CN1648167A - 浓偶氮染料溶液,其染色试剂盒及制备蛋白质染液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于染色蛋白质以进行分析的偶氮染料的存在形式，尤其是酰氨黑型，其浓缩于液体介质，本发明还涉及制备蛋白质染色溶液的方法。本发明也涉及包含所述浓缩染料溶液的染色试剂盒。

Description

浓偶氮染料溶液， 其染色试剂盒及制备蛋白质染液的方法
发明领域
本发明涉及一种稳定的浓缩染料溶液以及所述稳定溶液在染色通过电泳，例如凝胶电泳分析的蛋白质中的应用。
发明背景
电泳技术，尤其是凝胶电泳，能用来分离生物样品，如血清，血液，尿，脑脊髓液，等等中的蛋白质成分。沉积到电泳载体如凝胶上的蛋白质在电场的影响下迁移。因为蛋白质依赖于它们的电荷和/或分子量而以不同的速率迁移，因此电泳能够分离蛋白质。当迁移完成，载体，假如是凝胶，被干燥或经过用定影剂定影的步骤。或者，蛋白质能被转移到在另一个载体，例如膜片的凝胶上。
然后载体在染色浴中或为了给蛋白质染色而制备的染色溶液中被染色，使得被分离开的蛋白质级分更好地对比进行目测检验。如同定性分析一样，蛋白质级分的定性分析通过密度计读数从而获得生物样品中每个分离和染色的蛋白质级分的百分比来进行。
通常，使用偶氮染料，例如酰氨黑，在酸性溶液中使用，作为浴或染色溶液。为了染色蛋白质分析的规律性，精确性以及再现性，重要的是所使用的染色溶液是一致的，性质可比较的。
通常，用于染色的染料是市场上买得到的，以浓缩形式存在于液体介质中，一般是在含水酸性介质中。通常，市场上买得到的浓缩于酸性介质中的酰氨黑的存放期是2年或3年。这种浓缩型的在用之前先稀释再用来制备染色溶液，稀释后的备用染色溶液不稳定，因此应在制备好后一个月内使用这些溶液。
现在已经证实，对于相同的样品，密度计结果，即，每种被染色并检测到的分离的蛋白质级分的百分比，可作为不仅仅是染料性质、它的成分的函数而变化，而且也作为它的浓度，尤其是用于制备染色溶液的浓缩染料溶液的保存时间，即它的降解程度的函数而变化。
用密度计获得的分析结果显示级分的百分比随浓缩染料的保存时间而变化。举个例子，对于同一个人的血清，白蛋白的百分比可从69％(该值由稀释染料来测定，即从新的浓缩酰氨黑稀释的稀释染色溶液)，变化到63％(该值由保存了30个月的酰氨黑浓缩物稀释的染色溶液来测定)。染色凝胶的颜色的轻微变化已经被观察到：稀释新的浓缩物引起亮蓝色，而稀释放久了的浓缩物引起蓝-黑色。
为了进行恒定的测量，并避免级分百分比的变化，溶液不得不用以粉沫形式呈现并保存的染料。在将要时蛋白质染色的时候，将粉末溶于酸/水介质或酸/水/醇介质来制备染料。此外，应在制备好后一个月内使用该染料。
然而，粉末形式具有以下缺点。在制备过程中分配粉末存在困难。更进一步，与这种外观形态(粉末)相关的缺点是使用者难于处理粉末，其通常是非常细，结果比在液体状态中更不确定，而且溶解时间也相当长。
由于关系到粉末的难点，我们寻求研制一种液体形态的浓缩染料，允许例如蛋白质级分的百分比在随后的光密度测定步骤中不依赖于浓缩染料的存放时间而被测量。
因此，有必要提供一种用于染色蛋白质的偶氮染料，尤其是液体浓缩物形式的酰氨黑染料，它能提出一种不随浓缩染料的存放时间而变化的蛋白质级分的测量方法。
发明内容
本发明涉及包含偶氮染料和用于所述染料的溶剂的染料溶液，所述溶剂是非酸性的，并且和水易混合。
对于本发明的浓缩染料溶液，使得在没有染料粉末降解的情况下延长浓缩物在溶液中的保存期成为可能，即，浓缩染料溶液稳定并能生产所需的恒定质量的染色溶液，当它被稀释生产染色溶液时不依赖于储存浓缩物的保存时间。
因此，浓缩溶液的稳定问题被克服了，这通过实施例将看的更明显。
通过下面的详细描述并结合附图能更好地理解本发明。
附图简述
图1表示在现有技术的酸性介质中的酰氨黑染料溶液随着保存时间从1-30个月增加的薄膜色谱分析(TLC)的结果，从右向左，右侧有对照。
图2A和2B表示现有技术的染色溶液(2A)在TLC中显示的附加谱带相对应的紫外-可见光谱以及酰氨黑(2B)的紫外-可见光谱。
图3表示在本发明的酸性介质中的酰氨黑染料溶液在7-15天的加速老化过程后的薄膜色谱分析(TLC)结果，(从右向左，右侧有对照)。
