JP5904553B2 - 自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法 - Google Patents
自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5904553B2 JP5904553B2 JP2012544286A JP2012544286A JP5904553B2 JP 5904553 B2 JP5904553 B2 JP 5904553B2 JP 2012544286 A JP2012544286 A JP 2012544286A JP 2012544286 A JP2012544286 A JP 2012544286A JP 5904553 B2 JP5904553 B2 JP 5904553B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- analysis
- derived
- antibody
- arteriosclerosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 209
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 158
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title description 75
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 58
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims description 37
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 claims description 37
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 153
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 55
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 54
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 54
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 47
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 20
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 18
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 17
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 17
- 238000007418 data mining Methods 0.000 description 17
- 102000003786 Vesicle-associated membrane protein 2 Human genes 0.000 description 13
- 108090000169 Vesicle-associated membrane protein 2 Proteins 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 102100040751 Casein kinase II subunit alpha Human genes 0.000 description 12
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 12
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 12
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 12
- 101000892026 Homo sapiens Casein kinase II subunit alpha Proteins 0.000 description 12
- 101000691852 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1 Proteins 0.000 description 12
- 101000742143 Homo sapiens Prenylated Rab acceptor protein 1 Proteins 0.000 description 12
- 101000971468 Homo sapiens Protein kinase C zeta type Proteins 0.000 description 12
- 102100026114 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1 Human genes 0.000 description 12
- 102100038619 Prenylated Rab acceptor protein 1 Human genes 0.000 description 12
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 12
- 102100021538 Protein kinase C zeta type Human genes 0.000 description 12
- 102000013265 Syntaxin 1 Human genes 0.000 description 12
- 108010090618 Syntaxin 1 Proteins 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 12
- 102100024365 Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 108010058544 Cyclin D2 Proteins 0.000 description 11
- 102000006312 Cyclin D2 Human genes 0.000 description 11
- 102100039855 Histone H1.2 Human genes 0.000 description 11
- 101000833314 Homo sapiens Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 101001035375 Homo sapiens Histone H1.2 Proteins 0.000 description 11
- 101000866795 Homo sapiens Non-histone chromosomal protein HMG-14 Proteins 0.000 description 11
- 101001109719 Homo sapiens Nucleophosmin Proteins 0.000 description 11
- 101000697800 Homo sapiens Syntaxin-4 Proteins 0.000 description 11
- 101000625727 Homo sapiens Tubulin beta chain Proteins 0.000 description 11
- 102100031353 Non-histone chromosomal protein HMG-14 Human genes 0.000 description 11
- 102100022678 Nucleophosmin Human genes 0.000 description 11
- 102100027975 Syntaxin-4 Human genes 0.000 description 11
- 102100024717 Tubulin beta chain Human genes 0.000 description 11
- 102100036505 Vesicle-associated membrane protein 8 Human genes 0.000 description 11
- 101710205049 Vesicle-associated membrane protein 8 Proteins 0.000 description 11
- 101000642688 Homo sapiens Syntaxin-3 Proteins 0.000 description 10
- 101000788517 Homo sapiens Tubulin beta-2A chain Proteins 0.000 description 10
- 101000766771 Homo sapiens Vesicle-associated membrane protein-associated protein A Proteins 0.000 description 10
- 102100035937 Syntaxin-3 Human genes 0.000 description 10
- 102100028641 Vesicle-associated membrane protein-associated protein A Human genes 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 10
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102100036914 Proton-coupled amino acid transporter 4 Human genes 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 102100035300 Cystine/glutamate transporter Human genes 0.000 description 8
