PL1819366T5 - Kompozycja barwiąca do barwienia błony ocznej - Google Patents

Description

Opis

ZGŁOSZENIE PIERWSZEŃSTWA

[0001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z tymczasowego zgłoszenia US nr 60/633592 złożonego 6 grudnia 2004 r. i 60/647504 złożonego 27 stycznia 2005 r.

DZIEDZINA WYNALAZKU

[0002] Wynalazek dotyczy kompozycji barwiącej do barwienia błony ocznej. Bardziej konkretnie, wynalazek dotyczy kompozycji barwiącej stosowanej jako środek pomocniczy do barwienia błony ocznej, szczególnie usuwania tej błony.

TŁO WYNALAZKU

[0003] Barwienie błony granicznej wewnętrznej (ILM) jest jednym z najważniejszych osiągnięć w chirurgicznym leczeniu chorób ciała szklistego i siatkówki, takich jak otwór w plamce żółtej i błony przedsiatkówkowe (ERMS) (Indocyanine green-assisted peeling of the retinal internal limiting membrane. Burk SE i in. Ophthalmology. 2000; 107: 2010-2014.) Obecnie powszechnie uznaje się, że chirurgiczne usuwanie takich błon bez środka pomocniczego jest bardzo trudne ze względu na słabą widoczność ILM i ERMS. W szczególności barwienie przy użyciu zieleni indocyjaninowej (ICG) i błękitu trypanu (TB) istotnie ułatwiło usuwanie ILM i ERMS w różnych chorobach ciała szklistego i siatkówki i w efekcie ta technika jest szeroko uznawana przez wielu chirurgów. Natomiast ostatnio pojawiły się liczne opisy dotyczące uszkodzenia siatkówki spowodowanego doszklistkowym wstrzyknięciem ICG i TB, zarówno w warunkach eksperymentalnych, jak i klinicznych. (Morphological and functional damage of the retina caused by intravitreous indocyanine green in rat eyes. Enaida H i in. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002; 240:209-213.; Uemura A i in. Visual field defects after uneventful vitrectomy for epiretinal membrane with indocyanine green-assisted internal limiting membrane peeling. Am J Ophthahnol. 2003;136:252-257.; Veckeneer M i in. Ocular toxicity study of trypan blue injected into the vitreous cavity of rabbit eyes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001;239:698-704.) [0004] Ponadto przeprowadzenie ciągłej kapsulotomii krzywoliniowej (CCC) w oku z zaćmą istoty białej może być trudne, gdyż odróżnienie torebki przedniej od położonej głębiej kory białej jest utrudnione. Słabe uwidocznienie torebki wiąże się z niezupełną lub niedostateczną CCC, co może prowadzić do późniejszego naderwania torebki soczewki, utraty ciała szklistego i śródgałkowego przemieszczenia soczewki (IOL). Śródgałkowe podawa nie barwników w celu barwienia przedniej części torebki soczewki i wykonania CCC w oku z zaćmą ze słabym czerwonym odbiciem lub bez czerwonego odbicia staje się coraz bardziej popularne. Dada wykazał, że barwienie torebki soczewki ułatwia wykonanie CCC nawet w przypadku niedojrzałej zaćmy i może stanowić użyteczny dodatkowy element w szkoleniu chirurgów. Do barwienia torebki soczewki zastosowano błękit trypanu 0,1% i 0,6% i stwierdzono, że nie wywiera widocznych działań toksycznych w warunkach in vivo. Natomiast w różnych eksperymentach przeprowadzonych w warunkach in vitro stwierdzono, że błękit trypanu jest toksyczny dla nabłonka rogówki. Zieleń indycyjanino-wa (ICG) jest także często stosowana do barwienia torebki soczewki. McEnerney i Pey-man opisali zastosowanie ICG do zliczania komórek śródbłonka rogówki królika i sugerowali, że barwnik nie uszkadza żywego śródbłonka. Natomiast wynalazcy opisali potencjalne toksyczne działanie ICG na komórki siatkówki w 2002 roku, a ostatnio opisano toksyczne działanie ICG na nabłonek barwnikowy siatkówki, komórki zwojowe i fotorecepto-ry. (Indocyanine green induces apoptosis in human retinal pigment epithelial cells. Rezai KA i in. Am J Ophthalmol. 2004;137:931-933.; Trypan blue induces apoptosis in human retinal pigment epithelial cells. Rezai KA i in. Am J Ophthalmol. 2004; 13 8:492-495.) WO 2004/035091 ujawnia zastosowanie błękitu patentowego V lub błękitu brylantowego R do barwienia przedniej części torebki soczewki lub błony przedsiatkówkowej oka, w trakcie wykonywania operacji okulistycznej.

[0005] Jak stwierdzono powyżej, istnieją wątpliwości dotyczące bezpieczeństwa barwników (takich jak IC lub TB) zwykle stosowanych do barwienia błon ocznych, w szczególności błony granicznej wewnętrznej i torebki przedniej. Takie wątpliwości występują w związku z doniesieniami o możliwych działaniach toksycznych, teratogennych i tym podobnych wobec komórek siatkówki. Poza tym występują problemy techniczne, takie jak niemożność uzyskania niskich stężeń barwnika o satysfakcjonujących właściwościach oraz skomplikowane metody barwienia. Zatem takie problemy sprawiają, że operacje okulistyczne stają się jeszcze trudniejszym problemem.

[0006] W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na opracowanie barwnika, który w sposób wybiórczy wybarwiałby błonę oczną i dawałby intensywne wybarwienie w niskim stężeniu oraz wykazywał bezpieczeństwo wysokiego stopnia, w celu usprawnienia operacji okulistycznych.

STRESZCZENIE WYNALAZKU

[0007] Zatem celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji barwiącej, która będzie stanowiła alternatywę dla zwykle stosowanych barwników do barwienia błon ocznych. Bar dziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku jest dostarczenie kompozycji barwiącej przeznaczonej do barwienia błony granicznej wewnętrznej lub torebki przedniej, która byłaby użyteczna jako środek pomocniczy przy do operacyjnym usuwaniu takiej błony.

[0008] Aby dostarczyć kompozycję barwiącą dla osiągnięcia takich celów, wykonano badanie przesiewowe wszystkich barwników pod tym kątem, w tym barwników obecnie nie wykorzystywanych w organizmach żywych. Dodatkowo, w ramach badania przesiewowego obserwowano szczególnie bezpieczeństwo i powinowactwo barwienia. Następnie, po zawężeniu puli potencjalnych barwników, dokonano oceny bezpieczeństwa na szczurach. W oparciu o wyższe powinowactwo barwienia i bezpieczeństwo, ostatecznym potencjalnym barwnikiem został błękit brylantowy G (BBG).

[0009] Ponadto, przeprowadzono różne eksperymenty dla oceny optymalnych warunków dla barwienia błony ocznej przez kompozycję barwiącą zawierającą BBG. W ten sposób otrzymano kompozycję barwiącą według wynalazku. Należy zauważyć, że dotychczas nie stosowano w klinice BBG, w szczególności u ludzi. Natomiast, dzięki optymalnym warunkom wynalazku, można dostarczyć kompozycję barwiącą, która jest bezpieczna do stosowania klinicznego i ma wysokie powinowactwo barwienia.

[0010] Zatem, zgodnie z pierwszym głównym aspektem wynalazku, dostarczana jest kompozycja barwiąca zawierająca jako główny składnik BBG, do barwienia błony ocznej w momencie usuwania błony ocznej.

[0011] Tak więc jeden aspekt wynalazku odnosi się do kompozycji barwiącej do barwienia błony ocznej w momencie usuwania błony ocznej, przy czym kompozycja barwiąca zawiera, jako główny składnik, błękit brylantowy G (BBG), jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub hydrat.

[0012] Korzystną strukturą przestrzenną BBG zgodnie z wynalazkiem stanowią optycznie aktywne cząstki o konkretnej budowie, ale BBG zgodnie z wynalazkiem może występować w postaci enancjomerów lub mieszanin enancjomerów, takich jak mieszaniny race-miczne. Zatem BBG zgodnie z wynalazkiem obejmuje wszystkie optycznie aktywne cząstki, mieszaniny enancjomerów, takie jak mieszanina racemiczna i mieszaniny diaste-reomerów BBG.

[0013] Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych soli obejmują sole utworzone z zasadami nieorganicznymi, amoniakiem, zasadami organicznymi, kwasami nieorganicznymi, kwasami organicznymi, zasadowymi aminokwasami, jonami chlorowców lub tym podobnymi oraz sole wewnętrzne. Przykładami zasad nieorganicznych są zasady metali alkalicznych (np. Na, K) i metali ziem alkalicznych (np. Ca, Mg). Przykładami zasad organicznych są trimetylamina, trietylamina, cholina, prokaina, etanolamina i tym podobne. Przykładami kwasów nieorganicznych są kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy i kwas fosforowy oraz tym podobne. Przykładami kwasów organicznych są kwas p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas mrówkowy, kwas triflu-orooctowy i kwas maleinowy i tym podobne. Przykładami zasadowych aminokwasów są lizyna, arginina, ornityna, histydyna i tym podobne. Związek może stanowić farmaceutycznie dopuszczalny hydrat.

