CN107660198B - 特别地用于眼科手术的手术方法和用于染色蛋白质的染料分子和染料制备物 - Google Patents

特别地用于眼科手术的手术方法和用于染色蛋白质的染料分子和染料制备物 Download PDF

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Abstract

染料分子，具有结构(I)：
Figure DDA0001480319220000011
其中R1由键合于氢H原子或于另一种原子或于铵NH4基团或于赖氨酸盐或于精氨酸盐或于不同的一价阳离子的SO3 ‑基团构成，和R2由SO3 ‑基团构成，特别地用于制备治疗人体或动物体的方法中的染料制备物，例如用于在包括随后分别切除ILM和/或EPRM的手术方法中染色内界膜ILM和/或视网膜前膜EPRM；以及染料制备物，其具有高于1.01g/cm3的密度且包含至少一种染料和至少一种用于增加其密度的试剂，所述试剂为具有实验式(C12H22O11·C3H5ClO)n和结构(II)的聚合物：
Figure DDA0001480319220000012

Description

特别地用于眼科手术的手术方法和用于染色蛋白质的染料分 子和染料制备物
技术领域
本发明涉及新的染料分子，特别是可用于制备染色眼睛的内界膜(以下简称ILM)以及至少几种类型的视网膜前膜(以下简称EPRM)的制备物的分子，其目的是为了在包括切除如此染色的膜(ILM和EPRM)的玻璃体视网膜手术期间，在这些膜和下面组织(underlyingtissue)之间产生色差。而且，本发明的分子旨在用于染色蛋白质链。本发明还涉及包含所述新分子的染料制备物，特别地用于医学用途，并且甚至更特别地用于如上所述医学用途。本发明还涉及包含所述染料分子的制备物在医学领域特别地用于如上所述的特定医学用途，和在非医学领域用于染色蛋白质两者中的用途。特别是，本发明还涉及像这样两者的包含新增稠剂的染料制备物，以及用于治疗人体或动物体的方法中，特别地用于如上所述的方法中。最后，其涉及医学和非医学类型的包含新增稠剂的染料制备物的用途。
背景技术
如在现有文件EP 1819366 A1或US 2011/190728 A1中充分描述的，在眼睛的许多病理中，玻璃体切割术手术通常是最好的解决方案。然而，在手术期间，使引起视网膜损伤的风险降至最小很重要。普遍公认的预防措施之一包括在手术期间切除ILM，并且如有必要切除在其上形成的任何视网膜前膜，以防止玻璃体内压力影响黄斑部。根据目前通常使用的手术技术，ILM和任何视网膜前膜的切除是通过使用合适的夹钳以称为剥离的机械作用机械分离进行的。然而，因此，外科医生已经认识到重要的是如何能够尽可能地区别要切除的膜和下面视网膜。
为此，这些年来，与对于其它眼科手术所发生的情形类似，据建议要切除的膜应当选择性地染色，由此它们可以与未染色的下面结构在视觉上区分。显然，为了能够用于该目的，染料必须满足许多要求。特别地，在一个方面，其必须是生物相容的且对于细胞没有细胞毒性或危害。在另一方面，其必须优选地溶于水中，其必须能够尽可能选择性地染色膜，并且其必须在手术结束时容易从眼睛冲洗掉，但是在手术期间不太容易冲洗掉。
为此目的已经提议了许多染料，但是直到现在其中没有一种被证实完全令人满意。最初使用的染料包括吲哚菁绿(以下称为ICG-参见例如“Indocyanine green-assistedpeeling of the retinal internal limiting membrane”.Burk SE等人。Ophthalmology.2000；107:2010-2014)和锥虫蓝(以下称为TB)。然而，进行的多种研究突出显示出采用这样的染料的一些问题。特别地，当关于对于ICG用于人眼的安全性产生了许多质疑时，TB被证实能够令人满意地染色视网膜前膜，但是不染色ILM。
随后，提出了其它染料，比如亮蓝G(Brilliant Blue G)(以下称为BBG)、亮蓝R(以下称为BBR)、专利蓝V(Patent Blue V)或亚甲蓝。
