ITUB20150864A1 - Molecola colorante e composizioni coloranti, in particolare per uso in metodi chirurgici di chirurgia oftalmica e per la colorazione di proteine - Google Patents
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Description
MOLECOLA COLORANTE E COMPOSIZIONI COLORANTI, IN PARTICOLARE PER USO IN METODI CHIRURGICI DI CHIRURGIA OFTALMICA E PER LA COLORAZIONE DI PROTEINE
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una nuova molecola colorante, in particolare una molecola utilizzabile per la realizzazione di composizioni per la colorazione della membrana limitante interna (nel seguito ILM) di un occhio, nonch? di almeno alcune tipologie di membrane epiretiniche, allo scopo di creare una distinzione di colore tra le membrane cos? colorate (ILM ed epiretiniche) e il tessuto sottostante nel corso di interventi di chirurgia vitreoretinica che prevedano l?asportazione di tali membrane. Ulteriormente, la molecola della presente invenzione ? destinata ad essere utilizzata per la colorazione di catene proteiche. Non ultimo, la presente invenzione riguarda anche composizioni coloranti comprendenti un nuovo agente addensante. Come diffusamente descritto nei documenti anteriori EP 1819366 A1 o US 2011/190728 A1, in molte patologie dell?occhio un intervento chirurgico di vitrectomia ? spesso la soluzione pi? indicata. Nel corso dell?intervento, tuttavia, ? importante ridurre al minimo il rischio di causare danni alla retina. Una delle misure precauzionali generalmente riconosciute, consiste nel rimuovere nel corso dell?intervento la ILM, ed eventualmente qualsiasi membrana epiretinica formatasi su di essa, allo scopo di evitare che tensioni intravitreali possano interessare la macula. In accordo con la tecnica chirurgica oggi generalmente utilizzata, la rimozione della ILM e delle eventuali membrane epiretiniche viene effettuata staccandole meccanicamente per mezzo di una apposita pinza, con un?azione meccanica detta peeling. Conseguentemente, per?, ci si ? resi conto di come per il chirurgo sia fondamentale essere in grado di distinguere il pi? possibile la membrana da rimuovere rispetto alla sottostante retina.
A questo scopo negli anni, analogamente a quanto previsto per altri interventi di chirurgia oftalmica, ? stato proposto di colorare selettivamente le membrane da rimuovere in modo tale da poterle distinguere visivamente dalle strutture sottostanti non colorate. Ovviamente, per poter essere utilizzato a tale scopo un colorante deve soddisfare molti requisiti, in particolare da un lato deve essere biocompatibile e non citotossico n? dannoso per le cellule, dall?altro lato deve preferibilmente essere solubile in acqua, deve essere in grado di colorare le membrane in modo pi? selettivo possibile e deve essere facilmente dilavabile dall?occhio a fine intervento ma non troppo nel corso dell?intervento stesso.
Molti coloranti sono stati proposti a questo scopo ma fino ad ora nessuno si ? rivelato del tutto soddisfacente. Tra i primi coloranti utilizzati si ricordano l?Indocianina Verde (nel seguito ICG ? si veda ad esempio ?Indocyanine green-assisted peeling of the retinal internal limiting membrane?. Burk SE et al. Ophthalmology. 2000;107:2010-2014) ed il Trypan Blue (nel seguito TB). I vari studi effettuati, tuttavia, hanno evidenziato alcuni problemi per quanto riguarda tali coloranti. In particolare, mentre per l?ICG sono emersi molti dubbi circa la sicurezza del suo utilizzo all?interno dell?occhio umano, per quanto riguarda il TP esso si ? rivelato in grado di colorare in modo soddisfacente le membrane epiretiniche ma non la ILM.
Successivamente sono stati proposti anche altri coloranti, quali Brilliant Blue G (nel seguito BBG), Brilliant Blue R (nel seguito BBR), Patent Blue V o Metilene Blu.
In particolare, in EP 1819366 A1 ? stato proposto l?utilizzo di BBG, di un sale di BBG o di un idrato di BBG.
Il BBG ? indicato come colorante preferito anche in US 2011/190728 A1, documento peraltro pi? generico che descrive l?utilizzo di almeno un colorante scelto tra trifenilmetano coloranti e/o gli azo coloranti e/o i cianina coloranti e/o coloranti naturali quali gli antociani e le antocianidine.
