JP2021528639A - Aav治療の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)治療を使用する、対象における疾患を処置する方法に関する。ある態様において、方法は、対象における抗AAV抗体の総レベルの検出により、AAV治療に適する患者を同定し、低抗AAV抗体力価を有する対象にAAV治療剤を投与することを含む。
アデノ随伴ウイルス(AAV)を担持する導入遺伝子は、変異体もしくはヌルタンパク質発現をもたらす遺伝的欠損の矯正または既存の低レベルタンパク質発現の増強のための遺伝子療法(Nathwani et al to A.M Keeler et. al)ならびにおそらく遺伝子ノックダウン、ゲノム編集または修飾および非コード化RNA調節(Valdmanis et. al 2017)のための重要なツールである。しかしながら、ヒトは、AAVに幼少期に暴露され、AAVベクターの中和により遺伝子治療薬物の有効性に負に影響し得る、中和抗AAV抗体を含む、抗AAV抗体を獲得するようになっている(Blacklow et al., 1967; Boutin et al., 2010; Calcedo et al., 2009, 2011; Liu et al., 2013)。
ある態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるAAVに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗AAV抗体」)の力価を測定することを含む、方法に関する。ある実施態様において、方法は、低力価の抗AAV抗体を有するとして同定された対象にAAV治療剤を投与することをさらに含む。
実施態様
本発明のある態様は、アデノ随伴ウイルス(AAV)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるAAVに結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗AAV抗体」)の力価を測定することを含む、方法に関する。本発明のある態様は、対象にAAV治療剤を投与することを含む、対象における疾患を処置する方法に関する。ある態様において、対象は、ELISAで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して低力価の抗AAV抗体を有するとして同定される。ある態様において、本発明は、AAV治療に適する対象を同定するハイスループット法であって、ELISAを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法に関する。
本発明がより容易に理解され得るために、一部用語をまず定義する。本出願で使用するものであって、本明細書で特に断らない限り、下記用語の各々は、次に示す意味を有する。さらなる定義は、本明細書をとおして示される。
本発明のある態様は、アデノ随伴ウイルス(AAV)治療に適する対象を同定する方法であって、ELISAを使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるAAVに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗AAV抗体」)の力価を測定することを含む、方法に関する。ある実施態様において、方法は、低力価の抗AAV抗体を有するとして同定された対象にAAV治療剤を投与することをさらに含む。
本発明のある態様は、対象における抗AAV抗体を検出するおよび/またはAAVを投与する方法に関する。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科の無エンベロープ、一本鎖DNAウイルスである。パルボウイルス科の大部分の他のメンバーと対照的に、AAVは複製欠損であり、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス存在下でのみ効率的に複製できる。
AAVの一本鎖ゲノムは、3遺伝子s、rep(複製)、cap(カプシド)およびaap(アセンブリー)を含む。これら3遺伝子は、3個のプロモーター、オルタナティブ翻訳開始部位および選択的スプライシングの使用を介して少なくとも9個の遺伝子産物を生じさせる。
ある実施態様において、AAVは第一ITR、例えば、5’ ITRおよび第二ITR、例えば、3’ ITRを含む。一般に、ITRは原核生物プラスミドからのパルボウイルス(例えば、AAV)DNA複製およびレスキューまたは切除に関与する(Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb and Muzyczka, 1988)。さらに、ITRは、AAVプロウイルス組込みおよびAAV DNAのビリオンへのパッケージングに必要な最小配列であると報告されている(McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989)。これらの要素は、パルボウイルスゲノムの効率的増殖に必須である。