[0014] Zgodnie z korzystną postacią wynalazku, kompozycja barwiąca może być stosowana jako chirurgiczny środek pomocniczy przy leczeniu operacyjnym w chirurgii oka związanej z takimi chorobami okulistycznymi, jak, na przykład, choroba ciała szklistego i siatkówki, taka jak otwór w plamce żółtej, odwarstwienie siatkówki spowodowane otworem w plamce żółtej w przebiegu wysokiej krótkowzroczności, błona przedsiatkówkowa, retinopatia cukrzycowa proliferacyjna, cukrzycowy obrzęk plamki żółtej oraz witreoreti-nopatia proliferacyjna, szczególne przypadki zaćmy, takie jak zaćma przejrzała oraz zaćma wrodzona oraz przeszczepienie rogówki o niepełnej grubości, itp. Dzięki zastosowaniu kompozycji barwiącej według wynalazku, możliwe staje się bardziej wyraźne uwidocznienie trudnych do zobaczenia błon ocznych oraz poprawa bezpieczeństwa w trakcie operacji okulistycznych.

[0015] W kolejnej korzystnej postaci wynalazku kompozycja barwiąca może być wykorzystywana do barwienia błony ocznej, w korzystniej, do barwienia błony granicznej wewnętrznej i/lub torebki przedniej.

[0016] W korzystnej postaci wynalazku, pożądane jest, aby kompozycja barwiąca według wynalazku zawierała BBG w stężeniu 0,1 - 10 mg/ml, korzystnie w stężeniu 0,1 - 1,0 mg/ml, a najkorzystniej w stężeniu 0,1 - 0,25 mg/ml. Ta postać dostarcza kompozycję o wysokim powinowactwie barwienia w niskim stężeniu i w małej ilości.

[0017] Ponadto, zgodnie z jedną postacią wynalazku, kompozycja barwiąca korzystnie ma ciśnienie osmotyczne rzędu 280 mOsm. Zgodnie z tą postacią, kompozycja barwiąca według wynalazku ma ciśnienie osmotyczne równe ciśnieniu osmotycznemu soli fizjologicznej. W ten sposób unika się wystąpienia problemów związanych z różnicami ciśnienia osmotycznego.

[0018] W korzystnej postaci wynalazku pożądane jest aby kompozycja barwiąca według wynalazku mała obojętne pH, co oznacza pH wynoszące orientacyjnie 7,4.

[0019] Zgodnie z drugim głównym aspektem wynalazku, dostarczana jest kompozycja do stosowania w metodzie barwienia i usuwania błony ocznej, obejmującej etapy wytwarza nia kompozycji barwiącej zawierającej BBG jako główny składnik; barwienia błony ocznej przy użyciu tej kompozycji barwiącej w określonym stężeniu i usuwania wybarwionej błony ocznej.

[0020] W korzystnej postaci wynalazku błoną oczną jest błona graniczna wewnętrzna i/lub torebka przednia, chociaż wynalazek niekoniecznie jest ograniczony do tych błon.

[0021] Zgodnie z trzecim głównym aspektem wynalazku, dostarczane jest zastosowanie BBG do wytwarzania kompozycji barwiącej do leczenia chorób oczu.

[0022] Poza tym, zgodnie z czwartym głównym aspektem wynalazku, dostarczane jest zastosowanie BBG jako chirurgicznego środka pomocniczego do operacji okulistycznych.

SKRÓCONY OPIS RYSUNKÓW

[0023] Fig. 1 przedstawia zdjęcie z mikroskopu świetlnego oczu szczura, do których do-szklistkowo wstrzyknięto BBG (10 mg/ml, 0,05 ml/oko), wykonane 14 dni po wstrzyknięciu (Oryginalne powiększenie: A: x 200, B: x 400).

[0024] Fig. 2 przedstawia zdjęcie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego oczu szczura, do których doszklistkowo wstrzyknięto BBG (10 mg/ml i 1 mg/ml, 0,05 ml/oko), wykonane 14 dni po wstrzyknięciu (Oryginalne powiększenie: x 2000).

[0025] Fig. 3 przedstawia zdjęcie pokazujące apoptotyczną śmierć komórek wykrytą techniką TUNEL (Oryginalne powiększenie: x 400).

[0026] Fig. 4 przedstawia wykresy, na których pokazano fale i maksymalną amplitudę ERG w oczach szczura.

[0027] Fig. 5 przedstawia zdjęcia, na których pokazano wybarwienie ILM przy użyciu BBG w oczach naczelnych.

[0028] Fig. 6 przedstawia zdjęcie, na którym pokazano usunięcie ILM w MH pod kontrolą BBG.

[0029] Fig. 7 przedstawia zdjęcie, na którym pokazano złuszczenie błony w ERM pod kontrolą BBG.

[0030] Fig. 8 przedstawia zdjęcie ILM z transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

[0031] Fig. 9 przedstawia reprezentatywne obrazy biomikroskopowe wybarwionej torebki przy użyciu BBG (oryginalne powiększenie x4).

[0032] Fig. 10 przedstawia skrawki rogówki wybarwione hematoksyliną i eozyną, po podaniu barwników do przedniej komory oka (oryginalne powiększenie x400).

[0033] Fig. 11 przedstawia zdjęcie pokazujące apoptotyczną śmierć komórek wykrytą techniką TUNEL.

[0034] Fig. 12 przedstawia zdjęcia, na których pokazano ultrastrukturę komórek rogówki oraz matrycy komórkowej kolagenu, z transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

[0035] Fig. 13 przedstawia zdjęcia, na których pokazano ultrastrukturę komórek śród-błonka rogówki, ze skaningowego mikroskopu elektronowego.

[0036] Fig. 14 przedstawia zdjęcia, na których pokazano CCC pod kontrolą BBG.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

[0037] Jak opisano powyżej, badanie koncentrowało się na dostarczeniu barwnika do wy-barwiania błony w oku, który stanowiłby alternatywę dla zwykle stosowanych barwników, takich jak ICG lub TB. I tak, jak opisano poniżej, wzięto pod uwagę szereg cech charakterystycznych i uzyskano kompozycję barwiącą wykazującą wysokie powinowactwo barwienia i wysoki poziom bezpieczeństwa.

[0038] Jeden aspekt wynalazku odnosi się do kompozycji barwiącej do barwienia błony ocznej przy usuwaniu błony ocznej, przy czym kompozycja barwiąca jako główny składnik zawiera błękit brylantynowy G (BBG), jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub hydrat.

[0039] Korzystną stereostrukturą BBG zgodnie z wynalazkiem jest optycznie czynna cząstka o konkretnej budowie, ale BBG zgodnie z wynalazkiem może występować w postaci enancjomerów lub mieszanin enancjomerów, takich jak mieszaniny racemiczne. Zatem BBG zgodnie z wynalazkiem obejmuje wszystkie optycznie aktywne cząstki, mieszaniny enancjomerów, takie jak mieszanina racemiczna i mieszaniny diastereomerów BBG.

[0040] Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych soli obejmują sole utworzone z zasadami nieorganicznymi, amoniakiem, zasadami organicznymi, kwasami nieorganicznymi, kwasami organicznymi, zasadowymi aminokwasami, jonami chlorowców lub tym podobnymi oraz wewnętrzne sole. Przykładami zasad nieorganicznych są zasady metali alkalicznych (np. Na, K) i metali ziem alkalicznych (np. Ca, Mg). Przykładami zasad organicznych są trimetyloamina, trietyloamina, cholina, prokaina, etanoloamina i tym podobne. Przykładami kwasów nieorganicznych są kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy i kwas fosforowy oraz tym podobne. Przykładami kwasów organicznych są kwas p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas mrówkowy, kwas trifluorooctowy i kwas maleinowy i tym podobne. Przykładami zasadowych aminokwasów są lizyna, arginina, omityna, histydyna i tym podobne. Związek może stanowić farmaceutycznie dopuszczalny hydrat.

[0041] BBG stosowany zgodnie z wynalazkiem, jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub hydrat, w szczególności BBG, można nabyć i wytwarzać z wykorzystaniem powszechnie dostępnej wiedzy w dziedzinie chemii organicznej. Dodatkowo, można je wytwarzać metodą ujawnioną w opisie patentowym US nr 6057160.

[0042] Jedna postać wynalazku zostanie opisana na podstawie przedstawionych poniżej praktycznych przykładów i rysunków.

