DE102018004759A1

DE102018004759A1 - Diagnose einer Neuroautoimmunkrankheit

Info

Publication number: DE102018004759A1
Application number: DE102018004759.9A
Authority: DE
Inventors: Lars Komarowski; Ramona MISKE; lswariya Venkataraman; Winfried Stöcker; Christian Probst; Madeleine SCHARF; Yvonne DENNO; Stephanie Kade
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2018-12-20
Also published as: EP3415909A1; US11371991B2; US20180364228A1; CN109142740A; US20200309775A1; US10725035B2; EP3415909B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit umfassend den Schritt Nachweisen eines Antikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist, in einer Probe von einem Patienten, die Antikörper umfasst; ein Polypeptid umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder eine Variante davon; eine Verwendung des Polypeptides zur Diagnose einer Krankheit; einen Autoantikörper, der an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist; eine Verwendung des Autoantikörpers zur Diagnose einer Krankheit; ein Verfahren zum Isolieren eines Autoantikörpers, der an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst; eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine medizinische Vorrichtung umfassend das Polypeptid; einen Kit zur Diagnose einer Krankheit umfassend das Polypeptid oder die medizinische Vorrichtung und eine Verwendung des Polypeptides oder des Autoantikörpers zur Herstellung eines Kits oder einer medizinischen Vorrichtung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit umfassend den Schritt Nachweisen eines Antikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist, in einer Probe von einem Patienten, die Antikörper umfasst; ein Polypeptid umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder eine Variante davon; eine Verwendung des Polypeptides zur Diagnose einer Krankheit; einen Autoantikörper, der an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist; eine Verwendung des Autoantikörpers zur Diagnose einer Krankheit; ein Verfahren zum Isolieren eines Autoantikörpers, der an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst; eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine medizinische Vorrichtung umfassend das Polypeptid; einen Kit zur Diagnose einer Krankheit umfassend das Polypeptid oder die medizinische Vorrichtung und eine Verwendung des Polypeptides oder des Autoantikörpers zur Herstellung eines Kits oder einer medizinischen Vorrichtung.
Das Entwickeln diagnostischer Systeme zur Diagnose neurologischer Krankheiten ist eine anhaltende Herausforderung in der Biomedizin, nicht zuletzt deshalb, weil viele der beobachteten Symptome mit einer Vielzahl von Ursachen zusammenhängen können, u.a. genetisch vererbte Krankheiten, Drogenmissbrauch, Fehlernährung, Infektion, Verletzung, psychiatrische Krankheiten, immunologische Defekte und Krebs.
Da eine neurologische Krankheit selten mit einem einzigartigen charakteristischen Muster klinischer Symptome assoziiert ist, ist es häufig schwierig, eine verlässliche Diagnose ausschließlich basierend auf der Beobachtung und Untersuchung von den betroffenen Patienten oder Anamnese zu erstellen.
Die Bedeutung einer frühzeitigen Diagnose kann nicht überbewertet werden. Viele neurologische Störungen, besonders bekannt darunter Alzheimer'sche Krankheit und Parkinson'sche Krankheit sowie die Multiple Sklerose, können nicht geheilt werden, aber es stehen Medikamente zur Verfügung, die eingesetzt werden können, um ihr Fortschreiten zu verlangsamen. Zusätzlich sind bestimmte seltene Arten von Krebs mit neurologischen Symptomen assoziiert. Je früher die Diagnose erfolgt, desto besser stehen die Chancen, das Spektrum an vorhandenen Therapien zum bestmöglichen Nutzen des Patienten auszunutzen.
Dies alles trifft auf neurologische Krankheiten, die mit Autoantikörpern assoziiert sind, in besonderem Maße zu. In einigen Fällen ist die Verbindung zwischen einem spezifischen nachweisbaren Autoantikörper und einer Störung ausreichend eng, um eine unmittelbare Diagnose bei Nachweis des Autoantikörpers zu erlauben.
Doch selbst wenn das nicht der Fall ist, kann der Nachweis von Autoantikörpern den behandelnden Arzt auf therapeutische Mittel hinweisen, die verwendet werden können, um die Störung des Patienten zu lindern. Es gibt eine Vielzahl von häufig eingesetzten Immunsuppressiva, die unabhängig von der Natur des Autoantikörper-Targets eingesetzt werden können. Alternativ kann Apherese verwendet werden, um Autoantikörper aus dem Blut des Patienten zu entfernen. In vielen Fällen könnten Patienten nach der frühen Diagnose und Behandlung einer neurologischen Autoimmunkrankheit ein normales Leben führen.
Diagnostische Tests basierend auf dem Nachweis von Autoantikörpern können auch die Diagnose von anderen Krankheiten untermauern als denen, die mit Autoantikörpern assoziiert sind. Zeigt sich, dass in einer Blutprobe keine spezifischen Autoantikörper vorhanden sind, dann ist es wahrscheinlich, dass dieses Ergebnis dem behandelnden Arzt dabei hilft, eine Reihe von möglichen Krankheiten auszuschließen und daher das Spektrum von in Frage kommenden Störungen oder Krankheiten einzuengen.
Beispiele von neurologischen Störungen, die mit dem Auftreten von Autoantikörpern einhergehen, umfassen Neuromyelitis optica, eine Krankheit, die durch ein Verlust von Sehvermögen und Rückenmarksfunktion gekennzeichnet ist, und Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis, die mit autonomer Disfunktion, Hypoventilation, zerebelläre Ataxie, Hemiparese, Bewusstseinsverlust oder Katatonie assoziiert ist. Während die Beteiligung von Autoantikörpern und die Art dieser Störung selbst zuvor kaum verstanden wurden, können viele dieser Krankheiten jetzt diagnostiziert und effektiv behandelt werden, weil Assays zur Verfügung stehen, die auf dem Nachweis von Autoantikörpern basieren.
Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass neue Ansätze entwickelt werden, um neurologische Störungen, die mit Autoantikörpern assoziiert sind, von anderen Störungen zu unterscheiden.
WO1997/021729 und US 5693476 offenbaren die Verwendung von NSF-, Syntaxin- und VAMP-Proteinen als Teil künstlich gebildeter Komplexe, um Substanzen zu identifizieren, die die synaptische Transmission modulieren, aber offenbaren nicht die Existenz, geschweige denn die diagnostische Nützlichkeit eines Autoantikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STXB1 und VAMP2 ausgewählt ist.
Nicot et al. berichten von verringerten Konzentrationen an Transkript und Protein von STX1B in experimenteller muriner Autoimmunenzephalitis (Nicot A, Ratnakar PV, Ron Y, Chen CC, Elkabes S. Regulation of gene expression in experimental autoimmune encephalomyelitis indicates early neuronal dysfunction. Brain. 2003 Feb;126(Pt 2):398-412), offenbaren aber nicht die Existenz, geschweige denn die diagnostische Nützlichkeit eines Autoantikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst.
Hirai et al. berichten von Autoantikörpern gegen VAMP2 in 21% von Patienten mit Typ 1 Diabetes (Hirai H, Miura J, Hu Y, Larsson H, Larsson K, Lernmark A, Ivarsson SA, Wu T, Kingman A, Tzioufas AG, Notkins AL. Selective screening of secretory vesicle-associated proteins for autoantigens in type 1 diabetes: VAMP2 and NPY are new minor autoantigens. Clin Immunol. 2008 Jun;127(3):366-74), die über ein in vitro-Transkriptions-Translations-Immunpräzipitations-Protokoll gefunden wurden, mit dem auf sekretorische Vesikelassoziierte Proteine abgezielt wurde. In der gleichen Veröffentlichung offenbaren die Autoren, dass sie keine Antikörper gegen STX1A gefunden haben, ein Protein mit 97,6% Homologie zu STX1B. Sie offenbaren nicht die Existenz, geschweige denn die diagnostische Nützlichkeit eines Autoantikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF und STX1B umfasst. Weiterhin wurde der gegen VAMP2 bindende Autoantikörper nicht als Marker zum Diagnostizieren neurologischer Störungen betrachtet.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem besteht darin, neue Reagenzien, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die eingesetzt werden können, um die Diagnose und Behandlung einer Autoimmunkrankheit zu unterstützen, bevorzugt einer Autoimmunkrankheit des Nervensystems oder einer Autoimmunkrankheit, die mit einer neurologischen Krankheit oder neurologischen Symptomen assoziiert ist, bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt umfassend Stiff-Person-Syndrom und Enzephalitis, am bevorzugtesten Enzephalitis.
Ein weiteres der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem besteht darin, neue Reagenzien, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die verwendet werden können, um Autoimmunkrankheiten, insbesondere neurologische Autoimmunkrankheiten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Stiff-Person-Syndrom und Enzephalitis, bevorzugt Enzephalitis, von Krankheiten zu unterscheiden, die nicht Autoimmunkrankheiten sind, nicht zuletzt, um das vielversprechendste Behandlungsprotokoll zu bestimmen, genauer, ob eine immunsuppressive Behandlung angebracht ist.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem wird durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen und abhängigen Ansprüche gelöst.
In einem ersten Aspekt wird das Problem gelöst durch ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit umfassend den Schritt Nachweisen eines Antikörpers, der gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 bindet, in einer Antikörper umfassenden Probe von einem Patienten.
In einem zweiten Aspekt wird das Problem durch ein Polypeptid umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder eine Variante davon gelöst, das bevorzugt immobilisiert ist, bevorzugter auf einem festen Träger.
In einem dritten Aspekt wird das Problem durch die Verwendung eines Polypeptides gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose einer Krankheit gelöst, bevorzugt umfassend den Schritt Nachweisen eines Autoantikörpers in einer Probe, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst.
In einem vierten Aspekt wird das Problem durch ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit gelöst.
In einem fünften Aspekt wird das Problem durch einen Autoantikörper gelöst, bevorzugt einen isolierten Antikörper, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst, wobei der Antikörper bevorzugt in einem Komplex mit dem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung vorliegt.
In einem sechsten Aspekt wird das Problem durch die Verwendung eines Autoantikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose einer Krankheit gelöst.
In einem siebten Aspekt wird das Problem gelöst durch ein Verfahren zum Isolieren eines Autoantikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst, umfassend die Schritte

a) Kontaktieren einer Probe umfassend den Autoantikörper mit einem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die mit der Bildung eines Komplexes kompatibel sind, in dem der Autoantikörper gegen das Polypeptid bindet,
b) Isolieren des in Schritt a) gebildeten Komplexes,
c) Dissoziieren des in Schritt b) isolierten Komplexes, und
d) Trennen des Autoantikörpers von dem Polypeptid.