- 101000866286 Homo sapiens Excitatory amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 8
- 108091006908 SLC36A4 Proteins 0.000 description 8
- 108091006241 SLC7A11 Proteins 0.000 description 8
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 8
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102000012977 SLC1A3 Human genes 0.000 description 7
- 108091006239 SLC7A9 Proteins 0.000 description 7
- 102100021298 b(0,+)-type amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 7
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 4
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 4
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 description 4
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 238000003016 alphascreen Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000004300 Atrophic Gastritis Diseases 0.000 description 2
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 2
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 208000006926 Discoid Lupus Erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000036495 Gastritis atrophic Diseases 0.000 description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 2
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 2
- 101000708573 Homo sapiens Y+L amino acid transporter 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 2
- 206010022491 Insulin resistant diabetes Diseases 0.000 description 2
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 206010028665 Myxoedema Diseases 0.000 description 2
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 2
- 201000011152 Pemphigus Diseases 0.000 description 2
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 2
- 102000015799 Qa-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091006207 SLC-Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000037054 SLC-Transporter Human genes 0.000 description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 208000018359 Systemic autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 2
- 102100032803 Y+L amino acid transporter 2 Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 208000000594 bullous pemphigoid Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 208000016644 chronic atrophic gastritis Diseases 0.000 description 2
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000004921 cutaneous lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000003786 myxedema Diseases 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 2
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- -1 physical adsorption Substances 0.000 description 2
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037359 steroid metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 208000005057 thyrotoxicosis Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005990 Acidic Amino Acid Transport Systems Proteins 0.000 description 1
- 102000005946 Acidic Amino Acid Transport Systems Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000036490 Arterial inflammations Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100031563 Excitatory amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000001134 F-test Methods 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000713298 Homo sapiens Proton-coupled amino acid transporter 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 1
- 238000001790 Welch's t-test Methods 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003064 k means clustering Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003058 natural language processing Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
なお、本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願の特願2010-256418からの優先権を請求する。
ゲノム上に見出された、機能がまったく未知の遺伝子はもちろんのこと、実は、アノテーション(注釈付け)された遺伝子でさえ、生化学的な機能はまだわかっていない遺伝子が大半を占める。
そのため、ゲノムシークエンス後のポストゲノム時代において、膨大な予算を投入して見つかった2万5千種を超える遺伝子に関して、より有効な情報を得るためには、タンパク質の生化学的な機能を網羅的に解析する技術の発展が必須である(参照:非特許文献1)。
自己抗原が特定の臓器あるいは組織・細胞に限局して存在するような場合には、その臓器のみが障害されることとなり臓器特異的自己免疫疾患となる。代表的な例として、重症筋無力症、多発硬化症等が知られている。
一方、核物質など全身に普遍的な自己抗原に対する自己抗体の存在が知られており、血管炎など全身性の病変が生じているものは全身性自己免疫疾患となる。代表的な例として、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発動脈炎症等が知られている。
そのため、アテローム性動脈硬化症は、早期発見、発病予測が重要であるが、従来の画像診断では、初期段階のアテローム性動脈硬化を診断することができず、血清マーカー等も有用なものが存在しない状況である。
また、近年の研究成果から、アテローム性動脈硬化における炎症の一部に、自己免疫性機序が関わる可能性が示唆されていたが、実体は不明のままである。
おそらく、これらが重複して自己抗体が産生されてくると考えられている(参照:特許文献2)。また、全身性自己免疫疾患における自己抗体の役割についてはいくつか報告されている。
しかし、自己免疫疾患に関与する因子がIL-1α自己抗体のみであると考えることはできない。さらに、本発明で特定した自己免疫疾患に関与する因子には、IL-1αが含まれていない。
しかし、自己免疫疾患に関与する因子がホスホリルコリン自己抗体のみであると考えることはできない。さらに、本発明で特定した自己免疫疾患に関与する因子には、ホスホリルコリンが含まれていない。