Tale documento, ulteriormente prevede che la composizione colorata a base del colorante prescelto, venga realizzata con una densit? compresa tra 1.01 g/cm3 e 1.5 g/cm3, preferibilmente tra 1.01 g/cm3 e 1.3 g/cm3, allo scopo di garantire un maggiore contatto nel corso dell?intervento tra la soluzione colorata e la ILM e superare problemi di dilavamento eccessivo del colorante che si possono avere con coloranti aventi densit? inferiori, a causa dell?irrigazione continua cui ? sottoposto l?occhio nel corso dell?intervento stesso.
In accordo con tale documento, l?agente utilizzato per aumentare la densit? ? scelto tra acqua pesante, D2O, disaccaridi o polisaccaridi, o polimeri neutri quali polieteri, alcool polivinilico, poliesteri, copolimeri dell?acido poliacrilico e polivinil-pirrolidone.
Tra tutti i vari coloranti sopra indicati, comunque, l?unico che ha successivamente avuto una diffusione commerciale per la colorazione della ILM, ? il BBG (che non a caso ? indicato come colorante preferito nei documenti brevettuali citati).
Come anticipato, tuttavia, anche tale colorante non si ? rivelato esente da inconvenienti.
In particolare, il BBG ? un colorante difficile da sintetizzare con livelli elevati di purezza, almeno ad un costo ragionevole da un punto di vista commerciale.
Il BBG viene infatti ottenuto per modificazione del BBR e le rese della reazione di sintesi sono limitate, cosicch? il prodotto disponibile commercialmente presenta molto spesso una purezza anche ben inferiore al 90% dichiarato (test svolti dalla richiedente hanno evidenziato anche purezze pari all?80%) con elevata contaminazione da parte del BBR di partenza. Facile intuire che senza un preventivo esame di purezza pu? risultare difficile produrre composizioni coloranti a base di BBG aventi un contenuto di colorante controllato con precisione.
Allo stesso tempo, cercare di purificare ulteriormente il BBG risulta non vantaggioso dal punto di vista del rapporto costo-beneficio.
Come gi? anticipato, un secondo campo di applicazione della presente invenzione ? la generica colorazione di proteine e catene proteiche.
Anche in questo settore, infatti, uno dei coloranti oggi maggiormente utilizzati ? il BBG.
La richiedente si ? per? resa conto che pur essendo in grado di colorare le proteine, il BBG presenta in realt? una relativamente bassa affinit? con le proteine stesse. Test effettuati sulla proteina comunemente accettata come proteina di riferimento (l?albumina dell?uovo), mediante analisi di dicro ismo circolare (nel seguito CD), hanno infatti evidenziato per BBG-250 in tampone fosfato (1.22 mg/ml in D2O) una costante di associazione Kass tra BBG ed albumina pari a circa 38000 M-1. Si noti che per l?effettuazione dei test, il BBG commerciale che aveva purezza pari a 80% ? stato preventivamente purificato e che gli spettri CD sono stati misurati nella regione 800-400 nm in presenza di quantit? crescenti di albumina. In modo di per s? noto il valore della costante di associazione ? stato infine determinato utilizzando una regressione non lineare dell?intensit? del segnale dicroico espresso in ?A (AL-AR, dove AL ed AR indicano rispettivamente l?assorbanza della composizione per quanto riguarda le due onde di luce polarizzate circolarmente utilizzate per l?indagine di dicroismo circolare, l?onda sinistra e l?onda destra) in funzione della concentrazione di albumina di bianco d?uovo, utilizzata come riferimento. Sul punto si veda comunque anche quanto riportato nel successivo capitolo relativo ai Test di Affinit?.
In questo contesto il compito tecnico alla base della presente invenzione ? mettere a punto una nuova molecola colorante che ponga rimedio agli inconvenienti citati.
? in particolare compito tecnico della presente invenzione mettere a punto una nuova molecola colorante che presenti una nettamente maggiore affinit? con le proteine e le catene proteiche rispetto al BBG.
? ancora compito tecnico della presente invenzione mettere a punto una composizione colorante che possa essere utilizzata per colorare la ILM. Non ultimo ? compito tecnico della presente invenzione mettere a punto una composizione colorante che possa essere utilizzata in metodi per il trattamento del corpo umano o animale.
Il compito tecnico e gli scopi indicati sono sostanzialmente raggiunti da una molecola colorante e da una composizione colorante che la comprende, in accordo con quanto descritto nelle unite rivendicazioni.