特别地，在EP 1819366 A1中，其提议应当使用BBG、BBG的盐或BBG的水合物。
在更普通的文件US 2011/190728 A1中，也指出BBG是优选的染料，其中描述了使用至少一种选自三苯甲烷染料和/或偶氮染料和/或花青染料和/或天然染料比如花色素苷类(anthocyans)和花色素类(anthocyanidines)的染料。
在那个文件中，还制备了基于所选择的染料的染料制备物，具有在1.01g/cm3至1.5g/cm3之间，优选地在1.01g/cm3至1.3g/cm3之间的密度，以便确保在手术期间染色溶液和ILM之间更大的接触，并且克服由于在手术期间连续冲洗眼睛引起的、较低密度的染料可能发生的过度冲洗染料的问题。
根据那个文件，用于增加密度的试剂选自重水D2O、二糖或多糖、或中性聚合物比如聚醚、聚乙烯醇、聚酯、聚丙烯酸共聚物和聚乙烯吡咯烷酮。
然而，在如上所述的所有各种染料中，后来上市用于染色ILM的唯一一个染料是BBG(在上述提及的专利文献中其被指出是优选的染料，这并非巧合)。
然而，如已经指出的，即使是该染料也没有被证实不具有缺点。
特别地，BBG是一种很难以高水平的纯度(至少在商业条件下以合理的成本)合成的染料。
实际上，BBG是通过修饰BBR获得的，合成反应的产率有限，因此，商业可获得的产品经常具有甚至远低于所声称的90％纯度水平(本申请人进行的试验甚至显示80％的纯度水平)，具有由起始BBR引起的高污染。不难想象，在没有初步纯度检查的情况下，可能很难制备具有精确控制的染料含量的基于BBG的染料制备物。
同时，尝试进一步纯化BBG在成本-效益比方面不是有利的。
除了这些缺点之外，应当注意到BBG不是固有生物相容性物质，却是细胞毒性的。在预期用于医学用途或在任何情况下用于染色生命物质的制备物中，是否使用其的可能性只取决于其浓度。基于现有的科学文献，特别地，只有当其浓度不高于0.3g/L(等于0.03％w/v-参见来自Geuder AG公司的商品Brilliant
Figure GDA0002628926110000031
的小册子上显示的，根据DIN ENISO 10993进行的试验)时，BBG才被认为是非细胞毒性的。然而，根据许多外科医生，在那些浓度下，可以获得的染色作用可能一直不令人满意，例如，在特别近视的人的眼睛的情况下。
如已经指出的，本发明的第二个应用领域是蛋白质和蛋白质链的一般染色。
实际上，甚至在该领域，现今最常用的染料之一为BBG。
然而，本申请人已经认识到尽管其可以染色蛋白质，但是BBG事实上对相同的蛋白质类具有相对低亲和力。试验是利用圆二色性(下文为CD)分析在通常作为参比蛋白(卵白蛋白)的蛋白质上进行的，实际上强调对于在磷酸盐缓冲液(在D2O中1.22mg/mL)中的BBG-250，BBG和白蛋白之间的缔合常数Ka为约38000M-1。应当注意到，为了进行该试验，预先纯化纯度80％的商业BBG，并在增量的白蛋白存在下，在800-400nm区域测量CD光谱。最后，以已知的方式，使用以ΔA(AL-AR，其中AL和AR分别指制备物针对用于圆二色性研究的两个圆偏振光波(左波和右波)的吸收性)表示的二色性信号强度的非线性回归确定缔合常数值，所述二色性信号强度取决于用作参考的卵清蛋白的浓度。然而，在这一点上，还应当考虑在随后亲和性试验部分所显示的。
发明内容
在上下文中，形成本发明基础的技术目的是提供新染料分子，其克服了上述提及的缺点。
特别地，本发明的技术目的是提供染料分子，其可用于染色ILM的制备物中，特别地优于目前能够使用的BBG。本发明的另一个技术目的是提供一种新染料分子，其对于蛋白质和蛋白质链具有比BBG大得多的亲和性。
本发明的仍然另一个技术目的是提供重染料制备物，其具有比现有技术的制备物更好的染色能力。
特别是，本发明的技术目的是提供染料制备物，其可用于治疗人体或动物体的方法中。特定的技术目的和所示的目标基本上是由如下所述的染料分子和包含其的染料制备物实现的。
