ES2324485T3 - Composicion colorante para colorear una membrana oftalmica. - Google Patents
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Abstract
Composición colorante para colorear una membrana oftálmica cuando se procede a la retirada de la membrana oftálmica, caracterizada porque la composición colorante comprende, como componente primario, Azul Brillante G (ABG), una sal farmacéuticamente aceptable de ABG o un hidrato de Azul Brillante G (ABG).
Description
Composición colorante para colorear una membrana
oftálmica.
La presente solicitud reivindica la prioridad
respecto a las solicitudes provisionales de los Estados Unidos
número 60/633.592, solicitada el 6 de diciembre de 2004 y número
60/647.504 solicitada el 27 de enero de 2005.
La presente invención se refiere a una
composición colorante para colorear una membrana oftálmica. Más
específicamente, la presente invención se refiere a la composición
colorante utilizada como coadyuvante para colorear la membrana
oftálmica y, concretamente, para retirar la membrana.
El coloreado de la membrana limitadora interna
(MLI) es uno de los desarrollos importantes de la cirugía para
enfermedades vítreo-retinianas tales como orificio
macular y membranas epirretinales (MERS) (Indocyanine
green-assisted peeling of the retinal internal
membrane. Desprendimiento asistido por el verde de indocianina
de la membrana limitadora interna de la retina. Burk SE et
al. Ophthafmology. 2000; 107:2010-2014).
Actualmente se reconoce en general que es extremadamente difícil
retirar las membranas sin coadyuvante quirúrgico debido a la escasa
visibilidad de la MLI y las MER. En particular, la coloración con
verde de indocianina (VIC) y el Azul de Tripano (AT) han facilitado
en gran medida el desprendimiento de la MLI y las MER en diferentes
enfermedades vítreo-retinianas y, como resultado de
ello, esta técnica es ahora ampliamente aceptada por muchos
cirujanos. Sin embargo, se han publicado recientemente numerosos
informes en relación con el daño a la retina provocado por las
inyecciones intravítreas de VIC y AT, tanto en experimentos como en
uso clínico. (Morphological and functional damage caused by
intravitreal injections of ICG and TB caused by intravítreous
indocyanine green in rat eyes. Lesiones morfológicas y
funcionales de la retina provocadas por el verde de indocianina
intravítreo en ojos de ratas. Enaida H, et al. Graefes Arch
Clin Exp Ophtalmol. 2002; 240; 209-213.; Uemura A,
et al. Visual field defects after uneventful vitrectomy
for epirretinal membrana with indocyanine
green-asisted internal limiting membrane
peeling. Defectos del campo visual después de vitrectomía
satisfactoria de la membrana epirretiniana con desprendimiento de
la membrana limitadora interna asistido por verde de indocianina.
Am J Ophthahnol. 2003; 136:252-257.; Veckeneer M.
et al. Ocular toxicity study of trypan blue injected into
the vitreous cavity of rabbit eyes. Estudio de la toxicidad
ocular del azul de tripano inyectado en la cavidad vítrea de ojos
de conejo. Graefes Arch Clin Exp Ophtalmol.
2001;239:698-704).
Además, la creación de una capsulorrexia
curvilínea continua (CCC) en ojos con una catarata blanca madura
puede representar un reto, dado que es difícil distinguir la
cápsula anterior de la corteza blanca subyacente. Una deficiente
visualización de la cápsula tiende a provocar una CCC incompleta o
inadecuada que podría provocar un desgarro capsular posterior, la
pérdida de humor vítreo y dislocación de la lente intraocular
(DLI). La administración intraocular de colorantes para colorear la
cápsula anterior a fin de realizar la CCC en ojos con cataratas con
escaso o ningún reflejo rojo se ha hecho cada vez más popular. Dada
demostró que la coloración capsular facilita la CCC, incluso en
cataratas inmaduras y podría ser un complemento útil para los
alumnos de cirugía. El azul de tripano al 1% y 0,06% se ha
introducido en la coloración capsular y se ha comprobado que
carecen de toxicidad aparente in vivo. Sin embargo, se ha
descrito que el azul de tripano es tóxico para el endotelio corneal
in vitro en condiciones severas. El verde de indocianina
(VIC) es también un colorante utilizado frecuentemente para la
coloración capsular. McEnerney y Peyman describieron el uso del VIC
para recuentos de células en el endotelio corneal de conejo, y
sugirieron que el colorante no dañaba el endotelio vivo. Sin
embargo, los inventores describieron en 2002 la posible toxicidad
de la VIC para las células retinianas y, recientemente, se ha
descrito la toxicidad del VIC en el epitelio del pigmento
retiniano, las células de los ganglios y los fotorreceptores.
(Indocyanine green induces apoptosis in human retinal pigment
epithelial cells. El verde de indocianina provoca apoptosis en
las células epiteliales del pigmento retiniano humano. Rezai KA,
et al. Am J Ophtalmol. 2004;137:931-933.;
Trypan blue induces apoptosis in human retinal epithelial
cells. El azul de tripano provoca apoptosis en las células
epiteliales del pigmento retiniano humano. Rezai KA, et al.
Am J Ophtalmol. 2004;13 8:492-495). La patente WO
2004/035091 describe el uso de azul Patentblue V o Azul Brillante R
para la coloración de la cápsula anterior o la membrana
epirretiniana del ojo al realizar operaciones oftálmicas.
Como se ha indicado anteriormente, los
colorantes (como por ejemplo el IC o AT) utilizados normalmente
para colorear una membrana oftálmica, particularmente la membrana
limitadora interna y la cápsula anterior, han producido dudas en
cuanto a su seguridad. Dichas dudas han surgido como consecuencia
de informes sobre la posibilidad de toxicidad, teratogenicidad,
etc., en las células retinianas. Además, han surgido problemas
técnicos tales como la incapacidad para obtener un colorante
satisfactorio a bajas concentraciones y la complicación de los
procedimientos de coloración. Como consecuencia, estos problemas
han hecho que la cirugía oftálmica se convierta en una cuestión aún
más difícil.
Así pues, para promover la mejora en las
intervenciones oftálmicas, se ha perseguido con gran interés el
desarrollo de un colorante que coloree específicamente una membrana
oftálmica, y tenga como objetivos una fuerte coloración a bajas
concentraciones junto con niveles elevados de seguridad.
En consecuencia, un objetivo de la presente
invención es el de proporcionar una composición colorante que sea
una alternativa a los colorantes utilizados habitualmente para
colorear una membrana oftálmica. Un objetivo más detallado es el de
proporcionar una composición colorante que permita colorear
específicamente la membrana limitadora interna o la cápsula
anterior, y que pueda utilizarse como coadyuvante en una operación
para la retirada de dicha membrana.
A fin de proporcionar una composición colorante
que alcance dichos objetivos, se han utilizado todos los
colorantes, incluidos los que actualmente no se usan en organismos,
siendo cribados para encontrar los mejores colorantes. Además, como
condiciones para el cribado, se anotaron específicamente la
seguridad y la afinidad del colorante. Acto seguido se realizaron
evaluaciones de la seguridad, utilizando ratas, de los mejores
colorantes candidatos. Basándose en la superior afinidad de
coloración y a la seguridad, el candidato final fue el Azul
Brillante G (ABG).
Además, con el fin de examinar las condiciones
óptimas de una composición colorante que contenga ABG para colorear
una membrana oftálmica, se realizaron varios experimentos. De ese
modo, se obtuvo la composición colorante de la presente invención.
Conviene señalar que el ABG no ha sido utilizado aún clínicamente,
sobre todo en seres humanos. No obstante, debido a las óptimas
condiciones de la presente invención, se puede proporcionar una
composición colorante que sea segura para uso clínico y que tenga
al mismo tiempo una elevada afinidad a la coloración.
En consecuencia, según el primer aspecto
principal de la presente invención, se proporciona una composición
colorante que tiene el ABG como componente principal, para colorear
una membrana oftálmica cuando se procede a la retirada de la
membrana oftálmica.
Esto es, un aspecto de la presente invención se
dirige a una composición colorante para colorear una membrana
oftálmica cuando se procede a la retirada de la membrana oftálmica,
caracterizada porque dicha composición colorante comprende, como
componente primario, el Azul Brillante G (ABG), una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo o un hidrato suyo.