Ulteriori caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione appariranno maggiormente evidenti dalla descrizione dettagliata di alcune forme di esecuzione preferite, ma non esclusive, della presente invenzione illustrate nel seguito.
Per quanto riguarda la molecola colorante, quella messa a punto nel contesto della presente invenzione ha la seguente struttura:
dove R2 ? costituito da un gruppo SO -3 (che forma un sale interno con il vicino atomo di azoto N caricato positivamente) ed R1 da un gruppo SO legato con legame ionico ad un atomo di idrogeno H o ad altro atomo (ad esempio, sodio Na) o ad un gruppo ammonio NH4. Il nome chimico (in inglese) proposto dalla richiedente per questa nuova molecola ? N-[4-[[4-[N-(4-Ethoxyphenyl),N-methyl]amino-phenyl][4-[ethyl[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylene]-3-methyl-2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethyl-3-sulfobenzenemethanaminium inner salt monosodium salt.
Come si pu? vedere, la molecola oggetto della presente invenzione si differenzia da una molecola di BBG (si noti che nel contesto della presente invenzione con tale nome si intende indicare anche qualsiasi prodotto identificato da sinonimi, quali blu di Coomassie?, Acid Blue 90, C. I. 42655 e Brilliant Blue G 250, tutti univocamente identificati da numero CAS: 6104-58-1) per la presenza di un gruppo metile anzich? un atomo di idrogeno legato all?atomo di azoto amminico disostituito.
Per quanto riguarda la sintesi della nuova molecola oggetto della presente invenzione, essa pu? essere ottenuta mediante una reazione di metilazione all?azoto amminico disostituito di un prodotto di partenza costituito da Brilliant Blue G250,. In particolare, la reazione risulta particolarmente vantaggiosa a partire da BBG commerciale che, come detto, presenta generalmente una purezza inferiore/pari al 90% ed ? contaminato da BBR. Alla fine della reazione di metilazione e della successiva purificazione, infatti, la contaminazione di BBR ? stata eliminata.
Da un punto di vista generale, il metodo di sintesi prevede di far reagire in una o pi? fasi successive, il prodotto di partenza con sodio idrossido e iodometano, variando eventualmente di volta in volta le proporzioni reciproche.
ESEMPIO
Verr? ora descritto un esempio preferito di produzione; ovviamente le quantit? indicate potrebbero essere variate mantenendo le proporzioni tra le varie sostanze, fermo restando che il processo descritto porta alla produzione di circa 1.6 g di molecola secondo la presente invenzione, e che la produzione di quantitativi decisamente superiori potrebbe richiedere alcune modifiche del processo per la sua ottimizzazione industriale.
Materiali e Metodi
Reagenti
Quantit? per un lotto da Reagenti Produttore
circa 1.6 grammi Brilliant Blue G ?pure (BBG) (Sigma Aldrich, B0770) 2g Metanolo RP grade (Sigma Aldrich) 50 ml Sodio idrossido (Sigma Aldrich) 0.20 g Iodometano (Sigma Aldrich) 2.20 ml Acetonitrile HPLC grade (Sigma Aldrich) 4 l Acqua deionizzata 10 l acido trifluoroacetico UV (Sigma Aldrich) 40 ml grade
Metanolo HPLC grade (Sigma Aldrich) 4 l
Per quanto riguarda il BBG di partenza, nelle prove effettuate si trattava di prodotto con purezza pari a 91% (Certificato di analisi B0770, Sigma Aldrich, lottoSLBJ8621V). A conferma di ci? in figura 1 se ne riporta lo spettro di massa che evidenzia almeno due picchi significativi.
Materiali
Quantit? per un lotto da Materiali
circa 1.6 grammi Pallone di vetro 250 ml 1
Pipette 5 ml 2 Palloni per liofilizzazione 500 ml, 1 l 5 Provette vetro 16*160 mm lavate in lavavetreria 300
Vials per autocampionatore HPLC 200 ul 600 Strumenti
Strumento Produttore
Medium Pressure Liquid Chromatography
Colonna REVELERIS C18 WP 40gr Grace
Liofilizzatore Freeze Dryer Modulyo Edwards HPLC Shimadzu LC10
Agitatore magnetico Ika
Evaporatore rotante Buchi
Descrizione reazione
A 1.7 g di BBG disciolti in metanolo-acqua 1/1 v:v sono aggiunti 0.12 g di sodio idrossido e 0.92 ml di iodometano. La reazione ? lasciata decorrere circa due giorni a temperatura ambiente. La miscela di reazione pu? quindi essere controllata tramite HPLC per evidenziare come sia presente ancora del prodotto di partenza. I risultati dell?esame HPLC per le prove effettuate sono riportati in figura 3 ed evidenziano tre picchi che corrispondono, da sinistra a destra, il primo al solvente utilizzato nella reazione, il secondo alla molecola di BBG ed il terzo alla nuova molecola oggetto della presente invenzione. A quel punto si aggiungono altri 0.92 ml di iodometano e 0.08 g di sodio idrossido. Dopo 7 giorni si aggiungono altri 0.36 ml di iodometano e 0.08 g di sodio idrossido e si lascia terminare la reazione per altri due giorni.