従来の遺伝子発現プロファイル(参照:特許文献1、5〜7)では、自己免疫疾患患者由来の試料中の遺伝子発現量を、健常者由来の試料中の遺伝子発現量と比較することにより、原因タンパク質を特定していた。
しかし、各種の疾患患者の試料中の遺伝子発現量(転写産物)が、該遺伝子をコードするタンパク質の実際の発現量とは必ずしも一致しないことが多々報告されている。さらには、該プロファイルでは、自己抗体が発現しているかどうかを十分に特定することができない。
以上により、自己免疫疾患に関与する無数のタンパク質を高感度かつ高効率に検出する方法及び該検出方法から得られたデータの解析方法の構築が必要である。
「1.以下のいずれか1のタンパク質群に対する自己抗体の抗体価を患者由来の試料から検出することを特徴とする動脈硬化の検査方法。
(1)サイトカインに関与するタンパク質群、ここで、サイトカインに関与するタンパク質群は、以下のいずれか1以上である:
IL-5;STX1A;CSNK2A1;VAMP2;GSK3B;PRKCZ;PCNA;PIN1;STX4;HRB;HMGN1;HIST1H1C;TUBB;NPM1;VAMP8;VAPA;STX3;RABAC1、CCND2。
(2)アミノ酸輸送体に関与するタンパク質群、ここで、アミノ酸輸送体に関与するタンパク質群は、以下のいずれか1以上である:
SLC7A11;SLC36A4;SLC7A9、SLC1A3。
2.前記サイトカインに関与するタンパク質群は、以下のいずれか1以上である前項1の検査方法。
(1)IL-5
(2)STX1A
(3)CSNK2A1
(4)VAMP2
(5)GSK3B
(6)PRKCZ
(7)PCNA
(8)PIN1
(9)STX4
3.前記サイトカインに関与するタンパク質群は、以下のいずれか1以上である前項1の検査方法。
(1)HRB
(2)HMGN1
(3)HIST1H1C
(4)TUBB
(5)NPM1
(6)VAMP8
(7)VAPA
(8)STX3
(9)RABAC1
(10)CCND2
4.前記アミノ酸輸送体に関与するタンパク質群は、以下のいずれか1以上である前項1の検査方法。
(1)SLC7A11
(2)SLC36A4
(3)SLC7A9
(4)SLC1A3
5.前記動脈硬化が、アテローム性動脈硬化症である前項1〜4のいずれか1の検査方法。
6.前記検査方法は、発病リスクの検査、重症度の判定検査、又は治療効果の判定検査である前項5の検査方法。
7.動脈硬化検査を実施するための、少なくとも以下を含む検査キット:
IL-5;STX1A;CSNK2A1;VAMP2;GSK3B;PRKCZ;PCNA;PIN1;STX4;HRB;HMGN1;HIST1H1C;TUBB;NPM1;VAMP8;VAPA;STX3;RABAC1;CCND2;SLC7A11;SLC36A4;SLC7A9、及び/又はSLC1A3。
8.動脈硬化検査を実施するための、IL-5を含み、さらに少なくとも以下のいずれか1を含む検査キット。
(1)マイクロプレート
(2)標準液
(3)陽陰性コントロール
(4)反応用緩衝液
(5)酵素標識抗体
(6)洗浄用緩衝液
(7)酵素基質液
(8)反応停止液
9.以下の工程を有する自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法:
(1)哺乳動物由来のタンパク質を、自己免疫疾患患者由来の試料と接触させて自己抗体の検出データ(データ1)を取得する工程;
(2)哺乳動物由来のタンパク質を、健常者由来の試料と接触させて自己抗体の検出データ(データ2)を取得する工程、及び/又は、哺乳動物由来のタンパク質を、自己免疫疾患の治療薬を投与されている自己免疫疾患患者由来の試料と接触させて自己抗体の検出データ(データ3)を取得する工程;
(3)上記データ1〜3のいずれか2以上を用いて統計学的分析を行い、示差的に発現している1以上の自己抗体の自己抗原タンパク質(哺乳動物由来のタンパク質)群のデータ(データ4)を取得する工程;
(4)上記データ4のタンパク質群に注釈付け(アノテーション)を行う工程、
(5)上記アノテーションに基づき上記タンパク質群の共通規則を抽出する工程。
10.さらに、前記共通規則に基づく拘束条件を用いてデータマイニングを行う工程を有することを特徴とする前項9の解析方法。
11.前記(5)の工程で抽出された共通規則を有するタンパク質を用いて上記(1)〜(5)の工程を複数回繰り返す工程を特徴とする前項9又は10の解析方法。
12.さらに、前記データ1〜3に含まれておらず、かつ前記共通規則を有する哺乳動物由来のタンパク質を使用して、上記(1)〜(3)の工程を行うことによりデータ5を取得する工程を有することを特徴とする前項9〜11のいずれか1の解析方法。
13.前記データ5を上記4データに組み合わせる工程を有することを特徴とする前項9〜12のいずれか1の解析方法。
14.前記哺乳動物由来のタンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることを特徴とする前項9〜13のいずれか1の解析方法。
15.前記(1)及び/又は(2)の工程で、ALPHA(増幅発光近接ホモジニアスアッセイ)を使用してIgGと反応する哺乳動物由来のタンパク質を検出することを特徴とする前項9〜14のいずれか1の解析方法。
16.前記自己免疫疾患が、以下のいずれか1から選ばれる前項9〜15のいずれか1の解析方法、
全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、及びシェーグレン症候群。
17.前記自己免疫疾患が、動脈硬化症である前項9〜16のいずれか1の解析方法。
18.前記(4)の工程は、遺伝子オントロジー解析であることを特徴とする前項9〜17のいずれか1の解析方法。
19.前記遺伝子オントロジー解析の1つ以上が、分子機能、細胞内局在及び生物学的過程から選択される前項18の解析方法。
20.前記遺伝子オントロジー解析の共通規則が、分子機能の分類であることを特徴とする前項19の解析方法。
21.前記(1)〜(5)の工程を繰り返すことにより、前記分子機能の分類を下階層に絞りこむことを特徴とする前項20の解析方法。
22.前記自己免疫疾患が動脈硬化症であり、前記共通規則がアミノ酸輸送体であることを特徴とする前項18〜21のいずれか1の解析方法。
23.前記(4)の工程は、パスウェイ解析であることを特徴とする前項9〜17のいずれか1の解析方法。
24.前記自己免疫疾患が動脈硬化症であり、前記共通規則がサイトカインであることを特徴とする前項23の解析方法。」
本発明の自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法は、主に以下の特徴を有する。
(1)哺乳動物由来のタンパク質を、自己免疫疾患患者由来の試料と接触させて自己抗体の検出データ(データ1)を取得する。
これにより、自己免疫疾患患者由来の試料中の自己抗体と反応した哺乳動物由来のタンパク質(自己抗原タンパク質)を特定することができる。
なお、「自己抗体」とは、一般的にはIgG分子であり、特に、IgG4分子であるが、IgM、IgE、IgA、またはIgD分子でもよい。
(2)哺乳動物由来のタンパク質を、健常者由来の試料と接触させて自己抗体の検出データ(データ2)を取得する、及び/又は、哺乳動物由来のタンパク質を、自己免疫疾患治療薬を投与されている自己免疫疾患患者由来の試料と接触させて自己抗体の検出データ(データ3)を取得する。
これにより、健常者由来の試料中及び/又は自己免疫疾患治療薬を投与されている自己免疫疾患患者由来の試料中の自己抗体と反応した哺乳動物由来のタンパク質(自己抗原タンパク質)を特定することができる。
(3)上記データ1〜3のいずれか2以上を用いて統計学的分析を行い、示差的に発現している1以上の自己抗体に対する自己抗原タンパク質(哺乳動物由来のタンパク質)群のデータ(データ4)を取得する。
これにより、健常者、自己免疫疾患患者、自己免疫疾患治療薬を投与されている自己免疫疾患患者によって、どのような自己抗体が特異的に産出、増加、減少又は消失されているかを特定することができる。
(4)上記データ4のタンパク質群に注釈付け(アノテーション)を行う。
これにより、自己抗原タンパク質(哺乳動物由来のタンパク質)の遺伝子機能情報、疾患関連情報、塩基配列情報、公共データベース情報、他種遺伝子間のホモログ情報、遺伝子ネットワーク情報、パスウェイ情報等が付与される。
(5)前記アノテーションに基づき前記タンパク質群の共通規則を抽出する。
これにより、各種の自己抗原タンパク質の共通規則が特定される。
なお、「共通規則」とは、各タンパク質が、発病時期、分子機能、細胞内構成、生物学的プロセス等の共通の性質を共有することを意味する。
本発明の自己免疫疾患は、以下のいずれか1から選択される。特に、好ましい自己免疫疾患は、動脈硬化であり、より好ましくはアテローム性動脈硬化である。
全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群。
本発明の試料は、各状態(重篤、軽症、自己免疫疾患治療薬を投与されている状態)の自己免疫疾患患者及び健常者由来の生物学的材料を意味する。例えば、採取した血液、血液由来成分(血清、血漿)、尿、糞便、唾液、汗に含まれる産物を対象とする。特に、好ましい試料は、血清である。
本発明の哺乳動物由来のタンパク質は、哺乳動物の体内、特に血液で発現しているタンパク質を意味する。
さらに、本発明の哺乳動物は、ヒトを含む霊長類(例えば、ゴリラ、チンパンジー、ヒヒ、リスザル)、コンパニオンアニマル(例えば、ネコ、ウサギ、イヌ、ウマ)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ)、および実験動物(例えば、ネコ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、チンパンジー、およびヒヒ)を含む。
本発明の各工程における「接触」とは、A溶液をB溶液に添加する、又はB溶液をA溶液に添加する、の両方を意味する。
例えば、哺乳動物由来のタンパク質を自己免疫疾患患者由来の試料と接触させる場合には、哺乳動物由来のタンパク質を含む溶液を試料に添加しても、又は、試料を哺乳動物由来のタンパク質を含む溶液に添加してもよい。
本発明のデータマイニングとは、データから、興味ある規則性や因果関係をプログラム等を使用して自動的に抽出する技術のことである。なお、本発明で使用するデータマイニングは、統計的手法又は非統計的手法の両方を含む。