In einem achten Aspekt wird das Problem durch eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine medizinische Vorrichtung gelöst, bevorzugt eine diagnostische Vorrichtung, die das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
In einem neunten Aspekt wird das Problem durch ein Kit zur Diagnose einer Krankheit gelöst, wobei das Kit das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung oder die medizinische Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei das Kit zusätzlich ein Mittel zum Nachweisen eines Komplexes umfasst, der das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen Antikörper umfasst, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Patient oder ist die Krankheit assoziiert mit einem oder mehr als einem, bevorzugt zwei oder mehr als zwei Symptomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die progressive Steifheit in trunkalen Muskeln, umfassend thorakolumbale paraspinale und abdominale Muskeln, abdominale Wandmuskeln und proximale Beinmuskeln, rigiden Gang, lumbare Hyperlordose, chronischen Schmerz, Spastiken in proximalen Gliedern und axialen Muskeln, Empfindlichkeit auf Berührung oder Geräusche, Hyperekplexie, Myoklonus, Depression, Angst, Phobie, Fieber, Kopfschmerz, Verwirrung, Dysarthrie, Dysphagie, Nystagmus, Oszillopsie, Schwindel, Übelkeit, Ataxie, Parästhesie, Muskelschwund, Schwindel, Anfälle, Epilepsie und Tremor.
In einem zehnten Aspekt wird das Problem gelöst durch die Verwendung eines Polypeptides gemäß der vorliegenden Erfindung oder des Autoantikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines Antikörpers gegen das Polypeptid aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder die medizinische Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Kits, einer medizinischen Vorrichtung gelöst, bevorzugt eine diagnostische Vorrichtung, bevorzugt zur Diagnose einer Krankheit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Krankheit eine neurologische Krankheit, bevorzugt eine Autoimmunkrankheit des Nervensystems, bevorzugter ausgewählt aus der Gruppe umfassend Stiff-Person-Syndrom und Enzephalitis, bevorzugt Enzephalitis.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren oder die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen beabsichtigt, ob die Krankheit, bevorzugt die neurologische Krankheit, eine Autoimmunkomponente hat, bevorzugt eine, die einer immunsuppressiven Behandlung zugänglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine Körperflüssigkeit, die Antikörper umfasst, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Gesamtblut, Serum, Plasma, Liquor und Speichel.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Autoantikörper oder Komplex unter Verwendung eines Verfahrens nachgewiesen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Immundiffusions-Tests, immunoelektrophoretische Techniken, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinations-Tests, Immuntests mit Markierungen, wie diejenigen aus der Gruppe umfassend Immuntests mit Radiomarkierung, Enzymimmuntests, bevorzugt ELISA, Chemiluminszenz-Immuntests und Immunfluoreszenztests, bevorzugt die indirekte Immunfluoreszenztests.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die medizinische Vorrichtung aus der Gruppe ausgewählt, die einen Glasträger, bevorzugt insbesondere einen Objektträger, einen Biochip, eine Mikrotiter-Platte, einen Teststreifen, eine Membran, bevorzugt einen Line Blot, eine Chromatographiesäule und einen Bead, bevorzugt einen magnetischen Bead, umfasst.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass ein Autoantikörper gegen NSF, ein Autoantikörper gegen STX1B und ein Autoantikörper gegen VAMP2 existieren und in Proben von mehreren Patienten nachgewiesen werden konnten, die unter spezifisch neurologischen Symptomen leiden, aber nicht in Patienten, die von gesunden Personen erhalten wurden.
Weiterhin basiert die vorliegende Erfindung auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass die neue neurologische Krankheit durch Nachweis eines Autoantikörpers gegen ein Polypeptid diagnostiziert werden kann, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist.
Ohne an irgendwelche Theorien gebunden sein zu wollen, legt das Vorhandensein solcher Autoantikörper nahe, dass die Aktivität und Funktion einer oder von mehr als einem Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B, and VAMP2 und/oder Downstream-Effektoren in Patienten beeinträchtigt ist, die solche Antikörper aufweisen, mit der Wirkung, dass neurologische Symptome auftreten.
N-Ethylmaleimid-sensitives Fusionsprotein (NSF), Syntaxin 1B (STX1B), und Vesicleassoziiertes Membranprotein 2 (VAMP2) sind intrazelluläre periphäre Membranproteine, die im Gehirn stark exprimiert werden, besonders im Zellkörper und in den Axonen von Neuronen (Hong W, Lev S Tethering the assembly of SNARE complexes. Trends Cell Biol. 2014 24: 35-43).
Sie sind Teil von SNARE (Soluble NSF Attachment Protein Receptor)-Komplexen, die beim Andocken oder bei der Diffusion von synaptischen Vesikeln mit der präsynaptischen Membran in Neuronen beteiligt sind. Daher modulieren NSF, STX1B bzw. VAMP2 Neurotransmitter-Freisetzung, umfassend Freisetzung von Gama-Amino Buttersäure (GABA) und Glycin von inhibitorischen Neuronen (Südhof TC, Rizo J. Synaptic vesicle exocytosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12). pii: a005637).
Die Spaltung von STX1B and VAMP2 durch Botulinumtoxin aus Clostridium botulinum, das aus verschiedenen Proteasen besteht, die als Botulinum Neurotoxin A-G bezeichnet werden, beendet die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin aus Axonenden an der neuromuskulären Junction und verursacht daher Lähmung mit Schlaffheit. In ähnlicher Weise führt die Spaltung von VAMP2 durch Tetanustoxin aus Clostridium tetani zu Kiefersperre gekennzeichnet durch Muskelspastiken.
NSF ist ein 82 Kilodalton-Polypeptid umfassend 744 Aminosäuren. Es wird für den Vesikel vermittelten Transport benötigt. Es katalysiert die Fusion von Transportvesikeln innerhalb der Golgizisternen. Es wird auch für den Transport aus dem endoplasmatischen Retikulum zum Golgi benötigt. Seine Funktion scheint die eines Fusionsproteins zu sein, das für die Lieferung von Cargoproteinen an alle Kompartimente des Golgiapparates benötigt wird, unabhängig von der Herkunft des Vesikels.
STX1B ist ein 33 Kilodalton-Polypeptid, das 288 Aminosäuren umfasst. Es ist möglicherweise an dem Andocken von synaptischen Vesikeln an den präsynaptischen aktiven Zonen beteiligt.
VAMP2 ist ein 13 Kilodalton-Polypeptid, das 116 Aminosäuren umfasst. Es ist an dem Targeting und/oder an der Fusion von Transportvesikeln an ihre Zielmembran beteiligt. Es moduliert, wie der spannungsabhängige Kaliumkanal KCNB1 sich öffnet.
STX1B und VAMP2 gehören zum SNARE Kernkomplex in Neuronen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid umfassend ein Säugetier-, bevorzugt ein humanes Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2, oder Antigenvarianten davon, die gegen Autoantikörper reaktiv sind, die gegen NSF, STX1B beziehungsweise VAMP2 reaktiv sind. Säugetier-NSF, -STX1B und -VAMP2 umfassen die Polypeptide aus dem Menschen, Affen, Maus, der Ratte, dem Kaninchen, Meerschweinchen oder Schwein und sind bevorzugt die humanen Proteine.
In einer bevorzugteren Ausführungsform ist NSF das Polypeptid, das durch die Datenbanken Codes P46459-1 oder P46459-2 kodiert wird, bevorzugt P46459-1. Datenbankencodes der entsprechenden cDNA sind NM_006178 (NCBI). In dieser Anmeldung stehen sämtliche zitierte Datenbanken Codes für die Uniprot-Datenbank oder sonstige Datenbanken, genauer für deren Version am Einreichungstag dieser Anmeldung oder ihrer frühesten Prioritätsanmeldung.
In einer bevorzugteren Ausführungsform ist STX1B das Polypeptid, das durch die Datenbanken Codes P61266-1 oder P61266-2, bevorzugt P61266-1 kodiert wird. Der Datenbankcode der entsprechenden cDNA ist NM_052874 (NCBI).
In einer bevorzugteren Ausführungsform ist VAMP2 das Polypeptid, das durch den Datenbank Code P63027-1 kodiert wird. Der Datenbankencode der entsprechenden cDNA ist NM_014232 (NCBI).
Die erfindungsgemäße Lehre kann nicht nur unter Verwendung von Polypeptiden, genauer einem Polypeptid umfassend die Wildtypsequenz eines Polypeptides ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder Nukleinsäuren, die die genauen Sequenzen, die in dieser Anmeldung ausdrücklich erwähnt werden, beispielsweise durch Funktionen, Name, Sequenz oder Zugangsnummer, oder implizit, ausgeführt werden, sondern auch unter Verwendung von Varianten solcher Polypeptiden oder Nukleinsäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform, kann der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet werden, wenigstens ein Fragment oder eine Vollängen-Sequenz bezeichnen, genauer eine oder mehr als eine Aminosäurensequenz oder Nukleinsäuresequenz, die relativ zur Vollängen-Sequenz an einem oder beiden Enden um wenigstens eine oder mehr als eine Aminosäure trunkiert ist. Ein solches Fragment umfasst oder kodiert für ein Peptid mit wenigstens 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 oder 600 aufeinander folgenden Aminosäuren der Originalsequenz oder einer Variante davon. Die Gesamtlänge der Variante kann wenigstens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 oder 600 oder mehr Aminosäuren betragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „Variante“ nicht nur wenigstens ein Fragment, sondern auch ein Polypeptid oder Fragment davon, das Aminosäuresequenzen umfasst, die zu wenigstens 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 or 99 % identisch zur Aminosäuresequenz oder des Fragments davon sind, auf die oder das ausdrücklich Bezug genommen wurde, wobei andere Aminosäuren als die für die biologische Aktivität essenziellen, beispielsweise die Fähigkeiten eines Antigens, an den (Auto)Antikörper zu binden, oder die Faltung oder Struktur des Polypeptides, deletiert oder substituiert wurden und/oder eine oder mehr als eine solche essenzielle Aminosäure auf konservative Weise ersetzt und/oder Aminosäuren derart hinzugefügt wurden, dass die biologische Aktivität des Polypeptides beibehalten wird. Der Stand der Technik umfasst verschiedene Verfahren, die verwendet werden können, um zwei gegebene Nukleinsäuren- oder Aminosäuren- Sequenzen zu alignen und das Ausmaß ihrer Identität zu berechnen, siehe zum Beispiel Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3rd edition. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die ClustalW- Software unter Verwendung der Grundeinstellungen eingesetzt (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Variante ein lineares, nicht gefaltetes Polypeptid, das optional denaturiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform können das Polypeptid und Varianten davon zusätzlich chemische Modifikationen enthalten, zum Beispiel isotopische Markierungen oder kovalente Modifikationen wie eine Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Decarboxylierung, Citrullinierung, Methylierung, Hydroxylierung und dergleichen. Der Fachmann ist mit Verfahren vertraut, um Polypeptide zu modifizieren. Jegliche Modifikation wird derart gestaltet, dass sie die biologische Aktivität der Variante nicht aufhebt.
Darüber hinaus können Varianten auch durch Fusion mit anderen bekannten Polypeptiden oder Varianten davon generiert werden und aktive Teile oder Domänen umfassen, zum Beispiel mit einer Sequenzidentität von wenigstens 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 %, wenn sie mit dem aktiven Teil der Referenz-Sequenz aligned werden, wobei der Begriff „aktiver Teil“ wie hierin verwendet, die Aminosäurensequenz bezeichnet, die kürzer als die Vollängen-Aminosäurensequenz ist, oder, im Falle einer Nukleinsäuresequenz, für weniger als die Vollängen-Aminosäurennsequenz kodiert, und/oder eine Variante der natürlichen Sequenz ist, aber wenigstens ein Teil der biologischen Aktivität behält.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante“ Nukleinsäuren des komplementären Stranges, der unter stringenten Bedingungen, an die Referenz- oder Wildtyp- Nucleinsäure hybridisiert. Die Stringenz von Hybridisierungsreaktionen kann von dem Fachmann leicht bestimmt werden und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, den Waschtemperaturen und der Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen gilt, dass längere Sonden höhere Temperaturen zum richtigen Annealen benötigen, wohingegen kürzere Sonden weniger hohe Temperatur benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit einer denaturierten DNA ab, erneut an den Komplementärenstränge in einer Umgebung unterhalb ihrer Schmelztemperatur zu anneltieren. Je höher das Ausmaß der erforderlichen Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierfähigen Sequenz, desto höher die relative Temperatur die verwendet werden kann. Als Ergebnis würden höhere relative Temperaturen dazu tendieren, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während eine geringere Temperatur dies in einem geringeren Grad bewirkt. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz und Hybridisierungsreaktion siehe Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Darüber hinaus kann der Fachmann den Instruktionen folgen, die im Manual von Boehringer Mannheim GmbH (1993) (The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany and in Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260) zur Frage, wie DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung identifiziert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden stringente Bedingungen für jegliche Hybridisierung angewandt, d.h. eine Hybridisierung tritt auf, wenn die Probe zu 70% oder mehr zur Zielsequenz identisch ist. Sonden mit einem geringeren Ausmaß an Identität mit Hinblick auf die Zielsequenz können hybridisieren, aber solche Hybride sind instabil und werden in einem Waschschritt unter stringenten Bedingungen entfernt, zum Beispiel bei Erniedrigen der Salzkonzentration auf 2 x SSC oder optional und dann nachfolgend 0,5 x SSC, während die Temperatur, mit zunehmender Bevorzugtheit, ungefähr 50°C - 68°C, ungefähr 52°C - 68°C, ungefähr 54°C - 68°C, ungefähr 56°C - 68°C, ungefähr 58°C - 68°C, ungefähr 60°C - 68°C, ungefähr 62°C - 68°C, ungefähr 64°C - 68°C, ungefähr 66°C - 68°C beträgt. In einer besonderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die Temperatur ungefähr 64°C - 68°C oder bevorzugt 66°C - 68°C. Es ist möglich, die Salzkonzentration auf 0.2 x SSC oder selbst 0.1 x SSC anzupassen. Nukleinsäuresequenzen mit einem Identitätsausmaß mit Hinblick auf die Referenz- oder Wildtyp Sequenz von wenigstens 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % können isoliert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „Variante einer Nukleinsäuresequenz“, wie hierin verwendet, eine jegliche Nukleinsäuresequenz, die für die gleiche Aminosäuresequenz und Varianten davon wie die Referenz-Nukleinsäuresequenz kodiert, entsprechend der Degeneriertheit des genetischen Codes.
Die Variante des Polypeptides weist biologische Aktivität auf. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei biologischer Aktivität um die Fähigkeit, an ein Autoantikörper zu binden, der gegen das jeweilige Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist, wie er in einem Patienten gefunden wird, der an einer Autoimmunkrankheit leidet, die mit einem solchen Autoantikörper assoziiert ist, bevorzugt assoziiert mit einer neurologischen Krankheit wie Stiff-Person-Syndrom, paraneoplastisches Stiff-Person-Syndrom, progressive Enzephalomyelitis mit Rigidität und Myoklonus und Enzephalitis, bevorzugt Stiff-Person-Syndrom assoziiert mit einem solchen Autoantikörper. Ob z.B. eine Variante von NSF eine solche biologische Aktivität hat, kann beispielsweise dadurch bestimmt werden, ob die interessierende Variante an einen Antikörper aus einer Patientenprobe mit einem Autoantikörper gegen Wildtyp-NSF bindet, bevorzugt wie bestimmt durch Westernblotting und/oder IFA, bevorzugt IFA, unter Verwendung von rekombinanten Proteinen wie in dem experimentellen Teil dieser Anmeldung beschrieben. Gleiches gilt für Varianten von STX1B und VAMP2.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, das ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder eine Variante davon umfassend den erfindungsgemäßen Autoantikörper, ist, kann beim Ausführen der erfindungsgemäßen Lehre in jeglicher Form und jeglicher Aufreinigungsstufe bereitgestellt werden, von flüssigen Proben, Geweben oder Zellen, die das Polypeptid in einer endogenen Form umfassen, bevorzugter Zellen, die das Polypeptid überexprimieren, kruden oder angereicherten Lysaten solcher Zellen, bis zu gereinigtem und/oder isoliertem Polypeptid, das optional im wesentlichen rein ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein natives Polypeptid, wobei der Begriff „natives Polypeptid“, wie hierin verwendet, ein gefaltetes Polypeptid, bevorzugter ein gefaltetes Polypeptid aufgereinigt aus Geweben oder Zellen, bevorzugter aus Säugetierzellen oder -geweben, optional aus nicht-rekombinanten Geweben oder Zellen darstellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein rekombinantes Protein, wobei der Begriff „rekombinant“, wie hierin verwendet, ein Polypeptid bedeutet, das unter Verwendung von gentechnischen Methoden bei einer beliebigen Phase des Herstellungsprozesses hergestellt wurde, zum Beispiel durch Fusionieren einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, an einen starken Promotor zur Überexpression in Zellen oder Geweben oder durch Verändern der Polypeptid-Sequenz selbst. Der Fachmann ist mit Verfahren zum gentechnischen Verändern von Nukleinsäuren und von ihnen kodierten Polypeptiden vertraut (zum Beispiel beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall), sowie mit Methoden zum Produzieren und Aufreinigen nativer oder rekombinanter Proteine (zum Beispiel Handbooks „Strategies for Protein Purification“, „Antibody Purification“, „Purifying Challenging Proteins“ (2009/2010), published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009), Guide to Protein Purification). In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Polypeptid rein, wenn wenigstens 60, 70, 80, 90, 95 oder 99 % des Gesamtpolypeptides in der entsprechenden Probe aus dem Polypeptid besteht, wie mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Coomassie Blau-Färbung und Abschätzung mit dem bloßen Auge beurteilt wird. Falls das erfindungsgemäße Polypeptid in Form eines Gewebe bereitsgestellt wird, ist bevorzugt, dass das Gewebe ein Säugetier-Gewebe ist, zum Beispiel Gewebe vom Menschen, von der Ratte, vom Primaten, vom Esel, von der Maus, von der Ziege, vom Pferd, vom Schaf, vom Schwein, oder von der Kuh, bevorzugt, Gehirngewebe, am bevorzugtesten Cerebellum. Wenn ein Zelllysat verwendet wird, dann ist es bevorzugt, das Zelllysat die Membranen umfasst, die mit der Oberfläche der Zelle assoziiert sind, oder tatsächlich eine an Membranen angereicherte Fraktion darstellt. Wenn das Polypeptid in Form einer rekombinanten Zelle bereitgestellt wird, ist bevorzugt, dass die rekombinante Zelle eine eukaryotische Zelle wie eine Hefezelle ist, bevorzugter eine Zelle aus einem multizellulären Eukaryonten wie einer Pflanze, einem Säugetier, Frosch oder Insekt, am bevorzugtesten aus einem Säugetier, zum Beispiel Ratte, Mensch, Primat, Esel, Maus, Ziege, Pferd, Schaf, Schwein oder Kuh.
Das Polypeptid, das zum Ausführen der erfindungsgemäßen Lehre eingesetzt wird, umfassend jegliche Varianten davon, ist bevorzugt derart beschaffen, dass es wenigstens ein Epitop umfasst, das von dem Autoantikörper erkannt wird, der an ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 bindet, oder dass es an ihn spezifisch bindet. Das Epitop ist bevorzugt ein Epitop, das nur von solch einem Autoantikörper erkannt wird und nicht von anderen Antikörpern als dem Autoantikörper gegen NSF, STX1B oder VAMP2. In einer solchen Ausführungsform fasst ein solches Epitop einen Abschnitt von 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder mehr, bevorzugt wenigstens 9, aber nicht mehr als 16, aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus NSF, STX1B beziehungsweise VAMP2. Der Fachmann ist vertraut mit Richtlinien zum Entwerfen von Peptiden, die ausreichend Immunogenizität haben, zum Beispiel wie sie in Jackson et al. (Jackson, D. C., Fitzmaurice, C. J., Brown, L. E., Zeng, W. (1999), Preparation and properties of totally synthetic immunogenes, Vaccine Volume 18, Issues 3-4, September 1999, Pages 355-361; and Black, M., Trent, A., Tirrell, M. and Olive, C. (2010), Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists, Expert Rev Vaccines, 2010 February; 9(2): 157-173) beschrieben sind. Kurz gesagt ist es wünschenswert, dass das Peptid so viele der folgenden Erfordernisse erfüllt wie möglich: (a) es ist stark hydrophil, (b) es umfasst mehr als einen Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aspartat, Prolin, Tyrosin und Phenylalanin, (c) zwecks höherer Spezifität hat es keine oder wenig Homologie mit anderen Peptiden oder Polypeptiden, (d) es muss ausreichend löslich sein und (e) es umfasst keine Glykosylierung- oder Phosphorylierungstellen, es sei denn, dass diese aus bestimmten Gründen erforderlich sind. Alternativ können bioinformatische Ansätze verfolgt werden, zum Beispiel die in Moreau et al. beschrieben sind (Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S., Laune, D., Granier, C. and Molina, F. (2008), PEPOP: Computational design of immunogenic peptides, BMC Bioinformatics 2008, 9:71). Falls das Polypeptid STX1B oder eine Variante davon ist, liegt das Epitop bevorzugt in SEQ ID NO5.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, das das Polypeptid aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B oder VAMP2 oder eine Variante davon umfasst, kann zur Ausführung der vorliegenden Erfindung in jeglicher Konformation bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid ein im Wesentlichen ungefaltetes, oder teilweise oder voll gefaltetes Polypeptid darstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid in den Sinne gefaltet, dass die für das Binden an den erfindungsgemäßen Autoantikörper erforderlichem Epitop in seiner oder ihrer Gesamtheit, die Faltung annehmen, die das native Protein in seiner natürlichen Umgebung annimmt. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Verfahren vertraut, die zum Bestimmen eingesetzt werden können, ob das Polypeptid gefaltet ist, und wenn es gefaltet ist, welche Struktur es annimmt, zum Beispiel limitierte Proteolyse, NMR-Spektroskopie, CD-Spektroskopie oder Röntgen-Kristallografie (siehe zum Beispiel Banaszak L. J. (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press, or Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer), wobei bevorzugt CD-Spektroskopie verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann ein Fusionsprotein sein, das andere Aminosäuresequenzen als die aus NSF, STX1B und VAMP2 umfasst, insbesondere ein C-terminales oder N-terminales Tag, bevorzugt ein C-terminales Tag, das in einer bevorzugten Ausführungsform, wie hierin verwendet wird, ein zusätzliches Sequenzmotiv oder ein Polypeptid umfasst, die irgendeine biologische oder physikalische Funktion aufweisen, und zum Beispiel umgesetzt werden können, um das erfindungsgemäße Polypeptid aufzureinigen, zu immobilisieren, zu präzipitieren oder zu identifizieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Tag eine Sequenz oder Domäne, die in der Lage ist, spezifisch an einen Liganden zu binden, zum Beispiel ein Tag ausgewählt aus der Gruppe umfassend His-Tags, Thioredoxin, Maltose bindendes Protein, Glutathion-S-Transferase, ein Fluoreszenz Tag, zum Beispiel aus der Gruppe umfassend grünes fluoreszierendes Protein (GFP).
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann ein immobilisiertes Polypeptid sein. In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „immobilisiert“, wie hierin verwendet, ein Molekül, das an einen festen Träger gebunden ist, der in einer wässrigen Lösung unlöslich ist, bevorzugter über eine kovalente Bindung, elektrostatische Interaktion, Einkapselung oder Einschluß, zum Beispiel durch Denaturierung eines globulären Polypeptides in einem Gel, oder über hydrophobe Interaktion, am bevorzugtesten über eine oder mehr als eine kuvalente Bindung. Verschiedene geeignete Träger, zum Beispiel Papier, Polystyrol, Metall, Silikon oder Glasoberflächen, mikrofluidische Kanäle, Membranen, Beads wie magnetische Beads, Chromatographie-Säulenmedien, Biochips, Polyacrylamid Gele und dergleichen sind in der Literatur beschrieben, zum Beispiel in Kim, D., and Herr, A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. Auf diese Weise kann das immobilisierte Molekül zusammen mit dem unlöslichen Träger von einer wässrigen Lösung auf einfache Weise getrennt werden, zum Beispiel durch Filtrierung, Zentrifugieren oder Dekantieren. Ein immobilisiertes Molekül kann reversibel oder irreversibel immobilisiert sein. Zum Beispiel ist die Immobilisierung reversibel, wenn das Molekül mit dem Träger über eine ionische Interaktion interagiert, die durch Hinzufügen einer hohen Konzentration eines Salzes maskiert werden kann, oder wenn das Molekül über eine spaltbare kovalente Bindung wie eine Disulfidbrücke gebunden ist, die durch Hinzufügen von Thiol enthaltenen Reagenzien gespalten werden kann. Im Gegensatz dazu ist die Immobilisierung irreversibel, wenn das Molekül an dem Träger über eine kovalente Bindung befestigt ist, die nicht in wässriger Lösung gespalten werden kann, zum Beispiel eine Bindung, die durch Reaktion einer Epoxidgruppe und einer Amingruppe gebildet wird, wie sie häufig verwendet wird, um Lysinseitenketten an Affinitätssäulen zu binden. Das Protein kann indirekt immobilisiert werden, zum Beispiel durch Immobilisieren eines Antikörpers oder einer anderen Einheit mit Affinität an das Molekül, gefolgt von Bildung eines Komplexes mit der Wirkung, dass der Molekül-Antikörper Komplex immobilisiert ist. Verschiedene Möglichkeiten zum Immobilisieren von Molekülen sind in der Literatur beschrieben, zum Beispiel in Kim, D., Herr, and A. E. (2013), Protein immobilizsation techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. Zusätzlich sind verschiedene Reagenzien und Kits für Immobilisierungsreaktionen im Handel erhältlich, zum Beispiel von Pierce Biotechnology.
Es ist notwendig, dass die zur Diagnose im Wege des Nachweises von Autoantikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte Probe Antikörper aufweist, die auch als Immunglobuline bezeichnet werden. Typischerweise umfasst die Probe einer Körperflüssigkeit eine representative Auswahl der Gesamtheit der Immunglobuline des Patienten. Nach dem Bereitstellen kann die Probe jedoch weiteren Prozessierungsschritten unterworfen werden, die Fraktionierung, Zentrifugation, Anreichung oder Isolierung der Gesamtheit der Immunglobuline oder einer bestimmten Immunglobulinklasse des Patienten umfassen können und die relative Verteilung der Immunglobuline der verschiedenen Klassen beeinflussen können.
Die Reagenzien, Vorrichtungen, Verfahren und Verwendungen, die in dieser Anmeldung beschrieben sind, können zur Diagnose einer Krankheit verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Krankheit eine neurologische Krankheit. In einer bevorzugteren Ausführungsform bedeutet der Begriff „neurologische Krankheit“, wie hierin verwendet, eine Krankheit, die mit einem Defekt des Nervensystems verbunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Krankheit PNS sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „PNS“, Abkürzung für Paraneoplastisches Neurologisches Syndrom, wie hierin verwendet, eine systemische Störung, die indirekt durch die Anwesenheit eines Tumors verursacht wird, zum Beispiel als Ergebnis der Freisetzung von Substanzen wie Hormonen oder Cytokinen, die normalerweise von der Ausgangszelle des Tumors nicht hergestellt werden, oder die in einer erhöhten Konzentration hergestellt werden, oder die Herstellung und Freisetzung von biologisch aktiven Zellen. Es kann sein, dass der Tumor zu klein ist, um nachgewiesen werden zu können.
In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „Diagnose“, wie hierin verwendet, eine jegliche Prozedur, die darauf abzielt, Informationen zu erhalten, die für die Einschätzung, ob ein Patient an einer bestimmten Krankheit oder Störung in der Vergangenheit, zur Zeit der Diagnose oder in der Zukunft leidet bzw. mit höherer Wahrscheinlichkeit als die durchschnittliche Vergleichsperson, bevorzugt mit änlichen Symptomen, leiden wird, um herauszufinden, wie die Krankheit fortschreitet oder wahrscheinlich in der Zukunft fortschreiten wird, oder um das Ansprechen eines Patienten auf eine bestimmte Behandlung zu evaluieren, beispielsweise die Verabreichung von Immunsuppresiva. In anderen Worten umfasst der Begriff „Diagnose“ nicht nur das Diagnostizieren, sondern auch das Prognostizieren und/oder das Überwachen des Verlaufs einer Krankheit oder Störung.
In vielen Fällen ist das bloße Nachweisen, in anderen Worten das Bestimmen, ob nachweisbare Konzentrationen des Antikörpers in der Probe vorhanden sind oder nicht, für die Diagnose ausreichend. Wenn der Autoantikörper nachgewiesen werden kann, ist dies eine Information die für die Diagnose des Arztes wichtig ist und anzeigt, das seine erhöhte Wahrscheinlichkeit besteht, dass der Patient an der Krankheit leidet. In einer bevorzugten Ausführungsform gilt der Autoantikörper als nachweisbar, wenn er unter Verwendung von einem oder mehr als einem Verfahren ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immunpräzipitation, indirekte Immunfluoreszenz, ELISA oder Line Blot, bevorzugt Immunpräzipitation nachgewiesen werden kann. Die experimentellen Details sind wie in dem experimentellen Teil dieser Anmeldung beschrieben oder wie in Lehrbüchern oder praktischen Protokollen, wie sie zum frühesten Prioritätstag dieser Anmeldung verfügbar waren. In einer bevorzugten Ausführungsform, wird die relative Konzentration des Antikörpers im Serum bestimmt, im Vergleich zur Konzentration, die in einer durchschnittlichen gewöhnlichen Person gefunden werden. Während es in vielen Fällen ausreichend ist, festzustellen, ob die Autoantikörper in der Probe vorhanden oder nachweisbar sind, kann das Verfahren zum Erhalten nützlicher Informationen für die Diagnose umfassen, dass bestimmt wird, ob die Konzentration wenigstens 0.1, bevorzugt 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 oder 100000 Mal höher als die Konzentration ist, die in der gewöhnlichen gesunden Person gefunden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform, wird die relative Konzentration des Autoantikörpers unter Verwendung von einem oder mehr als einem Verfahren bestimmt, das aus der Gruppe umfassend semi-quantitative Immunpräzipitation, semi-quantitative indirekte Immunfluoreszenz, ELISA oder Line Blot, bevorzugt ELISA ausgewählt ist. Die experimentellen Details sind wie im experimentellen Teil dieser Anmeldung oder in Lehrbüchern oder praktischen Protokollen beschrieben, wie sie zum frühesten Prioritätstag dieser Anmeldung verfügbar waren.
Der Fachmann wird anerkennen, dass ein Arzt normalerweise nicht lediglich auf Basis eines einzelnen diagnostischen Parameters eine finale Schlussfolgerung ziehen wird, ob der Patient an einer Krankheit leidet oder wahrscheinlich daran leiden wird, sondern andere Aspekte in Betracht ziehen muss, zum Beispiel die Anwesenheit von anderen Autoantikörpern, Markern, Blutparametern, klinische Einschätzung der Symptome des Patienten oder den Ergebnissen einer Bildgebung oder anderen nicht invasive Verfahren wie Polysomnografie, um eine eindeutige Diagnose erstellen zu können. Vgl. Baenkler H. W. (2012), General aspects of autoimmune diagnostics, in Renz, H., Autoimmune diagnostics, 2012, de Gruyter, page 3. Der Wert eines diagnostischen Agens oder einer diagnostischen Methode mag ebenfalls in der Möglichkeit liegen, eine Krankheit ausschließen zu können, um damit die indirekte Diagnose einer anderen zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform entspricht die Bedeutung von Symptomen oder Krankheiten, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, dem Verständnis des Fachmanns zum Zeitpunkt des Anmeldetages oder, bevorzugt frühesten Prioritätstages, wie sie durch Lehrbücher oder wissenschaftliche Veröffentlichungen belegt wird.
Daher impliziert der Begriff „Diagnose“ bevorzugt nicht, dass die diagnostischen Verfahren oder Agenzien gemäß der vorliegenden Erfindung ein definitives Ergebnis liefern werden und ausreichend sind, um eine finale Diagnose auf Basis eines einzelnen Tests, geschweige denn Parameters zu erstellen, sondern einen Beitrag zu einer „differenziellen Diagnose“ leisten können, das heißt einem systematischen diagnostischen Vorgehen unter Betrachtung der Wahrscheinlichkeit einer Vielzahl von möglichen Krankheiten oder Störungen auf Basis einer Vielzahl diagnostischer Parameter. Dementsprechend kann das Verfahren, Polypeptid oder die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, optional zum Bestimmen, ob der Patient an einer Krankheit leidet, das Erhalten einer Probe von einem Patienten, bevorzugt einem menschlichen Patienten umfassend, das Bestimmen, ob ein Autoantikörper gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B and VAMP2, in der Probe vorhanden ist, wobei das Bestimmen durch Kontaktieren der Probe mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid ausgeführt wird und durch Nachweisen, ob eine Bindung zwischen dem Polypeptid und dem Autoantikörper stattfindet, bevorzugt unter Verwendung eines markierten sekundären Antikörpers, wobei der Autoantikörper an das Polypeptid bindet, wenn er in der Probe vorhanden ist, und dem Diagnostizieren und dem Erstellen der Diagnose, dass der Patient an der neurologischen Störung leidet oder mit höherer Wahrscheinlichkeit leidet, wenn die Anwesenheit des Autoantikörpers in der Probe nachgewiesen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das Nachweisen von mehr als einem Antikörper aus der Gruppe umfassend die Antikörper gegen jedes der Polypeptide NSF, STX1B, VAMP2, GAD65, GAD67, IA-2, ZNT8 und Amphiphysin, besonders bevorzugt das jeweilige humane Polypeptid. In einer bevorzugteren Ausführungsform, kann dieses umfassen a) Nachweisen eines Autoantikörpers aus der Gruppe umfassend einen Autoantikörper gegen eines oder mehr als eines der Polypeptide GAD65, GAD67, IA-2, ZNT8 and Amphiphysin, bevorzugt GAD65 and GAD67 und b) Nachweisen eines Antikörpers aus der Gruppe umfassend die Antikörper gegen eines oder mehr als eines der Polypeptide NSF, STX1B, VAMP2, bevorzugt NSF.
Der Begriff „Diagnose“ kann auch ein Verfahren oder ein Agens bezeichnen, das verwendet wird, um zwischen zwei oder mehr als zwei Störungen oder Krankheiten zu unterscheiden die mit ähnlichen oder identischen Symptomen assoziiert sind.
Der Begriff „Diagnose“ kann auch ein Verfahren oder ein Agens bezeichnen, das verwendet wird, um die vielversprechendste Behandlung für einen Patienten auszuwählen. In anderen Worten betrifft das Verfahren oder Agent das Auswählen eines Behandlungsprotokolls für eine Person. Zum Beispiel kann der Nachweis von Autoantikörpern anzeigen, dass eine immunsuppressive Therapie ausgewählt werden sollte, die das Verabreichen von einem oder mehr als einem immunsuppressiven Medikament an den Patienten umfassen kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Komplex umfassend einen Antikörper, bevorzugt Autoantikörper, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet. Ein solcher Komplex kann verwendet oder als Teil eines Verfahrens zum Diagnostizieren einer Krankheit nachgewiesen werden. Es kann eine flüssige Probe umfassend Antikörper von einem Patienten verwendet werden, um das Verfahren auszuführen, bei dem ein Autoantikörper gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2, nachzuweisen ist. Eine solche flüssige Probe kann irgendeine Körperflüssigkeit umfassend eine repräsentative Auswahl an Antikörpern aus der Person umfassen, bevorzugt eine Probe umfassend Antikörper der Immunglobulinklasse IgG von der Person. Zum Beispiel kann eine Probe Liquor, Blut oder Blutserum, Lymphflüssigkeit, interstitielle Flüssigkeit sein und ist bevorzugt Serum oder Liquor, bevorzugter Serum.
Der Schritt Kontaktieren einer flüssigen Probe umfassend Antikörper mit dem oder den erfindungsgemäßen Polypeptid beziehungsweise Polypeptiden kann durch Inkubieren einer immobilisierten Form des Polypeptides oder der Polypeptide in Anwesenheit der Probe, der Antikörper umfassenden Probe unter Bedingungen ausgeführt werden, die mit der Bildung eines Komplexes umfassend das Polypeptid und einen Antikörper, bevorzugt Autoantikörper, kompatibel sind, der oder die an das erfindungsgemäße Polypeptid bindet bzw. binden. Die flüssige Probe, in der Antikörper, die gegen das oder die erfindungsgemäßen Polypeptid(e) binden, abgereichert sind, kann anschließend entfernt werden, gefolgt von einem oder mehr als einem Waschschritt. Schließlich kann der Komplex umfassend den Antikörper oder die Antikörper und das Polypeptid oder die Polypeptide nachgewiesen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „Bedingungen, die mit der Bildung des Komplexes kompatibel sind“ Bedingungen, die das Ausbilden der spezifischen Antigen-Antikörper Interaktionen zum Aufbau des Komplexes umfassend das Polypeptid und den Antikörper gestatten. In einer bevorzugten Ausführungsform können solche Bedingungen das Inkubieren des Polypeptides in einer Probe verdünnt 1:100 in PBS-Puffer 30 Minuten lang bei 25 °C umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Autoantikörper“, wie hierin verwendet, einen Antikörper, der spezifisch an ein endogenes Molekül des Tieres, bevorzugt Säugetieres, bindet, das den Autoantikörper selbst herstellt, wobei die Konzentration des Autoantikörpers bevorzugt gegenüber dem Durchschnitt irgendwelcher Antikörper, die gegen ein solches endogenes Molekül binden, bevorzugt gegenüber einer gesunden Person, gegenüber erhöht ist. In einer bevorzugtesten Ausführungsform, ist der Autoantikörper ein Autoantikörper gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B and VAMP2.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist bevorzugt ein in vitro-Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Nachweis des Komplexes für die Prognose, Diagnose, Verfahren oder den Testkit gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immundiffusions-Tests, immunoelektrophoretische Tests, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinations-Tests, Immuntests mit Markierungen wie die aus der Gruppe umfassend radiomarkierte Immuntests, Enzymimmuntests, bevorzugt ELISA, Chemiluminszenz Immuntests und Immunfluoreszenztests, bevorzugt indirekte Immunfluoreszenztests. Der Fachmann ist mit solchen Verfahren vertraut, und sie sind auch im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Zane, H. D. (2001), Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, besonders in Kapitel 14.
Alternativ kann eine Probe umfassend Gewebe umfassend das erfindungsgemäß Polypeptid statt einer flüssigen Probe verwendet werden. Die Gewebeprobe stammt bevorzugt aus einem Gewebe umfassend endogenes Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2, bevorzugt exprimierend das Polypeptid in einem erhöhten Ausmaß gegenüber dem durchschnittlichen Gewebe in dem entsprechenden Organismus, bevorzugt dem menschlichen Körper. Eine solche Probe, die dann in der Form eines Gewebeschnittes fixiert auf einem Träger, zum Beispiel einem Objektträger für mikroskopische Analysen, vorliegen kann, kann dann mit dem erfindungsgemäßen Antikörper, bevorzugt Autoantikörper, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, kontaktiert werden. Der Antikörper wird bevorzugt markiert, um die Unterscheidung von endogenem Autoantikörper zu ermöglichen, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, sodass neu gebildete Komplexe mit Autoantikörpern aus einer nachfolgend kontaktierten Probe, der mit dem ersten Antikörper konkurriert, nachgewiesen und optional quantifiziert werden können. Wenn die Zahl der neu gebildeten Komplexe höher ist als die Zahl, die mit einer Probe von einer gesunden Person gefunden wird, ist es wahrscheinlich, dass die Person, von der die untersuchte Probe erhalten wurde, an der Krankheit leidet.
Jegliche Daten, die die Anwesenheit oder Abwesenheit des Komplexes umfassend den Antikörper und das erfindungsgemäße Polypeptid zeigen, können mit Referenzdaten verglichen werden. Zum Beispiel zeigt das Nachweisen des Komplexes an, dass der Patient, von dem die analysierte Probe erhalten wurde, an einer Krankheit litt, an ihr leidet oder in der Zukunft wahrscheinlich an der Krankheit leidet. Wenn ein Patient zuvor diagnostiziert wurde und das Verfahren zum Erhalten diagnostisch relevanter Informationen wieder durchgeführt wird, kann die Menge des Komplexes, die bei beiden Durchgängen erhalten wurden, korreliert werden, um das Fortschreiten der Krankheit und/oder den Erfolg einer Behandlung herauszufinden. Wird zum Beispiel gefunden, dass die Menge des Komplexes zugenommen hat, legt dies nahe, dass die Krankheit fortschreitet, sich wahrscheinlich in der Zukunft manifestieren wird und/oder das eine versuchte Behandlung nicht erfolgreich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Mikrotiterplatte, eine Membran, ein Blot wie ein Dotblot oder Linienblot eingesetzt, um das diagnostische Verfahren gemäß der Erfindung auszuführen. Der Fachmann ist mit dem experimentellen Aufbau vertraut, und dieser ist im Stand der Technik beschrieben (Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1- 2), 57-65; WO2013041540 ).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist für die Prognose, Diagnose, die Verfahren oder das Test Kit gemäß der erfindungsgemäßen Lehre die Verwendung von indirekter Immunfluoreszenz vorgesehen. Der Fachmann ist mit derartigen Techniken und der Zubereitung geeigneter Proben vertraut, und diese sind im Stand der Technik beschrieben ( US4647543 ; Voigt, J., Krause, C., Rohwäder, E, Saschenbrecker, S., Hahn, M., Danckwardt, M., Feirer, C., Ens, K, Fechner, K, Barth, E, Martinetz, T., and Stöcker, W. (2012), Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoantibodies on HEp-2 Cells," Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, doi:10.1155/2012/65105; Bonilla, E., Francis, L., Allam, F., et al., Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients, Clinical Immunology, vol. 124, no. 1, pp. 18-21, 2007). Geeignete Reagenzien, Vorrichtungen und Softwarepakete sind im Handel erhältlich, zum Beispiel von EUROIMMUN, Lübeck, Deutschland.
Eine Probe kann einem Test unterzogen werden, um zu bestimmen, ob nur ein Autoantikörper vorhanden ist, der ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B and VAMP2 bindet, vorhanden ist, aber es wird bevorzugt, das diagnostische Verfahren, Tests, Vorrichtungen und dergleichen vorsehen, dass die Anwesenheit von Autoantikörpern gegen ein oder mehr als ein zusätzliches Polypeptid bestimmt wird, bevorzugt betreffend neurologischer Autoimmunkrankheiten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, ATP1A3, NBC1, Neurochrondrin, CARPVIII, Zic4, Sox1, Ma, MAG, MP0, MBP, GAD65, amphiphysin, recoverin, GABA A receptor ( EP13189172.3 ), GABA B receptor ( EP2483417 ), glycine receptor, gephyrin, IgLON5 (2016/0349275), DPPX ( US2015/0247847 ), aquaporin-4, MOG, NMDA receptor, AMPA receptors, GRM1, GRM5, LGI1, VGCC und mGluR1 und CASPR2, wobei die Antigene bevorzugt immobilisiert sind, zum Beispiel an einer medizinischen Vorrichtung wie an einem Linienblot. In einer bveorzugteren Ausführungsform wird ein Autoantikörper gegen ein Polypeptid nachgewiesen, ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B, und VAMP2, sowie ein Autoantikörper gegen GAD65. Die diagnostisch relevanten Marker Neurochrondrin ( EP15001186 ), ITPR1 ( EP14003703.7 ), NBC1 ( EP14003958.7 ), ATP1A3, auch bezeichnet als die alpha 3-Untereinheit von menschlicher neuronaler Na(+)/K(+)- ATPase ( EP14171561.5 ), Flotillin1/2 ( EP3101424 ) and RGS8 ( EP17000666.2 ), gegen die Autoantikörper binden, von denen zusätzlich einer oder mehr als einer nachgewiesen werden kann, sind im Stand der Technik beschrieben.
Gemäß der erfindungsgemäßen Lehre, wird ein Antikörper, bevorzugt ein Autoantikörper, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, das für die Diagnose einer Krankheit verwendet wird, bereitgestellt. Der Fachmann auf dem Gebiet ist vertraut mit Verfahren zum Aufreinigen von Antikörpern, zum Beispiel denjenigen, die in Hermanson, G. T., Mallia, A. K., and Smith, P. K. (1992), Immobilized Affinity Ligand Techniques, San Diego: Academic Press, beschrieben sind. Kurz gesagt wird ein Antigen, das spezifisch gegen den interessierenden Autoantikörper bindet, wobei das Antigen das erfindungsgemäße Polypeptid ist, immobilisiert und verwendet, um über Affinitätschromatografie den interessierenden Autoantikörper aus einer geeigneten Quelle aufzureinigen. Eine flüssige Probe umfassend Antikörper aus einem Patienten, der an neurologischer Störung beziehungsweise Krankheit leidet, die mit dem Auftreten des Autoantikörpers assoziiert ist, kann als Quelle herangezogen werden.
Erfindungsgemäß wird ein Antikörper, zum Beispiel ein Autoantikörper bereitgestellt, der in der Lage ist, spezifisch an das erfindungsgemäße Polypeptid zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „Antikörper“, wie hierin verwendet, jegliche Immunglobulin-basierte bindende Einheiten, bevorzugt eine Einheit umfassend wenigstens eine schwere Kette und eine leichte Kette eines Immunglobulins, umfassend, wenn nicht begrenzt auf monoklonale und polyklonale Antikörper wie auch Varianten eines Antikörpers, insbesondere Fragmente, wobei die bindenden Einheiten in der Lage sind, gegen das entsprechende Antigen zu binden, bevorzugter spezifisch an es zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „spezifisch binden“, wie hierin verwendet, dass die Bindung stärker als eine Bindungsreaktion ist, die durch eine Dissoziationskonstante gekennzeichnet ist, die 1 × 10^-5 M, bevorzugter 1 × 10^-7 M, bevorzugter 1 × 10^-8 M, bevorzugter 1 × 10^-9 M, bevorzugter 1 × 10^-10 M, bevorzugter 1 × 10^-11 M, bevorzugter 1 × 10^-12 M beträgt, wie durch Surface Plasmon Resonanz unter Verwendung von Biacore-Ausrüstung bei 25°C in PBS Buffer bei pH 7 bestimmt wird.
Der Antikörper kann Teil einer Autoantikörperzubereitung sein, die heterogen ist, oder kann ein homogener Autoantikörper sein, wobei eine heterogene Zubereitung eine Vielzahl von verschiedenen Autoantikörper-Spezies umfasst, wie sie durch Zubereitung aus den Seren von menschlichen Donoren erhalten werden kann, beispielsweise durch Affinitätschromatografie unter Verwendung des immobilisierten Antigens, zum Aufreinigen irgendeines Autoantikörpers, der in der Lage ist, an das Antigen zu binden. Der Antikörper kann glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Verfahren vertraut, die zur Identifizierung, Produktion und Aufreinigung von Antikörpern und Varianten davon eingesetzt werden können, zum Beispiel diejenigen, die in EP 2 423 226 A2 und Referenzen darin beschrieben sind. Der Antikörper kann selbst oder in Kombination als diagnostischer Agent eingesetzt werden, zum Beispiel im Komplex mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Isolieren eines Antikörpers bereit, bevorzugt eines Autoantikörpers, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, umfassend die Schritte a) Kontaktieren einer Probe umfassend den Antikörper mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid, derart, dass ein Komplex gebildet wird, b) Isolieren des Komplexes, der in a) gebildet wird, c) Dissoziieren des Komplexes, der in Schritt b) isoliert wurde, und d) Abtrennen des Antikörpers von dem erfindungsgemäßen Polypeptid. Eine Probe von einem Patienten, der an der neuen neurologischen Störung leidet, die von den Erfindern identifiziert wurde, kann als Quelle für den Autoantikörper herangezogen werden. Geeignete Methoden sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in den Handbüchern „Affinitätschromatografie“, „Strategies for Protein Purification“ and „Antibody Purification“ (2009/2010), veröffentlicht von GE Healthcare Life Sciences, und in Philips, Terry, M., Analytical techniques in immunochemistry, 1992, Marcel Dekker, Inc.
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das erfindungsgemäße Polypeptid bereit, wobei die Zusammensetzung bevorzugt zur Verabreichung an ein Subjekt geeignet ist, bevorzugt ein Säugetier-Subjekt, bevorzugter ein Mensch. Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zum Beispiel oral, parenteral, über ein Inhalationsspray, topical, über Augentropfen, rektal, nasal, bukkal, vaginal oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden, wobei der Begriff „parenteral“, wie hierin verwendet, subkutane, intrakutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intralesionale und intrakraniale Injektions- oder Infusionstechniken umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in geeigneten Dosierungsformen bereitgestellt werden, zum Beispiel Kapseln, Tabletten und wässrigen Suspensionen und Lösungen, bevorzugt in steriler Form. Sie kann bei einem Behandlungsverfahren eingesetzt werden, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Polypeptides an ein Subjekt umfasst.
Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung wird eine medizinische diagnostische Vorrichtung umfassend, bevorzugt beschichtet mit einem Reagenz zum Detektieren des erfindungsgemäßen (Auto)Antikörpers und/oder das erfindungsgemäße Polypeptid bereitgestellt. Bevorzugt umfasst eine solche medizinische oder diagnostische Vorrichtung das erfindungsgemäße Polypeptid in einer Form, die das Kontaktieren des Polypeptides mit einer wässrigen Lösung, bevorzugter der flüssigen menschlichen Probe, in einer einfachen Weise gestattet. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Polypeptid auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert werden, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glasplatten oder -träger, Objektträger, Biochips, Mikrotiterplatten, Beads, zum Beispiel magnetische Beads, Apherese-Vorrichtungen, Chromatographie-Säulen, Membranen oder dergleichen. Beispielhafte medizinische Vorrichtungen umfassen Linienblots, Mikrotiterplatten, Glasträger für Mikroskopie, Beads, bevorzugt magnetische Beads, und Biochips. Zusätzlich zum erfindungsgemäßen Polypeptid kann die diagnostische Vorrichtung weitere Polypeptide umfassen, zum Beispiel Positiv- oder Negativ-Kontrollen wie Proben, die einen Antikörper gegen das interessierende Polypeptid enthalten bzw. nicht enthalten, oder andere bekannte Antigene, die gegen Autoantikörper von diagnostischem Wert binden, insbesondere betreffend andere Krankheiten, die mit einem oder mehr als einem identischen oder ähnlichen Symptom assoziiert sind.
Gemäß der erfindungsgemäßen Lehre wird ein Kit bereitgestellt, bevorzugt zum Diagnostizieren einer Krankheit. Ein solches Kit kann Instruktionen umfassen, die im Detail beschreiben, wie das Kit zu benutzen ist, sowie ein Mittel zum Kontaktieren des erfindungsgemäßen Polypeptides mit einer Körperflüssigkeitsprobe aus einem Subjekt, bevorzugt einem menschlichen Subjekt, zum Beispiel einen Line Blot, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid auf dem Line Blot immobilisiert ist. Weiterhin kann das Kit eine Positivkontrolle umfassen, zum Beispiel eine Charge Autoantikörper oder Rekombinantenantikörper, von dem bekannt ist, dass er gegen das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, und eine Negativkontrolle, zum Beispiel ein Protein, das keine nachweisbare Affinität zum erfindungsgemäßen Polypeptid hat, wie Rinderserumalbumin. Schließlich kann ein solches Kit eine Standardlösung des Antikörpers oder Antigens zum Erstellen einer Kalibrationskurve umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kit ein Mittel zum Detektieren eines Autoantikörpers, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, bevorzugt durch Nachweisen eines Komplexes umfassend das erfindungsgemäße Polypeptid und einen Antikörper, der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet. Ein solches Mittel ist bevorzugt ein Agens, das gegen den Komplex bindet und den Komplex modifiziert oder eine Markierung trägt, die den Komplex nachweisbar macht. Zum Beispiel kann ein solches Mittel ein markierter Antikörper sein, der gegen das Polypeptid an einer Bindungsstelle bindet, die sich von der Bindungsstelle unterscheidet, an die der primäre Autoantikörper bindet, oder der gegen eine konstante Region des primären Antikörpers bindet. Alternativ kann das Agens ein sekundärer Antikörper gegen NSF, STX1B oder VAMP2 sein, der gegen die konstante Region des Autoantikörpers bindet, bevorzugt ein sekundärer Antikörper, der für Säugetier-Antikörper der IgG-Klasse spezifisch ist. Eine Vielzahl von Verfahren und Mitteln zum Nachweisen eines solchen Komplexes ist im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Philips, Terry, M., Analytical techniques in immunochemistry, 1992, Marcel Dekker, Inc.
Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe NSF, STX1B und VAMP2 oder eine Variante davon, können hergestellt oder bereitgestellt werden in Form einer Zelle, die eine Nukleinsäure kodierend das Polypeptid umfasst und/oder exprimiert. Wenn eine Nukleinsäure umfassend eine Sequenz, die für das erfindungsgemäße Polypeptid oder eine Variante davon kodiert, verwendet wird, kann eine solche Nukleinsäure eine unmodifizierte Nukleinsäure sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die als solche nicht in der Natur vorkommt und verglichen zu einer natürlichen Nukleinsäure wenigstens eine Modifizierung umfasst, zum Beispiel ein Isotop enthält oder eine chemische Modifizierung, zum Beispiel eine Methylierung, eine Sequenzmodifizierung, eine Markierung oder dergleichen, die den synthetischen Ursprung anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure eine rekombinante Nukleinsäure oder, in einer bevorzugteren Ausführungsform, Teil eines Vektors, in dem sie funktionell verbunden mit einem Promotor ist, der die Expression, bevorzugt über Expression der Nukleinsäure gestattet. Der Fachmann ist mit einer Vielzahl von geeigneten Vektoren vertraut, die kommerziell erhältlich sind, zum Beispiel vom Origene. Zum Beispiel kann ein Vektor kodierend für Fusionskonstrukte mit einem C-terminalen GFP verwendet werden. Die Zelle kann eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle sein, bevorzugt eine eukaryotische Zelle, wie beispielweise eine Hefezelle, und ist bevorzugter eine Säugetierzelle, noch bevorzugter eine menschliche Zelle wie eine HEK293-Zelle. Beispiele für eine Säugetierzelle umfassen HEK293, CHO oder COS-7-Zellen. Die Zelle umfassend die Nukleinsäue kodierend für das erfindungsgemäße Polypeptid kann eine rekombinante Zelle sein oder eine isolierte Zelle, wobei der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass die Zelle derart angereichert ist, dass in ihrer Umgebung im Vergleich zum Wildtyp der Zelle oder dessen Umgebung weniger Zellen anderer Differenzierung oder Spezies oder tatsächlich gar keine anderen solcher Zellen anwesend sind.
Die erfindungsgemäße Lehre kann nicht lediglich für eine Diagnose aber auch zum Verhindern oder zum Behandeln einer Krankheit eingesetzt werden, genauer für ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln einer Krankheit, umfassend die Schritte a) Verringern der Konzentration von Autoantikörpern, die gegen das erfindungsgemäße Polypeptid binden, im Blut eines Subjekts und/oder b) Verabreichen von einer oder mehr als einer immunsuppressiven pharmazeutischen Substanz, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Rituximab, Prednisone, Methylprednisolon, Cyclophosphamid, Mycophenolatemofetil, intravenöse Immunoglobuline, FK506, Cyclosporin, Methotrexat und Azathioprie.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Mittels oder Reagenz für die Detektion eines Antikörpers gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder einer Nukleinsäure kodierend NSF, STX1B or VAMP2 oder eine Variante davon oder eines Vektors oder einer Zelle umfassend diese Nukleinsäure zur Herstellung eines Kits für die Diagnose einer Krankheit wie Stiff-Person-Syndrom bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann jegliches Verfahren oder jegliche Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung für einen nicht-diagnostischen Zweck beabsichtigt sein, insbesondere Bestimmen der Anwesenheit eines Autoantikörpers gegen ein Polypeptid selektiert aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 für eine andere Verwendung als das Diagnostizieren eines Patents. Zum Beispiel kann das Verfahren oder die Verwendung zum in vitro-Testbestimmen der Effizienz einer medizinischen Vorrichtung bestimmt sein, die dazu gestaltet ist, einen Autoantikörper aus dem Blut eines Patienten zu entfernen, wobei das Testen mit einer Flüssigkeit durchgeführt wird, die nicht Patientenblut ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein beliebiges Verfahren und eine beliebige Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Absicht verwendet werden, ein Autoantikörper-Profil zu generieren, bevorzugt zum Nachweisen einer Krankheit in einem Säugetier, bevorzugt einem Menschen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Verfahren oder eine Verwendung zum Nachweisen krankheits-assoziierter Marker in einer Probe aus Patienten verwendet werden, die unter einer neurologischen Krankheit leiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Kalibrieren eines diagnostischen Testsystems oder zum Bestätigen der Zuverlässigkeit und/oder ausreichenden Kapazität eines solchen Testsystems oder eines therapeutischen Systems zum Entfernen von Autoantikörpern aus dem Blut eines Patienten. Im Falle eines diagnostischen Testsystems, werden Autoantikörper nicht in der Probe eines Patienten nachgewiesen, der zu diagnostizieren ist, aber in einer künstlichen Lösung mit bekannter Zusammensetzung, insbesondere mit einer definierten, bekannten Konzentration des Antikörpers oder eines rekombinanten Antikörpers von bekannter Konzentration, der gegen das Autoantikörper bindet. Das diagnostische System kann jegliches System sein, das gestattet, dass den Nachweis von Autoantikörpern in einer Probe gestattet, beispielsweise eine medizinische diagnostische Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Im Falle eines therapeutischen Systems, z.B. eines Apparates zur Apharese, kann das Verfahren verwendet werden, um ein solches System zu entwickeln und seine Zuverlässigkeit und/oder Effizienz und/oder Kapazität zu testen. Zum Beispiel kann nach einem Aphareselauf oder davor eine Lösung umfassend eine bekannte Konzentration eines Antikörpers der gegen das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, mit dem System kontaktiert werden, und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann eingesetzt werden, um zu bestätigen, dass das System in der Lage ist, den Antikörper aus der Lösung zu entfernen.
1 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Cerebellum. Gefrierschnitte wurden mit Patientenseren (P1 1:32; P2 1:100) in einem ersten Schritt inkubiert, und mit Alexa488-markiertem Ziegen-anti-humanem IgG im zweiten Schritt. Eine glatte Färbung der molekularen und granulären Schicht des Cerebellums wurden erhalten, wobei die stärkste Reaktion bei der molekularen Schicht liegt.
2 zeigt eine Immunpräzipitation und Antigenidentifizierung. Lysate von Rattencerebellum wurden mit Patienten- oder Kontrollseren inkubiert. Die Immunkomplexe wurden mit mit Protein G beschichteten magnetischen Beads isoliert, mit SDS eluiert und einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen, gefolgt von (A) Anfärben mit kolloidalem Coomassie oder (B) Westernblot und Inkubation mit murinem anti-STX1B-Antikörper. Der Pfeil zeigt die Position des immunpräzipitierten Antigen bei etwa 33 kDa an.
3 zeigt die Verifizierung von STX1B als neuem Autoantigen über indirekte Immunfluoreszenz und Westernblot mit dem rekombinanten Antigen. (A) Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Aceton-fixierten mit STX1B oder zum Schein transfizierten HEK293-Zellen inkubiert mit Patienten-CSF (1:1) oder Seren (1:10) oder Serum einer gesunden Kontrollperson (1:10). (B) Westernblot mit STX1B(ic)-His und anti-His-Antikörper inkubierte Patientenseren (1:200) oder gesunden Kontrollseren (1:200). (C) Neutralisierung von Immunfluoreszenz Reaktion auf neuronalen Geweben. Patientenserum wurde mit Extrakten von HEK293-Zellen transfiziert mit STX1B oder mit leerem Vektor als Kontrolle vorinkubiert. Das Extrakt umfassend STX1B verhinderte die Immunreaktion.
4 zeigt die Bestimmung von Anti-STX1B über IFA und WB. Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von (A) Gewebeschnitten inkubiert mit Patientenseren (1:32) oder (B) Aceton-fixierten STX1B- oder zum Schein transfizierten HEK293-Zellen inkubiert mit Patientenserum (1:10) im ersten Schritt und mit Alexa488-markiertem Ziegen-anti-humanem IgG im zweiten Schritt. (C) Westernblot mit STX1B(ic)-His inkubiert mit Patientenseren (1:200) oder gesunden Kontrollseren (1:200).
5 zeigt die Verifizierung von NSF als dem neuen Autoantigen über Westernblot mit dem rekombinanten Antigen. Westernblot mit NSF-transfizierten HEK293-Zellextrakt inkubiert mit Anti-His, Patientenseren oder gesunden Kontrollseren (1:1000).
6 zeigt die Verifizierung von VAMP2 als neuem Autoantigen über indirekte Immunfluoreszenz mit dem rekombinanten Antigen. Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von (A) Gefrierschnitten inkubiert mit Patientenserum (1:32) oder (B) Aceton-fixierten VAMP2 oder zum Schein transfizierte HEK293-Zellen inkubiert mit Patientenserum oder einem gesunden Kontrollserum (1:10) im ersten Schritt, und mit Alexa488-markiertem Ziege-anti-humanes IgG im zweiten Schritt.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Reihe von Sequenzen, genauer