La estereoestructura preferida del ABG de la
presente invención son cuerpos ópticamente activos que tienen la
estructura absoluta, pero el ABG de la presente invención puede
estar presente en forma de enantiómeros, o mezclas de los mismos,
tales como cuerpos racémicos. Así pues, el ABG de la presente
invención incluye todos los cuerpos ópticamente activos, las
mezclas enantioméricas, tales como cuerpos racémicos y las mezclas
diaestereoméricas del ABG.
Entre los ejemplos de la sal farmacéuticamente
aceptable se incluyen las sales formadas con bases inorgánicas,
amoniaco, bases orgánicas, ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos,
aminoácidos básicos, iones de halógenos o similares, así como sales
moleculares internas. Entre los ejemplos de la base inorgánica se
incluyen el metal alcalino (por ejemplo Na, K) y el metal
alcalinotérreo (por ejemplo Ca, Mg). Ejemplos de la base orgánica
incluyen la trimetilamina, trietilamina, colina, procaína,
etanolamina y similares. Ejemplos del ácido inorgánico son ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico,
ácido fosfórico, y similares. Entre los ejemplos del ácido orgánico
incluyen el p-toluensulfónico, el ácido
metanesulfónico, el ácido fórmico, el ácido trifluoroacético, el
ácido maléico, y similares. Ejemplos de los aminoácidos básicos son
la lisina, arginina, ornitina, histidina, y similares. El compuesto
podría ser un hidrato farmacéuticamente aceptable.
Según una realización preferida de la invención,
dicha composición colorante puede utilizase como coadyuvante
quirúrgico en intervenciones oftálmicas relacionadas con
enfermedades de los ojos tales como la enfermedad
vítreo-retiniana, el orificio macular, el
desprendimiento de retina debido a orificio macular himiópico, la
membrana epirretiniana, la retinopatía diabética proliferativa, el
edema macular diabético y la viterorretinopatía proliferativa y
cataratas específicas tales como la catarata hipermadura y la
catarata congénita, al igual que el transplante corneal de espesor
dividido, etc. Según la composición colorante la presente invención,
se hace posible verificar más claramente las membranas oftálmicas
de difícil observación y mejorar la seguridad durante las
operaciones quirúrgicas.
En otra realización preferida de la presente
invención, dicha composición colorante puede utilizarse para
colorear una membrana oftálmica y, más preferentemente, para
colorear la membrana limitadora interna y/o la cápsula
anterior.
En una realización preferida de la presente
invención, es conveniente que la composición colorante de la
presente invención contenga ABG a una concentración de
0,1-10 mg/ml, preferentemente una concentración de
0,1 - 1,0 mg/ml y, más preferentemente, una concentración de 0,1 -
0,25 mg/ml. En esta realización, se presenta una composición
colorante que tiene una elevada afinidad colorante a concentraciones
bajas y en cantidades reducidas.
Además, según la realización de la presente
invención, es preferible que la composición colorante tenga una
presión osmótica de alrededor de 298 mOsm. Según esta realización,
la composición colorante de la presente invención tiene una presión
osmótica equivalente a la de una solución salina fisiológica. De
este modo, queda neutralizado cualquier problema que ocurra como
consecuencia de diferencias en la presión osmótica.
En una realización preferida de la presente
invención, es conveniente que la composición colorante de la misma
tenga un pH neutro, es decir, un pH cercano a 7,4.
Según el segundo aspecto principal de la
presente invención, se proporciona una composición para su uso en
un procedimiento de coloración y retirada de una membrana oftálmica
que incluye los pasos de preparar una composición colorante que
tiene el ABG como componente principal, colorear la membrana
oftálmica utilizándose una concentración predeterminada de dicha
composición colorante y retirar la membrana oftálmica coloreada.
En una realización preferida de la presente
invención, dicha membrana oftálmica es una membrana limitadora
interna y/o una cápsula anterior, aunque no se limita
necesariamente a las mismas.
Según el tercer aspecto principal de la presente
invención, se proporciona el uso del ABG en la fabricación de una
composición colorante para el tratamiento de enfermedades
oftálmicas.
Además, según el cuarto aspecto principal de la
presente invención, se proporciona el uso de ABG como coadyuvante
quirúrgico para intervenciones oftálmicas.
La Fig. 1 muestra un fotografía en microscopía
óptica de ojos de rata a los que se ha inyectado ABG intravítreo
(10 mg/ml, 0,05 ml/ojo) observada a los 14 días. (Aumento Original
A: x 200, B: x 400).
La Fig. 2 muestra una fotografía en microscopía
electrónica de transmisión de los ojos de rata inyectados con ABG
intravitreal (10 mg/ml y 1 mg/ml, 0,05 ml/ojo) observada a los 14
días. (Aumento Original x 2000).
La Fig. 3 muestra una fotografía que ilustra la
muerte de células apoptóticas detectada por TUNEL. (Aumento
original x 400).
La Fig. 4 muestra gráficos que presentan formas
de onda y amplitud máxima de ERGs en ojos de rata.
La Fig. 5 muestra fotografías que presenta la
coloración de la MLI por ABG en ojos de primates.
La Fig. 6 muestra fotografías que presentan el
desprendimiento de la MLI asistido por ABG para OM.
La Fig. 7 muestra una fotografía que ilustra el
desprendimiento de membrana asistido por ABG para la MER.
La Fig. 8 muestra una fotografía microscópica de
la transmisión de electrones para la MLI.
La Fig. 9 muestra las imágenes biomicroscópicas
representativas de la coloración capsular con ABG. (Aumento
original x4).
La Fig. 10 muestra secciones de la cornea
coloreadas con hematolixina y eosina después de la inyección de los
colorantes en la cámara anterior. (Aumento original x400).
La Fig. 11 muestra fotografías que presentan la
muerte de células apoptóticas detectada por TUNEL.
La Fig. 12 muestra fotografías que presentan la
ultraestructura de las células corneales y la matriz celular de
colágeno por microscopía electrónica de transmisión.
La Fig. 13 muestra fotografías que presentan la
ultraestructura de las células endoteliales corneales por
microscopía electrónica de exploración.
La Fig. 14 muestra fotografías que ilustran la
CCC asistido por el ABG.
Como se ha descrito anteriormente, la evaluación
se centró en proporcionar un colorante para la coloración de un
membrana oftálmica, coma alternativa a los colorantes utilizados
habitualmente, tales como el VIC o el AT. Así, tal como se expone a
continuación, se combinaron una serie de características, y se
obtuvo una composición colorante que posee una elevada afinidad
colorante y un alto nivel de seguridad.
Un aspecto de la presente invención se dirige a
una composición colorante para colorear una membrana oftálmica
cuando se procede a la retirada de la membrana oftálmica,
caracterizada porque dicha composición colorante comprende, como
componente primario, el Azul Brillante G (ABG), una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo o un hidrato suyo.
La estereoestructura preferida del ABG de la
presente invención son cuerpos ópticamente activos que tienen la
estructura absoluta, pero el ABG de la presente invención puede
estar presente en forma de enantiómeros o mezclas de los mismos,
tales como cuerpos racémicos. Así pues, el ABG de la presente
invención incluye todos los cuerpos ópticamente activos, las
mezclas enantioméricas, tales como cuerpos racémicos y las mezclas
diaestereoméricas del ABG.
Entre los ejemplos de la sal farmacéuticamente
aceptable se incluyen las sales formadas con bases inorgánicas,
amoniaco, bases orgánicas, ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos,
aminoácidos básicos, iones de halógenos o similares, así como sales
moleculares internas. Entre los ejemplos de la base inorgánica se
incluyen el metal alcalino (por ejemplo Na, K) y el metal
alcalinotérreo (por ejemplo Ca, Mg). Ejemplos de la base orgánica
incluyen la trimetilamina, trietilamina, colina, procaína,
etanolamina y similares. Ejemplos del ácido inorgánico son ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico,
ácido fosfórico, y similares. Entre los ejemplos del ácido orgánico
incluyen el p-toluensulfónico, el ácido
metanesulfónico, el ácido fórmico, el ácido trifluoroacético, el
ácido maléico, y similares. Ejemplos de los aminoácidos básicos son
la lisina, arginina, ornitina, histidina, y similares. El compuesto
podría ser un hidrato farmacéuticamente aceptable.