統計的手法の例として、主成分分析、重回帰分析、因子分析、判別分析、X二乗検定、Fisherの正確検定、Wilcoxonの検定、F-検定、多重検定、Welchのt-検定等が挙げられる。
非統計的手法の例として、クラスター解析、ニューラルネットワーク、自己組織化マップ、遺伝的アルゴリズム、決定木、k−最近傍法、パターン認識等が挙げられる。
加えて、以上述べた手法を併用することもできる。
本発明の工程では、好ましくは、正規化及び/又はフィルタリングを導入する。
実験を行った時間、場所、作業者が異なることから実験のバックグランドや、ノイズの程度が異なるので、その実験ごとのバックグランドやノイズの程度を揃えるために正規化を行う。本発明の工程で、プロテインチップを使用した場合には、チップごとに画像輝度(蛍光強度)が異なることがある。よって、バックグランド輝度を考慮する必要がある。
また、フィルタリングでは、適切なデータを選択し、解析に悪影響を与える誤り値を除く操作のことである。例えば、しきい値を定める方法がある。具体的には、信号強度(蛍光強度)が低い場合、しきい値をXとし、X以下の信号強度をXにするかもしくはゼロにする。
また、クロスバリデーションも導入してもよい。
遺伝子の機能を調べるには、解析対象の遺伝子群を、遺伝子の機能に基づいて、分類し、視覚化する必要がある。遺伝子の機能を表示する方式として、よく使われているものに、遺伝子オントロジー解析がある。遺伝子オントロジーは、遺伝子の機能に関する統一的な枠組みを制定する必要性から立ち上げられたGene Ontologyコンソーシアム(http://www.geneontology.org/)と呼ばれるプロジェクトによって、提案されたものである。Gene Ontologyによると、遺伝子の機能を3つの情報として体系化している。即ち、分子機能(Molecular Function)、細胞内局在(Cellular component)、生物学的過程(Biological process)である。
GOIDは、生物学的過程、細胞内局在、及び分子機能の3つの情報に関するデータベースの識別符号である。
図1のオントロジー右端括弧中の数字は登録遺伝子数を示す。32056個の遺伝子が輸送体機能(transport)を有する遺伝子として現在登録されており、アミノ酸輸送体(amino acid tramsport)には1272個の遺伝子が登録されている。
さらに、図2では、アミノ酸輸送体の下階層{酸性アミノ酸輸送体(95個)、アミノ酸膜貫通輸送体(8個)等}が登録されている。
遺伝子オントロジーでは汎用的な大分類から詳細な小分類へと階層構造を形成している。
下記実施例6の遺伝子オントロジー解析結果の図3を使用して説明する。
図3に記載の4つのタンパク質は、遺伝子オントロジー解析によって得られた結果である。
図3の遺伝子群は、あるクラス分類において重要であることが、上記(3)の工程の統計学的分析(データマイニング)により分かったタンパク質群であるとする。この図3の遺伝子群から共通した性質や特徴を抽出することが、遺伝子アノテーションから共通規則を抽出する工程の目的である。例えば、図3の遺伝子オントロジーに対して、複数の遺伝子において共通に見られるオントロジーがないかを検索する。
図3では、「amino acid transporter(アミノ酸輸送体)」又はその下階層が共通して見られる。これにより、一回目の上記(1)〜(5)の工程により、自己免疫疾患に関与するタンパク質群はアミノ酸輸送体のクラス分類に関わっているという規則が潜んでいる可能性を見出すことができる。
なお、実験者の主観を排除するために、クラス分類されたタンパク質群のTermの中で一番頻出頻度が高いものを共通規則として抽出してもよい。
データマイニングでは、例えば、得られたデータ1〜3に対し、amino acid transporter(GO:0006865)に対応するデータ(タンパク質)という拘束条件を設けて、それに該当するタンパク質群のみでデータマイニング、さらにはクロスバリデーションすることで、amino acid transporterがどの程度、クラス分類に寄与するかを定量的に把握することができる。
また、amino acid transporter(GO:0006865)の上階層は、amino transport(GO:0015837)である。そこで別のデータマイニングでは、得られたデータ1〜3に対し、amino transport(GO:0015837)に対応するデータ(タンパク質)という拘束条件を設けて、それに該当するタンパク質群のみでデータマイニング、さらにはクロスバリデーションすることで、amino transporterがどの程度、クラス分類に寄与するかを定量的に把握することができる。
加えて、amino acid transporter(GO:0006865)の下階層は、acidic amino acid transport(GO:0015800)である。そこで別のデータマイニングでは、得られたデータ1〜3に対し、acidic amino acid transport(GO:0015800)に対応するデータ(タンパク質)という拘束条件を設けて、それに該当するタンパク質群のみでデータマイニング、さらにはクロスバリデーションすることで、acid amino acid transporterがどの程度、クラス分類に寄与するかを定量的に把握することができる。
仮に、"acidic amino acid transportを含む"を拘束条件としてデータマイニングを行った結果(正解率もしくはエラー率)を、"amino transport"を含む拘束条件としデータマイニングを行った結果及び"amino acid transport"を含む拘束条件としデータマイニングを行った結果と比較した場合に、"acidic amino acid transportを含む"を拘束条件としてデータマイニングを行った結果が他2者より良ければクラス分類には、" amino acid transporter "及び" amino transporter "ではなく、" acidic amino acid transport "が重要であることが分かる。これにより、自己免疫疾患に関与するタンパク質の分子機能を上階層から下階層に絞りこむことができる。
加えて、データ1〜3には含まれておらず、かつ共通規則の特性を有するタンパク質を、上記(1)〜(3)の工程を実施することにより、追加のデータであるデータ5を取得することができる。さらに、データ5をデータ4に組み合わせることにより、精度の高く、より一般性の高い共通規則を抽出することができる。
また、1つのハブタンパク質として、9種類のタンパク質(IL-5、STX1A、CSNK2A1、VAMP2、GSK3B、PRKCZ、PCNA、PIN1、STX4)を特定できる。さらに、別のハブタンパク質として、10種類のタンパク質(HRB、HMGN1、HIST1H1C、TUBB、NPM1、VAMP8、VAPA、STX3、RABAC1、CCND2)を特定することができる。
文献データベースとしては、一般に、米国NCBIのMEDLINEやOMIMを用いているが、その他の文献データベースでもかまわない。
パスウェイ解析により、自己免疫疾患に関与するタンパク質の共通規則を抽出する工程を説明する。また、パスウェイ解析ソフトウェアとしては、公知のソフトウェア{例:Pathway Assist ver3.0(Ariadne Genomics)}を用いることができる。
上記説明したように示差的に発現している1以上のタンパク質(自己抗原タンパク質)群のデータ4を含む発現タンパク質リストを作成する。
そして、作成した発現タンパク質リストをパスウェイ解析ソフトウェアにインポートする。なお、下記実施例においては、公知のパスウェイ解析ソフトウェアを用いてパスウェイ解析を行なっているため、添付されている説明書のプロトコールに従った。
次に、発現タンパク質リスト内でのパスウェイを計算する。即ち、生物医学文献情報を記憶している公共のデータベースであるMEDLINEデータベースにおいて検索可能な論文の要約中から、パスウェイ解析ソフトウェアの処理アルゴリズム(Natural Language Processing Engine)で関連付けられている分子間のつながりが検索される。
そして、分子間のつながりが抽出された場合には、分子間のつながりを示すパスウェイが計算される。
従って、複数の検証を行うことにより、特定されたタンパク質群と自己免疫疾患の相関を有する可能性が高いものであるとの予測をより確実なものとすることができる。
加えて、段落「0026」及び「0027」に記載のように、データマイニング等の工程を追加してもよい。
本発明で使用する哺乳動物由来のタンパク質は、好ましくは、無細胞タンパク質合成系、より好ましくは真核生物由来のコムギ胚芽等を用いた無細胞タンパク質合成用抽出液を使用して発現させる。
市販のタンパク質合成用抽出液としては、ウサギ網状赤血球由来のRabbit Reticulocyte Lysate System(Promega社)やコムギ胚芽由来のWheat Germ Expression Premium Kit(WEPRO登録商標、株式会社セルフリーサイエンス)等が挙げられる。
本発明に適用される最良の抽出液は、コムギ胚芽由来の抽出液であり、さらに混入する胚乳成分や胚芽組織細胞中のタンパク質合成阻害をもたらすグルコースなどの代謝物質が実質的に除去された抽出液である。なお、胚乳成分が実質的に除去された抽出液とは、リボソームの脱アデニン化率が7%以下、好ましくは1%以下になっていること意味する。さらに、好適には、細胞抽出液は、糖、リン酸化糖が10mM以下、好ましくは6mM以下まで低減されている(260nmにおける吸光度200OD/mlの抽出液中のグルコース濃度として)。このような抽出液の調製方法は、WO2005/063979 A1号公報に例示される。
これにより、本発明の解析方法では、多量の哺乳動物由来のタンパク質に対する自己抗体の抗体価を効率的に測定することができる。
本発明の「自己抗体の検出データの取得」とは、自己免疫疾患患者に特異的に発現している自己抗体を検出することを意味し、より詳しくは該自己抗体の抗体価を測定することである。なお、抗体価を検出する方法は自体公知の方法を利用することができる。