[0043] Po pierwsze, badaniu przesiewowemu poddano wszystkie barwniki, w tym barwniki obecnie nie wykorzystywane w organizmach żywych. Badaniu przesiewowemu poddano następujące barwniki: błękit Evansa, błękit kwaśny 9, zieleń trwałą, błękit brylantowy FCF, indygokarminę, błękit metylowy, błękit metylenowy, błękit brylantowy G (BBG). Warunki badania przesiewowego dotyczyły w szczególności powinowactwa barwienia i bezpieczeństwa. Z listy potencjalnych kandydatów usunięto związki, które wykazywały korzystne bezpieczeństwo, ale nie wybarwiały docelowego przedmiotu oraz, odwrotnie, które wykazywały dobre barwienie, ale były szkodliwe dla siatkówki. Następnie, po zawężeniu puli potencjalnych barwników, przeprowadzano oceny ich bezpieczeństwa na szczurach. W oparciu o wyższe powinowactwo barwienia i lepsze bezpieczeństwo, ostatecznym potencjalnym barwnikiem został błękit brylantowy G (BBG). Poniżej szczegółowo opisano powody, dla których BBG został ostatecznym potencjalnym barwnikiem według niniejszego wynalazku.

[0044] Po pierwsze, jakość barwienia przy użyciu BBG była bardzo podobna do jakości barwienia przy użyciu ICG; dodatkowo związek ten był w stanie wybarwić docelowy obiekt w bardzo niskim stężeniu (1/10 - 1/20). Nawet po przebadaniu roztworów zawierających BBG w bardzo wysokim stężeniu, przekraczającym stężenie śródgałkowe, nie stwierdzono wyraźnych działań toksycznych w obrębie gałki ocznej. Dodatkowo, ponieważ BBG (w przeciwieństwie do ICG) nie jest barwnikiem fluorescencyjnym, można sądzić, że fototoksyczne działanie na siatkówkę, które, jak się uważa, występuje wskutek oświetlenia wnętrza gałki ocznej wtórnie do wysokiego natężenia światła, w przypadku BBG niemalże w ogóle nie występuje. Poza tym utrzymywanie się BBG na powierzchni tkanek po ich oczyszczeniu, było bardzo niewielkie, w porównaniu z ICG. Wreszcie, ponieważ BBG jest barwnikiem typu koloru zimnego, natomiast tkanki śródgałkowe są koloru ciepłego, zwiększa to kontrastowość barwnika.

[0045] Następnie przeprowadzono różne eksperymenty dla oceny optymalnych warunków barwienia błony ocznej przez kompozycję barwiącą zawierającą BBG. Poza tym, dotychczas nie stosowano w klinice BBG, w szczególności nie był on stosowany u ludzi. Natomiast, dzięki takim optymalnym warunkom wynalazku, można dostarczyć do stosowania klinicznego kompozycję, która jest bezpieczna oraz ma wysokie powinowactwo barwienia.

[0046] Zatem, zgodnie z pierwszym głównym aspektem wynalazku, dostarczana jest kompozycja barwiąca, zawierająca jako główny składnik BBG, do barwienia błony ocznej w momencie usuwania błony ocznej.

[0047] Zgodnie z korzystną postacią wynalazku, taka kompozycja barwiąca może być stosowana jako chirurgiczny środek pomocniczy w operacjach okulistycznych takich chorób oczu, jak na przykład choroba ciała szklistego i siatkówki, taka jak otwór w plamce żółtej, odwarstwienie siatkówki spowodowane otworem w plamce żółtej w przebiegu wysokiej krótkowzroczności, błona przedsiatkówkowa, retinopatia cukrzycowa proliferacyjna, cukrzycowy obrzęk plamki żółtej oraz witreoretinopatia proliferacyjna, szczególne przypadki zaćmy, takie jak zaćma przejrzała oraz zaćma wrodzona oraz przeszczepienie rogówki o niepełnej grubości, itp. Dzięki stosowaniu kompozycji barwiącej według wynalazku możliwe staje się bardziej wyraźne uwidocznienie trudnych do zobaczenia błon ocznych oraz poprawa bezpieczeństwa w trakcie operacji chirurgicznych.

[0048] W kolejnej korzystnej postaci wynalazku kompozycja barwiąca może być stosowana do barwienia błony ocznej, a korzystniej do barwienia błony granicznej wewnętrznej i/lub przedniej części torebki soczewki.

[0049] Następnie, zgodnie z jedną postacią wynalazku, kompozycję barwiącą według wynalazku można połączyć z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Można ją wytwarzać w postaci zestawu zawierającego roztwór rozpuszczający i lek w proszku lub roztworu znajdującego się w fabrycznie napełnionej strzykawce oraz, w przypadku połączenia z kwasem hialuronowym, w postaci żelopodobnego roztworu. Najkorzystniej, ale niekoniecznie, kompozycję wytwarza się w postaci roztworu.

[0050] W jednej postaci wynalazku taką kompozycję barwiącą wytwarza się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnego roztworu, aczkolwiek niekoniecznie. Jest to związane z właściwościami BBG, który może być bezpośrednio i z łatwością rozpuszczany w śródgał-kowym roztworze oczyszczającym i może być sterylizowany za pomocą filtra strzykawko wego.

[0051] Ponadto, zgodnie z jedną postacią wynalazku, tę kompozycję barwiącą wytwarza się w postaci roztworu, przy czym jest on rozpuszczany w roztworze do płukania śródgał-kowego, buforowanym roztworze soli fizjologicznej (BSS), roztworze soli fizjologicznej, lub najkorzystniej OPEGUARD-MA (Senjyu Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japonia), który jest śródgałkowym roztworem płuczącym (śródgałkowym roztworem oczyszczającym). Jednakże, niekoniecznie musi być tak.

[0052] W jednej korzystnej postaci wynalazku kompozycja barwiąca zawiera BBG w stężeniu 0,1 - 10 mg/ml, korzystnie w stężeniu 0,1 - 1,0 mg/ml, a najkorzystniej w stężeniu 0,1 - 0,25 mg/ml. W jednym praktycznym przykładzie realizacji wynalazku, stężenie BBG w tej kompozycji, niezbędne do barwienia ILM naczelnych, wynosi około 1/10 stężenia ICG. Dodatkowo, w celu barwienia torebki przedniej, BBG obecny w tej kompozycji barwiącej może zapewnić zadowalające barwienie w stężeniu nawet 0,25 mg/ml, w porównaniu z wymaganym stężeniem ICG 5 mg/ml i TB 1 mg/ml. Innymi słowy, zgodnie z tą postacią, można dostarczyć kompozycję, która wykazuje wysokie powinowactwo barwienia w niskich stężeniach i w małych ilościach.

[0053] Ponadto, zgodnie z jedną postacią wynalazku, korzystnie kompozycja barwiąca ma ciśnienie osmotyczne rzędu 298 mOsm. Zgodnie z tą postacią, kompozycja barwiąca według wynalazku ma ciśnienie osmotyczne równe ciśnieniu osmotycznemu roztworu soli fizjologicznej. Poprzednio stwierdzono, że ubytki w nabłonku barwnikowym siatkówki występujące po zastosowaniu ICG mogą wynikać z hipoosmolalności roztworu ICG. W związku z tym, kompozycja barwiąca według jednej postaci wynalazku wykazuje lepsze działanie, gdyż nie powoduje powstawania ubytków w nabłonku barwnikowym siatkówki, wywoływanych przez różnice w ciśnieniu osmotycznym, będących konsekwencją zaburzeń tkankowych związanych ze wzrostem rozmiarów komórek lub ich odwodnieniem (takich jak ubytek lub śmierć komórek).

[0054] W jednej korzystnej postaci wynalazku, pożądanym jest, aby kompozycja barwiąca według wynalazku miała obojętne pH, to oznacza pH rzędu 7,4.

[0055] Zgodnie z drugim głównym aspektem wynalazku, dostarczana jest kompozycja do stosowania w metodzie barwienia i usuwania błony ocznej, obejmującej etapy wytwarzania kompozycji barwiącej zawierającej BBG jako główny składnik; barwienia błony ocznej przy użyciu tej kompozycji barwiącej w określonym stężeniu i usuwania wybarwionej błony ocznej.

[0056] W jednej postaci wynalazku, w tym zastosowaniu do barwienia błony ocznej można wykorzystać metodę, którą z łatwością zrozumie fachowiec w danej dziedzinie, na przykład, wstrzyknięcie, infuzję, płukanie, potwierdzenie i złuszczenie. W jednym praktycznym przykładzie wynalazku, korzystnie to zastosowanie do barwienia błony ocznej obejmuje wstrzyknięcie tej kompozycji barwiącej. W tym praktycznym przykładzie nie jest konieczne zastosowanie dodatkowego etapu, takiego jak wymiana płyn-gaz, który jest konieczny przy stosowaniu TB na błonę oczną. Jako przykład, istnieje możliwość po prostu wybarwienia błony w momencie zastosowania substancji w trakcie operacji okulistycznej.

[0057] Zgodnie z trzecim głównym aspektem wynalazku, dostarczane jest zastosowanie BBG do wytwarzania kompozycji barwiącej do leczenia chorób oczu.

[0058] Dodatkowo, zgodnie z czwartym głównym aspektem wynalazku, dostarczane jest zastosowanie BBG jako chirurgicznego środka pomocniczego przy operacji okulistycznej.