本発明のある態様は、対象にAAV治療剤を投与する方法に関する。ある実施態様において、AAVは目的の遺伝子(GOI, Gene of Interest)を含む。ある実施態様において、目的の遺伝子は非AAV遺伝子である。ある実施態様において、GOIは哺乳動物遺伝子である。ある実施態様において、GOIはヒト遺伝子である。ある実施態様において、目的の遺伝子は生物学的に活性なポリペプチドをコードする。ある実施態様において、生物学的に活性なポリペプチドはサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、凝固因子、ホルモン、抗体、インスリンまたはこれらの何れかの組み合わせである。
本発明のある態様は、ELISAを使用して生物学的サンプルにおける抗AAV抗体の力価を検出および/または測定する方法に関する。当分野で知られるあらゆるELISAをここに記載する方法において使用できる。ある実施態様において、ELISAは集団ELISAである。ある実施態様において、ELISAは発光ELISAである。ある実施態様において、ELISAは化学発光ELISAである。
本試験は、患者除外目的のために細胞ベースのアッセイを総抗体アッセイに置き換えることを目的として、ELISAを使用して測定した抗AAV抗体の総力価と標準の細胞ベースのアッセイを使用して測定した中和抗体の力価の間に相関性があるかを決定することを意図とする。
材料
血清サンプルを、スコットランド、ダンディー大学で同意した患者から採取した。対象は、HFrEF(駆出率が低下した心不全)またはHFpEF(駆出率が保持された心不全)を有する心不全患者であった。血清サンプルをBMSとダンディー大学間で締結された材料移送契約(MTA)により調達し、使用するまでBMS Biorepositoryで−80℃において保管した。
rAAV9S100A1(AMT-120; uniQure Amsterdam)またはrAAV9HLuc(AAV9−CMV−ルシフェラーゼ924;uniQure Amsterdam)保存品を炭酸−重炭酸緩衝液(SRE0034; SIGMA)で2.5〜5.1×1011力価粒子/mL(約4〜8μg/mL総タンパク質濃度)に希釈した。100μLをELISプレートにコートし、プレートをマイクロプレートシーラー(WHA77040001; SIGMA)でシールし、4℃冷蔵庫で16〜18時間インキュベートして、プレートのポリスチレン表面へAAV9を受動吸着させた。比色分析ELISAには、Nunc 96ウェル透明ポリスチレンプレート(Thermo Fisher Roskilde, Denmark)を使用した。化学発光ELISAには、Corning 96ウェル黒色ポリスチレンプレート(Corning Inc. NY)を使用した。翌日、プレートを300μLのPBS/0.05%Tween 20緩衝液(Chata Biosystems)を各回使用して、3回自動化プレート洗浄機(Biotek ELx405, Winooski VT)で洗浄した。300μLのSuper遮断 T20(SBT20)緩衝液(ThermoScientific)をプレートに加えて、さらなる工程における非特異的タンパク質検出を遮断した。プレートを密封し、22℃インキュベーターで2.5〜3時間、振盪せずにインキュベートした。
ELISAのシグナル対ノイズ(S/N)を、抗AAV9 ADK9抗体または血清インキュベートウェルで得た平均化学発光または吸光度単位(比色分析ELISA)を、バックグラウンド対照ウェル(SBT20緩衝液インキュベーションのみ)で得た平均化学発光または吸光度単位で除することにより計算した。ADK9のS/Nは、ヤギ抗マウス検出抗体で得た単位を必要とした。ヒト血清のS/Nは、ヤギ抗ヒトκおよび抗ヒトλ検出抗体で得た単位を必要とした。
全グラフを、GraphPad Prism v 7.03ソフトウェアを使用して作成した。総ELISA抗体および中和抗体の順位ベースのスピアマンの順位相関分析も同じソフトウェアを使用して実施した。両側P値および95%信頼区間を相関分析で計算した。
Lec−2細胞(CRL 1736; ATCC)を、一夜、96ウェルプレートで、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Catalog #15140122; ThermoFisher Scientific)および2mM L−グルタミン(Catalog #25030081; ThermoFisher Scientific)を添加した10%FBS(Catalog #10438; Gibco)含有MEM培地(M8042; Millipore SIGMA)で、37℃/5%CO2で、20,000 Lec−2細胞/ウェル密度で培養した。翌日rAAV9HLucストックをFBS不含MEM培地で22,500MOIまで希釈し、FBS不含MEM培地で20倍希釈したヒト血清サンプルと、室温で1時間インキュベートした。陰性対照は、熱不活性化FBSのみと混合したrAAVHLucからなった。培養培地をLec−2細胞から吸引し、100μLのAAV9および血清混合物または対照を細胞に加え、30分間、37℃/5%CO2でインキュベートした。培地を10%FBS−DMEMに置き換え、細胞を16〜20時間、37℃/5%CO2でインキュベートした。培地の除去および100μL 1×DPBS(Catalog #14190094; Invitrogen)洗浄後、細胞を100μLのGLO溶解緩衝液(E2661: Promega)を使用して溶解し、室温で5分間インキュベートした。100μL ルシフェラーゼ基質(E6120; Promega)を製造業者の指示に従い調製し、溶解細胞に加え、3分間インキュベートした。ルミネセンスシグナルをプレートリーダー(Enspire; Perkin Elmer)を使用して測定した。血清サンプルの中和活性を、陰性FBS対照のパーセンテージ(%FBS)として示した。