 SEQ ID 1 (NSF, UNIPROT)
 MAGRSMQAARCPTDELSLTNCAWNEKDFQSGQHVIVRTSPNHRYTFTLKTHPSWPGSIA
 FSLPQRKWAGLSIGQEIEVSLYTFDKAKQCIGTMTIEIDFLQKKSIDSNPYDTDKMAAEFIQQF
 NNQAFSVGQQLVFSFNEKLFGLLVKDIEAMDPSILKGEPATGKRQKIEVGLWGNSQVAFEK
 AENSSLNLIGKAKTKENRQSIINPDWNFEKMGIGGLDKEFSDIFRRAFASRVFPPEIVEQMGC
 KHVKGILLYGPPGCGKTLLARQIGKMLNAREPKWNGPEILNKYVGESEANIRKLFADAEEE
 QRRLGANSGLHIIIFDEIDAICKQRGSMAGSTGVHDTVVNQLLSKIDGVEQLNNILVIGMTNRP
 DLIDEALLRPGRLEVKMEIGLPDEKGRLQILHIHTARMRGHQLLSADVDIKELAVETKNFSGA
 ELEGLVRAAQSTAMNRHIKASTKVEVDMEKAESLQVTRGDFLASLENDIKPAFGTNQEDYA
 SYIMNGIIKWGDPVTRVLDDGELLVQQTKNSDRTPLVSVLLEGPPHSGKTALAAKIAEESNFP
 FIKICSPDKMIGFSETAKCQAMKKIFDDAYKSQLSCVVVDDIERLLDYVPIGPRFSNLVLQALL
 VLLKKAPPQGRKLLIIGTTSRKDVLQEMEMLNAFSTTIHVPNIATGEQLLEALELLGNFKDKER
 TTIAQQVKGKKVWIGIKKLLMLIEMSLQMDPEYRVRKFLALLREEGASPLDFD

