DE69133393T2

DE69133393T2 - Verfahren zur diagnose und behandlung von diabetes

Info

Publication number: DE69133393T2
Application number: DE69133393T
Authority: DE
Inventors: Steinunn Baekkeskov; Henk-Jan Aanstoot; Pietro Decamilli; Franco Folli; Michele Solimena
Original assignee: Yale University; University of California
Current assignee: Yale University; University of California
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2011-09-07
Also published as: JPH06502916A; EP0547164A1; WO1992004632A1; US20020131963A1; EP0547164B1; US7718386B1; DE69133393D1; AU8721991A; JP2727377B2; EP0547164A4; ES2223039T3; ATE268908T1; DK0547164T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen verbesserte Verfahren zur Identifizierung und Behandlung von Individuen, die unter Diabetes leiden oder dafür anfällig sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Glutaminsäure-Decarboxylase zur Detektion von spezifischen Antikörpern gegen β-Zellen der Bauchspeicheldrüse in Seren von diabetischen oder prädiabetischen Individuen sowie eine Zubereitung zur Inhibierung der Immunantwort, die eine Zerstörung von β-Zellen verursacht.
Insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) betrifft vorwiegend junge Menschen. Auch wenn Insulin für eine Behandlung zur Verfügung steht, so treiben die mehrfach erhöhte Morbidität und Sterblichkeit, die mit dieser Krankheit verbunden sind, die Entwicklung von frühen diagnostischen und vorbeugenden Verfahren voran. Die Zerstörung von pankreatischen β-Zellen, die dem klinischen Ausbruch von IDDM vorausgeht, wird durch Autoimmunmechanismen vermittelt. Eine der am Besten untersuchten Autoimmunabnormitäten, die mit der Erkrankung in Verbindung stehen, stellt die hohe Häufigkeit von zirkulierenden β-zellspezifischen Autoantikörpern zum Zeitpunkt der Diagnose dar. Familienuntersuchungen zeigten, dass die Autoantikörper eine Reihe von Jahren vor einem offenen IDDM auftreten, was eine lange prodromale Periode der humoralen Autoimmunität vor dem Auftreten von klinischen Symptomen nahe legt. Die Familienuntersuchungen wiesen auch einen langsamen, progressiven Verlust der Insulinantwort gegenüber intravenöser Glucose in den Jahren vor der Diagnose nach. Das Vorliegen von β-zellspezifischen Autoantikörpern in der prädiabetischen Periode spiegelt aller Wahrscheinlichkeit nach den andauernden Autoimmunvorgang wider, der gegebenenfalls zu einer kritischen β-Zell-Dezimierung und Insulinabhängigkeit führt. Es wurde geschätzt, dass nur 10 % der gesamten β-Zellmasse zum Zeitpunkt des klinischen Ausbruchs beibehalten ist.
Ein Hauptziel der Diabetesforschung lag darin, Immuninterventionen zu entwickeln, die die Zerstörung von β-Zellen und die Entwicklung von IDDM blockieren oder inhibieren. Da Immuninterventionen wahrscheinlich immer eine gewisse Gefahr im Hinblick auf unerwünschte Nebenwirkungen mit sich führen, werden hochsensitive, spezifische und leicht anzuwendende Marker für das prädiabetische Stadium benötigt, wenn solch eine Behandlung eine akzeptable Alternative zur Ersatztherapie mit Insulin werden soll.
Zusätzlich zu der vorbeugenden Behandlung werden Verfahren zur frühen und akkuraten Identifizierung von anfälligen Individuen benötigt. Assays, die Autoantikörper, welche mit einer frühen humoralen Autoimmunität begleitend zur β-Zellzerstörung in Verbindung stehen, sind besonders bevorzugt. Das klassische Verfahren zum Selektieren von Inselzellen-Autoantikörpern ist mittels Immunhistologie unter Verwendung von gefrorenen Bauchspeicheldrüseschnitten. Jedoch zeigten Familienuntersuchungen, dass die β-Zellen cytoplasmatischen Antikörper (ICCA), die nach diesem Verfahren gemessen wurden, keine ausreichende Spezifität aufwiesen, um als ein einzelner Marker für die Anfälligkeit zu dienen. Ferner sind ICCA sehr schwer zu standardisieren und die Interpretation des angefärbten Schnitts unterliegt den Neigungen der Betrachter. Es konnte folglich nicht definiert werden, was eine "positive" Probe darstellt. Genauere Assays können erzielt werden, indem spezifischere Marker eingesetzt werden, entweder allein oder in Kombination mit ICCA. Alternative Marker umfassen 64 k Autoantikörper, Insulin-Autoantikörper und MHC Klasse II DR/DQß Haplotyp.
Assays für die frühe Detektion von humoralen Antworten in IDDM sollte eine rasche und quantitative Messung des speziellen Markers bereitstellen, bevorzugt mittels konventionellen Serumassay-Protokollen wie z. B. Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und/oder Radioimmunoassay (RIA). Solche Assays sollten einen primären β-Zell-Zielantikörper detektieren, der für die humorale Autoimmunität charakteristisch ist, und sollten eine verbesserte Sensitivität und Spezifität im Vergleich mit dem ICCA-Assay bei der Vorhersage von IDDM aufweisen. Insulin und das 64 k β-Zellen-Autoantigen sind zur Zeit die einzigen bekannten potenziellen primären Zielantigene der humoralen Autoimmunität in IDDM, wenn die β-Zellenexpression und Spezifität als Kriterien für solch ein Antigen herangezogen werden. Insulin-Autoantikörper weisen eine Häufigkeit von nur 30–40 % in kleinen Kindern auf, und eine sehr viel niedrigere Häufigkeit in älteren Kindern und Erwachsenen, die IDDM entwickeln. Die 64 k Autoantikörper weisen eine Häufigkeit von etwa 80 % sowohl zum Zeitpunkt des klinischen Ausbruchs als auch in der prädiabetischen Periode auf und es konnte gezeigt werden, dass sie in Familienuntersuchungen einem offenen IDDM mehrere Jahre vorausgehen, und dass sie zusammen mit und manchmal vor, aber nie später als ICCA und IAA nachgewiesen werden. Somit verspricht die Detektion von 64 k Autoantikörpern, ein sinnvoller Ansatz zur frühen Detektion von IDDM darzustellen.
Die Detektion von 64 k Autoantikörper war jedoch schwierig. Das 64 kD Autoantigen wurde bisher nur in der pankreatischen β-Zelle identifiziert, und wurde nicht in ausreichenden Mengen gereinigt, um eine Sequenzierung, Klonierung oder andere Identifizierung zu ermöglichen, die eine großtechnische Herstellung von Reagenzien er möglicht hätten, die für die Detektion oder Therapie erforderlich wären. Aus diesen Gründen wurde die Detektion von 64 k Autoantikörper mittels Immunpräzipitation mit Detergens-Lysaten von Ratten- und Human-Inselzellen durchgeführt. Solche Assays sind teuer, zeitaufwendig und lassen sich nicht leicht an klinische Laborausstattungen anpassen. Daher wären sie nicht geeignet für das weitverbreitete Screenen von humanen Populationen, um Individuen zu identifizieren, die ein Risiko für die Entwicklung von IDDM aufweisen.
Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, die Natur des 64 kD Autoantigens zu identifizieren, so dass große Mengen des Autoantigens oder Analoga davon erhalten werden könnten, für eine Anwendung als Reagenzien bei der Detektion und Therapie von IDDM.
Das 64 kD Autoantigen in pankreatischen β-Zellen wurde ursprünglich als ein Ziel von Autoantikörpern bei IDDM mittels Immunpräzipitationsexperimenten unter Verwendung von Detergens-Lysaten von humanen Inselzellen identifiziert (Baekkeskov et al. (1982) Nature 298: 167–169). Antikörper gegen das 64 kD Autoantigen gehen dem klinischen Ausbruch von IDDM voran und es konnte gezeigt werden, dass sie eine Häufigkeit von etwa 80 % beim klinischen Ausbruch und während der prädiabetischen Periode aufweisen (Baekkeskov et al. (1987) J. Clin. Invest. 79: 926–934; Atkinson et al. (1990) Lancet 335: 1357–1360; und Christie et al. (1988) Diabetologia 31: 597–602). Das 64 kD Protein von Ratten und das 64 kD Protein von Menschen sind hochhomolog im Hinblick auf die autoantigenen Epitope (Christie et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 376–381). Das 64 kD Autoantigen in Langerhans'schen Inselzellen wird in drei unterschiedlichen Formen im Hinblick auf die Hydrophobizität und die Kompartimentalisierung detektiert: eine hydrophile lösliche Form von 65 kD und pI von ungefähr 7,1; eine 64 kD hydrophobe Form, die löslich oder von einer geringen Membranavidität ist und einen pI von ungefähr 6,7 aufweist; und eine hydrophobe, fest in der Membran verankerte Form der gleichen elektrophoretischen Mobilität und pI. Sowohl die membrangebundene als auch die lösliche hydrophobe 64 kD Form liegen als zwei Isoformen vor, α und β, die identische pI und hydrophobe Eigenschaften aufweisen, sich jedoch um ungefähr 1 kD unterscheiden (Baekkeskov et al. (1989) Diabetes 38: 1133–1141). In einer Analyse einer Reihe von Geweben, zu denen nicht das Gehirn gehörte, wurde gefunden, dass das 64 kD Autoantigen β-zellspezifisch ist (Christie et al., supra).
Patienten mit einer seltenen, jedoch schweren neurologischen Erkrankung, Stiff Man Syndrom (SMS), weisen Autoantikörper gegen GABA-ergene Neuronen auf. Die Glu taminsäure-Decarboxylase (GAD), das Enzym, welches GABA aus Glutaminsäure synthetisiert, wurde als das vorwiegende Autoantigen entdeckt (Solimena et al. (1988) N. Engl. J. Med. 318: 1012–1020 und Solimena et al. (1990) N. Engl. J. Med. 322: 1555–1560). Fast alle Patienten, die im Hinblick auf die GABA-ergenen neuronalen Autoantikörper positiv waren, waren auch für Inselzellen-cytoplasmatische Antikörper positiv, was mittels einer Immunfluoreszenz von pankreatischen Schnitten nachgewiesen werden konnte, und ein Drittel litt unter IDDM. Ferner wurden Autoantikörper gegen GABA-ergene Neuronen, die mittels Immuncytochemie nachgewiesen werden können, in 3 von 74 IDDM-Patienten ohne SMS nachgewiesen (Solimena et al. (1988) supra und Solimena et al. (1990) supra). Weitere Untersuchungen berichteten ebenfalls über ein hohes Auftreten von IDDM in SMS-Patienten (Lorish et al. (1989) Mayo Clin. Proc. 64: 629–636). GAD wird in langer Langerhans'schen Inselzellen in hohen Mengen gefunden (Okada et al. (1976) Science 194: 620–622). Innerhalb der Inselzelle ist GAD selektiv in den β-Zellen lokalisiert und fehlt in den weiteren drei endokrinen Zelltypen, den α, β und PP-Zellen (Garry et al. (1988) J. Histochem. & Cytochem. 36: 573–580 und Vincent (1983) Neuroendocrinol. 36: 197–204). Während über die biochemischen Eigenschaften von pankreatischer GAD nur wenig bekannt ist, wurde das Hirnprotein teilweise charakterisiert. Im Hirn von Ratten wurde gefunden, dass 60 % des Proteins membrangebunden und 40 % löslich waren, nach Homogenisierung (Chang und Gottlieb (1988) J. Neurosci. 8: 2123–2130). GAD im Hirn besteht aus wenigstens zwei Isomeren, die durch Unterschiede in der elektrophoretischen Mobilität in SDS-Page aufgetrennt werden können. Deren Molekulargewichte wurden mit 59–66 kD angegeben (Chang und Gottlieb, supra). Immunogene Epitope dieser beiden Isoformen sind von Nagetieren zum Menschen hochkonserviert (Legay et al. (1986) J. Neurochem. 46: 1478–1486). Die mRNS der größeren Form wurden kloniert und sequenziert (Kaufmann et al. (1986) Science 232: 1138–1140 und Julien et al. (1990) J. Neurochem. 54: 703–705).