在参照下述举例说明的本发明的一些优选的非限制性实施方案的详细说明中，本发明的进一步特征和优点更加显而易见。
附图说明
图1显示了所用BBG的质谱。
图2显示了纯化的最终产物的ESI-MS质谱。
图3显示了所进行试验的HPLC分析结果。
图4显示了所进行试验中获得的纯化且冻干的最终产物的HPLC检查的结果。
图5显示了与包含所公开的分子和Ficoll的染料制备物有关的CD光谱学数据。
图6显示了与包含所公开的分子和Ficoll的染料制备物相关的回归趋势。
本发明优选实施方案的详细说明
关于染料分子，在本发明的上下文中，提供的染料分子家族由下述结构(I)表示：
Figure GDA0002628926110000051
其中R2由SO3 -基团(其与附近带正电荷的氮N原子形成内盐)构成，且R1由以离子键键合于氢H原子或于另一种原子(例如，钠Na)或于铵NH4基团或于赖氨酸盐或于精氨酸盐或于不同的一价阳离子的SO3 -基团构成。
可以看出，由于存在甲基而不是氢原子键合二取代的氨基氮原子，根据本发明公开的分子与BBG分子(应当注意到在本发明的上下文中，该名称也意指同义词比如
Figure GDA0002628926110000052
亮蓝、酸性蓝90、C.I.42655和亮蓝G 250识别的任何产品，全部都由CAS号：6104-58-1唯一识别)不同。
所公开新分子的合成可以利用由亮蓝G250构成的起始产物的二取代氨基氮的甲基化反应获得。特别地，该反应从商业BBG出发特别有利，如所述的，所述商业BBG一般具有小于或等于90％的纯度水平且被BBR污染。实际上，在甲基化反应结束时和随后的纯化结束时，已经清除了含BBR的污染物。
一般而言，合成方法包括在一个或多个连续步骤中使起始产物与氢氧化钠和碘代甲烷反应，如有必要每次改变它们的比例。
实施例
下述为优选的制备实施例的说明。显然，在保持各种物质之间比例的情况下，所指示的量可以变化，应当理解所描述的方法导致生产约1.6g所公开分子，为了其工业最优化，显著更大量的生产可能需要对所述方法进行一些改进。
材料和方法
试剂
试剂 制造商 一批约1.6克的量
亮蓝G-纯(BBG) (Sigma Aldrich,B0770) 2g
RP级甲醇 (Sigma Aldrich) 50ml
氢氧化钠 (Sigma Aldrich) 0.20g
碘代甲烷 (Sigma Aldrich) 2.20ml
HPLC级乙腈 (Sigma Aldrich) 4l
去离子水 10l
UV级三氟乙酸 (Sigma Aldrich) 40ml
HPLC级甲醇 (Sigma Aldrich) 4l
关于起始BBG，在进行的试验中，其为具有91％纯度的产品(分析证明书B0770,Sigma Aldrich，批次SLBJ8621V)。证实图1显示了其质谱，其指示至少两个显著峰。
材料
Figure GDA0002628926110000061
Figure GDA0002628926110000071
仪器
仪器 制造商
中压液相色谱
REVELERIS C18 WP 40g柱 Grace
冻干机 Freeze Dryer Modulyo Edwards
HPLC Shimadzu LC10
磁力搅拌器 Ika
旋转蒸发器 Buchi
反应描述
将0.12g的氢氧化钠和0.92ml的碘代甲烷加入到溶于甲醇-水1:1v/v中的1.7gBBG中。使该反应在环境温度下进行约两天。然后，可以使用HPLC检查反应混合物以突出显示起始产品仍然以何种方式存在。将对于所进行试验的HPLC分析结果显示在图3中，并且突出显示三个峰，从左到右，其中第一个对应于反应中使用的溶剂，第二个对应于BBG分子，且第三个对应于所公开的新分子。此时，加入另外0.92ml的碘代甲烷和0.08g的氢氧化钠。在7天之后，加入另外0.36ml的碘代甲烷和0.08g的氢氧化钠，并使反应再进行两天结束。
