置信区间(CI)。在单变量和多变量模型中将血清分析物分成三分位数并进行评估。调整第一个模型的基线母体因素，包括母亲年龄、未产妇、样本收集时的胎龄。除了与GDM状态显著相关(p<0.05)的每一种血清分析物以外，第二个模型还包括所有基线母体因素。在多变量二项逻辑回归分析中包括纤连蛋白-SNA、脂连蛋白、hs-CRP和胎盘催乳素(图4)。
为了评估这些血清分析物的作为用于预测GDM的单独生物标志物和作为孕期前3个月的潜在组合的临床效用，从来自逻辑回归模型的预测概率中产生了接收者操作特征(ROC)曲线。计算来自简单逻辑回归的ROC曲线下的面积(AUROC)和95％置信区间(CI)来单独描述每一种血清分析物的GDM分类能力。对由纤连蛋白-SNA、脂连蛋白、hs-CRP和胎盘催乳素组成的多分析物GDM筛选组合进行评估以确定和单个分析物相比的多分析物模型的区别。使用向后选择法来评估每个分析物对所述多分析物组合的贡献并确定血清分析物是否是累加性的。生成了其他ROC曲线以确定所述多分析物组合的分类性能是否因母亲的产次、GDM诊断的时间而变化。
报道了双侧p-值，并且认为小于0.05的值具有统计学显著性。使用SAS软件版本9.3(SAS Institute Inc.,Cary,NC)进行所有的统计分析。
实施例7：用于预测/检测GDM的孕期前3个月血清组合的2D-DIGE
如2D-DIGE所评估的，GDM与GDM母体血清糖蛋白质组的变化相关。图1中对此进行了说明，其示出了混合的对照和GDM母体血清的总糖蛋白部分的2D-DIGE比较，其中在对照和GDM样本中具有丰度差异的蛋白质斑点呈现为绿色或红色斑点，而以相似水平存在的蛋白质呈现为黄色。箭头指向对应于丰度不同的候选生物标志物的单独蛋白质斑点。
在随后的分析中，选择了纤连蛋白用于评估糖基化状态的潜在改变。凝集素反应分析表明与黑接骨木凝集素(SNA)结合相关的纤连蛋白糖基化在孕期前3个月的GDM母体血清中相对对照血清显著升高。因此，将FN-SNA包括在带有其他生物标志物的多分析物组合中，所述其他生物标志物之前已被证明在GDM中显示了差异丰度，其包括脂连蛋白、性激素结合球蛋白(SHBG)、C-反应蛋白(CRP)、以及人绒毛膜促性腺激素(hCG)和胎盘催乳素的比例。对一组来自以下表3所述群组的对照和GDM母体血清样本中的这些分析物进行了单独和联合评估。
表3.根据妊娠期糖尿病状态的孕期前3个月血清蛋白质和蛋白质糖基化浓度。
1对于连续变量使用两侧独立t-检验和Wilcoxon两侧非参数t-检验进行比较。卡方检验和Fisher精确检验用于分类变量。220例、19例和16例非糖尿病对照分别未获得分娩时的胎龄、出生体重和产次数据。
实施例8.孕期前3个月病例-对照分析
样本收集时的平均孕龄为9.9±1.2周(范围：5.7-13.1)，在GDM和非糖尿病对照参与者(分别为10.2±0.8周和9.7+1.4周)之间没有显著差异。GDM参与者比非糖尿病对照的年龄更大(31.4+5.9岁和26.2+4.0岁；p<0.0001)并且是未生育过的可能性更小(34％和82％；p<0.0001)(表3)。在GDM参与者中，诊断时的平均胎龄为22.2±6.2周，孕期前3个月血清抽取和GDM诊断的间隔为平均12.6+6.0周。
孕期前3个月的FN-SNA、脂连蛋白、hs-CRP和胎盘催乳素在浓度与GDM状态显著相关(p<0.001；表3)。具体地，和非糖尿病对照相比，FN-SNA在GDM中显示出显著更高的浓度，在小组分布上具有最小的重叠[平均(95％CI)：分别为132(124，139)mg/L和80(72，87)mg/L；p<0.0001]。
