BR112021010982A2 - Ligantes - Google Patents

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BR112021010982A2
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hydrogen
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Caroline Godfrey
Graham McClorey
Subhashis Banerjee
Michael Gait
Miguel Varela
Ashling Holland
Matthew Wood
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Abstract

ligantes. a presente invenção refere-se a ligantes para conectar uma molécula carreadora a uma molécula terapêutica para formar um conjugado, em particular ligantes formados de aminoácidos, tais como ácido glutâmico, ácido succínico e ácido gama-aminobutírico. a presente invenção refere-se adicionalmente a um conjugado que compreende um ligante da invenção e ao uso do dito conjugado no tratamento de várias doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “LIGANTES” Campo
[001] A presente invenção se refere a ligantes para conectar uma molécula carreadora a uma molécula terapêutica para formar um conjugado. A presente invenção se refere ainda a um conjugado que compreende um ligante da invenção e ao uso do dito conjugado no tratamento de várias doenças.
Fundamentos
[002] Os conjugados terapêuticos que compreendem uma molécula carreadora e uma molécula terapêutica covalentemente ligadas entre si foram desenvolvidos pela primeira vez após a realização inicial de que as moléculas terapêuticas frequentemente tinham penetração celular fraca se usadas sozinhas. O uso de um carreador parceiro foi sugerido para auxiliar a absorção celular da molécula terapêutica nas células e/ou tecidos.
[003] Um desses grupos de moléculas terapêuticas são os oligonucleotídeos anti-sentido (ON). As terapias de ON têm feito um rápido progresso clínico para tratar uma variedade de indicações de doenças devido à sua natureza direcionada e alta eficácia. ONs podem induzir modulação direcionada de splicing de pré-mRNA, tornando-os candidatos particularmente atraentes para novos fármacos de terapia gênica. Em particular, para o tratamento de doenças causadas por mutações de perda de função, como a distrofia muscular de Duchenne (DMD). No entanto, apesar de sua ampla aplicabilidade para tratar muitas doenças genéticas, a administração sistêmica in vivo de compostos ON alcançou sucesso limitado no fornecimento de efeitos terapêuticos devido à sua fraca penetração nos tecidos alvo e baixos níveis de absorção intracelular.
[004] Para abordar o problema da baixa absorção intracelular no caso de oligonucleotídeos terapêuticos, foram desenvolvidos conjugados que compreendem carreadores formados a partir de peptídeos curtos. Nos últimos anos, os peptídeos de penetração celular (CPPs) catiônicos, isto é, carregados positivamente, têm sido usados como carreadores para facilitar a absorção intracelular de espécies de carga neutra, como oligômeros terapêuticos de morfolino fosforodiamidato (PMOs). Foi demonstrado que os conjugados de CPP facilitam com sucesso a captação intracelular eficaz de PMOs in vivo em vários modelos de doenças, incluindo no contexto de DMD.
[005] No entanto, a aplicação desses conjugados carreador-terapêuticos como terapias tem sido dificultada por sua toxicidade associada.
[006] Amantana et al., Bioconjug Chem, 2007, 1325-1331 descreveu que os conjugados de peptídeo-PMO exibem toxicidade dependente da dose. Acima de um certo limite, a toxicidade é observada, incluindo letargia, respiração rápida, degeneração tubular nos rins e perda de peso. Um desses conjugados de CPP; o conjugado B-PMO, mostrou alta toxicidade aguda em camundongos mdx (Wu et al., Am J Pathol, 2012, 392-400).
[007] O trabalho para reduzir a toxicidade de tais conjugados terapêuticos tem se concentrado amplamente no desenvolvimento do portador; que se acredita ser a fonte da toxicidade. Em relação aos carreadores de peptídeo, Wu et al., Nuc Acids Res, 2007, 35, 5182-5191 indicou que o aumento do número de resíduos de ácido 6-aminohexanóico se correlaciona com o aumento da toxicidade, e afirmou que CPPs mais ativos e estáveis poderiam ser projetados por meio da otimização a posição e o número de resíduos de arginina (R, DR), ácido aminohexanóico (X) e beta-alanina (B). Outros estudos indicaram ainda que o número ou frequência de resíduos de arginina em um carreador de peptídeo afetou negativamente a toxicidade, e que estes deveriam ser reduzidos.
[008] Desde então, os peptídeos carreadores com várias sequências diferentes foram desenvolvidos numa tentativa de tornar os seus conjugados menos tóxicos, no entanto, muitos desses conjugados não chegaram à clínica. Isso se deve a níveis intoleráveis de toxicidade ou a uma indesejável perda de eficácia do conjugado. Por exemplo, Betts et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2012, 1, e38 demonstraram que alguns portadores de CPP promissores conhecidos na técnica como ‘Pips’ ainda não têm o índice terapêutico apropriado para o desenvolvimento clínico. Além disso, US 2016/0237426 contém dados que demonstram que outros carreadores de CPP concebidos de forma diferente, como R6Gly, têm toxicidade reduzida, mas quando usados em um conjugado com uma molécula terapêutica também têm eficácia reduzida na indução de salto de éxon.
[009] Apesar dos esforços dos pesquisadores para variar a sequência do carreador para uso em conjugados terapêuticos, até agora tem se mostrado muito difícil produzir um conjugado com alta eficácia em termos de resultados terapêuticos e níveis de toxicidade aceitáveis.
[0010] Portanto, permanece uma necessidade de conjugados para entregar moléculas terapêuticas que exibem toxicidade reduzida quando administradas sistemicamente a pacientes, mantendo a eficácia terapêutica.
[0011] Um ou mais aspectos da presente invenção pretendem resolver pelo menos este problema.
Declarações de Invenção
[0012] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um conjugado ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreendendo pelo menos um carreador, em que o carreador está covalentemente ligado a pelo menos um ligante, e em que o ligante está covalentemente ligado a pelo menos uma molécula terapêutica;
em que cada um dos pelo menos um ligante tem,
independentemente, uma estrutura de acordo com a Fórmula (I)
abaixo:
-T1-(CR¬1R2)n-T2-
(I)
em que
T1 + é para ligação ao portador e é selecionado de -NH-
ou -C(O)-;
T2 é para ligação a uma primeira molécula terapêutica e é selecionado de -NH- ou -C (O) -;
n é um número inteiro selecionado de 1, 2 ou 3; e cada ocorrência de R1 é independentemente um grupo de fórmula
-Y1-X1-Z1, em que
Y1 está ausente ou um grupo da fórmula - [CRA1RA2] m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio, OH ou (1-2C)alquila;
X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -
CH(ORA3)-, -N(RA3)-, -N(RA3)-C(O)-, -N(RA3)-C(O)O-, -C(O)-
N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, -N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-, -SO-, -S- -
SO2-, -S(O)2N(RA3)-, ou -N(RA3)SO2- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e
Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionado a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-
6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3-
6C)cicloalquenila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila,
(2-6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3-
6C)cicloalquila, (3-6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C) alquila, oxo, halo,
ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRA4RA5 ou alcóxi (1-4C), em que RA4 e RA5 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio ou alquila (1-2C); e cada ocorrência de R2 é independentemente um grupo de fórmula -Y2-X2-Z2, em que
Y2 está ausente ou um grupo da fórmula - [CRB1RB2] m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RB1 e RB2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio, OH ou alquila (1-2C);
X2 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -
CH(ORB3)-, -N(RB3)-, -N(RB3)- C(O)-, -N(RB3)-C(O)O-, -C(O)-
N(RB3)-, -N(RB3)C(O)N(RB3)-, -N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-, -SO-, -S- -
SO2-, -S(O)2N(RB3)-, ou -N(RB3)SO2- em que cada RB3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e
Z2 é selecionado de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-
6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila,
(3-6C)cicloalquenila ou heteroarila, em que cada (1- 6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3- 6C)cicloalquila, (3-6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados a partir de (1-4C) alquila, oxo, halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRB4RB5 ou (1-4C)alcóxi, em que RB4 e RB5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila; com a condição de que; quando n = 1 e T1 e T2 são diferentes um do outro, então R1 e R2 não são ambos H; quando n = 1, T1 e T2 são diferentes um do outro e um de R1 e R2 é H então o outro de R1 e R2 não é metila; ou quando n = 2 e cada ocorrência de R1 e R2 é H, então T1 e T2 são ambos -C(O)- ou são ambos -NH-.
quando o carreador é um peptídeo, o peptídeo não é glicosilado.
[0013] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido o conjugado de acordo com o primeiro aspecto para uso como um fármaco.
[0014] De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um conjugado de acordo com o primeiro aspecto.
[0015] De acordo com o quarto aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica do terceiro aspecto para uso como fármaco.
[0016] Os presentes inventores descobriram que um ligante localizado entre o carreador e a molécula terapêutica dentro de um conjugado tem um efeito surpreendente na toxicidade do conjugado.
[0017] Se um ligante é usado dentro de um conjugado, é normalmente uma pequena molécula que é usada com o único motivo de conectar a molécula careadora à molécula terapêutica. Até agora, não se esperava ou pretendia que o próprio ligante tivesse qualquer papel nas propriedades do conjugado.
[0018] Tanto quanto os inventores estão cientes, não houve pesquisa sobre como a escolha do ligante afeta as propriedades do conjugado, especialmente não sobre como a escolha do ligante afeta a toxicidade do conjugado.
[0019] Na presente invenção, os inventores conduziram pesquisas sobre o efeito do uso de diferentes ligantes na toxicidade de vários conjugados de carreadores peptídicos.
Os inventores identificaram vários ligantes que melhoram ativamente a toxicidade de conjugados terapêuticos.
Surpreendentemente, os inventores descobriram que os ligantes que caem dentro da estrutura do primeiro aspecto da invenção atuam para reduzir a toxicidade dos conjugados terapêutico-carreador em uma quantidade significativa quando comparados com outros ligantes que foram usados na técnica.
[0020] Sem estar limitado pela teoria, e puramente por especulação científica, os inventores acreditam que os ligantes que caem dentro da definição do primeiro aspecto da invenção têm a capacidade de organizar o carreador e a molécula terapêutica em uma orientação espacial que é estabilizada e protegida contra clivagem de proteases. Isso poderia resultar no conjugado como um todo tendo uma toxicidade reduzida quando comparado com conjugados semelhantes usando ligantes anteriores. Esta orientação vantajosa pode ser derivada do comprimento da cadeia de carbono que conecta o carreador à molécula terapêutica. Os inventores acreditam que o comprimento particular da cadeia de carbono fornece distância suficiente entre a carga do carreador e a molécula terapêutica. Além disso, os inventores acreditam que os metabólitos produzidos após a quebra dos referidos ligantes podem ser menos tóxicos.
[0021] Vantajosamente, a descoberta de ligantes com tal toxicidade reduzida significa que conjugados terapêuticos desenvolvidos anteriormente e recentemente desenvolvidos podem agora ser utilizáveis em um ambiente clínico. Além disso, porque os ligantes são uma porção separada do carreador e da molécula terapêutica, eles podem ser facilmente usados em muitos conjugados diferentes com diferentes carreadores e moléculas terapêuticas sem afetar as propriedades de penetração celular do carreador ou a eficácia da molécula terapêutica.
[0022] Certos recursos de qualquer um dos aspectos acima da presente invenção serão agora definidos mais detalhadamente sob os títulos abaixo.
[0023] A invenção inclui qualquer combinação dos aspectos e características descritos, exceto quando tal combinação for claramente inadmissível ou expressamente evitada.
[0024] Os títulos das seções usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito.
Ligante
[0025] O ligante é usado para conectar covalentemente um carreador a uma molécula terapêutica. Os conjugados de acordo com a invenção compreendem pelo menos um ligante que é definido pela Fórmula (I).
[0026] Adequadamente, o ou cada ligante tem uma estrutura de acordo com a Fórmula (I), definida anteriormente, isto é, -T1-(CR1R2)n-T2- (I)
[0027] Em uma modalidade, T1 é -NH-. Em outra modalidade, T1 é -C(O)-.
[0028] Em uma modalidade, T2 é -C(O)-.
[0029] Em uma modalidade, cada ocorrência de R1 é, independentemente, um grupo de fórmula -Y1-X1-Z1,
em que:
[0030] Y1 está ausente ou um grupo da fórmula - [CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-, - N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, - N(RA3)C(NRA3)N(RA3)- ou -S- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metil; e Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionada a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2- 6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3- 6C)cicloalquenila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2- 6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3- 6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados a partir de (1-4C) alquila, oxo, halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRA4RA5 ou (1-4C)alcóxi, em que RA4 e RA5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1- 2C)alquila
[0031] Em uma modalidade, cada ocorrência de R1 é, independentemente, um grupo de fórmula -Y1-X1-Z1, em que: Y1 está ausente ou um grupo da fórmula -[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-, - N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, - N(RA3)C(NRA3)N(RA3)- ou -S- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e Z1 é selecionado a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3- 6C)cicloalquila, (3-6C)cicloalquenila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2- 6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3- 6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C) alquila, oxo, halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRA4RA5 ou (1-4C)alcóxi, em que RA4 e RA5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1- 2C)alquila.
[0032] Em outra modalidade, cada ocorrência de R1 é, independentemente, um grupo de fórmula -Y1-X1-Z1, em que: Y1 está ausente ou um grupo da fórmula -[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-, - N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, -
N(RA3)C(NRA3)N(RA3)- ou -S- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionado a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, arila, (3- 6C)cicloalquila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, arila, (3-6C)cicloalquila ou heteroarila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C)alquila, halo ou hidróxi.
[0033] Em uma modalidade, cada ocorrência de R1 é, independentemente, um grupo de fórmula -Y1-X1-Z1, em que: Y1 está ausente ou um grupo da fórmula -[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-C(O)-, C(O)- N(RA3)-, em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionado a partir de é hidrogênio, (1-6C)alquila, arila, (3- 6C)cicloalquila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, arila, (3-6C)cicloalquila ou heteroarila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C)alquila, halo ou hidróxi.