[0059] Ponadto, w jednej postaci wynalazku, taka kompozycja barwiąca i/lub jej zastosowanie w metodzie barwienia, mogą być odpowiednio stosowane jako część operacji okulistycznych. Zgodnie z korzystną postacią wynalazku, te operacje okulistyczne są operacjami wykonywanymi w leczeniu otworu w plamce żółtej, odwarstwienia siatkówki spowodowanego przez otwór w plamce żółtej w przebiegu wysokiej krótkowzroczności, błony przedsiatkówkowej, retinopatii cukrzycowej proliferacyjnej, cukrzycowego obrzęku plamki żółtej oraz witreoretinopatii proliferacyjnej, szczególnych przypadków zaćmy, takie jak zaćma przejrzała oraz zaćma wrodzona oraz przy przeszczepieniu rogówki o niepełnej grubości, i tym podobnych, a najkorzystniej chorób ciała szklistego i siatkówki (w szczególności otworu w plamce żółtej lub błon przedsiatkówkowych (ERMS)) i zaćmy.

[0060] Dodatkowo, w jednej korzystnej postaci wynalazku, te operacje okulistyczne są wykonywane na oczach ssaków, a korzystniej na oczach ludzi.

[0061] Następujące przykłady przedstawiono w celu bardziej szczegółowego opisania wynalazku.

Przykład 1

Badanie przesiewowe różnych barwników jako potencjalnych barwników do stosowania zgodnie z wynalazkiem, pod katem ich bezpieczeństwa i zdolności wybarwiania błon [0062] Aby dostarczyć kompozycję barwiącą dla osiągnięcia takich celów, badaniu przesiewowemu poddano wszystkie barwniki, w tym barwniki obecnie nie wykorzystywane w organizmach żywych. Badaniu przesiewowemu poddano następujące barwniki: błękit Evansa, błękit kwaśny 9, zieleń trwałą, błękit brylantowy FCF, indygokarminę, błękit metylowy, błękit metylenowy, błękit brylantowy G (BBG). Dodatkowo, warunki badania przesiewowego dotyczyły w szczególności bezpieczeństwa i powinowactwa barwienia.

[0063] Z listy potencjalnych kandydatów usunięto związki, które były lepsze pod względem bezpieczeństwa, ale nie wybarwiały docelowego obiektu oraz, odwrotnie, które zapewniały dobre wybarwienie, ale były szkodliwe dla siatkówki.

[0064] Następnie, po zawężeniu puli potencjalnych barwników, dokonano oceny bezpieczeństwa na szczurach. W oparciu o wyższe powinowactwo barwienia i lepsze bezpieczeństwo, ostatecznym potencjalnym barwnikiem został BBG.

[0065] Następnie przeprowadzono różne eksperymenty dla oceny optymalnych warunków wybarwiania błony ocznej przez kompozycję barwiącą zawierającą BBG. W ten sposób otrzymano kompozycję barwiącą według wynalazku.

Przykład 2 2. Wpływ doszklistkowego podania BBG na siatkówkę [0066] Wszystkie procedury były zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań Naukowych nad Wzrokiem i w Okulistyce (Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO) „Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research” oraz wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie Kyushu, Fukuoka, Japonia.

2.1 Charakterystyka roztworu BBG

[0067] BBG występuje także pod nazwą błękit kwaśny 90 i Coomassie błękit brylantowy G. Poza naszymi wcześniejszymi publikacjami, brak jest opisów badań, w których oceniano by toksyczność BBG stosowanego w obrębie gałki ocznej. W Tabeli 1 podano osmolal-ność i pH roztworu BBG w różnych stężeniach. Stwierdzono, że osmolalność i pH BBG są zbliżone do osmolalności i pH śródgałkowych roztworów płuczących. _Tabela. 1__

2.2. Procedura operacyjna doszklistkowego podania BBG do oka szczura [0068] Szczury Brown Norway (n = 78 samców, w wieku 8 tygodni, Kyudo, Fukuoka, Japonia) znieczulano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie chlorowodorku ketaminy w dawce 75 mg/kg masy ciała. W jednym oku u każdego zwierzęcia (w sumie n = 6 na grupę dawki) wykonywano witrektomię przy użyciu 0,05 ml czystego gazu SFć, jak opisano poprzednio. Po wstrzyknięciu gazu do jamy szklistej każdego oka po witrektomii wstrzykiwano 0,05 ml roztworu BBG, za pomocą mikroskopu w celu poprawy powiększenia. Roztwór BBG (błękit brylantowy G, Coomassie (zarejestrowany znak towarowy) błękit brylantowy G 250; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) przygotowano w stężeniu 0,01, 0,1, 1,0 i 10 mg/ml, z zastosowaniem rozcieńczania w śródgałkowym roztworze płuczącym (OPE- GUARD(zarejestrowany znak towarowy)-MA, Senjyu Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japonia) i sterylizowano za pomocą 0,22 pm filtra strzykawkowego. Średnią osmolalność określano za pomocą osmometru (OSMO STATION, Arkray, Kyoto, Japonia), a pH każdego roztworu określano dla wszystkich przygotowanych stężeń (Tabela 1). Ostateczne stężenie określano w stosunku do roztworu ICG stosowanego w witrektomii u ludzi (2,5 -5,0 mg/ml), aby podać szczurom bezpieczną dawkę BBG, która może także doprowadzić do uzyskania dobrego wybarwienia. Jako kontrole wykorzystano dwadzieścia cztery pozornie leczone oczy (do których wstrzyknięto SFć, a następnie 0,05 ml śródgałkowego roztworu płuczącego). 2.3. Mikroskopia świetlna [0069] W dniu 14 (n = 30; 6 na grupę dawki i grupę kontrolną) oraz 2 miesiące (n = 30; 6 na grupę dawki i grupę kontrolną) po operacji gałki oczne wyłuszczano i utrwalano w 10% paraformaldehydzie. Całe gałki oczne przecinano orientacyjnie wzdłuż pionowego południka. Zatopione w parafinie skrawki barwiono hematoksyliną-eozyną (HE) i każdy skrawek badano metodą mikroskopii świetlnej.

[0070] W okresie 2 miesięcy po doszklistkowym wstrzyknięciu BBG, z zastosowaniem mikroskopii operacyjnej nie obserwowano toksycznych efektów BBG, takich jak obrzęk rogówki, ciężki obrzęk siatkówki ani zapalenie wnętrza gałki ocznej. Gałki oczne wyłuszczano w dniu 14 i 2 miesiące po operacji. W oczach, do których wstrzyknięto najwyższe dawki BBG (10 mg/ml), prawidłowa struktura siatkówki była zachowana zarówno w dniu 14, jak i po 2 miesiącach. Dodatkowo nie obserwowano nacieku komórek zapalnych (Fig. 1, dzień 14). Prawidłowa struktura siatkówki była także zachowana w grupach, w których podawano niższe dawki BBG: w skrawkach tkanek pobranych w dniu 14 i po 2 miesiącach nie stwierdzono cech zwyrodnienia komórek. 2.4. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) [0071] Gałki oczne wyłuszczano w dniu 14 i 2 miesiące po operacji i utrwalano w 1% aldehydzie glutarowym i 1% paraformaldehydzie w PBS. Następnie próbki ponownie utrwalano w buforze weronal - octan tetratlenku osmu (2%), odwadniano w etanolu i wodzie oraz zatapiano w Epon. Z bloczków wycinano ul traci enkie skrawki i mocowano na miedzianych siatkach. Próbki oglądano za pomocą mikroskopu elektronowego JEM 100CX (JEOL, Tokio).

[0072] W niektórych próbkach pochodzących z oczu, do których wstrzyknięto BBG w najwyższej dawce (10 mg/ml) obserwowano wakuolizację komórek zwojowych oraz wy pustek komórek Miillera włókien nerwowych, zarówno w dniu 14 (Fig. 2A, dzień 14), jak i po 2 miesiącach. Chociaż takie same zmiany stwierdzono także w grupie, w której wstrzykiwano 1 mg/ml BBG, stopień wakuolizacji był mniejszy niż w grupie 10 mg/ml (Fig. 2B). Wakuolizacji nie obserwowano w grupach otrzymujących najniższe dawki BBG ani w grupach kontrolnych. W żadnej z grup w siatkówce, w tym w wewnętrznej warstwie jądrowej, zewnętrznej warstwie jądrowej oraz warstwie barwnikowej komórek nabłonka siatkówki, nie obserwowano znaczących zmian. 2.5. Znakowanie końców dUTP za pomocą TdT (TUNEL) [0073] Apoptotyczną śmierć komórek wykrywano z zastosowaniem metody TUNEL (znakowanie końców dUTP za pomocą TdT), jak opisano poprzednio. Dla uzyskania skrawków o grubości 4-μιτι z próbek utrwalonych w 4% paraformaldehydzie i zatopionych w parafinie posłużono się kriostatem. Barwienie TUNEL wykonywano przy użyciu zestawu fluoresceinowego do bezpośredniego wykrywania apoptozy in situ ApopTag® (Intergen Company, New York, USA), zgodnie z protokołem producenta. Preparaty współbarwiono jodkiem propidium (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), co pozwoliło na uwidocznienie jąder komórkowych w mikroskopie fluorescencyjnym (Olympus, Tokio). Wybierano losowo dziesięć skrawków z próbki każdego oka i badano je pod mikroskopem.