Das Protein wird unter nichtreduzierenden Bedingungen in einer Dimerform detektiert (Legay (1987) J. Neurochem. 48: 1022–1026). Erlander et al. (1991) Neuron 7: 91–100 beschreiben die Klonierung und Sequenzierung sowohl der höheren als auch der niedrigeren Molekulargewichtsformen von Ratten-ZNS-GAD. Cram et al. (1991) beschreiben die partielle Sequenzierung der Gehirn- und Bauchspeicheldrüseformen von humaner GAD und berichten über sieben Aminosäurensubstitutionen innerhalb einer Sequenz von 180 Aminosäuren. Die Sequenz des Gens, das für die höhermolekulare Form von Ratten-ZNS-GAD steht, wird in Julien et al. (1990) J. Neurochem. 34: 703–705 beschrieben. Teile der experimentellen Arbeit, die der vorliegenden Er findung zugrunde liegen, wurden in Baekkeskov et al. (1990) Nature 347: 151–156 beschrieben.
Die EP-A-0543945 (nach dem vorliegenden Prioritätsdatum veröffentlicht) beschreibt die Verwendung von GAD bei der Selektion von mit Diabetes in Verbindung stehenden Autoantikörpern.
Es wird nun ein Verfahren zum Detektieren von Autoantikörpern gegen ein ungefähr 64 kD Autoantigen von β-Zellen der Bauchspeicheldrüsen in Seren bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst: eine Serumprobe wird gereinigtem Liganden für die Autoantikörper mit einer Reinheit von wenigstens 50% w/w ausgesetzt und die spezifische Interaktion zwischen dem gereinigten Liganden und den Autoantikörpern wird detektiert, worin der gereinigte Ligand eine ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon ist, das ein Epitop enthält, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden. Dies stellt ein verbessertes Verfahren für die Diagnose und die Überwachung von diabetischen und prädiabetischen Individuen bereit. Die Autoantikörper reagieren mit einem ungefähr 64 kD Pankreas-β-Zellen-Autoantigen(en) (häufig als 64 kD Autoantigen bezeichnet, jedoch umfasst es eigentlich zwei unterschiedliche Molekulargewichtsformen, wie im folgenden beschrieben). Bevorzugt werden die Verfahren das Vorliegen von Autoantikörpern sowohl gegen eine niedere Molekulargewichtsform von GAD als auch eine höhere Molekulargewichtsform von GAD detektieren, und bevorzugter zwischen dem Vorliegen von Antikörpern, die mit jeder Form reagieren, unterscheiden können.
Im Gegensatz zu früheren Verfahren zum Detektieren von Autoantikörpern gegen das pankreatische Antigen, die im Allgemeinen die Verwendung von lysierten pankreatischen Inselzellen notwendig machten, ermöglicht die Verwendung von einem gereinigten Liganden, der fähig ist, spezifisch an die Autoantikörper zu binden, den Einsatz einer breiten Vielfalt von einfachen Assay-Protokollen, die in der Lage sind, die Autoantikörper selbst in sehr geringen Konzentrationen zu detektieren. Beispielhafte Assay-Protokolle umfassen Festphasenassays, die immobilisierte Liganden einsetzen, die den Autoantikörper fangen können, wobei die Menge an gefangenem Antikörper kompetitiv oder nicht-kompetitiv gemessen werden kann. Beispielhafte kompetitive Assays umfassen Radioimmunassays (RIA) und Enzyme-linked-Immunosorbent-Assays (ELISA), während beispielhafte nicht-kompetitive Assays Sandwich-Assays umfassen. Alternativ können homogene Assay-Protokolle eingesetzt werden, bei denen die Bindung des Autoantikörpers an einen markierten Ligandenkomplex zu einer Modulierung eines Signals des Komplexes führt, d. h. einer Modulierung der Aktivität einer Enzymmarkierung. Ferner sind Enzymassays geeignet, worin die Bestimmung der GAD-Aktivität als direkte Messung der in den Seren vorhandenen Autoantikörper verwendet wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase mit geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon, enthaltend ein Epitop, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden, zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren der Entwicklung von insulinabhängigem Diabetes mellitus, wobei das Verfahren das Verabreichen einer vorbestimmten Dosis von Glutaminsäure-Decarboxylase an einen Patienten umfasst.
Ferner betrifft die Erfindung eine Zubereitung umfassend ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon, das ein Epitop aufweist, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Solch eine Zubereitung kann in Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Diabetes eingesetzt werden, wobei eine vorgewählte Dosis von GAD mit geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon als schützende Menge von gereinigtem Liganden, der fähig ist, wenigstens einen Teil des 64 kD Autoantigens von β-Zellen der Bauchspeicheldrüse nachzuahmen, verabreicht wird. Um eine schützende Immunantwort (d. h. Toleranz gegen das 64 kD Autoantigen) zu induzieren, kann es wünschenswert sein, den Liganden an Immunglobuline oder lymphoide Zellen vor der Verabreichung an den Patienten zu binden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ZNS-GAD mit geringerem Molekulargewicht verwendet werden, um T-Helferzellen, die an der humoralen Antwort beteiligt sind, welche die 64 k Autoantikörper produziert, zu stimulieren und zu isolieren. Die isolierten T-Zellrezeptoren auf diesen Zellen können wiederum einem Patienten als immunpräventive Therapie verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf die beiliegenden Figuren näher erläutert:
1 umfasst ein Fluorogramm-Paar, das nachweist, dass gegen Glutaminsäure-Decarboxylase gerichtete Antikörper und der aus diabetischen Seren erhaltene 64 k Autoantikörper das gleiche Protein in Ratteninselzellen erkennen.
2 ist ein Western-Blot von Immunpräzipitaten aus Rattenhirn und Ratteninselzellen, erhalten durch Reaktion mit 64 k Antikörper positiven Seren und Glutaminsäure-Decarboxylase Antikörper positiven Seren.
3 umfasst zwei Plots, die nachweisen, dass die Glutaminsäure-Decarboxylase Enzymaktivität in Inselzellen- und Gehirnzellenlysaten durch Immunpräzipitierung mit 64 k Antikörper positiven Seren inhibiert wird.
4 ist ein Immunfluoreszenz-Mikrograph, der die Gegenwart von Glutaminsäure-Decarboxylase in pankreatischen β-Inselzellen von Ratten nachweist.
5 umfasst eine zweidimensionale Gel-Elektrophorese des 64 kD Autoantigens in Rattenhirn und Inselzellen und ein Western-Blot von löslicher und teilchenförmiger Glutaminsäure-Decarboxylase aus Rattenhirn und Inselzellen vor und nach Trypsin-Verdau.
6 zeigt einen Western-Blot von neonatalem Rattenhirn und Inselzellen, wobei Glutaminsäure-Decarboxylase Antikörper positive Seren und diabetische Seren als Sonden verwendet wurden.
7 umfasst Mikrographen, die mit dem gleichen Serum angefärbte Nervenenden darstellen, was die Identität von Glutaminsäure-Decarboxylase und dem 64 kD Autoantigen aufzeigt.
8 ist ein Diagramm, das das Muster der Autoantikörperreaktivität mit der höheren und der niedrigeren Molekulargewichtsform von GAD in diabetischen Patienten, prädiabetischen Patienten, Patienten, die unter dem Stiff Man-Syndrom leiden, und Kontrollen darstellt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf unserer Entdeckung, dass das 64 kD Autoantigen von pankreatischen β-Zellen (welche die Insulin-sekretierenden Zellen der Langerhans'schen Inselzellen darstellen) der Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) entspricht (E.C. 4.1.1.15), die ein reichlich vorhandenes Protein von GABA-sekretierenden Neuronen im zentralen Nervensystem (ZNS) darstellt. Insbesondere wurde entdeckt, dass die pankreatischen Formen von GAD mit den ZNS-Formen von GAD im wesentlichen identisch und mit diesen immunologisch kreuzreaktiv sind (wie im folgenden ausführlich beschrieben), was die Verwendung von Reagenzien ermöglicht, die ZNS-GAD oder Teile davon enthalten, für die Detektion von Autoantikörpern gegen das 64 kD Autoantigen (im folgenden als 64 k Autoantikörper bezeichnet), die mit dem insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) in Verbindung gebracht worden sind, wie in der vorliegenden Beschreibung vorstehend ausführlich dargestellt. Folglich stehen zum ersten Mal gereinigte Reagenzien zur Verfügung, die für konventionelle Seren-Screening-Assays geeignet sind, so dass große Populationen auf Diabetes und prädiabetischen Status in effizienter und kostengünstiger Art und Weise gescreent werden können.
ZNS-GAD und pankreatische GAD werden in wenigstens zwei unterschiedlichen Molekulargewichtsformen gefunden, einschließlich einer kleineren Form, die in der Literatur (für ZNS-GAD) mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 59 – 65 kD beschrieben worden ist und eine größere Form, deren Molekulargewicht im Bereich von etwa 63 – 67 kD beschrieben worden ist. Siehe Kaufman et al. (1986) Science 232: 1138–1140 und Chang und Gottlieb (1988) J. Neurosci. 8: 2123–2130. Die niedrigere Molekulargewichtsform sowohl der pankreatischen als auch der ZNS-GAD können mittels GAD-6 Antikörper erkannt werden, wie in Chang und Gottlieb (1988), supra beschrieben. Pankreatische GAD, d. h. das 64 kD pankreatische Antigen, liegt als Protein-Duplett vor, mit einer elektrophoretischen Mobilität ähnlich zu den Isoformen von Hirn-GAD (6). Siehe Baekkeskov et al. (1989) Diabetes 38: 1133–1141. Gereinigte Zusammensetzungen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können von der niederen oder beiden Molekulargewichtsformen des ZNS erhalten oder abgeleitet werden. Ferner sind die Formen von GAD unter den Arten hochkonserviert, und gereinigte Liganden, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können, können auf nicht-humanen, wie auch humanen Formen von GAD, wie z. B. Ratten, Katzen oder weiteren Formen, die vorstehend charakterisiert worden sind, beruhen.
Weitere ausführliche Charakteristiken der niedrigeren Molekulargewichtsform und der höheren Molekulargewichtsform von pankreatischer GAD werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung im experimentellen Abschnitt ausführlich dargestellt. Natürliche GAD, die aus tierischen Quellen isoliert worden ist, ist in größerer Menge nur aus ZNS-Zellen erhältlich.
Die Daten im experimentellen Abschnitt zeigen ferner, dass rekombinant hergestellte Ratten-GAD zum Detektieren der 64 k Autoantikörper in Menschen geeignet ist. Somit scheint die tierische Quelle der GAD, die in diesen Assays eingesetzt worden, ist, nicht entscheidend zu sein. Die Molekulargewichtsform der GAD, die zur Detektion der Autoantikörper eingesetzt wird, ist jedoch ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, wie im folgenden noch ausführlich beschrieben.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwenden gereinigten Liganden für die 64 k Autoantikörper für die Detektion solcher Autoantikörper in Serumproben. Der gereinigte Ligand wird üblicherweise eine isolierte Form von ZNS-GAD oder einer rekombinant-hergestellte Form von ZNS-GAD darstellen, kann jedoch auch ein GAD-Fragment oder ein anderes Peptid darstellen, das eine epitope Bindungsstelle definiert, die fähig ist, spezifisch an die 64 k Autoantikörper zu binden. Es ist zu würdigen, dass die Kenntnis der DNS-Sequenz des GAD-Gens wie auch der Aminosäuresequenz von GAD die Identifizierung und Herstellung einer Vielfalt von synthetischen Peptidzusammensetzungen ermöglichen, die als gereinigter Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Der gereinigte Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung kann natürlich sein, d. h. intakte ZNS-GAD oder Fragmente davon, oder aus geeigneten Quellen isoliert sein, d. h. humane oder nicht-humane ZNS-Zellen. Verfahren für solch eine Isolierung sind in Oertel et al. (1980) Brain Res. Bull. Vol. 5, Suppl. 2, Seiten 713–719; Oertel et al. (1981) J. Neurosci. 6: 2689–2700; und Chang und Gottlieb (1988) J. Neurosci. 8: 2123–2130 beschrieben.