[0034] Em uma modalidade, cada ocorrência de R1 é, independentemente, um grupo de fórmula -Y1-X1-Z1, em que:
Y1 está ausente ou um grupo da fórmula -[CH2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1 ou 2; X1 está ausente ou -N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e Z1 é hidrogênio ou (1-2C)alquila.
[0035] Em certas modalidades, Z1 pode ser uma outra molécula terapêutica. A outra molécula terapêutica pode ser a mesma ou diferente da primeira molécula terapêutica ligada a T2.
[0036] Em uma modalidade, cada ocorrência de R2 é, independentemente, um grupo da fórmula -Y2-X2-Z2, em que: Y2 está ausente ou um grupo da fórmula - [CRA1RA2] m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X2 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-, - N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, - N(RA3)C(NRA3)N (RA3)- ou -S- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e Z2 é selecionado a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3- 6C)cicloalquila, (3-6C)cicloalcenila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-
6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3- 6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C) alquila, oxo, halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRB4RB5 ou (1-4C)alcóxi, em que RB4 e RB5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1- 2C)alquila.
[0037] Em uma modalidade, cada ocorrência de R2 é independentemente um grupo da fórmula -Y2-Z2, em que Y2 está ausente ou um grupo da fórmula -[CRB1RB2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RB1 e RB2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila; e Z2 é hidrogênio ou (1-6C)alquila.
[0038] Em uma modalidade preferida, cada ocorrência de R2 é H.
[0039] Em certas modalidades, n é 1.
[0040] Em certas modalidades, n é 2 ou 3.
[0041] Em uma modalidade, é fornecido um conjugado conforme definido neste relatório, que tem uma das seguintes estruturas: ;
; ; ;
[0042] Em certas modalidades, o ligante é um aminoácido ou um derivado do mesmo. Assim, o ligante pode ser um aminoácido ou aminoácido modificado que liga o carreador à molécula terapêutica. O aminoácido pode ser modificado para incluir um grupo de cobertura (por exemplo, um grupo de cobertura de acetil formado por cobertura com anidrido acético) ou um grupo de proteção. Adequadamente, o grupo de cobertura ou grupo de proteção pode estar presente na cadeia lateral do aminoácido.
[0043] Adequadamente, o aminoácido pode ser ligado a pelo menos um carreador e a pelo menos uma molécula terapêutica por pelo menos dois da cadeia lateral, o terminal N ou o terminal C. Adequadamente, o ligante de aminoácido pode ser ligado a pelo menos um carreador pela cadeia lateral, o terminal N ou o terminal C. Adequadamente, o ligante de aminoácido pode ser ligado a pelo menos uma molécula terapêutica pela cadeia lateral, o terminal N ou o terminal C. Por exemplo, o ligante de aminoácido pode ser ligado a pelo menos um carreador e a pelo menos uma molécula terapêutica pelo terminal N e a cadeia lateral, respectivamente, o terminal C e a cadeia lateral, respectivamente, ou o terminal N e o terminal C, respectivamente. Em uma modalidade, o ligante é um aminoácido ligado através do terminal N e do terminal C. Em uma modalidade, o ligante é um aminoácido ligado através do terminal N ao carreador e através do terminal C à molécula terapêutica. Em uma modalidade, o ligante é um aminoácido ligado através do terminal C ao carreador e através do terminal N à molécula terapêutica. Adequadamente, a cadeia lateral de aminoácido pode ser ligada a uma segunda molécula terapêutica.
[0044] Adequadamente, o ligante é um aminoácido que pode ser selecionado a partir de ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina, valina, leucina, histidina, triptofano, treonina, serina, isoleucina, metionina, fenilalanina e tirosina ou seus derivados.
[0045] Adequadamente, o ligante é ácido glutâmico ou seus derivados. Adequadamente, o ligante é ácido glutâmico e seus derivados encontrados no shunt GABA. Adequadamente, o ligante é selecionado a partir de ácido glutâmico, ácido succínico ou ácido gama-aminobutírico (GABA).
[0046] Em uma modalidade, o ligante é GABA ligado a um carreador através do terminal N e ligado a uma molécula terapêutica através do terminal C.
[0047] Em uma modalidade, o ligante é o ácido succínico ligado a uma molécula terapêutica através de um dos grupos carboxila e ligada ao carreador através do outro grupo carboxila.
[0048] Em uma modalidade, o ligante é o ácido glutâmico ligado a um carreador através do terminal N e um ligado a uma molécula terapêutica através da cadeia lateral do ácido glutâmico.
[0049] Em uma modalidade, o ligante é o ácido glutâmico ligado a um carreador através do terminal C e ligado a uma molécula terapêutica através da cadeia lateral do ácido glutâmico.
Definições
[0050] As referências a ‘X’ denotam qualquer forma do aminoácido ácido aminohexanóico, tal como ácido 6- aminohexanóico.
[0051] Referências a 'B' denotam o aminoácido beta- alanina.
[0052] Referências a ‘[Hip]’ denotam o aminoácido hidroxiprolina.
[0053] Referências a 'Ac' denotam a acetilação do peptídeo relevante.
[0054] Referências a outras letras maiúsculas denotam o resíduo de aminoácido codificado geneticamente relevante de acordo com o código de aminoácido alfabético aceito.
[0055] Nesta especificação, o termo "alquila" inclui grupos alquila de cadeia linear e ramificada. As referências a grupos alquila individuais, como "propila", são específicas apenas para a versão de cadeia linear e as referências a grupos alquila de cadeia ramificada individuais, como "isopropila", são específicas apenas para a versão de cadeia ramificada. Por exemplo, "(1-6C)alquila" inclui (1-4C)alquila, (1-3C)alquila, propila, isopropila e t-butila. Uma convenção semelhante se aplica a outros radicais, por exemplo "fenila(1-6C)alquila" inclui fenila (1-4C)alquila, benzila, 1-feniletila e 2-feniletila.
[0056] O termo "alquenila", como aqui utilizado, se refere a um grupo alifático contendo pelo menos uma ligação dupla e se destina a incluir tanto "alquenos não substituídos" quanto "alquenos substituídos", o último dos quais se refere a frações alquenila tendo substituintes substituindo um hidrogênio em um ou mais carbonos do grupo alquenila. Esses substituintes podem ocorrer em um ou mais carbonos que estão incluídos ou não incluídos em uma ou mais ligações duplas. Por exemplo, a substituição de grupos alquenila por um ou mais grupos alquila, carbociclila, arila, heterociclila ou heteroarila é contemplada.
[0057] O termo "alquinila", tal como aqui utilizado, se refere a um grupo alifático contendo pelo menos uma ligação tripla e se destina a incluir tanto "alquinilas não substituídos" quanto "alquinilas substituídos", o último dos quais se refere a porções alquinila tendo substituintes que substituem um hidrogênio em um ou mais carbonos do grupo alquinila. Esses substituintes podem ocorrer em um ou mais carbonos que estão incluídos ou não incluídos em uma ou mais ligações triplas. Além disso, tais substituintes incluem todos aqueles contemplados neste relatório.
[0058] O termo "(m-nC)" ou "grupo (m-nC)" usado sozinho ou como um prefixo, se refere a qualquer grupo tendo m a n átomos de carbono.
[0059] “(3-8C)cicloalquila” significa um anel de hidrocarboneto contendo de 3 a 8 átomos de carbono, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila ou biciclo[2.2.1]heptila.
[0060] "(3-8C)cicloalquenila" significa um anel de hidrocarboneto contendo pelo menos uma ligação dupla, por exemplo, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclohexenila ou cicloheptenila, tal como 3-ciclohexeno-1-ila, ou ciclooctenila.
[0061] O termo "halo" ou "halogeno" se refere a flúor, cloro, bromo e iodo.
[0062] Por "sistemas de anel em ponte" entende-se sistemas de anel em que dois anéis compartilham mais de dois átomos, ver por exemplo Advanced Organic Chemistry, por Jerry March, 4ª edição, Wiley Interscience, páginas 131-133, 1992.
Exemplos de anel heterociclila em ponte os sistemas incluem aza-biciclo[2.2.1]heptano, 2-oxa-5- azabiciclo[2.2.1]heptano, aza-biciclo[2.2.2]octano, aza- biciclo[3.2.1]octano e quinuclidina.
[0063] O termo "arila" significa um anel aromático cíclico ou policíclico aromático com 5 a 12 átomos de carbono. O termo arila inclui espécies monovalentes e espécies divalentes. Exemplos de grupos arila incluem, mas não estão limitados a, fenila, bifenila, naftila e semelhantes. Em modalidades particulares, um arila é fenila opcionalmente substituído.
[0064] O termo "heteroarila" ou "heteroaromático" significa um anel aromático mono, bi ou policíclico que incorpora um ou mais (por exemplo 1 4, particularmente 1, 2 ou 3) heteroátomos selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. O termo heteroarila inclui espécies monovalentes e espécies divalentes. Exemplos de grupos heteroarila são grupos monocíclicos e bicíclicos contendo de cinco a doze membros do anel e, mais geralmente, de cinco a dez membros do anel. O grupo heteroarila pode ser, por exemplo, um anel monocíclico de 5 ou 6 membros ou um anel bicíclico de 9 ou 10 membros, por exemplo, uma estrutura bicíclica formada a partir de anéis fundidos de cinco e seis membros ou dois anéis fundidos de seis membros. Cada anel pode conter até cerca de quatro heteroátomos tipicamente selecionados de nitrogênio, enxofre e oxigênio. Normalmente, o anel heteroaril conterá até 3 heteroátomos, mais geralmente até 2, por exemplo, um único heteroátomo. Em uma modalidade, o anel de heteroarila contém pelo menos um átomo de nitrogênio do anel. Os átomos de nitrogênio nos anéis de heteroarila podem ser básicos, como no caso de um imidazol ou piridina, ou essencialmente não básicos, como no caso de um nitrogênio indol ou pirrol. Em geral, o número de átomos de nitrogênio básico presentes no grupo heteroarila, incluindo quaisquer substituintes do grupo amino do anel, será menor do que cinco.
[0065] Exemplos de heteroarila incluem furila, pirrolila, tienila, oxazolila, isoxazolila, imidazolila, pirazolila, tiazolila, isotiazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, triazolila, tetrazolila, piridila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, 1,3,5-triazinila,
benzofuranila, indolila, isoindolila, benzotienila, benzoxazolila, benzimidazolila, benzotiazolila, benzotiazolila, indazolila, purinila, benzofurazanila, quinolila, isoquinolila, quinazolinila, quinoxalinila, cinolinila, pteridinila, naftiridinila, carbazolila, fenazinila, benzisoquinolinila, piridopirazinila, tieno[2,3-b]furanila, 2H-furo[3,2-b]-piranila, 5H- pirido[2,3 d]-o-oxazinila, 1H-pirazolo[4,3-d]oxazolila, 4H- imidazo[4,5-d]tiazolila, pirazino[2,3-d]piridazinila, imidazo[2,1-b]tiazolila, imidazo[1,2-b][1,2,4]triazinila.
“Heteroarila” também cobre sistemas de anéis parcialmente aromáticos bicíclicos ou policíclicos em que pelo menos um anel é um anel aromático e um ou mais dos outros anéis é um anel não aromático, saturado ou parcialmente saturado, desde que pelo menos um anel contenha um ou mais heteroátomos selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Exemplos de grupos heteroarila parcialmente aromáticos incluem, por exemplo, tetrahidroisoquinolinila, tetrahidroquinolinila, 2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolinila, di-hidrobenztienila, di-hidrobenzfuranila, 2,3-di-hidro-benzo[1,4]dioxinila, benzo [1,3]dioxolila, 2,2-dioxo-1,3-di-hidro-2- benzotienila, 4,5,6,7-tetra-hidrobenzofuranila, indolinila, 1,2,3,4 tetra-hidro 1,8 naftiridinila, 1,2,3,4 tetra- hidropirido [2,3-b] pirazinila e 3,4 di-hidro 2H pirido[3,2- b][1,4]oxazinila.
[0066] Exemplos de grupos heteroarila de cinco membros incluem, mas não estão limitados a grupos pirrolila, furanila, tienila, imidazolila, furazanila, oxazolila, oxadiazolila, oxatriazolila, isoxazolila, tiazolila, isotiazolila, pirazolila, triazolila e tetrazolila.
[0067] Exemplos de grupos heteroarila de seis membros incluem, mas não estão limitados a, piridila, pirazinila, piridazinila, pirimidinila e triazinila.
[0068] Um grupo heteroaril bicíclico pode ser, por exemplo, um grupo selecionado a partir de: um anel de benzeno fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel; um anel de piridina fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel; um anel de pirimidina fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel pirrole fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel; um anel de pirazol fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de pirazina fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de imidazol fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de oxazol fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de isoxazol fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de tiazol fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de isotiazol fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1 ou 2 heteroátomos no anel; um anel de tiofeno fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel; um anel de furano fundido a um anel de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel; um anel de ciclohexila fundido a um anel heteroaromático de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel; e um anel de ciclopentila fundido a um anel heteroaromático de 5 ou 6 membros contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos no anel.
[0069] Exemplos particulares de grupos heteroarila bicíclicos contendo um anel de seis membros fundido a um anel de cinco membros incluem, mas não estão limitados a benzfuranila, benztiofenila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila, benztiazolila, benzisotiazolila, isobenzofuranila, indolinila, isoindolila, indolinila, indolinila, indolinila, indolinila, (por exemplo, grupos adeninila, guaninila), indazolila,
benzodioxolila e pirazolopiridinila.