[0074] W grupie, w której podawano najwyższe dawki BBG (10 mg/ml) odnotowano jeden przypadek apoptotycznej śmierci komórki wśród dziesięciu skrawków. Natomiast odsetek komórek apoptotycznych nie różnił się istotnie od odsetka obserwowanego w preparatach kontrolnych (Fig. 3, dzień 14). W grupach, w których wstrzykiwano niższe dawki BBG, barwienia TUNEL nie obserwowano w siatkówce tylko w dniu 14. Dodatkowo, nie stwierdzono śmierci apoptotycznej komórek siatkówki w żadnej z grup BBG po 2 miesiącach. 2.6. Elektroretinografia [0075] Po wstrzyknięciu gazu, do jamy szklistej wstrzykiwano 0,05 ml roztworu BBG (1 mg/ml i 10 mg/ml) lub śródgałkowy roztwór płuczący. W każdej grupie dawki znajdowało się sześć szczurów i w grupie kontrolnej także sześć szczurów. U wszystkich szczurów przed wykonaniem pomiarów potwierdzono brak zaćmy. W punkcie czasowym czternastu dni i ponownie dwóch miesięcy, szczury przez jedną noc przetrzymywano w ciemnym pomieszczeniu, w którym występowało jedynie czerwone światło o niewielkim natężeniu; następnie szczury znieczulano wstrzykując dootrzewnowo 15 μΐ/g masy ciała roztworu soli fizjologicznej zawierającego ketaminę (1 mg/ml), ksylazynę (0,4 mg/ml) i uretan (40 mg/ml). Następnie wykonywano elektroretinografię tak jak opisano poprzednio. Źrenice rozszerzano 2,5% chlorowodorkiem fenylefryny i 1% tropikamidem w kroplach i przed rejestracją ERG potwierdzano maksymalne rozszerzenie źrenic. Rogówkę znieczulano 1% chlorowodorkiem paraprokainy w kroplach, a następnie szczury umieszczano na podgrzewającej podkładce na pozostałą część eksperymentu. Na rogówce umieszczano drucianą elektrodę pokrytą 1% metylocelulozą, dla rejestracji ERG. Podobna elektroda umieszczona w jamie ustnej pełniła rolę elektrody odniesienia, natomiast igła - elektroda umieszczona w ogonie pełniła rolę uziemienia. Odpowiedzi wzmacniano różnicowo (0,8 do 1200 Hz), uśredniano i przechowywano na komputerze. Białe (ksenonowe) rozbłyski wyświetlano na stymulatorze Ganzfeld (VPA-10; Cadwell, Kennewick, Washington, USA) na achroma-tycznym, adaptującym tle. Na początku rejestrowano ERG po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności (pręcikowe) w celu sprawdzenia stabilności odpowiedzi przy obu natężeniach. Następnie każdego szczura przez 20 minut adaptowano do oświetlenia tła; był to okres wystarczający do uzyskania stabilnego poziomu odpowiedzi. Następnie wywoływano ERG po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności a (pręcikowe) i po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności b (z komórek dwubiegunowych i komórek Mullera), przy luminancji błysku 1,30 log cd sek/m2. W celu określenia odpowiedzi po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności uśredniano odpowiedzi na pięć kolejnych błysków przy odstępie między bodźcami 1 min. Następnie szczury umieszczano w polu białego adaptującego światła (1,50 log cd/m ) na co najmniej 25 minut i wywoływano fale ERG b po zaadaptowaniu siatkówki do jasności (czopkowe), przy luminancji rozbłysku 1,30 log cd sek/m2 (warunki desensytyzacji pręcików u szczurów). Uśredniano odpowiedzi na 50 kolejnych rozbłysków wyświetlanych z częstotliwością 2 Hz. Uzyskane wyniki amplitudy ERG oceniano z pomocą testu t-Studenta i za statystycznie istotną uznawano wartość p < 0,05.

[0076] Na Figurze 4A przedstawiono zapisy ERG po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności i jasności, uzyskane w dniu 14 w grupie kontrolnej i grupach wysokich dawek. Amplitudy odpowiedzi po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności, uzyskanych na początku eksperymentów, wykazują małą zmienność między badanymi grupami. Chociaż w dniu 14 obserwowano niewielki, zależny od dawki spadek średniej maksymalnej amplitudy po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności fal a (Fig. 4B, dzień 14) w grupach wysokiej dawki, nie stwierdzono istotnej różnicy pod względem maksymalnej amplitudy fal, w porównaniu z kontrolami (10 mg/ml: p = 0,054 i 1,0 mg/ml: p = 0,063; test t-Studenta). Dodatkowo nie stwierdzono wyraźnej redukcji fal b ERG po zaadaptowaniu siatkówki (10 mg/ml: p = 0,553 i 1,0 mg/ml: p = 0,508; test t-Studenta) fal b ERG po zaadaptowaniu siatkówki do jasności (10 mg/ml: p = 0,451 i 1,0 mg/ml: p = 0,550; test t-Studenta): nie stwierdzono sta- ty stycznie istotnych różnic między amplitudami fal (Fig. 4B, dzień 14). Po 2 miesiącach zarejestrowano ERG w tych samych grupach dawek (1,0 mg/ml i 10 mg/ml) i stwierdzono zmniejszenie redukcji fal a po zaadaptowaniu siatkówki do ciemności, podobną do obserwowanej w grupie kontrolnej. 2.7. Wvbarwianie ILM przy użyciu BBG w oczach naczelnych [0077] Ponieważ wykonanie usunięcia ILM w oku szczura jest niemożliwe, badacze oceniali zdolność BBG do wybarwiania ILM w oku naczelnych. W tym badaniu wykorzystywano oczy dwóch małp cynomolgus w wieku 3 lat. Zwierzęta unieruchamiano w kwadratowej klatce i w udo wstrzykiwano im domięśniowo 20 mg/kg chlorowodorku ketaminy (Sankyo Yell Pharmaceutical Products Co. Ltd., Japonia) w celu indukcji znieczulenia ogólnego. Następnie małpy transportowano na salę operacyjną. Operacja składała się ze standardowej witrektomii przez część płaską ciała rzęskowego, z zastosowaniem trzech sklerotomii, z indukcją tylnego odwarstwienia ciała szklistego drogą ssania, przy użyciu przecinaka do witrektomii i wstrzyknięciem acetonidu triamcynolonu w celu uwidocznienia ciała szklistego.

[0078] Dziesięć miligramów BBG rozpuszczano w 20 ml śródgałkowego roztworu płuczącego i sterylizowano za pomocą filtra strzykawkowego. Końcowe stężenie BBG wynosiło 0,5 mg/ml. Następnie delikatnie wstrzykiwano otrzymany roztwór BBG (0,5 ml) do jamy szklistej, a następnie wypłukiwano przy użyciu buforowanego roztworu soli fizjologicznej (BSS plus(zarejestrowany znak towarowy), Santen, Osaka, Japonia). ILM usuwano za pomocą kleszczyków do ILM. Następnie wyjmowano instrumenty, a otwory skleroto-mijne zamykano za pomocą szwów 7-0 z poligalatynu. W dniu 1, 3 i 14 po operacji wykonywano badanie w mikroskopowej lampie szczelinowej oraz badanie oftalmoskopem. W dniu 14 wykonywano angiografię z fluoresceiną.

[0079] Po wypłukaniu jamy szklistej, ILM wybarwiano na kolor jasnoniebieski. Krawędź i płat ILM były wyraźnie widoczne w trakcie usuwania ILM (Lig. 5A). Po usunięciu ILM, okrężny obszar po usunięciu ILM był wyraźnie widoczny (Fig. 5B).

[0080] W badaniu w mikroskopowej lampie szczelinowej i za pomocą oftalmoskopu wykonanych w dniu 14 po operacji nie obserwowano toksycznych efektów BBG, takich jak obrzęk rogówki, ciężki obrzęk siatkówki czy zapalenie wnętrza gałki ocznej. W angiografii fluoresceinowej wykonanej w dniu 14 także nie stwierdzono wyraźnego uszkodzenia siatkówki przez BBG (Fig. 5C). Dalsze badania oftalmoskopowe przeprowadzone w okresie sześciomiesięcznej kontroli nie wykazały dodatkowych zmian w siatkówce.