Natürliche Polypeptide können mittels konventionellen Techniken wie z. B. Affinitätschromatographie isoliert werden. Geeigneterweise können polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen zuvor gereinigte GAD gezüchtet und verwendet werden, um eine geeignete Affinitätssäule nach wohlbekannten Techniken herzustellen. Solche Techniken werden z. B. in Hudson und Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, United Kingdom, 1980, Kapitel 8 gelehrt. Üblicherweise erhält man eine intakte Form von GAD nach solchen Isolierungstechniken. Wenn Peptidfragmente erwünscht sind, so können diese durch chemische oder enzymatische Spaltung des intakten Moleküls erhalten werden.
Als Alternative zur Isolierung von intakter GAD aus natürlichen Quellen wird es möglich sein, synthetische Proteine und Polypeptide herzustellen, die auf den Sequenzen von wenigstens der niederen und gegebenenfalls auch der höheren der beiden Molekulargewichtsformen von ZNS-GAD beruhen. Peptidsequenzen von der niedrigeren Molekulargewichtsform von ZNS-GAD werden in Chang und Gottlieb (1988) supra beschrieben. Die Nukleinsäuresequenzen der niedrigeren Molekulargewichtsform von ZNS-GAD kann mittels konventionellen Techniken erhalten werden, wobei eine Nuk leinsäuresonde auf der Basis der DNS-Sequenz der höheren Molekulargewichtsform von ZNS-GAD eingesetzt werden kann, die in Julien et al. (1990) J. Neurochem. 54: 703–705 beschrieben ist. Alternativ dazu können cDNS-Expressions-Bibliotheken auf eine gewünschte Form von GAD gescreent werden, wobei α-GAD Antikörper eingesetzt werden, die zur Verfügung stehen oder wie im folgenden beschrieben hergestellt werden können.
Die Klonierung und Expression der beiden Molekulargewichtsformen von Ratten-ZNS-GAD sind in Erlander et al. (1991) Neuron 7: 91–100 beschrieben, worin offenbart wird, dass die beiden Formen durch unterschiedliche Gene codiert werden. Die Klonierung und Expression der höheren Molekulargewichtsform von pankreatischer Ratten-GAD wird im folgenden im experimentellen Abschnitt beschrieben.
Synthetische Proteine und Polypeptide können nach jedem der zwei allgemeinen Ansätze hergestellt werden. Erstens können Polypeptide mit bis zu etwa 150 Aminosäuren, üblicherweise mit weniger als etwa 100 Aminosäuren und noch üblicher mit weniger als etwa 75 Aminosäuren nach dem wohlbekannten Festphasen-Syntheseverfahren nach Merrifield synthetisiert werden, bei dem Aminosäuren sequenziell zu einer wachsenden Kette zugegeben werden. Siehe Merriefield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156. Die Apparate zur automatischen Synthese solcher Polypeptide unter Verwendung der Festphasenmethodologie sind nun von einer Reihe von Unternehmen kommerziell erhältlich, wie z. B. Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien.
Das zweite und bevorzugte Verfahren zum Synthetisieren von Proteinen und Polypeptiden im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst die Expression in kultivierten Säugerzellen von rekombinanten DNS-Molekülen, die das gewünschte GAD-Gen oder einen Teil davon codieren. Die Verwendung von Säugerexpressionssystemen wie z. B. chinesischen Hamstereizellen (Chinese hamster ovary cells, CHO), kann eine post-translationale Modifikation der Proteine und Polypeptide ermöglichen, was die immunologische Ähnlichkeit der synthetischen Produkte mit den nativen Formen von GAD erhöht. Das GAD-Gen selbst kann natürlich oder synthetisch sein, wobei das natürliche Gen aus cDNS oder genomischen Bibliotheken erhältlich ist, unter Verwendung von degenerierten Sonden auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz, dargestellt in Julien et al., supra. Alternativ dazu können Polynukleotide auf der Grundlage der beschriebenen DNS-Sequenz mittels wohlbekannter Techniken synthetisiert werden. Zum Beispiel können Einzelstrang-DNS-Fragmente nach dem Phosphoramidit-Verfahren hergestellt werden, das von Beaucage und Carruthers (1981) Tett. Letters 22: 1859–1862 beschrieben worden ist. Ein Doppelstrangfrag ment kann anschließend durch Synthese des komplementären Strangs und Verbindung (annealing) der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Zugabe des komplementären Strangs unter Verwendung einer DNS-Polymerase mit einer geeigneten Primer-Sequenz erhalten werden.
Die natürlichen oder synthetischen DNS-Fragmente, die für das gewünschte GAD-Protein oder Fragment davon codieren, werden anschließend in DNS-Konstrukte inkorporiert, die fähig sind, in eine in vitro Säugerzellkultur eingeführt und exprimiert zu werden. Im allgemeinen sind die DNS-Konstrukte in der Lage, in prokaryotischen Wirten zu replizieren, um die anfängliche Manipulation und Multiplikation des Konstruktes zu erleichtern. Nachdem eine ausreichende Menge des Konstruktes erhalten worden ist, werden sie eingeführt und im allgemeinen in das Genom der kultivierten Säugerzelllinien oder weiteren eukaryotischen Zelllinien integriert.
DNS-Konstrukte, die für eine Einführung in Bakterien oder Hefe geeignet sind, umfassen ein Replikationssystem, das durch den Wirt erkannt wird, das GAD-DNS-Fragment, das das gewünschte Protein oder Polypeptidprodukt codiert, transkriptionelle oder translationelle Initiations- und Regulationssequenzen, die am 5'-Ende der strukturellen DNS-Sequenz angebracht sind, und transkriptionelle und translationelle Terminierungsregulationssequenzen, die an dem 3'-Ende der strukturellen Sequenz angebracht sind. Die transkriptionellen Regulationssequenzen werden einen heterologen Promotor umfassen, der durch den Wirt erkannt wird.
Geeigneterweise können erhältliche Klonierungsvektoren, die das Replikationssystem und transkriptionelle und translationelle Regulationssequenzen zusammen mit einer Insertionsstelle für die GAD-DNS-Sequenz enthalten, eingesetzt werden. Für die Transformation von Säugerzelllinien und anderen eukaryotischen Zelllinien kann eine Co-Transfektion der Zelllinien in Gegenwart eines geeigneten Markers wie z. B. dem DHFR-Gen vorgenommen werden. Die Transfektion kann auch unter Verwendung von chemischen oder elektroporetischen Techniken durchgeführt werden.
Die Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung werden in im wesentlichen reiner Form verwendet werden, d. h. wenigstens etwa 50 % w/w (Gewicht/Gewicht) Reinheit, wie auch im allgemeinen im wesentlichen ohne interferierende Proteine und Verunreinigungen. Bevorzugt werden die Liganden in einer Reinheit von etwa wenigstens 80 % w/w isoliert oder synthetisiert, und noch bevorzugter in einer wenigstens etwa 95 % w/w Reinheit. Bei Verwendung von konventionellen Proteinreinigungstechniken können homogene Peptide mit einer Reinheit von wenigstens 99 % w/w erhalten werden. Zum Beispiel können die Proteine durch Verwendung von Antikörpern, die für die GAD-Polypeptide spezifisch sind, unter Anwendung einer Immunoadsorbent-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Solch eine Affinitätschromatographie wird durchgeführt, indem die Antikörper zuerst an einen Festphasenträger gebunden werden und anschließend werden die gebundenen Antikörper mit der Quelle der Ligandenpolypeptide in Kontakt gebracht, d. h. Lysaten von ZNS-Zellen oder Zellen, die rekombinant modifiziert worden sind, um GAD zu produzieren, oder Überstände von Zellen, die rekombinant modifiziert worden sind, um bei der Kultivierung GAD zu sekretieren.
Für eine Anwendung bei der Reinigung können die Antikörper gegen GAD erhalten werden, indem GAD oder GAD-Fragmente in eine breite Vielfalt von Wirbeltieren in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken injiziert werden. Geeignete Wirbeltiere umfassen Mäuse, Ratten, Schafe und Ziegen. Im allgemeinen werden den Tieren periodisch Blut entnommen, wobei nachfolgende Blutentnahmen einen verbesserten Titer und verbesserte Spezifität aufweisen. Die Antigene können intramuskulär, intraperitoneal oder subkutan injiziert werden. Im allgemeinen werden Vehikel eingesetzt wie z. B. ein vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans. Bevorzugt können monoklonale Antikörper nach wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Insbesondere monoklonale Fab-Fragmente können in E. coli nach dem Verfahren von Huse et al. (1989) Science 246: 1275–1281 hergestellt werden.
Die Assays gemäß der vorliegenden Erfindung können das Vorliegen von Autoantikörpern gegen wenigstens eine der beiden Molekulargewichtsformen von GAD in Patientenseren detektieren, und können bevorzugt beide Formen detektieren. Es wurde gefunden (wie in dem folgenden experimentellen Abschnitt in der vorliegenden Anmeldung beschrieben), dass die diabetischen und prädiabetischen Patienten im allgemeinen Autoantikörper gegen beide Molekulargewichtsformen von GAD aufweisen, in einigen Fällen jedoch nur Antikörper gegen entweder die höhere Molekulargewichtsform oder die niedrigere Molekulargewichtsform. Daher ist das bevorzugte Assay gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage, das Vorliegen von Antikörpern, die gegenüber irgendeiner der Molekulargewichtsform von GAD reaktiv sind, selbst in Abwesenheit von Antikörpern gegen die andere Molekulargewichtsform zu detektieren.
Noch bevorzugter werden die Assays gemäß der vorliegenden Erfindung fähig sein, das Vorliegen von Autoantikörpern gegen jede der beiden Molekulargewichtsformen von GAD getrennt voneinander zu detektieren. Es wird angenommen, dass das Mus ter der vorliegenden Antikörper (d. h. nur gegen die GAD mit höherem Molekulargewicht, nur gegen GAD mit geringerem Molekulargewicht oder gegen beide Molekulargewichtsformen von GAD) ein signifikanter diagnostischer Indikator für den Erkrankungszustand darstellt.
Die Assays für die getrennte Detektion von Antikörpern gegen GAD mit höherem Molekulargewicht und gegen GAD mit geringerem Molekulargewicht können geeigneterweise durch separate Reaktion der Patientenseren mit jeder Form von GAD durchgeführt werden, worin die andere Form im wesentlichen nicht vorliegt. Die Verwendung von rekombinant hergestellter GAD (oder GAD-Fragmenten oder Analoga) ist besonders geeignet zur Durchführung von separaten Detektionen, da die derart hergestellte GAD im wesentlichen frei von der anderen Molekulargewichtsform ist.
In vielen Fällen ist es jedoch nach wie vor erwünscht, Patientenseren für das Vorliegen von beiden Molekulargewichtsformen von GAD simultan zu untersuchen. Ein negatives Ergebnis (d. h. keine Reaktion) wird anzeigen, dass der Patient weder diabetisch noch prädiabetisch ist. Ein positives Ergebnis wird anzeigen, dass der Patient diabetisch oder prädiabetisch ist. Die Patientenseren können anschließend, sofern erwünscht, weiter im Hinblick auf das Vorliegen von jedem Autoantikörper separat untersucht werden. Simultanes Screenen kann einfach durchgeführt werden, indem entweder Kombinationen der beiden Molekulargewichtsformen von GAD, die aus tierischen Quellen zusammen isoliert worden sind, verwendet werden, oder durch Kombinieren von separat hergestellten rekombinanten GAD jeder Molekulargewichtsform.
Assays gemäß der vorliegenden Erfindung beruhen im allgemeinen auf der Aussetzung des gereinigten Liganden bzw. der gereinigten Liganden gegenüber einer Serumprobe und Detektieren einer spezifischen Bindung zwischen dem Liganden und Autoantikörpern für das 64 kD pankreatische β-Zellen Autoantigen, das in dem Serum vorliegen kann. Eine Bindung zwischen den Autoantikörpern und gereinigten Liganden zeigt an, dass die Autoantikörper vorliegen und ist für einen diabetischen oder prädiabetischen Zustand des Patienten diagnostisch. Alternativ dazu können solche Assays verwendet werden, um den Zustand eines Patienten zu überwachen, der eine Transplantation von pankreatischen Inselzellen erhalten hat, wobei das Vorliegen der 64 k Autoantikörper eine unerwünschte Immunantwort gegen die transplantierten Zellen anzeigt. Das spezifische gewählte Assay-Protokoll ist nicht entscheidend, und es ist nur notwendig, dass der Assay ausreichend sensitiv ist, um einen Schwellenwert der Autoantigene zu detektieren, der als positiv erachtet wird.