La miscela di reazione ? poi concentrata a piccolo volume e il grezzo viene purificato tramite Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC) utilizzando una colonna REVELERIS C18 WP 40gr (Grace) eluita con una miscela di acqua (A) e 90% v/v acetonitrile in acqua (B) contenenti entrambe 0.05% v/v di acido trifluoroacetico.
Dopo la purificazione le frazioni contenenti il prodotto desiderato sono riunite, concentrate a piccolo volume e liofilizzate. Il solido disciolto in sodio idrossido 0.01 ? quindi purificato utilizzando la stessa colonna con una miscela di acqua (A) ? metanolo (B). Condizioni MPLC: flusso 20 ml/min, detection 254 nm, gradiente 40% (B) per 5 min, 40-60% (B) in 40 min, 60-95% (B) in 2 min, 95% (B) 2 min, 95-40% (B) 2 min.
La figura 4 mostra il risultato del controllo HPLC sul prodotto finale purificato e liofilizzato ottenuto nelle prove effettuate, e mostra la presenza di un picco unico corrispondente alla molecola oggetto della presente invenzione. A conferma di ci? in figura 2 ? riportato lo spettro di massa ESI-MS del prodotto finale purificato.
Sempre nelle prove effettuate la purezza del prodotto finale ? stata di circa 96.6% come calcolato a partire dagli spettri HPLC, mentre la resa della reazione ? stata circa del 60% in prodotto grezzo (da 100 g di BBG-250 si sono ottenuti quindi circa 60 g della molecola della presente invenzione).
Come detto, forma poi oggetto della presente invenzione anche una composizione colorante che comprenda almeno un primo colorante la cui molecola sia la nuova molecola colorante oggetto della presente invenzione.
Preferibilmente, la composizione colorante ? una soluzione acquosa e/o presenta una matrice tampone fosfato; inoltre ? liquida almeno nell?intervallo di temperature compreso tra 0?C e 50?C.
Quantomeno per gli utilizzi nel contesto di metodi per il trattamento del corpo umano o animale, inoltre, la composizione ? inoltre vantaggiosamente sterile e biocompatibile.
Vantaggiosamente, il primo colorante ? presente in una quantit?, in peso rispetto al volume complessivo della composizione (p/v), compresa tra 0.0001% e 0.5%, preferibilmente tra 0.015% e 0.05%.
In alcune forme realizzative preferite, inoltre, la composizione colorante presenta una densit? compresa tra 1.01 g/cm3 e 1.5 g/cm3 grazie alla presenza aggiuntiva di almeno un agente per aumentarne la densit?.
L?almeno un agente per aumentare la densit? potr? essere scelto a seconda delle esigenze; ad esempio potr? essere scelto tra acqua pesante D2O, disaccaridi o polisaccaridi, o polimeri neutri quali polieteri, alcool polivinilico, poliesteri, copolimeri dell?acido poliacrilico, mannitolo e polivinil-pirrolidone. In una forma realizzativa particolarmente preferita, comunque, l?agente per aumentare la densit? ha formula bruta (C12H22O11?C3H5ClO)x, e struttura
Tale agente ? commercialmente noto con il nome Ficoll? o Polysucrose (Numero CAS: 26873-85-8), ed ? vantaggiosamente presente in una quantit?, in peso rispetto al volume complessivo della composizione (p/v), compresa tra 0.001% e 20%, preferibilmente tra 0.1% e 10%. Nel seguito quando si far? riferimento al Ficoll si intender? indicare tale agente.
Una formulazione particolarmente preferita prevede che la composizione comprenda 0,05% (p/v) della molecola oggetto della presente invenzione e 4% (p/v) Ficoll in tampone fosfato.