Przykład 3 3. Seria interwencyjnych przypadków klinicznych, w których oceniano BBG jako potencjalny roztwór barwiący w złuszczaniu błony [0081] Barwienie przy użyciu zieleni indocyjaninowej (ICG) i błękitu trypanu (TB) istotnie ułatwiło usunięcie ILM w różnych chorobach ciała szklistego i siatkówki. Natomiast ostatnio pojawiły się liczne opisy dotyczące uszkodzenia siatkówki spowodowanego zastosowaniem ICG i TB, zarówno w warunkach eksperymentalnych, jak i klinicznych [0082] Na podstawie wyników badania przedklinicznego wybrano BBG jako potencjalny barwnik do wybarwiania ILM. Jest to najwyraźniej pierwsze badanie kliniczne BBG w ludzkim oku. Jest to pierwsze znane badanie kliniczne BBG w ludzkich oczach. 3.1. Zastosowanie BBG do wybarwiania ILM oraz działanie i bezpieczeństwo BBG w ludzkim oku (pierwsza próba) [0083] W okresie między sierpniem a wrześniem 2004 roku, w poradni ambulatoryjnej Szpitala Uniwersyteckiego Kyushu (Fukuoka, Japonia) do badania włączono szesnaście oczu 16 pacjentów z otworem w plamce żółtej (MH) i błonami przedsiatkówkowymi (ERMS). Z udziału w badaniu wykluczano pacjentów z chorobami oczu takimi jak jaskra, zapalenie błony naczyniowej i schorzeniami rogówki. W Tabeli 1 przedstawiono charakterystykę pacjentów. To badanie przeprowadzono po uzyskaniu odpowiedniej zgony Komisji Etycznej instytucji, zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1989 roku. Przed operacją pacjentom wyjaśniono możliwe korzyści i zagrożenia związane z tym postępowaniem i od każdego pacjenta uzyskano świadomą zgodę. Operacja polegała na witrek-tomii przez część płaską ciała rzęskowego, z zastosowaniem trzech sklerotomii, z indukcją tylnego odwarstwienia ciała szklistego drogą ssania, przy użyciu przecinaka do witrektomii i wstrzyknięciem acetonidu triamcynolonu. Dwadzieścia miligram BBG (błękit brylantowy G 250; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) rozpuszczono w 10 ml śródgałkowego roztworu płuczącego (OPEGUARD(zarejestrowany znak towarowy)-MA, Senjyu Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japonia) i sterylizowano za pomocą filtra strzykawkowego (Mini-sart(zarejestrowany znak towarowy) Sartorius AG, Goettingen, Niemcy). Końcowe stężenie BBG wynosiło 0,25 mg/ml. Następnie 0,5 ml uzyskanego roztworu BBG (289 mOsm, pH = 7,44) delikatnie wstrzykiwano do jamy szklistej i natychmiast wypłukiwano buforowanym roztworem soli fizjologicznej (BSS plus(zarejestrowany znak towarowy), Santen, Osaka, Japonia). ILM ulegała wybarwieniu na kolor jasnoniebieski. ILM usuwano za pomocą kleszczyków do ILM (D.O.R.C.; Dutch Ophthalmic Research Center International b.v., Holandia). Natomiast w tym stężeniu BBG nie potwierdzono wybarwienia ERMS.

[0084] Po operacji przeprowadzano następujące badania: badanie w mikroskopowej lampie szczelinowej, oftalmoskopię, ocenę najlepszej skorygowanej ostrości wzroku (BCVA) i ciśnienie śródgałkowe. Po 2 miesiącach pole widzenia oceniano przy użyciu Humphrey Field Analyzer II (Humphrey Systems, Dublin, California, USA) [0085] Procedurę operacyjną zakończono skutecznie, Ostrość wzroku powróciła we wszystkich przypadkach. U żadnego z pacjentów nie stwierdzono wzrostu ciśnienia śród-gałkowego. Nie obserwowano wyraźnego zmniejszenia nasilenia ani ubytków w polu widzenia. W okresie obserwacji nie stwierdzono żadnych innych działań niepożądanych BBG (Tabela 2).

Tabela 2

3.2. Zastosowanie BBG do wybarwiania ILM oraz działanie i bezpieczeństwo BBG w ludzkim oku (druga próba) [0086] Badacze kontynuowali badania przypadków klinicznych i uzyskali następujące wyniki.

[0087] W okresie między sierpniem a listopadem 2004 roku wykonano witrektomię z usunięciem błon przy użyciu roztworu barwiącego BBG w dwudziestu oczach u kolejnych 20 pacjentów z otworem z plamce żółtej (MH: dziesięć oczu u 10 pacjentów; 5 mężczyzn i 5 kobiet) lub z błoną przedsiatkówkową (ERM: dziesięć oczu u 10 pacjentów, 5 mężczyzn i 5 kobiet). Z udziału w badaniu wykluczano pacjentów z chorobami oczu, takimi jak jaskra, retinopatia cukrzycowa, zapalenie błony naczyniowej oraz schorzeniami rogówki. Średni wiek odchylenie standardowe pacjentów wynosił 67 ± 11,9 lat, przy zakresie 33 do 85 lat. Średnia długość okresu obserwacji wynosiła 7,3 ± 1,0 miesięcy. W Tabeli 3 i 4 przedstawiono charakterystykę pacjentów. Przed i po operacji wykonywano następujące badania okulistyczne: badanie w mikroskopowej lampie szczelinowej, oftalmoskopię, ocenę najlepszej skorygowanej ostrości wzroku (BCVA) oraz ciśnienie śródgałkowe (IOP). Zamknięcie MH i pomiar grubości dołka środkowego (przypadku ERM) wykonywano metodą optycznej tomografii koherentnej (OCT3: Humphrey Instruments, San Leandro, CA, USA). Średnią grubość dołka środkowego obliczano na podstawie 4 zdjęć.

[0088] Wycięte próbki z 4 oczu (2 oczy od pacjentów z MH i 2 oczy od pacjentów z ERM) zbadano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym w celu oceny występowania ILM. Następnie próbki ponownie utrwalano w buforze weronal - octan czterotlenku osmu (2%), odwadniano w etanolu i wodzie oraz zatapiano w Epon. Z bloczków wycinano ultracienkie skrawki i mocowano na miedzianych siatkach. Próbki oglądano za pomocą mikroskopu elektronowego JEM 100CX (JEOL, Tokio).

[0089] Niniejsze badanie przeprowadzono po uzyskaniu zgody Komisji Nadzoru Instytucji, zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1989 roku. Przed operacją pacjentom wyjaśniono możliwe korzyści i zagrożenia związane z tym postępowaniem i od każdego pacjenta uzyskano świadomą zgodę.

[0090] W razie konieczności wykonywano standardową fakoemulsyfikację. Operacja polegała na witrektomii przez część płaską ciała rzęskowego, z zastosowaniem trzech sklero-tomii, z indukcją tylnego odwarstwienia ciała szklistego (PVD) drogą ssania, przy użyciu przecinaka do witrektomii i wstrzyknięciem acetonidu triamcynolonu (Kenakolt-A® Bristol Pharmaceuticals KK, Tokyo, Japonia), w razie potrzeby. BBG (błękit brylantowy G 250; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) rozpuszczono w śródgałkowym roztworze płuczą cym (OPEGUARDO-MA, Senjyu Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japonia). Następnie roztwór sterylizowano za pomocą 0,22 pm filtra strzykawkowego. Końcowe stężenie BBG wynosiło 0,25 mg/ml (289 mOsm, pH = 7,44). Następnie uzyskany roztwór BBG (0,5 ml) delikatnie wstrzykiwano do jamy szklistej (Fig. 6A) i natychmiast wypłukiwano buforowanym roztworem soli fizjologicznej (BSS plus(rejestrowany znak towarowy), Santen, Osaka, Japonia). W przypadkach MH, ILM wybarwiano na kolor jasnoniebieski. ILM usuwano za pomocą kleszczyków do ILM (Fig. 6B, C). Po usunięciu ILM, różnica w kolorze powierzchni siatkówki między powierzchnią, z której usunięto ILM oraz powierzchnią otaczającą, była wyraźnie widoczna (Fig. 6D). Natomiast nie potwierdzono wybarwie-nia ERM w tym stężeniu BBG w przypadkach ERM (Fig. 7A). Po złuszczeniu ERM (Fig. 7B) ponownie wstrzykiwano roztwór BBG, a następnie płukano jamę szklistą. ILM na obszarze, z którego usunięto ERM, była dobrze wybarwiona BBG (Fig. 7C). Natomiast nie wybarwił się obszar, na którym pozostała resztka ERM i tylna część ciała szklistego. Dobrze wybarwioną ILM można było z łatwością usunąć wraz z nie wybarwioną ERM i tylną częścią ciała szklistego (Fig. 7D).

[0091] Na koniec, we wszystkich przypadkach wszczepiano soczewki śródgałkowe. W przypadkach MH wykonywano wymianę ciecz-gaz, zastępując ciecz gazem 15% sześcio-fluorkiem siarki. Pacjentom zalecano zachowanie pozycji z twarzą zwróconą ku dołowi przez jeden tydzień.

[0092] ILM wraz z ERM skutecznie usunięto z 20 oczu podczas operacji. Badanie w transmisyjnym mikroskopie elektronowym potwierdziło obecność ILM we wszystkich badanych próbkach (n = 4) (Fig. 8). Do 14 dnia po operacji w badaniu w mikroskopowej lampie szczelinowej i oftalmoskopowym, nie obserwowano ostrych toksycznych efektów BBG, takich jak obrzęk rogówki, ciężki obrzęk siatkówki ani zapalenie wnętrza gałki ocznej.