比色分析ELISAは、抗AAV Abの検出に以前使用されている。タンパク質特異的抗体全般の検出における化学発光ELISAの優れた感受性から、抗AAV抗体検出について2つの方法を比較した。透明または黒色ポリスチレンプレートを、ルシフェラーゼ(rAAV9−HLuc)またはS100A1(rAAV9−S100A1)の導入遺伝子を含むAAV9カプシドで、炭酸緩衝液中8μg/mL濃度で一夜コートし、方法セクションに記載するADK9、マウスモノクローナル抗AAV9抗体で検出した。rAAV9−HLuc粒子は、細胞ベースの中和抗体アッセイで使用するホタルルシフェラーゼレポーター構築物を含む。両AAV9粒子は、同一カプシドを有するよう構築しているが、ルシフェラーゼカプシドをカプシド類似性を証明するためおよび総および中和抗体データセットの相関的照合を可能にするために、ELISAに含めた。表1に示すとおり、1:50および1:100 ADK9希釈で、およびルシフェラーゼおよび導入遺伝子含有構築物両者で、化学発光ELISAは、比色分析ELISAと比較してシグナル対ノイズ(S/N)比の21〜38倍改善を示した。rAAV9−S100A1およびrAAV9−ルシフェラーゼ検出に差異はなく、AAV9カプシドが抗体反応性の点で類似していることを示した。
上でマウスモノクローナル対照を使用して決定した条件が、ヒト抗AAV9抗体検出に適用できることを確認するために、2種のELISA検出法を商業的に得た正常ヒト血清(NHS)サンプルを使用して再評価した。プレートを、コーティング最適化実験(データは示していない)に従い4μg/mLのrAAV9S100A1でコートした。8つの異なるロットのNHSサンプルの10倍希釈を、SBT20緩衝液を使用して4倍希釈から出発して調製した。希釈物の一部を二等分し、HRPコンジュゲート抗κおよび抗λ検出抗体を使用する化学発光および比色分析検出法で試験した。化学発光法において、4倍〜4000倍希釈範囲で直線性が観察され(図1A)、一方比色分析法において、400倍希釈範囲まで直線性が検出された(図1B)。故に、化学発光法は少なくとも1ログの動的範囲の改善を示す。シグナル対ノイズ比(S/N)を、方法セクションに記載のとおり1:4、1:40および1:400の血清希釈で、全3希釈が両方法でほぼ直線範囲に入ったため計算した。代表的コンパレーターとして、1:400倍希釈で計算したS/Nを示す(図2)。全試験サンプルで、S/Nは比色分析法と比較して化学発光法で高かった(図2)。CL方法で17/21サンプルがS/N>4.0を示し、比色分析法で1/21サンプルのみ、S/N>4.0を示した。1:4および1:400倍血清希釈でのS/N比較を図11Aおよび図11Bに示す。
特異性層を、プレートに直接結合する非特異的血清要素ではなく、AAV9特異的抗体が、検出されたことを確認するため、化学発光ELISAに組み込んだ。正常ヒト血清サンプルを、示す濃度の2倍で調製し、ポリプロピレンプレート中、8μg/mL rAAV9S100A1(4μg/mL最終濃度)で2時間プレインキュベートし、その後血清サンプルを、洗浄し、遮断したrAAV9S100A1被覆プレートに加えた(図4A〜4C)。溶液中の競合AAV9カプシドに結合したままの抗体はAAV9S100A1被覆プレートでのインキュベーション後のELISAで洗い流されたと予測された。プレート被覆AAV9カプシドの競合レベルまたは抗体結合特異性を、材料および方法に記載のとおり計算し、ELISAシグナルのパーセント阻害として示した。この方法を使用して、4個の試験血清サンプルは競合ELISAで50%以上の阻害を示した(図4A〜4B)。マウスADK9モノクローナル抗体対照は96%の阻害を示し、競合パラメータが阻害および特異性決定のほぼ最高レベルで最適であることを示した。
12の異なるロットの正常ヒト血清を、方法の再現性を確認するために異なる日に2回、各回、別の分析者により、化学発光ELISA法で試験した(図5A〜5B)。直線範囲の2つの血清希釈物(図1A〜1B参照)を本実験に選択した。結果は両試験希釈物での分析者間の良好な再現性を示し、実験間精度は30%未満であった(図5A〜5B)。
最終的目的は、心疾患集団からの血清サンプルのプレスクリーニングにおいて抗rAAV9総抗体と中和抗体の相関があるかの決定であった。しかしながら、総抗体アッセイは、S100A1導入遺伝子を封入するrAAV9カプシドを使用し、一方中和抗体アッセイは、ルシフェラーゼレポーターを封入するrAAV9カプシドを使用した。2つのデータセット間で見られる何らかの非相関が、各アッセイで使用したAAV9カプシド材料の差異によるものではないことを確認するために、両構築物を陽性対照として3つの異なるロットの正常ヒト血清を使用する総抗体ELISAでまず試験した。等量のルシフェラーゼおよび導入遺伝子含有rAAV9カプシドをELISAプレートにコートし、3つの異なるロットの正常ヒト血清サンプルの4希釈物を遮断および洗浄ELISプレートのプローブに使用した。両カプシドは、全3個の血清サンプルおよび全試験希釈でプローブしたとき、類似シグナルを示した(図6A〜6C)。したがって、総および中和抗体アッセイデータ間で可能性のある相関は、2カプシドタイプ間の抗体結合エピトープにおける予期しない変動によるものではない。