后续产生GDM的风险随着FN-SNA、hs-CRP和胎盘催乳素的三分位数的增加而增加(下表4)。如果孕期前3个月浓度低于第一个三分位数(<2.2μg/ml)，脂连蛋白则表现出明显更大的GDM风险，但是在第二个和第三个三分位数之间的风险比率上没有显著差异(p＝0.15)。多变量分析表明一旦调整了母亲年龄、未产妇和样本收集时的胎龄，所有血清分析物的风险比率显著衰减。尽管如此，在调整这些母体因素以后，FN-SNA与GDM具有很强的独立相关性。另外，当小于80mg/L的FN-SNA浓度被用作参照组时，在第二个和第三个三分位数之间的风险比率增加[RR(95％CI)：分别为4.81(1.85，12.49)和7.62(2.97，19.58)]。第二个和第三个三分位数之间的差异具有统计学显著性(p<0.0001)。在将所有的血清分析物加入到所述母体因素模型中时，FN-SNA的风险比率具有最小的变化。在这个充分调整过的模型中，只有FN-SNA和胎盘催乳素表现出与该人群中GDM的产生具有显著独立相关性。
表4.孕期前3个月血清蛋白质和蛋白质糖基化浓度的所有三分位数中的后续妊娠期糖尿病的风险
1调整母体因素(包括母亲年龄、样本收集时的胎龄)
由于与疾病或结果的统计学上显著相关性不总是转化为很强的诊断准确性，使用ROC分析对这些测试的临床效用进行了量化。所述ROC曲线是所有可能假阳性部分的诊断测试的灵敏度的曲线(1-特异性，图5)。所述AUROC是可被用于比较诊断测试的分类性能的统计数据。1.00的AUROC反应了研究小组之间的完美区别，而0.5的AUROC表明没有区别。如下面表5所示，单独的FN-SNA的AUROC为0.91(95％CI：0.87，0.96)。这转化为来自孕期前3个月血清筛查的82％GDM病例的检出率，假阳性率为10％。尽管与GDM状态之间有很强的单变量相关性，hs-CRP、脂连蛋白、和胎盘催乳素仅显示出边缘分类性能。为了检测将这些测试组合成多分析物模型是否提高了诊断的精确性，计算了FN-SNA、脂连蛋白、hs-CRP、和胎盘催乳素的AUROC。所述多变量分析模型产生了0.91的AUROC(95％CI：0.88，0.96)，其与单独的FN-SNA的性能相比没有显著差异(p＝0.48)。
表5.作为孕期前3个月单独的测试和作为多分析物组合的每一种蛋白质和蛋白质糖基化的分类性能。
1使用单变量和多变量逻辑回归模型获得了接收者操作特征(ROC)曲线下的面积(AUROC)和95％置信区间(CI)。
进行了根据关键母体特征的分层以确定所述分类性能是否受这些因素影响。在对未产妇进行分层时，没有观察到FN-SNA的AUROC的不同。另外，如果FN-SNA只能检测当前或将发生的GDM，则孕期前3个月筛查和GDM诊断间隔的时间可影响所述测试的诊断准确性。当所述分析仅限于在其孕期前3个月样本收集后10周以上才诊断为GDM的病例时，所述FN-SNA的AUROC是相似的[AUROC(95％CI)：0.92(0.87，0.96)]。另外，在FN-SNA浓度与孕期前3个月样本收集和GDM诊断间隔的时间之间没有观察到相关性(r＝-0.06)。
实施例9：纤连蛋白-SNA的连续测量
组内相关系数表明了在具有重复血清测量结果的非糖尿病对照的整个孕期中FN-SNA具有适度的可重复性(r＝0.44)。在孕期前、中和后3个月间观察到了FN-SNA浓度的显著差异[平均(95％CI)：分别为66(59，72)mg/L，56(50，63)mg/L和69(62，75)mg/L；p＝0.003]。关于FN-SNA浓度，在孕期前3个月和后3个月之间没有显著差异(p＝0.51)。尽管在整个孕期中有变化，但只有4例非糖尿病对照参与者具有高于孕期前3个月GDM人群的第25百分位数的FN-SNA浓度。