[0070] Exemplos particulares de grupos heteroarila bicíclicos contendo dois anéis fundidos de seis membros incluem, mas não estão limitados a quinolinila, isoquinolinila, cromanila, tiocromanila, cromenila, isocromenila, cromanila, isocromanila, benzodioxanila, quinolizinila, benzoxazinila, quinidolinzinila, quinodiazinila, quinidolinila, quinidolinila, benzoxazinila, quinidolinzinila, quinidolinzinila, benzoxazinila, quinidolinzinila, benzoxazinila, quinidolinzinila, benzoxazino grupos ftalazinila, naftiridinila e pteridinila.
[0071] O termo "opcionalmente substituído" se refere a grupos, estruturas ou moléculas que são substituídas e aquelas que não são substituídas. O termo "em que um/qualquer grupo CH, CH2, CH3 ou heteroátomo (ou seja, NH) dentro de um grupo R1 é opcionalmente substituído" significa adequadamente que (qualquer) um dos radicais de hidrogênio do grupo R1 é substituído por um grupo estipulado relevante.
[0072] Quando substituintes opcionais são escolhidos de "um ou mais" grupos, deve ser entendido que esta definição inclui todos os substituintes sendo escolhidos de um dos grupos especificados ou os substituintes sendo escolhidos de dois ou mais dos grupos especificados.
Carreador
[0073] O conjugado da invenção compreende um ligante que é usado para conectar uma molécula terapêutica a uma molécula carreadora para formar o referido conjugado.
[0074] Normalmente, a molécula carreadora auxilia no transporte da molécula terapêutica para atingir o alvo terapêutico, seja um gene, transcrito ou proteína. O carreador pode ter um efeito estabilizador na molécula terapêutica para permitir que ela alcance o alvo terapêutico sem degradação. Igualmente, o carreador pode ter o efeito de facilitar a entrada da molécula terapêutica nas células alvo.
[0075] Adequadamente, qualquer molécula carreadora conhecida pode ser usada nos conjugados da presente invenção.
Os carreadores adequados incluem qualquer molécula tolerada biologicamente, como por exemplo: proteínas, peptídeos, ácidos graxos, polímeros, nanopartículas, polímeros de ácido nucleico.
[0076] Em uma modalidade, a molécula carreadora é um peptídeo.
[0077] Adequadamente, o peptídeo carreador pode ser ligado ao ligante no terminal N ou no terminal C do peptídeo carreador.
[0078] Adequadamente, em qualquer uma das estruturas aqui divulgadas, o carreador de peptídeo pode ser conectado à molécula terapêutica através do ligante no terminal N ou C do peptídeo, igualmente a molécula terapêutica pode ser conectada através do ligante no terminal N ou C do carreador de peptídeo.
[0079] Os carreadores de peptídeos adequados são conhecidos na técnica. Tais carreadores peptídicos são descritos em, por exemplo: GB1812972.6, GB 1812980.9, WO2009/147368, WO2013/030569, WO2009/005793.
[0080] Adequadamente, se a molécula carreadora for um peptídeo, o peptídeo não é glicosilado. Adequadamente, a molécula carreadora não é um peptídeo glicosilado.
[0081] Adequadamente, o carreador peptídico tem até 40 aminoácidos de comprimento. O peptídeo pode, portanto, ser considerado um oligopeptídeo.
[0082] Adequadamente, o peptídeo tem um comprimento total entre 3-30 resíduos de aminoácidos, adequadamente entre 5-25 resíduos de aminoácidos, entre 10-25 resíduos de aminoácidos, entre 13-23 resíduos de aminoácidos, entre 15- 20 resíduos de aminoácidos.
[0083] Adequadamente, o peptídeo tem um comprimento total de pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17 resíduos de aminoácidos.
[0084] Adequadamente, o peptídeo é capaz de penetrar nas células. O peptídeo pode, portanto, ser considerado um peptídeo de penetração celular.
[0085] Adequadamente, o peptídeo carreador tem uma sequência que é uma única molécula contígua, portanto, quaisquer domínios do peptídeo são contíguos. Adequadamente, o peptídeo pode compreender vários domínios em um arranjo linear entre o terminal N e o terminal C. Adequadamente, o carreador de peptídeo pode compreender qualquer tipo de domínio, tal como: domínios hidrofóbicos, domínios hidrofílicos, domínios catiônicos, domínios aniônicos, domínios neutros, domínios ácidos, domínios básicos.
Adequadamente, o carreador de peptídeo pode compreender qualquer número de domínios em qualquer configuração.
[0086] As referências a "catiônico" aqui denotam um aminoácido ou domínio de aminoácidos com uma carga global positiva em pH fisiológico.
[0087] Adequadamente, cada domínio catiônico compreende um ponto isoelétrico (pI) de pelo menos 7,5, pelo menos 8,0, pelo menos 8,5, pelo menos 9,0, pelo menos 9,5, pelo menos 10,0, pelo menos 10,5, pelo menos 11,0, pelo menos 11,5, pelo menos 12,0.
[0088] Adequadamente, cada domínio catiônico compreende um ponto isoelétrico (pI) de pelo menos 10,0.
[0089] Adequadamente, cada domínio catiônico compreende um ponto isoelétrico (pI) entre 10,0 e 13,0
[0090] Adequadamente, o ponto isoelétrico de um domínio catiônico é calculado em pH fisiológico por qualquer meio adequado disponível na técnica. Adequadamente, usando o IPC
(www.isoelectric.org) um algoritmo baseado na web desenvolvido por Lukasz Kozlowski, Biol Direct. 2016; 11:
55. DOI:10.1186/s13062-016-0159-9.
[0091] Referências a "hidrofóbico" aqui denotam um aminoácido ou domínio de aminoácidos com a capacidade de repelir água ou que não se misturam com água.
[0092] Adequadamente, cada domínio hidrofóbico compreende uma hidrofobicidade de pelo menos 0,3, pelo menos 0,4, pelo menos 0,5, pelo menos 0,6, pelo menos 0,7, pelo menos 0,8, pelo menos 0,8, pelo menos 1,0, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3.
[0093] Adequadamente, cada domínio hidrofóbico compreende uma hidrofobicidade entre 0,4 e 1,4 Adequadamente, a hidrofobicidade é medida por White e Wimley: W.C. Wimley e S.H. White, "Escala de hidrofobicidade determinada experimentalmente para proteínas em interfaces de membrana" Nature Struct Biol 3: 842 (1996).
[0094] Adequadamente, o carreador de peptídeo pode compreender ou consistir em domínios hidrofóbicos e/ou domínios catiônicos. Adequadamente, o carreador de peptídeo compreende pelo menos um domínio catiônico e pelo menos um domínio hidrofóbico. Adequadamente, o carreador de peptídeo compreende ou consiste em dois domínios catiônicos e um domínio hidrofóbico.
[0095] Adequadamente, os domínios catiônicos estão localizados no terminal N e C do carreador de peptídeo.
Adequadamente, em qualquer uma das extremidades do carreador peptídico. Adequadamente, um ou mais domínios hidrofóbicos estão localizados no centro do carreador de peptídeo.
Adequadamente, um domínio hidrofóbico separa quaisquer dois domínios catiônicos. Adequadamente, cada domínio hidrofóbico é flanqueado por domínios catiônicos em ambos os lados.
Adequadamente, nenhum domínio catiônico é contíguo a outro domínio catiônico.
[0096] Adequadamente, cada domínio tem um comprimento de entre 3 a 15 resíduos de aminoácidos. Adequadamente, um comprimento de entre 3 a 7 resíduos de aminoácidos.
Adequadamente, cada domínio do mesmo tipo tem comprimento semelhante, adequadamente cada domínio do mesmo tipo tem o mesmo comprimento. Adequadamente, cada domínio catiônico tem um comprimento de 4, 5, 6 ou 7 resíduos de aminoácidos.
[0097] Adequadamente, cada domínio hidrofóbico tem um comprimento entre 3-6 aminoácidos. Adequadamente, cada domínio hidrofóbico tem um comprimento de 5 aminoácidos.
[0098] Adequadamente, o peptídeo carreador é um peptídeo carregado positivamente.
[0099] Adequadamente, o carreador de peptídeo é um peptídeo rico em arginina. Adequadamente, o carreador de peptídeo compreende pelo menos 20%, 30%, pelo menos 32%, pelo menos 34%, pelo menos 36%, pelo menos 38%, pelo menos
40%, pelo menos 42%, pelo menos 44%, pelo menos 46%, pelo menos 48%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% de resíduos de arginina.
Adequadamente, o carreador peptídico compreende uma maioria de resíduos de arginina.
[00100] Adequadamente, o carreador de peptídeo pode não compreender aminoácidos artificiais. Adequadamente, o carreador de peptídeo pode não compreender resíduos de ácido aminohexanóico. As referências a um aminoácido ou resíduo "artificial" aqui denotam qualquer aminoácido que não ocorre na natureza e inclui aminoácidos sintéticos, aminoácidos modificados (tais como aqueles modificados com açúcares), aminoácidos não naturais, aminoácidos artificiais, espaçadores e espaçadores não ligados por peptídeo.
[00101] Os aminoácidos sintéticos podem ser aqueles quimicamente sintetizados pelo homem.
[00102] Para evitar dúvidas, o ácido aminohexanóico (X) é um aminoácido artificial no contexto da presente invenção.
[00103] Adequadamente, os domínios catiônicos são carregados positivamente.
[00104] Adequadamente, os domínios catiônicos são ricos em arginina. Adequadamente, cada domínio catiônico compreende uma maioria de resíduos de arginina.
Adequadamente, um domínio catiônico pode compreender pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% de resíduos de arginina.
Adequadamente, cada domínio catiônico compreende entre 40- 70% de resíduos de arginina.
[00105] Adequadamente, cada domínio hidrofóbico compreende uma maioria de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Adequadamente, cada domínio hidrofóbico compreende pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 100% de aminoácidos hidrofóbicos. Adequadamente, cada domínio hidrofóbico consiste em resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.
[00106] Adequadamente, cada domínio catiônico tem pelo menos 3 resíduos de arginina, adequadamente pelo menos 4 resíduos de arginina. Adequadamente, cada domínio catiônico contém 4, 5, 6 ou mais resíduos de arginina.
Adequadamente, os domínios catiônicos compreendem não mais do que 3 resíduos de arginina contíguos, adequadamente não mais do que 2 resíduos de arginina contíguos.
[00107] Adequadamente, os domínios catiônicos compreendem unidades de aminoácidos selecionadas a partir dos seguintes: RBR, RXR, XXR, XRR, RRX, BXR, RXB, XRB, RBB, BRB, BBR, RRB, BRR e BRX R, H, B, RR, HH, BB, RH, HR, RB, BR, HB, BH, RBR, RBB, BRR, BBR, BRB, RBH, RHB, HRB, BRH,
HRR, RRH, HRH, HBB, BBH, RHR, BHB, HBH, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00108] Adequadamente, os domínios catiônicos são formados por unidades de aminoácidos selecionadas a partir de: R, RR, RJR, RRJ, JRR em qualquer combinação ou ordem. Em que J representa qualquer aminoácido não natural.
[00109] Adequadamente, os domínios catiônicos podem compreender ou consistir em (RXR) n onde n = 2, 3 ou 4; [SEQ ID №s: 1-3] e/ou (RBR) n onde n = 2, 3 ou 4; [SEQ ID №s: 4- 6] e/ou (RHR) n onde n = 2, 3 ou 4 [SEQ ID №s: 7-9].
[00110] Adequadamente, um domínio catiônico também pode incluir resíduos de serina, prolina e/ou hidroxiprolina. Adequadamente, os domínios catiônicos podem compreender ainda unidades de aminoácidos selecionadas a partir dos seguintes: RP, PR, PP, RPR, RRP, PRR, PRP, Hyp; R[Hyp]R, RR[Hyp], [Hyp]RR, [Hyp]R[Hyp], [Hyp][Hyp]R, R[Hyp][Hyp], SB, BS ou qualquer combinação destes, ou qualquer combinação com as unidades de aminoácidos listadas acima.
[00111] Adequadamente, os domínios hidrofóbicos podem compreender uma das seguintes sequências: ZAA, ZA, Z, AZA, AZ, ZAZ, ZZA e ZZZ;
[00112] Em que Z representa resíduo de ácido 1,2,3,4- tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico (TIC).
[00113] Em que A representa um resíduo de aminoácido hidrofóbico conforme definido acima.
[00114] Adequadamente, os domínios hidrofóbicos são selecionados a partir de uma das seguintes sequências: GFTGPL (SEQ ID NO.10), QFL, Z, ZL, F, FL, FQILY (SEQ ID № 11), FQ, WF, QF, FQ e YQFLI (SEQ ID № 12). Adequadamente, os domínios principais são selecionados a partir de uma das seguintes sequências Z, F e FL ou qualquer combinação das mesmas. Em que Z representa resíduo de ácido 1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina-3-carboxílico (TIC).
[00115] Adequadamente, o ou cada domínio hidrofóbico compreende uma das seguintes sequências: YQFLI (SEQ ID №: 12), FQILY (SEQ ID №: 11), ILFQY (SEQ ID №: 13), FQIY (SEQ ID №: 14), WWW , WWPWW (SEQ ID №: 15), WPWW (SEQ ID №: 16), WWPW (SEQ ID №: 17), ILFQ (SEQ ID №: 18), ILIQ (SEQ ID №: 19), IKILFQN (SEQ ID №: 20), IHILFQN (SEQ ID №: 21), IRILFQN (SEQ ID №: 22), IILFQN (SEQ ID №: 23), KILFQN (SEQ ID №: 24), HILFQN (SEQ ID №: 25), RILFQN (SEQ ID №: 26), ILFQN (SEQ ID №: 27), HLIQN (SEQ ID №: 28), KILIQN (SEQ ID №: 29), KILIQY (SEQ ID №: 30), HILIQN (SEQ ID №: 31), RILIQN (SEQ ID №: 32), HILIQY (SEQ ID №: 33), RILIQY (SEQ ID №: 34), ILIQN (SEQ ID №: 35), ILIQY (SEQ ID №: 36) ou qualquer combinação dos mesmos, ou qualquer combinação com o acima unidades de aminoácidos listadas.