Assays gemäß der vorliegenden Erfindung werden zur Identifizierung von Patienten geeignet sein, die entweder prädiabetisch sind, d. h. zirkulierende Autoantikörper gegen das 64 kD Autoantigen aufweisen, jedoch noch nicht unter einem ausreichenden Schaden der Insulin-produzierenden β-Zellen gelitten haben, um klinisch als Träger von IDDM identifiziert zu werden, oder unter klinischem IDDM leiden. Diese Assays können ferner zur Überwachung der Wirkung einer Immuntherapie (wie im Rahmen der vorliegenden Anmeldung im Folgenden beschrieben) dienen, um Autoimmunreaktionen gegen β-Zellen zu blockieren oder zu verhindern, und zur Überwachung des Fortschreitens der Erkrankung von Prädiabetes zu klinischem Diabetes dienen und werden besonders geeignet sein für eine Überwachung des Status von transplantierten pankreatischen β-Zellen in diabetischen Patienten, die eine Inselzellentransplantation erhalten haben.
Geeignete Assays umfassen sowohl Festphasen-Protokolle (heterogen) als auch Nichtfestphasen-Protokolle (homogen). Die Assays können in kompetitiven oder nicht-kompetitiven Formaten durchgeführt werden, und eine breite Vielfalt von Markern können eingesetzt werden wie z. B. Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Mittel, chemilumineszierende Mittel, Spin-Markierungen und ähnliches. Ein Großteil der geeigneten Assays basieren auf heterogenen Protokollen, worin der Ligand an eine feste Phase gebunden wird, die eingesetzt wird, um den Ligand-Autoantikörper-Komplex zu trennen, der sich bildet, wenn ein Antikörper in der Serumprobe vorliegt. Ein besonderer Vorteil der Verwendung eines gereinigten Liganden liegt darin, dass er die Herstellung einer festen Phase zur Verwendung in dem Assay erleichtert. Das heißt, der Ligand kann geeigneterweise auf einer Vielzahl von festen Phasen immobilisiert werden wie z. B. Dipsticks, partikulären Teilchen, Mikrosphären, magnetischen Teilchen, Teströhrchen und Mikrotiter-Wells.
Die feste Phase wird der Serumprobe ausgesetzt, so dass der gegebenenfalls vorliegende Autoantikörper durch den Liganden gefangen wird. Wenn die feste Phase aus der Serumprobe entfernt wird, können die gefangenen Autoantikörper von nicht-gebundenen Autoantikörpern und weiteren Verunreinigungen in der Serumprobe entfernt werden. Der gefangene Autoantikörper kann anschließend detektiert werden, indem die nicht-kompetitive "Sandwich-Technik" eingesetzt wird, bei der der markierte Ligand für den Autoantikörper der gewaschenen Festphase ausgesetzt wird. Alternativ dazu beruhen kompetitive Formate auf der vorherigen Einführung von löslichen, markierten Autoantikörpern gegen die Serumprobe, so dass markierte und nicht-markierte Formen für die Bindung an die feste Phase miteinander konkurrieren. Solche Assay-Techniken sind wohlbekannt und sowohl in der Patentliteratur als auch in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Beispielhafte Immunoassays, die für die Detektion der Autoantikörper in Seren geeignet sind, umfassen jene, die in den US-Patenten 3,791,932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074 und 4,098,876 beschrieben sind.
Besonders bevorzugt sind sensitive Enzym-linked-Immunosorbent-Assays (ELISA-Verfahren), die ausführlich in den US-Patenten Nr. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,879,262 und 4,034,074 beschrieben sind. Solche ELISA-Assays ermöglichen die Messung von sehr geringen Titern der Autoantikörper.
Gemäß der bevorzugten ELISA-Technik wird der gereinigte Ligand entweder kovalent oder nicht-kovalent an eine feste Oberfläche gebunden. Die feste Oberfläche wird der Serumprobe ausgesetzt, wobei Autoantikörper, die in der Probe vorliegen, gefangen und gebunden werden. Im allgemeinen liegt der Ligand auf der festen Phase in einem Überschuss vor, so dass die gesamte Menge an Autoantikörper gebunden werden kann. Nach Abtrennung der festen Phase und Waschen von deren Oberfläche kann die feste Phase markierten Reagenzien ausgesetzt werden, die fähig sind, spezifisch an die gefangenen Autoantikörper zu binden. Das markierte Reagenz kann entweder gereinigter Ligand oder ein anderer Ligand sein, der fähig ist, an den Autoantikörper zu binden, wie z. B. markierte Anti-Humanantikörper. Auf diese Art und Weise wird eine Markierung an die feste Phase nur gebunden, wenn Autoantikörper in der Serumprobe vorlag. Die Enzymmarkierungen können nach konventionellen Visualisierungstechniken detektiert werden, z. B. Herstellung eines farbigen Farbstoffs, Chemilumineszenz, Fluoreszenz.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform umfasst Radioimmunassays (RIA), die unter Verwendung einer festen Phase durchgeführt werden, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wird. Die feste Phase wird der Serumprobe in Gegenwart von radioaktiv-markierten Autoantikörpern ausgesetzt, die um eine Bindung an dem immobilisierten Liganden konkurrieren. Auf diesem Weg ist die Menge an radioaktiver Markierung, die an die feste Phase gebunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge an Autoantikörpern, die anfänglich in der Serumprobe vorhanden waren. Nach Abtrennung der festen Phase kann eine nicht-spezifisch gebundene radioaktive Markierung durch Waschen entfernt werden und die Menge an radioaktiver Markierung, die an die feste Phase gebunden ist, kann bestimmt werden. Die Menge an gebundener radioaktiver Markierung wiederum kann mit der Menge an Autoantikörpern, die anfänglich in der Probe vorlagen, in Zusammenhang gebracht werden.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen konventionellen immunologischen Assay-Protokollen kann das Vorliegen des 64 k Autoantikörpers in Seren auch durch Messen des Effekts des Autoantikörpers auf die Enzymaktivität der niedrig-molekularen ZNS-GAD oder pankreatischen GAD, die in eine Probe der Seren eingeführt wurden, detektiert werden. Solche direkten Enzym-Assays können auf dem Verfahren beruhen, das von Albers und Brady (1959) J. Biol. Chem. 234: 926–928 beschrieben worden ist. Eine ausführliche Beschreibung einer geeigneten Technik wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung mit Bezug auf 3 in dem experimentellen Abschnitt dargestellt, worin Interaktionen zwischen den Autoantikörpern und der GAD auf der Basis des Verlustes an Enzymaktivität detektiert wird.
Der gereinigte Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung kann als Komponente von pharmazeutischen Zubereitungen eingeführt werden, die dazu dienen können, die Zerstörung von pankreatischen β-Zellen, die mit dem Ausbruch von insulinabhängigem Diabetes mellitus assoziiert ist, zu schwächen, zu inhibieren oder zu verhindern. Die Zubereitungen sollten eine therapeutische oder prophylaktische Menge wenigstens eines gereinigten Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Bei dem pharmazeutischen Träger kann es sich um jede kompatible, nicht-toxische Substanz handeln, die fähig ist, die Polypeptide an den Patienten zu transportieren. Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können als Träger eingesetzt werden. Pharmazeutisch verträgliche Adjuvans, Puffermittel, Dispersionsmittel und ähnliches können ebenfalls in pharmazeutische Zubereitungen inkorporiert werden. Solche Zubereitungen können ein einzelnes Polypeptid oder können zwei oder mehrere Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung in Form eines "Cocktails" enthalten.
Die vorliegenden Erfinder gehen zur Zeit davon aus, dass die Zerstörung von pankreatischen β-Zellen in IDDM eine zelluläre Autoimmunantwort darstellt. Daher sollten die pharmazeutischen Zubereitungen geeignet sein, eine solche Antwort zu inhibieren. Insbesondere kann es wünschenswert sein, die gereinigten Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung an Immunglobuline zu koppeln, d. h. IgG oder an lymphoide Zellen aus dem Patienten, der behandelt wird, um die Toleranz zu fördern. Solch ein Ansatz wird in Bradley-Mullen, Activation of Distinct Subsets of T Suppressor Cells with Type III Pneumococcal Polysaccharide Coupled to Syngeneic Spleen Cells, in: Immunological tolerance to self and non-self, Buttisto et al., eds., Annals N.Y. Acad. Sci., Vol. 392, Seiten 156–166, 1982 beschrieben. Alternativ dazu können die Peptide modifiziert werden, um die Bindung an den MHC beizubehalten oder zu verstärken, während die Bindung an den assoziierten T-Zellrezeptor reduziert oder eliminiert wird. Auf diesem Weg können die modifizierten GAD-Peptide mit natürlicher GAD konkurrieren, um die Helfer-T-Zellaktivierung und somit die Immunantwort zu inhibieren. In all diesen Fällen sollte beachtet werden, dass die Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung nicht die Autoimmunantwort verstärkt.
Die vorstehend beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen sind für eine parenterale Verabreichung geeignet. Bevorzugt werden die Zubereitungen parenteral verabreicht, d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die vorliegende Erfindung stellt somit Zubereitungen für eine parenterale Verabreichung an einen Patienten bereit, wobei die Zubereitungen eine Lösung oder Dispersion der Polypeptide in einem verträglichen Träger umfasst, wie vorstehend beschrieben. Die Konzentration des Proteins oder Polypeptids in der pharmazeutischen Zubereitung kann stark variieren, d. h. von weniger als etwa 0,1 Gew.-%, wobei es im allgemeinen wenigstens 1 Gew.-% bis zu 20 Gew.-% oder mehr beträgt. Typische pharmazeutische Zubereitungen für eine intramuskuläre Injektion können so hergestellt werden, dass sie beispielsweise 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 1–100 μg des gereinigten Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Eine typische Zubereitung für eine intravenöse Infusion kann derart hergestellt werden, dass sie 100 – 500 ml sterile Ringersche Lösung und 100 – 500 mg des gereinigten Liganden enthält. Aktuelle Methoden zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Zubereitungen sind im Stand der Technik wohlbekannt und ausführlich in verschiedenen Quellen beschrieben, einschließlich z. B. Remington's Pharmaceutical Science, 15te Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).
Die pharmazeutischen Polypeptidzubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung können für eine prophylaktische Behandlung von prädiabetischen Individuen verabreicht werden, die durch die Assay-Methoden gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert worden sind, oder für eine therapeutische Behandlung von Individuen verabreicht werden, die unter insulinabhängigem Diabetes mellitus leiden, jedoch eine substanzielle Restmasse von pankreatischen β-Zellen aufweisen. Für therapeutische Anwendungen werden die pharmazeutischen Zubereitungen einem Patienten verabreicht, der unter festgestelltem Diabetes leidet, in einer Menge, die ausreicht, um eine weitere β-Zellzerstörung zu inhibieren oder zu verhindern. Für Individuen, die gegenüber Diabetes anfällig sind, werden die pharmazeutischen Zubereitungen prophylaktisch in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Immunzerstörung der β-Zellen entweder zu verhindern oder zu inhibieren. Eine adäquate Menge, um dies zu erreichen, wird als eine "therapeutisch-wirksame Dosis" bezeichnet. Solche eine wirksame Dosis hängt von der Schwere der Autoimmunantwort und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab, und liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 1 – 500 mg gereinigtem Ligand pro Kilogramm Körpergewicht, wobei Dosierungen von etwa 5 – 25 mg pro Kilogramm häufiger eingesetzt werden.
Die therapeutischen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung in den vorstehend beschriebenen Mengen und unter den vorstehend angegebenen Verhältnissen.