然后，将反应混合物浓缩成小体积，并将未精制的混合物利用中压液相色谱(MPLC)纯化，所述中压液相色谱使用REVELERIS C18 WP 40g柱(Grace)，用水(A)和90％v/v乙腈水溶液(B)的混合物洗脱，所述水(A)和90％v/v乙腈水溶液(B)都包含0.05％v/v三氟乙酸。
在纯化之后，将包含期望产物的级分合并在一起，浓缩成小体积，并冻干。然后，将溶于氢氧化钠0.01中的固体使用用水(A)-甲醇(B)混合物的相同柱纯化。MPLC条件：流速20ml/min，检测254nm，梯度40％(B)5分钟，40-60％(B)40分钟，60-95％(B)2分钟，95％(B)2分钟，95-40％(B)2分钟。
图4显示对于进行的试验中获得的纯化且冻干的最终产物的HPLC检查的结果，显示存在对应于所公开分子(钠盐形式)的单个峰。证实图2显示了纯化的最终产物的ESI-MS质谱。
而且在进行的试验中，如从HPLC光谱开始计算的，最终产物的纯度为约96.6％，同时反应产率为约60％的非精制产物(因此，100g的BBG-250得到约60g所公开的分子的钠盐形式)。
如指出的，本发明还涉及包含至少一种第一染料的染料制备物，所述第一染料分子为公开的新染料分子或其可药用盐或其水合物。
优选地，染料制备物为水溶液和/或具有磷酸盐缓冲基质。而且，其至少在0℃至50℃之间的温度范围下为液体。
而且，至少对于在治疗人体或动物体的方法方面中的应用，所述制备物也是有利地无菌的且生物相容的。
有利地，相对于制备物总体积，以重量(w/v)计，第一染料的存在量在0.0001％至0.5％之间，优选地在0.015％至0.05％之间。
而且，在某些优选的实施方案中，由于另外存在至少一种提高其密度的试剂，染料制备物具有在1.01g/cm3至1.5g/cm3之间的密度。
所述至少一种提高密度的试剂可以根据需要选择。例如，其可以选自：重水D2O、单糖、二糖、多糖和中性聚合物；在中性聚合物中，特别地其可以选自聚醚、聚乙烯醇、聚酯、聚丙烯酸共聚物、甘露醇和聚乙烯吡咯烷酮。
然而，在特别优选的实施方案中，用于提高密度的试剂为具有实验式(C12H22O11·C3H5ClO)n和下述结构的聚合物：
Figure GDA0002628926110000091
该试剂在商业上称为
Figure GDA0002628926110000092
或Polysucrose(CAS号：26873-85-8)，并且相对于制备物总体积，以重量(w/v)计，有利地存在量在0.001％至20％之间，优选地在0.1％至10％之间。在下文中，当提及Ficoll时，意指那样的试剂。
在特别优选的制剂中，制备物包含在磷酸盐缓冲液中0.05％(w/v)的所公开的分子和4％(w/v)的Ficoll。
根据其预期的应用，染料制备物也可以包含其它物质，特别地其也可以包含至少一种不同于第一染料的第二染料。在其中染料制备物预期用于治疗人体或动物体的方法方面中的优选的实施方案中，第二染料有利地为锥虫蓝。
关于染料制备物的其它性质，比如动态粘度、pH、渗透压等，在每种情况下，本领域的专家都能够调整其用于染料制备物。例如，在染料制备物用于人体或动物体的情况下，如有必要，可以以使它们尽可能地接近生理条件的方式调节它们。
关于染料制备物的可能用途，本发明特别地预期的用途之一是用于治疗人体或动物体的方法中。
有利地，特别地，染料制备物预期用于玻璃体视网膜手术的手术方法中。
甚至更有利地，在包括随后切除ILM和/或EPRM的手术方法中，染料制备物可用于染色内界膜ILM和/或视网膜前膜。实际上，已经看到所公开的染料分子能够以如下这样的方式选择性地至少染色ILM：在分离ILM(剥离)和EPRM的步骤期间，在染色的ILM和未染色的下面结构之间产生明显可见的差别。为了确保还染色所有可能的EPRM，染料制备物也可包含能够选择性地染色它们的第二染料(比如，锥虫蓝)。
所公开的染料制备物的进一步优选的用途是在其中其染色蛋白质的方法中，例如使该蛋白质所属的组织更明显可见。
实验数据
下述为在本申请人进行的试验和分析之后获得的一些实验数据。
细胞毒性分析