图4表示在本发明的酸性介质中的酰氨黑染料溶液在7，14，24天的加速老化过程后的薄膜色谱分析(TLC)结果，，从右向左，右侧有对照。
术语“染料溶液”在此表示在稀释使用之前的浓缩溶液，术语“染色溶液”表示稀释后的溶液，如备用溶液。
按照本发明，术语“偶氮染料”是指在该化学领域中的染料，常常用来染色蛋白质，尤其是那些能在酸性介质中降解的。
因此本发明的染料首先是酰氨黑染料，但偶氮染料也可以选自例如丽春红，酸性紫以及考马斯蓝。
染料酰氨黑也被认为是萘酚蓝黑。含水乙酸/异丙醇溶液和粉末都是市场上可以买到的。
因此，一方面，本发明允许偶氮染料，尤其是酰氨黑染料以稳定的形式存在于浓缩溶液中。这一结果是通过在保存时从常规制备的酸性介质中分离出染料而得到的。本发明的染料溶液不含有任何在一种成分的酸性影响下能降解溶液中染料的所述成分。
按照本发明，对于染料能使用的溶剂是非酸性的溶剂，即，能溶解染料的溶剂，阻止染料被酸降解。由于浓缩溶液之后的使用，因此溶剂选自易与水混合的溶剂。可以用无水溶剂。
通过在溶剂中用常规方法增溶染料粉末来制备染料溶液。
优选地，溶剂选自乙二醇，二甲基甲酰胺，乙醇，甲醇，二甲亚砜，水，丙三醇，苯甲醇以及它们的混合物，以及通常不会由于溶剂的酸性而导致染料变差的任何染料溶剂。
优选地，溶剂选自乙二醇，水以及丙三醇；更优选，选自乙二醇。
关于浓缩物，染料溶液每100毫升溶剂中包含约4克纯染料，最多可达到染料在所选溶剂中的溶解度极限。
换句话说，对于酰氨黑，染料溶液优选每100毫升溶剂包含4-20克染料。这些值，以及实施例给出的值都是作为例子，其它稀释物也可以，这依赖于染料，最终目的是获得包含常用浓缩物的染色溶液，即，至少每升染色溶液中含1克染料。每100毫升溶剂包含8-20克染料的染料溶液也是合适的。
染色溶液在使用的时候临时制备，也可以在制备好一个月内使用。
染色溶液通过用酸性溶液稀释浓缩溶液来制备。在使用的时候，浓缩染料溶于酸水混合物来适当地染色蛋白质。
酸性溶液主要是常用于染色溶液的酸的水溶液或水醇溶液。优选，使用柠檬酸或乙酸，但也优选富马酸，硝酸，磺基水杨酸，磷酸以及三氯乙酸，例如，也可以用它们的混合物。
能用于水醇混合物的醇是常用的醇类，如，选自异丙醇，甲醇及乙醇。
为了获得染色溶液，染料溶液可以用制备好的酸性溶液稀释或者在制备好的酸性溶液中稀释，或者染料溶液可以和水或其它溶剂混合物，如水醇溶液混合，水醇溶液稀释并引进浓缩酸或纯酸溶液。稀释条件以及酸的量被调整使得染色溶液中的pH值约为2。pH值在使用时可以任意调整。
本发明也涉及如上所述的浓缩溶液制备蛋白质染色溶液的应用。例如，染色溶液可以通过用稀释酸的含水溶液稀释制备，或者通过混合合适剂量的浓缩酸和染色溶液及稀释剂，如水来制备。稀释剂优选水或任何其它稀释剂的混合物，也可以用溶剂混合物，例如水醇的，它和染料相容，或使用水及酸。
本发明也涉及在电泳，尤其是凝胶电泳后的染色溶液染色蛋白质的应用。
本发明也涉及染色试剂盒，包含至少一种染料溶液，一定用量的酸稀释剂或一定用量的浓缩酸，以及任意的稀释剂。
下面的实施例用以说明本发明，但本发明不局限于下述实施方式。
具体实施方式
浓缩酰氨黑溶液的稳定性的评价方法
用于电泳的酰氨黑染料以浓缩形式存在于柠檬酸/水介质中(75毫升10％w/v柠檬酯溶液中有1.2克染料)。然后这一浓缩染料溶液在使用时在水中稀释(75毫升浓缩物用225毫升水稀释)。
a)对于同样的分析样品，级分的百分比和染料的颜色变化作为保存时间的函数被记录下来，见下面的表I及图1。试验中用到两批保存时间有10个月的染料。
染料的保存时间(月) 人的白蛋白级分的百分比(％)    染料颜色
    30     63     蓝-黑
    19     64.9     蓝-黑
    16     66.3
    15     66.1
    10     64.6
    10     64.5
    4     67.2
    1     68.3     亮蓝
    0     69     亮蓝
表I
b)按照它们的保存时间的函数分类的酸性介质中的染料浓缩物(75毫升10％w/v柠檬酸溶液中有1.2克染料)也可以通过薄膜色谱
分析(TLC)来测试。对于用法，通过往1体积浓缩溶液中加入3体积水，酸性介质中的浓缩染色溶液被稀释4倍，得到的染色溶液与a)所述的染色溶液类似。