[00116] Adequadamente, o carreador de peptídeo pode consistir em uma das seguintes sequências:
RRRRR (SEQ ID №: 37)
RRRRRR (SEQ ID №: 38)
RRRRRRR (SEQ ID №: 39)
RRRRRRRR (SEQ ID №: 40)
(RXRRBR)2 (SEQ ID №: 41)
RXRRBRRXRRBRX (SEQ ID №: 42)
RXRRXRRXRRXRX (SEQ ID №: 43)
RXRRBRRFQILYRBRXR (SEQ ID №:44)
RXRRBRRXRILFQYRXRBRXR (SEQ ID №:45)
RXRRBRRXRILFQYRXRXRXR (SEQ ID №:46)
RXRRXRILFQYRXRRXR (SEQ ID №:47)
RBRRXRRBRILFQYRBRXRBR (SEQ ID №:48)
RBRRXRRBRILFQYRXRBRXR (SEQ ID №:49)
RBRRXRRBRILFQYRXRRXR (SEQ ID №:50)
RBRRXRRBRILFQYRXRBRX (SEQ ID №:51)
RXRRBRRXRILFQYRXRRXR (SEQ ID №:52)
RXRRBRRXRILFQYRXRBRX (SEQ ID №:53)
RXRRBRRXRILFQYRXRBRXR (SEQ ID №:54)
RXRRBRRXRYQFLIRXRBRXR (SEQ ID №:55)
RXRRBRRXRIQFLIRXRBRXR (SEQ ID №:56)
RXRRBRRXRQFLIRXRBRXR (SEQ ID №:57)
RXRRBRRXRQFLRXRBRXR (SEQ ID №:58)
RXRRBRRXYRFLIRXRBRXR (SEQ ID №:59)
RXRRBRRXRFQILYRXRBRXR (SEQ ID №:60)
RXRRBRRXYRFRLIXRBRXR (SEQ ID №:61)
RXRRBRRXILFRYRXRBRXR (SEQ ID №:62) RXRRBRRXRIYQFLIRXRBRXR (SEQ ID №:63) Adequadamente, o carreador de peptídeo pode consistir em uma das seguintes sequências: YQFLIRBRRXRBRXBRXRBYQFLI (SEQ ID №:64) YQFLIRBRRBRBRBRRBYQFLI (SEQ ID №:65) YQFLIRBRRBRBRBBRXRBYQFLI (SEQ ID №:66) Adequadamente, o carreador de peptídeo pode consistir em uma das seguintes sequências: RBRRBRRFQILYRBRBR (SEQ ID №:67) RBRRBRRYQFLIRBRBR (SEQ ID №:68) RBRRBRRILFQYRBRBR (SEQ ID №:69) RBRRBRFQILYBRBR (SEQ ID №:70) RBRRBRRFQILYRBHBH (SEQ ID №:71) RBRRBRRFQILYHBHBR (SEQ ID №:72) RBRRBRFQILYRBHBH (SEQ ID №:73) Adequadamente, o carreador de peptídeo é N-terminalmente modificado. Adequadamente, o carreador de peptídeo é N- acetilado, N-metilado, N-trifluoroacetilado, N- trifluorometilsulfonilado ou N-metilsulfonilado ou modificado com ácidos graxos adicionais. Adequadamente, o carreador de peptídeo é N-acetilado.
[00117] Opcionalmente, o terminal N do carreador de peptídeo pode ser não modificado.
[00118] Em uma modalidade, o carreador de peptídeo é
N-acetilado.
[00119] Adequadamente, o carreador é conectado ao ligante por ligação covalente. Adequadamente, o ligante pode ser covalentemente ligado ao carreador por uma ligação amida, uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação dissulfeto, uma ligação tioéter. Adequadamente, o carreador é conectado ao ligante por uma ligação amida ou uma ligação éster.
Molécula Terapêutica
[00120] O conjugado da invenção compreende uma molécula terapêutica conectada a uma molécula carreadora para formar o referido conjugado, o conjugado auxilia no transporte da molécula terapêutica para o alvo terapêutico relevante.
[00121] A molécula terapêutica pode ser qualquer molécula para o tratamento de uma doença. A molécula terapêutica pode ser selecionada a partir de: um ácido nucleico, ácido nucleico de peptídeo, oligonucleotídeo, oligonucleotídeo anti-sentido (como PNA, PMO), mRNA, gRNA (por exemplo, no uso de tecnologia CRISPR/Cas9), RNA de interferência curto, micro RNA, antagomiRNA, peptídeo, peptídeo cíclico, proteína, produto farmacêutico, droga ou nanopartícula.
[00122] As proteínas terapêuticas podem ser selecionadas a partir de: um anticorpo, um antígeno, um domínio VH, um domínio VL, uma molécula scFv, uma fração Fc,
um receptor ou domínio extracelular do mesmo, um Fab e uma porção de ligação ao receptor de um ligante, uma enzima , um fator de crescimento, uma interleucina, uma citocina, uma quimiocina.
[00123] Adequadamente, a molécula terapêutica é um ácido nucleico. Adequadamente, a molécula terapêutica é um oligonucleotídeo, que pode ser um oligonucleotídeo anti- sentido.
[00124] A sequência de ácido nucleico terapêutica pode ser selecionada a partir de qualquer um que esteja disponível, por exemplo, oligonucleotídeos anti-sentido para salto de éxon em DMD são descritos em https://research- repository.uwa.edu.au/en/publications/antisense- oligonucleotide-induced-exon-skipping-across-the-human-, ou um oligonucleotídeo anti-sentido terapêutico complementar à sequência ISSN1 ou IN7 para o tratamento de SMA são descritos em Zhou, HGT, 2013; e Hammond et al, 2016; e Osman et al, HMG, 2014. Em uma modalidade, a molécula terapêutica é um oligonucleotídeo anti-sentido.
[00125] Adequadamente, o oligonucleótido anti-sentido é constituído por um oligonucleótido fosforodiamidato morfolino (PMO).
[00126] Alternativamente, o oligonucleotídeo pode ser um PMO modificado ou qualquer outro oligonucleotídeo de carga neutra, como um ácido nucleico de peptídeo (PNA), um PNA quimicamente modificado, como um gama-PNA (Bahal, Nat.Comm.
2016), oligonucleotídeo fosforamidato (onde o oxigênio sem ponte do fosfato é substituído por uma amina ou alquilamina, tais como aquelas descritas em WO2016028187A1, ou qualquer outro oligonucleotídeo parcialmente ou totalmente neutralizado com carga.
[00127] Em uma modalidade, a molécula terapêutica do conjugado é um oligonucleotídeo complementar ao pré-mRNA de um gene alvo. Em uma modalidade, a molécula terapêutica é um siRNA.
[00128] Adequadamente, o oligonucleotídeo complementar ao pré-mRNA de um gene alvo dá origem a um evento de bloqueio estérico que altera o pré-mRNA levando a um mRNA alterado e, portanto, a uma proteína de sequência alterada.
[00129] Adequadamente, o evento de bloqueio estérico pode ser inclusão de éxon ou salto de éxon. Em uma modalidade, o evento de bloqueio estérico é o salto de éxon.
Adequadamente, a molécula terapêutica é uma sequência de oligonucleotídeo para induzir o salto de éxon.
Adequadamente, a molécula terapêutica é uma sequência de oligonucleotídeo que pode induzir o salto de éxon de um ou múltiplos éxons.
[00130] Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de uma doença genética. Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de uma doença genética hereditária. Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de uma doença genética hereditária ligada ao X.
[00131] Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de doenças neuromusculares genéticas.
Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de doenças genéticas do sistema neuromuscular.
Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de doenças genéticas hereditárias do sistema neuromuscular. Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de doenças neuromusculares genéticas hereditárias. Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de doenças genéticas hereditárias ligadas ao X do sistema neuromuscular. Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de doenças neuromusculares hereditárias ligadas ao X.
[00132] Adequadamente, em qualquer uma das modalidades acima, a molécula terapêutica é um ácido nucleico, adequadamente um oligonucleotídeo, adequadamente um oligonucleotídeo anti-sentido.
[00133] Adequadamente, a molécula terapêutica é para uso no tratamento de DMD. Adequadamente, a molécula terapêutica para uso no tratamento de DMD é um ácido nucleico, adequadamente um oligonucleotídeo anti-sentido.
[00134] Adequadamente, a sequência de oligonucleotídeo anti-sentido é para induzir o salto de éxon no gene da distrofina para uso no tratamento de DMD.
[00135] Em uma modalidade, a sequência de oligonucleotídeo anti-sentido é para induzir o salto de éxon de um único éxon do gene da distrofina para uso no tratamento de DMD. Adequadamente, o éxon único é selecionado a partir de qualquer éxon implicado em DMD, que pode ser qualquer éxon no gene da distrofina, tal como, por exemplo, éxon 45, 51 ou 53. Adequadamente, o uso médico da molécula terapêutica é o mesmo que o uso médico do conjugado compreendendo a referida molécula terapêutica. Portanto, adequadamente, qualquer um dos usos médicos descritos neste relatório em relação à molécula terapêutica se aplica igualmente ao conjugado da invenção.
[00136] Os oligonucleotídeos de PMO de qualquer sequência podem ser adquiridos (por exemplo, de Gene Tools Inc, EUA).
[00137] Opcionalmente, os resíduos de lisina podem ser adicionados a uma ou ambas as extremidades de uma molécula terapêutica (como um PMO ou PNA) antes da ligação ao peptídeo para melhorar a solubilidade em água.
[00138] Adequadamente, a molécula terapêutica tem um peso molecular inferior a 5.000 Da, adequadamente inferior a 3.000 Da ou adequadamente inferior a 1.000 Da.
Molécula de Imagem
[00139] O conjugado da invenção pode igualmente compreender uma molécula de imagem conectada a uma molécula carreadora, a fim de fornecer o referido conjugado.
[00140] Uma molécula de imagem pode ser qualquer molécula que permite a visualização do conjugado.
Adequadamente, a molécula de imagem pode indicar a localização do conjugado. Adequadamente, a localização do conjugado in vitro ou in vivo. Adequadamente, é fornecido um método de monitoramento da localização de um conjugado compreendendo uma molécula de imagem compreendendo: administrar o conjugado a um sujeito e gerar imagem do sujeito para localizar o conjugado.
[00141] Exemplos de moléculas de imagem incluem moléculas de detecção, moléculas de contraste ou moléculas de intensificação. Moléculas de imagem adequadas podem ser selecionadas a partir de radionuclídeos; fluoróforos; nanopartículas (como uma nanoconcha); nanocages; agentes cromogênicos (por exemplo, uma enzima), radioisótopos, corantes, materiais radiopacos, compostos fluorescentes e suas combinações.
[00142] Adequadamente Moléculas de imagem são visualizadas usando técnicas de imagem, estas podem ser técnicas de imagem celular ou técnicas de imagem médica. As técnicas de imagem celular adequadas incluem citometria de imagem, microscopia fluorescente, microscopia de contraste de fase, SEM, TEM, por exemplo. As técnicas de imagiologia médica adequadas incluem raios X, fluoroscopia, MRI, cintilografia, SPECT, PET, CT, CAT, FNRI, por exemplo.
[00143] Em alguns casos, a molécula de imagem pode ser considerada uma molécula de diagnóstico. Adequadamente, uma molécula de diagnóstico permite o diagnóstico de uma doença usando o conjugado. Adequadamente, o diagnóstico de uma doença pode ser alcançado através da determinação da localização do conjugado usando uma molécula de imagem.
Adequadamente, é fornecido um método de diagnóstico de uma doença que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um conjugado que compreende uma molécula de imagem a um sujeito e o monitoramento da localização do conjugado.
[00144] Adequadamente, os detalhes do ligante de um conjugado que compreende uma molécula de imagem são iguais aos descritos acima em relação a um conjugado que compreende uma molécula terapêutica.
[00145] Adequadamente, o conjugado é capaz de penetrar nas células e tecidos, adequadamente no núcleo das células. Adequadamente em tecidos musculares.
Conjugado
[00146] Um conjugado da invenção compreende pelo menos um carreador ligado a pelo menos uma molécula terapêutica usando pelo menos um ligante conforme definido de acordo com o primeiro aspecto.
[00147] Adequadamente, um ligante da invenção pode ser usado para conectar um carreador a uma ou mais moléculas terapêuticas a fim de fornecer um conjugado. Adequadamente, portanto, um ou mais ligantes da invenção podem ser usados para conectar um carreador a uma ou mais moléculas terapêuticas.
[00148] Adequadamente, o carreador está ligado a pelo menos uma molécula terapêutica por meio de pelo menos um ligante. Adequadamente, portanto, o conjugado da invenção compreende um carreador ligado a pelo menos uma molécula terapêutica por meio de pelo menos um ligante.
[00149] Adequadamente, o conjugado pode compreender mais de um ligante e/ou mais de uma molécula terapêutica.