2つのアッセイ、すなわち、細胞ベースの中和抗体および総抗体ELISAで使用したカプシドが免疫反応性の点で類似することが証明され、心疾患患者からの100血清サンプルのパネルで中和抗体データと総抗体データの相関の評価を勧めた。細胞ベースのアッセイについて、血清サンプルを20倍希釈し、rAAV9−HLucカプシドと1時間インキュベートし、培養中のLec−2細胞に加えた。対照はHLucカプシド単独またはマウスモノクローナル抗体ADK9からなった。次いで、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ基質を加え、アッセイを材料および方法に記載のとおり完了させた。
ヒトは、野生型AAVに幼少期に暴露され、抗AAV抗体を獲得するようになっている。血清型1〜9由来のAAVベクターは、非臨床および臨床試験で最も一般に使用される血清型である。このような既存の抗AAV抗体は、多様な実験成績により証明されるとおり、遺伝子療法のための組み換えアデノウイルのインビボ適用に限界を提起する。例えば、凝固第IX因子導入遺伝子をコードするAAV8ベクター投与前の精製ヒトIgGでの受動免疫化の非臨床モデルは、肝臓の形質導入の遮断を示した(Mingozzi et al., 2012)。マウスまたは非ヒト霊長類へのAAV血清型の連続投与を含む他の研究において、1血清型に応答して産生された中和抗体は、同じ血清型による形質導入を完全に遮断したが、異なる血清型による形質導入は阻害しなかった(Majowicz et. al., 2014)。抗AAV2中和抗体の相対力価の差異は、ヒト臨床治験における血友病B導入遺伝子形質導入の予防に貢献する可能性があると報告された(Manno et. al., 2006)。これら観察に鑑みて、既存のAAV抗体を有する臨床治験対象および患者の同定および除外は、導入遺伝子の形質導入率を増加させ得る。
Claims (40)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるAAVに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗AAV抗体」)の力価を測定することを含む、方法。
- 低力価の抗AAV抗体を有するとして同定された対象にAAV治療剤を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 対象における疾患を処置する方法であって、対象にAAV治療剤を投与することを含み、ここで、該対象はELISAで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して低力価の抗AAV抗体を有するとして同定されているものである、方法。
- 対象における疾患を処置する方法であって、(1)ELISAで対象から得た生物学的サンプルの抗AAV抗体の力価を測定し、ここで、該対象は低力価の抗AAV抗体を有するとして同定され、そして(2)低力価の抗AAV抗体を有するとして同定された対象にAAV治療剤を投与することを含む、方法。
- 対象における疾患を処置する方法であって、(1)対象から生物学的サンプルを得て、(2)ELISAで生物学的サンプルにおける抗AAV抗体の力価を測定し、ここで、対象は低力価の抗AAV抗体を有するとして同定され、そして(3)低力価の抗AAV抗体を有するとして同定された対象にAAV治療剤を投与することを含む、方法。
- 疾患が心臓、肝臓、肺、眼、血液、神経系、リンパ系、筋肉、幹細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおけるものである、請求項3〜5の何れかに記載の方法。
- 疾患が心疾患である、請求項3〜6の何れかに記載の方法。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)治療に適する対象を同定するためのハイスループット法であって、ELISAを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法。
- 複数の対象が約5〜約10、約10〜約20、約30〜約40または約40〜約50の対象を含む、請求項8のハイスループット法。
- 複数の生物学的サンプルの各々における力価が、並行してまたは連続して測定される、請求項8または9のハイスループット法。
- 抗AAV抗体の力価が中和抗AAV抗体の力価、非中和抗AAV抗体の力価または両者を含む、請求項1〜10の何れかに記載の方法。
- ELISAが中和抗AAV抗体または非中和抗AAV抗体に結合する二次抗体を含む、請求項11に記載の方法。
- ELISAが中和抗AAV抗体および非中和抗AAV抗体に結合する二次抗体を含む、請求項11に記載の方法。
- AAV治療が組み換えAAVの投与を含む、請求項1〜13の何れかに記載の方法。
- AAV治療がAAV1型、AAV2型、AAV3型(3A型および3B型を含む)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、AAV12型、AAV13型、ヘビAAV、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、ヤギAAV、エビAAVおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるAAVの投与を含む、請求項1〜14の何れかに記載の方法。
- AAV治療がAAV5型の投与を含む、請求項1〜15の何れかに記載の方法。
- AAV治療がAAV9型の投与を含む、請求項1〜16の何れかに記載の方法。
- AAV治療がAAV2型の投与を含む、請求項1〜17の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体が抗AAV1型抗体、抗AAV2型抗体、抗AAV3型A抗体、抗AAV3型B抗体、抗AAV4型抗体、抗AAV5型抗体、抗AAV6型抗体、抗AAV7型抗体、抗AAV8型抗体、抗AAV9型抗体、抗AAV10型抗体、抗AAV11型抗体、抗AAV12型抗体、抗AAV13型抗体、抗ヘビAAV抗体、抗トリAAV抗体、抗ウシAAV抗体、抗イヌAAV抗体、抗ウマAAV抗体、抗ヒツジAAV抗体、抗ヤギAAV抗体または抗エビAAV抗体である、請求項1〜18の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体が抗AAV5型抗体である、請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体が抗AAV9型抗体である、請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体が抗AAV2型抗体である、請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- AAV治療のためのAAVが抗AAV抗体が結合するAAVとは異なる血清型である、請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- ELISAが化学発光ELISAを含む、請求項1〜23の何れかに記載の方法。
- ELISAが集団ELISAである、請求項1〜24の何れかに記載の方法。
- 生物学的サンプルが血清サンプルを含む、請求項1〜25の何れかに記載の方法。
- 生物学的サンプルが血液サンプルを含む、請求項1〜26の何れかに記載の方法。
- 生物学的サンプルをELISAの前に希釈する、請求項1〜27の何れかに記載の方法。
- 生物学的サンプルを少なくとも約1:2、少なくとも約1:3、少なくとも約1:4、少なくとも約1:5、少なくとも約1:10、少なくとも約1:20、少なくとも約1:30、少なくとも約1:40、少なくとも約1:50、少なくとも約1:100、少なくとも約1:150、少なくとも約1:200、少なくとも約1:250、少なくとも約1:300、少なくとも約1:350、少なくとも約1:400、少なくとも約1:450、少なくとも約1:500、少なくとも約1:1000に希釈する、請求項1〜28の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体力価が約800未満〜約40,000未満である、請求項1〜29の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体力価が約40,000未満、約35,000未満、約30,000未満、約25,000未満、約20,000未満、約15,000未満、約10,000未満、約5000未満、約4000未満、約3000未満、約2000未満、約1000未満、約900未満または約800未満である、請求項1〜30の何れかに記載の方法。
- 抗AAV抗体力価が約800未満である、請求項1〜31の何れかに記載の方法。
- 対象が生物学的サンプルが化学発光ELISAで約100,000未満、約10,000未満、約1000未満、約950未満、約900未満、約850未満、約800未満、約750未満、約700未満、約650未満、約600未満、約550未満または約500未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗AAV抗体を有するとして同定される、請求項1〜32の何れかに記載の方法。
- 対象が生物学的サンプルが化学発光ELISAで約700未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗AAV抗体を有するとして同定される、請求項1〜33の何れかに記載の方法。
- 低力価の抗AAV抗体が低力価の中和抗AAV抗体と相関する、請求項2〜34の何れかに記載の方法。
- AAV治療が目的の遺伝子を含むAAVの投与を含む、請求項1〜35の何れかに記載の方法。
- 目的の遺伝子が生物学的に活性なポリペプチドをコードする、請求項36に記載の方法。
- AAVが制御配列をさらに含む、請求項36または37に記載の方法。
- 制御配列が組織特異的プロモーターを含む、請求項38に記載の方法。
- 組織特異的プロモーターが心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉および幹細胞からなる群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を誘導する、請求項38に記載の方法。
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