本申请人进行了多种试验，其强调根据本发明的染料制备物为何是非细胞毒性的。
例如，下述为由意大利Vimodrone(Milan省)的Eurofins Biolab S.r.l.实验室对于三个不同批次的染料制备物获得的结果，所述染料制备物包含在磷酸盐缓冲液中的0.05％(w/v)根据本发明制备的分子(基团R1由键合于钠阳离子的SO3 -基团构成)、4％(w/v)Ficoll，其显示出三个样品中没有一个是细胞毒性的。应当注意到，所使用的浓度比声明BBG具有细胞毒性的浓度(0.03％w/v)高得多。
Figure GDA0002628926110000101
亲和性试验
这些是由本申请人进行的比较所公开的分子和商业BBG-250在与蛋白质和蛋白质链的亲和性方面的试验。如在之前的情形中，在试验中使用的根据本发明制备的分子是用实施例中描述的方法得到的分子，其中基团R1由键合于钠阳离子的SO3 -基团构成。
相反，关于商业BBG-250，假定所述化合物的纯度为约91％(与所声称的80％相比较)，在进行试验之前，将其纯化为约98％。
特别地，对在磷酸盐缓冲液中水基的四个不同的染料制备物进行试验：对于每种分子，一个包含Ficoll(4％w/v)，且一个包含重水D2O(13％v/v)。在所有测试的染料制备物中，磷酸盐缓冲液包含∶
-磷酸二氢钠一水合物NaH2PO4·H2O:0.266mg/mL；
-无水磷酸氢二钠Na2HPO4:1.51mg/ml；
-氯化钠NaCl:8.2mg/ml。
利用CD(圆二色性)光谱测定亲和性。CD光谱是在增量的卵清蛋白存在下在800-400nm区域测量的，其如已知的，是对于该类型的分析普遍认为的蛋白质的一般表征。
应当注意到，在所使用的条件(400-800nm)下，白蛋白没有吸收，因此没有产生任何二色性信号，同时染料具有高水平的吸收，但是没有显示任何二色性信号。相反，白蛋白与染料分子(BBG-250或本文公开的)的相互作用诱发染料的手性，其可以利用CD测量。因此，用白蛋白滴定染料，利用滴定曲线的非线性回归，可以确定其表观结合常数或缔合常数。
与包含所公开的分子和Ficoll的染料制备物有关的CD光谱学数据显示在图5中，其中数字1指示在不存在蛋白质的情况下染料制备物的二色性光谱，而其它线条涉及在存在增量的白蛋白的情况下的相同制备物(按照箭头所示)。
如已经指出的，使用以ΔA(AL-AR)表示的二色性信号强度(取决于卵清蛋白的浓度)的非线性回归，确定缔合常数值Ka。图6显示与包含所公开的分子和Ficoll的染料制备物相关的回归趋势。应当注意到，在计算缔合常数Ka时，应考虑两种染料的不同浓度。
得到的结果如下：
-含有在磷酸盐缓冲液中Ficoll4％中的BBG-250的染料制备物(灭菌的)∶Ka约60,000M-1；
-含有在磷酸盐缓冲液中Ficoll 4％中的所公开分子的染料制备物(灭菌的)∶Ka约300,000M-1；
-含有在磷酸盐缓冲液中BBG-250(在D20中1.22mg/ml)的染料制备物(灭菌的)∶Ka约38,000M-1；
-含有在磷酸盐缓冲液中所公开的分子(在D20中0.58mg/ml)的染料制备物(灭菌的)∶Ka约180,000M-1。
因此，如可以看到的，与使用的用于提高密度的试剂无关，所公开的分子令人惊奇地显示出对于白蛋白的亲和性等于商业BBG-250的4.7-5倍。
而且，可以确定，对于两种染料分子，与在重水中使用的相比，Ficoll的存在促进(1.66-1.58倍)染料与白蛋白的结合。虽然目前确实不确定后者结果的原因，但是本申请人的理论是，Ficoll除了提高密度的试剂作用之外，也可以通过“排除体积”和空间因素实现“拥挤试剂(crowding agent)”(以下称为CA)的作用并促进染料与卵清蛋白相互作用。