这些分析说明了由母体血清中单独的蛋白质分析物、分析物比例、和特定的蛋白质糖基化组成的组合有效鉴定独立由OGTT区分的GDM患者的用途。单独的FN-SNA在孕期前、中和后3个月的稳健性能，加上在加入CRP、SHBG、和hCG/胎盘催乳素比例时其增强的孕期前3个月的性能，支持了所述组合用于早期筛查和后续确认和诊断GDM的用途。事实上，单独的纤连蛋白-SNA在特异性和灵敏度方面的性能，超过了已被提出作为标准OGTT的前置筛查的50g葡萄糖负荷测试的性能。这些分析物都适于在干血斑中分析，这使得能够将微创、方便和低成本的筛查测试用于GDM，该测试尤其适用于评估在糖尿病护理上存在显著差异的缺乏医务照料的人群。
除了纤连蛋白-SNA自身以外，所述多分析物组合的大部分组分也是糖蛋白，并且已经报道它们的糖基化在病理条件下被改变以调控血清稳定性或调节活性。因此，它们在鉴定GDM中的用途进一步支持了以下观点，即所述糖蛋白质组构成了和细胞功能以及病理生理学密切相连的一类重要的生物标志物。
实施例10.用于诊断GDM的血清标志物
连续共1463名处在妊娠中间3个月和后3个月孕期的妇女进行了75克口服葡萄糖耐受测试(OGTT)及随后2小时血浆葡萄糖测定。2小时血浆葡萄糖>7.8mmol/L则诊断为GDM，这与WHO标准一致。将所有剩下的妇女都归类为非糖尿病患者。
使用了病例-对照设计，其中从所述人群中随机选取14名非糖尿病患者和15名GDM参与者。将来自所述OGTT的血液样本用于获得以下测量结果：性激素结合球蛋白(SHBG)、脂连蛋白、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胎盘催乳素、C-反应蛋白(CRP)，PSG-1、纤连蛋白以及纤连蛋白和PSG-1的糖基化形式。
通过直接凝集素结合测定确定了特定蛋白质(例如，纤连蛋白和PSG-1)的差异糖基化，其中从母体血清中免疫沉淀出蛋白质。通过商业ELISA试剂盒测定了母体血清中总的纤连蛋白和PSG-1、脂连蛋白、CRP、hCG和胎盘催乳素的水平。
对每一种蛋白质、糖基化的蛋白和参与者的特征进行了详尽的描述性分析。使用参数t-检验和Wilcoxon非参数t-检验分别在所有研究小组中检测了带有正态和倾斜分布的变量的差异。使用Wilcoxon非参数t-检验在所有研究小组中计算和检测了蛋白质的比例。
从来自逻辑回归模型的预测概率中产生的接收者操作特征(ROC)曲线可用于评估单个分析物和多个分析物组合的分类能力。计算来自简单逻辑回归的ROC曲线下的面积(AUROC)来单独描述每一种蛋白质、比例、以及糖基化蛋白的分类能力。基于所述AUROC结果，连续加入单独的蛋白质、比例、和糖基化蛋白质来构建用于提高分类性能的多分析物模型。
使用SAS软件版本9.22(SAS Institute Inc.,Cary,NC)进行所有的统计学分析。
下表6中描述了所述样本群体的特征。所述平均的参与者年龄和孕前BMI分别是24.4±3.5岁和20.3±3.3kg/m2。糖化血红蛋白测量结果在非糖尿病参与者和GDM参与者之间没有区别[分别为5.2％(IQR：5.0-5.4％)和5.4％(IRQ：5.1-5.8％)]。空腹血浆葡萄糖测量结果在小组间也是类似的[80mg/dl(IQR：77-85mg/dl)和84mg/dl(IQR：79-90mg/dl)；p＝0.20]。另外，对于测量的任何其他临床参数在研究小组之间没有观察到统计学显著差异。
表6.根据妊娠期糖尿病状态的参与者特征