El ABG de la presente invención, una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo o un hidrato suyo,
especialmente ABG, puede adquirirse y fabricarse mediante el
conocimiento común de química orgánica. También, pueden fabricarse
mediante el procedimiento descrito en la memoria de la patente de
los Estados Unidos número 6.057.160.
A continuación se describirá una realización de
la presente invención utilizándose ejemplos prácticos y
dibujos.
En primer lugar, se utilizaron todos los
colorantes, incluidos los que actualmente no se usan para
organismos, cribándose a continuación para encontrar los colorantes
candidatos. Los colorantes cribados son el azul de Evans, el azul
Ácido 9, el verde Fijo, el Azul Brillante FCF,
Indigo-carmine, el azul de metilo, el azul de
metileno y el Azul Brillante G (ABG). Las condiciones del cribado
se centraron en particular en la seguridad y la afinidad de la
coloración. Entre algunos de los principales candidatos, fueron
retirados los que mostraban superioridad en cuanto a la seguridad
pero incapacidad de colorear el objeto diana o, por el contrario,
los que presentaban una buena coloración pero eran virulentos para
la retina. Se efectuaron evaluaciones de seguridad, de los mejores
colorantes elegidos, con el uso de ratas y, de acuerdo con su
excelente afinidad de coloración y de seguridad, el candidato final
fue el ABG. A continuación se describe con más detalle las razones
por las que el ABG pasó a ser el candidato final para la presente
invención.
En primer lugar, las cualidades de coloración
del ABG, cuando se comparan con las del VIC, eran muy similares, ya
que pueden colorear un objeto-blanco a
concentraciones muy bajas (1/10 - 1/20). Incluso después del examen
de soluciones a concentraciones muy elevadas que quedaban en la
zona intraocular, no pudo demostrarse ningún carácter en cuanto a
una clara toxicidad al ojo. Además, dado que el ABG (al contrario
que el VIC) no es un colorante fluorescente, se considera que es
prácticamente inexistente la fototoxicidad para la retina que se
cree que tiene lugar debido a la iluminación intraocular como
consecuencia de una elevada iluminancia. Además, la persistencia
del colorante en la superficie tisular después de limpieza fue muy
baja comparada con el VIC. Por otra parte, dado que el ABG es un
colorante del tipo de color frío, siendo los tejidos intraoculares
del tipo de color cálido, se puede reforzar el contraste del
colorante.
A continuación, se efectuaron diferentes
experimentos para evaluar las condiciones óptimas de una
composición colorante que contiene ABG para colorear una membrana
oftálmica. Además, el ABG no se ha utilizado hasta ahora
clínicamente, sobre todo en seres humanos. No obstante, dadas las
condiciones óptimas de la presente invención, puede proporcionarse
una composición, que es al mismo tiempo segura, y con una elevada
afinidad de coloración para uso clínico.
En consecuencia, según el primer aspecto
principal de la presente invención, se proporciona una composición
colorante que tiene el ABG como componente principal, para colorear
una membrana oftálmica cuando se procede a la retirada de la
membrana oftálmica.
Según una realización preferida de la invención,
dicha composición colorante puede utilizase como coadyuvante
quirúrgico en intervenciones oftálmicas relacionadas con
enfermedades de los ojos tales como, por ejemplo, la enfermedad
vítreo-retiniana, el orificio macular, el
desprendimiento de retina debido a orificio macular himiópico, la
membrana epirretiniana, la retinopatía diabética proliferativa, el
edema macular diabético y la viterorretinopatía proliferativa, y
cataratas específicas tales como la catarata hipermadura y la
catarata congénita, al igual que el transplante corneal de espesor
dividido, etc. Según la composición colorante la presente invención,
se hace posible verificar más claramente las membranas oftálmicas
de difícil observación y mejorar la seguridad durante las
operaciones quirúrgicas.
En otra realización preferida de la presente
invención, dicha composición colorante puede utilizarse para
colorear una membrana oftálmica y, más preferentemente, para
colorear la membrana limitadora interna y/o la cápsula
anterior.
anterior.
Una vez más, según una realización de la
presente invención, la composición colorante de la presente
invención puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Puede prepararse en forma de conjunto con una solución
disolvente y fármacos en polvo, o como solución que llena una
jeringa, así como en solución en estado de gel combinada con un
ácido hialurónico. Más preferentemente, se prepara en la forma de
solución, pero no es preciso limitarse a esta forma.
En una realización de la presente invención,
dicha composición colorante se prepara como solución
farmacéuticamente aceptable, aunque no es preciso limitarse
necesariamente a la misma. Esto se debe a las cualidades del ABG,
puesto que puede disolverse directa y fácilmente en una solución
intraocular de limpieza, y puede esterilizarse con el filtro de la
jeringa.
Además, según una realización de la presente
invención, dicha composición colorante se prepara en forma de
solución, disolviéndose en una solución de riego intraocular, una
solución salina equilibrada (SSE), una solución fisiológica salina
o, más preferentemente, la conocida como OPEGUARD -MA (Senjyu
Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japón) que es una solución de
riego intraocular (solución intraocular de limpieza). No obstante,
no es necesario que se limite a dicha forma.
En una realización preferida de la presente
invención, la composición colorante de la presente invención
contiene ABG a una concentración de 0,1 - 10 mg/ml, preferentemente
a una concentración de 0,1 - 1,0 mg/ml y, más preferentemente, a
una concentración de 0,1 - 0,25 mg/ml. En un ejemplo práctico de la
presente invención, en dicha composición colorante, la
concentración de ABG necesaria para colorear la MLI de primates, es
aproximadamente 1/10 si se compara con el VIC. Además, para colorear
la cápsula anterior, el ABG de dicha composición colorante puede
proporcionar una coloración satisfactoria con una baja
concentración de 0,25 mg/ml, comparado con el VIC que requiere 5
mg/ml y el AT que exige 1 mg/ml. En otras palabras, según esta
realización, se puede proporcionar una composición colorante que
tiene una elevada afinidad a la coloración a bajas concentraciones
y pequeñas
cantidades.
cantidades.
Además, según una realización de la presente
invención, es preferible que la composición colorante tenga una
presión osmótica de alrededor de 298 mOsm. Según esta realización,
la composición colorante de la presente invención presenta una
presión osmótica equivalente a la de una solución fisiológica
salina. Se ha descrito anteriormente que los defectos en el
epitelio del pigmento retiniano con el VIC, podrían deberse
posiblemente a la hipoosmolalidad de su solución. A este respecto,
la composición colorante de una realización de la presente
invención tiene efectos superiores, dado que no ocurren los
defectos debidos a diferencias de la presión osmótica en el epitelio
del pigmento retiniano - que son trastornos tisulares relacionados
con las dilataciones o deshidratación de las células (tales como la
falta de células o su muerte)-.
En una realización preferida de la presente
invención, es conveniente que la composición colorante de la misma
tenga un pH neutro, es decir, un pH cercano a 7,4.
Según el segundo aspecto principal de la
presente invención, se proporciona una composición para su uso en
un procedimiento de coloración y retirada de una membrana oftálmica
que incluye los pasos para preparar una composición colorante que
tiene el ABG como componente principal; colorear la membrana
oftálmica utilizándose una concentración predeterminada de dicha
composición colorante; y retirar la membrana oftálmica
colorea-
da.
da.
Para una realización de la presente invención,
el citado uso para colorear la membrana oftálmica puede utilizar un
procedimiento que conoce fácilmente una persona docta en la
materia, por ejemplo, inyección, infusión, irrigación, confirmación
y desprendimiento. En un ejemplo práctico de la presente invención,
es preferible que el citado uso para colorear una membrana
oftálmica utilice la inyección de dicha composición colorante. Con
este ejemplo práctico, no es necesario un paso adicional, como es el
intercambio de fluidos-gases, que se necesita
cuando se aplica el AT a una membrana oftálmica. Por ejemplo, es
posible simplemente colorear en el momento de su uso durante la
cirugía oftálmica.
Según el tercer aspecto principal de la presente
invención, se proporciona el uso del ABG en la fabricación de una
composición colorante para el tratamiento de enfermedades
oftálmicas.