实际上，最近，已经研究了Ficoll与PEG和葡聚糖一起，并且用作CA，也就是说，用作填充/拥挤试剂，以模拟细胞内环境的条件，其表现为极其拥挤的环境，具有有限量的游离水，且几乎完全没有空间。对于CA的许多研究(参见例如，“What MacromolecularCrowding Can Do to a Protein”,Irina M.Kuznetsova 1,2,Konstantin K.Turoverov1,2and Vladimir N.Uversky 1,3,4,5)实际上已经显示出由CA造成的“大分子拥挤”能够如何影响蛋白结构、折叠、形式、形状、稳定性、与小分子的结合、酶活性、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用和病理学聚合。
CA的主要机制是起“排除体积”的作用，其相当于空间占据，因此，相当于其它分子迁移进入剩余游离空间。局部地，这可以导致溶质的浓度增加或空间分子变化。因此，这也可以出现在所讨论的情形中。
根据刚刚讨论的使用Ficoll作为用于提高密度的试剂可以获得的令人惊奇的优点的实验结果，得出结论，本发明还涉及具有密度高于1.01g/cm3且包含Ficoll作为用于提高其密度的试剂的染料制备物，用于眼科手术的手术方法中。该制备物可以用于关于所公开的新染料分子如上所述的所有用途。
有利地，该染料制备物可以包含至少一种选自下述的染料：三苯甲烷染料、偶氮染料、花青染料、天然染料和/或它们的混合物，但是优选地其应当包含BBG或其结构类似物。
在后者中，优选的那些是BBG的可药用盐、BBG水合物和BBG甲基化物。
从操作的观点来看，在使用利用Ficoll获得高于1.01g/cm3的密度的染料制备物染色ILM的情况下，应当记得在这些手术中，在利用玻璃体切除术切除玻璃体之后，将染料制备物注射到后房中。由于其高密度，其沉积在ILM上，在利用通常用BSS大量冲洗后房被除去之前，其保持接触ILM仅数秒。然而，尽管仅接触数秒，但是该染料制备物染色了ILM。
然而，应当注意到，在那些使用条件中(因此，甚至在相似条件下进行其它眼科手术的情况下)，用作增稠剂的任何Ficoll都不能充当CA，因为在染色膜且在后房中被BSS稀释之后，染料制备物被立即除去。
因此，限用于在眼科手术方法中的手术中染色，使用Ficoll得到类似于与采用提高密度的一般试剂比如重水可获得的、染料制备物的密度与采用提高密度的一般试剂比如重水相同的“最合适的”性能。
本发明带来了重要优点。
关于提供的新染料分子，首先获得的极大优点是证实该分子能够比商业BBG更好地染色，其不仅染色ILM(所有参与实验性测试的外科医生都声明的情形)，还染色蛋白质和蛋白质链(参见上述显示的试验结果)，结果是能够使用更少的染料获得相同的结果。
而且，其在显著高于目前允许的商业BBG的浓度下是非细胞毒性的。
相反，关于使用用作提高密度的试剂Ficoll，作为迄今在本领域中使用的那些的替代品，能够确立允许其在某些应用中使用，得到类似于迄今可获得的那些结果(如在眼科手术的情形中)，同时在其它应用中，允许使用更少的染料获得同样的结果。
最后，注意到本发明相对易于生产，并且甚至与实施本发明有关的成本不是非常高。
因此，在不背离本发明原理的范围下，上述本发明可以以多种方式修饰和调整。
本发明的所有细节都可以使用其它技术上同等的要素和材料替代，以及各种组分的形状和尺寸都可以根据需要变化。

Claims (24)

1.具有下述结构的染料分子∶
Figure FDA0002628926100000011
其中：
R1由SO3 -基团构成，它以离子键键合至氢H原子或至另一种原子或至铵NH4基团或至赖氨酸盐或至精氨酸盐或至除上述以外的一价阳离子；以及
R2由SO3 -基团构成。
2.染料制备物，它包含至少一种根据权利要求1具有所述分子的第一染料或其可药用盐。
3.根据权利要求2的染料制备物，特征在于相对于制备物总体积，以重量(w/v)计，所述第一染料的含量在0.0001％至0.5％之间。
4.根据权利要求2的染料制备物，它还包含不同于第一染料的第二染料。
5.根据权利要求4的染料制备物，其中所述的第二染料为锥虫蓝。