1t-检验用于正态分布的连续变量并且Wilcoxon非参数等效检验用于带有倾斜分布的变量。将卡方检验和Fisher精确检验用于分类变量。
如下面表7所示，PSG-AAL和纤连蛋白-SNA的水平在GDM小组中均显著升高，hCG/胎盘催乳素比例也是。尽管已经报道了hCG和胎盘催乳素在GDM母体血清中显示了改变的水平，它们的比例在所述样本组中是明显高度分化的。
表7.根据妊娠期糖尿病状态的蛋白质浓度和糖基化
1Wilcoxon非参数t-检验
图6示出了使用纤连蛋白-SNA和PSG-AAL以及所述组合的接收者操作特征(ROC)曲线。尽管用于检测GDM的这两个分析物的灵敏度和特异性是良好的，在多分析物模型(图7)中附加表7中所述的其他分析物则明显地表现出优越性能，即使这些分析物本身在非糖尿病和GDM母体血清中单独不具有显著的丰度差异。
实施例11.纤连蛋白侧流免疫测定(FN LFIA)
可使用多种侧流测定方法来检验生物样本中分析物的存在或不存在或数量。在一个实施例中，“夹心”测定法使用固定在固体支持物上的抗体——其形成了带有标记的抗体的复合物的部分——通过观察结合的分析物标记的抗体复合物的存在和数量来确定靶分析物的存在。对于侧流免疫测定的目的，所述标记物可以是酶、有色微球、荧光标记的微球，或者可使用其他相似的检测方法，所述方法用于对结合到所述检测线上的分析物进行检测和/或定量。
传统的侧流检测条以固体支持物为特征，在该固体支持物上支持样本接收区和靶标捕获区。所述固体支持物的材料是这样一种材料，其能够支持所述样本接收区和靶标捕获区，并且当所述侧流检测条暴露于适当的作为所述样本的流体载体的溶剂或缓冲液中时，其能够支持样本的毛细管流动，以从所述样本接收区流出至靶标捕获区。可用作支持物的通用类材料包括有机或无机聚合物，以及天然和合成的聚合物。适合的固体支持物的更具体的实例包括，但不限于，玻璃纤维、纤维素、尼龙、交联葡聚糖、各种色谱纸和硝化纤维素。尤其有用的材料是硝化纤维素。
图8A和8B示出了依据本文公开的多个实施方案可使用的侧流免疫测定(图8A)以及侧流检测装置(图8B)的实例的示意图。简而言之，将200μg/mL的兔抗-纤连蛋白作为检测线固定在膜上(0.5μL/条带)并将300μg/mL的山羊抗小鼠IgG作为过程对照线进行固定(0.5μL/条带)。将鼠抗纤连蛋白-缀合的微球(10μl的150μg/mL鼠抗纤连蛋白，1mg/mL固体物质)干燥到缀合垫上，所述缀合垫已经被含有以下物质的溶液(每升)处理过：3.81g硼酸钠、2.0g葡聚糖、5.0g BSA、1.0g吐温-20、和0.5g叠氮钠、pH8.0，并接着在50℃下干燥1小时。
然后将所述样本在HEPES电泳缓冲液(10mM HEPES、0.1mM CaCl2、155mM NaCl、0.1％的NaN3、0.75％的吐温-20、和0.01％的聚乙烯醇)中稀释500倍。当将样本施加到样本垫上，毛细管流动使得含纤连蛋白的样本能够水化并与所述标记的微球相互作用，形成了纤连蛋白标记的微球复合物，其进一步迁移到所述检测线，在此它们被兔抗纤连蛋白捕获。
在毛细管迁移完成后，扫描所述装置，并且通过定量光密度测定法确定样本中相对于标准曲线的纤连蛋白的含量，所述标准曲线使用纯化的纤连蛋白作为标准。图9是示出了将纤连蛋白ELISA结果和上述FNLFIA测试结果进行比较的图表。如图9所示，所述两个测试结果彼此密切一致，表明了所述FN-LFIA测试是灵敏和精确的。
虽然本文已说明和描述了特定的实施方案，但本领域的普通技术人员会理解推算可实现相同目的的各种各样的替代和/或等价的实施方案或实施例可以替代所示的和所描述的实施方案，而不偏离本发明的范围。本领域的技术人员会很容易地理解，实施方案可以各种各样的方式来实施。本申请意欲覆盖本文论述的实施方案的任何修改或变化。因此，很显然实施方案仅由权利要求及其等价物限定。