 SEQID NO 2 (NSF, REC)
 MAGRSMQAARCPTDELSLTNCAWNEKDFQSGQHVIVRTSPNHRYTFTLKTHPSWPGSIA
 FSLPQRKWAGLSIGQEIEVSLYTFDKAKQCIGTMTIEIDFLQKKSIDSNPYDTDKMAAEFIQQF
 NNQAFSVGQQLVFSFNEKLFGLLVKDIEAMDPSILKGEPATGKRQKIEVGLWGNSQVAFEK
 AENSSLNLIGKAKTKENRQSIINPDWNFEKMGIGGLDKEFSDIFRRAFASRVFPPEIVEQMGC
 KHVKGILLYGPPGCGKTLLARQIGKMLNAREPKWNGPEILNKYVGESEANIRKLFADAEEE
 QRRLGANSGLHIIIFDEIDAICKQRGSMAGSTGVHDTVVNQLLSKIDGVEQLNNILVIGMTNRP
 DLIDEALLRPGRLEVKMEIGLPDEKGRLQILHIHTARMRGHQLLSADVDIKELAVETKNFSGA
 ELEGLVRAAQSTAMNRHIKASTKVEVDMEKAESLQVTRGDFLASLENDIKPAFGTNQEDYA
 SYIMNGIIKWGDPVTRVLDDGELLVQQTKNSDRTPLVSVLLEGPPHSGKTALAAKIAEESNFP
 FlKlCSPDKMlGFSETAKCQAMKKlFDDAYKSQLSCVVVDDlERLLDYVPlGPRFSNLVLQALL
 VLLKKAPPQGRKLLIIGTTSRKDVLQEMEMLNAFSTTIHVPNIATGEQLLEALELLGNFKDKER
 TTIAQQVKGKKVWIGIKKLLMLIEMSLQMDPEYRVRKFLALLREEGASPLDFD