Zusätzlich zu der Verwendung der GAD-Peptide direkt in pharmazeutischen Zubereitungen ist es auch möglich, die GAD-Peptide einzusetzen, um die Toleranz gegenüber dem 64 k Autoantigen in diabetischen und prädiabetischen Individuen zu verstärken. Periphere Blutlymphozyten werden von dem Individuum auf konventionelle Art gesammelt und durch Aussetzung gegenüber dem GAD-Peptid oder einem äquivalenten Liganden stimuliert, wie vorstehend beschrieben. Im allgemeinen werden weitere Mitogene und Wachstumsverstärker vorliegen, z. B. Phytohämagglutinin, oder Interleukin 2. Proliferierende T-Helferzellen können isoliert und geklont werden, ebenfalls unter der Stimulierung von GAD-Peptid. Klone, die mit der Proliferation fortfahren, können anschließend eingesetzt werden, um therapeutische Zubereitungen für das Individuum herzustellen. Die klonierten T-Zellen können geschwächt werden, z. B. durch Aussetzung gegenüber Strahlung, und dem Wirt verabreicht werden, um die Toleranz zu induzieren. Alternativ dazu kann der T-Zellrezeptor oder Teile davon mittels konventionellen Proteinreinigungsverfahren von den klonierten T-Zellen isoliert und an das Individuum verabreicht werden. Solche Immuntherapieverfahren werden allgemein in Sinha et al. (1990) Science 248: 1380–1388 beschrieben.
In einigen Fällen kann es nach der wie vorstehend beschriebenen Klonierung der T-Helferzelle möglich sein, therapeutische Peptide aus dem T-Zellrezeptor zu entwickeln, wobei die Peptide für eine Behandlung einer Population von diabetischen und/oder prädiabetischen Individuen günstig sein würden. In solchen Fällen kann das T-Zellrezeptor-Gen nach konventionellen Techniken isoliert und kloniert werden und Peptide auf der Basis des Rezeptors können mittels rekombinanter Techniken wie vorstehend beschrieben, produziert werden. Die rekombinant hergestellten Peptide können anschließend wie vorstehend beschrieben in pharmazeutische Zubereitungen eingeführt werden.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Darstellung bereitgestellt, ohne beschränkend zu wirken.
EXPERIMENTE
Antikörper gegen GAD immunpräzipitieren das 64 kD Autoantigen aus Inselzellen Wir untersuchten zunächst, ob das Serum S3, ein Schafantiserum, das gegen gereinigte Rattenhirn-GAD gezüchtet wurde (Oertel et al. (1980), Brain Res. Bull. 5 (Suppl 2): 713–179), und Seren von Patienten mit dem Stiff Man-Syndrom (SMS), die positiv auf GAD-Antikörper waren (Solimena et al. (1988) supra und Solimena et al. (1990) supra), das 64 kD Autoantigen aus Ratteninselzellen immunpräzipitieren konnten. Für diesen Zweck verwendeten wir ³⁵S-Methionin-markierte Ratteninselzellfraktionen, die partiell mit dem 64 kD Antigen angereichert waren (S-100 DP, 1). Die GAD-Antikörper positiven Seren immunpräzipitierten ein Duplett von ³⁵S-Methionin-markierten Proteinen, die auf SDS-PAGE eine identische Mobilität wie das 64 kD α/β Autoantigen aufwiesen, das durch IDDM Seren immunpräzipitiert wurde (1A, Bahnen 2–9).
Um eine mögliche gemeinsame Identität der Proteine festzustellen, die durch 64 kD Antikörper positive Seren und durch GAD-Antikörper positive Seren erkannt werden, wurden Überstände, die aus der Immunpräzipitierung mit GAD-Antikörper positiven Seren erhalten wurden, nacheinander mit 64 kD Antikörper positiven IDDM-Seren erneut präzipitiert. Ähnlich dazu wurden Überstände, die aus der Immunpräzipitierung mit 64 kD Antikörper positiven IDDM-Seren resultierten, mit GAD-Antikörper positiven Seren erneut präzipitiert. Die Ergebnisse aus diesen Experimenten zeigten, dass die GAD-Antikörper positiven Seren und die 64 kD Antikörper positiven Seren jeweils quantitativ das Protein, das durch die anderen Gruppen von Seren erkannt wurde, entfernten, was eine vollständige Kreuzreaktivität zwischen GAD und 64 kD Antikörper positiven Seren nachwies, und stark darauf hindeutet, dass das 64 kD Protein die GAD in Ratteninselzellen darstellt (1A, Bahnen 10–20).
Ein Trypsin-Verdau von ³⁵S-Methionin-markierten Inselzellextrakten, gefolgt von einer Immunpräzipitierung, zeigte, dass ein 55 kD immunreaktives Fragment sowohl aus dem 64 kD Protein als auch aus GAD gebildet wurde, was ihre gemeinsame Identität weiter unter Beweis stellte (1B). Ferner zeigten 2D-Analysen von CAD, die aus ³⁵S-Methionin-markierten Inselzellen mit dem S3-Antiserum immunpräzipitiert worden war, ein identisches Muster zu dem für das 64 kD Protein beschriebene auf (Baekkeskov et al. (1989) supra) (Ergebnisse nicht dargestellt). Dieses Muster war auch identisch zu dem 2D-Muster von pankreatischer und Hirn-GAD, wie durch Western-Blots von 2D-Gels mit dem S3-Serum dargestellt (siehe 5A).
1A ist ein Fluorogramm eines SDS-PAGE, das die Immunpräzipitierung von Triton X-114 Detergensphasen-gereinigten löslichen Fraktionen von ³⁵S-Methionin-markierten Ratteninselzellen (S-100 DP) mit GAD-Antikörper positiven Seren, 64 kD Antikörper positiven IDDM-Seren und Kontrollseren zeigt. Bahnen 2–9, Proben aus einer einzigen Immunpräzipitierung mit Seren, die am Kopf jeder Bahn angegeben sind; Bahnen 10 – 20, Proben aus einer zweiten Immunpräzipitierung von Überständen, die nach der ersten Immunpräzipitierung vorlagen. Die Seren, die für die erste und zweite Immunpräzipitierung eingesetzt wurden, sind am Kopf jeder Bahn angegeben. Seren, die für die Immunpräzipitierung verwendet wurden, sind am Kopf jeder Bahn angegeben. Die für die Immunpräzipitierungen eingesetzten Seren waren die folgenden: C, Seren von gesunden Individuen; SMS, Seren von SMS-Patienten, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie GAD-Antikörper positiv sind (Solimena (1990) supra); 1, Seren von neu diagnostizierten 64 kD Antikörper positiven IDDM-Patienten (Sigurdsson et al. Genetic, Environmental and Autoimmune Etiology. Current Topics in Microbiology and Immunology (eds. Baekkeskov et al.) Vol. 164 Springer, Verlag, Heidelberg, 1990) (die Nummern stehen für den Patientencode); S3, ein Schaf-Antiserum, das gegen gereinigte Rattenhirn-GAD gezüchtet wurde (Oertel et al. (1980) supra). Molekulargewichtsmarker sind in der Bahn 1 dargestellt. Die GAD-Antikörper positiven Seren immunpräzipitierten GAD aus Überständen nach Immunpräzipitierung mit 64 kD Antikörper positiven Seren (Bahnen 11 und 18). Die 64 kD Antikörper positiven Seren immunpräzipitierten das 64 kD Protein aus Überständen nach Immunpräzipitierung mit Kontrollserum (Bahn 16), jedoch nicht aus Überständen nach Immun-präzipitierung mit GAD-Antikörper positiven Seren (Bahnen 13 – 15). Die Dreifachbande steht für die 65 kD Form und 64 kD α- und β-Formen des 64 kD Autoantigens (Baekkeskov et al. (1989) supra). Die SMS-Seren 1, 2 und 3 entsprechen den Patienten #190, 188 und 1 (Solimena et al. (1990) supra).
Die 1B ist ein Fluorgramm, das die Immunpräzipitierung des 64 kD Proteins und GAD aus S-100 DP von ³⁵S-Methionin-markierten Ratteninselzellen vor (Bahnen 2 – 4) und nach (Bahnen 4 – 10) Trypsin-Verdau darstellt. Die Serumcodes sind wie in der Legende für A. NSS ist ein Präimmun-Schafserum. Der Trypsin-Verdau resultiert in einem 55 kD immunreaktiven Fragment, das sowohl von 64 kD Antikörper positiven Seren als auch dem GAD-Antikörper positiven Serum S3 erkannt wird.
Neonatale Ratteninselzellen wurden wie beschrieben isoliert und mit ³⁵S-Methionin markiert (Baekkeskov et al. (1989) supra). Die Inselzellen wurden für 10 Minuten auf Eis geschwollen (swollen) in 10 mM Hepes pH 7,4, 1 mM MgCl₂ und 1 mM EGTA (HME Puffer) und anschließend durch 20 Stöße in einem Glashomogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 2000 g zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen, und der postnukleare Überstand wurde bei 100000 g für eine Stunde zentrifugiert, um eine Cytosolfraktion (S-100) und eine Teilchenfraktion (particulate, P-100) zu erhalten. Aus der 5-100 Fraktion wurden amphophile Proteine gereinigt, durch eine Modifizierung des Verfahrens, das von Bordier, C. (1981) J. Biol. Chem. 256: 1604–1607 für Triton TX-114 Phasentrennung beschrieben worden ist. Kurz gesagt wurde die 5-100 Fraktion in 1 % in TX-114 hergestellt, bei 37°C für 2 Minuten gewärmt, um den TX-114 Phasenübergang zu induzieren, und bei 15000 g für 2 Minuten zentrifugiert, um die wässrige Phase und die Detergensphase zu trennen. Die Detergensphase wurde in 20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl (TBS) verdünnt und wie beschrieben immunpräzipitiert (Baekkeskov et al. (1989) supra) unter Verwendung von DP aus 300 Inselzellen für jedes Immunpräzipitat. Die Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE (10 %) analysiert und für eine Fluorographie vorbereitet (Baekkeskov et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6456–6460). Für den Trypsin-Verdau wurde S-100 DP aus 4000 Inselzellen auf 200 μl 10 mM Hepes, 5 mM EDTA, 5 mM Pyrophosphat, 5 mM Benzamidin/HCl, pH 7,5 verdünnt. Verdautes und nicht-verdautes Material wurden immunpräzipitiert und die Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE (15 %) analysiert. Die dargestellten Molekulargewichtsmarker sind ¹⁴C methylierte β-Phosphorylase (MW 94000 und 100000), Rinderserumalbumin (MW 69000), Ovalbumin (MW 45000) und Carbonatdehydrase (MW 30000). Die 64 kD Antikörper positiven Seren stammten von 3 kürzlich diagnostizierten IDDM-Patienten, die Kontrollseren stammten von 2 gesunden Individuen und die SMS-Seren stammten von 3 GAD Antikörper positiven Individuen (Solimena et al. (1990) supra). Das S3-Antiserum wurde von Dr. I. J. Kopin, NIH, erhalten.
Autoantikörper gegen das 64 kD Protein immunpräzipitieren GAD aus Hirn und Inselzellen Als nächstes analysierten wir, ob 64 kD Antikörper positive Seren GAD aus Rattenhirn und Inselzellen immunpräzipitieren können. Membranfraktionen und lösliche Fraktionen wurden aus dem Hirn und Inselzellen hergestellt und einer Immunpräzipitierung mit Serum S3, GAD Antikörper positiven SMS-Viren, 64 kD Antikörper positiven IDDM-Seren und Kontrollseren unterworfen. Das Vorliegen von GAD in den Immunpräzipitaten wurde mittels Western-Blot analysiert. Die Blots wurden mit Sonden von Serum S3 oder Serum 7673 untersucht, einem Kaninchenserum, das gegen ein synthetisches Peptid mit 17 Aminosäuren, das dem C-Terminus der größeren Rattenhirn-GAD-Isoform entspricht, gezüchtet worden war (Julien et al. (1990) supra). Beide Seren ergaben identische Ergebnisse. 2 zeigt einen Western-Blot, der einige Immunpräzipitate enthielt, bei denen Serum S3 als Sonde eingesetzt wurde. Wie erwartet wurde eine immunoreaktive Bande mit der elektrophoretischen Mobilität von GAD in Immunpräzipitaten detektiert, die mit GAD-Antikörper positiven Seren erhalten worden waren (2, Bahnen 11, 12 und 16). Eine Bande von identischer Mobilität wurde in allen Immunpräzipitaten gesichtet, die mit 64 kD Antikörper positiven Seren erhalten wurden (7/7) (2, Bahnen 1 – 7 und 14), jedoch nicht in jenen, die mit Kontrollseren erhalten wurden (2, Bahnen 8 – 10, 13, 15 und 17). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protein, das aus Hirn und Inselzellen mittels 64 kD Antikörper positiven Seren immunpräzipitiert worden ist, nicht von GAD unterscheidbar ist.