本発明では検出した1以上の自己抗体の抗体価の数値をエクセルファイル(Microsoft社製)等に書き込むことにより、データとして取得することができる。
本発明では、自己抗体の抗体価の検出方法は特に限定されない。しかし、洗浄工程を省略できるホモジニアスアッセイ、特にALPHAを検出系として使用することが好ましい。
本発明では、好ましくはALPHAを使用することで、大量に発現したタンパク質を効率的かつ高精度に検出することができる。
ALPHA は、PerkinElmer社のAlphaScreenTMが代表的なアッセイ法である。
その方法は、近接させられたドナービーズとアクセプタービースとの間に一重項酸素の移動に基づく分析方法である。これは、680nmでの励起において、ドナービース中の光増感剤は、周囲の酸素を一重項状態の酸素に変換し、その酸素が200nmの距離まで拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、エネルギーをビーズ内の蛍光アクセプターに移動させ、続いて約600nmで光を放出する。なお、アクセプタービーズは、ガラス、シリカゲル、樹脂のような不活性担体であって、上記生体分子を固定化しておくための担体である。ドナービースは、ガラス、シリカゲル、樹脂のような不活性担体であって、ストレプトアビジンを固定化しておくための担体である。
ビオチン化した哺乳動物由来のタンパク質(ビオチン化哺乳動物由来タンパク質と称する場合がある)、該ビオチン化基質を直接的又は間接的に認識可能なアクセプタービーズ{Anti-IgG(protein G) Acceptor Beads}、ストレプトアビジンが結合したドナービース、自己免疫疾患患者由来の試料(血清)及び/又は健常者由来の試料をマイクロプレートに添加する。
ここで、ビオチン化哺乳動物由来タンパク質に対する自己抗体が発現していれば、該自己抗体が該ビオチン化哺乳動物由来タンパク質を抗原として認識(結合)することにより、ドナービースとアクセプタービーズが近接してシグナルの上昇が起こる。
一方、ビオチン化哺乳動物由来タンパク質に対する自己抗体が発現していなければ、該自己抗体が該ビオチン化哺乳動物由来タンパク質を抗原として認識(結合)しないので、ドナービースとアクセプタービーズが近接できずシグナルの上昇が起こらない。
なお、シグナルの検出方法は、例えばアクセプタービーズが発する蛍光強度を使って測定する。
本発明では、自己抗体の抗体価の検出は、哺乳動物由来タンパク質又はその断片を、自己免疫疾患、特に動脈硬化症由来の試料(特に血清)に接触させることによって行うことができる。哺乳動物由来タンパク質又はその断片に結合する自己抗体は、自体公知のイムノアッセイにより検出することができる。具体的な方法は、以下の通りであるが、特に限定されない。
哺乳動物由来タンパク質又はその断片に結合する自己抗体を、抗ヒト・イムノグロブリン抗体によって検出する。このとき、哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片、又は、抗ヒト・イムノグロブリン抗体を予め固相化しておくと、未反応成分の除去(一般にB/F分離と呼ばれる)を洗浄によって容易に行うことができる。
例えば、固相化哺乳動物由来タンパク質又はその断片を患者血清に接触後、血清を除去してから抗ヒト・イムノグロブリン抗体を加える。抗ヒト・イムノグロブリン抗体を標識しておけば、自己抗体に比例して固相に結合する標識が増加する。この抗ヒト・イムノグロブリン抗体は、第2抗体と呼ばれる抗体に相当する。抗ヒト・イムノグロブリン抗体として、抗体のクラスを識別しうる抗体を利用すれば、自己抗体をクラス別に検出することもできる。哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片、試料(例:血清)、および抗ヒト・イムノグロブリン抗体とは、同時に反応させることもできる。
一方、イムノクロマトグラフィーでは、先に述べた固相化哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片がクロマトグラフ媒体中に存在し、これに対して試料中の自己抗体、そして標識した抗ヒト・イムノグロブリン抗体を反応させ、更に未反応成分の分離がクロマトグラフ媒体中で反応と並行して行われるように設計されている。
哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片と抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体との免疫学的な反応を、自己抗体が阻害する現象を利用して、自己抗体の検出が可能である。この場合にも、未反応成分の除去は、固相を利用して簡便に行うことができる。すなわち、抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体と血液試料の存在下で哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片と接触させるとき、抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体と哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片のいずれかを固相化し、他方を標識して用いる。加えて、B/F分離の後に固相に結合した標識量に基づいて自己抗体の検出が可能である。競合的なイムノアッセイを行う場合、反応成分として用いる抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体は、自己抗体と競合するものであればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であっても良い。
哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片と試料とを接触させた後に、抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体との反応を行う。哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片に対する自己抗体を含まない場合には哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片と抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体との反応が阻害されないが、試料中に哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片に対する自己抗体が存在すれば阻害をもたらす。
具体的には、まず固相化哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片を試料に加え、十分に反応させた後に、さらに抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体を加える。抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体を標識しておけば、固相に結合した(またはしなかった)標識量を測定することによって自己抗体の存在を確認することができる。あるいは、標識した哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片と試料を接触させ、これを固相化した抗哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片抗体と接触させることも可能である。特にイムノクロマトグラフィーに応用する場合には利点がある方法である。
抗ヒト・イムノグロブリン抗体や哺乳動物由来タンパク質若しくはその断片のような反応成分は、これらの標識成分によって直接標識することもできるし、あるいは更にこれらの成分を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。各種の抗体を固相に結合させるには、マイクロプレート、プラスチックビーズ、あるいは合成樹脂微粒子のような固相担体を用い、物理吸着や化学的な結合、あるいはアビジン−ビオチンを用いた間接的な結合方法が一般に利用される。これらの免疫成分を固相化した担体は、ウシ血清アルブミンやスキムミルクなどの不活性タンパク質で処理することによって、非特異的な反応を抑制することができる。なお、固相と酵素標識を組み合わせたとき、このイムノアッセイは特にELISAと呼ばれる。
本発明の自己免疫疾患、特に動脈硬化症の検査において、以下のタンパク質群のいずれか1以上の抗体を患者由来の試料、特に血清から検出する。
なお、本発明の検査とは、発症リスク検査、重症度の判定検査、治療効果の判定検査を含む。
(1)サイトカインに関与するタンパク質群
(2)アミノ酸輸送体に関与するタンパク質群
サイトカインに関与するタンパク質群としては、好ましくは、IL-5(interleukin-5)、STX1A(syntaxin 1A)、CSNK2A1(casein kinase 2, alpha 1 polypeptide)、VAMP2{vesicle-associated membrane protein 2 (synaptobrevin 2)}、GSK3B(glycogen synthase kinase 3 beta)、PRKCZ (protein kinase C, zeta)、PCNA(proliferating cell nuclear antigen)、STX4(syntaxin 4)若しくはPIN1(peptidylprolyl cis/trans isomerase, NIMA-interacting 1)、及び/又はHRB(HIV-1 Rev binding protein)、HMGN1(high-mobility group nucleosome binding domain 1)、HIST1H1C(histone cluster 1, H1c)、TUBB(tubulin, beta)、NPM1{nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, numatrin)}、VAMP8(vesicle-associated membrane protein 8)、VAPA{VAMP (vesicle-associated membrane protein)-associated protein A}、STX3(SYNTAXIN 3)、CCND2(cyclin D2)若しくはRABAC1(Rab acceptor 1)であるが特に限定されない。