[00150] Em uma modalidade, o conjugado compreende um carreador covalentemente ligado por meio de um ligante a uma molécula terapêutica. Adequadamente, o conjugado pode compreender ou consistir na seguinte estrutura: [carreador] – [ligante] - [molécula terapêutica]
[00151] Adequadamente, o carreador pode ser ligado a duas moléculas terapêuticas. Em tal modalidade, o conjugado pode compreender um carreador covalentemente ligado por meio de um ligante a duas moléculas terapêuticas. Adequadamente, o conjugado pode compreender ou consistir na seguinte estrutura:
[molécula terapêutica] [carreador] – [ligante] [molécula terapêutica]
[00152] Alternativamente, o conjugado pode compreender um carreador covalentemente ligado por meio de dois ligantes a duas moléculas terapêuticas. Adequadamente, o conjugado pode compreender ou consistir na seguinte estrutura: [ligante] - [molécula terapêutica] [carreador] [ligante] - [molécula terapêutica];
[00153] Alternativamente, o conjugado pode compreender ou consistir na seguinte estrutura: [molécula terapêutica] – [ligante] – [carreador] – [ligante] – [molécula terapêutica]
[00154] Adequadamente, o conjugado pode compreender mais de um carreador. Adequadamente, cada carreador é covalentemente ligado por meio de um ligante. Adequadamente, não há dois carreadores contíguos. Adequadamente, o conjugado pode compreender dois carreadores. Adequadamente, portanto, o conjugado pode compreender um primeiro carreador e um segundo carreador, adequadamente ligados por meio de um primeiro ligante e um segundo ligante. Adequadamente, cada carreador pode ser igual ou diferente. Adequadamente, cada ligante pode ser igual ou diferente. Adequadamente, cada carreador pode ter uma função particular. Adequadamente, pelo menos um carreador tem a função de penetração celular.
No entanto, outras funções de carreador podem incluir ligação ao receptor, ativação de enzima, inibição de enzima, modulação de solubilidade, modulação de meia-vida, indicação, detecção, modulação de estabilidade, conformação ou modulação de orientação e semelhantes.
[00155] Em uma modalidade, o conjugado compreende um primeiro carreador covalentemente ligado por um primeiro ligante a um segundo carreador, o referido segundo carreador sendo covalentemente ligado a um segundo ligante e o referido segundo ligante sendo covalentemente ligado a uma molécula terapêutica.
[00156] Adequadamente, o conjugado pode compreender ou consistir na seguinte estrutura: [carreador] – [ligante] – [carreador] – [ligante] – [molécula terapêutica]
[00157] Em uma modalidade, o primeiro carreador tem a função de penetração celular e o segundo carreador tem a função de ligação ao receptor.
[00158] Adequadamente, o conjugado da invenção pode existir em qualquer orientação. Adequadamente, portanto, as conformações do conjugado acima podem ser invertidas.
[00159] Adequadamente, em qualquer uma das modalidades acima, a ou cada molécula terapêutica pode ser substituída por uma molécula de imagem. Adequadamente, em qualquer uma das modalidades acima, o conjugado pode compreender ainda uma ou mais moléculas de imagem.
Adequadamente, a ou cada molécula de imagem pode ser conectada à ou a cada molécula terapêutica, ou a ou a cada carreador. Adequadamente, a ou cada molécula de imagem pode ser conectada por um outro ligante. Adequadamente, o ligante adicional pode ser um ligante da invenção. Adequadamente, o ligante e qualquer outro ligante podem ser iguais ou diferentes.
[00160] Adequadamente, qualquer um dos carreadores listados aqui pode ser usado em um conjugado de acordo com a invenção. Adequadamente, qualquer molécula terapêutica aqui listada pode ser usada em um conjugado de acordo com a invenção.
Composições farmacêuticas
[00161] Um conjugado da invenção pode ser formulado em uma composição farmacêutica para entrega a um sujeito em necessidade.
[00162] Adequadamente, a composição farmacêutica compreende um conjugado da invenção.
[00163] Adequadamente, a composição farmacêutica pode compreender ainda um diluente, adjuvante ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[00164] Diluentes, adjuvantes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica.
[00165] Como aqui utilizado, a frase "farmaceuticamente aceitável" se refere aos ligantes, materiais, formulações e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico sensato, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem excessos toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação proporcional a uma relação risco/benefício razoável.
[00166] A frase "carreador farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, se refere a um material, formulação ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante, envolvido no carreamento ou transporte do conjugado de um órgão ou parte do corpo, a outro órgão ou parte do corpo. Cada peptídeo de penetração celular deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros componentes da composição, por exemplo, o peptídeo e a molécula terapêutica, e não é prejudicial ao indivíduo. As composições liofilizadas, que podem ser reconstituídas e administradas, também estão dentro do escopo da presente composição.
[00167] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser, por exemplo, excipientes, veículos, diluentes e combinações dos mesmos. Por exemplo, quando as composições se destinam a ser administradas por via oral, podem ser formuladas como comprimidos, cápsulas, grânulos, pós ou xaropes; ou para administração parentérica, eles podem ser formulados como injeções, preparações para infusão de gotas, nebulizadores, aerossóis ou supositórios. Estas composições podem ser preparadas por meios convencionais e, se desejado, o composto ativo (isto é, conjugado) pode ser misturado com qualquer aditivo convencional, tal como um excipiente, um aglutinante, um agente desintegrante, um lubrificante, um corretivo, um agente solubilizante, um auxiliar de suspensão, um agente emulsificante, um agente de revestimento ou combinações dos mesmos.
[00168] Deve ser entendido que as composições farmacêuticas da presente divulgação podem incluir ainda agentes terapêuticos conhecidos adicionais, fármacos, modificações de compostos em pró-fármacos e semelhantes para aliviar, mediar, prevenir e tratar as doenças, distúrbios e condições aqui descritas sob uso médico.
[00169] Adequadamente, a composição farmacêutica é para uso como um medicamento. Adequadamente para uso como um medicamento da mesma maneira que aqui descrito para o conjugado. Todas as características aqui descritas em relação ao tratamento médico usando o conjugado se aplicam à composição farmacêutica.
[00170] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de uma doença ou condição em um sujeito em necessidade, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica de acordo com o terceiro aspecto ao sujeito.
Usos Médicos
[00171] O conjugado da invenção pode ser usado como um medicamento para o tratamento de uma doença.
[00172] O medicamento pode estar na forma de uma composição farmacêutica conforme definido acima.
[00173] Em um aspecto adicional, um método de tratamento de uma doença ou condição em um sujeito em necessidade também é fornecido, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de acordo com o primeiro aspecto ao sujeito.
[00174] Adequadamente, o tratamento médico requer a entrega da molécula terapêutica em um tecido ou uma célula, adequadamente no núcleo da célula, adequadamente após a injeção sistêmica.
[00175] As doenças a serem tratadas podem incluir qualquer doença em que a penetração melhorada da célula e/ou membrana nuclear por uma molécula terapêutica pode levar a um efeito terapêutico melhorado.
[00176] Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de uma doença definida pelo uso terapêutico da molécula terapêutica.
[00177] Adequadamente, os conjugados compreendendo ligantes da invenção são adequados para o tratamento de doenças genéticas. Os conjugados adequados compreendendo ligantes da invenção são adequados para o tratamento de doenças genéticas hereditárias. Os conjugados adequados compreendendo ligantes da invenção são adequados para o tratamento de doenças genéticas hereditárias ligadas ao X.
Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de doenças do sistema neuromuscular. Os conjugados adequados compreendendo ligantes da invenção são adequados para o tratamento de doenças genéticas do sistema neuromuscular. Em uma modalidade adequada, é fornecido um conjugado de acordo com o primeiro aspecto para uso no tratamento de doenças genéticas do sistema neuromuscular.
[00178] Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de doenças genéticas hereditárias do sistema neuromuscular. Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de doenças neuromusculares genéticas hereditárias. Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de doenças genéticas hereditárias ligadas ao X do sistema neuromuscular. Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de doenças neuromusculares hereditárias ligadas ao X.
[00179] Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de doenças causadas por deficiências de splicing.
Em tais modalidades, a molécula terapêutica pode compreender um oligonucleotídeo capaz de prevenir ou corrigir o defeito de splicing e/ou aumentar a produção de moléculas de mRNA corretamente splicing como descrito acima. Adequadamente, em tais modalidades, a molécula terapêutica é um oligonucleotídeo anti-sentido como explicado acima.
[00180] Adequadamente, o conjugado é para uso no tratamento de qualquer uma das seguintes doenças: Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Bucher (BMD), Doença de Menkes, Beta-talassemia, demência, Doença de Parkinson, Atrofia Muscular Espinhal (SMA), Huntington Doença, Síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria, Ataxia- telangiectasia ou câncer.
[00181] Em uma modalidade, o conjugado é para uso no tratamento de DMD. Em uma modalidade, é fornecido um conjugado de acordo com o primeiro aspecto para uso no tratamento de DMD.
[00182] Adequadamente, em tal modalidade, a molécula terapêutica do conjugado é operável para restaurar o quadro de leitura do transcrito da distrofina. Adequadamente, a molécula terapêutica do conjugado é operável para induzir a produção de uma proteína distrofina parcialmente funcional truncada internamente. Adequadamente, em tal modalidade, a molécula terapêutica é um oligonucleotídeo anti-sentido como descrito acima na seção relevante. Adequadamente, o paciente ou sujeito a ser tratado pode ser qualquer animal ou humano.
Adequadamente, o paciente ou sujeito pode ser um mamífero não humano. Adequadamente, o paciente ou sujeito pode ser do sexo masculino ou feminino. Em uma modalidade, o sujeito é do sexo masculino.
[00183] Adequadamente, o paciente ou sujeito a ser tratado pode ter qualquer idade. Adequadamente, o paciente ou sujeito a ser tratado tem idade entre 0-40 anos, adequadamente 0-30, adequadamente 0-25, adequadamente 0-20 anos de idade.
[00184] Adequadamente, o conjugado é para administração sistêmica a um sujeito, por exemplo, pelas vias intramedular, intratecal, intraventricular, intravítrea, enteral, parenteral, intravenosa, intra- arterial, intramuscular, intratumoral, intracraniana, intrastratium, intraventricular, subcutânea oral ou nasal.
[00185] Em uma modalidade, o conjugado é para administração a um sujeito por via intravenosa.
[00186] Em uma modalidade, o conjugado é para administração a um sujeito por injeção.
[00187] Adequadamente, o conjugado é para administração a um sujeito em uma "quantidade terapeuticamente eficaz", o que significa que a quantidade é suficiente para mostrar benefício para o indivíduo. A quantidade real administrada e a taxa e o tempo de administração dependerão da natureza e gravidade da doença a ser tratada. As decisões sobre a dosagem são da responsabilidade dos clínicos gerais e outros médicos.
Exemplos das técnicas e protocolos podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª edição, 2000, pub.
Lippincott, Williams & Wilkins.
[00188] Doses exemplares podem estar entre 0,01 mg/kg e 200 mg/kg, 0,05 mg/kg e 160 mg/kg, 0,1 mg/kg e 140 mg/kg, 0,5 mg/kg e 120 mg/kg, 1 mg/kg e 100 mg/kg, 2 mg/kg e 80mg/kg, 5mg/kg e 60mg/kg, 10mg/kg e 50mg/kg ou qualquer valor entre eles.
[00189] Vantajosamente, a dosagem dos conjugados da presente invenção é uma ordem ou magnitude inferior à dosagem necessária para ver qualquer efeito da molécula terapêutica sozinha.
[00190] Adequadamente, o conjugado da presente invenção pode ser usado em métodos in vitro, adequadamente em métodos de laboratório in vitro. Adequadamente, os conjugados da presente invenção podem ser usados em um método in vitro para testar a eficácia de uma molécula terapêutica candidata. Adequadamente, o método in vitro pode ser um ensaio. Por exemplo, um conjugado da invenção pode ser usado em um ensaio de correção de splice, um ensaio de salto de éxon, ensaio de estabilidade do soro, um ensaio de viabilidade celular ou uma restauração de um ensaio de proteína truncada parcialmente funcional.
[00191] Adequadamente, o termo "in vitro" pretende abranger experiências com células em cultura, enquanto que o termo "in vivo" pretende abranger experiências com organismos multicelulares intactos.
[00192] Em uma modalidade, o conjugado é para administração a um sujeito para subsequente avaliação celular in vitro.
Toxicidade
[00193] O uso dos conjugados da presente invenção compreendendo um ligante conforme definido no primeiro aspecto para conectar uma molécula carreadora e uma molécula terapêutica reduz vantajosamente a toxicidade do conjugado.
Consequentemente, a toxicidade dos conjugados da invenção é vantajosamente menor do que os conjugados anteriores, tais como aqueles discutidos acima e demonstrados nos exemplos.
[00194] Adequadamente, após a administração dos conjugados da presente invenção, um ou mais marcadores de toxicidade são significativamente reduzidos em comparação com os conjugados anteriores usando ligantes atualmente disponíveis.
[00195] Os marcadores adequados de toxicidade podem ser marcadores de nefrotoxicidade ou hepatotoxicidade.
[00196] Os marcadores de toxicidade adequados incluem KIM-1, NGAL, BUN, creatinina, fosfatase alcalina, alanina transferase e aspartato aminotransferase.
[00197] Adequadamente, o nível de pelo menos um de KIM-1, NGAL e BUN é reduzido após a administração dos conjugados da presente invenção quando comparado com conjugados usando ligantes atualmente disponíveis.
[00198] Adequadamente, os níveis de cada um de KIM- 1, NGAL e BUN são reduzidos após a administração dos conjugados da presente invenção quando comparados aos conjugados usando ligantes atualmente disponíveis.
[00199] Adequadamente, os níveis do ou de cada marcador(es) são significativamente reduzidos em comparação com os conjugados anteriores.
[00200] Adequadamente, os níveis do ou de cada marcador(es) são reduzidos em até 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% após a administração dos conjugados da presente invenção quando comparada com conjugados usando ligantes atualmente disponíveis.
[00201] Adequadamente, portanto, os conjugados da presente invenção têm nefrotoxicidade reduzida quando comparados aos conjugados usando ligantes atualmente disponíveis.