2 ist ein Western-Blot von Immunpräzipitaten aus Rattenhirn (S-100 DP) und Inselzellen (P-100 DP) Fraktionen, die mit 64 kD Antikörper positiven Seren und GAD Antikörper positiven Seren erhalten wurden. Der Blot wurde mit dem S3-Serum als Sonde behandelt. Die Seren, die für die Immunpräzipitierung eingesetzt wurden, sind am Kopf jeder Bahn angezeigt, mit den gleichen Codes wie in der 1. Das 64 kD Protein, das aus sowohl Hirn als auch Inselzellen immunpräzipitiert worden ist, wird mittels GAD-Antikörpern immunogefärbt. In dem gezeigten Gel wanderte die GAD als eine einzelne Bande.
Neonatales Rattenhirn wurde bei 4°C in 7 Volumen HME-Puffer homogenisiert, gefolgt von der Zentrifugation bei 100000 g für eine Stunde, um eine lösliche (5-100) Fraktion und eine Teilchenfraktion (P-100) zu erhalten. S-100 DP wurde hergestellt und Aliquots (1/13 Hirn pro Bahn) wurde wie in der Legende zu 1 immunpräzipitiert. P-100 wurde aus neonatalen Ratteninselzellen hergestellt und in 200 ml TBS mit 1 % Triton X-114 für 2 Stunden bei 4°C extrahiert (Baekkeskov et al. (1989) supra). P-100 DP wurde wie für 5-100 DP beschrieben hergestellt und die Aliquots (1500 Inselzellen pro Bahn) wurden immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden einer SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von Elektroblotting auf einer PVDF-Membran (Immobilon^®) (Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4850–4854), Sondenbehandlung mit S3-Serum und Visualisierung durch alkalische Phosphatase-konjugiertes Kaninchen-anti-Schaf-IgG.
Das 64 kD Protein weist eine GAD-Enzymaktivität auf.
Die Folgerung, dass das 64 kD Autoantigen tatsächlich der GAD entspricht, sagt vorher, dass das 64 kD Protein die gleichen enzymatischen Eigenschaften wie GAD aufweisen sollte, und diese Möglichkeit wurde untersucht. Wir untersuchten, ob die GAD-Enzymaktivität aus neonatalen Ratteninselzellen und Hirnzelllysaten entfernt werden konnte, indem eine Immunpräzipitierung mit einem 64 kD Antikörper positiven IDDM-Serum durchgeführt wurde, und ob die GAD-Aktivität anschließend in den Immunpräzipitaten gemessen werden konnte. Gehirnfraktionen und Inselzellfraktionen wurden einer Immunpräzipitierung mit ansteigenden Mengen eines 64 kD Antikörper positiven IDDM-Serums unterworfen und die GAD-Enzymaktivität wurde nach Immunpräzipitierung sowohl in den Überständen als auch den Pellets gemessen ( 3A und B). Die Ergebnisse zeigten, dass eine Immunpräzipitierung mit ansteigenden Mengen von 64 kD Antikörper positivem Serum, jedoch nicht mit Kontrollserum, die GAD-Aktivität sowohl aus Hirnlysaten als auch Inselzelllysaten in einer dosisabhängigen Weise entfernte und dass parallel dazu ansteigende Mengen von GAD-Aktivität in den Immunpräzipitaten auftraten. Die GAD-Aktivität, die in den Immunpräzipitaten zurückgewonnen wurde, machte nicht die gesamte Aktivität aus, die aus den Überständen verloren gegangen war, wahrscheinlich aufgrund eines inhibierenden Effekts von Antikörpern auf die Enzymaktivität. Im Fall von Inselzellextrakten, die aus ³⁵S-Methionin-markierten Inselzellen erhalten worden waren, zeigte eine SDS-PAGE Analyse, dass das einzige Inselzellenprotein, das spezifisch in den Immunpräzipitaten detektiert wurde, welche mit dem 64 kD Antikörper positiven IDDM-Serum erhalten worden waren, das 64 kD Autoantigen war (siehe 1). Folglich ist die GAD-Enzymaktivität, die in Immunpräzipitaten, welche mit dem 64 kD Antikörper positiven IDDM-Serum erhalten worden waren, gemessen wurde, eine Eigenschaft des 64 kD Autoantigens.
3A ist ein Plot, der durch Immunpräzipitation von Aliquots (700 Inselzellen pro Probe) von S-100 DP aus neonatalen Ratteninselzellen mit ansteigenden Mengen des 64 kD positiven IDDM-Serums 1–1 (geschlossene Symbole) oder des Kontrollserums C-1 (offene Symbole) erhalten worden ist. Die GAD-Aktivität wurde in den Überständen nach Immunpräzipitierung (Quadrate) und in Pellets (Kreise) gemessen. Die Aktivität in den Überständen wurde als Prozentsatz der Aktivität in nicht-immunpräzipitierten Proben, die mit der gleichen Menge von Kontrollserum inkubiert worden waren, berechnet. Die Aktivität in den Immunpräzipitaten wurde als Prozentsatz der Aktivität in Proben berechnet, die ohne Serum inkubiert worden waren. Die Werte stellen einen Mittelwert von 3 Experimenten ± Standardabweichung dar. 3B ist ähnlich zu 3A, außer dass die Aliquots von S-100 DP aus neonatalem Rattenhirn statt Inselzellenmaterial verwendet wurden.
S-100 DP wurde aus Inselzellen und Hirn wie vorstehend in den Legenden zu 1 und 2 beschrieben hergestellt, außer dass die Puffer mit 1 mM Aminoethylisothiouroniumbromidhydrobromid (AET) und 0,2 mM Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) ergänzt worden waren. S-100 DP wurde 10-fach in 50 mM Kaliumphosphat pH 6,8, 1 mM AET, 0,2 mM PLP (Puffer A) verdünnt und mit den angegebenen Serummengen in einem Gesamtvolumen von 150 ml für 7 Stunden bei 4°C inkubiert. Immunkomplexe wurden auf 150 μl Protein A-Sepharosekügelchen (PAS, Pharmacia) absorbiert und durch Zentrifugation isoliert. Die Überstände wurden gesammelt und 3 mal zentrifugiert, um Spuren von PAS zu entfernen. Die PAS-Pellets wurden 5 mal durch Zentrifugation in Puffer A gewaschen. Die Enzymaktivität in den PAS-Pellets und den Überständen wurde gemessen, indem eine modifizierte Version des zuerst von Albers et al. (1959) ). Biol. Chem. 234: 926–928 beschriebenen Verfahrens durchgeführt wurde. Sowohl die PAS-Pellets als auch die Überstände wurden in 1,5 ml Schraubdeckelröhrchen überführt. 20 μl 5 mM L-Glutamat in Puffer A und 0,4 μCi [1-¹⁴C]-L-Glutamat (59 mCi/mmol, Amersham) wurden dazugegeben. Die Röhrchen wurden sofort mit einem Deckel verschlossen, der ein Whatman Filterpapier enthielt, das in 50 μl 1 M Hyaminhydroxid in Methanol eingeweicht worden war, verschlossen und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Filterpapier wurde anschließend entfernt und das absorbierte ¹⁴CO₂ wurde in einem Szintillationszähler gemessen. Die spezifische Aktivität von GAD in Homogenaten von neonatalem Hirn und Inselzellenmaterial war ähnlich (ungefähr 40 – 70 mU/g Protein.
Vergleichsanalysen von Hirn-GAD und β-Zellen-GAD
Die Analyse der GAD-Enzymaktivität in neonatalen und adulten Rattengeweben zeigte, dass GAD in sehr hohen Spiegeln im Hirn und Inselzellen exprimiert wird und in einer Reihe von weiteren analysierten Geweben entweder vollständig abwesend oder nur in sehr geringen Mengen vorliegt (Ergebnisse nicht dargestellt), was frühere Berichte bestätigen (Erdo and Bowery (eds.) GABAergic Mechanisms in the Mammalian Periphery, New York, Raven Press (1986)). Innerhalb der Inselzellen bestätigte eine doppelte Immunfärbung mit einem monoklonalen Antikörper gegen GAD und entweder Glucagon oder Somatostatin die Lokalisierung von GAD im Kern der β-Zellen, und die Abwesenheit von GAD in den anderen endokrinen Zellen, die an der Peripherie der Insel lokalisiert sind (4). Es wurde gefunden, dass die GAD in Hirn und Inselzellen eine identische Mobilität mittels SDS-PAGE (2) und mittels zwei dimensio naler Gel-Elektrophorese unter Verwendung von IEF/SDS-PAGE (5A) aufweist. Ferner verglichen wir die immunreaktiven Trypsinfragmente, die aus Hirn-GAD und Inselzellen-GAD erzeugt wurden. Trypsin erzeugte ein 55 kD immunreaktives Fragment sowohl aus Inselzellen-GAD als auch Hirn-GAD (5B, siehe auch 1). In beiden Geweben wurde GAD in Form einer löslichen hydrophoben Form wie auch einer membrangebundenen hydrophoben Form gefunden (5B), wie für das 64 kD Inselzellen-Autoantigen beschrieben. Die 65 kD Komponente des 64 kD Proteins wurde in Hirnzellen und Inselzellen in einigen Analysen (1A, 5A, Felder b und c, 5B und 6), jedoch nicht in anderen Analysen (1B und 2) detektiert. Ferner wurde das 64 kD α/β-Duplett in einigen Analysen detektiert (1A und 6). Zusammenfassend legen die Analysen der immunochemischen und biochemischen Eigenschaften der Hirn- und Inselzellen-GAD nahe, dass diese hochhomolog sind.
Die 4 ist ein Immunfluoreszenzmikrograph, der pankreatische Inselzellen darstellt. Die Inselzellen in den Feldern a und c wurden zweifach für GAD und Glucagon markiert. Die Inselzelle in Feld b und d wurde zweifach für GAD und Somatostatin markiert. Pfeile weisen auf die entsprechenden Zellen in den zwei Paaren der Felder.
Die β-Zellen im Zentralkern der Inselzellen werden mit dem GAD-Antikörper hell angefärbt, während die Glucagon- und Somatostatin-positiven Zellen sich mit dem gleichen Antikörper nicht anfärben.
Formaldehyd-fixierte gefrorene Schnitte von Rattenpankreas wurden zuerst für GAD Rhodamin-markiert, wobei eine monoklonale Maus-GAD6 eingesetzt wurde, gezüchtet gegen gereinigte Rattenhirn-GAD (Chang et al. (1988) supra), und anschließend für Glucagon oder Somatostatin Fluorescein-markiert, wobei polyklonale Kaninchenantikörper gegen jedes der Hormone verwendet wurden, nach veröffentlichten Methoden (Baumert et al. (1990) J. Cell Biol. 110: 1285–1294). Die GAD6 wurde von Dr. D. I. Gottlieb, Universität von Washington, erhalten. Bar = 25 mm.
Die 5A zeigt eine zweidimensionale (2D) Gel-Elektrophorese von neonatalen Ratten- und Inselzellen-GAD/64 kD Antigen. Felder a und b, Westernblots von 2D-Gelen einer neonatalen Inselzellenteilchenfraktion (a) und einer Hirnfraktion (b), als Sonde wurde das GAD-Antiserum S3 eingesetzt; Felder c und d, Fluorogramme von 2D-Gelen von Immunpräzipitaten eines ³⁵S-Methionin-markierten Ratteninselzellenextrakts (S-100 DP) mit dem 64 kD Antikörper positiven IDDM-Serum 1–1 (c) und mit einem Kontrollserum C-1 (d). Die löslichen Fraktionen von Hirn und Inselzellen (Fel der b und c) enthalten beide die 65 kD pI 7,1 Komponente und 64 kD pI 6,7 Komponente. Sowohl die 65 kD Komponente als auch die 64 kD Komponente weisen eine Ladungsheterogenizität auf, die zuvor für das 64 kD Autoantigen in Inselzellen beschrieben worden war (Baekkeskov et al. (1989) supra). Diese beiden Felder zeigen das identische Verhalten des 64 kD Proteins (Feld c) und GAD (Felder a und b), was einen weiteren Beleg dafür darstellt, dass es sich um das gleiche Protein handelt, und zeigen die Ähnlichkeiten der Hirn-GAD und Inselzellen-GAD im Hinblick auf sowohl die Ladung als auch die Größe.