Además, según el cuarto aspecto principal de la
presente invención, se proporciona el uso del ABG como coadyuvante
quirúrgico para intervenciones oftálmicas.
Además, en una realización de la presente
invención, dicha composición colorante y/o su uso en un
procedimiento de coloración, puede emplearse adecuadamente como
parte de intervenciones oftálmicas. Según una realización preferida
de la presente invención, dichas intervenciones oftálmicas son
cirugías para tratar el orificio macular, el desprendimiento de
retina debido a orificio macular himiópico, la membrana
epirretiniana, la retinopatía diabética proliferativa, el edema
macular diabético y la viterorretinopatía proliferativa, cataratas
específicas tales como la catarata hipermadura y la catarata
congénita, al igual que el transplante corneal de espesor dividido,
etc. y, más preferentemente, enfermedades
vítreo-retinianas (en particular el orificio macula
o membranas epirretinianas (MERs)) y cataratas.
Además, con una realización preferida de la
presente invención, las citadas intervenciones oftálmicas pueden
efectuarse en los ojos de los mamíferos y, más preferentemente, en
los ojos de los humanos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
describir la invención con mayor detalle.
\newpage
Ejemplo
1
A fin de proporcionar una composición colorante
que alcance dichos objetivos, se utilizaron todos los colorantes,
incluidos los que actualmente no se usan para organismos,
cribándose a continuación para encontrar los colorantes candidatos.
Los colorantes cribados son el azul de Evans, el azul Ácido 9, el
verde Fijo, el Azul Brillante FCF, Indigo-carmine,
el azul de metilo, el azul de metileno y el Azul Brillante G (ABG).
Además, como condiciones de cribado, se observaron en particular la
seguridad y la afinidad de la coloración.
Entre algunos de los principales candidatos,
fueron retirados los que mostraban superioridad en cuanto a la
seguridad pero incapacidad de colorear el objeto diana o, por el
contrario, los que presentaban una buena coloración pero eran
virulentos para la retina.
Se efectuaron evaluaciones de seguridad, de los
mejores colorantes elegidos, con el uso de ratas. Basándose en su
excelente afinidad de coloración y de seguridad, el candidato final
fue el ABG.
A continuación, a fin de examinar las
condiciones óptimas de una composición colorante que contiene ABG
para colorear una membrana oftálmica, se efectuaron diferentes
experimentos. De ese modo, se obtuvo la composición colorante de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Todos los procedimientos cumplieron la
declaración de la Asociación para Investigación en la Visión y
Oftalmológica (AIVO) para el Uso de Animales en Investigación
Oftálmica y de la Visión así como las directrices para el cuidado
de animales de la Universidad de Kyushu, Fukuoka, Japón.
\vskip1.000000\baselineskip
El ABG es también conocido Azul Ácido 90 y Azul
Brillante Coomassie G. Aparte de nuestra publicación anterior, no
existen informes sobre la investigación de la toxicidad del ABG
para uso oftálmico. La Tabla 1 muestra la osmolalidad y el pH de la
solución de ABG a diferentes concentraciones. Se observó que la
osmolalidad y el pH del ABG eran similares a los de las soluciones
de irrigación intraocular.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas ratas marrones de Noruega (n = 78 machos,
de 8 semanas de edad, Kyudo, Fukuoka, Japón) fueron anestesiadas
con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina a una
dosis de 75 mg/kg de peso corporal. Un ojo de cada animal (con un
total de n = 6 por grupo de dosis) fue vitrectomizado con el uso de
0,05 ml de gas SF_{6} puro, como se ha descrito anteriormente.
Después de la inyección de gas, se inyectaron en la cavidad vítrea
de cada ojo vitrectomizado 0,05 ml de solución ABG, con el uso de un
microscopio para mejorar el aumento durante la intervención. Se
preparó la solución de ABG (Azul Brillante G, azul brillante G 250
Coomassie (marca comercial registrada);
Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) a concentraciones
de 0,01, 0,1, 1,0, y 10 mg/ml utilizándose dilución en solución de
riego intraocular (OPEGUARD(marca
registrada)-MA, Senjyu Pharmaceutical Co. Ltd.,
Osaka, Japón), y se esterilizó a través de un filtro de jeringa de
0,22 pm. Se determinó la osmolalidad media con el uso de un medidor
de presión osmótica (OSMO STATION, Arkray, Kyoto, Japón) y se
calculó el pH de cada solución para todas las concentraciones
preparadas (Tabla 1). La concentración final se calculó de acuerdo
con la solución de VIC utilizada en vitrectomías en humanos
(2,5-5,0 mg/ml), a fin de administrar a la ratas una
dosis segura de ABG que produjera al mismo tiempo una buena
coloración. Como controles se utilizaron veinticuatro ojos
falsamente operados (a los que se inyectó SF_{6} seguido por 0,05
ml de solución de riego intraocular).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ojos fueron enucleados y fijados en
paraformaldehído al 10% el día 14 (n = 30; 6 por grupo de dosis y
de control) y a los 2 meses (n = 30, 6 por dosis y grupo de
control) postoperatoriamente. Se cortaron ojos completos
siguiéndose aproximadamente el meridiano vertical. Unas secciones
empapadas en parafina se colorearon con
hematoxilina-eosina (HE) y se examinó cada sección
utilizando un microscopio óptico.
Después de inyección intravítrea de ABG, no se
observó, por microscopía quirúrgica, efecto tóxico alguno del ABG,
tales como edema corneal, edema retiniano grave o endoftalmitis,
durante un período de dos meses. Los ojos se enuclearon el día 14 y
2 meses después de la intervención. La estructura normal de la
retina quedaba preservaba en los ojos a los que se inyectó las
dosis más elevadas de ABG (10 mg/ml) cuando se observaron tanto el
día 14 como a los 2 meses. Además, no se observó ninguna
infiltración de células inflamatorias. (Fig. 1, día 14). La
estructura normal de la retina se conservó igualmente en los grupos
a los que se inyectaron dosis menores de ABG y no se observaron
signos de degeneración celular de las secciones, tanto en el día 14
como a los 2 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ojos fueron enucleados en el día 14 y a los
2 meses después de la operación, fijándose en paraformaldehído al
1%, y glutaraldehído al 1%, en PBS. Las muestras fueron
posteriormente fijadas en el tampón de acetato de veronal en
tetróxido de osmio (2%), se deshidrataron en etanol y agua, y se
empaparon en Epon. De los bloques se cortaron secciones ultrafinas,
que se montaron en rejillas de cobre. Se observaron las muestras
con un microscopio electrónico JEM 100CX (JEOL, Tokio).
Algunas muestras a las que se inyectó la dosis
más alta de ABG (10 mg/ml) mostraron vacuolización en las células
ganglionares y en los procesos de las células de Müller de las
fibras nerviosas, tanto en el día 14 (Fig. 2A, día 14) como a los 2
meses. Aunque estos mismos cambios se hallaron también en el grupo
al que se inyectó 1 mg/ml de ABG, el grado de vacuolización fue
inferior que en el grupo de 10 mg/ml (Fig. 2B). Ni en los grupos
que recibieron dosis inferiores ni en los controles se observó
vacuolización alguna. Entre todos los grupos, no se observaron
cambios dignos de mención en la retina, incluidas las capas de
células nucleares internas, nucleares externas, y epiteliales del
pigmento retiniano.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el uso del Etiquetado del Extremo de la
Entalla del Terminal TdT-dUTO (TUNEL) se detectó la
muerte de células apoptóticas, como se ha descrito anteriormente.
Para obtener secciones de 4-\mum a partir de
muestras fijadas en paraformaldehído al 4% y empapadas en parafina,
se utilizó un criostato. La coloración TUNEL se realizó con el Kit
de Detección Directa de Apoptosis in situ con Fluoresceína
ApopTag® (Intergen Company, Nueva York, EE.UU.) siguiéndose el
protocolo del fabricante. Las secciones se colorearon
simultáneamente con yoduro de propidio (Molecular Probes, Eugene,
OR, EE.UU.), permitiéndose así la observación de los núcleos de las
células a través de un microscopio de fluorescencia (Olympus,
Tokio). Se seleccionaron aleatoriamente diez secciones de cada
muestra de ojo, observándose con el uso el microscopio.