[0093] We wszystkich przypadkach MH uzyskano całkowite zamknięcie anatomiczne MH zarówno w badaniu oftalmoskopowym, jak i w OCT. Mediana przedoperacyjnej BCVA wynosiła 20/100 (zakres: 20/200-20/50). Mediana pooperacyjnej BCVA wynosiła 20/32 (zakres: 20/200-20/20). Ostrość wzroku uległa poprawie w 9 oczach (90%) o co najmniej 2 wiersze na tablicy Snellena, natomiast nie uległa zmianie w jednym oku. W dwóch przypadkach wystąpiły powikłania polegające na jatrogennym obwodowym przerwaniu ciągłości siatkówki, które skorygowano śródoperacyjnie za pomocą fotokoagulacji laserowej. Tylko w jednym przypadku MH 6 miesięcy po operacji stwierdzono wzrost IOP (26 mmHg); w tym przypadku zastosowano leczenie latanoprostem (Tabela 3).

[0094] W przypadku operacji ERM, średnia grubość dołka środkowego siatkówki zmierzona metodą OCT spadła z 454,7 ± 141,3 pm (przed operacją) do 249,4 ± 71,3 pm (po operacji). W przypadkach ERM, pooperacyjna BCVA (20/100-20/12,5; mediana: 20/32) była lepsza od przedoperacyjnej BCVA (20/100-20/40; mediana: 20/50) (Tabela 4). U ośmiorga pacjentów (80%) odnotowano poprawę BCVA o co najmniej 2 wiersze na tablicy Snellena, podczas gdy u pozostałych dwojga pacjentów BCVA nie zmieniła się lub uległa poprawie o 1 wiersz. Jedynym powikłaniem było przedłużenie krwawienia do ciała szklistego w jednym przypadku, które uległo wchłonięciu w trakcie obserwacji. W żadnym z przypadku w trakcie dalszej obserwacji nie stwierdzono żadnych innych działań niepożądanych, takich jak zanik nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE).

Tabela 3

Tabela 4

Przykład 4 4. Zgodność biologiczna BBG: Badanie przedkliniczne BBG stosowanego jako środek pomocniczy do wybarwiania torebki soczewki 4.1. Zdolność BBG do wybarwiania torebki soczewki [0095] Zdolność BBG do wybarwiania torebki soczewki oceniano w oczach świń przy użyciu barwnika w rosnących stężeniach.

[0096] Oczy świń otrzymywano z lokalnej rzeźni i transportowano do laboratorium na lodzie. Skrupulatnie obcinano mięśni gałki ocznej i zewnątrzgałkową tkankę łączną i oczy umieszczano w komorze operacyjnej. Roztwór BBG otrzymywano z zastosowaniem następującej metody. Dwadzieścia miligramów BBG (Coomassie, błękit brylantowy G 250; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) rozpuszczano w śródgałkowym roztworze płuczącym (OPEGUARD®-MA, Senjyu Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japonia) i sterylizowano za pomocą filtra strzykawkowego (Minisart® Sartorius AG, Goettingen, Niemcy). Pod mikroskopem operacyjnym badano wybarwienie torebki przez BBG w następujący sposób. Do przedniej komory oka wprowadzano, przez przeziemą rogówkę, igłę 26 G zamocowaną na strzykawce. BBG wstrzykiwano na torebkę przednią przez igłę 26 G wprowadzoną w ten sam sposób (10, 1, 0,5, 0,25, 0,1 i 0,01 mg/ml). Natychmiast płukano przednią komorę oka ulepszonym buforowanym roztworem soli fizjologicznej (BSS Plus®, Santen Pharmaceuticals, Japonia) i z łatwością wypłukiwano nadmiar barwnika.

[0097] W celu pogłębienia przedniej komory oka wstrzykiwano 1% hialuronian sodu (He-alon®, Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Operację CCC rozpoczynano przez wypreparowanie niewielkiego trójkątnego płata torebki przedniej za pomocą zagiętej jednorazowej igły 26 G zamontowanej na wiskoelastycznej strzykawce. Następnie właściwą CCC wykonywano za pomocą cystotomu lub kleszczyków do kapsulotomii.

[0098] Barwnik wybarwiał torebkę przednią w sposób jednorodny i krawędź CCC można było z łatwością zidentyfikować pod mikroskopem operacyjnym. Wraz ze wzrostem stężenia barwnika (0,25 mg/ml do 1 mg/ml, Fig. 9) doszło do zwiększenia intensywności wy-barwienia torebki przedniej i stwierdzono, że minimalne stężenie niezbędne do uzyskania wybarwienia o wysokiej jakości, z wyraźnym uwidocznieniem wybarwianego obiektu, wynosiło 0,25 mg/ml (Fig. 9, górny prawy panel). Przy stężeniu 0,1 mg/ml i 0,01 mg/ml, wybarwienie torebki było słabo widoczne i stosowanie barwnika było bezcelowe (Fig. 9, panel środkowy lewy i dolny lewy). Wstrzyknięcie barwnika do przedniej komory oka prowadziło także do wybarwienia bocznego otworu.

4.2. Zgodność biologiczna BBG

[0099] Badanie przeprowadzono na szczurach Brown Norway (Kyudo, Fukuoka, Japonia), w wieku 8 tygodni, według następującego protokołu. Szczury znieczulano wstrzykując dootrzewnowo pentobarbital, źrenice rozszerzano podając miejscowo 1% tropikamid i 2,5% chlorowodorek fenylefryny. Do przedniej komory oka, przez przeziemą rogówkę, wprowadzano igłę 30 G zamontowaną na strzykawce. Następnie wykonywano pojedyncze wstrzyknięcie każdego z barwników: BBG (10, 1, 0,5, 0,25, 0,1 i 0,01 mg/ml), ICG (5mg/ml), błękitu trypanu (1 mg/ml) oraz kontrolnego roztworu OPEGUARD® (n = 6 dla każdego oka, w sumie 54 oczy). Średnią osmolalność i pH każdego roztworu przedstawiono w Tabeli 1.

[0100] Barwnik pozostawał w komorze przedniej oka przez 2 miesiące, a następnie wykonywano badanie biomikroskopowe. Gałki oczne wyłuszczano po 2 tygodniach i 2 miesiącach od operacji. Oczy analizowano za pomocą mikroskopii świetlnej, transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. 4.3. Mikroskopia świetlna [0101] Oczy utrwalano w 4% paraformaldehydzie i przecinano na pół, zatapiano w parafinie, deparafinizowano w ksylenie, ponownie uwadniano w etanolu i płukano w soli buforowanej fosforanem (PBS). Skrawki o grubości 4 pm barwiono hematoksyliną i eozyną i badano w mikroskopie świetlnym.

[0102] W skrawkach rogówki barwionych hematoksyliną i eozyną, w żadnej z grup nie stwierdzono istotnych zmian (BBG, ICG, TB; Fig. 10). W mikroskopie świetlnym nie stwierdzono cech utraty komórek śródbłonka ani obrzęku rogówki. Blaszkowe warstwy kolagenu, komórki zrębu i komórki warstwy nabłonkowej były dobrze zachowane. W żadnej z warstw rogówki nie stwierdzono nacieku komórek zapalnych. 4.4. Znakowanie końców dUTP za pomocą TdT (TUNEL) [0103] Apoptotyczną śmierć komórek wykrywano z zastosowaniem metody TUNNEL (znakowania końców dUTP za pomocą TdT), jak opisano powyżej. Z próbek utrwalonych w 4% paraformaldehydzie i zatopionych w parafinie cięto skrawki o grubości czterech mikrometrów. Barwienie TUNEL wykonywano przy użyciu zestawu fluoresceinowego do bezpośredniego wykrywania apoptozy in situ ApopTag® (Intergen Company, New York, USA), zgodnie z protokołem producenta. Preparaty współbarwiono [0104] jodkiem propidyny (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), co pozwoliło na uwidocznienie jąder komórkowych w mikroskopie fluorescencyjnym (Olympus, Tokio). Wy bierano losowo dziesięć skrawków z próbki każdego oka i badano je pod mikroskopem (n = 3). Wyniki przedstawiano w postaci średnich ± odchylenie standardowe.

[0105] We wszystkich grupach sporadycznie obserwowano apoptotyczną śmierć komórek nabłonka rogówki związaną z fizjologiczną wymianą komórek (Fig. 11, końcówki strzałek). W grupach BBG nie obserwowano barwienia TUNEL w komórkach zrębu, śródbłon-ka, ciała rzęskowego i komórkach soczewki (Fig. 11). W grupie ICG nie stwierdzono wyraźnej apoptotycznej śmierci komórek przy stężeniu 5 mg/ml. W grupie TB wykryto apoptotyczną śmierć komórek nabłonka rogówki w 2% wszystkich komórek śródbłonka. W pozostałych komórkach w grupie TB nie stwierdzono śmierci apoptotycznej. 4.5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) [0106] Gałki oczne wyłuszczano i utrwalano przednie segmenty gałek ocznych w 1% aldehydzie glutarowym i 1% paraformaldehydzie w PBS. Następnie próbki ponownie utrwalano w buforze weronal - octan czterotlenku osmu (2%), odwadniano w etanolu i wodzie oraz zatapiano w Epon. Z bloczków wycinano ultracienkie skrawki i mocowano na miedzianych siatkach. Próbki oglądano za pomocą mikroskopu elektronowego JEM 100CX (JEOL, Tokio).