 SEQ ID NO 3 (STX1B, UNIPROT)
 MKDRTQELRSAKDSDDEEEWHVDRDHFMDEFFEQVEEIRGCIEKLSEDVEQVKKQHSAIL
 AAPNPDEKTKQELEDLTADIKKTANKVRSKLKAIEQSIEQEEGLNRSSADLRIRKTQHSTLSR
 KFVEVMTEYNATQSKYRDRCKDRIQRQLEITGRTTTNEELEDMLESGKLAIFTDDIKMDSQM
 TKQALNEIETRHNEIIKLETSIRELHDMFVDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHSVDYVERAVSD
 TKKAVKYQSKARRKKIMIIICCWLGWLASSIGGTLGL

 SEQID NO 4 (STX1B, REC)
 MKDRTQELRSAKDSDDEEEWHVDRDHFMDEFFEQVEEIRGCIEKLSEDVEQVKKQHSAIL
 AAPNPDEKTKQELEDLTADIKKTANKVRSKLKAIEQSIEQEEGLNRSSADLRIRKTQHSTLSR
 KFVEVMTEYNATQSKYRDRCKDRIQRQLEITGRTTTNEELEDMLESGKLAIFTDDIKMDSQM
 TKQALNEIETRHNEIIKLETSIRELHDMFVDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHSVDYVERAVSD
 TKKAVKYQSKARRKKIMIIICCWLGWLASSIGGTLGL

 SEQID NO 5 (STX1B(ic)-His, REC)
 MKDRTQELRSAKDSDDEEEWHVDRDHFMDEFFEQVEEIRGCIEKLSEDVEQVKKQHSAIL
 AAPNPDEKTKQELEDLTADIKKTANKVRSKLKAIEQSIEQEEGLNRSSADLRIRKTQHSTLSR
 KFVEVMTEYNATQSKYRDRCKDRIQRQLEITGRTTTNEELEDMLESGKLAIFTDDIKMDSQM
 TKQALNEIETRHNEIIKLETSIRELHDMFVDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHSVDYVERAVSD
 TKKAVKYQSKARRKKLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO 6 (VAMP2, UNIPROT)
 MSATAATAPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEWDIMRVNVDKVLERDQKL
 SELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST

 SEQ ID NO 7 (VAMP2, REC)
 MSATAATAPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEWDIMRVNVDKVLERDQKL
 SELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST

 SEQID NO 8 (sense NSF)
 ATACGTCTCACATGGCGGGCCGGAGCATGCAAG

 SEQID NO 9 (asense NSF)
 TATCGTCTCCTCGATCAATCAAAATCAAGGGGGCTAG

 SEQID NO 10 (sense STX1B)
 ATACGTCTCACATGAAGGATCGGACTCAAGAGCTGC

 SEQID NO 11 (asense STX1B)
 ATACGTCTCCTCGAGCTACAAGCCCAGCGTCCCCCCAATG

 SEQID NO 12 (asense STX1B(ic)-His)
 ATACGTCTCCTCGAGTTTCTTCCTCCGGGCCTTGCTCTG

 SEQID NO 13 (sense VAMP2)
 ATACGTCTCTCATGTCTGCTACCGCTGCCACGGCCC

 SEQID NO 14 (asense VAMP2)
 ATACGTCTCCTCGAGTTAAGTGCTGAAGTAAACTATGATG

 SEQID NO 15 (pTriEx-1-NSF)
 TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCGGAGTTAATCCGG
 GACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATAAGAATTATTATCAAATCATTT
 GTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTTACAATCAAAGGAGATATACC
 ATGGCGGGCCGGAGCATGCAAGCGGCAAGATGTCCTACAGATGAATTATCTTTAACCAA
 TTGTGCAGTTGTGAATGAAAAGGATTTCCAGTCTGGCCAGCATGTGATTGTGAGGACCT
 CTCCCAATCACAGGTACACATTTACACTGAAGACACATCCATCGGTGGTTCCAGGGAGC
 ATTGCATTCAGTTTACCTCAGAGAAAATGGGCTGGGCTTTCTATTGGGCAAGAAATAGAA
 GTCTCCTTATATACATTTGACAAAGCCAAACAGTGTATTGGCACAATGACCATCGAGATT
 GATTTCCTGCAGAAAAAAAGCATTGACTCCAACCCTTATGACACCGACAAGATGGCAGC
 AGAATTTATTCAGCAATTCAACAACCAGGCCTTCTCAGTGGGACAACAGCTTGTCTTTAG
 CTTCAATGAAAAGCTTTTTGGCTTACTGGTGAAGGACATTGAAGCCATGGATCCTAGCAT
 CCTGAAGGGAGAGCCTGCGACAGGGAAAAGGCAGAAGATTGAAGTAGGACTGGTTGTT
 GGAAACAGTCAAGTTGCATTTGAAAAAGCAGAAAATTCGTCACTTAATCTTATTGGCAAA
 GCTAAAACCAAGGAAAATCGCCAATCAATTATCAATCCTGACTGGAACTTTGAAAAAATG
 GGAATAGGAGGTCTAGACAAGGAATTTTCAGATATTTTCCGACGAGCATTTGCTTCCCG
 AGTATTTCCTCCAGAGATTGTGGAGCAGATGGGTTGTAAACATGTTAAAGGCATCCTGTT
 ATATGGACCCCCAGGTTGTGGTAAGACTCTCTTGGCTCGACAGATTGGCAAGATGTTGA
 ATGCAAGAGAGCCCAAAGTGGTCAATGGGCCAGAAATCCTTAACAAATATGTGGGAGAA
 TCAGAGGCTAACATTCGCAAACTTTTTGCTGATGCTGAAGAGGAGCAAAGGAGGCTTGG
 TGCTAACAGTGGTTTGCACATCATCATCTTTGATGAAATTGATGCCATCTGCAAGCAGAG
 AGGGAGCATGGCTGGTAGCACGGGAGTTCATGACACTGTTGTCAACCAGTTGCTGTCC
 AAAATTGATGGCGTGGAGCAGCTAAACAACATCCTAGTCATTGGAATGACCAATAGACC
 AGATCTGATAGATGAGGCTCTTCTTAGACCTGGAAGACTGGAAGTTAAAATGGAGATAG
 GCTTGCCAGATGAGAAAGGCCGACTACAGATTCTTCACATCCACACAGCAAGAATGAGA
 GGGCATCAGTTACTCTCTGCTGATGTAGACATTAAAGAACTGGCCGTGGAGACCAAGAA
 TTTCAGTGGTGCTGAATTGGAGGGTCTAGTGCGAGCAGCCCAGTCCACTGCTATGAATA
 GACACATAAAGGCCAGTACTAAAGTGGAAGTGGACATGGAGAAAGCAGAAAGCCTGCA
 AGTGACGAGAGGAGACTTCCTTGCTTCTTTGGAGAATGATATCAAACCAGCCTTTGGCA
 CAAACCAAGAAGATTATGCAAGTTACATTATGAACGGTATCATCAAATGGGGTGACCCA
 GTTACTCGAGTTCTAGATGATGGGGAGCTGCTGGTGCAGCAGACTAAGAACAGTGACC
 GCACACCATTGGTCAGCGTGCTTCTGGAAGGCCCTCCTCACAGTGGGAAGACTGCTTT
 AGCTGCAAAAATTGCAGAGGAATCCAACTTCCCATTCATCAAGATCTGTTCTCCTGATAA
 AATGATTGGCTTTTCTGAAACAGCCAAATGTCAGGCCATGAAGAAGATCTTTGATGATGC
 GTACAAATCCCAGCTCAGTTGTGTGGTTGTGGATGACATTGAGAGATTGCTTGATTACG
 TCCCTATTGGCCCTCGATTTTCAAATCTTGTATTACAGGCTCTTCTCGTTTTACTGAAAAA
 GGCACCTCCTCAGGGCCGCAAGCTTCTTATCATTGGGACCACTAGCCGCAAAGATGTC
 CTTCAGGAGATGGAAATGCTTAACGCTTTCAGCACCACCATCCACGTGCCCAACATTGC
 CACAGGAGAGCAGCTGTTGGAAGCTTTGGAGCTTTTGGGCAACTTCAAGGATAAGGAA
 CGCACCACAATTGCACAGCAAGTCAAAGGGAAGAAGGTCTGGATAGGAATCAAGAAGTT
 ACTAATGCTGATCGAGATGTCCCTACAGATGGATCCTGAATACCGTGTGAGAAAATTCTT
 GGCCCTCTTAAGAGAAGAAGGAGCTAGCCCCCTTGATTTTGATTGATCGAGCACCACCA
 TCACCATCACCATCACTAAGTGATTAACCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGT
 GGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCGATCTTTTTCCCTCT
 GCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG
 GAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACA
 TATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACA
 TATGCCCATATGTAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTT
 TTTGCTGAAAGCATGCGGAGGAAATTCTCCTTGAAGTTTCCCTGGTGTTCAAAGTAAAG
 GAGTTTGCACCAGACGCACCTCTGTTCACTGGTCCGGCGTATTAAAACACGATACATTG
 TTATTAGTACATTTATTAAGCGCTAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGT
 ACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCA
 AATGATTTTCAGCGTCTTTATATCTGAATTTAAATATTAAATCCTCAATAGATTTGTAAAAT
 AGGTTTCGATTAGTTTCAAACAAGGGTTGTTTTTCCGAACCGATGGCTGGACTATCTAAT
 GGATTTTCGCTCAACGCCACAAAACTTGCCAAATCTTGTAGCAGCAATCTAGCTTTGTCG
 ATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTGTAATAAAGGTTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTT
 TTGTATTTCTTTCATCACTGTCGTTAGTGTACAATTGACTCGACGTAAACACGTTAAATAG
 AGCTTGGACATATTTAACATCGGGCGTGTTAGCTTTATTAGGCCGATTATCGTCGTCGTC
 CCAACCCTCGTCGTTAGAAGTTGCTTCCGAAGACGATTTTGCCATAGCCACACGACGCC
 TATTAATTGTGTCGGCTAACACGTCCGCGATCAAATTTGTAGTTGAGCTTTTTGGAATTA
 TTTCTGATTGCGGGCGTTTTTGGGCGGGTTTCAATCTAACTGTGCCCGATTTTAATTCAG
 ACAACACGTTAGAAAGCGATGGTGCAGGCGGTGGTAACATTTCAGACGGCAAATCTACT
 AATGGCGGCGGTGGTGGAGCTGATGATAAATCTACCATCGGTGGAGGCGCAGGCGGG
 GCTGGCGGCGGAGGCGGAGGCGGAGGTGGTGGCGGTGATGCAGACGGCGGTTTAGG
 CTCAAATGTCTCTTTAGGCAACACAGTCGGCACCTCAACTATTGTACTGGTTTCGGGCG
 CCGTTTTTGGTTTGACCGGTCTGAGACGAGTGCGATTTTTTTCGTTTCTAATAGCTTCCA
 ACAATTGTTGTCTGTCGTCTAAAGGTGCAGCGGGTTGAGGTTCCGTCGGCATTGGTGGA
 GCGGGCGGCAATTCAGACATCGATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGCGCTGGAATGTTA
 GGCACGGGAGAAGGTGGTGGCGGCGGTGCCGCCGGTATAATTTGTTCTGGTTTAGTTT
 GTTCGCGCACGATTGTGGGCACCGGCGCAGGCGCCGCTGGCTGCACAACGGAAGGTC
 GTCTGCTTCGAGGCAGCGCTTGGGGTGGTGGCAATTCAATATTATAATTGGAATACAAA
 TCGTAAAAATCTGCTATAAGCATTGTAATTTCGCTATCGTTTACCGTGCCGATATTTAACA
 ACCGCTCAATGTAAGCAATTGTATTGTAAAGAGATTGTCTCAAGCTCGGAACGCTGCGC
 TCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTAT
 CCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC
 CAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGAC
 GAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA
 GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCC
 GCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCT
 CACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCA
 CGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCC
 AACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA
 GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTA
 CACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAA
 GAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTT
 TGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGTTACCAAT
 GCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCT
 GACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGC
 TGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC
 CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTC
 TATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGT
 TGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCA
 GCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCG
 GTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACT
 CATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTC
 TGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTT
 GCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTG
 CTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAG
 ATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCAC
 CAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGG
 GCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATC
 AGGGTTATTGTCTCATGTCCGCGCGTTTCCTGCATCTTTTAATCAAATCCCAAGATGTGT
 ATAAACCACCAAACTGCCAAAAAATGAAAACTGTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGC
 AACTGCAAGGGTCTCAATCCTATTTGTAATTATTGAATAATAAAACAATTATAAATGTCAA
 ATTTGTTTTTTATTAACGATACAAACCAAACGCAACAAGAACATTTGTAGTATTATCTATA
 ATTGAAAACGCGTAGTTATAATCGCTGAGGTAATATTTAAAATCATTTTCAAATGATTCAC
 AGTTAATTTGCGACAATATAATTTTATTTTCACATAAACTAGACGCCTTGTCGTCTTCTTC
 TTCGTATTCCTTCTCTTTTTCATTTTTCTCTTCATAAAAATTAACATAGTTATTATCGTATC
 CATATATGTATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGTTGTCATAAATATATATGTCTTTTTTA
 ATGGGGTGTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCTGTAATTTACAACAGTGCTATTTTCT
 GGTAGTTCTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAATTTATATAATCAATGAATTTGGGAT
 CGTCGGTTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGCTTCTTCTAGTTCAATTACAC
 CATTTTTTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCAAAATGTTGTACGAACCGTTAAACA
 AAAACAGTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGCGAGCAGTTGTTTGTTGTTAAAAAT
 AACAGCCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAACTGGAAATGTCTATCAATAT
 ATAGTTGCTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATAT
 GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGAC
 CCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT
 CCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAG
 TGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG
 CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTA
 GTCATCGCTATTACCATGCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCA
 TCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGC
 GATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGA
 GGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCG
 CTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAA
 GCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGC
 CGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAG
 CGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTTCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTT
 GTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCG
 GGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGG
 GCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACC
 ATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGT
 CTCATCATTTTGGCAAAGAATTGGATCGGACCGAAAT