En el grupo al que se administró las dosis más
elevadas de ABG (10 mg/ml), se observó entre las diez secciones un
caso de muerte de células apoptóticas. Sin embargo, la proporción
de células apoptóticas no fue significativamente diferente de lo
que se observó en las secciones de control (Fig. 3, día 14). A los
grupos a los que se inyectaron las dosis inferiores de ABG, no se
observó coloración en TUNEL en la retina en el día 14. Además, al
cabo de 2 meses, las células retininas de todos los grupos de dosis
de ABG no habían sufrido ninguna muerte de células
apoptóticas.
apoptóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de una inyección de gas, se inyectaron
en la cavidad vítrea 0,05 ml de solución ABG (1 mg/ml y 10 mg/ml) o
una solución de riego intraocular. Se estudiaron seis ratas de cada
grupo de dosis y seis controles. Se confirmó la ausencia de
cataratas en todas las ratas antes de efectuarse las mediciones. A
los catorce días, así como dos meses más tarde, se mantuvieron a
las ratas en una sala oscura durante una noche, con sólo una leve
iluminación roja, anestesiándose con una inyección intraperitoneal
de 15 \mul/g de peso corporal de una solución salina que contenía
ketamina (1 mg/ml), xilazina (0,4 mg/ml), y uretano (40 mg/ml). A
continuación se efectuó la electrorretinografía (ERG) como se ha
descrito previamente. Las pupilas se dilataron con gotas de
fenilefrina HCl al 2,5% y tropicamida al 1%, hasta que se alcanzó
la dilatación máxima antes registrarse del ERG. Se anestesió la
cornea con gotas de proparacaína HCI al 1% colocándose acto seguido
las ratas sobre una almohadilla térmica durante el experimento.
Sobre la cornea se colocó un electrodo de alambre, recubierto con
metilcelulosa al 1%, para registrar las ERGs. Como electrodo de
referencia, se utilizó un electrodo de alambre similar colocado en
la boca, al tiempo que se puso a tierra un electrodo de aguja en la
cola. Las respuestas se amplificaron diferencialmente, (de 0,8 a
1.200 Hz), se promediaron, y se almacenaron con el uso de un
ordenador. Se presentaron destellos estroboscópicos blancos (xenón)
en un estimulador de Ganzfeld (VPA-10; Cadwell,
Kennewick, Washington, EE.UU.) contra un campo acromático de
adaptación. Se registraron las ERGs adaptadas a la oscuridad
(mediadas con varilla) en primer lugar para verificar la
estabilidad de la respuesta a ambas intensidades. A continuación, se
adaptó cada rata a una luminancia de fondo oscuro durante 20
minutos, período suficiente para alcanzar un nivel estable de
respuesta. Posteriormente, se obtuvieron ERG adaptadas a la
oscuridad a (mediadas con varilla) y adaptadas a la oscuridad
b (bipolares y mediadas con células de Müller) a una
luminancia de destello de 1,30 log cd seg/m^{2}. Después de sacó
la media de las respuestas a cinco destellos sucesivos con un
intervalo entre los estímulos de 1 min. a fin de establecer las
respuestas adaptadas a la oscuridad. A continuación se expusieron
las ratas a un campo de luz de adaptación blanca (1,50 log
cd/m^{2}) durante un mínimo de 25 minutos, obteniéndose a
continuación ERG adaptadas a la luz b (mediadas con conos) a
una luminancia del destello de 1,30 log cd seg/m^{2} (estado de
sensibilizado de los bastoncillos en ratas). Se sacó la medida de
las respuestas a 50 destellos sucesivos efectuados a 2 Hz. Se
evaluaron los resultados de la amplitud de las ERGs con el uso del
test t de Student, considerándose estadísticamente
significativo un valor de
p de < 0,05.
p de < 0,05.
La figura 4A representa las formas de ondas de
las ERG en la oscuridad y adaptadas a la luz de las respuestas de
los grupos de control y de dosis elevada en el día 14. Las
amplitudes de las respuestas adaptadas a la oscuridad, obtenidas al
comienzo de los experimentos, mostraron una escasa variabilidad
entre los grupos. Aunque en los grupos que recibieron las dosis
elevadas se observó en el día 14 una ligera reducción de la amplitud
máxima media de las ondas a adaptadas a la oscuridad (Fig. 4B, día
14), de manera dependiente de la dosis, no se observó ninguna
diferencia significativa en la amplitud máxima de las ondas en
comparación con los controles (10 mg/ml: p = 0,054 y 1,0 mg/ml: p =
0,063; test de la t). Por otra parte, las ERG de las ondas
b adaptadas a la oscuridad (10 mg/ml: p = 0,053 y 1,0 mg/ml:
p = 0,508; ensayo t) y las ondas b adaptadas a la luz (10
mg/ml:
p = 0,451 y 1,0 mg/ml: p = 0,550; ensayo t) no mostraron ninguna reducción digna de mención, sin que se produjera diferencia estadística significativa entre las amplitudes (Fig. 4B, día 14). Al cabo de 2 meses, se registraron las ERGS de los mismos grupos de dosis (1,0 mg/ml y 10 mg/ml), comprobándose que la reducción de la amplitud de las ondas a adaptadas a la oscuridad se recuperaban de manera similar a lo que ocurría en el grupo de
control.
p = 0,451 y 1,0 mg/ml: p = 0,550; ensayo t) no mostraron ninguna reducción digna de mención, sin que se produjera diferencia estadística significativa entre las amplitudes (Fig. 4B, día 14). Al cabo de 2 meses, se registraron las ERGS de los mismos grupos de dosis (1,0 mg/ml y 10 mg/ml), comprobándose que la reducción de la amplitud de las ondas a adaptadas a la oscuridad se recuperaban de manera similar a lo que ocurría en el grupo de
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que, en los ojos de rata, es imposible el
desprendimiento de la MLI, los inventores examinaron la capacidad
de la ABG de colorear la MLI en ojos de primates. En este estudio
se utilizaron dos ojos de dos monos cynomolgus de 3 años de
edad. Los animales fueron confinados en una jaula de sujeción y se
les inyectó en el muslo, por vía intramuscular, 20 mg/kg de
clorhidrato de ketamina (Sankyo Yell Pharmaceutics Products Co.
Ltd., Japón) para anestesia general. Posteriormente los monos
fueron trasladados a un quirófano. La intervención consistió en una
vitrectomía estándar de la pars plana y de tres orificios,
provocándose un desprendimiento vítreo posterior por aspiración con
una cuchilla de vitrectomía, utilizándose una inyección
triamcinolona-acetomida para visualización
vítrea.
vítrea.
Se disolvieron diez miligramos de ABG en 20 ml
de solución de riego intraocular, esterilizándose con un filtro de
jeringa. La concentración final de ABG fue de 0,5 mg/ml. A
continuación, se inyectó lentamente la solución preparada de ABG
(0,5 ml) en la cavidad vítrea y se lavó de inmediato con solución
salina equilibrada (BSS plus(marca registrada), Santen,
Osaka, Japón). Se realizó la retirada de la MLI con el uso de
fórceps de MLI. Posteriormente se retiraron los instrumentos y se
cerraron los orificios de esclerotomía con el uso de suturas de
poligalatina 7-0. Los exámenes postoperatorios
incluyeron microscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopía en
los días 1, 3 y 14. El día 14 se realizó una angiografía de
fluoresceína.
Después de irrigación de la cavidad vítrea, la
MLI se coloreó con un color azul claro. El borde y el colgajo de la
MLI se mantuvieron claramente visibles durante el desprendimiento
de la MLI (Fig. 5A). La zona circular situada debajo de la MLI fue
claramente visible después del desprendimiento de la misma (Fig.
5B).
\newpage
Postoperatoriamente, durante la microscopía de
lámpara de hendidura y los exámenes oftalmoscópicos del día 14, no
se observaron efectos tóxicos del ABG, tales como edema corneal,
grave edema retiniano ni endoftalmitis. La angiografía con
fluoresceína puso igualmente de relieve que la ABG no había
producido a los 14 días ningún daño retiniano visible (Fig. 5C).