A seconda delle applicazioni cui ? destinata, la composizione colorante potr? poi comprendere anche altre sostanze, ed in particolare potr? comprendere inoltre almeno un secondo colorante diverso dal primo colorante. In una forma realizzativa preferita in cui la composizione colorante ? destinata ad essere utilizzata nel contesto di metodi per il trattamento del corpo umano o animale, il secondo colorante ? vantaggiosamente trypan blue.
Per quanto riguarda le altre propriet? della composizione colorante, quali viscosit? dinamica, pH, osmolalit?, ecc? di volta in volta la persona esperta del settore sar? in grado di adattarle all?utilizzo della composizione colorante; ad esempio, nel caso di utilizzo della composizione colorante nel corpo umano o animale, se necessario esse potranno essere regolate in modo tale da avvicinarsi il pi? possibile alle condizioni fisiologiche.
Per quanto riguarda i possibili utilizzi della composizione colorata, uno di quelli cui ? specificamente destinata la presente invenzione ? l?uso in metodi per il trattamento del corpo umano o animale.
Vantaggiosamente, in particolare, la composizione colorante ? destinata all?uso in un metodo chirurgico di chirurgia vitreoretinica.
Ancor pi? vantaggiosamente la composizione colorante ? utilizzabile per la colorazione della membrana limitante interna ILM e/o di membrane epiretiniche (nel seguito EPRM) in un metodo chirurgico che preveda la successiva rimozione della ILM e/o delle EPRM stesse. Si ? infatti visto che la molecola colorante oggetto della presente invenzione ? in grado di colorare selettivamente sia la ILM sia almeno alcune tipologie di EPRM (i pochi test sino ad ora effettuati per le EPRM, sebbene tutti favorevoli, non permettono di affermare con ragionevole certezza che la molecola sia effettivamente in grado di colorare tutte le possibili EPRM attualmente colorabili con il trypan blue) in modo tale che durante la fase di stacco della ILM (peeling) e delle EPRM si crei una netta distinzione visiva tra la ILM colorata e le strutture sottostanti non colorate. Per garantire la colorazione anche di tutte le possibili EPRM pu? essere quindi previsto che la composizione colorante possa comprendere anche un secondo colorante in grado di colorarle selettivamente (quale appunto il trypan blue).
Un ulteriore uso preferito della composizione colorante in accordo con la presente invenzione ? in un metodo che preveda di colorare proteine, ad esempio per rendere maggiormente visibile un tessuto cui le proteine stesse appartengono.
DATI SPERIMENTALI
Nel seguito verranno riportati alcuni dati sperimentali ottenuti a seguito di test ed esami condotti dalla richiedente.
Esame di citotossicit?
La richiedente ha eseguito vari test che hanno evidenziato come composizioni coloranti in accordo con la presente invenzione non siano citotossiche.
Qui di seguito si riportano a titolo di esempio i risultati ottenuti dai laboratori Eurofins Biolab S.r.l. di Vimodrone (MI), Italia, per tre diversi lotti di una composizione colorante comprendente lo 0,05% (p/v) di una molecola realizzata in accordo con la presente invenzione (con i gruppi R1 e R2 nella forma SO -3), 4% (p/v) Ficoll in tampone fosfato, che dimostrano come nessuno dei tre campioni fosse citotossico.
% riduzione di vitalit? grado di degenerazione cellulare lotto sterilizzazione
valore limite limite misurato citotossicit? valore
% misurato citotossicit? grado
1 autoclave
121,1?C x20' 1,6 >30 0 >2
2 autoclave
121,1?C x20' -0,42 >30 0 >2
3 autoclave
121,1?C x20' -2,77 >30 0 >2
Test di affinit?
Si tratta di test svolti dalla richiedente per comparare la molecola oggetto della presente invenzione ed il BBG-250 commerciale, per quanto riguarda l?affinit? con le proteine e le catene proteiche. La molecola realizzata in accordo con la presente invenzione utilizzata nei test, come nel caso precedente, ? una molecola ottenuta con il metodo descritto nell?Esempio, ed in cui i gruppi R1 e R2 sono entrambi nella forma SO -3.
Per quanto riguarda invece il BBG-250 commerciale, dato che la purezza di quest?ultimo composto era pari a circa il 91% (a fronte di un 80% dichiarato), prima di effettuare i test ? stato purificato fino a circa il 98%.
In particolare sono state esaminate quattro diverse composizioni coloranti in tampone fosfato: per ciascuna molecola una comprendente Ficoll (al 4% p/v) ed una comprendente acqua pesante D2O (al 13% v/v).