Die 5B ist ein Westerblot von löslicher und partikulärer GAD, erhalten aus neonatalem Rattenhirn und Inselzellen vor und nach einem Trypsin-Verdau. Die Bahnen 1-8, mit S3-Serumsonde; Bahnen 9–16, mit normalen (präimmunen) Schafsserum-Sonde. Ein Trypsinabbau der Hirn-GAD und der Inselzellen-GAD führt in beiden Fällen zu einem 55 kD immunreaktiven GAD-Fragment.
Eine partikuläre Fraktion wurde aus neonatalen Ratteninselzellenhomogenisaten durch Zentrifugation bei 36000 g hergestellt (Feld a). Ein synaptosomaler Überstand niedriger Geschwindigkeit wurde aus dem Hirn wie beschrieben hergestellt (Huttner et al. (1983) ). Cell Biol. 96: 1374–1388) (Feld b). S-100 DP wurde aus neonatalen Ratteninselzellen wie in der Legende zu der 1 beschrieben hergestellt und immunpräzipitiert (Felder c und d). Eine zweidimensionale Gel-Elektrophorese wurde wie von O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007–4021 beschrieben durchgeführt und nach Ames et al. (1976) Biochemistry 15: 616–623 modifiziert. Ein Immunoblotting wurde in Übereinstimmung mit Towbin et al. (1979) supra durchgeführt. Die GAD in den Feldern a und b wurde mit der Sonde Anti-GAD-Serum S3 sichtbar gemacht, gefolgt von Kaninchen-anti-Schaf-IgG Serum und I¹²⁵ Protein A und Autoradiographie. Für das Experiment in Feld B wurden S-100 DP und P-100 DP aus Inselzellen und Hirn wie in den Legenden zu den 1 und 2 beschrieben hergestellt und mit Trypsin wie in der Legende zu der 1 beschrieben, abgebaut. Die Hirnfraktionen und Inselzellfraktionen wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung von 15 % Polyacrylamid-Gel unterworfen. Westernblotting und Anfärbungsverfahren waren wie in der Legende zu der 2 beschrieben.
Vergleich von GAD-Antikörpern in SMS- und IDDM-Seren
Die GAD-Reaktivität in SMS Seren wurde mittels Westernblotting und mittels immuncytochemischen Färbungen von fixierten Gewebeschnitten nachgewiesen (Solimena et al. (1988) supra und Solimena et al. (1990) supra), d. h. Assays, die eine vollstän dige oder partielle Denaturierung des Antigens umfassen. Beim Standard-Assay für 64 kD Antikörper in IDDM Seren handelte es sich um eine Immunpräzipitierung aus Inselzelllysaten, die in nicht-denaturierenden Bedingungen hergestellt worden waren (Baekkeskov et al. (1987) ). Clin. Invest. 79: 926–934, Baekkeskov et al. (1982) supra, und Baekkeskov et al. (1989) supra). Wir wählten Seren von den Individuen aus, die die höchste Immunreaktivität gegen das 64 kD Autoantigen in Immunpräzipitierungsexperimenten in einer Studie von 112 IDDM-Patienten und prädiabetischen Individuen ohne SMS aufwiesen (Sigurdsson et al. (1990) supra) und untersuchten sie im Hinblick auf die Immunreaktivität gegen das Hirn-GAD-Protein auf Westernblots (5 Seren) und im Hinblick auf eine Immunfärbung von GABA-ergenen Neuronen (7 Seren). Die Ergebnisse wurden mit jenen von SDS-Seren verglichen. Im Gegensatz zu den SMS-Seren detektierte keines der IDDM-Seren das denaturierte GAD-Protein auf Westernblots (6), und nur ein Serum war fähig, GABA-ergene Neuronen schwach anzufärben (7, Feld C). Eine Titration von IDDM- und SMS-Seren in Immunpräzipitierungsexperimenten zeigte ferner, dass SMS-Seren üblicherweise einen 10-200-fach höheren Titer von GAD-Antikörpern als IDDM-Seren aufwiesen (Ergebnisse nicht dargestellt). In einer weiteren Untersuchung von 74 IDDM- Patienten wurden nur drei Patienten positiv für Antikörper gegen GABA-ergene Neurone gefunden (7, Feld B), einschließlich der einzigen beiden, die mittels Westernblotting positiv waren (13 und Ergebnisse nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu waren alle mittels Immunochemie und/oder Westerblotting positiven SMS-Seren auch positiv für die Immunpräzipitierung (Ergebnisse nicht dargestellt).
Zusammenfassend weisen GAD-Antikörper in SMS-Patienten im allgemeinen einen höheren Titer und eine deutliche Epitop-Erkennung verglichen mit GAD-Antikörpern in IDDM-Patienten auf. In seltenen Fällen jedoch können GAD-Antikörper in IDDM-Patienten denaturierte GAD erkennen. Interessanterweise erkennen die 7673 und S3 Antiseren beide die 65 kD und 64 kD α- und β-Isoformen auf Westernblots (6, Bahnen 2 und 4), während humane GAD-Autoantikörper wie auch der monoklonale Antikörper GAD6 bevorzugt die kleineren 64 kD α- und β-Isoformen erkennen (2, Bahnen 5 und 7 – 11). Es wurde berichtet, dass der GAD6 Antikörper für die kleinere GAD-Isoform im Hirn spezifisch sei.
Die 6 stellt Westernblots von S-100 DP aus neonatalem Rattenhirn (Bahnen 1 – 4 und 7 – 24) und Inselzellen (Bahnen 5 und 6) dar, sondenbehandelt mit GAD Antikörper positiven SMS-Seren und Seren von IDDM-Patienten und prädiabetischen Individuen mit einer hohen Immunreaktivität gegen das 64 kD/GAD-Protein in Immunpräzipitierungsexperimenten. Die Seren sind am Anfang jeder Bahn mit den gleichen Codes angegeben, wie sie auch in 1 verwendet worden sind. Das S3 Serum, 7673 Serum, GAD6 Serum und GAD Antikörper positive SMS-Seren erkennen die denaturierte Form von GAD in Hirn und Inselzellen, während dies bei 64 kD positiven IDDM-Seren nicht der Fall ist. Die S3 und 7673 Seren reagieren sowohl mit der 65 kD Form als auch den 64 kD α- und β-Formen, während GAD6 (von dem zuvor gezeigt werden konnte, dass es selektiv mit der kleineren Hirn-GAD-Isoform reagiert (Chang et al. (1988) supra)) und die SMS-Seren nur mit den 64 kD α- und β-Komponenten reagieren.
S-100 DP Aliquots aus Rattenhirn und Ratteninselzellen wurden einer SDS-PAGE unterworfen, elektrogeblottet und immungefärbt, wie in der Legende zu der 2 beschrieben. Die Verdünnungen für eine Immunfärbung von Westernblots waren wie folgt: 1/200 für GAD6, 1/250 für IDDM-Seren, Kontroll-Humanserum, SMS-Seren 2 und 5, das 7673 Serum und normales Kaninchenserum, 1/500 für SMS-Seren 3 und 4 und 1/2000 für S3 und normales (präimmunes) Schafserum. (Die SMS-Seren 4 und 5 entsprechen den Patienten Nr. 161 und 176 in Solimena et al. (1990) supra).
Mikrographen von Hellfeld-Lichtmikroskopie, die eine Immunfärbung von GABA-ergenen Nervenenden in der Kleinhirnrinde (cerebellar cortex) von Ratten mit SMS und IDDM-Seren zeigen. Feld a, SMS-3-Serum; Feld b, IDDM-Serum 1-8 (Patient 69 von Solimena et al. (1990) supra); Feld c, IDDM-Serum 1–2; Feld d, IDDM-Serum 1–1. Alle Seren außer Serum 1–1 zeigen die typischen Färbungen von GABA-ergenen Nervenenden. Man beachte die Akkumulierung von Immunreaktivität an der Basis der Purkinje-Zellen, wo die GABA-ergenen Nervenenden von Korbzellen enden. Die Verfahren wurden wie in Solimena et al. (1990) supra beschrieben, durchgeführt.
Autoantikörper von IDDM-Patienten erkennen beide Molekulargewichtsformen von pankreatischer GAD.
Wir klonierten die höhere Molekulargewichtsform von pankreatischer GAD (GAD_67kD) aus einer Ratteninselzellen-cDNS-Bibliothek. Durch Expression dieses Proteins in einer Säugerzelllinie (COS) waren wir in der Lage, GAD_67kD zu produzieren, die ihre enzymatische Aktivität beibehielt und von wohl charakterisierten Antikörpern gegen Hirn-GAD erkannt wurde. Wir verwendeten dieses zelluläre Expressionssystem um zu bestimmen, ob GAD_67kD ein Ziel von Autoantikörpern in IDDM darstellt und, sofern dies der Fall ist, ob die Antikörper mit einer ähnlichen Häufigkeit wie Antikörper gegen die niedrigere Molekulargewichtsform von pankreatischer GAD_67kD auftreten würden.
COS-Zellen, die mit Plasmiden transfiziert worden waren, welche das klonierte GAD_67kD-Gen enthielten, und COS-Zellen, die Plasmide mit dem gleichen Gen enthielten, das in umgekehrter Richtung insertiert war (Kontrolle), wurden unter Standardbedingungen kultiviert und mit ³⁵S-Methionin markiert. Aus den markierten Zellen wurden lösliche hydrophile Proteine isoliert (Baekkeskov et al. (1990) Nature 347: 151–156), und mit Seren von 27 kürzlich diagnostizierten IDDM-Patienten, 15 prädiabetischen Individuen (4 Monate bis 7 Jahre vor dem klinischen Ausbruch), 8 SMS-Patienten und 10 gesunden Individuen immunpräzipitiert. 91,4 % aller GAD_64kD Antikörper positiven Seren von kürzlich diagnostizierten IDDM-Patienten und prädiabetischen Individuen erkannten GAD_67kD (7). Ferner waren 2/5 (40 %) der GAD_67kD Antikörper negativen Individuen GAD_67kD Antikörper positiv. Alle GAD_64kD Antikörper negativen Kontrollen waren auch für GAD_67kD Antikörper negativ. Alle in dieser Studie untersuchten SMS-Patienten zeigten Antikörper gegen beide Formen der GAD. Die COS-Zellen, die das GAD_67kD-Gen in umgekehrter Richtung insertiert enthielten, enthielten keines der Proteine, die spezifisch durch IDDM-Seren präzipitiert wurden.
Folglich konnten wir nachweisen, dass die GAD_67kD und GAD_64kD Antigene jeweils Epitope enthalten, die von Antikörpern erkannt werden, welche mit frühen und späten Phasen der β-Zellstörung assoziiert sind. Die hohe Korrelation zwischen Antikörpern gegen GAD_64kD und GAD_67kD, die in dieser Studie gefunden werden konnte, weist auf einen hohen Grad der Homologie zwischen autoantigenischen Epitopen der beiden Formen des Enzyms hin. Jedoch deuten diese Daten ferner an, dass die GAD_67kD-Form ausgeprägte autoantigenische Epitope enthält, die nicht in der GAD_64kD-Form vorliegen, und dass die Untersuchung auf Antikörper gegen beide Formen die Empfindlichkeit in vor kurzen diagnostizierten Patienten und prädiabetischen Individuen erhöht.