Los exámenes oftalmoscópicos posteriores no mostraron ningún otro
cambio en la retina durante el período de seguimiento de seis
meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La coloración con verde de indocianina (VIC) y
Azul de Tripano (AT) ha facilitado notablemente el desprendimiento
de la MLI en diversas enfermedades
vítreo-retinianas. Sin embargo, se han publicado
recientemente numerosos informes en relación con el daño a la
retina provocado por el VIC y el AT, tanto en experimentos como en
uso
clínico.
clínico.
A partir del estudio
pre-clínico, se seleccionó el ABG como colorante
candidato para coloración de la MLI. Al parecer, esta es la primera
investigación clínica del ABG en el ojo humano. Esta es la primera
investigación clínica conocida del ABG en el ojo humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre agosto y septiembre de 2004, se reclutaron
de la unidad de pacientes ambulatorios del Hospital Universitario
de Kyushu (Fukuoka, Japón), dieciséis ojos de 16 pacientes con un
orificio macular (OM) y membranas epirretinianas (MER). Se excluyó
a los pacientes con enfermedades oculares, tales como glaucoma,
uveítis, y trastorno corneal. En la Tabla 1 se presentan los datos
de los pacientes. Este estudio se efectuó con la aprobación del
Comité de Ética Institucional apropiado, ejecutándose de acuerdo con
las normas éticas dispuestas en la Declaración de Helsinki de 1989.
Antes de la intervención quirúrgica, se expusieron a los pacientes
las posibles ventajas y riesgos del presente tratamiento,
obteniéndose el consentimiento informado de todos los pacientes. La
intervención consistió en una vitrectomía de la pars plana y
de tres orificios, provocándose un desprendimiento vítreo posterior
por aspiración con una cuchilla de vitrectomía, utilizándose
triamcinorona. Se disolvieron veinte miligramos de ABG (Azul
brillante G 250; Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.)
en 10 ml de solución de riego intraocular (OPEGUARD(marca
registrada)-MA, Senjyu Pharmaceutical Co., Ltd.,
Osaka, Japón), esterilizándose con un filtro de jeringa
(Minisart(marca registrada) Sartorius AG, Goettingen,
Alemania). La concentración final de ABG fue de 0,25 mg/ml. A
continuación, se inyectó lentamente la solución preparada de ABG
(289 mOsm, pH = 7,44) en la cavidad vítrea y se lavó inmediatamente
con una solución salina equilibrada (BSS plus(marca
registrada), Santen, Osaka, Japón). La MLI quedó coloreada con un
color azul claro. Se realizó la retirada de la MLI utilizando
fórceps de MLI (D.O.R.C.; Dutch Ophtalmic Research Center
International b.v., Holanda). No obstante, la coloración de las MERS
no pudo confirmarse en esta
concentración.
concentración.
Los exámenes postoperatorios incluyeron
microscopía con lámpara de hendidura, oftalmoscopia, mejor agudeza
visual corregida (MAVC) y presión intraocular. Se evaluó el campo
visual con el Analizador de Campo de Humphrey II (Humphrey Systems,
Dublín, California, EE.UU.) al cabo de 2 meses.
El procedimiento quirúrgico se completó
satisfactoriamente. En todos los casos se recuperó la agudeza
visual. Ninguno de los pacientes presentó una elevación de la
presión intraocular. No se observó ninguna reducción visible de la
intensidad ni defecto en el campo visual. Dentro del período de
observación no se observaron otros efectos perjudiciales debidos al
ABG. (Tabla 2).
Los inventores han continuado investigando el
caso clínico, y obtuvieron los resultados siguientes.
Entre agosto y noviembre de 2004 se realizó
vitrectomía con retirada de las membranas, con el uso de la
solución colorante ABG, a veinte ojos de 20 pacientes consecutivos
que presentaban orificio macular (OM: diez ojos de 10 pacientes; 5
hombres y 5 mujeres) o con membrana epirretinal (MER: diez ojos de
10 pacientes, 5 hombres y 5 mujeres). Se excluyó a los pacientes
con enfermedades oculares, tales como glaucoma, retinopatía
diabética, uveítis, y trastorno corneal. La edad media \pm DT de
los pacientes fue de 67 \pm 11,9 años, con un rango de 33 a 85
años. El período medio de seguimiento fue 7,3 \pm 1,0 meses. Los
detalles de los pacientes aparecen en la Tabla 3 y 4. Los exámenes
oftálmicos preoperatorios y postoperatorios incluyeron microscopía
con lámpara de hendidura, oftalmoscopía, mejor agudeza visual
corregida (MAVC) y presión intraocular (PIO). El cierre del OM y la
medición del espesor de la fóvea (casos de MER) se determinó
mediante tomografía de coherencia óptica (OCT3: Humphrey
Instruments, San Leandro, CA, EE.UU.). Se calculó el espesor de la
fóvea a partir de un total de 4 escáneres.
Se enviaron muestras extraídas de 4 ojos (2 ojos
de pacientes de OM y 2 ojos de pacientes de MER) para microscopía
electrónica de transmisión, a fin de verificar la presencia de la
MLI. Las muestras fueron posteriormente fijadas en el tampón de
acetato de veronal en tetróxido de osmio (2%), se deshidrataron en
etanol y agua, y se empaparon en Epon. De los bloques se cortaron
secciones ultrafinas, que se montaron en rejillas de cobre. Se
observaron las muestras con un microscopio electrónico JEM 100CX
(JEOL, Tokio).
Este estudio se efectuó con la aprobación del
Comité de Ética Institucional apropiado, ejecutándose de acuerdo
con las normas éticas dispuestas en la Declaración de Helsinki de
1989. Antes de la intervención quirúrgica, se expusieron a los
pacientes las posibles ventajas y riesgos del presente tratamiento,
obteniéndose el consentimiento informado de todos los
pacientes.
Cuando fue preciso se efectuó la
facoemulsificación estándar. La intervención consistió en una
vitrectomía de la pars plana y de tres orificios, con
inducción de un desprendimiento vítreo posterior (DVP) por
aspiración con una cuchilla de vitrectomía, utilizándose una
inyección de triamcinorona-acetomida
(Kenakolt-A® Bristol Phramaceuticals KK, Tokio,
Japón) en la medida necesaria. Se disolvió ABG (Azul brillante G
250; Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) en solución
de riego intraocular (OPEGUARD®-MA, Senjyu Pharmaceutical Co.,
Ltd., Osaka, Japón). Se esterilizó la solución con un filtro de
jeringa de 0,22 pm. La concentración final de ABG fue de 0,25 mg/ml
(289 mOsm, pH = 7,44). A continuación, se inyectó lentamente la
solución preparada de ABG (0,5 ml) en la cavidad vítrea (Fig. 6A) y
se lavó inmediatamente con una solución salina equilibrada (BSS
plus(marca registrada), Santen, Osaka, Japón). En los casos
de OM, la MLI quedó coloreada instantáneamente con un color azul
brillante. Se realizó la retirada de la MLI utilizando fórceps de
MLI (Fig. 6B, C). Después de la retirada de la MLI, fue claramente
visible (Fig. 6D) la diferencia en el color de la superficie
retiniana entre la zona de la cual se había retirado la MLI y el
área circundante. No obstante, en los casos de MER, la coloración
de la MER no pudo confirmarse a esta concentración (Fig. 7A).
Después de desprendimiento de la MER (Fig. 7B), se inyectó de nuevo
la solución de ABG, seguida por el riego inmediato de la cavidad
vítrea. La MLI de la zona donde se había retirado la MLI se coloreó
bien con ABG (Fig. 7C). Sin embargo, no se coloreó la zona en la
que quedaban restos de MER y del humor vítreo posterior. La MLI
coloreada pudo retirarse fácilmente con los restos no coloreados de
MER y de humor vítreo posterior (Fig. 7D).
Por último, se insertaron en todos los casos
lentes intraoculares. En los casos de OM, se efectuó el intercambio
fluido-gas, sustituyéndose con gas de hexafluoruro
de azufre al 15%. Se aconsejó a los pacientes que mantuvieran
durante una semana una postura con la cara hacia abajo.
Durante la intervención, se retiraron
satisfactoriamente de los 20 ojos la MLI incluida la MER. Los
exámenes en microscopia electrónico de transmisión confirmaron la
presencia de la MLI en todas las muestras procesadas (n = 4) (Fig.