アミノ酸輸送体に関与するタンパク質群としては、好ましくは、SLC7A11{solute carrier family 7, (cationic amino acid transporter, y+ system) member 11}、SLC36A4{solute carrier family 36 (proton/amino acid symporter), member 4}、SLC7A9{solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 9}又はSLC1A3{solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate transporter), member 3}であるが特に限定されない。
加えて、下記実施例9〜11の結果により、上記タンパク質群の中でも、IL-5が好ましい。さらに、IL-5はfull lengthである完全長だけでなく、部分配列{例、IL-5(20-135: : IL-5の20位から135位を意味する。以下同じ)、IL-5(64-135:IL-5の64位から135位を意味する。以下同じ)}、特に分泌型IL-5{ IL-5(20-135) }も含む。
本発明の自己免疫疾患、特に動脈硬化症の検査キットは、上記述べた各ELISA、化学発光法、イムノクロマト法等を実施するためのキットでありうる。
特に、ELISAキットでは、IL-5、STX1A、CSNK2A1、VAMP2、GSK3B、PRKCZ、PCNA、PIN1、STX4、HRB、HMGN1、HIST1H1C、TUBB、NPM1、VAMP8、VAPA、STX3、RABAC1、CCND2、RABAC1、SLC7A11、SLC36A4、SLC7A9、及び/又はSLC1A3を含み、さらに以下のいずれか1の構成を含む。
(1)マイクロプレート
(2)標準液
(3)陽陰性コントロール
(4)反応用緩衝液
(5)酵素標識抗体
(6)洗浄用緩衝液
(7)酵素基質液
(8)反応停止液
本実施例では、アテローム性動脈硬化症の患者(23名)から得た血清を試料とした。さらに、該試料を、軽度の患者(mild)、重症患者(Serious)、軽度かつ陳旧性患者(mild Old)及び重症かつ陳旧性患者(mild Old)に分けて解析した。
なお、健常者由来の血清をコントロールとした。
翻訳鋳型となるmRNAは、各種哺乳動物由来タンパク質(約3千種類)をコードする遺伝子にビオチンタグを融合したビオチン化タンパク質転写鋳型であるベクターを作成した(pEU-ビオチン化タグ-各種哺乳動物由来タンパク質)。該ベクターを基に、タバコモザイクウィルス(TMV)のΩ配列部分を含むPCR産物を鋳型とした。該転写鋳型を、転写反応溶液〔最終濃度、80mM HEPES−KOH pH7.8、16mM 酢酸マグネシウム、10mM ジチオトレイトール、2mM スペルミジン、2.5mM 4NTPs(4種類のヌクレオチド三リン酸)、0.8U/μLRNase阻害剤、1.6U/μL SP6 RNAポリメラーゼ〕に添加し、37℃で3時間反応させた。得られたRNAをフェノール/クロロフォルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column(Amersham Pharmacia Biotech社製)により精製して翻訳鋳型とした。
96穴タイタープレートを反応容器として用いた。
先ず、125.0μLの供給相(2×Substrate Mixture 62.5μ1、50μMのビオチン1.25μ1、MilliQ 61.25μ1)をタイタープレートに添加した。次に、25.0μ1の反応相(4μg/μLのcreatine kinase 0.25μ1、無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽Extract(200 O.D.)6.5μ1、ビオチン化酵素(180 O.D.)1.0μ1、2×Substrate Mixture 8.75μ1、5μMのビオチン2.5μ1、MilliQ 3.5μ1)に、上記実施例2の各翻訳鋳型{ペレット状の翻訳鋳型(mRNA)を25μLの反応液で溶かした}を添加したものを、注意深く静かにタイタープレートの底に添加した。タンパク質合成反応は、26度、15〜20時間の静置で行った。
合成終了のビオチン化タンパク質は精製せずに、以下の実施例に用いた。
384穴タイタープレート(Optiplate-384TPP)を反応容器として用いた。
8.0μLのMixture A{6.0μLのMillQ, 1.0μLの10×AlphaScreen Buffer(1M Tris-HCl, pH8.0/0.1% Tween20), 1.0μLの10mG/mL BSA}、10μLの血清{(+):2.5×10-3希釈}及び5.0μLの上記実施例3の各種のビオチン化哺乳動物由来タンパク質(5倍希釈、Biomek FXを使用)を、それぞれの穴に添加して、26℃、30分間静置した。
上記静置後、10μLのMixture B(7.88μLのMillQ, 1.0μLの10×AlphaScreen Buffer(1M Tris-HCl, pH8.0/0.1% Tween20), 1.0μLの10mG/mL BSA, 0.06μLの{5mG/mL StreptAvidin Donor Beads, 0.06μLの5mG/mL Anti-IgG (protein G) Acceptor Beads}を、さらにそれぞれの穴に添加して、26℃、60分間静置した。
上記静置後、EnVisionを用いて蛍光強度(自己抗体価)を測定した。
上記結果から、哺乳動物由来タンパク質の相違により自己抗体の検出結果が異なることがわかった。
さらに、抗体価の高い自己抗原タンパク質に関するデータを取得した。
上記実施例4から得られた各患者{軽度の患者(mild)、重症患者(Serious)、軽度かつ陳旧性患者(mild Old)及び重症かつ陳旧性患者(mild Old)}由来の試料における蛍光強度(自己抗体価)のデータを、コントロールである健常者由来の試料における蛍光強度(自己抗体価)のデータを比較して、示差的に発現している自己抗体(特に、発現が上昇している自己抗体)の自己抗原タンパク質群のデータを取得した。
より詳しくは、各々のデータを自然対数変換したのち、平均・標準偏差を使ってスコア化(平均値を0として、+1SDのものを1, +2SDのものを2とする)した。さらに、スコアの上位のものから382種類のタンパク質を選択した。
なお、cluster 1〜4は、それぞれ、126個(参照:図6、7)、62個(参照:図6、7)、129個(参照:図6、7)及び65個(参照:図6、7)を示すグループであった。
図8の結果から明らかなように、各疾患の状態により、自己抗体の抗体価が異なることがわかった。
図9の結果から明らかなように、各疾患の状態及び各クラスターにより自己抗体の抗体価が異なることがわかる。
特に、cluster1に属するタンパク質に対する自己抗体の抗体価が非常に高いことがわかった。
これにより、血清中の自己抗体に対する自己抗原タンパク質を検出することにより、自己免疫疾患、特に動脈硬化症の発病リスク、重症度、治療効果の判定を行うことができる。
上記実施例5で取得した自己免疫疾患、特にアテローム性動脈硬化で示差的に発現しているタンパク質群の各クラスター別のデータを、公共のデータベース(http://www.geneontology.org/)にインポートした。
図10に示すように、各クラスター別では、Termが異なることがわかる。なお、図10の計算値(Pvalue)は、複数のシグナル値のグループを比較し検定を行った計算結果である。Termは遺伝子の機能を示す。
また、各クラスターで頻出Termに関し、cluster1はアミノ酸輸送体(Amino acid transporter)、cluster2は炎症反応(Inflammation)、糖質代謝(Carbohydrate matabolism)及びステロイド代謝(Steroid metabolism)、cluster3は翻訳(Translation)、転写(Transcription)及び組換え(recombination)、並びにcluster4はRNA異化(RNA catabolism)であった。
これにより、図3に示したタンパク質群であるSLC7A11、SLC36A4、SLC7A9及びSLC1A3は、自己免疫疾患、特に動脈硬化に関与するタンパク質であると判定することができる。
すなわち、自己免疫疾患、特にアテローム性動脈硬化の患者由来の試料、特に血清中のSLC7A11、SLC36A4、SLC7A9及びSLC1A3に対する自己抗体の抗体価を検出、測定することにより、自己免疫疾患、特に動脈硬化症、さらにはアテローム性動脈硬化症の発病リスク、重症度、治療効果の判定を行うことができる。
上記実施例5で取得した自己免疫疾患、特にアテローム性動脈硬化で示差的に発現しているタンパク質群のデータを、公知のソフトウェア{GeneSphere,Fujitsu(http://venus.netlaboratory.com/drug_discovery/genesphere/feature/)}で解析し、パスウェイ単位でタンパク質発現を評価した場合に自己免疫疾患において健常者群と比べて有意に発現変動しているパスウェイを抽出した。
図4の結果により、14種類のタンパク質(IL-5、STX1A、CSNK2A1、VAMP2、GSK3B、PRKCZ、PCNA、PIN1、STX4、HRB、HMGN1、HIST1H1C、TUBB、NPM1、VAMP8、VAPA、STX3、RABAC1、CCND2)を特定した。
すなわち、自己免疫疾患、特に動脈硬化、さらにはアテローム性動脈硬化の患者由来の試料、特に血清中のIL-5、STX1A、CSNK2A1、VAMP2、GSK3B、PRKCZ、PCNA、PIN1及びSTX4、さらには、HRB、HMGN1、HIST1H1C、TUBB、NPM1、VAMP8、VAPA、STX3、RABAC1及びCCND2に対する自己抗体の抗体価を検出、測定することにより、自己免疫疾患、特にアテローム性動脈硬化症の発病リスク、重症度、治療効果の判定を行うことができる。