6.根据权利要求2的染料制备物，特征在于其具有在1.01g/cm3至1.5g/cm3之间的密度，并且其还包含至少一种用于提高密度的试剂。
7.根据权利要求6的染料制备物，特征在于所述至少一种用于提高密度的试剂选自：重水D2O、单糖、二糖、多糖、聚醚、聚乙烯醇、聚酯、聚丙烯酸共聚物、甘露醇和聚乙烯吡咯烷酮。
8.根据权利要求6的染料制备物，特征在于所述至少一种用于提高密度的试剂是中性聚合物。
9.根据权利要求6的染料制备物，特征在于所述用于提高其密度的试剂为具有实验式(C12H22O11·C3H5ClO)n和下述结构的聚合物：
Figure FDA0002628926100000021
10.根据权利要求9的染料制备物，其中相对于制备物总体积，以重量(w/v)计，所述用于提高其密度的试剂的含量在0.001％至20％之间。
11.根据权利要求2至10中任一项的染料制备物，特征在于它还包含磷酸盐缓冲基质。
12.根据权利要求2至10中任一项的染料制备物，特征在于至少在0℃至50℃之间的温度范围内它也为液体。
13.用于合成根据权利要求1的染料分子的方法，特征在于其利用由亮蓝G250构成的起始产物的甲基化反应。
14.根据权利要求13的方法，其中所述甲基化反应包括使起始产物在一个或多个步骤中与氢氧化钠和碘代甲烷反应。
15.根据权利要求2至10中任一项的染料制备物在制备用于玻璃体视网膜手术的手术方法中的制剂中的用途。
16.根据权利要求2至10中任一项的染料制备物在制备用于在手术方法中染色内界膜ILM和/或视网膜前膜EPRM的制剂中的用途，所述手术方法包括随后分别切除ILM和/或EPRM。
17.根据权利要求4或5的染料制备物在制备用于在手术方法中染色内界膜ILM和视网膜前膜EPRM的制剂中的用途，所述手术方法包括随后分别切除ILM和EPRM，其中第一染料用于至少染色ILM且第二染料染色视网膜前膜EPRM。
18.根据权利要求2至10中任一项的染料制备物在制备用于染色蛋白质的制剂中的用途，所述的制剂是为了使该蛋白质所属的组织更明显可见。
19.染料制备物在制备用于玻璃体视网膜手术的手术方法中的制剂中的用途，其中所述的染料制备物大于1.01g/cm3的密度且包含至少一种染料和至少一种增加其密度的物质，该物质是具有经验式(C12H22O11·C3H5ClO)n和如下结构的聚合物
Figure FDA0002628926100000041
其中所述的至少一种染料选自BBG、BBG的可药用盐或BBG的甲基化物。
20.染料制备物在制备用于在手术方法中染色内界膜ILM和/或视网膜前膜EPRM的制剂中的用途，所述的手术方法包括后续分别除去ILM和/或EPRM，其中所述的染料制备物大于1.01g/cm3的密度且包含至少一种染料和至少一种增加其密度的物质，该物质是具有经验式(C12H22O11·C3H5ClO)n和如下结构的聚合物
Figure FDA0002628926100000042
其中所述的至少一种染料选自BBG、BBG的可药用盐或BBG的甲基化物。
21.染料制备物在制备用于染色蛋白质使该蛋白质所属的组织更可见的制剂中的用途，其中所述的染料制备物大于1.01g/cm3的密度且包含至少一种染料和至少一种增加其密度的物质，该物质是具有经验式(C12H22O11·C3H5ClO)n和如下结构的聚合物
Figure FDA0002628926100000043
其中所述的至少一种染料选自BBG、BBG的可药用盐或BBG的甲基化物。
22.根据权利要求19、20或21的染料制备物的用途，其中相对于制备物总体积，以重量(w/v)计，所述用于提高其密度的试剂的含量在0.001％至20％之间。
23.根据权利要求19、20或21的染料制备物的用途，特征在于所述的染料制备物还包含磷酸盐缓冲基质。
24.根据权利要求19、20或21的染料制备物的用途，特征在于至少在0℃至50℃之间的温度范围内所述的染料制备物也为液体。
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