 SEQID NO 16 (pTriEx-1-STX1B)
 GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCG
 CCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCC
 TTCTCCTTCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCT
 GCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGG
 GGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCG
 GCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTC
 TTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA
 GAATTGGATCGGACCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACA
 ATTCCCCGGAGTTAATCCGGGACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATA
 AGAATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTT
 ACAATCAAAGGAGATATACCATGAAGGATCGGACTCAAGAGCTGCGGAGTGCGAAAGA
 CAGTGATGATGAAGAGGAGGTGGTCCACGTGGATCGGGACCACTTCATGGATGAGTTC
 TTTGAACAGGTGGAAGAGATCCGGGGCTGCATTGAGAAACTGTCGGAGGATGTGGAGC
 AGGTGAAAAAACAGCATAGCGCCATCCTGGCCGCACCCAACCCAGATGAGAAGACCAA
 ACAGGAGCTGGAGGATCTCACTGCAGACATCAAGAAGACGGCCAACAAGGTTCGGTCC
 AAATTGAAAGCGATCGAGCAAAGCATTGAACAGGAGGAGGGGCTGAACCGTTCCTCCG
 CGGACCTGCGCATCCGCAAGACCCAGCACTCCACACTGTCCCGGAAGTTCGTGGAGGT
 AATGACCGAATATAACGCGACCCAGTCCAAGTACCGGGACCGCTGCAAGGACCGGATC
 CAGCGGCAACTGGAGATCACTGGAAGGACCACCACCAACGAAGAACTGGAAGACATGC
 TGGAGAGCGGGAAGCTGGCCATCTTCACAGATGACATCAAAATGGACTCACAGATGAC
 GAAGCAGGCGCTGAATGAGATTGAGACGAGGCACAATGAGATCATCAAGCTGGAGACC
 AGCATCCGCGAGCTGCACGATATGTTTGTGGACATGGCCATGCTCGTAGAGAGCCAGG
 GAGAGATGATTGACCGCATCGAGTACAACGTGGAACATTCTGTGGACTACGTGGAGCG
 AGCTGTGTCTGACACCAAGAAAGCAGTGAAATATCAGAGCAAGGCCCGGAGGAAGAAA
 ATCATGATCATCATTTGCTGTGTGGTGCTGGGGGTGGTCTTGGCGTCGTCCATTGGGG
 GGACGCTGGGCTTGTAGCTCGAGCACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGATTAAC
 CTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA
 CAAATACCACTGAGATCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGC
 CCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT
 GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATC
 AGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGTAACTAGCATAACCCC
 TTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGCATGCGGAGGAAATTCT
 CCTTGAAGTTTCCCTGGTGTTCAAAGTAAAGGAGTTTGCACCAGACGCACCTCTGTTCA
 CTGGTCCGGCGTATTAAAACACGATACATTGTTATTAGTACATTTATTAAGCGCTAGATT
 CTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAA
 TCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCAAATGATTTTCAGCGTCTTTATATCTGAATT
 TAAATATTAAATCCTCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTAGTTTCAAACAAGGGTTG
 TTTTTCCGAACCGATGGCTGGACTATCTAATGGATTTTCGCTCAACGCCACAAAACTTGC

 CAAATCTTGTAGCAGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTGTAATAAA
 GGTTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTTTTGTATTTCTTTCATCACTGTCGTTAGTGT
 ACAATTGACTCGACGTAAACACGTTAAATAGAGCTTGGACATATTTAACATCGGGCGTGT
 TAGCTTTATTAGGCCGATTATCGTCGTCGTCCCAACCCTCGTCGTTAGAAGTTGCTTCC
 GAAGACGATTTTGCCATAGCCACACGACGCCTATTAATTGTGTCGGCTAACACGTCCGC
 GATCAAATTTGTAGTTGAGCTTTTTGGAATTATTTCTGATTGCGGGCGTTTTTGGGCGGG
 TTTCAATCTAACTGTGCCCGATTTTAATTCAGACAACACGTTAGAAAGCGATGGTGCAGG
 CGGTGGTAACATTTCAGACGGCAAATCTACTAATGGCGGCGGTGGTGGAGCTGATGAT
 AAATCTACCATCGGTGGAGGCGCAGGCGGGGCTGGCGGCGGAGGCGGAGGCGGAGG
 TGGTGGCGGTGATGCAGACGGCGGTTTAGGCTCAAATGTCTCTTTAGGCAACACAGTC
 GGCACCTCAACTATTGTACTGGTTTCGGGCGCCGTTTTTGGTTTGACCGGTCTGAGACG
 AGTGCGATTTTTTTCGTTTCTAATAGCTTCCAACAATTGTTGTCTGTCGTCTAAAGGTGCA
 GCGGGTTGAGGTTCCGTCGGCATTGGTGGAGCGGGCGGCAATTCAGACATCGATGGT
 GGTGGTGGTGGTGGAGGCGCTGGAATGTTAGGCACGGGAGAAGGTGGTGGCGGCGG
 TGCCGCCGGTATAATTTGTTCTGGTTTAGTTTGTTCGCGCACGATTGTGGGCACCGGCG
 CAGGCGCCGCTGGCTGCACAACGGAAGGTCGTCTGCTTCGAGGCAGCGCTTGGGGTG
 GTGGCAATTCAATATTATAATTGGAATACAAATCGTAAAAATCTGCTATAAGCATTGTAAT
 TTCGCTATCGTTTACCGTGCCGATATTTAACAACCGCTCAATGTAAGCAATTGTATTGTA
 AAGAGATTGTCTCAAGCTCGGAACGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTA
 TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAA
 GAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTG
 GCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCA
 GAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCC
 CTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCC
 TTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGG
 TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGC
 CTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG
 CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTT
 CTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTC
 TGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACC
 ACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGG
 ATCTCAAGAAGATCCTTTGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCT
 GTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGG
 GAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGG
 CTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCC
 TGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAG
 TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCAC
 GCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACA
 TGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAG
 AAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTAC
 TGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG
 AGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACC
 GCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAA
 ACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCA
 ACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGG
 CAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTT
 CCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGTCCGCGCGTTTCCTG
 CATCTTTTAATCAAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAACTGCCAAAAAATGAAAACT
 GTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGCAACTGCAAGGGTCTCAATCCTATTTGTAATTAT
 TGAATAATAAAACAATTATAAATGTCAAATTTGTTTTTTATTAACGATACAAACCAAACGCA
 ACAAGAACATTTGTAGTATTATCTATAATTGAAAACGCGTAGTTATAATCGCTGAGGTAAT
 ATTTAAAATCATTTTCAAATGATTCACAGTTAATTTGCGACAATATAATTTTATTTTCACAT
 AAACTAGACGCCTTGTCGTCTTCTTCTTCGTATTCCTTCTCTTTTTCATTTTTCTCTTCATA
 AAAATTAACATAGTTATTATCGTATCCATATATGTATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGT
 TGTCATAAATATATATGTCTTTTTTAATGGGGTGTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCT
 GTAATTTACAACAGTGCTATTTTCTGGTAGTTCTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAA
 TTTATATAATCAATGAATTTGGGATCGTCGGTTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTAC
 GCAGCTTCTTCTAGTTCAATTACACCATTTTTTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCA
 AAATGTTGTACGAACCGTTAAACAAAAACAGTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGC
 GAGCAGTTGTTTGTTGTTAAAAATAACAGCCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCA
 CAAACTGGAAATGTCTATCAATATATAGTTGCTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG
 GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC
 GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCC
 ATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACT
 GCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAA
 TGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTA
 CTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCATGGTCGAGGTGAGCCC
 CACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATT
 TATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCC
 AGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGC
 GGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCG
 GCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG

 SEQID NO 17 (pTriEx-1-STX1B(ic)-His)
 GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCG
 CCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCC
 TTCTCCTTCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCT
 GCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGG
 GGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCG
 GCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTC
 TTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA
 GAATTGGATCGGACCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACA
 ATTCCCCGGAGTTAATCCGGGACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATA
 AGAATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTT
 ACAATCAAAGGAGATATACCATGAAGGATCGGACTCAAGAGCTGCGGAGTGCGAAAGA
 CAGTGATGATGAAGAGGAGGTGGTCCACGTGGATCGGGACCACTTCATGGATGAGTTC
 TTTGAACAGGTGGAAGAGATCCGGGGCTGCATTGAGAAACTGTCGGAGGATGTGGAGC
 AGGTGAAAAAACAGCATAGCGCCATCCTGGCCGCACCCAACCCAGATGAGAAGACCAA
 ACAGGAGCTGGAGGATCTCACTGCAGACATCAAGAAGACGGCCAACAAGGTTCGGTCC
 AAATTGAAAGCGATCGAGCAAAGCATTGAACAGGAGGAGGGGCTGAACCGTTCCTCCG
 CGGACCTGCGCATCCGCAAGACCCAGCACTCCACACTGTCCCGGAAGTTCGTGGAGGT
 AATGACCGAATATAACGCGACCCAGTCCAAGTACCGGGACCGCTGCAAGGACCGGATC
 CAGCGGCAACTGGAGATCACTGGAAGGACCACCACCAACGAAGAACTGGAAGACATGC
 TGGAGAGCGGGAAGCTGGCCATCTTCACAGATGACATCAAAATGGACTCACAGATGAC
 GAAGCAGGCGCTGAATGAGATTGAGACGAGGCACAATGAGATCATCAAGCTGGAGACC
 AGCATCCGCGAGCTGCACGATATGTTTGTGGACATGGCCATGCTCGTAGAGAGCCAGG
 GAGAGATGATTGACCGCATCGAGTACAACGTGGAACATTCTGTGGACTACGTGGAGCG
 AGCTGTGTCTGACACCAAGAAAGCAGTGAAATATCAGAGCAAGGCCCGGAGGAAGAAA
 CTCGAGCACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGATTAACCTCAGGTGCAGGCTGCC
 TATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATC
 GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACT
 TCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCT
 CACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTT
 AGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGTAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGG
 GTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGCATGCGGAGGAAATTCTCCTTGAAGTTTCCCTGG
 TGTTCAAAGTAAAGGAGTTTGCACCAGACGCACCTCTGTTCACTGGTCCGGCGTATTAA
 AACACGATACATTGTTATTAGTACATTTATTAAGCGCTAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTA
 CAGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCTTTAGGGTGGTATGTT
 AGAGCGAAAATCAAATGATTTTCAGCGTCTTTATATCTGAATTTAAATATTAAATCCTCAA
 TAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTAGTTTCAAACAAGGGTTGTTTTTCCGAACCGATGG
 CTGGACTATCTAATGGATTTTCGCTCAACGCCACAAAACTTGCCAAATCTTGTAGCAGCA
 ATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTGTAATAAAGGTTCGACGTCGTTCAA
 AATATTATGCGCTTTTGTATTTCTTTCATCACTGTCGTTAGTGTACAATTGACTCGACGTA
 AACACGTTAAATAGAGCTTGGACATATTTAACATCGGGCGTGTTAGCTTTATTAGGCCGA
 TTATCGTCGTCGTCCCAACCCTCGTCGTTAGAAGTTGCTTCCGAAGACGATTTTGCCATA
 GCCACACGACGCCTATTAATTGTGTCGGCTAACACGTCCGCGATCAAATTTGTAGTTGA
 GCTTTTTGGAATTATTTCTGATTGCGGGCGTTTTTGGGCGGGTTTCAATCTAACTGTGCC
 CGATTTTAATTCAGACAACACGTTAGAAAGCGATGGTGCAGGCGGTGGTAACATTTCAG
 ACGGCAAATCTACTAATGGCGGCGGTGGTGGAGCTGATGATAAATCTACCATCGGTGG
 AGGCGCAGGCGGGGCTGGCGGCGGAGGCGGAGGCGGAGGTGGTGGCGGTGATGCA
 GACGGCGGTTTAGGCTCAAATGTCTCTTTAGGCAACACAGTCGGCACCTCAACTATTGT
 ACTGGTTTCGGGCGCCGTTTTTGGTTTGACCGGTCTGAGACGAGTGCGATTTTTTTCGT
 TTCTAATAGCTTCCAACAATTGTTGTCTGTCGTCTAAAGGTGCAGCGGGTTGAGGTTCC
 GTCGGCATTGGTGGAGCGGGCGGCAATTCAGACATCGATGGTGGTGGTGGTGGTGGA
 GGCGCTGGAATGTTAGGCACGGGAGAAGGTGGTGGCGGCGGTGCCGCCGGTATAATT
 TGTTCTGGTTTAGTTTGTTCGCGCACGATTGTGGGCACCGGCGCAGGCGCCGCTGGCT
 GCACAACGGAAGGTCGTCTGCTTCGAGGCAGCGCTTGGGGTGGTGGCAATTCAATATT
 ATAATTGGAATACAAATCGTAAAAATCTGCTATAAGCATTGTAATTTCGCTATCGTTTACC
 GTGCCGATATTTAACAACCGCTCAATGTAAGCAATTGTATTGTAAAGAGATTGTCTCAAG
 CTCGGAACGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAG
 GCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAA
 AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAG
 GCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAAC
 CCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTC
 CTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGT
 GGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCA
 AGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAA
 CTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG
 GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTG
 GCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG
 TTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGC
 GGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGA
 TCCTTTGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTT
 CATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCA
 TCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
 CAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATC
 CGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTA
 ATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTT
 GGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCAT
 GTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGG
 CCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCAT
 CCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA
 TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAG
 CAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGA
 TCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCA
 GCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGC
 AAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATA
 TTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGTCCGCGCGTTTCCTGCATCTTTTAATC
 AAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAACTGCCAAAAAATGAAAACTGTCGACAAGCTC
 TGTCCGTTTGCTGGCAACTGCAAGGGTCTCAATCCTATTTGTAATTATTGAATAATAAAA
 CAATTATAAATGTCAAATTTGTTTTTTATTAACGATACAAACCAAACGCAACAAGAACATT
 TGTAGTATTATCTATAATTGAAAACGCGTAGTTATAATCGCTGAGGTAATATTTAAAATCA
 TTTTCAAATGATTCACAGTTAATTTGCGACAATATAATTTTATTTTCACATAAACTAGACGC
 CTTGTCGTCTTCTTCTTCGTATTCCTTCTCTTTTTCATTTTTCTCTTCATAAAAATTAACAT
 AGTTATTATCGTATCCATATATGTATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGTTGTCATAAATA
 TATATGTCTTTTTTAATGGGGTGTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCTGTAATTTACAA
 CAGTGCTATTTTCTGGTAGTTCTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAATTTATATAATC
 AATGAATTTGGGATCGTCGGTTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGCTTCTTC
 TAGTTCAATTACACCATTTTTTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCAAAATGTTGTAC
 GAACCGTTAAACAAAAACAGTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGCGAGCAGTTGT
 TTGTTGTTAAAAATAACAGCCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAACTGGAA
 ATGTCTATCAATATATAGTTGCTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTT
 CATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTG
 ACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGC
 CAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG
 GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAA
 ATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGT
 ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTG
 CTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAA
 TTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGC
 GGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAAT
 CAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCC
 TATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG

 SEQID NO 18 (pTriEx-1-VAMP2)
 GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCG
 CCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCC
 TTCTCCTTCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCT
 GCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGG
 GGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCG
 GCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTC
 TTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA
 GAATTGGATCGGACCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACA
 ATTCCCCGGAGTTAATCCGGGACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATA
 AGAATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTT
 ACAATCAAAGGAGATATACCATGTCTGCTACCGCTGCCACGGCCCCCCCTGCTGCCCC
 GGCTGGGGAGGGTGGTCCCCCTGCACCCCCTCCAAACCTCACCAGTAACAGGAGACT
 GCAGCAGACCCAGGCCCAGGTGGATGAGGTGGTGGACATCATGAGGGTGAACGTGGA
 CAAGGTCCTGGAGCGAGACCAGAAGCTGTCGGAGCTGGACGACCGTGCAGATGCACT
 CCAGGCGGGGGCCTCCCAGTTTGAAACAAGCGCAGCCAAGCTCAAGCGCAAATACTGG
 TGGAAAAACCTCAAGATGATGATCATCTTGGGAGTGATTTGCGCCATCATCCTCATCATC
 ATCATAGTTTACTTCAGCACTTAACTCGAGCACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTG
 ATTAACCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCT
 GGCTCACAAATACCACTGAGATCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCA
 TGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAG
 TGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAA
 AACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGTAACTAGCAT
 AACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGCATGCGGAGG
 AAATTCTCCTTGAAGTTTCCCTGGTGTTCAAAGTAAAGGAGTTTGCACCAGACGCACCTC
 TGTTCACTGGTCCGGCGTATTAAAACACGATACATTGTTATTAGTACATTTATTAAGCGC
 TAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAAT
 TTATAATCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCAAATGATTTTCAGCGTCTTTATATC
 TGAATTTAAATATTAAATCCTCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTAGTTTCAAACAA
 GGGTTGTTTTTCCGAACCGATGGCTGGACTATCTAATGGATTTTCGCTCAACGCCACAA
 AACTTGCCAAATCTTGTAGCAGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTG
 TAATAAAGGTTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTTTTGTATTTCTTTCATCACTGTCG
 TTAGTGTACAATTGACTCGACGTAAACACGTTAAATAGAGCTTGGACATATTTAACATCG
 GGCGTGTTAGCTTTATTAGGCCGATTATCGTCGTCGTCCCAACCCTCGTCGTTAGAAGT
 TGCTTCCGAAGACGATTTTGCCATAGCCACACGACGCCTATTAATTGTGTCGGCTAACA
 CGTCCGCGATCAAATTTGTAGTTGAGCTTTTTGGAATTATTTCTGATTGCGGGCGTTTTT
 GGGCGGGTTTCAATCTAACTGTGCCCGATTTTAATTCAGACAACACGTTAGAAAGCGAT
 GGTGCAGGCGGTGGTAACATTTCAGACGGCAAATCTACTAATGGCGGCGGTGGTGGAG
 CTGATGATAAATCTACCATCGGTGGAGGCGCAGGCGGGGCTGGCGGCGGAGGCGGAG
 GCGGAGGTGGTGGCGGTGATGCAGACGGCGGTTTAGGCTCAAATGTCTCTTTAGGCAA
 CACAGTCGGCACCTCAACTATTGTACTGGTTTCGGGCGCCGTIIIIGGTTTGACCGGTC
 TGAGACGAGTGCGATTTTTTTCGTTTCTAATAGCTTCCAACAATTGTTGTCTGTCGTCTAA
 AGGTGCAGCGGGTTGAGGTTCCGTCGGCATTGGTGGAGCGGGCGGCAATTCAGACAT
 CGATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGCGCTGGAATGTTAGGCACGGGAGAAGGTGGTGG
 CGGCGGTGCCGCCGGTATAATTTGTTCTGGTTTAGTTTGTTCGCGCACGATTGTGGGCA
 CCGGCGCAGGCGCCGCTGGCTGCACAACGGAAGGTCGTCTGCTTCGAGGCAGCGCTT
 GGGGTGGTGGCAATTCAATATTATAATTGGAATACAAATCGTAAAAATCTGCTATAAGCA
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Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele illustriert, aus denen weitere Merkmale, Ausführungsformen, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können.

Beispiele

Zusammenfassung

Verfahren: Zwei Patienten (P1-P2) mit idiopathischer Autoimmun-Enzephalitis (AE) und einem Autoimmunhintergrund wurden serologisch untersucht. Zu diesem Zweck wurden Seren von beiden Patienten und eine dazu passende Liquorflüssigkeit (CSF) aus P2 einem umfassenden Screening auf Autoantikörper durch indirekte Immunfluoreszenz (IFA) und Immunblot unterzogen. Eine Immunpräzipitation mit Lysaten aus dem Cerebellum, gefolgt von Massenspektrometrie (MS), wurde verwendet, um das Autoantigen zu identifizieren, und dieses wurde durch Western Blot (WB) mit monospezifischen Tierantikörpern gegen das entsprechende Zielantigen sowie durch rekombinante Expression in HEK293-Zellen und durch die Verwendung von rekombinantem Protein in Immuntests verifiziert. Weiterhin wurden Seren von Patienten mit neurologischen Symptomen und definierten anti-neuralen Autoantikörpern, Seren mit ähnlichen Färbemustern, wie denen bei den Patienten 1 und 2 ohne bekannte Autoantikörperreaktivität sowie negative Kontroll-Seren auf anti-STX1B-Antikörper untersucht. Alle Seren wurden zusätzlich durch IFA oder Western Blot mit anderen rekombinanten SNARE-Komplex-Proteinen (VAMP2, NSF) als Substraten analysiert.

Ergebnisse: Die IFA-Untersuchung von P1 und P2 zeigte eine IgG-Reaktivität von Seren und LSF molekulare und granuläre Schichten in Nagetier- und Affencerebellum. Weiterhin konnten mit einer Reihe von 30 rekombinant exprimierten etablierten neuralen Autoantigenen keine IgG-Reaktivitäten festgestellt werden. Die Seren von P1 und P2 immunpräzipitierten Syntaxin 1B (STX1B), wie mittels Coomassie-gefärbter SDS-PAGE gefolgt von MALDI-TOF-Massenspektrometrie nachgewiesen wurde. Wenn die Immunpräzipitate mittels Western Blot unter Verwendung monospezifischer Tierantikörper gegen STX1B analysiert wurden, zeigte anti-STX1B Reaktivität mit dem Immunpräzipitat von P1 und P2. In keiner von 45 Kontrollen mit gesunden Patienten wurden anti-STX1B-Antikörper festgestellt. Jedoch konnten in zwei Patientenseren (P3 und P4) mit einem ähnlichen Färbemuster auf Cerebellum wie P1 und P2 anti-STX1B-Antikörper mittels RC-IFA und Western Blot mit dem rekombinanten Protein gefunden werden. Weiterhin waren anti-GAD65-positive Seren von zwei Patienten mit einer Vordiagnose mit Stiff Person-Syndrom (SPS) (P6 und P7) im IFA positiv mit rekombinatem STX1B. Eine Untersuchung von Kontroll- und anti-STX1B-positiven Seren gegen andere rekombinante SNARE-Proteine zeigte drei anti-NSF-positive (P3, P6 und P7) und eine anti-VAMP2 (P5)-positive Probe.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Auftreten und der Nachweis eines Antikörpers spezifisch mit dem Auftreten von AE und SPS spezifisch verbunden sind und sie daher diagnostisch nützlich sind.

Patienten

Die Kontrollkollektive umfassten 45 gesunde Donoren, 33 Patienten mit neurologischen Symptomen und definierten anti-neuralen Autoantikörpern (3x anti-CASPR2, 3x anti-NMDAR, 3x anti-LGI1, 3x anti-Hu, 3x anti-Ri, 2x anti-Yo/anti-Ri, 3x anti-Yo, 3x anti-AQP4, 10x anti-GAD65) sowie 10 Seren mit einem ähnlichen Färbemuster wie P1 und P2 ohne bekannte Autoantikörperreaktivität.

Test mit indirekter Immunfluoreszenz (IFA)

Der IFA-Test wurde unter Verwendung von Trägern mit einer Biochipanordnung mit Gehirngewebe-Gefrierschnitten (Hippocampus von Ratte, Cerebellum von Ratte und Affe) kombiniert mit rekombinanten HEK293-Zellen durchgeführt, die 30 verschiedene Gehirnantigene exprimierten, darunter Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA2, ITPR1, Homer 3, CARP VIII, ARHGAP26, ZIC4, DNER/Tr, GAD65, GAD67, amphiphysin, recoverin, GABA_B receptor, glycine receptor, DPPX, lgLON5, glutamate receptors (types NMDA, AMPA, mGluR1, mGluR5, GLURD2), LGI1, CASPR2, AQP4 (M1 and M23), MOG, ATP1A3, NCDN exprimieren. (EUROIMMUN, FA 111a-1003-51, FA 1112-1003-50, FA-1128-1003-50, FA112d-1003-1, FA 112m-1003-50, FA 1151-1003-50, Miske R, Hahn S, Rosenkranz T, Müller M, Dettmann IM, Mindorf S, Denno Y, Brakopp S, Scharf M, Teegen B, Probst C, Melzer N, Meinck HM, Terborg C, Stöcker W, Komorowski L., 2016, Autoantibodies against glutamate receptor δ2 after allogenic stem cell transplantation. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 3(4):e255; Scharf M, Miske R, Heidenreich F, Giess R, Landwehr P, Blöcker IM, Begemann N, Denno Y, Tiede S, Dähnrich C, Schlumberger W, Unger M, Teegen B, Stöcker W, Probst C, Komorowski L, 2015, Neuronal Na+/K+ ATPase is an autoantibody target in paraneoplastic neurologic syndrome, Neurology; 84(16): 1673-9; Miske R, Gross CC, Scharf M, Golombeck KS, Hartwig M, Bhatia U, Schulte-Mecklenbeck A, Bönte K, Strippel C, Schöls L, Synofzik M, Lohmann H, Dettmann IM, Deppe M, Mindorf S, Warnecke T, Denno Y, Teegen B, Probst C, Brakopp S, Wandinger KP, Wiendl H, Stöcker W, Meuth SG, Komorowski L, Melzer N, 2016, Neurochondrin is a neuronal target antigen in autoimmune cerebellar degeneration, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm.;4(1):e307)). Jedes Biochip-Mosaik wurde mit 70 µL PBS-verdünnter Probe bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, mit PBS-Tween gewaschen und 5 Minuten lang in PBS-Tween eingetaucht. Beim zweiten Schritt wurden entweder Alexa488-markiertes Ziegen-anti-humanes lgG (Jackson Research, Suffolk, United Kingdom) oder mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierter Ziegen-anti-humanes IgG (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck) eingesetzt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Träger wurden erneut mit einer Spülung PBS-Tween gewaschen und anschließend 5 Minuten lang in PBS-Tween eingetaucht. Die Träger wurden in mit PBS gepuffertem, DABCO enthaltenen Glycerin eingebettet (ungefähr 20 µL pro Feld) und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Positiv- und Negativkontrollen wurden einbezogen. Die Proben wurden basierend auf der Fluoreszenzintensität der transfizierten Zellen mit direktem Vergleich mit nicht-transfizierten Zellen und Kontrollproben als positiv oder negativ klassifiziert. Die Endpunkttiter bezeichnen die letzte Verdünnung, die sichtbare Fluoreszenz zeigte.

Die Ergebnisse wurden von zwei unabhängigen Beobachtern unter Verwendung eines EUROSTARII-Mikroskops (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck, Germany) evaluiert. Die Reagenzien wurden von Merck, Darmstadt, Deutschland oder Sigma-Aldrich, Heidelberg, Deutschland bezogen, wenn nicht anders angegeben wurde.

Immunblot

Immunpräzipitiertes Lysat vom Cerebellum oder Lysat von HEK293-Zellen, die SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 exprimieren, in 0,1% Triton-X-100, 1 mM EDTA-Puffer, 150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 7,4, wurden mit NuPage LDS-, Probenpuffer (ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland) enthaltend 25 mmol/L Dithiothreitol bei 70°C 10 Minuten lang inkubiert, gefolgt von SDS-PAGE (NuPAGE, ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland). Die aufgetrennten Proteine wurden auf eine Nitrozellulose-Membran durch Tank-Blotting mit Transferpuffer (ThermoFisher Scientific) gemäß den Instruktionen des Herstellers elektrotransferiert. Die Membranen wurden mit Universal Blot-Puffer Plus (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck) 15 Minuten lang blockiert und mit Patienten- oder Kontrollseren (1:200-Verdünnung) oder monospezifischen Maus-Antikörper gegen STX1B (R+D Systems, MAB6848, 1:10.000) in Universal Blot-Puffer Plus 3 Stunden lang inkubiert, gefolgt von drei Waschschritten mit Universal Blot-Puffer (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck), weiter gefolgt von einer zweiten Inkubation 30 Minuten lang mit anti-human-lgG-AP (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck, 1:10) oder anti-Maus-IgG-AP (1:2.000) in Universal Blot-Puffer Plus, 3 Waschschritten und Anfärben mit NBT/BCIP-Substrat (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck). Die Reagenzien wurden von Merck, Darmstadt, Deutschland oder Sigma-Aldrich, Heidelberg, Deutschland erhalten, wenn nicht anders angegeben wurde.

Identifizierung der Antigene

Cerebellum aus der Ratte wurde präpariert und in flüssigen Stickstoff schockgefroren. Die Gewebe wurden in Solubilisierungspuffer (100 mmol/L tris-HCI pH 7.4, 150 mmol/L Natriumchlorid, 2.5 mmol/L Ethylendiamin-Tetraessigsäure, 0.5% (w/v) Natriumdeoxycholat, 1% (w/v) Triton X-100) enthaltend Protease Inhibitoren (Complete mini, Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) mit einem Miccra D-8 (Roth, Karlsruhe, Deutschland) und einem Hand-Homogenisator (Sartorius, Göttingen, Deutschland) bei 4°C homogenisiert. Die Gewebelysate wurden bei 21.000 x g bei 4°C 15 Minuten lang abzentrifugiert, und klare Überstände wurden mit Patientenserum (verdünnt 1:16,7) bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Proben wurden dann mit Protein G-Dynabeads (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland) bei 4°C 3 Stunden lang inkubiert, um Immunkomplexe einzufangen. Die Beads wurden dreimal mit PBS gewaschen und es wurden mit NuPage LDS Probenpuffer (ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland) enthaltend 25 mmol/L Dithiothreitol bei 70°C 10 Minuten lang eluiert. Vor der SDS-PAGE (NuPAGE, ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland) wurde eine Carbamidomethylierung mit 59 mM lodoacetamid (Bio-Rad, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Die aufgetrennten Proteine wurden mit Coomassie Brillant Blue (G-250) (Merck) sichtbar gemacht und mittels Massenspektrometrie-Analyse identifiziert.

Massenspektrometrie

Sichtbare Proteinbanden wurden aus mit Coomassie Brillant Blue G-250 gefärbten Gelen ausgeschnitten. Nach dem Entfärben und tryptischen Verdau wurden Peptide extrahiert und mit α-cyano-4-Dihydroxyzimtsäure auf einen MTP AnchorChip™ 384 TF-target gespottet.

Die MALDI-TOF/TOF-Messungen wurden mit einem Autoflex III smartbeam TOF/TOF200-System unter Verwendung von flexControl 3.4 software durchgeführt. Die MS-Spektren für Peptid Massen-fingerprinting (PMF) wurden im positiven Ionen-Reflektormodus mit 4.000-10.000 Shots und in einem Massenbereich von 600 Da bis 4.000 Da aufgenommen. Die Spektren wurden extern mit dem kommerziell verfügbaren Peptid Calibration Standard II kalibriert, mit flexAnalysis 3.4 prozessiert, und Peak Listen wurden mit BioTools 3.2 analysiert.