[00202] Os níveis de KIM-1/creatinina são descritos como sendo uma indicação útil para a toxicidade de CPPs e conjugados de CPP. Em particular, os níveis de KIM- 1/creatinina são úteis para indicar a toxicidade de conjugados de CPP ricos em arginina; Vaidya et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2008, 48, 463-493, Chaturvedi et al., Int. J. Biol. Sci. 2009, 5, 128-134 e Zhou et al., Sci Reports, 2016, 6, 38930.
[00203] Adequadamente, o nível de KIM-1/creatinina é reduzido após a administração dos conjugados da presente invenção quando comparado com os conjugados usando ligantes atualmente disponíveis. Adequadamente, o nível de KIM- 1/creatinina é significativamente reduzido após a administração dos conjugados da presente invenção quando comparado com os conjugados usando ligantes atualmente disponíveis.
[00204] Adequadamente, o nível de KIM-1/creatinina é reduzido em até 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% após a administração dos conjugados que compreendem um ligante da presente invenção quando comparado a conjugados usando ligantes atualmente disponíveis.
[00205] Vantajosamente, a toxicidade dos conjugados é significativamente reduzida em comparação com os peptídeos de penetração celular anteriores e seus conjugados. Em particular, KIM-1/creatinina é um marcador de toxicidade e isso é significativamente reduzido em até 10 vezes, 20 vezes,
30 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 110 vezes, 120 vezes ao usar o conjugado da invenção compreendendo o ligante definido em comparação com os conjugados anteriores.
[00206] Uma redução nos níveis de KIM-1/creatinina indica que há uma redução na lesão renal e aumento na filtração glomerular. Acredita-se que os níveis reduzidos de KIM-1/creatinina sejam uma consequência da redução das células epiteliais do túbulo proximal desdiferenciado que estão frequentemente presentes nos rins após uma lesão isquêmica ou tóxica (Chaturvedi et al., 2009 Int. J. Biol.
Sci.). Os níveis de Kim-1/creatinina são amplamente usados para avaliar a toxicidade de agentes terapêuticos.
Breve descrição dos desenhos
[00207] Certas modalidades da presente invenção serão agora descritas com referência às seguintes figuras e tabelas nas quais: Figura 1: mostra os níveis relativos do marcador 1 de lesão renal urinária (KIM-1) normalizado para creatinina urinária medida na urina de camundongos C57BL/6 no dia 2 e no dia 7 após a administração de uma dose única de 30 mg/kg de peptídeo DPEP3.1 conjugado por meio de diferentes ligantes a um PMODMD anti-sentido terapêutico, em comparação com controle de solução salina 0,9% e carreadores de peptídeo atualmente disponíveis (R6Gly- e Pip9b2-) conjugados com o mesmo PMODMD anti-sentido terapêutico (barras de erro: média com SEM, n = 3-10).
[00208] Figura 2: mostra a eficácia in vivo do peptídeo DPEP3.1 conjugado por meio de diferentes ligantes a um PMODMD anti-sentido terapêutico em (A) tibial anterior, (B) diafragma e (C) músculo cardíaco após uma única administração de bolus intravenoso de 30 mg/kg em camundongos C57BL/6. A eficácia foi medida 7 dias após a administração por qPCR para salto de éxon da distrofina (éxon 23). A eficiência de salto de éxon foi usada em comparação com o controle de solução salina 0,9% e os carreadores de peptídeo atualmente disponíveis (R6Gly- e Pip9b2-) conjugados com o mesmo PMODMD anti-sentido terapêutico. Outlier para DPEP3.1d- PMODMD sugere uma injeção perdida. (barras de erro: média com SEM, n = 3-10).
[00209] Figura 3: mostra os níveis relativos do marcador 1 de lesão renal urinária (KIM-1) normalizado para creatinina urinária medida na urina de camundongos C57BL/6 no dia 2 e no dia 7 após a administração de uma dose única de 10 mg/kg , 30 mg/kg ou 50 mg/kg de peptídeo DPEP1.9 conjugado através de diferentes ligantes a um PMODMD anti- sentido terapêutico, em comparação com controle de solução salina 0,9% e carreadores de peptídeo atualmente disponíveis (R6Gly- e Pip9b2-) conjugados com o mesmo anti-sentido terapêutico PMODMD (barras de erro: média com SEM, n = 3-10).
[00210] Figura 4: mostra a eficácia in vivo do peptídeo conjugado DPEP1.9 através de diferentes ligantes a um PMODMD anti-sentido terapêutico em (A) tibial anterior, (B) diafragma e (C) músculo cardíaco após um único 10 mg/kg, 30 mg/kg ou 50 mg/kg de administração em bolus intravenoso em camundongos C57BL/6. A eficácia foi medida 7 dias após a administração por qPCR para salto de éxon da distrofina (éxon 23). A eficiência de salto de éxon foi usada em comparação com o controle de solução salina 0,9% e os carreadores de peptídeo atualmente disponíveis (R6Gly- e Pip9b2-) conjugados com o mesmo PMODMD anti-sentido terapêutico (barras de erro: média com SEM, n = 3-10).
[00211] Figuras 5 e 7: mostram que diferentes DPEP1/3- [CAG]7 conjugados usando ligantes a, b e d em várias concentrações corrigiram defeitos de splicing de transcritos dependentes de Mbnl1 em mioblastos de pacientes com DM1 derivados de pacientes com DM1 com 2600 repetições de CTG na DMPK gene; Figura 6: mostra diferentes conjugados DPEP1/3-[CAG]7 PMO usando ligantes a, b e d em várias concentrações corrigir defeitos de splicing de transcritos de DMD in vitro em mioblastos de pacientes com DM1 derivados de pacientes com DM1 com 2600 repetições no gene DMPK em várias concentrações; Figura 8: mostra a porcentagem de viabilidade de células de mioblastos de mioblastos de pacientes com DM1 com 2600 repetições de CTG 48 horas transfectadas com várias doses de diferentes conjugados de DPEP1/3-[CAG]7 usando ligantes a, b e d.
A concentração do conjugado pode ser aumentada várias vezes em relação aos níveis terapêuticos, sem causar mortalidade celular;
Figura 9: mostra a porcentagem de viabilidade de células de hepatócitos transfectadas com 40 uM de diferentes conjugados de DPEP1/3-[CAG]7 usando ligantes a, b e d.
A concentração do conjugado pode ser aumentada várias vezes em relação aos níveis terapêuticos sem causar mortalidade celular, ao contrário dos conjugados Pip6a;
Figuras 10 e 11: mostram marcadores de toxicologia da urina do Dia 2 e Dia 7 após a injeção de diferentes conjugados
DPEP1/3- [CAG]7 PMO para camundongos fêmeas C57BL6 medidos por ELISA (R&D cat # MKM100) com amostras diluídas para caber dentro do padrão curva.
Os valores foram normalizados para os níveis de creatinina urinária (Harwell) para contabilizar a concentração de proteína na urina.
Os níveis de KIM-1 foram semelhantes às injeções de controle de solução salina em comparação com os aumentos induzidos pela série Pip anterior de carreadores de peptídeo;
Figuras 12 e 13: mostram marcadores de toxicologia avaliados no soro de camundongos C57BL6 fêmeas (8-10 semanas de idade, n = 5 por grupo), aos quais foi administrada injeção de bolus IV (veia da cauda) de diferentes DPEP1/3-
[CAG]7 PMO conjuga-se com diferentes ligantes. No dia 7 pós- injeção, coleta de soro em comparação com solução salina.
Todos os níveis foram semelhantes às injeções de controle de solução salina no dia 7 após a injeção.
[00212] Ao longo da descrição e reivindicações deste relatório descritivo, as palavras "compreende" e "contém" e variações delas significam "incluindo, mas não se limitando a", e não se destinam a (e não excluem) outras frações, aditivos, componentes, inteiros ou etapas. Ao longo da descrição e reivindicações desta especificação, o singular engloba o plural, a menos que o contexto exija de outra forma. Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o relatório descritivo deve ser entendido como contemplando a pluralidade, bem como a singularidade, a menos que o contexto exija o contrário.
[00213] Características, números inteiros, características, compostos, frações químicas ou grupos descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ou exemplo particular da invenção devem ser entendidos como sendo aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo descrito neste relatório, a menos que seja incompatível com eles. Todas as características divulgadas neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo assim divulgado, podem ser combinadas em qualquer combinação, exceto combinações onde pelo menos algumas dessas características e/ou etapas são mutuamente exclusivas. A invenção não está restrita aos detalhes de quaisquer modalidades anteriores.
[00214] A invenção se estende a qualquer nova, ou qualquer nova combinação, das características divulgadas neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos), ou a qualquer nova, ou qualquer nova combinação, das etapas de qualquer método ou processo tão divulgado. A atenção do leitor é direcionada a todos os papéis e documentos que são arquivados simultaneamente ou anteriores a esta especificação em conexão com este pedido e que estão abertos à inspeção pública com esta especificação, e o conteúdo de todos esses papéis e documentos são incorporados aqui por referência.
Exemplos
1. Material e métodos
1.1 Materiais
[00215] L-aminoácidos protegidos com 9- fluroenilmetoxicarbonila (Fmoc), benzotriazol-1-il-oxi- tris-pirrolidino-fosfônio (PyBOP), resina de amida Rink (0,46 mmol·g-1) e o Fmoc-β-Ala-OH resina Wang pré-carregada (0,19 ou 0,46 mmol·g-1) foi obtida da Merck Millipore (Hohenbrunn, Alemanha). A resina Tentagel Hydroxy-tritila foi adquirida na Rapp Polymere (Tuebingen, Alemanha). A acetonitrila de grau HPLC, metanol e N-metil-2-pirrolidona de grau de síntese (NMP) foram adquiridos a Fisher Scientific (Loughborough, UK). Síntese de peptídeos de grau N, N- dimetilformamida (DMF) e éter dietílico foram obtidos de VWR (Leicestershire, UK). A piperidina e o ácido trifluoroacético (TFA) foram obtidos na Alfa Aesar (Heysham, Inglaterra). Os PMOs foram adquiridos da Gene Tools Inc.
(Philomath, EUA). A espectrometria de massa MALDI-TOF foi realizada usando uma estação de trabalho Voyager DE Pro BioSpectrometry (Applied Biosystems, Cheshire UK). Uma solução estoque de 10 mg·mL-1 de ácido--ciano-4- hidroxicinâmico ou ácido sinapínico em 50% de acetonitrila em água foi usada como matriz. HPLC analítica e semi- preparativa foi realizada em um Varian 940-LC HPLC System (Yarnton, UK). Meio DMEM (31966047), soro fetal bovino (FBS) (10270106), solução antibiótica antimicótica (A5955), brometo de etídio (15585011), 2x ReddyMix PCR Master Mix (AB0575DCLDB), O sistema de síntese de primeira fita M-MLV (28025013) e o reagente TRIzol (15596026) foram adquiridos na ThermoFisher Scientific. O Ensaio de Viabilidade Celular MT RealTime-Glo™ (G9711), o Maxwell® 16 Total RNA Purification Kit (AS1050) foram adquiridos na Promega. As células de mioblastos foram cultivadas com o kit de mídia de crescimento de células de músculo esquelético da PromoCell (C-23160). A insulina (91077C) e a agarose (A9539) eram da
SigmaAldrich. DNA Marker - HyperLadder 50bp (BIO-33039) foi da BioLine Reagents. Todos os iniciadores foram solicitados por IDT. Para a coleta de urina, os camundongos foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas da Tecniplast, Reino Unido, e o biomarcador urinário ELISA para o marcador de lesão renal-1 (KIM-1) (MKM100) foi de R&D.
Todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich (Reino Unido), a menos que indicado de outra forma.
1.2 Síntese de conjugados de peptídeo-PMO
1.2.1 Síntese de variantes de peptídeos via sintetizador de micro-ondas
[00216] Os peptídeos foram sintetizados em uma escala de 100 µmol usando um Sintetizador de peptídeos de micro- ondas CEM Liberty BlueTM (Buckingham, Reino Unido) e química Fmoc seguindo as recomendações do fabricante. Os péptidos sintetizados com ácido glutâmico ou ácido succínico como ligante foram sintetizados com uma resina de amida Rink para proporcionar uma amida no terminal carboxila do peptídeo após clivagem por TFA. Os peptídeos com um ligante ß-alanina foram sintetizados usando uma resina Wang pré-carregada. Uma lista completa dos peptídeos sintetizados com seus métodos e ligantes está resumida na Tabela 1. Os grupos de proteção da cadeia lateral usados eram instáveis ao tratamento com TFA e o peptídeo foi sintetizado usando um excesso de 5 vezes de aminoácidos protegidos por Fmoc (0,25 mmol) que foram ativados usando PyBOP (excesso de 5 vezes) na presença de DIPEA. Piperidina (20% v/v em DMF) foi usada para remover grupos de proteção N-Fmoc. O acoplamento foi realizado uma vez a 75 C por 5 min a uma potência de micro-ondas de 60 watts, exceto para os resíduos de arginina, que foram acoplados duas vezes cada. Cada reação de desprotecção foi realizada a 75 C duas vezes, uma vez durante 30 segundos e, em seguida, uma vez durante 3 minutos à potência de micro- ondas de 35 watts. Uma vez que a síntese foi completada, a resina foi lavada com DMF (3 x 50 mL) e o N-terminal do peptídeo ligado à fase sólida foi acetilado com anidrido acético na presença de DIPEA em temperatura ambiente por 15 min. Após a acetilação do terminal N, a resina peptídica foi lavada com DMF (3 x 20 mL) e DCM (3 x 20 mL). Para os peptídeos DPEP com ácido succínico no terminal N, a acetilação do terminal N não foi realizada. Em vez disso, o N-terminal livre do peptídeo foi tratado com anidrido succínico na presença de DIPEA à temperatura ambiente durante 30 min, seguido de lavagem com DMF (3 x 20 mL). Para os peptídeos DPEP que transportam ácido glutâmico no terminal N como um ligante, o terminal N foi acetilado conforme descrito, mas a ligação do PMO foi realizada no grupo carboxílico da cadeia lateral.