所得结果显示染料的保存时间和外观或紫外-可见光谱的附加谱带的强度的增加之间有一定关系，是特有的且不同于酰氨黑，所述紫外-可见光谱由分光光度计获得。同时，随着染料保持时间的延长可观察到酰氨黑的主谱带的强度的降低。
这些观测值总结在下述表II中并显示于图1中(TLC)，以及图2A和图2B(紫外-可见光谱)-图1的箭头指向附加谱带。
浓缩染料的保存条件 人的白蛋白级分的百分比(％) 染料颜色
    60℃，15天     63.2     蓝-黑
    60℃，7天     65.7
    60℃，0天     69     蓝-黑
表II
c)结论
如上所述在酸/水混合物溶液中制备的浓缩酰氨黑染料，于60℃，b)下保存，显示出的降解信号和以同样的方式制备的同样的染料但在环境温度下保存30个月，a)的降解信号相同。蛋白质级分的百分比的修饰，染料颜色的变化，以及TLC附加谱带的概貌都可以观察出来(见图3及比较表II和表I)。
图3中的箭头指向附加谱带。
可以得出结论，在60℃下保存染料14天与在环境温度下保存相同的染料30个月是同等的，这个加速老化方案可以有效地用于说明在环境温度下的自然老化。
实施例1
将16克Mcrck所售的粉末状酰氨黑加入到100毫升乙二醇中，搅拌直到完全溶解。得到染料溶液。
取8毫升这种染料溶液在292毫升10％(w/v)的柠檬酸溶液中稀释。如此制得备用的染色溶液，它的pH值约为2。
实施例2和3
重复实施例1的步骤，以同样比例的丙三醇和水取代乙二醇，得到染料溶液。
在同样的稀释条件下得到pH值约为2的染色溶液。
实施例4：本发明的浓缩染料的稳定性的评价
实施例1的浓缩染料溶液的表III的结果是在上述方法的条件下得到的。
浓缩染料的保存条件 人的白蛋白级分的百分比(％) 染料颜色
    60℃，24天     69.2     亮蓝
    60℃，14天     69.1     亮蓝
    60℃，7天     69.5     亮蓝
    60℃，0天     69.1     亮蓝
表III：人血清白蛋白的百分比的变化是作为浓缩染料在乙二醇介质中的保存条件的函数，如图4所示。
箭头强调缺少附加谱带。
可以看出实施例1的浓缩染料溶液比传统的酸性浓缩溶液稳定。
实施例5
一种试剂盒，包含8毫升实施例1的染料溶液以及装有60毫升浓缩柠檬酸(50％w/v)的烧瓶。通过混合8毫升染料溶液和烧瓶中的物质并加入水至300毫升，可获得pH值约为2的染色溶液。

Claims (14)

1、一种染料溶液，包含偶氮染料和用于所述染料的溶剂，所述溶剂是非酸性的并与水易混合，该染料溶液每100毫升溶剂中包含约4克染料，最多可达到在所述溶剂中所述染料的溶解度极限。
2、按照权利要求1所述的染料溶液，其特征在于偶氮染料能在酸性介质中降解。
3、按照权利要求1或2所述的溶液，其特征在于所述偶氮染料选自丽春红，酸性紫，考马斯蓝以及酰氨黑染料。
4、按照权利要求1至3中任一所述的染料溶液，其特征在于所述染料是酰氨黑染料。
5、按照权利要求1至4中任一所述的溶液，其特征在于所述溶剂选自乙二醇，二甲基甲酰胺，乙醇，甲醇，二甲亚砜，水，丙三醇，苯甲醇以及它们的混合物。
6、按照权利要求1至5中任一所述的溶液，其特征在于所述溶剂选自乙二醇，水和丙三醇以及它们的混合物。
7、按照权利要求1至6中任一所述的溶液，其特征在于所述溶剂是乙二醇。
8、一种制备染色溶液的方法，其特征在于用酸性的含水或水醇溶液，或者是用含水或水醇溶液临时稀释按照权利要求1至7中的任一染料溶液，所述酸是临时加到染色溶液中的。
9、按照权利要求8所述的方法，其中所述染色组合物的pH值被调整到约2。
10、按照权利要求8或9所述的方法，其中所述酸选自柠檬酸，乙酸，富马酸，硝酸，三氯乙酸，磺基水杨酸和磷酸以及它们的混合物。
11、按照权利要求8，9或10所述的方法，其中所述酸是柠檬酸或乙酸。
12、按照权利要求1至7中所述的任一溶液的用途，用于制备蛋白质染色溶液。
13、按照权利要求12所述的用途，其特征在于所述蛋白质在凝胶电泳后染色。
14、一种染色试剂盒，包含至少一种按照权利要求1至7所述的任一染料溶液，一定剂量的酸性稀释剂或一定剂量的浓缩酸，以及任选的稀释剂。
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