上記解析して得られた各タンパク質(IL-5、STX1A、CSNK2A1、VAMP2、GSK3B、PRKCZ、PCNA、PIN1、STX4、HRB、HMGN1、HIST1H1C、TUBB、NPM1、VAMP8、VAPA、STX3、RABAC1、CCND2、SLC7A11、SLC36A4、SLC7A9及びSLC1A3)を用いて上記実施例4と同様な方法により、患者由来の血清中の自己抗体の抗体価を測定した。
これにより、上記解析して得られた各タンパク質を用いれば自己免疫疾患、特にアテローム性動脈硬化症の発病リスク、重症度、治療効果の判定を行うことができる。
さらには、本発明の解析方法は、自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法として優れていることがわかった。
上記実施例1〜8により自己免疫疾患、特にアテローム性動脈硬化症の発病リスク、重症度、治療効果の判定の指標となる抗IL-5抗体の抗体価を詳細に測定した。詳細は、以下の通りである。
上記実施例2〜4と同様な方法により、Full length IL-5、Full length IL-5より抗体価の高い分泌型IL-5(20-135)及び部分配列IL-5(64-135)をコードする遺伝子を基にして、ビオチン化Full length IL-5、ビオチン化IL-5(20-135)及びビオチン化IL-5(64-135)を無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽Extractで発現させた。
さらに、ビオチン化Full length、 ビオチン化分泌型IL-5(20-135)及びビオチン化部分配列IL-5(64-135)を、それぞれ、冠状動脈硬化症患者(IHD)及び閉塞性動脈硬化症患者(ASO)由来の血清中に添加して、抗IL-5抗体の抗体価を測定した。
図11に示すように、冠状動脈硬化症患者血清中の抗IL-5抗体は、Full length IL-5よりも、分泌型IL-5(20-135)及び部分配列IL-5(64-135)を強く認識することを確認した。
図12に示すように、閉塞性動脈硬化症患者及び冠状動脈硬化症患者血清中の抗IL-5抗体は、分泌型IL-5(20-135)を認識していることを確認した。
以上により、閉塞性動脈硬化症患者及び冠状動脈硬化症患者血清中の抗IL-5抗体は、Full length IL-5だけでなく、分泌型IL-5(20-135)及び部分配列IL-5(64-135)を認識する。これにより、分泌型IL-5(20-135)及び部分配列IL-5(64-135)に対する自己抗体を患者の血清中から検出することにより、自己免疫疾患、特に動脈硬化症の検査を行うことができる。
動脈硬化症患者である冠状動脈硬化症患者血清中(n=20)及び健常者由来の血清中(n=10)のIL-5濃度をELISA(IMMUNOTECH, Mareille, France)で測定した。
なお、IL-5は、IL-5 遺伝子配列を基にして、無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽Extractで発現させた。
図13に示すように、動脈硬化症患者である冠状動脈硬化症患者血清のIL-5濃度が有意に低下していることを確認した。
以上により、患者の血清中のIL-5濃度を検出することにより、自己免疫疾患、特に動脈硬化症の検査を行うことができる。
上記実施例9〜10の結果を基にして、抗IL-5抗体の抗体価の受信者動作特性曲線を作成した。
図14に示すように、抗IL-5抗体の抗体価の感度・特異度は、カットオフ値を1.19-1.21にすると、感度約81.3%, 特異度90%となる。
以上により、患者の血清中のIL-5抗体の抗体価の検出による自己免疫疾患、特に動脈硬化症の検査は、感度及び特異度が高いことを確認した。
Claims (5)
- IL-5に対する自己抗体の抗体価を患者由来の試料から検出することを特徴とする動脈硬化の検査方法。
- 前記動脈硬化が、アテローム性動脈硬化症である請求項1の検査方法。
- 前記検査方法は、発病リスクの検査、重症度の判定検査、又は治療効果の判定検査である請求項2の検査方法。
- 動脈硬化検査を実施するための、IL-5を含む検査キット。
- 動脈硬化検査を実施するための、IL-5を含み、さらに少なくとも以下のいずれか1を含む検査キット。
(1)マイクロプレート
(2)標準液
(3)陽陰性コントロール
(4)反応用緩衝液
(5)酵素標識抗体
(6)洗浄用緩衝液
(7)酵素基質液
(8)反応停止液
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010256418 | 2010-11-17 | ||
JP2010256418 | 2010-11-17 | ||
PCT/JP2011/076450 WO2012067165A1 (ja) | 2010-11-17 | 2011-11-16 | 自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012067165A1 JPWO2012067165A1 (ja) | 2014-05-12 |
JP5904553B2 true JP5904553B2 (ja) | 2016-04-13 |
Family
ID=46084088
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012544286A Active JP5904553B2 (ja) | 2010-11-17 | 2011-11-16 | 自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9310380B2 (ja) |
JP (1) | JP5904553B2 (ja) |
WO (1) | WO2012067165A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190085056A (ko) * | 2016-11-15 | 2019-07-17 | 후지쿠라 가세이 가부시키가이샤 | 동맥 경화의 검출 방법 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014075995A (ja) * | 2012-10-09 | 2014-05-01 | Norichika Ogata | トランスクリプトームを用いた、発現変動遺伝子抽出又はパスウェイ解析にかける実験区の選定方法 |
JP7012366B2 (ja) | 2016-10-19 | 2022-02-14 | 公立大学法人横浜市立大学 | 抗動脈硬化剤及び動脈硬化の病態判定方法 |
CN109142740A (zh) * | 2017-06-16 | 2019-01-04 | 欧蒙医学诊断技术有限公司 | 神经自身免疫疾病的诊断 |
JP7153054B2 (ja) * | 2017-07-13 | 2022-10-13 | マグアレイ,インコーポレイテッド | 自己抗体の定量方法 |
JP6944700B2 (ja) * | 2017-10-02 | 2021-10-06 | 学校法人 川崎学園 | 自己免疫異常の検査方法 |
JP2021528639A (ja) * | 2018-06-20 | 2021-10-21 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | Aav治療の方法 |
CN110412278A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-11-05 | 四川大学华西医院 | Slc1a3自身抗体检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途 |
CN113721021B (zh) * | 2021-09-16 | 2023-07-07 | 郑州大学 | Prkcz自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008501636A (ja) * | 2004-04-15 | 2008-01-24 | アテラ バイオテクノロジーズ エービー | 新規組成物 |
JP2009503529A (ja) * | 2005-08-02 | 2009-01-29 | エクスバイオテク インコーポレーティッド | IL−1α自己抗体を用いた血管障害の診断、処置、および予防 |
JP2009544971A (ja) * | 2006-07-26 | 2009-12-17 | イノヴァ ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | 急性アテローム硬化症候群を有する患者を診断するための組成物および方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007199047A (ja) * | 2005-12-28 | 2007-08-09 | Cellfree Sciences Co Ltd | ビオチン化タンパク質の調製方法及び該タンパク質を用いた検出方法 |
WO2008064336A2 (en) * | 2006-11-22 | 2008-05-29 | Inivitrogen Corporation | Autoimmune disease biomarkers |
-
2011
- 2011-11-16 WO PCT/JP2011/076450 patent/WO2012067165A1/ja active Application Filing
- 2011-11-16 US US13/988,269 patent/US9310380B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-11-16 JP JP2012544286A patent/JP5904553B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008501636A (ja) * | 2004-04-15 | 2008-01-24 | アテラ バイオテクノロジーズ エービー | 新規組成物 |