8). Postoperatoriamente, hacia el día 14, no se observó, por
microscopía de lámpara de hendidura y exámenes oftalmoscópicos,
ninguna toxicidad grave provocada por el inyectado de ABG, tal como
edema corneal, grave edema retiniano grave o grave inflamación
intraocular como por ejemplo endoftalmitis.
Todos los casos de OM se cerraron del todo
anatómicamente con exámenes tanto oftalmoscópicos como con OCT. La
MAVC media preoperatoria fue de 20/100 (rango;
20/200-20/50). La MAVC medida postoperatoria fue de
20/32 (rango; 20/200-20/20). La agudeza visual
mejoró en 9 ojos (90%) en 2 o más líneas de Snellen y no se modificó
en un ojo. En dos casos, las complicaciones incluyeron
desprendimientos retinianos periféricos iatrogénicos, que fueron
tratados intraoperatoriamente por fotocoagulación endolaser. Sólo
un caso de OM presentó una elevación de la PIO (26 mmHg) al cabo de
6 meses y siendo tratada con latanoprost. (Tabla 3).
En los casos de intervención de la MER, el
espesor medio de la fóvea de la retina, medido con OCT, disminuyó
454,7 \pm 141,3 \mum (preoperatoriamente) a 249,4 \pm 71,3
\pm (postoperatoriamente). La MAVC postoperatoria
(20/100-20/12,5; media: 20/32) fue mejor que la MAVC
preoperatoria (20/100-20/40; media: 20/50) en los
casos de MER (Tabla 4). Ocho pacientes (80%) consiguieron una
mejora de 2 o más líneas en la tabla de Snellen, mientras que la
MAVC permaneció igual o mejoró en 1 línea en los otros dos
pacientes. La única complicación fue la protracción de la
hemorragia vítrea en un caso, que fue absorbida después de
observación. En todos los casos, durante el período de seguimiento,
no se observó ningún otro efecto secundario, tal como atrofia del
epitelio del pigmento retiniano (EPR).
\newpage
Ejemplo
4
Se evaluó la capacidad colorante capsular del
ABG en ojos de cerdo con el uso de concentraciones graduadas del
colorante.
Los ojos de cerdo se obtuvieron de un matadero
local, y se transportaron al laboratorio en hielo. Se cortaron
cuidadosamente los músculos extraoculares y otros tejidos
conectivos, colocándose los ojos se colocaron en el quirófano. Se
preparó la solución de ABG utilizándose el procedimiento siguiente.
Se disolvieron veinte miligramos de ABG (Azul brillante G 250;
Signa-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) en 10 ml de
solución de riego intraocular (OPEGUARD(marca
registrada)-MA, Senjyu Pharmaceutical Co., Ltd.,
Osaka, Japón), esterilizándose con un filtro de jeringa (Minisart.
Sartorius AG, Goettingen, Alemania). Bajo el microscopio quirúrgico,
se examinó la coloración capsular por ABG del modo siguiente. Se
entró en la cámara anterior a través de la cornea transparente con
una aguja de calibre 26 montada en una jeringa. Se inyectó ABG
sobre la zona capsular anterior a través de una aguja calibre 26
introducida a través del mismo punto de entrada (10, 1, 0,5, 0,25,
0,1 y 0,01 mg/ml). Se regó inmediatamente la cámara anterior con
una solución salina equilibrada mejorada (BSS plus(marca
registrada), Santen, Osaka, Japón) lavándose fácilmente el exceso
de colorante.
Para profundizar en la cámara anterior, se
inyectó hialuronato sódico al 1% (Healon®, Pharmacia, Upsala,
Suecia). Se inició un CCC preparándose un pequeño colgajo capsular
anterior de forma triangular con una aguja desechable doblada de
calibre 26, montada sobre una jeringa viscoelástica. Se completó la
CCC utilizando quistótomo o fórceps de capsulorrexia.
El colorante coloreó de forma homogénea la
cápsula anterior y, bajo el microscopio quirúrgico, se pudo
observar claramente el borde de la CCC. La coloración se profundizó
a medida que se aumentó la concentración del colorante (0,25 mg/ml a
1 mg/ml, Fig. 9), comprobándose que la concentración mínima
necesaria para producir una coloración de calidad excelente con una
clara visualización era de 0,25 mg/ml (Fig. 9, arriba a la
derecha). A 0,1 mg/ml y 0,01 mg/ml, la coloración capsular era
oscura, y no pudo comprobarse ventaja alguna en el uso del
colorante. (Fig. 9, en medio a la izquierda y abajo a la
izquierda). El orificio lateral se coloreó igualmente con la
inyección de la cámara anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas ratas marrones de Noruega (Kyudo, Fukuoka,
Japón), de 8 semanas después del nacimiento, se estudiaron del
siguiente modo. Se anestesió a las ratas con una inyección
intraperitoneal de pentobarbital y se dilataron sus pupilas con la
aplicación tópica de tropicamida al 1% y clorhidrato de fenilefrina
al 2,5%. Se entró en la cámara anterior a través de la cornea
transparente con una aguja de calibre 30 montada en una jeringa. A
continuación se realizó una única inyección en la cámara anterior
con cada colorante, ABG (10, 1, 05, 0,25, 0,1 y 0,01 mg/ml), VIC (5
mg/ml, azul tripano (1 mg/ml) y la solución OPEGUARD de control
(n=6 para cada colorante, total 54 ojos).
La osmolalidad media y pH de cada solución
aparecen en la Tabla 1.
El colorante permaneció en la cámara anterior y
fue seguido por examen biomicroscópico durante 2 meses. Los ojos
fueron enucleados a las 2 semanas y a los 2 meses después de la
operación. Se analizaron los ojos por microscopía óptica,
microscopía electrónica de transmisión y microscopía electrónica de
exploración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fijaron los ojos en paraformaldehído al 4% y
se cortaron por la mitad, se empaparon en parafina, se
desparafinizaron en xileno, se rehidrataron en etanol, y se lavaron
en solución salina tamponada de fosfato (SPF). Las secciones de 4
\mum de espesor se colorearon con hematoxilina y eosina y se
observaron al microscopio óptico.
Las secciones de la cornea coloreadas con
hematoxilina y eosina no mostraron cambios significativos en ninguno
de los grupos (ABG, VIC, AT; Fig. 10). En el examen al microscopio
óptico, no se observaron signos de pérdida de células endoteliales
ni de edema corneal. Las capas laminares de colágeno, las capas
estromales y la capa de células epiteliales quedaban perfectamente
preservadas. En ninguna de las capas corneales se observó
infiltración de células inflamatorias.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el uso del Etiquetado del Extremo de la
Entalla del Terminal TdT-dUTO (TUNEL) se detectó la
muerte de células apoptóticas. Se obtuvieron secciones de cuatro
micras de espesor a partir de las muestras fijadas en
paraformaldehído al 4% y empapadas en parafina. La coloración TUNEL
se realizó con el Kit de Detección Directa de Apoptosis in
situ con Fluoresceína ApopTag® (Intergen Company, Nueva York,
EE.UU.) siguiéndose el protocolo del fabricante. Las secciones se
colorearon simultáneamente con
yoduro de propidio (Molecular Probes, Eugene,
OR, EE.UU.), permitiéndose así la observación de los núcleos de las
células a través de un microscopio de fluorescencia (Olympus,
Tokio). Se seleccionaron y observaron aleatoriamente diez secciones
de cada muestra de ojo (n=3). Los resultados se presentan como
medias \pm desviaciones típicas.
En todos los grupos, se observó a veces la
muerte de células apoptóticas del epitelio corneal debido al
recambio fisiológico (Fig. 11, cabeza de flechas). En los grupos
con ABG, no se observó coloración tipo TUNEL en las células del
estroma corneal, el endotelio, el cuerpo ciliar y las células del
cristalino (Fig. 11). En el grupo con VIC, no se detectó ninguna
muerte visible de células apoptóticas en la concentración de 5
mg/ml. En el grupo con AT, se detectó muerte de células apoptóticas
del endotelio corneal en el 2% del total de dichas células. Las
restantes células del grupo de AT no sufrieron ninguna muerte de
células apoptóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ojos fueron enucleados y se fijaron los
segmentos anteriores en paraformaldehído al 1%, y glutaraldehído al
1%, en PBS. Las muestras fueron posteriormente fijadas en el tampón
de acetato de veronal en tetróxido de osmio (2%), se deshidrataron
en etanol y agua, y se empaparon en Epon. De los bloques se
cortaron secciones ultrafinas, que se montaron en rejillas de
cobre. Se observaron las muestras con un microscopio electrónico
JEM 100CX (JEOL, Tokio).