1.2.2 Síntese de variantes de peptídeos via sintetizador Intavis Multipep
[00217] Os peptídeos sintetizados com um ligante de ácido -aminobutírico foram sintetizados em uma resina
Tentagel Cl-tritila em temperatura ambiente usando um sintetizador Intavis Multipep e química Fmoc seguindo as recomendações do fabricante.
A resina Tentagel® Cl-tritil foi preparada a partir da resina Tentagel® Hydroxy-tritil usando cloreto de acetila de acordo com as recomendações do fabricante.
Resumidamente, a resina (1 g) foi lavada com DMF
(2 x 10 mL), DCM seco (3 x 10 mL) e tolueno seco (3 x 10 mL)
transferido para um tubo de fundo redondo equipado com um condensador.
Foi adicionado tolueno suficiente para cobrir a resina e, em seguida, cloreto de acetila foi adicionado gota a gota (1 mL·g-1 de resina, volume total de 1 mL) e a mistura foi aquecida durante 3 h a 60-70 C com agitação suave.
Após a conclusão, a resina foi deixada resfriar à temperatura ambiente e, em seguida, lavada cuidadosamente com tolueno (5 x 15 mL), DMF (5 x 15 mL) e finalmente DCM seco (3 x 15 mL). A resina foi então carregada com ácido
Fmoc--aminobutírico (3 equivalentes) em DCM com DIEA (8 equivalentes) por 15 min, após o qual DIEA adicional (4 equivalentes) foi adicionado e a reação foi deixada misturar para um total de 1 h.
Após 1 h, a resina foi então tampada com MeOH (0,8 mL·g-1) durante 15 min e depois lavada com DMF
(5 x 10 mL) e DCM (5 x 15 mL). O rendimento e o carregamento da resina foram realizados por determinação de Fmoc em um espectrofotômetro de UV/visível a 304nm como sendo 0,41 mmol·g-1 e a resina foi usada imediatamente.
[00218] Normalmente, os peptídeos foram sintetizados em uma escala de 100 µmol usando aminoácidos Fmoc padrão com grupos de proteção de cadeia lateral lábeis a TFA e o peptídeo foi sintetizado usando um excesso de 5 vezes de aminoácidos protegidos por Fmoc (0,50 mmol) que foram ativados usando PyBOP (Excesso de 5 vezes) na presença de 4- metilmorfolina. Passos de acoplamento duplo foram usados seguidos por capeamento com anidrido acético após cada passo.
Piperidina (20% v/v em DMF) foi usada para remover grupos de proteção N-Fmoc. Cada ciclo de desprotecção foi realizado à temperatura ambiente duas vezes, cada uma durante 10 min.
Uma vez que a síntese foi completada, a resina foi lavada com DMF (3 x 50 mL) e o N-terminal do peptídeo ligado à fase sólida foi acetilado com anidrido acético na presença de DIPEA em temperatura ambiente por 15 min. Após a acetilação do terminal N, a resina peptídica foi lavada com DMF (3 x 20 mL) e DCM (3 x 20 mL).
Localização do Peptídeo ligante em Modificação Método de Ligante Resina usada DPEP relação ao do termo-C síntese peptídeo Resina Wang Ácido sintetizador DPEP1.9 ß-Ala Terminal C pré- carboxílico de microondas carregada Resina de sintetizador DPEP1.9b Glu Terminal C Amida amida Rink de microondas
Resina de sintetizador DPEP1.9d Glu Terminal N Amida amida Rink de microondas Resina Wang Ácido sintetizador DPEP3.1 ß-Ala Terminal C pré- carboxílico de microondas carregada Resina Ácido Intavis DPEP3.1a -Ab Terminal C carboxílico tentagel Cl- Multipep Tritila Resina de sintetizador DPEP3.1b Glu Terminal C Amida amida Rink de microondas Resina de sintetizador DPEP3.1c Succ Terminal N Amida amida Rink de microondas Resina de sintetizador DPEP3.1d Glu Terminal N Amida amida Rink de microondas Resina de sintetizador DPEP3.8b Glu Terminal C Amida amida Rink de microondas Tabela 1. Método de síntese e resinas usadas dos peptídeos com diferentes ligantes e a modificação C-terminal resultante.
1.2.3 Clivagem do suporte sólido e purificação do peptídeo via HPLC Semi-Prep
[00219] O peptídeo foi clivado do suporte sólido por tratamento com um coquetel de clivagem que consiste em TFA/H2O/triisopropilsilano (TIPS) (95: 2,5: 2,5, 10 mL) por 3 h em temperatura ambiente. O excesso de TFA foi removido borrifando com nitrogênio. O peptídeo clivado foi precipitado através da adição de éter dietílico gelado e centrifugado a 3000 rpm durante 5 min. O pellet de peptídeo bruto foi lavado três vezes com éter dietílico frio (3 x 40 mL) e purificado por RP-HPLC usando um sistema de HPLC Varian 940-LC equipado com um módulo de aumento de escala 445-LC e coletor de fração 440-LC. Os peptídeos foram purificados por HPLC semi-preparativa em uma coluna RP-C18 (10 x 250 mm,
Phenomenex Jupiter) usando um gradiente linear de CH3CN em 0,1% de TFA / H2O (0-99%, 0,1% de TFA em CH3CN) com um fluxo taxa de 15 mL·min-1 ao longo de 15 min. A detecção foi realizada a 220 nm e 260 nm.
Número Sequência Sequência testada (com C adicional Ligante/ponto Rendimento do ID № de fixaçãob e modificações do terminal N)a peptídeo incorporado DPEP1.9 70 Ac-RBRRBRFQILYBRBR-B B (term C) 38 % DPEP1.9b 70 Ac-RBRRBRFQILYBRBR-E E (term C) 40 % DPEP1.9d 70 E-RBRRBRFQILYBRBR-NH2 E (term N) 36 % DPEP3.1 71 Ac-RBRRBRRFQILYRBHBH-B B (term C) 34 % DPEP3.1a 71 Ac-RBRRBRRFQILYRBHBH-Ab Ab (term C) 37 % DPEP3.1b 71 Ac-RBRRBRRFQILYRBHBH-E E (term C) 34 % DPEP3.1c 71 Succ-RBRRBRRFQILYRBHBH-NH2 Succ (term N) 26 % DPEP3.1d 71 E-RBRRBRRFQILYRBHBH-NH2 E (term N) 34 % DPEP3.8b 73 Ac- RBRRBRFQILYRBHBH-E E (term C) 34% Tabela 2. Sequências de peptídeos sintetizadas para teste nos exemplos com vários ligantes e pontos de ligação.
aLigantes são listados como suas abreviações de aminoácidos individuais. A ligação de bligante diz respeito ao peptídeo, term C = terminal carboxila, term N = terminal amino. O número de ID da sequência se refere à sequência do peptídeo sem quaisquer modificações N e C terminais adicionais, tais como ligantes.
1.2.4 Síntese de conjugados de Peptídeo-PMO
[00220] Foi usada uma sequência anti-sentido de PMO 25-mer para o éxon-23 da distrofina de camundongo (GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (SEQ ID NO: 74). O peptídeo foi conjugado à extremidade 3' do PMO através de seu grupo carboxila C-terminal ou N-terminal grupo amino dependendo do local de fixação do ligante.
Isso foi conseguido usando 2,3 e 2 vezes equivalentes de PyBOP e HOAt em NMP,
respectivamente, na presença de 2,3 equivalentes de DIPEA sobre o peptídeo e um excesso de 2,5 vezes de peptídeo sobre
PMO dissolvido em DMSO.
Em geral, a uma solução de peptídeo
(10 mol) em N-metilpirrolidona (NMP, 100 L) foram adicionados PyBOP (76,6 L de 0,3 M em NMP), HOAt em (66,7
L de 0,3 M NMP), DIPEA (4,0 L) e PMO (4 µmol, 400 L de 10 mM em DMSO). A mistura foi deixada por 2 h a 40 C e a reação foi extinta pela adição de H2O (1 mL). A reação foi purificada em uma coluna de cromatografia de troca catiônica (coluna
Resource S 6 mL, GE Healthcare) usando um gradiente linear de cloreto de sódio (0 a 1 M) em tampão de fosfato de sódio
(25 mM, pH 7,0) contendo 20% de CH3CN a uma taxa de fluxo de
6 mL·min-1. A remoção do excesso de sais do conjugado peptídeo-PMO (P-PMO) foi conseguida através da filtração das frações coletadas após a troca iônica usando um dispositivo de filtro centrífugo Amicon® ultra-15 3K.
O conjugado foi liofilizado e analisado por MALDI-TOF.
Os conjugados foram dissolvidos em água estéril e filtrados através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 µm antes do uso.
A concentração de P-PMO foi determinada pela absorção molar dos conjugados a 265 nm em solução 0,1 M de HCl.
Os rendimentos gerais (Tabela 3) foram de 26-64% com base no P- PMO.
Conjugadosa Sequência Conjugadab Rendimento P-PMO DPEP1.9b Ac-RBRRBRFQILYBRBR-(E)-PMO 39 % DPEP1.9d PMO-(E)-RBRRBRFQILYBRBR-NH2 29 % DPEP3.1a Ac-RBRRBRRFQILYRBHBH-(Ab)-PMO 26 % DPEP3.1b Ac-RBRRBRRFQILYRBHBH-(E)-PMO 27 % DPEP3.1c PMO-(Succ)-RBRRBRRFQILYRBHBH-NH2 64 % DPEP3.1d PMO-(E)-RBRRBRRFQILYRBHBH-NH2 48 % DPEP3.8b Ac-RBRRBRFQILYRBHBH-(E)-PMO 49 % Tabela 3. Rendimentos de conjugados de P-PMO sintetizados em escala maior para análise in vivo (os rendimentos são calculados via espectroscopia UV-Vis e são baseados no coeficiente de extinção do PMO). A pureza para os P-PMOs é superior a 95%, conforme determinado por HPLC de fase normal a 220 nm e 260 nm. aO PMO usado para conjugar com o peptídeo tem a seguinte sequência, 5’-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3’.
bO anexo do PMO é dado aqui em negrito e itálico, o ligante entre colchetes.
[00221] Os seguintes conjugados de comparação também foram sintetizados/obtidos e o mesmo PMO foi conjugado ao peptídeo usando ligantes comparativos.
Sequência (N-> Sequência Site de Classe de Nome do terminal C) com ID № Ligante ligação de peptídeo Peptídeo ligante incorporado PMO Peptídeo Extremidade de R6Gly Ac-RRRRRR-(G) 38 Glicina terminal do comparação peptídeo
Pip9b2 Ac- Extremidade β- RXRRBRRFQILYRBRXR- 44 terminal do Alanina (B) peptídeo Extremidade Ac- RXRRBRRXR- β- Pip6a 82 terminal do YQFLI-RXRBRXR-(B) Alanina peptídeo Tabela 4: peptídeos de comparação
1.4 Quantificação e reconstituição de P-PMO
[00222] O P-PMO foi dissolvido em água livre de RNase.
A partir desta solução, uma alíquota foi diluída 100 vezes em HCl 0,1 M e medida via UV-VIS a 265 nm. A concentração foi determinada usando a lei de Beer-Lambert: 𝐴265 𝑐= 𝜀265 𝑙
[00223] Antes do uso, o P-PMO foi descongelado à temperatura ambiente (se congelado antes) e agitado em vórtice brevemente, em seguida, incubado por 30 min a 37 C.
A alíquota de P-PMO foi subsequentemente sonicada por 5 min em um banho de sonicação. Finalmente, o P-PMO foi brevemente agitado e o pulso girado.
[00224] A solução de injeção foi preparada combinando o P-PMO na concentração de tratamento desejada diluída em água livre de RNase e solução salina a 9% (para uma concentração final de solução salina a 0,9%).
1.4 Avaliação de tratamento de P-PMO in vivo
1.4.1 Administração sistêmica de P-PMO
[00225] Todos os experimentos com animais foram conduzidos na Unidade de Ciências Biomédicas da Universidade de Oxford, sob autorização do Home Office Project License
(Reino Unido) e de acordo com a Lei dos Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 e revisão ética institucional. Os camundongos foram alojados em instalações específicas para doenças livres de patógenos; o ambiente tinha temperatura e umidade controladas com ciclo claro- escuro de 12 horas. Todos os animais receberam ração comercial para roedores e água ad libitum.
[00226] Os experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 fêmeas com 8-10 semanas de idade. Os camundongos receberam uma injeção intravenosa de bolus único na veia da cauda de 0,9% de solução salina, 10 mg/kg, 30 mg/kg ou 50 mg/kg de P-PMO. Uma semana após a injeção, os camundongos foram sacrificados e os músculos tibial anterior, diafragma e cardíaco removidos e congelados em gelo seco e armazenados a -80ºC.
1.4.2 Avaliação toxicológica de P-PMO
[00227] Após a administração intravenosa de P-PMO (Ver Seção 1.4.1), a urina foi coletada de forma não invasiva em condições refrigeradas no dia 2 e no dia 7 após a administração, após 20 horas de alojamento em gaiolas metabólicas. O sangue foi coletado da veia jugular no dia 7 durante a necropsia e o sangue foi fracionado e o soro coletado. O tecido tibial anterior, o diafragma e o coração foram coletados no dia 7 durante a necropsia.
[00228] Os níveis urinários da molécula 1 de lesão renal (KIM-1) foram quantificados por ELISA após diluição apropriada da urina para se ajustar às curvas padrão. Os valores de KIM-1 foram normalizados para os níveis de creatinina urinária que foram quantificados no MRC Harwell Institute, Mary Lyon Centre, Oxfordshire, UK.