L?affinit? ? stata determinata tramite spettroscopia CD (dicroismo circolare); gli spettri CD sono stati misurati nella regione 800-400 nm in presenza di quantit? crescenti di albumina di bianco d?uovo che, come ? noto, per analisi di questo tipo ? comunemente ritenuta rappresentativa delle proteine in generale.
Si noti che nelle condizioni utilizzate (400-800 nm) l?albumina non assorbe e quindi non d? luogo ad alcun segnale dicroico, mentre i coloranti presentano un elevato assorbimento, ma non evidenziano alcun segnale dicroico. Al contrario, l?interazione dell?albumina con la molecola colorante (BBG-250 o secondo la presente invenzione) induce una chiralit? nel colorante che ? determinabile tramite CD. Conseguentemente, titolando il colorante con l?albumina si pu? determinarne la costante apparente di binding o costante di associazione, tramite una regressione non lineare della curva di titolazione..
I dati della spettroscopia CD relativi ad una composizione colorante comprendente la molecola oggetto della presente invenzione e Ficoll sono riportati in Figura 5 dove il numero 1 indica lo spettro dicroico della composizione colorante in assenza di proteina mentre le altre linee si riferiscono alla stessa composizione in presenza di quantit? crescenti di albumina (secondo la freccia).
Utilizzando, come detto, una regressione non lineare dell?intensit? del segnale dicroico espresso in ?A (AL-AR) in funzione della concentrazione di albumina di bianco d?uovo, si determinano i valori della costante di associazione Kass. In Figura 6 ? riportato l?andamento della regressione per quanto riguarda la composizione colorante comprendente la molecola della presente invenzione e Ficoll. Si noti che nel calcolo della costante di associazione Kass si ? tenuto conto delle diverse concentrazioni dei due coloranti; tutti i dati sono stati quindi riportati ad una base comune.
I risultati ottenuti sono i seguenti:
- Composizione colorante con BBG-250 in Ficoll 4% in tampone fosfato (sterilizzato): Kass circa 60000 M-1;
- Composizione colorante con molecola oggetto della presente invenzione in Ficoll 4% in tampone fosfato (sterilizzato): Kass circa 300000 M-1;
- Composizione colorante con BBG-250 in tampone fosfato (1.22 mg/ml in D20) (sterilizzato): Kass circa 38000 M-1;
- Composizione colorante con molecola oggetto della presente invenzione in tampone fosfato (0.58 mg/ml in D20) (sterilizzato): Kass circa 180000 M-1.
Come si pu? vedere, quindi, indipendentemente dall?agente per aumentare la densit? utilizzato, la molecola oggetto della presente invenzione ha sorprendentemente evidenziato un?affinit? per l?albumina pari a 4.7-5 volte rispetto al BBG-250 commerciale.
Si ? inoltre potuto constatare che, per entrambe le molecole coloranti, la presenza del Ficoll ha favorito (di 1.66 ? 1.58 volte) l?associazione del colorante con albumina rispetto al caso di utilizzo di acqua pesante. Sebbene la ragione di questo secondo risultato non sia al momento certa, la richiedente ipotizza che il Ficoll, oltre al ruolo di agente per aumentare la densit?, potrebbe svolgere anche il ruolo di ?crowding agent? (nel seguito CA) e favorire l?interazione dei coloranti con l?albumina dell?uovo tramite ?l?escussione del volume? e i fattori spaziali.
Recentemente, infatti, il Ficoll, insieme a PEG e destrano, ? stato studiato ed utilizzato come CA, vale a dire come agente di riempimento/di affollamento, per mimare le condizioni dell? ambiente intracellulare che ? caratterizzato da un ambiente estremamente affollato, con una quantit? limitata di acqua libera e la quasi totale mancanza di spazio. Numerosi studi sui CA (vedasi ad esempio ?What Macromolecular Crowding Can Do to a Protein?, Irina M. Kuznetsova 1,2, Konstantin K. Turoverov 1,2 and Vladimir N. Uversky 1,3,4,5) hanno infatti mostrato che ?l?affollamento macromolecolare? creato dai CA potrebbe influenzare la struttura delle proteine, il ripiegamento, la forma, la conformazione, la stabilit?, il legame con le piccole molecole, l?attivit? enzimatica, le interazioni proteina-proteina, le interazioni proteina-acido nucleico, e l?aggregazione patologica.