En el grupo de ABG, se conservó bien la
ultraestructura de las células corneales y la matriz celular de
colágeno en la concentración más elevada de 10 mg/ml (Fig. 12,
izquierda). En el endotelio corneal, las membranas celulares,
núcleos bien definidos, y oganelle citoplásmico no mostraron
cambios degenerativos (Fig. 12, abajo a la izquierda). El grupo de
VIC mostró una estructura bien conservada de las células
endoteliales, pero algunas células endoteliales mostraron signos de
tumefacción mitocondrial (Fig. 12, a la mitad, flechas). El grupo
de AT mostró la formación de quistes en la capa de células
endoteliales debida a la separación entre las células (Fig. 12, a
la derecha), y degeneración ocasional del endotelio corneal de
manera irregular (Fig. 12, abajo a la derecha).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ojos fueron enucleados y se fijaron los
segmentos anteriores en paraformaldehído al 1%, y glutaraldehído al
1%, en PBS. Las muestras fueron posteriormente fijadas en el tampón
de acetato de veronal en tetróxido de osmio (2%), y se
deshidrataron en etanol y agua. Se saturaron las muestras en
alcohol t-butilo, y se efectuó en secado en punto
crítico (Eiko, Tokio). A continuación, las muestras se colocaron en
trozos por medio de lengüetas de carbono adherentes y pulverizadas
con Au de 20 nm de espesor mediante revestimiento de plasma de
argón (Eiko). A continuación, se estudió la superficie endotelial
de la cornea con un microscopio electrónico de exploración JEM 840
(JEOL).
En las corneas expuestas al ABG, el MEE mostró
células normales similares a las de los controles. La imagen de MEE
mostró una lámina de células endoteliales hexagonales normales con
bordes intactos, sin tumefacción endotelial (Fig. 13, arriba). El
grupo de VIC mostró también celulares en la capa endotelial de la
cornea. Ocasionalmente, se observaron células endoteliales
degeneradas liberadas de su emplazamiento original. En el grupo de
AT se reconoció una contracción celular endotelial en la zona
central de la cornea. La contracción celular llevó a una pérdida
celular endotelial en una forma esporádica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Como se ha indicado anteriormente, los
inventores informaron los resultados de un estudio preclínico con
un nuevo colorante, el Azul Brillante G (ABG), que coloreó la
cápsula anterior a concentraciones inferiores y con una toxicidad
mínima. Este ejemplo demuestra la eficacia del ABG en la coloración
capsular de un ojo humano.
En agosto de 2004, una mujer de 70 años de edad
con una catarata blanca madura recibió una CCC asistida por ABG y
la facoemulsificación con implante de lentes intraoculares
(LIO).
La paciente no tenía otras enfermedades oculares
tales como glaucoma, uveítis o trastornos oculares. Se disolvió
Coomassie® BBG 250 (Sigma-Aldrich, St. Louis,
EE.UU.) en solución de riego intraocular (OPEGUARD®-MA, Senjyu
Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japón), en una dosis de 0,25 mg/ml,
esterilizándose con un filtro de jeringa. Se inyectó lentamente la
solución preparada de ABG en la cámara anterior y a continuación se
lavó de inmediato con solución salina equilibrada (SSE).
Según la Fig. 14, la cápsula anterior azul
brillante era claramente visible durante la producción quirúrgica
de la CCC. La solución de ABG (0,25 mg/ml) se inyectó en la cámara
anterior del ojo, regándose inmediatamente. (A) La flecha indica la
CCC creada en el ojo, que tenía una catarata blanca. (B) Las
cabezas de flecha muestran los márgenes de la CCC completada. (C)
Después de la facoemulsificación y aspiración, se insertó una LIO.
El día siguiente, ni se observó ninguna toxicidad grave (tal como
edema corneal, grave inflamación ni presión intraocular elevada). La
agudeza visual de la paciente mejoró en la percepción a la luz (PL)
a 20/20 y se observó una pérdida mínima de células endoteliales de
la cornea del 0,8% después de 2 meses.
Este estudio se efectuó con la aprobación del
Consejo de Revisión Interna de nuestra institución, ejecutándose de
acuerdo con las normas éticas dispuestas en la Declaración de
Helsinki de 1989. Antes de la intervención quirúrgica, se
expusieron a la paciente las posibles ventajas y riesgos del
presente tratamiento, obteniéndose el consentimiento informado de
la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citada por el
solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Incluso aunque se ha
prestado mucha atención en la compilación de las referencias, no
pueden excluirse errores u omisiones y la EPO rechaza cualquier
responsabilidad a este respecto.
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[0004]
Claims (16)
1. Composición colorante para colorear una
membrana oftálmica cuando se procede a la retirada de la membrana
oftálmica, caracterizada porque la composición colorante
comprende, como componente primario, Azul Brillante G (ABG), una
sal farmacéuticamente aceptable de ABG o un hidrato de Azul
Brillante G (ABG).
2. Composición colorante según la reivindicación
1, caracterizada porque la membrana oftálmica es la membrana
limitadora interna (MLI).
3. Composición colorante según la reivindicación
1, caracterizada porque la membrana oftálmica es la cápsula
anterior.
4. Composición colorante según la reivindicación
1, caracterizada porque dicha composición colorante tiene
una concentración de ABG, una sal farmacéuticamente aceptable de
ABG o un hidrato de ABG, dentro del rango de 0,1 a 1,0 mg/ml.
5. Composición colorante según la reivindicación
1, caracterizada porque dicha composición colorante tiene
una concentración de ABG, una sal farmacéuticamente aceptable de
ABG o un hidrato de ABG, dentro del rango de 0,1 a 0,25 mg/ml.
6. Composición colorante según la reivindicación
1, caracterizada dicha composición colorante tiene una
presión osmótica de aproximadamente 298 mOSM, que es la misma que
la solución salina.
7. Uso de una composición que comprende ABG, una
sal farmacéuticamente aceptable de ABG o un hidrato de ABG como
componente de ABG para la preparación de una composición colorante
principal que se utilizará en un procedimiento de coloración y
retirada de una membrana oftálmica por la coloración de la membrana
oftálmica con el uso de una concentración preestablecida de la
composición colorante, y desprender la membrana coloreada.
8. Uso según la reivindicación 7,
caracterizado porque la concentración preestablecida de la
composición colorante es de 0,1 a 1,0 mg/ml de ABG, una sal
farmacéuticamente aceptable de ABG o un hidrato de ABG.
9. Uso según la reivindicación 7,
caracterizado porque la concentración preestablecida de la
composición colorante se encuentra en el rango de 0,1 a 0,25 mg/ml
de ABG, una sal farmacéuticamente aceptable de ABG o un hidrato de
ABG.
10. Uso de ABG, una sal farmacéuticamente
aceptable de ABG o un hidrato de Azul Brillante G en la fabricación
de una composición colorante para el tratamiento de una enfermedad
oftálmica, caracterizado porque la composición colorante se
utiliza para colorear una membrana oftálmica.
11. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque dicho tratamiento incluye la coloración
y retirada de la membrana limitadora interna (MLI).
12. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque dicho tratamiento incluye la coloración
y retirada de la cápsula anterior.
13. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque, durante dicho tratamiento, la citada
composición colorante tiene una concentración dentro del rango de
0,1 a 1,0 mg/ml de ABG, una sal farmacéuticamente aceptable de ABG
o un hidrato de ABG.
14. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque, durante dicho tratamiento, la citada
composición colorante tiene una concentración dentro del rango de
0,1 a 0,25 mg/ml de ABG, una sal farmacéuticamente aceptable de ABG
o un hidrato de ABG.
15. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque, durante dicho tratamiento, la citada
composición colorante tiene una presión osmótica de aproximadamente
298 mOsm.
16. Uso de Azul Brillante G (ABG), una sal
farmacéuticamente aceptable de ABG o un hidrato de Azul Brillante G
en la preparación de un coadyuvante para uso en cirugía
oftálmica.
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