1.4.3 Análise qPCR de salto de éxon induzido por P-PMO
[00229] A quantificação do salto de éxon induzido por P-PMO foi realizada no músculo tibial anterior (TA), diafragma e coração 7 dias após a administração.
Resumidamente, o RNA foi extraído de tecido homogeneizado usando o método de extração baseado em TRIzol e o cDNA foi sintetizado usando iniciadores aleatórios. Os iniciadores/sondas foram sintetizados pela Integrated DNA Technologies e projetados para amplificar uma região que abrange o éxon 23-24 representando o produto não ignorado (mDMD23-24, consulte a Tabela 4), ou para amplificar especificamente transcritos sem o éxon 23 usando uma sonda que atravessa a fronteira do éxon 22 e 24 (mDMD22-24). Os níveis das respectivas transcrições foram determinados por transcritos ignorados e não ignorados e expressos como percentagem de transcritos ignorados versus totais (ignorados e não ignorados) (ver Tabela 5 para sequências).
Reversão Iniciador do Transcrito direto SEQ ID №: SEQ ID №: Sonda SEQ ID №: iniciador (5'-3') (5'-3')
mDMD GAAACTTTCC /5FAM/TCAACTTCA/ZEN/GCC
CAGGCCATTC 75 TCCCAGTTGG 76 ATCCATTTCTGTAAGGT/3IABk 77 (éxon 23-24) CTCTTTCAGG T FQ/ mDMD CTGAATATGA CTTCAGCCAT /5FAM/ATGTGATTC/ZEN/TGT AATAATGGAG 78 CCATTTCTGT 79 80 (éxon 22-24) AATTTCC/3IABkFQ/
GAGAGACTCG AAGGT Tabela 5. Sequências de iniciador e sonda para quantificação de distrofina de camundongo (éxon 23) salto de éxon por métodos qPCR.
2. OUTROS EXEMPLOS Síntese de Conjugados Peptídeo-PMO.
[00230] Os peptídeos foram sintetizados e conjugados com PMO conforme descrito anteriormente. A sequência de PMO direcionada a repetições expandidas de CUG (5′ CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3′ (SEQ ID NO: 81) foi adquirida da Gene Tools LLC e usada para fazer outros conjugados.
Cultura de células e tratamento com Peptídeo-PMO.
[00231] Mioblastos imortalizados de indivíduos saudáveis ou pacientes com DM1 com 2600 repetições de CTG foram cultivados em um meio de crescimento que consiste em uma mistura de M199:DMEM (proporção de 1:4; tecnologias da vida) suplementado com 20% de FBS (tecnologias da vida), 50 μg/ml de gentamicina (Life technologies), 25 µg/ml de fetuína, 0,5 ng/ml de bFGF, 5 ng/ml de EGF e 0,2 µg/ml de dexametasona (Sigma-Aldrich). A diferenciação miogênica foi induzida pela troca de culturas de células confluentes para meio DMEM suplementado com 5 µg/ml de insulina (Sigma- Aldrich) para mioblastos. Para o tratamento, as células WT ou DM1 são diferenciadas por 4 dias. Em seguida, o meio foi trocado por meio de diferenciação fresco com peptídeo-PMOs em uma concentração de 1, 2, 5, 10, 20 ou 40 µM. As células foram colhidas para análise 48h após o tratamento. A viabilidade celular foi quantificada após 2 dias de transfecção de peptídeo-PMOs a 40uM em hepatócitos humanos ou a uma concentração de 1, 2, 5, 10, 20 ou 40 µM em mioblastos humanos usando um ensaio baseado em fluorescência (Promega).
Isolamento de RNA, RT-PCR
[00232] Para células humanas: antes da extração de RNA, as células foram lisadas em um tampão de proteinase K (500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 2% SDS e 0,5 mg/ml de proteinase K) por 45 min a 55°C.
RNAs totais foram isolados usando TriReagent de acordo com o protocolo do fabricante. Um micrograma de RNA foi transcrito reversamente usando o sistema de síntese de primeira fita M-MLV (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante em um total de 20 µL. Um microlitro de preparação de cDNA foi subsequentemente usado em uma análise de PCR semiquantitativa de acordo com o protocolo padrão (ReddyMix, Thermo Scientific). A amplificação por PCR foi realizada por 25-35 ciclos dentro da faixa linear de amplificação para cada gene. Os produtos de PCR foram resolvidos em géis de agarose 1,5-2%, corados com brometo de etídio e quantificados com software ImageJ. As razões de inclusão do éxon foram quantificadas como uma porcentagem de inclusão em relação à intensidade total dos sinais de isoforma. Para quantificar a expressão de mRNA, PCR em tempo real foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
Os ciclos de PCR foram uma etapa de desnaturação de 15 min seguida por 50 ciclos com uma desnaturação de 94 °C por 15 s, anelamento de 58°C por 20 se extensão de 72 °C por 20 s.
Tabela 6: iniciadores para PCR Nome do SEQ ID №. Espécie/Gene/Éxon Sequência (5’- Iniciador 3’) Mbnl1.F 83 Camundongo- GCTGCCCAATACCAG Humano/mbnl1/éxon5 GTCAAC Mbnl1.R 84 Camundongo- TGGTGGGAGAAATGC Humano/mbnl1/éxon5 TGTATGC DMD.F 85 Humano/DMD/éxon78 TTAGAGGAGGTGATG
GAGCA DMD.R 86 Humano/DMD/éxon78 GATACTAAGGACTCC
ATCGC
[00233] Experimentos com animais e injeções de ASO.
Os experimentos foram realizados na Universidade de Oxford de acordo com a legislação do Reino Unido. As injeções intravenosas em camundongos HSA-LR C57BL/6 foram realizadas por administrações únicas ou repetidas através da veia da cauda. Doses de 30, 12,5, 7,5 e 5 mg/kg de peptídeo-PMO-CAG7 foram diluídas em solução salina a 0,9% e administradas em um volume de 5-6 µL/g de peso corporal. Níveis de KIM-1 em camundongos fêmeas C57BL6 medidos por ELISA (R&D cat#MKM100) com amostras diluídas para caber na curva padrão. Os valores foram normalizados para os níveis de creatinina urinária (Harwell) para contabilizar a concentração de proteína na urina.
Tabela 7: Os tempos de recuperação de camundongos C57BL6 após as injeções com conjugados de PMO [CAG]7 baseados em DPEP são mais curtos do que após a injeção com conjugados formados com carreadores de peptídeo anteriores, como Pip6a.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado ou sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um carreador, em que o carreador está covalentemente ligado a pelo menos um ligante, e em que o ligante está covalentemente ligado a pelo menos uma molécula terapêutica; em que cada um do pelo menos um ligante tem, independentemente, uma estrutura de acordo com a Fórmula (I) abaixo: -T1-(CR1R2)n-T2- (I) em que T1 é para ligação ao carreador e é selecionado de -NH- ou -C(O)-; T2 é para ligação a uma primeira molécula terapêutica e é selecionado de -NH- ou -C(O)-; n é um número inteiro selecionado de 1, 2 ou 3; cada ocorrência de R1 é independentemente um grupo da fórmula -Y1-X1-Z1, em que Y1 está ausente ou um grupo da fórmula –[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, OH ou (1-2C)alquila;
X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -
CH(ORA3)-, -N(RA3)-, -N(RA3)-C(O)-, -N(RA3)-C(O)O-, -C(O)-
N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, -N(RA3)C(N RA3)N(RA3)-, -SO-, -S-
-SO2-, -S(O)2N(RA3)-, ou -N(RA3)SO2- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e
Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionada a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-
6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3-
6C)cicloalquenila ou heteroarila,
em que cada (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-
6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3-
6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados a partir de
(1-4C) alquila, oxo, halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi,
NRA4RA5 ou (1-4C)alcóxi, em que RA4 e RA5 são, cada um,
independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-
2C)alquila e cada ocorrência de R2 é independentemente um grupo da fórmula -Y2-X2-Z2, em que
Y2 está ausente ou um grupo da fórmula –[CRB1RB2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RB1 e RB2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, OH ou (1-2C)alquila;
X2 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -
CH(ORB3)-, -N(RB3)-, -N(RB3)-C(O)-, -N(RB3)-C(O)O-, -C(O)-
N(RB3)-, -N(RB3)C(O)N(RB3)-, -N(RB3)C(N RB3)N(RB3)-, -SO-, -S-
-SO2-, -S(O)2N(RB3)-, ou -N(RB3)SO2- em que cada RB3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e
Z2 é selecionado de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-
6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila,
(3-6C)cicloalquenila ou heteroarila, em que cada (1-
6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2-6C)alquinila, arila, (3-
6C)cicloalquila, (3-6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados a partir de (1-4C) alquila, oxo,
halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRB4RB5 ou (1-4C)alcóxi,
em que RB4 e RB5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila;
com a condição de que;
quando n=1 e T1 e T2 são diferentes um do outro, então
R1 e R2 não são ambos H;
quando n=1, T1 e T2 são diferentes um do outro e um de
R1 e R2 é H então o outro de R1 e R2 não é metila; ou quando n=2 e cada ocorrência de R1 e R2 é H, então T1 e
T2 são ambos -C(O)- ou são ambos -NH-
quando o carreador é um peptídeo, o peptídeo não é glicosilado.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende uma das seguintes estruturas: [carreador] – [ligante] - [molécula terapêutica]; [molécula terapêutica] [carreador] – [ligante] [molécula terapêutica]; [ligante] - [molécula terapêutica] [carreador] [ligante] - [molécula terapêutica]; [molécula terapêutica] – [ligante] – [carreador] – [ligante] – [molécula terapêutica]; e [carreador] – [ligante] – [carreador] – [ligante] – [molécula terapêutica].
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o conjugado tem a seguinte estrutura: [carreador] – [ligante] - [molécula terapêutica].
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que T2 é -C(O)-.
5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ocorrência de R1 é independentemente um grupo da fórmula -Y1-X1-Z1, em que:
Y1 está ausente ou um grupo da fórmula –[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-, - N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, -N(RA3)C(N RA3)N(RA3)- ou -S- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionada a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2- 6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3- 6C)cicloalquenila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, (2-6C)alquenila, (2- 6C)alquinila, arila, (3-6C)cicloalquila, (3- 6C)cicloalquenila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados a partir de (1-4C) alquila, oxo, halo, ciano, nitro, hidróxi, carbóxi, NRA4RA5 ou (1-4C)alcóxi, em que RA4 e RA5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1- 2C)alquila.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ocorrência de R1 é independentemente um grupo da fórmula -Y1-X1-Z1, em que:
Y1 está ausente ou um grupo da fórmula –[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-, - N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, -N(RA3)C(O)N(RA3)-, -N(RA3)C(N RA3)N(RA3)- ou -S- em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionada a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, arila, (3- 6C)cicloalquila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, arila, (3-6C)cicloalquila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C)alquila, halo ou hidróxi.
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ocorrência de R1 é independentemente um grupo da fórmula -Y1-X1-Z1, em que: Y1 está ausente ou um grupo da fórmula –[CRA1RA2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RA1 e RA2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila; X1 está ausente ou -C(O)-, -C(O)O-, -N(RA3)-C(O)-, C(O)- N(RA3)-, em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e
Z1 é uma outra molécula terapêutica ou é selecionada a partir de hidrogênio, (1-6C)alquila, arila, (3- 6C)cicloalquila ou heteroarila, em que cada (1-6C)alquila, arila, (3-6C)cicloalquila ou heteroarila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos substituintes selecionados de (1-4C)alquila, halo ou hidróxi.
8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ocorrência de R1 é independentemente um grupo da fórmula -Y1-X1-Z1, em que: Y1 está ausente ou um grupo da fórmula –[CH2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1 ou 2; X1 está ausente ou -N(RA3)-C(O)-, -C(O)-N(RA3)-, em que cada RA3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio ou metila; e Z1 é hidrogênio ou (1-2C)alquila.
9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ocorrência de R2 é independentemente um grupo da fórmula -Y2-Z2, em que Y2 está ausente ou um grupo da fórmula – [CRB1RB2]m- em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3 ou 4, e RB1 e RB2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio ou (1-2C)alquila; e Z2 é hidrogênio ou (1-6C)alquila.
10. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ocorrência de R2 é hidrogênio.
11. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que n é 2 ou 3.
12. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que n é 1.
13. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ligante é selecionado a partir de ácido glutâmico, ácido succínico e ácido gama-aminobutírico.
14. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou 13, caracterizado pelo fato de que tem uma das seguintes estruturas: [carreador] [molécula terapêutica] ; [molécula terapêutica] [carreador] ;
[carreador] [molécula terapêutica] ; [carreador] [molécula terapêutica] .
15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o ligante é um aminoácido ou um derivado do mesmo.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é selecionado de ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina, valina, leucina, histidina, triptofano, treonina, serina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina e derivados dos mesmos.
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é ácido glutâmico.
18. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é ligado através de pelo menos dois da cadeia lateral, o terminal N e o terminal C.
19. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o ligante é um aminoácido ligado a pelo menos um carreador através do terminal N e ligado a pelo menos uma molécula terapêutica através da cadeia lateral do aminoácido.
20. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ou cada carreador é selecionado a partir de: uma proteína, peptídeo, ácido graxo, polímero e nanopartícula; preferivelmente em que o ou cada carreador é um peptídeo.
21. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ou cada molécula terapêutica é selecionada a partir de: um ácido nucleico, ácido nucleico de peptídeo, oligonucleotídeo antissentido (como PNA, PMO), mRNA, gRNA (por exemplo, no uso da tecnologia CRISPR/Cas9), RNA de interferência curto, micro RNA, antagomiRNA, peptídeo, peptídeo cíclico, proteína, produto farmacêutico, fármaco e nanopartícula; preferivelmente em que a ou cada molécula terapêutica é um oligonucleotídeo.
22. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
23. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.
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