Die Klonierung der GAD_67kD von Ratteninselzellen wurde wie folgt durchgeführt. Vier Oligonucleotid-Matching-Sequenzen 128 – 151, 1112 – 1137 (reverse); 1035 – 1061 und 1883 – 1909 (reverse) der veröffentlichten Hirnform von Ratten-GAD-cDNA (Julien et al. (1990) J. Neurochem. 54: 703–705). Diese wurden in Kombination von zweien (128 – 151/1112 – 1137 und 1035 – 1061/1883 – 1909) in PCR-Reaktionen verwendet, um homologe Sequenzen in cDNS aus Ratteninselzellen zu amplifizieren. Die Amplifizierungsprodukte jeder PCR-Reaktion wurden anschließend mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert und die Produkte innerhalb des erwarteten Größenbereichs wurden anschließend ausgewählt und weiter mit einem geeigneten Primerpaar amplifiziert, um individuelle PCR-Banden zu isolieren. Im folgenden untersuch ten wir, ob eine dieser diskreten Banden aus einer Einzel-DNA-Spezies bestand, was die Amplifizierung eines Teils des erwünschten Gens reflektieren würde. Die isolierten Moleküle wurden mit spezifischen Restriktionsenzymen abgebaut. In den meisten Fällen wies das erzeugte Fragmentenset die Größe der originalen Hirn-cDNS auf. Diese PCR-Banden scheinen folglich jeweils eine einzelne cDNS-Spezies zu enthalten. Um die Natur dieser cDNSs zu bestimmen, wurde ein Aliquot der Reaktion in den Plasmidvektor Bluescript KS+ kloniert, und Kolonien wurden mit einer Sonde gescreent, die aus einem Fragment von einem cDNS-Klon von GAD_67kD von Rattenhirn bestand, erhalten von Dr. A. Tobin der Universität von Kalifornien. Die hybridisierenden Kolonien wurden einer PCR-Amplifizierung unterworfen, und nur jene, die ein PCR-Produkt der geeigneten Größe ergaben, wurden gereinigt und ferner einer DNS-Sequenzanalyse unterworfen. Die Sequenz jedes Klons wurde mit internen Primern vervollständigt, die den Nukleotiden 500 – 516, 1305 – 1321 (antisense) und 1440 -1556 (antisense) entsprachen. PCR-Experimente unter Verwendung von "Nested-Primern" (Standardprimern gefolgt von Primern zu internen Sequenzen) wurden eingesetzt, um zu bestätigen, dass Fragmente, die ein positives Signal ergeben, keine störenden Moleküle enthalten. Die Sequenzierung der cDNSs zeigte eine vollständige Sequenzhomologie mit GAD_67kD im Hirn. Somit exprimieren Ratteninselzellen eine Form von GAD, die zur GAD_67kD identisch ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse und der Vergleichsanalyse von GAD_67kD im Hirn und der 65 kD Form in Inselzellen auf dem Proteinniveau folgern wir, dass das 65 kD Protein in β-Zellen durch das GAD_67kD-Gen codiert wird.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit COS-Zellen erhalten, die GAD_67kD (höhere molekulare Form) und GAD_65kD (niedrigere molekulare Form) aus humanem Hirn exprimierten. cDNS-Klone, die von einer humanen Hirn-cDNS-Bibliothek isoliert worden waren und für GAD_67kD oder GAD_65kD codierten, von Dr. Tobin erhalten, wurden in einen COS-Zellexpressionsvektor 91023B insertiert (Wong et al. (1985) Science 228: 810–815). COS7-Zellen wurden unter Verwendung eines Lipofectinreagenz transfiziert und mit ³⁵S-Methionin 48 Stunden nach der Transfektion markiert. Wir verwendeten Zelllysate aus der COS-Transfektion zur Analyse von Seren von 25 kürzlich diagnostizierten IDDM-Patienten, 14 prädiabetischen Individuen, 8 SMS-Patienten und 10 Kontrollen. Bei allen diesen Seren (außer den Kontrollen) wurde zuvor gefunden, dass sie Antikörper gegen die amphiphile 64 kD Form von GAD enthielten, wobei isolierte Inselzellen als Antigenquelle verwendet wurde. Alle Seren, die zuvor für die 64 kD Inselzellenform positiv waren, waren auch positiv für die COS-Zellen GAD_65kD. Ähnlich waren alle Seren, die für Antikörper gegen die 64 kD Form von Inselzellen negativ waren, auch negativ für Antikörper gegen die GAD_65kD von COS-Zellen, wodurch bestä tigt wurde, dass GAD und die 64 kD Inselzellenform antigenisch identisch sind. Auch wenn der Großteil von IDDM-Seren (18/25) und prädiabetischen Seren (8/14) und alle SMS-Seren (8/8) sowohl GAD_65kD als auch GAD_67kD erkannten, so erkannten Seren von einigen IDDM-Patienten entweder GAD_65kD (3/25) oder GAD_67kD (3/25), aber nicht beide Formen. Unter den prädiabetischen Individuen erkannten ferner 3 von 14 spezifisch GAD_65kD während keines für Antikörper gegen GAD_67kD spezifisch war. Wir folgern daraus, dass Autoantikörper in sowohl IDDM-Patienten als auch SMS-Patienten beide Formen von GAD in einer nativen Konfiguration erkennen können und dass einige IDDM-Patienten und prädiabetischen Individuen bevorzugt entweder die eine oder die andere Form von GAD erkennen können. Die Ergebnisse in der prädiabetischen Gruppe weisen darauf hin, dass sich Antikörper schneller gegen GAD_65kD als gegen GAD_67kD entwickeln können.
Auch wenn die vorstehende Erfindung zum Zwecke eines klaren Verständnisses ausführlich beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, dass im Rahmen der beigefügten Ansprüche gewisse Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims

Ein Verfahren zum Detektieren von Autoantikörpern gegen ein ungefähr 64 kD pankreatisches β-Zellen-Autoantigen in Seren, wobei das Verfahren folgendes umfasst: eine Serumprobe wird gereinigtem Liganden für die Autoantikörper mit einer Reinheit von wenigstens 50% w/w ausgesetzt und die spezifische Interaktion zwischen dem gereinigten Liganden und den Autoantikörpern wird detektiert, worin der gereinigte Ligand eine ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon ist, enthaltend ein Epitop, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Ligand wenigstens 99% rein ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht rekombinant hergestellt ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht aus einer Quelle von nativer ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase isoliert ist.
Ein Verfahren zur Diagnose oder zur Überwachung von Insulin-abhängigem Diabetes mellitus oder einer Anfälligkeit dafür in einem Patienten durch Untersuchen einer Serumprobe des Patienten, wobei das Verfahren folgendes umfasst: die Serumprobe wird gereinigtem Liganden ausgesetzt, der eine ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon darstellt, enthaltend ein Epitop, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden, und eine Reinheit von wenigstens 50% w/w aufweist; und die Interaktion zwischen der Glutaminsäure-Decarboxylase oder dem Fragment und Autoantikörpern, die in der Serumprobe vorliegen können, wird detektiert, wobei solch eine Interaktion für Insulin-abhängigen Diabetes mellitus oder eine Anfälligkeit dafür diagnostisch ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, worin der Ligand wenigstens 99% rein ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, worin die ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht rekombinant hergestellt ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, worin die ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht aus ZNS-Zellen isoliert ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Serumprobe mit löslichen, markierten Autoantikörpern vereinigt wird, so dass markierte und unmarkierte Autoantikörper für die Bildung von Komplexen mit dem gereinigten Liganden in Konkurrenz stehen, wobei die Menge an Markierung, die in diesen Komplexen gebunden ist, zu der Konzentration an Autoantikörpern, die anfänglich in der Serumprobe vorliegen, umgekehrt proportional ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Autoantikörper mit einem Enzym markiert sind und die Bindung von Ligand an die Autoantikörper die Enzymaktivität inhibiert.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der gereinigte Ligand an eine Festphase gebunden ist und das Verfahren ferner die Entfernung der Festphase aus der Serumprobe umfasst, um markierte Komplexe von nicht-gebundenen, markierten Autoantikörpern zu trennen.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der gereinigte Ligand an eine Festphase gebunden ist und das Verfahren ferner das Abtrennen der Festphase, um im wesentlichen die gesamten Autoantikörper, die in der Probe vorliegen, zu entfernen und das Messen der Menge an entfernten Autoantikörpern umfasst, wobei die Menge zu der Konzentration von Autoantikörpern, die in der Probe vorliegen, direkt proportional ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Autoantikörpermenge gemessen wird, indem die Festphase einem markierten Reagenz, das für die Autoantikörper spezifisch ist, ausgesetzt wird und die Menge an gebundenem, markierten Reagenz bestimmt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der gereinigte Ligand eine Glutaminsäure-Decarboxylase-Aktivität aufweist und die Interaktion zwischen dem Liganden und den Autoantikörpern auf der Grundlage des Verlusts an Enzymaktivität des gereinigten Liganden detektiert wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die spezifische Interaktion mittels Immunpräzipitierung des gereinigten Liganden und der Autoantikörper detektiert wird.
Ein Verfahren zur Diagnose oder Überwachung von Insulin-abhängiger Diabetes mellitus oder einer Anfälligkeit dafür in einem Patienten, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Durchführung eines Assays einer Serumprobe des Patienten, um das Vorliegen von Autoantikörpern gegen ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht zu bestimmen, wobei eine ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht mit einer Reinheit von wenigstens 50 Gew.-% verwendet wird, um die Autoantikörper zu detektieren; und Durchführung eines Assays der Probe, um das Vorliegen von Autoantikörpern gegen ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von höherem Molekulargewicht zu bestimmen, wobei ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von höherem Molekulargewicht zum Detektieren der Autoantikörper verwendet wird, worin das Vorliegen von Autoantikörpern gegen wenigstens eine der Molekulargewichtsformen von GAD die Anfälligkeit gegenüber, den Ausbruch oder die Persistenz von Insulin-abhängigem Diabetes mellitus anzeigt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, worin die Autoantikörper gegen jede Molekulargewichtsform der Glutaminsäure-Decarboxylase getrennt detektiert werden, so dass das Vorliegen jeder Form bekannt ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, worin das Vorliegen von Autoantikörpern gegen jede Molekulargewichtsform der Glutaminsäure-Decarboxylase getrennt voneinander durch Reaktion mit rekombinant hergestellter Glutaminsäure-Decarboxylase bestimmt wird, welche frei von der jeweils anderen Molekulargewichtsform ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, worin die Autoantikörper gegen jede Molekulargewichtsform der Glutaminsäure-Decarboxylase simultan detektiert werden, so dass das Vorliegen keiner der Formen individuell bestimmt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das Vorliegen der Autoantikörper durch Reaktion mit einer Mischung beider Molekulargewichtsformen der Glutaminsäure-Decarboxylase bestimmt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 20, worin die Mischung aus einer Quelle von nativer ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase isoliert wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, worin das Assay oder jedes Assay ein Radioimmunoassay ist, bei dem an eine Festphase gebundene Glutaminsäure-Decarboxylase eingesetzt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, worin das Assay oder jedes Assay ein Enzym-gebundenes Immunoabsorptionsassay ist, bei dem an eine Festphase gebundene Glutaminsäure-Decarboxylase eingesetzt wird.
ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon, enthalten ein Epitop, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden, zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung der Entwicklung von Insulin-abhängigem Diabetes mellitus, wobei das Verfahren das Verabreichen einer vorgewählten Dosierung von Glutaminsäure-Decarboxylase an einen Patienten umfasst.
ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 24, gekoppelt an ein Immunglobulin oder eine lymphoide Zelle des zu behandelnden Patienten.
ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 24 oder 25, die modifiziert worden ist, um die Bindung an einen assoziierten T-Zellrezeptor zu verringern, während die Bindung an den MHC beibehalten wird, wodurch die zelluläre Immunantwort inhibiert wird.
ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, worin die Dosierung von Glutaminsäure-Decarboxylase oder eines Fragments davon in diesem Verfahren ausgewählt wird, um in dem Patienten eine Toleranz gegen das 24 kD Autoantigen zu induzieren, das mit der Insulin-abhängigen Diabetes assoziiert ist.
ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht gemäß Anspruch 24, die rekombinant hergestellt ist.
ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht gemäß Anspruch 24, die aus einer Quelle von nativer ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase isoliert ist.
Eine Zubereitung umfassend ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase von geringerem Molekulargewicht oder ein Fragment davon, enthaltend ein Epitop, das fähig ist, Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase zu binden, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 30, worin die Glutaminsäure-Decarboxylase oder ein Fragment davon an ein Immunglobulin oder eine lymphoide Zelle gekoppelt ist.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 30, worin die Glutaminsäure-Decarboxylase rekombinant hergestellt ist.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 30, worin die Glutaminsäure-Decarboxylase aus einer Quelle von nativer ZNS-Glutaminsäure-Decarboxylase isoliert ist.