Il meccanismo principale degli CA ? di agire per ?l?esclusione di volume?, che corrisponde a una occupazione spaziale e quindi allo spostamento delle altre molecole nei residui spazi liberi . Questo localmente pu? risultare nell?aumento di concentrazione o nelle modifiche molecolari steriche dei soluti. Questo potrebbe quindi avvenire anche nel caso in esame.
Alla luce dei risultati sperimentali appena discussi circa i sorprendenti vantaggi che si possono avere utilizzando Ficoll come agente per aumentare la densit?, forma infine oggetto della presente invenzione anche una composizione colorante per uso in un metodo chirurgico di chirurgia oftalmica che abbia densit? superiore a 1.01 g/cm3 e che comprenda Ficoll come agente per aumentarne la densit?. Tale composizione potr? essere utilizzata per tutti gli usi sopra indicati con riferimento alla nuova molecola colorante oggetto della presente invenzione.
Vantaggiosamente, questa composizione colorante pu? comprendere almeno un colorante scelto nel gruppo comprendente trifenilmetano coloranti, azo coloranti, cianina coloranti, coloranti naturali e/o loro miscele, ma preferibilmente essa comprender? BBG o un suo analogo strutturale. Tra questi ultimi i preferiti sono i sali di BBG farmaceuticamente accettabili, gli idrati di BBG ed i metilati di BBG.
Da un punto di vista operativo, nel caso di utilizzo di una composizione colorata che utilizzi Ficoll per ottenere una densit? superiore a 1.01 g/cm3, per la colorazione della ILM, va ricordato che in questi interventi dopo la rimozione del corpo vitreo tramite la vitrectomia, la composizione colorante viene iniettata nella camera posteriore. Grazie alla sua elevata densit? essa si deposita sulla membra ILM con cui rimane a contatto solo pochi secondi prima di essere rimossa tramite gli usuali abbondanti lavaggi della camera posteriore con BSS. Nonostante i pochi secondi di contatto, comunque, la composizione colorante colora la membrana ILM.
Si noti tuttavia che in queste condizioni di utilizzo (quindi anche nel caso di altri interventi di chirurgia oftalmica analoghi come condizioni di esecuzione), l?eventuale Ficoll utilizzato come addensante non ? in grado di agire come CA, in quanto la composizione colorante viene rimossa subito dopo la colorazione della membrana e viene diluita nella camera posteriore con BSS.
Limitatamente all?utilizzo per la colorazione intraoperatoria in metodi di chirurgia oftalmica, quindi, utilizzando Ficoll si possono ottenere ?solo? prestazioni analoghe a quelle ottenibili, a parit? di densit? della composizione colorante, con i normali agenti per aumentare la densit?, quale acqua pesante.
La presente invenzione consegue importanti vantaggi.
Per quanto riguarda la nuova molecola colorante messa a punto, in primo luogo si ? ottenuto il grande vantaggio che tale molecola si ? rivelata in grado di colorare meglio del BBG commerciale non solo la ILM, ma anche le proteine e le catene proteiche, con la conseguenza che ? possibile utilizzare meno colorante a parit? di risultati.
Ulteriormente, la nuova molecola si ? rivelata in grado di colorare selettivamente anche almeno alcune tipologie di EPRM sino ad oggi non colorabili con il BBG ma esclusivamente con diverso colorante quale il trypan blue. Dato che tutti i test di colorazione di EPRM sino ad ora effettuati hanno avuto esito favorevole, al momento si ritiene inoltre non solo possibile ma anche probabile che la nuova molecola colorante sia effettivamente in grado di colorare tutte le tipologie di EPRM.
Essa inoltre ? risultata non citotossica a concentrazioni maggiori di quelle oggi ammesse per il BBG commerciale.
Per quanto riguarda invece l?utilizzo di Ficoll come agente per aumentare la densit? in alternativa a quelli sino ad ora utilizzati nel settore, si ? potuto constatare che il suo utilizzo permette in alcune applicazioni di ottenere risultati analoghi a quelli sino ad ora ottenibili (come nel caso della chirurgia oftalmica), mentre in altre applicazioni permette di utilizzare meno colorante a parit? di risultati.
Va infine rilevato che la presente invenzione risulta di relativamente facile realizzazione e che anche il costo connesso alla sua attuazione non risulta molto elevato.
L?invenzione cos? concepita ? suscettibile di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell?ambito del concetto inventivo che la caratterizza.