Claims (16)

1.抗体或凝集素在制备用于进行确定受试者是否患有妊娠期糖尿病的体外方法的试剂中的用途，所述方法包括：
提供来自所述受试者的测试样品；
测量所述样品中糖基化的纤连蛋白的水平；
测量所述样品中糖基化的PSG的水平；和
确定相对于非糖尿病对照参照样本，在所述样品中糖基化的纤连蛋白和糖基化的PSG的水平是否升高。
2.权利要求1的用途，其中测量所述样品中糖基化的纤连蛋白的水平包括使用抗体或凝集素检测糖基化的纤连蛋白。
3.权利要求2的用途，其中测量所述样品中糖基化的纤连蛋白的水平包括使用抗纤连蛋白-SNA抗体检测糖基化的纤连蛋白。
4.权利要求2的用途，其中测量所述样品中糖基化的PSG的水平包括使用抗PSG-AAL抗体检测糖基化的PSG。
5.权利要求2的用途，其中测量所述样品中糖基化的纤连蛋白的水平包括使用SNA检测糖基化的纤连蛋白。
6.权利要求2的用途，其中测量所述样品中糖基化的PSG的水平包括使用AAL检测糖基化的PSG。
7.权利要求1的用途，其中所述方法还包括在所述样品中测量以下中的一种或多种：脂连蛋白、性激素结合球蛋白(SHBG)、C-反应蛋白(CRP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例；或其组合。
8.权利要求1的用途，其中所述方法还包括确定相对于非糖尿病对照参照样本，在所述样品中C-反应蛋白(CRP)的水平和/或人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例是否升高和/或确定相对于非糖尿病对照参照样本，在所述样品中脂连蛋白和/或性激素结合球蛋白(SHBG)的水平是否降低。
9.权利要求1的用途，其中相对于所述非糖尿病对照参照样本，在所述样品中糖基化纤连蛋白的水平和糖基化PSG的水平的升高表明所述受试者患有妊娠期糖尿病。
10.权利要求9的用途，其中相对于所述非糖尿病对照参照样本，C-反应蛋白(CRP)的水平和/或人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例的升高，或相对于非糖尿病对照参照样本，脂连蛋白和/或性激素结合球蛋白(SHBG)的水平的降低，表明所述受试者患有妊娠期糖尿病。
11.权利要求10的用途，其中所述糖基化纤连蛋白的水平和糖基化PSG的水平的升高，以及C-反应蛋白(CRP)的水平和/或人绒毛膜促性腺激素(hCG)与胎盘催乳素的比例的升高为至少增加10％。
12.权利要求10的用途，其中所述降低为至少降低10％。
13.权利要求1的用途，其中所述测试样品包含全血或血清。
14.权利要求1的用途，其中使用ELISA测定或侧流装置确定所述样品中糖基化纤连蛋白的水平和糖基化PSG的水平。
15.用于权利要求1的用途的试剂盒，所述试剂盒包含抗纤连蛋白-SNA抗体和/或抗糖基化纤连蛋白抗体以及抗PSG-AAL抗体和/或抗糖基化PSG抗体。
16.权利要求15的试剂盒，所述试剂盒还包括：
抗纤连蛋白抗体；
抗PSG抗体；
抗脂连蛋白抗体；
抗性激素结合球蛋白(SHBG)抗体；
抗C-反应蛋白(CRP)抗体；
抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)抗体；
抗胎盘催乳素抗体；或其组合。
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