Für die Proteinidentifizierung wurde die Mascot-Suchmaschine Mascot Server 2.3 (Matrix Science, London, UK) durch das Suchen gegen die NCBI- oder SwissProt-Datenbanken eingeschränkt auf Säugetiere verwendet. Die Suchparameter waren die folgenden: Massentoleranz wurde bei 80 ppm eingestellt, eine fehlende Spaltstelle wurde akzeptiert, und Carbamidomethylierung von Cysteinresten sowie die Oxidierung von Methioninresten wurden als fixierte bzw. variable Modifikation eingestellt. Um die Proteine zu evaluieren, wurde eine Signifikanzschwelle von p<0,05 ausgewählt.

Zur weiteren Bestätigung der PMF-Hits wurden zwei bis fünf Peptide von jedem identifizierten Protein für MS/MS-Messungen unter Verwendung des WARP-Feedback-Mechanismus von BioTools ausgewählt. Die Parent- und Fragmentmassen wurden mit 400 bzw. 1.000 Shots aufgenommen. Die Spektren wurden wie oben zuvor mit einer Fragment-Massentoleranz von 0,7 Da verarbeitet und analysiert.

Rekombinante Expression von NSF, STX1B und VAMP2 in HEK293

Die kodierenden DNAs für menschliches NSF (SEQ ID Nr. 1) wurde durch RT-PCR mit total-RNA aus Gehirn und den Primern ATACGTCTCACATGGCGGGCCGGAGCATGCAAG ([sense NSF], SEQ ID Nr. 8) und TATCGTCTCCTCGATCAATCAAAATCAAGGGGGCTAG ([asense NSF] SEQ ID Nr. 9). erhalten. Die Amplifikationsprodukte wurden mit BsmBI und Dpnl verdaut. Die verdauten cDNAs wurden mit pTriEx-1 (Merck, Darmstadt, Deutschland) ligiert. Das daraus erhaltene Konstrukt (SEQ ID Nr. 15) kodierte für SEQ ID Nr. 2.

Die kodierenden DNAs für menschliches STX1B (SEQ ID Nr. 3) wurde durch RT-PCR mit Gesamt-Gehirn-RNA und den Primern ATACGTCTCACATGAAGGATCGGACTCAAGAGCTGC ([sense STX1B], SEQ ID Nr. 10) und entweder ATACGTCTCCTCGAGCTACAAGCCCAGCGTCCCCCCAATG ([asense STX1B], SEQ ID Nr. 11) oder [ATACGTCTCCTCGAGCTACAAGCCCAGCGTCCCCCCAATG, SEQ ID Nr. 12] erhalten. Die Amplifikationsprodukte wurden mit Esp3I und Dpnl verdaut. Die verdauten cDNAs wurden in pTriEx-1 (Merck, Darmstadt, Deutschland) ligiert. Die daraus erhaltenen Konstrukte (SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17) kodierten für SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5.

Die kodierende DNA für menschliches VAMP2 (SEQ ID Nr. 6) wurde durch RT-PCR mit total Gehirn-RNA und den Primern ATACGTCTCTCATGTCTGCTACCGCTGCCACGGCCC ([sense VAMP2], SEQ ID Nr. 13) und ATACGTCTCCTCGAGTTAAGTGCTGAAGTAAACTATGATG ([asense VAMP2], SEQ ID Nr. 14) erhalten. Die Amplifikationsprodukte wurden mit Esp3I und Dpnl verdaut. Die verdauten cDNAs wurden mit pTriEx-1 (Merck, Darmstadt, Deutschland) ligiert. Das daraus erhaltene Konstrukt (SEQ ID Nr. 18) kodierte für SEQ ID Nr. 7.

NSF, STX1B bzw. VAMP2 wurden in der Humanzelllinie HEK293 nach ExGen500-vermittelter Transfizierung (ThermoFisher Scientific) entsprechend den Anweisungen des Herstellers exprimiert. Die Zellen wurden in Standard T-Flaschen transfiziert und die Zellen wurden nach 5 Tagen geerntet. Das Zellsediment wurde mit Solubilisierungspuffer extrahiert. Die Extrakte wurden in Aliquots bei -80 °C bis zur weiteren Benutzung gelagert.

Charakterisierung der Autoantikörper der Patienten

Tests mit indirekter Immunfluoreszenz (IFA) der Seren P1 bis P2 unter Verwendung permeabilisierter Gefrierschnitte von Cerebellum zeigten eine glatte Färbung auf den molekularen und granulären Schichten (1). Weitere monospezifische Analysen wurden unter Verwendung von rekombinanten HEK293-Zellen durchgeführt, die 30 neurale Autoantigene exprimierten: Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA2, SOX1, ITPR1, Homer 3, CARP VIII, ARHGAP26, ZIC4, DNER/Tr, GAD65, GAD67, amphiphysin, recoverin, GABAB receptor, glycine receptor, DPPX, lgLON5, glutamate receptors (types NMDA, AMPA, mGluR1, mGluR5, GLURD2), LGI1, CASPR2, AQP4 (M1 and M23), MOG, ATP1A3 and NCDN. Es wurde keine spezifische Reaktivität beobachtet.

Identifizierung von STX1B als neuronales Target-Autoantigen

Das mit Seren von P1 und P2 Immunpräzipitat aus homogenisiertem RattenCerebellum zeigte ein Protein von ungefähr 33 kDa in Coomassie-gefärbter SDS-PAGE, das fehlte, wenn die Homogenate mit Kontrollseren inkubiert wurden ( 2A). Unter Verwendung von MALDI-TOF MS wurde das Protein als STX1B (UNIPROT acc. # P61265) identifiziert. Als Beleg für die richtige Antigenidentifizierung wurden Immunpräzipitate unter Verwendung von Antikörpern gegen STX1B getestet. Die Immunpräzipitate der Patientenseren umfassten STX1B wie durch die 33 kDa-Bande gezeigt wurde (2B). Weiterhin wurden die Patientenproben durch IFA unter Verwendung von transfizierten HEK293-Zellen getestet, die STX1B (SEQ ID Nr. 4) exprimierten (3A). Patientenseren und CSFs reagierten mit den STX1B exprimierenden Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten nur zum Schein transfizierte Zellen keine spezifische Antikörperbindung. Beide Proben reagierten auch mit rekombinanten Hilfs-STX1B im Immunblot unter Verwendung von STX1B (ic)-His (SEQ ID Nr. 5) (3B).

Die Reaktion der Patienten-Autoantikörper konnte durch Vorinkubation mit HEK293-Lysat enthaltend STX1B (SEQ ID Nr. 4) (3c) unterbunden werden. Wurde stattdessen eine vergleichbare Fraktion von zum Schein transfizierten HEK293-Zellen verwendet, so hatte dies hingegen keinen Einfluss auf die Antikörper-Bindung.

Spezifität von anti-STX1B-Autoantikörpern

Seren von 33 Patienten mit verschiedenen neuronalen Autoantikörper-assoziierten neurologischen Syndromen (3x anti-CASPR2, 3x anti-NMDAR, 3x anti-LGI1, 3x anti-Hu, 3x anti-Ri, 2x anti-Yo/anti-Ri, 3x anti-Yo, 3x anti-AQP4, 10x anti-GAD65), 10 Seren mit ähnlichen Färbemustern wie bei Patient 1 und 2 auf Cerebellum ohne bekannte anti-neurale Autoantikörperreaktivität und 45 gesunde Kontrollen wurden mittels IFA mit HEK293-STX1B-His parallel zu den Proben von den Patienten analysiert. Keine der Seren der gesunden Kontrollen zeigte ein ähnliches Immunfluoreszenzmuster wie die Seren der Patienten auf Rattengehirngewebe, und alle waren negativ, wenn sie mit HEK293-Zellen getestet wurden, die STX1B exprimieren. Zwei von den 10 anti-GAD65-positiven Seren von Patienten mit einer Vordiagnose von Stiff Person-Syndrom (P6, P7) und zwei (P3, P4) der 10 Seren mit ähnlichen Färbemustern wie Patient 1 und 2 auf Cerebellum reagierten mit rekombinantem STX1B in IFA und Western Blot positiv (4).

Reaktivität gegen andere SNARE-Komplex-Proteine

Eine Untersuchung von anti-STX1B-positiven und zusätzlichen Seren von Patienten, die unter Verdacht standen, Autoimmun-Encephalitis zu haben, gekennzeichnet durch das Erzeugen ähnlicher IFA-Muster wie die Indexseren oder Seren von Patienten mit neurologischen Symptomen und definierten anti-neuralen-Autoantikörpern durch IFA oder Western Blot unter Verwendung von HEK293-Zellen, die rekombinant NSF (SEQ ID Nr. 2) und VAMP2 (SEQ ID Nr. 7) exprimierten, zeigten drei anti-NSF (P3, P6, P7)-positive (5) und eine anti-VAMP2(P5)-positive Probe (6B). Zum Schein transfizierte Zellen zeigten keine spezifische Antikörperbindung. P3 und P5 zeigten ein ähnliches Immunfluoreszenzmuster wie die Seren der Indexpatienten (P1, P2) auf Rattengehirngewebe (4A and 6A). P6 und P7 waren anti-GAD65 positiv und diagnostiziert mit Stiff Person-Syndrom. Die drei anti-NSF-positiven Seren (P3, P6, P7) waren ebenfalls anti-STX1B positiv (4). Keine der 45 gesunden Kontrollen zeigte eine positive Reaktion gegen NSF oder VAMP2.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

WO 1997/021729 [0010]
US 5693476 [0010]
WO 2013041540 [0074]
US 4647543 [0075]
EP 13189172 [0076]
EP 2483417 [0076]
US 2015/0247847 [0076]
EP 15001186 [0076]
EP 14003703 [0076]
EP 14003958 [0076]
EP 14171561 [0076]
EP 3101424 [0076]
EP 17000666 [0076]
EP 2423226 A2 [0079]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Clin Immunol. 2008 Jun;127(3):366-74 [0012]
Trends Cell Biol. 2014 24: 35-43 [0035]
Südhof TC, Rizo J. Synaptic vesicle exocytosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12). pii: a005637 [0036]
Beispiel Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3rd edition [0048]
Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948 [0048]
Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology [0052]
John Wiley & Sons, Inc. Darüber hinaus kann der Fachmann den Instruktionen folgen, die im Manual von Boehringer Mannheim GmbH (1993) [0052]
Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 [0052]
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) [0054]
Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986) [0054]
Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall [0054]
Jackson, D. C., Fitzmaurice, C. J., Brown, L. E., Zeng, W. (1999) [0055]
Preparation and properties of totally synthetic immunogenes, Vaccine Volume 18, Issues 3-4, September 1999, Pages 355-361 [0055]
Black, M., Trent, A., Tirrell, M. and Olive, C. (2010), Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists, Expert Rev Vaccines, 2010 February; 9(2): 157-173 [0055]
Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S., Laune, D., Granier, C. and Molina, F. (2008), PEPOP: Computational design of immunogenic peptides, BMC Bioinformatics 2008, 9:71 [0055]
Banaszak L. J. (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press, or Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer [0056]
Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1- 2), 57-65 [0074]
Voigt, J., Krause, C., Rohwäder, E, Saschenbrecker, S., Hahn, M., Danckwardt, M., Feirer, C., Ens, K, Fechner, K, Barth, E, Martinetz, T., and Stöcker, W. (2012), Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoantibodies on HEp-2 Cells," Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, doi:10.1155/2012/65105 [0075]
Bonilla, E., Francis, L., Allam, F., et al., Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients, Clinical Immunology, vol. 124, no. 1, pp. 18-21, 2007 [0075]
Hermanson, G. T., Mallia, A. K., and Smith, P. K. (1992), Immobilized Affinity Ligand Techniques, San Diego: Academic Press [0077]
Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 3(4):e255; Scharf M, Miske R, Heidenreich F, Giess R, Landwehr P, Blöcker IM, Begemann N, Denno Y, Tiede S, Dähnrich C, Schlumberger W, Unger M, Teegen B, Stöcker W, Probst C, Komorowski L, 2015, Neuronal Na+/K+ ATPase is an autoantibody target in paraneoplastic neurologic syndrome, Neurology; 84(16): 1673-9 [0103]
Miske R, Gross CC, Scharf M, Golombeck KS, Hartwig M, Bhatia U, Schulte-Mecklenbeck A, Bönte K, Strippel C, Schöls L, Synofzik M, Lohmann H, Dettmann IM, Deppe M, Mindorf S, Warnecke T, Denno Y, Teegen B, Probst C, Brakopp S, Wandinger KP, Wiendl H, Stöcker W, Meuth SG, Komorowski L, Melzer N, 2016, Neurochondrin is a neuronal target antigen in autoimmune cerebellar degeneration, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm.;4(1):e307)) [0103]

Claims

Verfahren umfassend den Schritt Nachweisen eines Autoantikörpers in einer Antikörper enthaltenden Probe von einem Patienten, wobei der Autoantikörper an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die NSF, STX1B und VAMP2 umfasst.
Rekombinantes Polypeptid umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 oder eine Variante davon, das bevorzugt immobilisiert ist, bevorzugter auf einem festen Träger.
Verwendung des Polypeptides gemäß Anspruch 2 zur Diagnose einer Krankheit, bevorzugt umfassend den Schritt Nachweisen in einer Probe eines Autoantikörpers, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP 2 ausgewählt ist.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 2 zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit.
Autoantikörper, bevorzugt isolierter Autoantikörper, der gegen ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe bestehend aus NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist, wobei der Autoantikörper bevorzugt im Komplex mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 2 vorliegt.
Verwendung des Autoantikörpers gemäß Anspruch 5 zur Diagnose einer Krankheit.
Verfahren zum Isolieren eines Autoantikörpers, der gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 bindet, umfassend die Schritte a) Kontaktieren einer Probe umfassend den Autoantikörper mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 2 unter Bedingungen, die mit der Bildung eines Komplexes kompatibel sind, in dem der Autoantikörper an das Polypeptid bindet, b) Isolieren des in Schritt a) gebildeten Komplexes, c) Dissoziieren des in Schritt b) isolierten Komplexes und d) Abtrennen des Autoantikörpers von dem Polypeptid.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder medizinische Vorrichtung, bevorzugt diagnostische Vorrichtung, umfassend das Polypeptid gemäß Anspruch 2.
Kit zur Diagnose einer Krankheit, wobei das Kit das Polypeptid gemäß Anspruch 2 oder die medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 8 umfasst, wobei bevorzugt das Kit zusätzlich ein Mittel zum Nachweisen eines Komplexes umfassend das Polypeptid gemäß Anspruch 2 und/oder einen Antikörper umfasst, der gegen ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 ausgewählt ist.
Das Verfahren, Polypeptid, die Verwendung, der Autoantikörper, die pharmazeutische Zusammensetzung, die Vorrichtung oder das Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Patient ein oder mehr als ein Symptom, bevorzugt zwei oder mehr als zwei Symptome aufweist oder die Krankheit damit assoziiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die progressive Steifheit in trunkalen Muskeln, umfassend thorakolumbale paraspinale und abdominale Muskeln, abdominale Wandmuskeln und proximale Beinmuskeln, rigiden Gang, lumbare Hyperlordose, chronischen Schmerz, Spastiken in proximalen Gliedern und axialen Muskeln, Empfindlichkeit auf Berührung oder Geräusche, Hyperekplexie, Myoklonus, Depression, Angst, Phobie, Fieber, Kopfschmerz, Verwirrung, Dysarthrie, Dysphagie, Nystagmus, Oszillopsie, Schwindel, Übelkeit, Ataxie, Parästhesie, Muskelschwund, Schwindel, Anfälle, Epilepsie und Tremor umfasst.
Verwendung eines Polypeptides gemäß Anspruch 2 oder des Autoantikörpers gemäß Anspruch 5 oder der medizinischen Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder eines Antikörpers gegen ein Polypeptid aus der Gruppe umfassend NSF, STX1B und VAMP2 zur Herstellung eines Kits, einer medizinischen Vorrichtung, bevorzugt diagnostischen Vorrichtung, bevorzugt zur Diagnose einer Krankheit.
Das Verfahren, Polypeptid, die Verwendung, der Autoantikörper, die pharmazeutische Zusammensetzung, die Vorrichtung oder das Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Krankheit eine neurologische Krankheit ist, bevorzugt einer Autoimmunkrankheit des Nervensystems oder eine Autoimmunkrankheit, die mit einer neurologischen Krankheit oder neurologischen Symptomen assoziiert ist, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Stiff-Person-Syndrom und Enzephalitis, am bevorzugtesten Enzephalitis.
Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 7, 10 und 12, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit umfassend Antikörper ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Blut, Serum, Liquor und Speichel.
Das Verfahren, die Verwendung oder das Kit gemäß einem der Ansprüche 1 und 10 bis 13, wobei der Autoantikörper oder Komplex unter Verwendung eines Verfahrens nachgewiesen wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Immundiffusions-Tests, immunoelektrophoretische Techniken, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinations-Tests, Immuntests mit Markierungen, wie diejenigen aus der Gruppe umfassend Immuntests mit Radiomarkierung, Enzymimmuntests, bevorzugter ELISA, Chemiluminszenz-Immuntests und Immunfluoreszenztests umfasst, bevorzugt die indirekte Immunfluoreszenz.
Die medizinische Vorrichtung, die Verwendung oder das Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die medizinische Vorrichtung aus der Gruppe ausgewählt ist, die einen Glasträger, bevorzugt zur Mikroskopie, einen Biochip, eine Mikrotiter-Platte, einen Teststreifen, eine Membran, bevorzugt ein Line Blot, eine Chromatographie Säule und einen Bead, bevorzugt einen magnetischen Bead, umfasst.