ES2714535T3 - Métodos para predecir secuencias de virus ancestrales y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido de cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCION
Metodos para predecir secuencias de virus ancestrales y usos de los mismos
CAMPO TECNICO
Generalmente esta divulgacion se refiere a virus.
ANTECEDENTES
Eludir y evitar una respuesta inmunitaria neutralizante o toxica contra un vector de terapia genica es un desaffo importante con todos los tipos de vectores de transferencia genica. Hasta la fecha, la transferencia genica se logra de manera mas eficiente utilizando vectores basados en virus que circulan en seres humanos y animales, por ejemplo, adenovirus y virus adenoasociados (AAV). Sin embargo, si los sujetos han sido infectados de forma natural con un virus, un tratamiento posterior con un vector basado en ese virus conlleva un aumento de los riesgos de seguridad y una menor eficiencia de la transferencia genica debido a las respuestas inmunitarias celulares y humorales. Los antfgenos de capside son los principales responsables de la inmunidad innata y/o adaptativa hacia las partmulas vmcas, sin embargo, los polipeptidos codificados por genes vmcos tambien pueden ser inmunogenos. Calcedo et al., 2009 divulga la seroprevalencia mundial hacia varios tipos de AAV diferentes.
RESUMEN
La invencion se define por las reivindicaciones.
Esta divulgacion describe metodos para predecir y sintetizar secuencias vmcas ancestrales o porciones de las mismas, y tambien describe partmulas vmcas que contienen tales secuencias vmcas ancestrales. Los metodos descritos en el presente documento se aplicaron al virus adenoasociados (AAV); por lo tanto, esta divulgacion describe secuencias de AAV ancestrales predichas y partmulas de virus de AAV que contienen tales secuencias de AAV ancestrales. Esta divulgacion tambien describe la reducida seroprevalencia presentada por partmulas vmcas que contienen secuencias ancestrales en relacion con partmulas vmcas que contienen secuencias contemporaneas. En un aspecto, esta divulgacion incluye polipeptidos de capside de virus adenoasociado (AAV), por ejemplo, polipeptidos de capside de AAV sinteticos y/o artificiales, que tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17. En algunas implementaciones, los polipeptidos de capside de AAV o partmulas vmcas que comprenden los polipeptidos de capside de AAV presentan una menor seroprevalencia que polipeptido de capside de AAV2 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV2, y los polipeptidos de capside de AAV o partmulas vmcas que comprenden los polipeptidos de capside de AAV presentan una seroprevalencia igual o inferior a la de un polipeptido de capside de AAV8 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV8. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV o partmulas vmcas que comprenden los polipeptidos de capside de AAV se neutralizan en una menor medida por suero humano que un polipeptido de capside de AAV2 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV2, y los polipeptidos de capside de AAV o partfculas vmcas que comprenden los polipeptidos de capside de AAV se neutralizan en una menor medida o similar por suero humano que un polipeptido de capside de AAV8 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV8. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV estan purificados. Los polipeptidos de capside de AAV proporcionados en el presente documento pueden codificarse por una secuencia de acidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18.
En un aspecto, la divulgacion proporciona moleculas de acido nucleico, por ejemplo, moleculas de acido nucleico sinteticas y/o artificiales, que codifican un polipeptido de capside de virus adenoasociado (AAV) que tiene una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18. Tambien se proporcionan vectores que incluyen tal acido nucleico, y una celula huesped que incluye tal vector. En otro aspecto, la divulgacion proporciona partmulas vmcas purificadas que incluyen un polipeptido de capside de AAV descrito en el presente documento. En algunas formas de realizacion, las partmulas vmcas incluyen un transgen.
En otros aspectos, la divulgacion proporciona polipeptidos de capside de virus adenoasociado (AAV), por ejemplo, polipeptidos de capside de AAV sinteticos y/o artificiales, que tienen al menos el 95% (por ejemplo, 97, 98, 99 o el 100%) de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV o partmulas vmcas que comprenden el polipeptido de capside de AAV presentan una menor seroprevalencia que un polipeptido de capside de AAV2 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV2, y el polipeptido de capside de AAV o una partfcula vmca que comprende el polipeptido de capside de AAV presentan una seroprevalencia aproximadamente igual o inferior a la de un polipeptido de capside de AAV8 o una partfcula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV8. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV o partfculas vmcas que comprenden el polipeptido de capside de AAV se neutralizan en una menor medida por suero humano que un polipeptido de capside de AAV2 o una partfcula vmca que comprende un polipeptido de capside de aAV2, y el polipeptido de capside de AAV o una partfcula vmca que comprende el polipeptido de capside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar por suero humano que un polipeptido de capside de AAV8 o una partfcula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV8. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV estan purificados.
En otro aspecto, los polipeptidos de capside de AAV descritos en el presente documento pueden codificarse por secuencias de acidos nucleicos como se describe en el presente documento. En una implementacion, la divulgacion proporciona moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido de capside de virus adenoasociado (AAV), en las que las moleculas de acido nucleico tienen al menos el 95% (por ejemplo, 97, 98, 99 o el 100%) de identidad de secuencia con una secuencia de acido nucleico como se muestra en el presente documento. La divulgacion tambien proporciona vectores que incluyen dichas moleculas de acido nucleico, como son las celulas huesped que incluyen tal vector.
En un aspecto, la divulgacion proporciona partfculas vmcas que incluyen al menos uno de los polipeptidos de capside de AAV descritos en el presente documento. En algunas formas de realizacion, las partfculas vmcas incluyen un transgen.
En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona una partfcula vmca como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de administracion a un sujeto que necesita transferencia genica o vacunacion. En algunas formas de realizacion, las partfculas vmcas presentan menos seroprevalencia que una partfcula vmca AAV2. En algunas formas de realizacion, las partfculas vmcas presentan aproximadamente la misma o menos seroprevalencia que una partfcula vmca AAV8. En algunas formas de realizacion, las partfculas vmcas se neutralizan en una menor medida por suero humano que una partfcula vmca de AAV2, y las partfculas vmcas de AAV se neutralizan en una menor medida o similar por suero humano que una partfcula de virus de AAV8.
En un aspecto, la divulgacion proporciona un antfgeno diana unido operativamente a un polipeptido de capside de AAV como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de administracion a un sujeto que necesita vacunacion. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV presentan menos seroprevalencia que un polipeptido de capside de AAV2. En algunas formas de realizacion, el polipeptido de capside de AAV presenta aproximadamente la misma o menos seroprevalencia que un polipeptido de capside de AAV8. En algunas formas de realizacion, los polipeptidos de capside de AAV se neutralizan en una menor medida por suero humano que un polipeptido de capside de AAV2, y el polipeptido de capside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar en suero humano que un polipeptido de capside de AAV8.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos in silicio para predecir una secuencia de un virus ancestral o una porcion del mismo. Dichos metodos tfpicamente incluyen proporcionar secuencias de nucleotidos o aminoacidos de una pluralidad de virus contemporaneos o porciones de los mismos; alinear las secuencias utilizando un algoritmo de alineamiento multiple de secuencias (MSA); modelar la evolucion para obtener una filogenia ancestral predicha de la pluralidad de virus contemporaneos o porciones de los mismos; estimar, en un nodo filogenico de la filogenia ancestral predicha, la probabilidad evolutiva de un nucleotido particular o un residuo de aminoacido en cada posicion de la secuencia; y predecir, basandose en la probabilidad estimada en cada posicion, una secuencia de un virus ancestral o una porcion del mismo.
En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, una o mas, o todas, las etapas se realizan usando un procesador informatico. En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, el algoritmo MSA usa informacion filogenetica para predecir si un hueco en el alineamiento es resultado de una eliminacion o una insercion. En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, el algoritmo MSA es un kit de alineamiento probabilistic (PRANK). En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, el modelo utilizado para modelar la evolucion se selecciona utilizando el criterio de informacion de Akaike (AIC). En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, la filogenia ancestral predicha se obtiene utilizando un modelo JTT con un modelo de distribucion gamma ("+G") y un calculo de frecuencia de ni ("+F"). En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, la modelacion de la etapa de evolucion se realiza utilizando un modelo JTT+G+F. En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, los metodos incluyen la smtesis, basada en la secuencia predicha, del virus ancestral o una porcion del mismo. En algunas formas de realizacion de la presente divulgacion, los metodos incluyen ensamblar el virus ancestral o una porcion del mismo en una partmula de virus ancestral.
En algunas formas de realizacion, los metodos tambien incluyen cribar la partmula de virus ancestral para al menos uno de los siguientes: (a) replicacion; (b) propiedades de transferencia genica; (c) union al receptor; o (d) seroprevalencia. En algunas formas de realizacion, las partfculas de virus ancestrales presentan menos seroprevalencia que una partfcula vmca ensamblada de al menos una de la pluralidad de virus contemporaneos o porciones de los mismos. En algunas formas de realizacion, la partmula vmca ancestral se neutraliza en menor medida por suero humano que una partfcula vmca ensamblada a partir de al menos uno de la pluralidad de virus contemporaneos o porciones de los mismos. En algunas formas de realizacion, la pluralidad de virus contemporaneos o porciones de los mismos, pertenecen a una familia seleccionada del grupo que consiste en adenovirus (AV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), retrovirus, lentivirus, virus del herpes simple (VHS), virus vaccinia, virus de la viruela, virus de influenza, virus sincitial de las vfas respiratorias, virus parainfluenza y virus espumoso.
Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona virus ancestrales o porciones de los mismos que muestran una susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente en las poblaciones humanas actuales en comparacion con los virus contemporaneos o porciones de los mismos. Generalmente, la susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente mostrada por los virus ancestrales o porciones de los mismos en las poblaciones humanas actuales se refleja como una susceptibilidad reducida a anticuerpos neutralizantes.
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenecen los metodos y composiciones de la materia. Aunque se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o en el ensayo de los metodos y composiciones de materia, a continuacion, se describen los metodos y materiales adecuados. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La Oficina proporcionara copias de esta patente o publicacion de solicitud de patente con dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
La Figura 1 es un esquema que muestra las relaciones entre las infecciones vmcas ancestrales/contemporaneas y la respuesta inmunitaria del huesped ancestral/contemporanea.
Las Figuras 2A a 2D son una serie de esquemas que muestran un ejemplo de un procedimiento de reconstruccion ancestral. Los datos mostrados estan extrafdos de un conjunto de datos completo y representan los residuos 564-584 (numeracion VP1 de AAV2).
Las Figuras 3A a 3C juntas ilustran un arbol filogenetico de secuencias contemporaneas de AAV generadas usando los metodos descritos en el presente documento.
Las Figuras 4A y 4B juntas ilustran un alineamiento de polipeptidos de VP1 de AAV ancestrales.
Las Figuras 5A y 5B juntas ilustran un alineamiento de polipeptidos de VP1 de AAV ancestrales funcionales y polipeptidos de VP1 de AAV contemporaneos.
La Figura 6 es un gel electroforetico que demuestra que las secuencias de VP1 de AAV ancestrales se transcriben y se someten a corte y empalme alternativamente de una manera similar a la de las secuencias de VP1 de AAV contemporaneas.
La Figura 7 es un grafico que muestra la actividad de la luciferasa en celulas HEK293 transducidas con vectores de AAV ancestrales.
La Figura 9 es un grafico que muestra la comparacion de secuencias (% por encima de la diagonal, N.° de diferencias de aa a continuacion) entre la biblioteca Anc80 y Anc80L65.
Las Figuras 10A-D son imagenes de resultados experimentales que demuestran que Anc80L65 es capaz de ensamblar y producir partfculas de alto tftulo. El panel A muestra que Anc80L65 es capaz de producir rendimientos vectoriales equivalentes a AAV2; el panel B es una imagen TEM de partfculas vmcas que incluyen Anc80L65; el panel C muestra que las partmulas vmcas que incluyen Anc80L65 son capaces de producir protemas VP1, 2 y 3 de cap de AAV basadas en gel s DS-PAGE en condiciones de desnaturalizacion; y el panel D muestra una transferencia Western de Anc80L65 utilizando el anticuerpo de capside AAV, B1.
Las Figuras 11A-C son imagenes de resultados experimentales que demuestran que Anc80L65 es capaz de infectar celulas in vitro en celulas HEK293 usando GFP como lectura (Panel A) o luciferasa (Panel B) en comparacion con los controles de AAV2 y/o AAV8 y tambien es eficaz en el direccionamiento al hngado despues de una inyeccion IV de AAV que codifica un transgen LacZ nuclear (fila superior, Panel C: hngado), despues de la inyeccion IM directa de un AAV que codifica una GFP (fila central, Panel C: musculo), y despues de la inyeccion subretiniana con un AAV que codifica GFP (fila inferior, Panel C: retina).
Las Figuras 13A y 13B son matrices de identidad de secuencia que producen el uso de MAFFT que muestran las secuencias de aminoacidos de las protemas VP1 de vectores ancestrales alineadas con las de los AAV existentes representativos (Figura 13A), y las secuencias de aminoacidos de las protemas VP3 de vectores ancestrales alineadas con las de AAV existentes representativos (Figura 13B).
La Figura 14 es un grafico que demuestra que los vectores de AAV se produjeron por triplicado en pequena escala (placas de 6 pocillos). Los virus en bruto se evaluaron mediante qPCR para determinar la produccion absoluta de cada vector.
La Figura 15 es una tabla que muestra los tftulos de cada vector, promediados y comparados, con los de AAV8.
La Figura 16 son fotograffas que muestran los resultados de los experimentos en los que se anadieron 1,9E3 GC/celula de cada vector a las celulas HEK293 (excepto para Anc126, en cuyo caso se lograron MOI de 2,5E2 - 3,1E2 GC/celula). Sesenta horas mas tarde, la infectividad se evaluo utilizando microscopfa de fluorescencia.
La Figura 17 es un grafico que muestra los resultados de experimentos en los que las mismas celulas de la Figura 16 se lisaron y se analizaron para determinar la expresion de luciferasa. Como en la Figura 16, Anc126 no se controlo de tftulo con los otros vectores, sino que vario desde una MOI de 2,5E2 - 3,1E2 GC/celda.
La Figura 18 es una tabla que muestra la luminiscencia de las celulas transducidas por cada vector, que se promediaron y compararon con las de AAV8.
La Figura 19 es un grafico que proporciona un resumen de experimentos in vitro para determinar la produccion relativa y la infectividad de los vectores de AAV ancestrales descritos en el presente documento.
DESCRIPCION DETALLADA
La transferencia genica, ya sea con fines experimentales o terapeuticos, se basa en un vector o sistema vectorial para transferir informacion genetica a las celulas diana. El vector o sistema de vectores se considera el principal determinante de la eficiencia, especificidad, respuesta del huesped, farmacologfa y longevidad de la reaccion de transferencia genica. Actualmente, la forma mas eficiente y eficaz de lograr la transferencia genica es a traves del uso de vectores o sistemas de vectores basados en virus que se han hecho defectuosos en la replicacion.
Sin embargo, los estudios de seroprevalencia indican que se han expuesto previamente proporciones significativas de poblaciones humanas en todo el mundo (por ejemplo, por infeccion natural) a un gran numero de los virus utilizados actualmente en la transferencia genica y, por lo tanto, albergan inmunidad preexistente. Se sabe que los anticuerpos neutralizantes hacia el vector viral en estos individuos expuestos previamente limitan, a veces significativamente, la extension de la transferencia genica o incluso redirigen el virus lejos de la diana. Veanse, por ejemplo, Calcedo et al. (2009, J. Infect. Dis., 199:381-90) y Boutin et al. (2010, Human Gene Ther., 21:704-12). Por lo tanto, la presente divulgacion se basa en el reconocimiento de que los virus ancestrales o porciones de los mismos presentan una susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente (por ejemplo, una susceptibilidad reducida a anticuerpos neutralizantes) en las poblaciones humanas actuales en comparacion con los virus contemporaneos o porciones de los mismos.
La Figura 1 es un esquema que muestra las relaciones entre las infecciones vmcas ancestrales y contemporaneas y la respuesta inmunitaria del huesped ancestral y contemporanea. La Figura 1 muestra como los AAV ancestrales pueden ser refractarios a la inmunidad preexistente contemporanea. Se presume que un virus contemporaneo existente (Vc) ha evolucionado a partir de una especie ancestral (Vanc), principalmente bajo presiones evolutivas de la inmunidad del huesped a traves de mecanismos de escape inmunologico. Cada una de estas especies, Vanc y Vc, tienen la capacidad de inducir inmunidad adaptativa, incluyendo la inmunidad de linfocitos B y T (Ianc y Ic, respectivamente). Se formulo la hipotesis, y se confirmo en el presente documento, de que la inmunidad inducida por virus contemporaneos no necesariamente reacciona de forma cruzada con una especie vmca ancestral, que puede ser sustancialmente diferente en terminos de la composicion de epftopo que el virus existente.
Esta divulgacion proporciona metodos para predecir la secuencia de un virus ancestral o una porcion del mismo. Una o mas de las secuencias de virus ancestrales predichas utilizando los metodos descritos en el presente documento se pueden generar y ensamblar en una partmula vmca. Como se demuestra en el presente documento, las partmulas vmcas ensambladas a partir de secuencias vmcas ancestrales predichas pueden presentar menos, a veces significativamente menos, seroprevalencia que las partmulas vmcas contemporaneas actuales. Por lo tanto, las secuencias de virus ancestrales divulgadas en el presente documento son adecuadas para su uso en vectores o sistemas de vectores para la transferencia genica.
Metodos para predecir y sintetizar una secuencia virica ancestral
Para predecir una secuencia virica ancestral, las secuencias de nucleotidos o aminoacidos primero se compilan a partir de una pluralidad de virus contemporaneos o porciones de los mismos. Si bien los metodos descritos en el presente documento se ilustraron utilizando secuencias de capside de virus adenoasociado (AAV), los mismos metodos se pueden aplicar a otras secuencias de AAV (por ejemplo, el genoma completo, secuencias rep, secuencias iTr ) o cualquier otro virus o porcion del mismo. Los virus distintos de AAV incluyen, sin limitacion, adenovirus (AV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), retrovirus, lentivirus, virus del herpes simple (HSV), sarampion, virus vaccinia, virus de la viruela, virus de la influenza, virus sincitial de las vfas respiratorias, virus parainfluenza, virus espumoso, o cualquier otro virus para el cual la inmunidad preexistente se considere un problema.
Se pueden usar secuencias de tan solo dos virus contemporaneos o porciones de los mismos, sin embargo, se entiende que es deseable un mayor numero de secuencias de virus contemporaneos o porciones de los mismos para incluir la mayor parte del paisaje de la diversidad de secuencia diaria moderna posible, pero tambien porque un numero mayor de secuencias puede aumentar las capacidades predictivas de los algoritmos descritos y utilizados. Por ejemplo, se pueden usar secuencias de 10 o mas virus contemporaneos o porciones de los mismos, secuencias de 50 o mas virus contemporaneos o porciones de los mismos, o secuencias de 100 o mas virus contemporaneos o porciones de los mismos.
Dichas secuencias se pueden obtener, por ejemplo, de cualquier numero de bases de datos publicas incluyendo, sin limitacion, GenBank, UniProt, EMBL, Colaboracion internacional de bases de datos de secuencias de nucleotidos (INSDC), o el Archivo europeo de nucleotidos. Adicionalmente, o como alternativa, dichas secuencias pueden obtenerse de una base de datos que sea espedfica de un organismo en particular (por ejemplo, la base de datos de VIH). Las secuencias contemporaneas pueden corresponder a todo el genoma, o solo se puede usar una porcion del genoma, tal como, sin limitacion, secuencias que codifican uno o mas componentes de la capside virica, la protema de replicacion, o las secuencias ITR.
A continuacion, las secuencias contemporaneas se alinean utilizando un algoritmo de alineamiento multiple de secuencias (MSA). La Figura 2(a) es un esquema que muestra un alineamiento multiple de secuencias. Los algoritmos MSA se conocen bien en la tecnica y generalmente estan disenados para aplicarse a conjuntos de datos de diferentes tamanos y diferentes entradas (por ejemplo, acido nucleico o protema), y para alinear las secuencias de una manera particular (por ejemplo, programacion dinamica, progresiva, heunstica) y aplicar diferentes esquemas de puntuacion en el alineamiento (por ejemplo, basado en matriz o basado en consistencia, por ejemplo, minima entropfa, suma de pares, matriz de similitud, puntuaciones de huecos). Los algoritmos MSA ya conocidos incluyen, por ejemplo, ClustalW (Thompson et al., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90), Kalign (Lassmann et al., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99), MAFFT (Katoh et al., 2005, Nuc. Acids Res., 33:511-8), MUSCLE (Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113), y T-Coffee (Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17).
Como se describe en el presente documento, una de las caractensticas principales al seleccionar un algoritmo MSA para su uso en los metodos descritos en el presente documento es la manera en que el algoritmo trata un hueco en el alineamiento. A los huecos en un alineamiento de secuencias se les puede asignar un valor de penalizacion que es dependiente o independiente del tamano del hueco. En los presentes metodos, se prefiere que el algoritmo MSA utilizado en los metodos descritos en el presente documento aplique informacion filogenetica para predecir si un hueco en el alineamiento es el resultado de una eliminacion o una insercion en oposicion a un tratamiento sesgado, no filogenetico de huecos debido, por ejemplo, a inserciones y/o eliminaciones. Un metodo adecuado para tratar los huecos en los alineamientos y el analisis evolutivo se describe en Loytynoja y Goldman, 2008, Science, 320:1632-5, y los algoritmos disponibles comercialmente que aplican huecos en los alineamientos de una manera que es adecuada para su uso en los metodos descritos en el presente documento son un kit de alineamiento probabilfstico (PRANK; Goldman Group Software; Loytynoja y Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62), y variaciones del algoritmo PRANK.
Luego se aplica un modelo evolutivo al alineamiento resultante para obtener una filogenia ancestral predicha (vease la Figura 2(b)). Existe una serie de modelos evolutivos disponibles en la tecnica, cada uno de los cuales aplica matrices de tasas de reemplazo ligeramente diferentes para los aminoacidos. Sin limitacion, los algoritmos para aplicar modelos de evolucion incluyen los modelos de Dayhoff (por ejemplo, PAM120, PAM160, PAM250; Dayhoff et al., 1978, In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), pags. 345-52, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C.), el modelo JTT (Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82), el modelo WAG (Whelan y Goldman, 2001, Mol. Biol. Evol., 18:691-9), y los modelos Blosum (por ejemplo, Blosum45, Blosum62, Blosum80; Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10915-9).
Ademas, las restricciones que la estructura y la funcion imponen en un modelo evolutivo pueden modelarse, por ejemplo, considerando que algunas posiciones son invariantes ("+I"; Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31), que algunas posiciones experimentan diferentes tasas de cambio ("+G"; Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401), y/o que las frecuencias de equilibrio de nucleotidos o aminoacidos son las mismas que las del alineamiento ("+F"; Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27).
La idoneidad de uno o mas modelos de evolucion puede evaluarse utilizando el criterio de informacion de Aikake (AIC; Akaike, 1973, In Second International Symposium on Information Theory, Petrov y Csaki, eds., pags. 267-81, Budapest, Akademiai Kiado), el criterio de informacion bayesiano (BIC; Schwarz, 1978, Ann. Statist. 6:461-4), o variaciones o combinaciones de los mismos. Ademas, se puede usar AIC, BIC, o variaciones o combinaciones de los mismos para evaluar la importancia relativa de incluir uno o mas parametros (por ejemplo, las restricciones analizadas anteriormente) en el modelo evolutivo.
Como se explica en la seccion de Ejemplos a continuacion, ProTest3 (Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5) se puede usar para determinar, en funcion del AIC mas bajo, que un algoritmo JTT+G+F fue el modelo mas adecuado para la evolucion de AAV. Tambien se entendera por un experto en la tecnica que un algoritmo JTT+G+F tambien se puede usar para predecir secuencias vmcas ancestrales distintas de los polipeptidos de capside de AAV, sin embargo, un experto en la tecnica tambien entendera que, dependiendo del conjunto de datos y la puntuacion de aptitud, puede ser mas adecuado un modelo diferente de evolucion.
Una vez que se ha seleccionado un modelo de evolucion y se ha determinado su aptitud, se puede construir un arbol filogenetico de las secuencias vmcas o porciones de las mismas. La construccion de arboles filogeneticos es conocida en la tecnica y tfpicamente emplea metodos de maxima probabilidad tales como los implementados por PhyML (Guindon y Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)), MOLPHY (Adachi y Hasegawa, 1996, ed. Tokyo Institute of Statistical Mathematics), BioNJ (Gascuel, 1997, Mol. Biol. Evol., 14:685-95), o PHYLIP (Felsenstein, 1973, Systematic Biology, 22:240-9). Un experto en la materia entendera que es deseable un equilibrio entre la complejidad computacional y la bondad del ajuste en un modelo de sustituciones de aminoacidos.
Si se desea, el arbol filogenetico puede evaluarse para determinar su importancia. Se dispone de varios metodos estadfsticos y se utilizan de forma rutinaria para evaluar la importancia de un modelo incluyendo, sin limitacion, muestreo con reemplazo, jackknife, validacion cruzada, pruebas de permutacion o combinaciones o variaciones de los mismos. La importancia tambien puede evaluarse utilizando, por ejemplo, una prueba de razon de verosimilitud aproximada (aLRT; Anisimova y Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52)).
En cualquier nodo filogenetico de la filogenia (por ejemplo, un nodo filogenetico interior), la secuencia se puede reconstruir estimando la probabilidad evolutiva de un residuo particular de nucleotido o de aminoacido en cada posicion de la secuencia (Figura 2(c)). Un nodo filogenico se refiere a un punto de ramificacion evolutivo intermedio dentro de la filogenia ancestral predicha. Como se usa en el presente documento, la "probabilidad evolutiva" se refiere a la probabilidad de la presencia de un nucleotido o aminoacido particular en una posicion particular basada en un modelo evolutivo en oposicion a un modelo que no tiene en cuenta, por ejemplo, un cambio evolutivo en el uso del codon. Los modelos ejemplares que tienen en cuenta la probabilidad evolutiva de un residuo de nucleotido de aminoacido particular en una posicion particular pueden estimarse utilizando, por ejemplo, cualquier numero de metodos de maxima verosimilitud que incluyen, sin limitacion, el analisis filogenetico por maxima verosimilitud (PAML; Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6) o analisis filogenetico usando parsimonia (PAUP; Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA).
En base a la probabilidad evolutiva estimada de un residuo de nucleotido o aminoacido particular en cada posicion, la secuencia predicha de un virus ancestral o una porcion del mismo, puede ensamblarse para formar una secuencia completa o parcial sintetica de acido nucleico o polipeptido. Si se desea, puede calcularse la verosimilitud de que cualquier residuo se encuentre en un estado determinado en un nodo determinado a lo largo del nodo, y se puede identificar cualquier posicion a lo largo de la secuencia que tenga una verosimilitud posterior calculada por debajo de un umbral particular (Figura 2(d)). De esta manera, se puede generar una secuencia de andamiaje ancestral, que puede incluir variaciones en aquellas posiciones que tienen una probabilidad por debajo del umbral particular.
Si la secuencia ancestral que se predice usando los metodos en el presente documento es una secuencia de acido nucleico, la secuencia puede optimizarse entonces por codon de modo que se pueda traducir de manera eficiente en una secuencia de aminoacidos. Se conocen en la tecnica las tablas de uso de codones para diferentes organismos. Opcionalmente, sin embargo, se puede disenar una tabla de uso de codones basada en una o mas secuencias contemporaneas que tiene homologfa (por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia) con la secuencia de andamiaje ancestral, y una secuencia ancestral como se describe en el presente documento puede optimizarse por codones para el uso de codones mairnferos (por ejemplo, un ser humano).
Cualquiera o todas las etapas descritas en el presente documento para predecir una secuencia vmca ancestral se pueden realizar o simular en un ordenador (por ejemplo, in silicio) usando un procesador o un microprocesador. Secuencias de andamiaje de virus adenoasociados (AAV) ancestrales
Los metodos descritos en el presente documento se aplicaron a virus adenoasociados (AAV) utilizando secuencias de capside contemporaneas (descritas en detalle en los Ejemplos a continuacion). El AAV es ampliamente considerado como un vector de transferencia genica terapeutico y un vetnculo de vacuna genetico, pero presenta una alta seroprevalencia en poblaciones humanas. Usando los metodos descritos en el presente documento, un arbol filogenetico se ensamblo utilizando secuencias de AAV contemporaneas (veanse las Figuras 3A-3C) y se obtuvieron secuencias de andamiaje ancestrales predichas en el nodo filogenetico designado (Tabla 1). Como se usa en el presente documento, una secuencia de andamiaje ancestral se refiere a una secuencia que se construye usando los metodos descritos en el presente documento (por ejemplo, usando probabilidades evolutivas y modelos evolutivos) y no se sabe que hayan existido en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, las secuencias de andamiaje ancestrales son diferentes de las secuencias consenso, que se construyen tfpicamente usando la frecuencia de los nucleotidos o residuos de aminoacidos en una posicion particular.
Tabla 1.
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La secuencia de andamiaje del polipeptido Anc80 se muestra en la SEQ ID NO:1, que esta codificada por la secuencia de andamiaje del acido nucleico Anc80 que se muestra en la SEQ ID NO:2. La secuencia de andamiaje de Anc80 contiene 11 posiciones en las que cualquiera de los dos residuos era probable. Por lo tanto, la secuencia de andamiaje de Anc80 representa 2048 (211) secuencias diferentes.
Para demostrar la eficacia de los metodos descritos en el presente documento para predecir la secuencia ancestral de un virus o porcion del mismo, se genero una biblioteca de las 2048 secuencias ancestrales predichas en el nodo Anc80 de AAV y, como se describe en el presente documento, se demostro que forman partfculas vmcas viables que presentan menos seroprevalencia, en algunos casos, significativamente menos seroprevalencia, que las partfculas vmcas ensambladas con polipeptidos de capside contemporaneos.
Metodos para hacer particulas viricas ancestrales
Despues de que se haya obtenido la secuencia ancestral predicha de un virus o porcion del mismo, la molecula y/o el polipeptido o polipeptidos de acido nucleico real pueden generarse, por ejemplo, sintetizarse. Los metodos para generar una molecula o polipeptido de acido nucleico artificial basado en una secuencia obtenida, por ejemplo, in silicio, se conocen en la tecnica e incluyen, por ejemplo, smtesis química o clonacion recombinante. Se conocen en la tecnica metodos adicionales para generar moleculas o polipeptidos de acido nucleico y se describen con mas detalle a continuacion.
Una vez que se ha producido un polipeptido ancestral, o una vez que se ha generado y expresado una molecula de acido nucleico ancestral para producir un polipeptido ancestral, el polipeptido ancestral puede ensamblarse en una partmula de virus ancestral usando, por ejemplo, una celula huesped empaquetadora. Los componentes de una partmula vmca (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap, secuencias de repeticion terminales invertidas (ITR)) pueden introducirse, de forma transitoria o estable, en una celula huesped empaquetadora utilizando uno o mas vectores como se describe en el presente documento. Uno o mas de los componentes de una partmula vmca se pueden basar en una secuencia ancestral predicha como se describe en el presente documento, mientras que los componentes restantes se pueden basar en secuencias contemporaneas. En algunos casos, toda la partmula vmca puede basarse en secuencias ancestrales predichas.
Dichas partfculas vmcas ancestrales pueden purificarse usando metodos de rutina. Como se usa en el presente documento, las partmulas vmcas "purificadas" se refieren a partmulas vmcas que se eliminan de los componentes en la mezcla en la que se fabricaron, tales como, pero sin limitacion, componentes vmcos (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap), celulas huesped empaquetadoras, y partmulas vmcas ensambladas parcialmente o de forma incompleta.
Una vez ensambladas, las partmulas vmcas ancestrales pueden cribarse, por ejemplo, para determinar la capacidad de replicacion; las propiedades de la transferencia genica; la capacidad de union al receptor; y/o la seroprevalencia en una poblacion (por ejemplo, una poblacion humana). Determinar si una partmula vmca puede replicarse es rutinario en la tecnica y tipicamente incluye infectar una celula huesped con una cantidad de partmulas vmcas y determinar si las partmulas vmcas aumentan en numero con el tiempo. Determinar si una partmula vmca es capaz de realizar la transferencia genica tambien es rutinario en la tecnica e incluye tfpicamente infectar celulas huesped con partmulas vmcas que contienen un transgen (por ejemplo, un transgen detectable tal como un gen indicador, analizado con mas detalle mas adelante a continuacion). Tras la infeccion y la eliminacion del virus, las celulas huesped pueden evaluarse para determinar la presencia o ausencia del transgen. La determinacion de si una partmula de virus se une a su receptor es habitual en la tecnica, y dichos metodos pueden realizarse in vitro o in vivo.
La determinacion de la seroprevalencia de una partmula vmca se realiza de forma rutinaria en la tecnica y tfpicamente incluye el uso de un inmunoensayo para determinar la prevalencia de uno o mas anticuerpos en muestras (por ejemplo, muestras de sangre) de una poblacion particular de individuos. La seroprevalencia se entiende en la tecnica que se refiere a la proporcion de sujetos en una poblacion que es seropositiva (es decir, ha sido expuesta a un patogeno o inmunogeno en particular), y se calcula como el numero de sujetos en una poblacion que producen un anticuerpo contra un patogeno o inmunogeno particular dividido por el numero total de individuos en la poblacion examinada. Los inmunoensayos se conocen bien en la tecnica e incluyen, sin limitacion, una inmunotransferencia, transferencia Western, inmunoensayos enzimaticos (EIA), inmunoensayo enzimatico ligado a enzimas (ELISA), o radioinmunoensayo (RIA). Como se indica en el presente documento, las partfculas vmcas ancestrales presentan menos seroprevalencia que las partfculas vmcas contemporaneas (es decir, partfculas vmcas ensambladas que usan secuencias vmcas contemporaneas o porciones de las mismas). Simplemente a modo de ejemplo, veanse Xu et al. (2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6); Paul et al. (1994, J. Infect. Dis., 169:801-6); Sauerbrei et al. (2011, Eurosurv., 16(44):3); y Sakhria et al. (2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429), cada uno de los cuales determino la seroprevalencia para un anticuerpo en particular en una poblacion dada.
Como se describe en el presente documento, las partfculas vmcas ancestrales se neutralizan por el sistema inmunitario de una persona, por ejemplo, del paciente, en menor medida que las partfculas vmcas contemporaneas. Se dispone de varios metodos para determinar la extension de los anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero. Por ejemplo, un ensayo de anticuerpos neutralizantes mide el tftulo en el que una muestra experimental contiene una concentracion de anticuerpos que neutraliza la infeccion en un 50% o mas en comparacion con una muestra de control sin anticuerpo. Veanse, tambien, Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12) y Manning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85).
Con respecto a los polipeptidos de capside de AAV ancestrales ilustrados en el presente documento, la seroprevalencia y/o el grado de neutralizacion pueden compararse, por ejemplo, con un polipeptido de capside de AAV8 o partfcula vmca que incluye un polipeptido de capside de AAV8, o un polipeptido de capside de AAV2 o partfcula vmca que incluye un polipeptido de capside de AAV2. Generalmente, en la tecnica se entiende que los polipeptidos de capside de AAV8 o partfculas vmcas presentan una seroprevalencia, y una neutralizacion resultante, en la poblacion humana que se considera baja, mientras que el polipeptido de capside de AAV2 o partfculas vmcas presentan una seroprevalencia y una neutralizacion resultante, en la poblacion humana que se considera alta. Obviamente, la seroprevalencia particular dependera de la poblacion examinada, asf como los metodos inmunologicos utilizados, pero hay informes de que AAV8 presenta una seroprevalencia de aproximadamente el 22% hasta aproximadamente el 38%, mientras que AAV2 presenta una seroprevalencia de aproximadamente el 43,5% hasta aproximadamente el 72%. Veanse, por ejemplo, Boutin et al., 2010, "Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against AAV types 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors", Hum. Gene Ther., 21:704-12. Vease, tambien, Calcedo et al., 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90.
Acido nucleico ancestral predicho y secuencias de polipeptidos ancestrales de virus adenoasociado (AAV)
Se secuenciaron varios clones diferentes de la genoteca que codificaba polipeptidos de capside ancestrales predichos del nodo Anc80, y las secuencias de aminoacidos de polipeptidos de capside ancestrales predichos de AAV representativos se muestran en la SEQ ID NO: 19 (Anc80L27); SEQ ID NO: 20 (Anc80L59); SEQ ID NO: 21 (Anc80L60); SEQ ID NO: 22 (Anc80L62); SEQ ID NO: 23 (Anc80L65); SEQ ID NO: 24 (Anc80L33); SEQ ID NO: 25 (Anc80L36); y SEQ ID NO:26 (Anc80L44). Los expertos en la tecnica apreciaran que la secuencia de acido nucleico que codifica cada secuencia de aminoacidos puede determinarse facilmente.
Ademas de los polipeptidos de capside ancestral predichos que tienen las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26, se proporcionan polipeptidos que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia) con los polipeptidos de capside ancestral predichos que tienen las secuencias que se muestran en las SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o 26. De forma similar, se proporcionan moleculas de acido nucleico que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia) con las moleculas de acido nucleico que codifican los polipeptidos de capside ancestrales (es decir, que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia).
En el calculo del porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el numero de coincidencias identicas de nucleotidos o residuos de aminoacidos entre las dos secuencias. El numero de coincidencias identicas se divide por la longitud de la region alineada (es decir, el numero de nucleotidos o residuos de aminoacidos alineados) y se multiplica por 100 para llegar a un porcentaje de valor de identidad de secuencia. Se apreciara que la longitud de la region alineada puede ser una porcion de una o ambas secuencias hasta el tamano de longitud completa de la secuencia mas corta. Tambien se apreciara que una unica secuencia puede alinearse con mas de una secuencia diferente y, por lo tanto, puede tener diferentes valores de porcentaje de identidad de secuencia en cada region alineada.
El alineamiento de dos o mas secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede realizarse utilizando el algoritmo descrito por Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:33893402) como se incorpora en los programas BLAST (herramienta de busqueda de alineamiento local basico), disponibles en ncbi.nlm.nih.gov en Internet. Se pueden realizar busquedas de BLAST para determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia (acido nucleico o aminoacido) y cualquier otra secuencia o porcion de la misma alineada usando el algoritmo de Altschul et al. BLASTN es el programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de acidos nucleicos, mientras que BLASTP es el programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de aminoacidos. Cuando se utilizan programas BLAST para calcular el porcentaje de identidad entre una secuencia y otra secuencia, generalmente se usan los parametros predeterminados de los programas respectivos.
Se muestran alineamientos representativos en las Figuras 4A y 4B y en las Figuras 5A y 5B. Las Figuras 4A y 4B muestran un alineamiento de polipeptidos de capside de VP1 de AAV ancestrales, designados como Anc80L65 (SEQ ID NO: 23), Anc80L27 (SEQ ID NO: 19), Anc80L33 (SEQ ID NO: 24), Anc80L36 (SEQ ID NO: 25), Anc80L44 (SEQ ID NO: 26), Anc80L59 (SEQ ID NO: 20), Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), y Anc80L62 (SEQ ID NO: 22). El alineamiento mostrado en las Figuras 4A y 4B confirma la variacion predicha en cada uno de los 11 sitios, y una unica mutacion no sinonima en la posicion 609E de Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), que puede ser un artefacto de clonacion. Las Figuras 5A y 5B muestran un alineamiento entre los polipeptidos de capside de VP1 de AAV ancestrales (Anc80L65 (SEQ ID NO: 23), Anc80L27 (SEQ ID NO: 19), Anc80L33 (SEQ ID NO: 24), Anc80L36 (SEQ ID NO: 25), Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), Anc80L62 (SEQ ID NO: 22), Anc80L44 (SEQ ID NO: 26), y Anc80L59 (SEQ ID NO: 20)) y los polipeptidos de capside de VP1 de AAV contemporaneos (AAV8 (SEQ ID NO: 27), AAV9 (SEQ ID NO: 28), AAV6 (SEQ ID NO: 29), AAV1 (SEQ ID NO: 30), AAV2 (SEQ ID NO: 31), AAV3 (SEQ ID NO: 32), AAV3B (SEQ iD NO: 33), y AAV7 (SEQ ID NO: 34)). El alineamiento en las Figuras 5A y 5b muestra que las secuencias de AAV ancestrales tienen entre aproximadamente el 85% y el 91% de identidad de secuencia con las secuencias de AAV contemporaneas.
Tambien se proporcionan vectores que contienen moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos. Los vectores, incluidos los vectores de expresion, estan disponibles comercialmente o pueden producirse mediante tecnolog^a recombinante. Un vector que contiene una molecula de acido nucleico puede tener uno o mas elementos para la expresion unidos operativamente a tal molecula de acido nucleico, y ademas puede incluir secuencias tales como las que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibioticos), y/o aquellas que se pueden usar en la purificacion de un polipeptido (por ejemplo, la etiqueta 6xHis). Los elementos para la expresion incluyen secuencias de acido nucleico que dirigen y regulan la expresion de secuencias codificantes de acido nucleico. Un ejemplo de un elemento de expresion es una secuencia promotora. Los elementos de expresion tambien pueden incluir uno o mas de intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresion de una molecula de acido nucleico. Los elementos de expresion pueden ser de origen bacteriano, levadura, insecto, mairnfero o vmco y los vectores pueden contener una combinacion de elementos de expresion de diferentes offgenes. Como se usa en el presente documento, unido operativamente significa que los elementos para la expresion se colocan en un vector con respecto a una secuencia codificante de tal manera que dirijan o regulen la expresion de la secuencia codificante.
Una molecula de acido nucleico, por ejemplo, una molecula de acido nucleico en un vector (por ejemplo, un vector de expresion, un vector vmco) puede introducirse en una celula huesped. El termino "celula huesped" se refiere no solo a la celula o celulas en particular en las que se ha introducido la molecula de acido nucleico, sino tambien a la progenie o posible progenie de tal celula. Los expertos en la tecnica conocen muchas celulas huesped adecuadas; las celulas huesped pueden ser celulas procariotas (por ejemplo, E. coli) o celulas eucariotas (por ejemplo, celulas de levadura, celulas de insecto, celulas vegetales, celulas de mai^ero). Las celulas huesped representativas pueden incluir, sin limitacion, A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, celulas 293, Saos, C2C12, celulas L, HT1080, HepG2 y fibroblastos primarios, hepatocitos y celulas de mioblastos derivadas de mai^eras, incluyendo seres humanos, monos, ratones, ratas, conejos y hamsteres. Los metodos para introducir moleculas de acido nucleico en celulas huesped se conocen bien en la tecnica e incluyen, sin limitacion, precipitacion con fosfato de calcio, electroporacion, choque termico, lipofeccion, microinyeccion y transferencia de acido nucleico mediada por virus (por ejemplo, transduccion).
Con respecto a los polipeptidos, "purificado" se refiere a un polipeptido (es decir, un peptido o un polipeptido) que se ha separado o purificado a partir de componentes celulares que lo acompanan de forma natural. Tfpicamente, el polipeptido se considera "purificado" cuando esta al menos el 70% (por ejemplo, al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o el 99%) en peso seco, libre de los polipeptidos y moleculas de origen natural con las que se asocia de forma natural. Dado que un polipeptido que se sintetiza químicamente esta, por naturaleza, separado de los componentes que lo acompanan de forma natural, un polipeptido sintetico se considera "purificado", pero puede eliminarse adicionalmente de los componentes utilizados para sintetizar el polipeptido (por ejemplo, residuos de aminoacidos). Con respecto a las moleculas de acido nucleico, "aislado" se refiere a una molecula de acido nucleico que esta separada de otras moleculas de acido nucleico que usualmente estan asociadas con esta en el genoma. Ademas, una molecula de acido nucleico aislada puede incluir una molecula de acido nucleico modificada por ingenieffa genetica, tal como una molecula de acido nucleico recombinante o sintetica.
Los polipeptidos se pueden obtener (por ejemplo, purificar) a partir de fuentes naturales (por ejemplo, una muestra biologica) mediante metodos conocidos tales como intercambio ionico DEAE, filtracion en gel, y/o cromatograffa de hidroxiapatita. Tambien se puede obtener un polipeptido purificado, por ejemplo, expresando una molecula de acido nucleico en un vector de expresion o mediante smtesis química. El grado de pureza de un polipeptido se puede medir utilizando cualquier metodo apropiado, por ejemplo, cromatograffa en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o analisis por HPLC. De manera similar, las moleculas de acido nucleico se pueden obtener (por ejemplo, aislar) utilizando metodos de rutina tales como, sin limitacion, tecnologfa de acido nucleico recombinante (por ejemplo, digestion con enzimas de restriccion y ligadura) o la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR; vease, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Ademas, las moleculas de acido nucleico aisladas se pueden sintetizar químicamente.
Metodos de uso de virus ancestrales o porciones de los mismos
Un virus ancestral o una porcion del mismo como se describe en el presente documento, particularmente aquellos que presentan una seroprevalencia reducida en relacion con los virus contemporaneos o porciones de los mismos, se puede usar en varias aplicaciones de investigacion y/o terapeuticas. Por ejemplo, un virus ancestral o una porcion del mismo, como se describe en el presente documento, se puede usar en medicina humana o animal para terapia genica (por ejemplo, en un vector o sistema de vectores para transferencia genica) o para vacunacion (por ejemplo, para la presentacion de antigenos). Mas espedficamente, un virus ancestral o una porcion del mismo, como se describe en el presente documento, se puede usar para la adicion de genes, el aumento de genes, el suministro genetico de un polipeptido terapeutico, la vacunacion genetica, el silenciamiento de genes, la edicion del genoma, la terapia genica, el suministro de ARNi, el suministro de ADNc, el suministro de ARNm, el suministro de ARNmi, esponjamiento de ARNmi, la inmunizacion genetica, la terapia genica optogenetica, la transgenesis, la vacunacion con ADN, o la inmunizacion con ADN.
Una celula huesped puede transducirse o infectarse con un virus ancestral o una porcion del mismo in vitro (por ejemplo, creciendo en cultivo) o in vivo (por ejemplo, en un sujeto). Las celulas huesped que se pueden transducir o infectar con un virus ancestral o una porcion del mismo in vitro se describen en el presente documento; las celulas huesped que pueden transducirse o infectarse con un virus ancestral o una porcion del mismo in vivo incluyen, sin limitacion, cerebro, hugado, musculo, pulmon, ojo (por ejemplo, retina, epitelio pigmentario de la retina), rinon, corazon, gonadas (por ejemplo, testmulos, utero, ovarios), piel, fosas nasales, sistema digestivo, pancreas, celulas de los islotes, neuronas, linfocitos, ofdo (por ejemplo, ofdo interno), folmulos pilosos, y/o glandulas (por ejemplo, tiroides).
Un virus ancestral o una porcion del mismo como se describe en el presente documento puede modificarse para incluir un transgen (en cis o trans con otras secuencias vmcas). Un transgen puede ser, por ejemplo, un gen indicador (por ejemplo, beta-lactamasa, beta-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina cinasa, polipeptido verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), o luciferasa, o polipeptidos de fusion que incluyen un dominio de etiqueta de antfgeno tal como hemaglutinina o Myc) o un gen terapeutico (por ejemplo, genes que codifican hormonas o receptores de los mismos, factores de crecimiento o receptores de los mismos, factores de diferenciacion o receptores de los mismos, reguladores del sistema inmunitario (por ejemplo, citocinas e interleucinas) o receptores de los mismos, enzimas, ARN (por ejemplo, ARN inhibitorios o ARN catalfticos), o antfgenos diana (por ejemplo, antfgenos oncogenos, antfgenos autoinmunitarios).
El transgen particular dependera, al menos en parte, de la enfermedad o deficiencia particular que se esta tratando. Simplemente a modo de ejemplo, la transferencia genica o la terapia genica pueden aplicarse al tratamiento de la hemofilia, retinitis pigmentosa, fibrosis qrnstica, amaurosis congenita de Leber, trastornos de almacenamiento lisosomal, errores innatos del metabolismo (por ejemplo, errores innatos del metabolismo de los aminoacidos, incluyendo fenilcetonuria, errores innatos del metabolismo de los acidos organicos, incluyendo academia propionica, errores innatos del metabolismo de los acidos grasos, incluida la deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD), cancer, acromatopsia, distrofias de conos y bastones, degeneraciones maculares (por ejemplo, degeneracion macular relacionada con la edad), deficiencia de lipopolipeptido lipasa, hipercolesterolemia familiar, atrofia muscular espinal, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, obesidad, trastorno inflamatorio del intestino, diabetes, insuficiencia cardfaca congestiva, hipercolesterolemia, perdida de la audicion, enfermedad coronaria, amiloidosis familiar, smdrome de Marfan, insomnio familiar fatal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de celulas falciformes, enfermedad de Huntington, degeneracion del lobulo fronto-temporal, smdrome de Usher, intolerancia a la lactosa, trastornos de almacenamiento de lfpidos (por ejemplo, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C), enfermedad de Batten, coroideremia, enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo II (enfermedad de Pompe), ataxia telangiectasia (smdrome de Louis-Bar), hipotiroidismo congenito, inmunodeficiencia combinada severa (SCID), y/o esclerosis lateral amiotrofica (ALS).
Un transgen tambien puede ser, por ejemplo, un inmunogeno que es util para inmunizar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano, un animal (por ejemplo, un animal de comparMa, un animal de granja, un animal en peligro de extincion). Por ejemplo, los inmunogenos pueden obtenerse de un organismo (por ejemplo, un organismo patogeno) o una porcion inmunogena o un componente del mismo (por ejemplo, un polipeptido de toxina o un subproducto del mismo). A modo de ejemplo, los organismos patogenos de los cuales se pueden obtener polipeptidos inmunogenos incluyen virus (por ejemplo, picornavirus, enterovirus, ortomixovirus, reovirus, retrovirus), procariotas (por ejemplo, neumococos, estafilococos, listeria, pseudomonas) y eucariotas (por ejemplo, amebiasis, malaria, leishmaniasis, nematodos). Se entendera que los metodos descritos en el presente documento y las composiciones producidas por dichos metodos no se limitan por ningun transgen en particular.
Un virus ancestral o una porcion del mismo, usualmente suspendido en un vehmulo fisiologicamente compatible, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un mairnfero humano o no humano). Los vehmulos adecuados incluyen una solucion salina, que se puede formular con una diversidad de soluciones tamponantes (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato), lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina y agua.
El virus ancestral o porcion del mismo, se administra en cantidades suficientes para transducir o infectar las celulas y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresion genica para proporcionar un beneficio terapeutico sin demasiados efectos adversos. Las v^as de administracion convencionales y farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitacion, la administracion directa a un organo tal como, por ejemplo, el dgado o el pulmon, por via oral, intranasal, intratraqueal, por inhalacion, intravenosa, intramuscular, intraocular, subcutanea, intradermica, transmucosa, o por otras vfas de administracion. Las rutas de administracion se pueden combinar, si se desea. La dosis del virus ancestral o porcion del mismo administrada a un sujeto dependera principalmente de factores tales como la afeccion que se esta tratando, y la edad, el peso y la salud del sujeto. Por ejemplo, una dosis terapeuticamente eficaz de un virus ancestral o una porcion del mismo a administrar a un sujeto humano generalmente esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml de una solucion que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 101 a 1 x 1012 copias genomicas (GC) de virus ancestrales (por ejemplo, aproximadamente 1 x 103 a 1 x 109 GC). La transduccion y/o la expresion de un transgen se pueden controlar en diversos puntos de tiempo despues de la administracion por ADN, ARN o ensayos de protemas. En algunos casos, los niveles de expresion del transgen se pueden controlar para determinar la frecuencia y/o la cantidad de dosis. Los regfmenes de dosificacion similares a los descritos con fines terapeuticos tambien pueden utilizarse para la inmunizacion.
Los metodos descritos en el presente documento tambien se pueden usar para modelar la evolucion directa, para modificar o eliminar uno o mas dominios inmunogenos de un virus o porcion del mismo.
De acuerdo con la presente invencion, pueden emplearse tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, bioquímica y ADN recombinante dentro de los conocimientos de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. La invencion se describira adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los metodos y composiciones de materia que se describen en las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Prediccion computacional de secuencias ancestrales
Se obtuvo un conjunto de 75 secuencias de aminoacidos diferentes de capsides de AAV a partir de varias bases de datos publicas, incluyendo GenBank, y las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo PRANK-MSA, version 121002, con la opcion "-F".
Se uso ProtTest3 (vease, por ejemplo, Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5; disponible en darwin.uvigo.es/software/prottest3 en Internet) para evaluar diferentes modelos de la evolucion polipeptfdica (por ejemplo, los incluidos en ProTest3, concretamente, JTT, LG, WAG, VT, CpRev, RtRev, Dayhoff, DCMut, fLu , Blosum62, VT, HIVb, MtArt, MtMam) en condiciones diferentes (por ejemplo, las incluidas en ProTest3, concretamente, "+I", "+F", "+ G", y combinaciones de los mismos). El modelo JTT (Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82) con G y F (Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; y Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519­ 27) se selecciono basandose en su puntuacion del criterio de informacion de Aikake (AIC; Hirotugu, 1974, IEEE Transactions on Automatic Control, 19:716-23) de acuerdo como se implemento en ProTest3.
Se construyo una filogenia de la evolucion de AAV utilizando PhyML (Guindon y Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)). Vease la Figura 3. El arbol se genero utilizando el modelo de sustitucion JTT F con 4 categonas de sustitucion discretas y un parametro de forma Gamma estimado. Los arboles resultantes se mejoraron a traves del intercambio de vecinos mas cercanos (NNI) y la poda y reinjerto de subarbol (SPR), y se evaluo su importancia a traves de muestreo por repeticion y la prueba de razon de similitud aproximada (aLRT; Anisimova y Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52)) usando la variante "de tipo SH".
El arbol filogenico construido anteriormente se uso entonces para estimar los estados ancestrales de la capside de AAV en cada nodo interior a la filogenia. Las secuencias de capside ancestral se reconstruyeron utilizando los principios de maxima verosimilitud mediante el software Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood (PAML) (Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6; disponible en abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html en Internet) envuelto en Lazarus (Sourceforge en sf.net). Mas espedficamente, la reconstruccion de Lazarus/PAML se configuro para generar una reconstruccion de aminoacidos usando el modelo de sustitucion JTT+F utilizando 4 categonas distribuidas por gamma. Se uso AAV5 como un grupo externo. Finalmente, se anadio la opcion "I" para colocar los indeles (es decir, se codifico de forma binaria y se coloco a traves de parsimonia maxima utilizando el algoritmo de Fitch) despues de que se realizo la reconstruccion de PAML.
Debido a que la reconstruccion se realizo en un modo de maxima verosimilitud, se puede calcular la verosimilitud de que cualquier residuo se encuentre en una posicion dada en un nodo dado. Para ello, se escribio un guion adicional para identificar todas las posiciones a lo largo de la secuencia con una probabilidad posterior calculada por debajo de un cierto umbral. Se selecciono un umbral de 0,3, lo que significa que cualquier aminoacido con una probabilidad posterior calculada de mas de 0,3 se incluyo en la smtesis de la genoteca. Estos residuos se seleccionaron como variantes de interes en la genoteca.
Para finalizar la secuencia, se tuvo que codificar una utilidad adicional para seleccionar los codones. Se escribio un guion para derivar codones similares a los de otra secuencia de AAV (AVVRh10, que tiene aproximadamente un 92% de identidad de secuencia con la secuencia de andamiaje de Anc80) y se aplica un algoritmo novedoso para sustituir codones en los que existian emparejamientos incorrectos de secuencia basados en una matriz de sustitucion de codones. El nuevo algoritmo se muestra a continuacion:
Dado: secuencia de aminoacidos, Pt, con la secuencia de nucleotidos correspondiente, Nt, donde Nt codifica Pt; y secuencia de protemas, Pi, donde Pi presenta una fuerte homologfa con Pt.
Alinear Pi con Pt usando Needleman-Wunsch usando la tabla Blosum62 para la puntuacion. Generar una nueva secuencia de nucleotidos, Ni, pasando por el alineamiento de protemas, utilizando el codon correspondiente de Nt,
donde el aminoacido en Pt coincide exactamente con el de Pi,
el codon de "mejor puntuacion" de la matriz Codon-PAM (Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6: 134) donde hay una sustitucion,
un hueco donde existe un hueco en Pi alineada contra un aminoacido en Pt, y
el nucleotido que ocurre con mayor frecuencia en el Nt (que codifica un aminoacido dado) donde existe un aminoacido en Pi alineada contra un hueco en Pt.
Ademas, se realizaron dos cambios de un solo nucleotido para suprimir la transcripcion de la protema activadora del ensamblaje (AAP), que se codifica fuera del marco dentro del gen de la capside del AAV en el AAV natural. Dado que la codificacion de la AAP (contemporanea o ancestral) no fue parte de esta reconstruccion, la expresion de la AAP se elimino haciendo una mutacion sinonima en la secuencia cap, y la secuencia de AAP se proporciono en trans durante la produccion vmca.
Ejemplo 2 - Expresion de secuencias de VP1 de AAV ancestrales
Se realizaron experimentos para determinar si las secuencias de capside de AAV ancestrales predichas se pueden usar para hacer vectores vmcos.
Se clonaron varias de las secuencias de capside de AAV ancestrales predichas. La genoteca de capsides ancestrales se transfirio a un plasmido de expresion rep-cap para permitir la formacion de partmulas vmcas en la transfeccion transitoria. Para mantener los niveles de expresion apropiados y el corte y empalme de VP1, VP2 y VP3, se clonaron los genes de cap de la genoteca cortando Hindlll, ubicado en 5' de cap en la secuencia codificante rep, y Spel, que se modifico entre el codon de parada cap y la senal de poliadenilacion. En consecuencia, para clonar las capsides ancestrales en una construccion "REP/cAp" mas convencional, el plasmido de paso se digirio con Hindlll y Spel, se purifico en gel y se ligo en un plasmido rep/cap digerido de manera similar.
Los polipeptidos expresados se resolvieron en un gel de SDS al 10%. Como se muestra en la Figura 6, los polipeptidos de la capside se expresaron y sometieron a corte y empalme adecuadamente en VP1, VP2 y VP3 a partir de varias secuencias de AAV ancestrales (Anc80L44, Anc80L27 y Anc80L65), asf como de una secuencia de AAV contemporanea, AAV2/8.
Ejemplo 3 - Valoracion virica
El AAV se produjo en celulas HEK293 a traves de la cotransfeccion transitoria de plasmidos que codifican todos los elementos necesarios para el ensamblaje de partmulas vmcas. Brevemente, las celulas HEK293 se hicieron crecer al 90% de confluencia y se transfectaron con (a) el plasmido del genoma vmco que codifica el transgen de luciferasa (expresado por el promotor de CMV) flanqueado por ITR de AAV2, (b) el plasmido de empaquetamiento de AAV que codifica rep de AAV2 y las protemas de la capside sintetizadas divulgadas en el presente documento, (c) capside que expresa AAP de AAV2, y (d) genes auxiliares adenovirales necesarios para el empaquetado y el ensamblaje de AAV. Las celulas se incubaron a 37°C durante 2 dfas y las celulas y los medios se recolectaron y recogieron.
La suspension de medio celular se liso mediante 3 ciclos consecutivos de congelacion y descongelacion. A continuacion, el lisado se elimino por centrifugacion y se trato con una enzima en condiciones para realizar una digestion exhaustiva del ADN, aqu Benzonase™, para digerir cualquier ADN presente fuera de la partmula vmca. La preparacion de AAV se diluyo hasta estar dentro del intervalo de medicion lineal de una plantilla de ADN de control, en este caso, un plasmido linealizado con el cebador TaqMan™ identico y la secuencia de union de la sonda en comparacion con el genoma del vector. Se realizo la PCR TaqMan™ con cebadores e hibridacion de la sonda al genoma del vector vmco de eleccion. El tftulo se calculo basandose en la medicion de TaqMan™ en copias genomicas (GC) por mililitro (ml) como se muestra en la Tabla 2 a continuacion.
Tabla 2
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Los resultados de la produccion de vectores a pequena escala en partfculas de capside de AAV reconstruidas de forma ancestral demostraron rendimientos similares a AAV2, pero reducidos en relacion con AAV8, ambos de los cuales son preparaciones de vectores basadas en AAV contemporaneos.
Ejemplo 4 - Transduccion virica in vitro
Se realizaron transducciones vmcas in vitro para evaluar la capacidad de los virus que contienen las secuencias de AAV ancestrales predichas para infectar celulas.
Despues de la produccion vectorial de alto rendimiento utilizando la biblioteca de secuencias de Anc80, las celulas HEK293 se transdujeron con cada vector vmco. Ademas de una secuencia Anc80, cada vector vmco contema un transgen de luciferasa. La luciferasa se midio mediante la cuantificacion de la bioluminiscencia en un lector de placas de 96 pocillos despues de la adicion del sustrato de luciferina a las celulas transducidas o al lisado celular. Despues de la cuantificacion, se produjo un mapa de calor de la expresion de luciferasa en cuatro placas de 96 pocillos concatenadas (excluyendo una columna de controles en cada placa). Debido a la gran cantidad de inserciones, eliminaciones y transiciones asociadas con el proceso de produccion de vectores de alto rendimiento, muchos de los vectores no eran funcionales. Para los fines del presente documento, solo se evaluaron adicionalmente los virus que eran funcionales en este ensayo (es decir, capaces de transducir celulas HEK293 y expresar el transgen).
Se transdujeron celulas HEK293, a igual multiplicidad de infeccion (MOI) de 1 x 104 copias genomicas (GC) por celula, con dos vectores de AAV contemporaneos (AAV2/2 y AAV2/8) y tres vectores de AAV ancestrales predichos (Anc80L27, Anc80L44, y Anc80L65). Cada vector contema un transgen que codificaba luciferasa o un transgen que codificaba eGFP. Se tomaron imagenes de las celulas 60 horas despues utilizando el canal de GFP de un microscopio optico AMG EvosFI. La Figura 7 muestra la expresion de luciferasa despues de la transduccion in vitro. Cada uno de los virus AAV ancestrales demostro una transduccion eficiente de celulas HEK293.
Ejemplo 5 - Transduccion retiniana in vivo
Se realizaron transducciones retinianas para determinar si los vectores AAV ancestrales son capaces de dirigirse a las celulas retinianas murinas in vivo.
Los ojos murinos se transdujeron con 2 x 108 copias genomicas (GC) de tres AAV ancestrales diferentes (Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65) y un AAV contemporaneo (AAV2/8), todos los cuales incluyen un transgen que codifica eGFP. Para las transducciones, cada vector AAV se administro quirurgicamente debajo de la retina al generar un espacio entre el fotorreceptor y la capa del epitelio pigmentario de la retina a traves de la administracion de un bolo vectorial con un dispositivo de inyeccion. El bolo vectorial se dejo en el espacio subretiniano y el desprendimiento subretiniano se resolvio con el tiempo. La expresion de GFP se controlo de forma no invasiva mediante fotograffa de fondo de la retina del animal despues de la dilatacion de la pupila con Tropicamide™. Todas las retinas presentadas demostraron diversos grados de direccionamiento exitoso de AAV ancestrales a la retina.
La histologfa retiniana tambien se realizo y se visualizo bajo microscopfa fluorescente para identificar el tipo o tipos de celulas transducidos. La histologfa se realizo en una retina murina transducida con el vector de AAV ancestral Anc80L65 como se describe anteriormente. La expresion de eGFP mediada por Anc80L65 fue evidente en la capa nuclear externa (ONL), los segmentos internos (IS) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE), lo que indica que el vector Anc80L65 ancestral se dirige a fotorreceptores murinos y celulas del epitelio pigmentario retiniano.
Ejemplo 6 - Ensayo de anticuerpos neutralizantes
Se realizaron ensayos de anticuerpos neutralizantes para evaluar si un virus AAV ancestral es mas resistente a la neutralizacion de anticuerpos que un virus AAV contemporaneo. Los ensayos de anticuerpos neutralizantes miden la concentracion de anticuerpos (o el tftulo en el que una muestra experimental contiene una concentracion de anticuerpos) que neutraliza una infeccion en un 50% o mas en comparacion con un control en ausencia del anticuerpo.
Las muestras de suero o la solucion madre de IVIG (200 mg/ml) se diluyeron en serie dos veces, y las muestras sin diluir y diluidas se incubaron conjuntamente con un virus AAV ancestral, Anc80L65, y un virus AAV contemporaneo, AAV2/8, a una MOI de 104 durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Cada virus inclrna un transgen de luciferasa. El vector mezclado y una muestra de anticuerpo se transdujeron entonces en celulas HEK293. Para estos experimentos, la muestra de anticuerpos utilizada fue inmunoglobulina intravenosa (IGIV), IgG agrupadas extrafdas del plasma de mas de mil donantes de sangre (vendidos comercialmente, por ejemplo, como Gammagard™ (Baxter Healthcare; Deerfield, IL) o Gamunex™ (Grifols; Los Angeles, CA)). 48 horas despues del inicio de la transduccion, las celulas se analizaron por bioluminiscencia para detectar luciferasa. El tftulo de anticuerpos neutralizantes se determino identificando la dilucion de la muestra para la cual se alcanzo un 50% o mas de neutralizacion (transduccion de muestra/transduccion del virus de control en ausencia de muestra).
Ejemplo 7 - Caracterizacion de Anc80
En base a los metodos descritos en el presente documento, se obtuvo la secuencia Anc80 mas probable (de acuerdo como se determino a traves de la probabilidad posterior) y se designo Anc80L1 (la SEQ ID nO:35 muestra la secuencia de acido nucleico de la capside de Anc80L1 y la SEQ ID NO:36 muestra la secuencia de aminoacidos del polipeptido de VP1 de Anc80L1). La genoteca probabilfstica de Anc80 tambien se sintetizo utilizando las secuencias descritas en el presente documento por una empresa comercial y se subclono en vectores de expresion. La genoteca de Anc80 se evaluo clonalmente para determinar el rendimiento vectorial y la infectividad en ensayos combinados. Fuera de este cribado, se caracterizaron adicionalmente Anc80L65 (SEQ ID NO:23), asf como varias otras variantes.
La genoteca de Anc80 y Anc80L65 se compararon en terminos de diferencia de secuencia (Figura 9; % por encima de la diagonal, N.° de diferencias de aminoacidos a continuacion). Usando NCBI-BLAST, la secuencia mas cercana disponible publicamente para Anc80L65 es rh10 (GenBank N.° de acceso AAO88201.1).
La Figura 10 muestra que Anc80L65 produjo rendimientos vectoriales equivalentes a AAV2 (Panel A), genero partfculas vmcas bajo electroscopia de transmision (TEM) (Panel B), y produjo bioquímicamente la cap de AAV y las protemas VP1, 2 y 3 basadas en SDS page en condiciones de desnaturalizacion (Panel C) y transferencia Western utilizando el anticuerpo de capside de AAV, B1 (Panel D). Estos experimentos se describen con mas detalle en los parrafos siguientes.
Brevemente, los vectores AAV2/8, AAV2/2, AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L44, y AAV2/Anc80L65 se produjeron a pequena escala que conteman una construccion de indicador compuesta por eGFP y luciferasa de luciernaga bajo un promotor de CMV a pequena escala. Los tttulos de estas preparaciones de virus a pequena escala se obtuvieron despues a traves de qPCR. Basandose en estos experimentos, se encontro que los vectores Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65 producen niveles vmcos comparables a los de AAV2 (Figura 10A).
Para confirmar que las protemas de la capside Anc80L65 se ensamblaron en partfculas pseudovmcas intactas del tamano y conformacion apropiados, se obtuvieron micrograffas utilizando microscopfa electronica de transmision (TEM). Una preparacion purificada a gran escala de Anc80-L065 se cargo en rejillas de cobre recubiertas con polivinilo formal (Formvar®) y luego se tino con acetato de uranilo. Las micrograffas revelaron partmulas hexagonales intactas con diametros entre 20 y 25 nm (Figura 10B).
Para determinar si los genes de capside ancestrales sinteticos se procesaron adecuadamente (es decir, se sometieron a corte y empalme y se expresaron), se cargaron preparaciones purificadas a gran escala de vectores AAV2/8, AAV2/2 y AAV2/Anc80L65 en un gel SdS-PAGE (1E10 GC/pocillo) en condiciones de desnaturalizacion. Las bandas que representaban las protemas de capside vmca VP1, Vp2 y VP3 estaban claramente presentes para cada preparacion de vector (Figura 10C). La transferencia de Western con el anticuerpo de capside de AAV B1 confirmo ademas que estas bandas representaban las protemas predichas (Figura 10D).
Ademas, la Figura 11 muestra que Anc80L65 infecto tejidos y celulas de mairnfero in vitro en celulas HEK293 en MOI 10E4 GC/celula usando GFP como lectura (Panel A) o luciferasa (Panel B) frente a controles de AAV2 y/o AAV8. Anc80L65 tambien fue eficaz en el direccionamiento al hugado despues de una inyeccion IV del AAV indicado que codifica un transgen LacZ nuclear (fila superior, Panel C), despues de la inyeccion intramuscular (IM) directa del AAV indicado que codifica GFP (fila central, Panel C), y despues de la inyeccion subretiniana con el AAV indicado que codifica GFP (fila inferior, Panel C). Estos experimentos se describen con mas detalle en los parrafos siguientes. Para obtener una medida relativa de la infectividad de los viriones ancestrales, se produjeron preparaciones en bruto de AAV2/2, AAV2/8, AAV2/Anc80L65, AAV2/Anc80L44, AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L121, AAV2/Anc80L122, AAV2/Anc80L123, AAV2/Anc80L124, y AAV2/Anc80L125 que contienen una construccion indicadora bi-cistronica que incluye una eGFP y secuencias de luciferasa de luciernaga bajo el control de un promotor de CMV. Las placas de 96 pocillos confluentes con celulas HEK293 se sometieron luego a transduccion con cada vector a una MOI de 1E4 GC/celula (tftulos obtenidos a traves de qPCR como anteriormente). 48 horas despues, la microscopfa de fluorescencia confirmo la presencia de GFP en celulas transducidas (Figura 11A). Despues, las celulas se analizaron para determinar la presencia de luciferasa (Figura 11B), que determino que la expresion de luciferasa en celulas transducidas con vectores derivados de Anc80 estaba en medio de celulas transducidas con AAV8 (nivel inferior de transduccion) y AAV2 (nivel superior de transduccion).
Para evaluar la eficacia relativa de la transferencia genica en un contexto in vivo, se obtuvieron preparaciones purificadas de alto tftulo de AAV2/2, AAV2/8 y AAV2/Anc80L65. Se inyectaron 3,9E10 GC de cada vector, encapsidando un transgen que codifica LacZ nuclear bajo el control de un promotor TBG, en ratones C57BL/6 (3 ratones por condicion) a traves de una inyeccion IP despues de la anestesia general. 28 dfas despues de la inyeccion, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos. Los hugados se seccionaron mediante tecnicas histologicas estandar y se tineron para determinar la beta-galactosidasa. Luego, se tomaron imagenes de las secciones bajo un microscopio y se muestran imagenes representativas en la Figura 11C, fila superior.
Despues, se obtuvieron vectores de los mismos serotipos que conteman un transgen bicistronico que codificaba eGFP y hA1AT bajo el control de un promotor pCASI. Para evaluar la capacidad de Anc80L65 para transducir el musculo esqueletico murino, se inyecto 1E10 GC de cada vector en el musculo esqueletico de ratones C57BL/6 (5 ratones por condicion) despues de la anestesia general. 28 dfas despues de la inyeccion, los ratones se sacrificaron, los tejidos se sometieron a crioseccion y se evaluo la presencia de eGFP utilizando microscopfa confocal fluorescente (azul es DAPI, verde es eGFP). Las imagenes representativas se muestran en la Figura 11C, fila central. Estos experimentos demostraron que los vectores Anc80L65 eran capaces de transducir el musculo esqueletico murino mediante inyeccion intramuscular.
Se obtuvieron vectores de los mismos serotipos, esta vez encapsidando construcciones que codificaban solo un transgen de eGFP bajo el control de un promotor de CMV. Las partmulas de 2E9 se inyectaron por via subretiniana en ratones C57BL/6 despues de la anestesia general. 28 dfas despues de la inyeccion, se sacrificaron los ratones y se recogieron los ojos, se sometieron a crioseccion, y se evaluo la presencia de eGFP utilizando microscopfa confocal fluorescente (azul es DAPI, verde es eGFP). Se muestran imagenes representativas en la Figura 11C, fila inferior. Estos experimentos demuestran que los vectores Anc80L65 pueden transducir la retina murina a un nivel que es comparable a los vectores AAV8.
Brevemente, se obtuvieron preparaciones purificadas y de alto tftulo de vectores vmcos AAV2/8, AAV2/2, AAV2/rh32.33 y AAV2/Anc80L65 que encapsidaban un transgen bicistronico que incluye eGFP y luciferasa de luciernaga bajo el control de un promotor de CMV. Estos vectores se incubaron luego con diluciones seriadas de dos veces de IVIG (10 mg, 5 mg, 2,5 mg, etc.) o se incubaron sin IVIG (1E9 GC por condicion). Despues de la incubacion, se usaron vectores para transducir celulas HEK293 a una MOI de 1E4 por pocillo (una dilucion por pocillo).
Ejemplo 8 - Generacion de capsides de AAV ancestrales adicionales
Las secuencias de capside de AAV ancestrales mas probables (de acuerdo con lo determinado por la probabilidad posterior) se sintetizaron luego a traves de un laboratorio comercial (Gen9) y se proporcionaron como ADNds lineal. Estas secuencias de aminoacidos se compararon entonces con las de los AAV existentes para determinar el grado en que difieren (Figura 13). Cada protema VP1 ancestral difiere de las de los AAV existentes representativos seleccionados entre un 3,6% y un 9,3% (Figura 13A), mientras que las protemas VP3 ancestrales difieren entre un 4,2 y un 9,4% (Figura 13B). Estas capsides se subclonaron en plasmidos de produccion de AAV (pAAVector2/Vado) a traves de la digestion con enzimas de restriccion (HindIII y Spel) y la ligadura de T4. Estos clones se confirmaron a traves de digestion de restriccion y secuenciacion de Sanger, y luego se produjeron preparaciones a escala media de ADN plasirftdico.
Cada uno de estos plasmidos se uso luego para producir vectores de AAV que conteman un gen indicador que codificaba tanto eGFP como luciferasa de luciernaga. Estos vectores se produjeron por triplicado en pequena escala como se describe anteriormente. Las preparaciones en bruto del virus se titularon luego a traves de qPCR y se encontro que produdan entre un 2,71% y un 183,1% de partmulas vfticas en relacion con AAV8 (Figuras 14 y 15). Estos tftulos se utilizaron entonces para configurar un experimento controlado por tftulos para evaluar la infectividad relativa. Anc126 no estaba controlado por tftulo debido a su produccion significativamente reducida y, en consecuencia, los datos sobre la infectividad de Anc126 no se pueden comparar con precision con la infectividad de los otros virus en el experimento. Los otros vectores se usaron para transducir celulas HEK293 a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 1,9E3 GC/celula.
60 horas despues de la transduccion, las celulas se evaluaron para determinar la expresion de GFP a traves de microscopfa de fluorescencia. Se detectaron celulas positivas para eGFP en cada una de las condiciones, excepto para el control negativo (Figura 16). Esto indica que cada una de las secuencias ancestrales predichas, sintetizadas y clonadas es capaz de producir partmulas vmcas infecciosas y viables. Para tener una idea de los niveles relativos de infectividad, los ensayos de luciferasa tambien se realizaron en las mismas celulas. Los resultados indican que cada uno de los vectores ancestrales es capaz de transducir celulas HEK293 entre un 28,3% y un 850,8% en relacion con AAV8 (Figuras 17 y 18). Se observa que Anc126 se excluyo del analisis de la transduccion relativa ya que no se controlo por tftulo.
En resumen, se sintetizaron ocho nuevos genes de capside de AAV ancestrales y se usaron en la produccion de vectores vfticos funcionales junto con AAV8, AAV2 y los vectores Anc80L65 descritos previamente. La produccion y la infectividad se evaluaron in vitro y se muestra un resumen de estos hallazgos en la Figura 19.
Ejemplo 9 - Inmunoprofilaxis vectorizada
En la inmunoprofilaxis vectorizada, los vehmulos de terapia genica (tal como el AAV) se utilizan para administrar transgenes que codifican anticuerpos ampliamente neutralizantes contra agentes infecciosos. Veanse, por ejemplo, Balazs et al. (2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52); Limberis et al. (2013, Sci. Transl. Med., 5:187ra72); Balazs et al. (2012, Nature, 481:81-4); y Deal et al. (2014, PNAS USA, 111:12528-32). Una ventaja de este tratamiento es que el huesped produce los anticuerpos en sus propias celulas, lo que significa que una unica administracion tiene el potencial de conferir una proteccion de por vida contra los agentes etiologicos.
Ejemplo 10 - Vehiculos de administracion farmacologica
LUCENTIS® (ranibizumab) y AVASTIN® (bevacizumab) son ambos agentes anti-angiogenesis basados en los mismos anticuerpos monoclonales de raton humanizados contra el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A). Aunque el bevacizumab es un anticuerpo completo y el ranibizumab es un fragmento (Fab), ambos actuan para tratar la degeneracion macular relacionada con la edad humeda a traves del mismo mecanismo: antagonizando el VEGF. Veanse, por ejemplo, Mao et al. (2011, Hum. Gene Ther., 22:1525-35); Xie et al. (2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.2014.07.105); y Watanabe et al. (2010, Gene Ther., 17:1042-51). Debido a que ambas de estas moleculas son protemas, pueden codificarse por el ADN y producirse en celulas transducidas con vectores que contienen un transgen, y son lo suficientemente pequenas como para ser empaquetadas en vectores de AAV.
OTRAS FORMAS DE REALIZACION
Debe entenderse que, si bien los metodos y las composiciones de materia se han descrito en el presente documento
junto con varios aspectos diferentes, la descripcion anterior de los diversos aspectos pretende ilustrar y no limitar el
alcance de los metodos y composiciones de la materia. Otros aspectos, ventajas y modificaciones estan dentro del
alcance de las siguientes reivindicaciones.
Se divulgan metodos y composiciones que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la
preparacion para, o son productos de los metodos y composiciones que se divulgan. Estos y otros materiales se
divulgan en el presente documento, y se entiende que se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones,
grupos, etc. de estos metodos y composiciones. Es decir, aunque la referencia espedfica a cada una de las diversas
combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estas composiciones y metodos no se puede divulgar
explicitamente, cada una se contempla y se describe espedficamente en el presente documento. Por ejemplo, si se
describe y se analiza una composicion particular de materia o un metodo particular y se analizan varias
composiciones o metodos, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de las composiciones y los
metodos se contemplan espedficamente a menos que se indique espedficamente de otro modo. Asimismo, tambien
se contempla espedficamente y se divulga cualquier subconjunto o combinacion de estas.
APENDICE A
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polipeptido de capside de virus adenoasociado (AAV) que tiene una secuencia de aminoacidos que consiste en la SEQ ID NO: 1.
2. El polipeptido de capside de AAV de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido de capside de AAV o una partmula vmca que comprende el polipeptido de capside de AAV presenta una menor seroprevalencia que un polipeptido de capside de AAV2 o una partfcula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV2, y en el que el polipeptido de capside de AAV o una partfcula vmca que comprende el polipeptido de capside de AAV presenta una seroprevalencia aproximadamente igual o inferior a la de un polipeptido de capside de AAV8 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV8.
3. El polipeptido de capside de AAV de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido de capside de AAV o una partmula vmca que comprende el polipeptido de capside de AAV se neutralizan en menor medida por suero humano que un polipeptido de capside de AAV2 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV2, y en el que el polipeptido de capside de AAV o una partfcula vmca que comprende el polipeptido de capside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar por suero humano, que un polipeptido de capside de AAV8 o una partmula vmca que comprende un polipeptido de capside de AAV8.
4. El polipeptido de capside de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipeptido de capside de AAV esta purificado.
5. El polipeptido de capside de AAV de la reivindicacion 1 codificado por una secuencia de acido nucleico que consiste en la SeQ ID NO: 2.
6. Una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de capside de virus adenoasociado (AAV) que tiene una secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO: 2.
7. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 6.
8. Una celula huesped que comprende el vector de la reivindicacion 7.
9. Una partfcula de virus purificada que comprende el polipeptido de capside de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. La partfcula de virus purificada de la reivindicacion 9, que comprende ademas un transgen.
11. Una partfcula vmca de la reivindicacion 10 para su uso en un metodo de transferencia genica y/o vacunacion con un transgen, comprendiendo el metodo
administrar la partfcula vmca a un sujeto que necesita transferencia genica o vacunacion, en la que la partmula vmca presenta menos seroprevalencia que una partfcula de virus AAV2.
12. La partfcula vmca para el uso de la reivindicacion 11, en la que la partfcula vmca presenta aproximadamente la misma o menos seroprevalencia que una partfcula de virus AAV8, o en la que la partmula vmca se neutraliza en menor medida por suero humano que una partfcula de virus AAV2, y en la que la parttcula del virus AAV se neutraliza en menor medida o similar por suero humano que una partfcula de virus a AV8.
13. Un antfgeno diana unido operativamente al polipeptido de capside de AAV de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de vacunacion de un sujeto, comprendiendo el metodo
administrar el antfgeno diana unido operativamente al polipeptido de capside de AAV de la reivindicacion 1 a un sujeto que necesita vacunacion, en el que el polipeptido de capside de AAV presenta menos seroprevalencia que un polipeptido de capside de AAV2.
14. El antfgeno diana unido operativamente al polipeptido de capside de AAV de la reivindicacion 1 para el uso de la reivindicacion 13, en el que el polipeptido de capside de AAV presenta aproximadamente la misma o menos seroprevalencia que un polipeptido de capside de AAV8.
15. El antfgeno diana para el uso de la reivindicacion 13, en el que el polipeptido de capside de AAV se neutraliza en menor medida por suero humano que un polipeptido de capside de AAV2, y en el que el polipeptido de capside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar por suero humano que un polipeptido de capside AAV8.
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