Tutti i dettagli sono rimpiazzabili da altri tecnicamente equivalenti ed i materiali impiegati, nonch? le forme e le dimensioni dei vari componenti, potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze.
Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Molecola colorante avente struttura: dove:R1 ? costituito da un gruppo SO -3 legato con legame ionico ad un atomo di idrogeno H o ad altro atomo o ad un gruppo ammonio NH4; ed R2 ? costituito da un gruppo SO - 3.
- 2. Composizione colorante comprendente almeno un primo colorante con molecola in accordo con la rivendicazione 1.
- 3. Composizione colorante secondo la rivendicazione 2 caratterizzata dal fatto che il primo colorante ? presente in una quantit?, in peso rispetto al volume complessivo della composizione (p/v), compresa tra 0.001 e 0.1%.
- 4. Composizione colorante secondo la rivendicazione 2 comprendente inoltre almeno un secondo colorante diverso dal primo colorante.
- 5. Composizione colorante secondo la rivendicazione 4 in cui il secondo colorante ? trypan blue.
- 6. Composizione colorante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 5 caratterizzata dal fatto di presentare una densit? compresa tra 1.01 g/cm3 e 1.5 g/cm3 e dal fatto di comprendere inoltre almeno un agente per aumentare la densit?.
- 7. Composizione colorante secondo la rivendicazione 6 caratterizzata dal fatto che l?almeno un agente per aumentare la densit? ? scelto tra acqua pesante D2O, disaccaridi o polisaccaridi, o polimeri neutri quali polieteri, alcool polivinilico, poliesteri, copolimeri dell?acido poliacrilico, mannitolo e polivinil-pirrolidone.
- 8. Composizione colorante secondo la rivendicazione 6 caratterizzata dal fatto che l?agente per aumentarne la densit? ha formula bruta e struttura
- 9. Composizione colorante avente densit? superiore a 1.01 g/cm3 e comprendente almeno un colorante ed almeno un agente per aumentarne la densit? che ha formula bruta (C12H22O11?C3H5ClO)x, e struttura
- 10. Composizione colorante secondo la rivendicazione 9 comprendente almeno un colorante scelto nel gruppo comprendente trifenilmetano coloranti, azo coloranti, cianina coloranti, coloranti naturali e/o loro miscele.
- 11. Composizione colorante secondo la rivendicazione 10 in cui il colorante ? Brilliant Blue G (BBG) o un suo analogo strutturale.
- 12. Composizione colorante secondo la rivendicazione 10 in cui il colorante ? scelto tra BBG, un sale di BBG farmaceuticamente accettabile, un idrato di BBG o un metilato di BBG.
- 13. Composizione colorante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 12 in cui l?agente per aumentarne la densit? ? presente in una quantit?, in peso rispetto al volume complessivo della composizione (p/v), compresa tra 0.001% e 20%.
- 14. Composizione colorante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 13 caratterizzata dal fatto di comprendere inoltre una matrice tampone fosfato.
- 15. Composizione colorante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 14 per uso in metodi per il trattamento del corpo umano o animale.
- 16. Composizione colorante secondo la rivendicazione precedente per uso in un metodo chirurgico di chirurgia vitreoretinica.
- 17. Composizione colorante secondo la rivendicazione 15 o 16 per la colorazione della membrana limitante interna ILM e/o di membrane epiretiniche EPRM in un metodo chirurgico che prevede la successiva rimozione rispettivamente della ILM e/o delle EPRM.
- 18. Composizione colorante secondo la rivendicazione 17, quando dipende dalla 4, per la colorazione anche di eventuali membrane epiretiniche, in cui il primo colorante in uso colora quantomeno la ILM ed il secondo colorante colora le membrane epiretiniche EPRM.
- 19. Composizione colorante secondo la rivendicazione 15 per uso in un metodo in cui la composizione colorante colora proteine per rendere maggiormente visibile un tessuto cui le proteine stesse appartengono.
- 20. Composizione colorante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 14 per la colorazione di proteine.
- 21. Composizione colorante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 20 caratterizzata dal fatto di essere inoltre liquida almeno nell?intervallo di temperature compreso tra 0?C e 50?C.
- 22. Metodo per la sintesi della molecola colorante in accordo con la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di utilizzare una reazione di metilazione di un prodotto di partenza costituito da Brilliant Blue G250.
- 23. Metodo secondo la rivendicazione precedente in cui la reazione di metilazione prevede di far reagire in una o pi? fasi, il prodotto di partenza con sodio idrossido e iodometano.
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