[0107] W grupie BBG, przy najwyższym stężeniu barwnika (10 mg/ml, Fig. 12, lewy panel), ultrastruktura komórek rogówki oraz kolagenowa matryca komórkowa były dobrze zachowane. W śródbłonku rogówki błony komórkowe, dobrze odgraniczone jądra komórkowe i organelle cytoplazmatyczne nie wykazywały zmian zwyrodnieniowych (Fig. 12, dolny lewy panel). W grupie ICG obserwowano dobrze zachowaną strukturę komórek śródbłonka, ale niektóre komórki śródbłonka wykazywały obrzęk mitochondriów (Fig. 12, środkowy panel, strzałki). W grupie TB stwierdzono występowanie torbieli w komórkach śródbłonka w związku z oddzielaniem się komórek od siebie (Fig. 12, prawy panel) oraz sporadycznym, rozsianym zwyrodnieniem śródbłonka rogówki (Fig. 12, dolny prawy panel). 4.6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) [0108] Gałki oczne wyłuszczano i utrwalano przednie segmenty gałek ocznych w 1% aldehydzie glutarowym i 1% paraformaldehydzie w PBS. Następnie próbki ponownie utrwalano w buforze weronal - octan czterotlenku osmu (2%), odwadniano w etanolu i wodzie. Próbki nasycano w alkoholu t-butylowym i wykonywano suszenie w punkcie krytycznym (Eiko, Tokio). Następnie próbki umieszczano na wypustkach za pomocą samoprzylepnych etykiet węglowych i natryskiwano na nie powłokę Au o grubości 20 nm z zastosowaniem powlekania plazmowego pod argonem (Eiko). Następnie oglądano powierzchnię śródbłon-kową rogówki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego JEM 840 (JEOL).

[0109] W rogówkach eksponowanych na BBG, w SEM obserwowano prawidłową warstwę sześciokątnych komórek śródbłonka z nienaruszonymi granicami i bez obrzęku komórek śródbłonka (Fig. 13, górny panel). W grupie ICG obserwowano także niewielki obrzęk komórek śródbłonka rogówki. Sporadycznie obserwowano zwyrodniałe komórki śródbłonka, oddzielone od swojego normalnego miejsca występowania. W grupie TB, w części środkowej rogówki, stwierdzono kurczenie się komórek śródbłonka. Kurczenie się komórek śródbłonka doprowadziło do sporadycznej utraty komórek śródbłonka.

Przykład 5 5. Ciągła krzywoliniowa kapsulotomia pod kontrola błękitu brylantowego [0110] Jak podano powyżej, wynalazcy ogłosili wyniki badania przedklinicznego z zastosowaniem nowego barwnika, błękitu brylantowego G (BBG), który wybarwiał przednią torebkę w niższych stężeniach i przy minimalnym działaniu toksycznym. Poniższy przykład wykazuje skuteczność BBG w barwieniu torebki w ludzkim oku.

[0111] W sierpniu 2004 roku, u 70-letniej kobiety z białą dojrzałą zaćmą wykonano CCC pod kontrolą BBG oraz fakoemulsyfikację z wszczepieniem soczewki śródgałkowej. Pacjentka nie chorowała na żadne inne choroby oczu, takie jak jaskra, zapalenie błony naczyniowej ani schorzenia rogówki. Coomassie® BBG 250 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) rozpuszczano w śródgałkowym roztworze płuczącym (OPEGUARD®-MA; Senjyu Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japonia) w dawce 0,25 mg/ml i sterylizowano za pomocą filtra strzykawkowego. Roztwór BBG delikatnie wstrzykiwano do przedniej komory oka, a następnie natychmiast wypłukiwano buforowanym roztworem soli fizjologicznej (BSS).

[0112] Jak przedstawiono na Fig. 14, jasnoniebieska torebka przednia była wyraźnie widoczna w trakcie operacyjnej CCC. Roztwór BBG (0,25 mg/ml) wstrzykiwano do komory przedniej oka, którą natychmiast płukano. (A) strzałka wskazuje na CCC w obrębie gałki ocznej, w której występowała biała zaćma. (B) Końcówki strzałek wskazują granice wykonanej CCC. (C) po fakoemulsyfikacji i odessaniu wprowadzono IOL. Następnego dnia nie obserwowano ostrych efektów toksycznych (takich jak obrzęk rogówki, ciężkie zapalenie czy podwyższone ciśnienie śródgałkowe). Ostrość wzroku pacjentki uległa poprawie z percepcji światła (LP) na 20/20, a po 2 miesiącach obserwowano minimalną utratę komórek śródbłonka rogówki (2%).

[0113] To badanie przeprowadzono po uzyskaniu odpowiedniej zgony Komisji Nadzoru naszej instytucji, zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1989 roku. Przed operacją pacjentce wyjaśniono możliwe korzyści i zagrożenia związane z tym postępowaniem i uzyskano od niej świadomą zgodę.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja barwiąca do barwienia błony ocznej przy wykonywaniu usuwania błony ocznej, przy czym kompozycja barwiąca zawiera, jako główny składnik, błękit brylantowy G (BBG), farmaceutycznie dopuszczalną sól BBG lub hydrat błękitu brylantowego G (BBG).
2. 2. Kompozycja barwiąca według zastrzeżenia 1, przy czym błoną oczną jest błona graniczna wewnętrzna (ILM),
3. 3. Kompozycja barwiąca według zastrzeżenia 1, przy czym błoną oczną jest torebka przednia.
4. 4. Kompozycja barwiąca według zastrzeżenia 1, przy czym kompozycja barwiąca zawiera BBG, farmaceutycznie dopuszczalną sól BBG lub hydrat BBG w stężeniu od 0,1 mg/ml do 1,0 mg/ml.
5. 5. Kompozycja barwiąca według zastrzeżenia 1, przy czym kompozycja barwiąca zawiera BBG, farmaceutycznie dopuszczalną sól BBG lub hydrat BBG w stężeniu od 0,1 mg/ml do 0,25 mg/ml.
6. 6. Kompozycja barwiąca według zastrzeżenia 1, przy czym kompozycja barwiąca ma ciśnienie osmotyczne rzędu 298 mOsm, które jest identyczne z ciśnieniem osmotycz-nym roztworu soli fizjologicznej.
7. 7. Zastosowanie kompozycji zawierającej, jako główny składnik, BBG, farmaceutycznie dopuszczalną sól BBG lub hydrat BBG, do wytwarzania kompozycji barwiącej do stosowania w metodzie barwienia i usuwania błony ocznej przez barwienie błony ocznej przy użyciu kompozycji barwiącej w określonym stężeniu oraz złuszczenie wybar-wionej błony.
8. 8. Zastosowanie według Zastrzeżenia 7, przy czym określone stężenie kompozycji barwiącej wynosi 0,1 mg/ml do 1,0 mg/ml BBG, farmaceutycznie dopuszczalnej soli BBG lub hydratu BBG.
9. 9. Zastosowanie według Zastrzeżenia 7, przy czym określone stężenie kompozycji barwiącej wynosi 0,1 mg/ml do 0,25 mg/ml BBG, farmaceutycznie dopuszczalnej soli BBG lub hydratu BBG.
10. 10. Zastosowanie BBG, farmaceutycznie dopuszczalnej soli BBG lub hydratu błękitu brylantowego G, do wytwarzania kompozycji barwiącej do leczenia choroby oczu, przy czym kompozycję barwiącą stosuje się do barwienia błony ocznej.
11. 11. Zastosowanie według Zastrzeżenia 10, w którym leczenie obejmuje barwienie i usuwanie błony granicznej wewnętrznej (ILM).
12. 12. Zastosowanie według Zastrzeżenia 10, w którym leczenie obejmuje barwienie i usuwanie torebki przedniej.
13. 13. Zastosowanie według Zastrzeżenia 10, w którym stężenie BBG, farmaceutycznie dopuszczalnej soli BBG lub hydratu BBG w kompozycji barwiącej w trakcie leczenia wynosi rzędu 0,1 mg/ml do 1,0 mg/ml.
14. 14. Zastosowanie według Zastrzeżenia 10, w którym stężenie BBG, farmaceutycznie dopuszczalnej soli BBG lub hydratu BBG w kompozycji barwiącej w trakcie leczenia wynosi rzędu 0,1 mg/ml do 0,25 mg/ml.
15. 15. Zastosowanie według Zastrzeżenia 10, w którym ta kompozycja barwiąca w trakcie leczenia ma ciśnienie osmotyczne rzędu 298 mOsm.
16. 16. Zastosowanie błękitu brylantowego G (BBG), farmaceutycznie dopuszczalnej soli BBG lub hydratu błękitu brylantowego G, do wytwarzania środka pomocniczego do stosowania w operacji okulistycznej. Uprawniony: Kyushu University, National University Corporation Pełnomocnik: mgr ini. Zofia Sulima Rzecznik patentowy