JP2009503529A (ja) * | 2005-08-02 | 2009-01-29 | エクスバイオテク インコーポレーティッド | IL−1α自己抗体を用いた血管障害の診断、処置、および予防 |
JP2009544971A (ja) * | 2006-07-26 | 2009-12-17 | イノヴァ ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | 急性アテローム硬化症候群を有する患者を診断するための組成物および方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6011067097; BINDER,C.J. et al.: 'The role of natural antibodies in atherogenesis' J.Lipid Res. Vol.46, No.7, 2005, p.1353-1363 * |
JPN6011067098; 能勢眞人 他: '難治性血管炎に関する調査研究 無細胞タンパク質合成系による自己抗体のスクリ-ニング法と簡便なELISA法の' 難治性血管炎に関する調査研究 平成19年度 総括・分担研究報告書 , 2008, Page.53-56 * |
JPN6015045050; Sampi,M. et al.: 'Plasma Interleukin-5 Levels Are Related to Antibodies Binding to Oxidized Low-Density Lipoprotein an' Journal of the American College of Cardiology Vol.52, No.17, 20081021, 第1370-1378頁, Elsevier Inc. * |
JPN6015045052; BINDER,C.J. et al.: 'IL-5 links adaptive and natural immunity specific for epitopes of oxidized LDL and protects from ath' The Journal of Clinical Investigation Vol.114, No.3, 20040801, 第427-437頁, The American Society for Clinical Investigation * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190085056A (ko) * | 2016-11-15 | 2019-07-17 | 후지쿠라 가세이 가부시키가이샤 | 동맥 경화의 검출 방법 |
KR102365805B1 (ko) | 2016-11-15 | 2022-02-22 | 후지쿠라 가세이 가부시키가이샤 | 동맥 경화의 검출 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9310380B2 (en) | 2016-04-12 |
WO2012067165A1 (ja) | 2012-05-24 |
US20130273579A1 (en) | 2013-10-17 |
JPWO2012067165A1 (ja) | 2014-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5904553B2 (ja) | 自己免疫疾患に関与するタンパク質の解析方法及び該疾患の検査方法 | |
Deutsch et al. | Advances and utility of the human plasma proteome | |
Xu et al. | In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine | |
Baird et al. | Age-dependent changes in the cerebrospinal fluid proteome by slow off-rate modified aptamer array | |
Schwenk et al. | Toward next generation plasma profiling via heat-induced epitope retrieval and array-based assays | |
Bruzelius et al. | PDGFB, a new candidate plasma biomarker for venous thromboembolism: results from the VEREMA affinity proteomics study | |
KR20140084106A (ko) | 심혈관 위험 사건 예측 및 그것의 용도 | |
US10859572B2 (en) | Biomarker signatures and uses thereof | |
Tozzoli | Recent advances in diagnostic technologies and their impact in autoimmune diseases | |
US20050266467A1 (en) | Biomarkers for multiple sclerosis and methods of use thereof | |
KR101338136B1 (ko) | 금 나노입자를 이용하여 신호 증폭도가 향상된, 표적 물질의 다중화 처리 분석법과 그 시스템 | |
CN109738653B (zh) | 用于阿尔茨海默症的检测、诊断或风险预测的抗原蛋白组合以及包含其的试剂盒 | |
Bodansky et al. | Autoantigen profiling reveals a shared post-COVID signature in fully recovered and long COVID patients | |
Krasitskaya et al. | Bioluminescent aptamer-based sandwich-type assay of anti-myelin basic protein autoantibodies associated with multiple sclerosis | |
Li et al. | Applications of protein microarrays in biomarker discovery for autoimmune diseases | |
Kuusela et al. | Changes in plasma protein levels as an early indication of a bloodstream infection | |
WO2015164616A1 (en) | Biomarkers for detection of tuberculosis | |
Alghamdi et al. | Advances in the diagnosis of autoimmune diseases based on citrullinated peptides/proteins | |
Poulsen et al. | Identification of potential autoantigens in anti-CCP-positive and anti-CCP-negative rheumatoid arthritis using citrulline-specific protein arrays | |
Ding et al. | Potential biomarkers identified by tandem mass tags based quantitative proteomics for diagnosis and classification of Guillain–Barré syndrome | |
Couch | Challenges associated with using extracellular vesicles as biomarkers in neurodegenerative disease | |
Magnusson et al. | RNA-sequencing and mass-spectrometry proteomic time-series analysis of T-cell differentiation identified multiple splice variants models that predicted validated protein biomarkers in inflammatory diseases | |
Yin et al. | Proteome profiling of early gestational plasma reveals novel biomarkers of congenital heart disease | |
WO2022271865A2 (en) | Protein biomarker indicators of neurological injury and/or disease and methods of use thereof | |
Mossotto et al. | Evidence of a genetically driven metabolomic signature in actively inflamed Crohn’s disease |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141113 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141125 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160108 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160215 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160309 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5904553 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |