CN105203368B - 5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的用途 - Google Patents

Abstract

某些氨基酸(如色氨酸等)会与嘧啶碱基发生光解加成反应而放出可见荧光。5‑氟胞嘧啶作为一种新型的蛋白质染色剂，可以在5分钟内完成对蛋白条带的可见荧光检测。蛋白质中的色氨酸在紫外光诱导下和5‑氟胞嘧啶反应产生可见荧光的蛋白条带。本专利研究表明，5‑氟胞嘧啶作为蛋白质新型染色剂可以减少染色步骤，凝胶电泳结束后取出凝胶并放在紫外激发台上可以在5分钟内看到荧光蛋白条带，完成对蛋白的初步检测工作；另外，快速可视化方法可以看到78ng的总蛋白量检测灵敏度等同于考马斯亮蓝(CBB)染色法；并且凝胶在观察后还可以进行CBB染色，实现对蛋白质的互补检测；此外，凝胶可视化操作后还可以进行后续的蛋白免疫印迹检测等实验操作并无不良影响。

Description

5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的用途

技术领域

本发明涉及5-氟胞嘧啶的新用途，尤其涉及5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途，属于5-氟胞嘧啶的应用领域。

背景技术

蛋白质组学（proteomics）是指以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，从细胞水平及整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识有机体的各种生理和病理。与传统蛋白质研究比较，蛋白质组学研究体现了全面性、整体性、高通量、大规模的特点。蛋白质组学的研究对于已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析具有无法替代的重要作用。蛋白质组学技术较为复杂，包括蛋白质分离、鉴定和信息分析三方面的内容。其中，凝胶电泳是与分离和鉴定相对应的核心技术之一。

自1959年Raymond和Weintraub首次使用聚丙烯酰胺作为电泳的支持介质，特别是20世纪60年代初Hjerten、Ornstein和Davis发表不连续电泳系统的基础工作以来，聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验最常用的支持介质，通过使用强阴离子SDS建立的SDS-PAGE技术已成为蛋白质分离、分析的常用方法。为了确定多肽链的分子量，就必须在有阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠的存在下进行蛋白电泳。这种去污剂不仅可以完全打开蛋白质的折叠结构，而且可以和未折叠的肽链结合产生恒定的电荷密度。这意味着可以只依据蛋白质分子量对蛋白质进行分离。并通过与已知分子量的蛋白标准品进行比对而得知未知蛋白的分子量。

而在蛋白质组学而在蛋白质组学试验中，蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的染色是一个十分重要的环节。常用的蛋白质染色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色等。其中，考马斯亮蓝（CBBR和CBBG）染色是最常用的蛋白质染色方法，它具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点。但是此方法通常涉及到几个小时的蛋白质固定，染色和脱色过程。并且染色和脱色试剂都具有腐蚀性和刺激性气味，考马斯亮蓝的蓝色染色沾染在操作仪器等物品上也很难消除，除此之外，经过染色剂染色的聚丙烯酰胺凝胶也无法再进行下游相关的蛋白质检测操作。银染是目前公认的除了放射性标记以外最为灵敏的蛋白质检测方法，可以在纳克级水平上检测蛋白。但是，银染通常会有相对低的重复性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛会对蛋白质进行修饰，导致银染的后续蛋白质组学研究的兼容性能普遍不佳。最近发展以来的荧光染色技术有很高的灵敏度和后续蛋白质组学研究兼容性。但由于荧光染料价格昂贵，且极易淬灭，还需要高端的仪器设备和特殊的分析软件，限制了该项技术在蛋白质组学领域的广泛应用。

Western blot凝胶电泳是后续的蛋白质组学研究技术之一，其主要是用来识别、量化、并确定特定蛋白的大小。Western blot是由Northern blot和Southern blot演化而来。在20世纪70年代后期，Towbin等人（1979年）使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。Burnette等人（1981年）使用应用广泛的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，这最终将这种方法被称为Western印迹。它也被称为蛋白质印迹或免疫印迹，并迅速成为蛋白质组学研究的有力工具。Western blot的方法是先用凝胶电泳分离天然或变性的蛋白质，然后将蛋白质转移到膜上，用未标记的特异性一抗与转移到膜上的抗原结合，再加入标记（酶、荧光、生物素等标记）的二抗进行免疫检测，存在检测步骤多、成本高等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明目的之一是提供5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途；

本发明目的之二是将用5-氟胞嘧啶染色蛋白质的方法进行了优化；

本发明目的之三是提供了一种改进的蛋白质检测方法；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

针对现有的蛋白质染色剂或染色方法所存在的各种缺陷，本发明人进行了深入研究，最终发现，5-氟胞嘧啶可以作为蛋白质的染色剂。用5-氟胞嘧啶作为蛋白质的染色剂，染色步骤简便、染色所需时间短，所需染料的量少及5分钟内可完成检测，染色后的蛋白产物经紫外激发后可以肉眼直观检测也可以被仪器检测，从而完成了本发明。

本发明首先提供了5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途；5-氟胞嘧啶可以在蛋白质的标记或检测等领域中有了多种用途，诸如：将标准量的蛋白质用5-氟胞嘧啶染色后制作预染蛋白质分子量标准品（marker）以及质谱分析前端的目的蛋白筛选和鉴定等。

进一步，本发明提供了用5-氟胞嘧啶对蛋白质进行染色的方法，该方法包括：在聚丙烯酰胺凝胶混合液（聚丙烯酰胺凝胶混合液的组成成分为Tris-Cl、丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、SDS、过硫酸铵、TEMED。）聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液或将5-氟胞嘧啶溶液提前混入聚丙烯酰胺凝胶组分之一的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液中4℃贮存，,制备凝胶时取出直接作为组分使用则凝胶聚合前不再需要添加5-氟胞嘧啶或将5-氟胞嘧啶溶液与需要染色的蛋白质混合进行反应或将聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后放入该5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色。

其中，在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液的体积比范围为0.1%至5%；5-氟胞嘧啶溶液与聚丙烯酰胺凝胶组分（丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液）的混合比例优选为1:500至1: 50；5-氟胞嘧啶溶液与蛋白质的体积比优选为1:20至1:5。

适用于5-氟胞嘧啶染色的蛋白质可以是任何一种需要采用染色的方法进行定性或定量检测的蛋白质，例如：在蛋白检测中作为蛋白质分子量标准品（marker）的蛋白质。

由此，本发明提供了一种预染色的蛋白质分子量标准品，通过将标准量的蛋白质用5-氟胞嘧啶染色后制备得到。

本发明提供了一种优化的检测蛋白质的Western blot方法，该方法包括：用凝胶电泳分离待检测的蛋白质；将凝胶电泳分离的蛋白质转移到膜上；通过紫外光检测系统直接检测转膜效率及蛋白质在膜上的分布，以确定是否完成后续实验，节省检测时间，降低检测成本。

综上，采用5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂具有价格低廉，操作简单，染色所需时间短，灵敏度适中，观察简易，凝胶背景很浅，后续蛋白质组学研究的兼容性好等优点，可以在制备蛋白质分子量标准品（marker）、优化Western-blot、或聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方式有较为广泛的应用前景。

附图说明

图1 5-氟胞嘧啶不同处理方法对蛋白质染色的结果

图1A显示的是大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后使用紫外线激发的结果图；M-蛋白分子量标准。

图1B显示的是在大肠杆菌总蛋白中加入5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后紫外线激发后的检测结果图；M-蛋白分子量标准。

图1C显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液后，大肠杆菌总蛋白电泳结束后使用紫外线激发后的检测结果图；M-蛋白分子量标准。

图1D显示的是30%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺（29:1）与5-氟胞嘧啶溶液预混合后制备聚丙烯酰胺凝胶，大肠杆菌总蛋白在电泳结束后使用紫外线激发后的检测结果图； M-蛋白分子量标准。

图2 、图3 5-氟胞嘧啶不同处理方法对蛋白质染色后再进行CBBR-250染色的结果

图2A显示的是大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后后使用紫外线激发观察后再经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；M-蛋白分子量标准。

图2B显示的大肠杆菌总蛋白中加入5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发观察后经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；

图2C显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液后，大肠杆菌总蛋白电泳结束后使用紫外线激发观察后经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；

图2D显示的是30%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺（29:1）与5-氟胞嘧啶溶液预混合后制备聚丙烯酰胺凝胶，大肠杆菌总蛋白电泳结束后使用紫外线激发观察后经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果图片；

图3A聚丙烯酰胺泳结束后将凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色10分钟后用紫外光照射检测图；

图3B聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后将凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色10分钟后用紫外光照射检测后再经CBB-R250染色检测。

图4 不同浓度的5-氟胞嘧啶对蛋白质染色的结果

图4A显示的是不同浓度的大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后使用紫外线激发后的结果；M-蛋白分子量标准。

图4B显示的不同浓度大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在加入0.1% 的5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发的结果；M-蛋白分子量标准。

图4C显示的不同浓度大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在加入1% 的5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发后的结果；M-蛋白分子量标准。

图4D显示的不同浓度大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在加入5% 的5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发后的结果；M-蛋白分子量标准。

图5 不同浓度的5-氟胞嘧啶对蛋白质染色后再经考马斯亮蓝R250染色的结果

图5A显示的是不同浓度的大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在聚丙烯酰胺凝胶未加入5-氟胞嘧啶溶液时电泳结束后使用紫外线激发后再经考马斯亮蓝R250染色的结果；M-蛋白分子量标准。

图5B显示的不同浓度大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在加入0.1% 的5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发后再经考马斯亮蓝R250染色的结果；M-蛋白分子量标准。

图5C显示的不同浓度大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在加入1% 的5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发后再经考马斯亮蓝R250染色的结果；M-蛋白分子量标准。

图5D显示的不同浓度大肠杆菌总蛋白（泳道2-9）在加入5% 的5-氟胞嘧啶溶液后经过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离后使用紫外线激发后再经考马斯亮蓝R250染色的结果；M-蛋白分子量标准。

图6 5-氟胞嘧啶染色对蛋白浓度的检测；

图6A显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液，牛血清白蛋白（BSA）电泳结束后使用紫外线激发检测结果；牛血清白蛋白（BSA）的上样量：M-蛋白分子量标准；泳道2：10μg，泳道3：5μg；泳道4：2.5μg；泳道5：1.25μg；泳道6：0.625μg；泳道7：0.3125μg；泳道8：0.156μg；泳道9：0.078μg；泳道10：0.039μg

图6B显示的是聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液，牛血清白蛋白（BSA）电泳结束后使用紫外线激发观察后再经考马斯亮蓝R-250染色20分钟、脱色过夜的结果；

图7小鼠肺组织总蛋白使用5-氟胞嘧啶染色后β-actin的免疫印迹检测；

图7A显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液，小鼠肺组织总蛋白电泳结束后使用紫外线激发后的检测结果；

图7B显示的是在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液，小鼠肺组织总蛋白电泳结束后使用紫外线激发后、进行转膜操作后的β-actin的免疫印迹检测结果（使用化学发光方法检测结果）；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1. 实验材料：

1.1 染料

5-氟胞嘧啶购自Sigma公司，将5-氟胞嘧啶配置成浓度为1.5g/100mL的溶液在实施例中使用。

1.2蛋白及抗体

牛血清白蛋白（BSA）购自sigma公司，兔源非特异性IgG抗体购自英国Abcam公司。Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司。

2.实验试剂：

Tris盐：北京欣经科生物技术有限责任公司

SDS （十二烷基硫酸钠）：MP Biomedicals（Shanghai）Co.,Ltd.

EDTA-Na₂ （乙二胺四乙酸二钠）：MP Biomedicals（Shangha）Co.,Ltd.

丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺（29:1）：MP Biomedicals（Shanghai）Co.,Ltd.

DTT（二硫苏糖醇）：北京欣经科生物技术有限责任公司

APS（过硫酸铵）：北京欣经科生物技术有限责任公司

TEMED (N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺)：MP Biomedicals （Shanghai）Co.,Ltd.

甘氨酸:国药集团化学试剂北京有限公司

预染标准分子量蛋白：美国 Biorad公司

异丙醇： 国药集团化学试剂北京有限公司

乙酸：国药集团化学试剂北京有限公司

氯化钠： 国药集团化学试剂北京有限公司

磷酸二氢钾: 国药集团化学试剂北京有限公司

磷酸氢二钠: 国药集团化学试剂北京有限公司

Tween-20：美国MP Biomedicals公司

考马斯亮蓝R-250：美国MP Biomedicals公司

无水乙醇：国药集团化学试剂北京有限公司

主要试剂的配制

3.2SDS-PAGE 电泳：

10%APS：称取0.1g过硫酸铵，去离子水溶解并定容至lmL，4°C保存1周内使用。

10%SDS：称取10gSDS，加去离水定容至100mL。

1.5M Tris-HCl（pH8.8）：称取18.17g Tris盐，去离子水溶解后，用浓HCl调节pH值至8.8，最后用去离子水定容至100mL，4°C保存。

0.5M Tris-HCl（pH6.8）[0054] 称取12.11g Tris盐，去离子水溶解后，用浓HCl调节pH至6.8，最后用去离子水定容至100mL，4°C保存。

电泳缓冲液[0058] 称取15g Tris盐、72g甘氨酸、5g SDS，去离子水定容至1000mL。

3.4考马斯亮蓝染色所需试剂：

固定的染色液

分别称取1g考马斯亮蓝R-250，250mL乙醇、100mL醋酸，去离子水定容至1000mL

脱色液

50mL乙醇、100mL醋酸，去离子水定容至1000mL。

实施例1使用5-氟胞嘧啶采用不同方法染色蛋白质的结果

方法1.在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶对蛋白质进行染色的方法

（1）将清洗过的1.0mm厚的玻璃板固定于灌胶架上。

（2）配制10%的聚丙烯酰胺分离胶混合液，聚丙烯酰胺凝分离胶混合液的组成为Tris-Cl、丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、SDS、过硫酸铵、TEMED。将上述试剂混合均匀后再加入5-氟胞嘧啶溶液混匀后全量加样于玻璃板中，缓慢加入去离子水，室温下放置30min等待分离胶凝固。

（3）待分离胶凝固后倒掉所封水层，加入2mL聚丙烯酰胺浓缩胶，同时在胶面上插上梳子。

（4）待上胶凝固后，缓慢拔掉梳子，加样于上样孔中，80V电压跑电泳，待样品在浓缩胶和分离胶的界面处压成一条线时，约为30min，调电压至150V。

（5）电泳结束后，分开两块玻璃板，切除浓缩胶，紫外光激发后照相。

方法2.在制备聚丙烯酰胺凝胶的组分之一丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液中加入5-氟胞嘧啶溶液对蛋白质进行染色的方法。

（1）使用提前已经加入5-氟胞嘧啶溶液制成的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液作为组分之一，再配制10%的聚丙烯酰胺分离胶混合液，聚丙烯酰胺凝分离胶混合液的组成为Tris-Cl、丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、SDS、过硫酸铵、TEMED。将上述试剂混合均匀后全量加样于玻璃板中，缓慢加入去离子水，室温下放置30min等待分离胶凝固。

（2）待分离胶凝固后倒掉水层，加入2mL聚丙烯酰胺浓缩胶，同时在胶面上插上梳子。

（3）待上胶凝固后，缓慢拔掉梳子，加样于上样孔中，80V电压跑电泳，待样品在浓缩胶和分离胶的界面处压成一条线时，约为30min，调电压至150V。

（4）电泳结束后，分开两块玻璃板，切除浓缩胶，紫外光激发后照相保存实验结果。

方法 3.在蛋白质检测样品中加入5-氟胞嘧啶对蛋白质进行染色的方法

（1）将蛋白质样品加入上样缓冲液100°C加热5min后取出，4℃，13000rpm离心10分钟后取上清。

（2）取10 μL5-氟胞嘧啶溶液染色液与100 μL蛋白质溶液充分混合。

（3）将混合后的样本经SDS-PAGE 电泳鉴定。

方法 4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后将凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色。

（1）将清洗过的1.0mm厚的玻璃板固定于灌胶架上。

（2）配制10%的聚丙烯酰胺分离胶混合液，聚丙烯酰胺凝分离胶混合液的组成为Tris-Cl、丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、SDS、0.1%过硫酸铵、TEMED。将上述试剂混合均匀后全量加样于玻璃板中，缓慢加入去离子水，室温下放置30min等待分离胶凝固。

（3）待分离胶凝固后倒掉所封水层，加入2mL聚丙烯酰胺浓缩胶，同时在胶面上插上梳子。

（4）待上胶凝固后，缓慢拔掉梳子，加样于上样孔中，80V电压跑电泳，待样品在浓缩胶和分离胶的界面处压成一条线时，约为30min，调电压至150V。

（5）电泳结束后，分开两块玻璃板，切除浓缩胶，将聚丙烯酰胺凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色，紫外线照射后观察实验结果。

将上述四种方法得到的凝胶放入考马斯亮蓝染色液R250中20min，期间不断震荡染色。

将凝胶放入脱色液中，多次更换脱色液直至凝胶背景脱净为止。

2、实验结果

通过以上方法对蛋白质进行预染，实验组的设计分别是用5-氟胞嘧啶采用不同方法处理蛋白质电泳后紫外激发检测及紫外激发检测后再用考马斯亮蓝染色的蛋白质检测结果。实验结果显示，通过5-氟胞嘧啶经过三种不同染色方法对蛋白质的染色可以被肉眼识别且条带与考马斯亮蓝染色后的条带一致（图1、图2、图3）。实验结果表明5-氟胞嘧啶可以用于蛋白质的染色。

实施例2 不同浓度的5-氟胞嘧啶对蛋白质染色效果的检测实验

1、实验方法

（1）配置浓度为0.1 μg/μL的大肠杆菌总蛋白溶液，逐次递减稀释浓度分别为0.05μg/μL、0.025μg/μL、0.0125μg/μL、0.00625μg/μL、0.003125μg/μL、0.00156μg/μL、0.00078μg/μL、0.00039μg/μL。

100°C加热5min后取出，4℃，13000rpm离心10分钟后取上清10μL上样。

按照实验例1中的方法1分别配制不同浓度的5-氟胞嘧啶的聚丙烯酰胺凝胶，浓度分别为0.1%、1%、5%后进行SDS-PAGE电泳检测。

按照实验例1中的方法2分别使用5-氟胞嘧啶溶液与丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液的混合比例为1:50，1:100，1:500的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液加入其它组分（Tris-Cl、SDS、过硫酸铵、TEMED）配制聚丙烯酰胺凝胶后进行SDS-PAGE电泳检测。（此实验例没有展示结果图片）

2、实验结果

通过紫外光激发，可见所测样品在包含不同浓度的5-氟胞嘧啶的聚丙烯酰胺凝胶中的电泳结果有所分别，随着5-氟胞嘧啶的浓度递增，蛋白样品的染色效果有所区别，其中1%的5-氟胞嘧啶（图4C）和5%的5-氟胞嘧啶（图4D）的聚丙烯酰胺凝胶所检测的蛋白样品条带清晰度一致，并且伴随5-氟胞嘧啶浓度大幅度的提高，并未出现蛋白条带清晰度的显著变化。因此实验结果显示，5-氟胞嘧啶染料的使用浓度范围确定为0.1%-5%，并且随后使用传统考马斯亮蓝染色方法检测到的结果和使用5-氟胞嘧啶染料染料对蛋白进行染色的结果是一致的（图5）。

实施例3 5-氟胞嘧啶标记牛血清白蛋白浓度检测实验

1、实验方法

（1）配置浓度为1μg/μL的BSA蛋白溶液，逐次递减稀释浓度分别为0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.125μg/μL、0.0625μg/μL、0.03125μg/μL、0.0156μg/μL、0.0078μg/μL、0.0039μg/μL。

100°C加热5min后取出，4℃，13000rpm离心10分钟后取10μL上清上样。

按照实验例1中的方法2配制随后进行SDS-PAGE电泳鉴定。

2、实验结果

通过紫外光激发，可见8管样品（第2泳道～第9泳道）都呈现清晰条带，并且条带随蛋白质浓度的降低逐渐变细，当蛋白质量为78ng（第10泳道）时，条带已经极细，不易辨别（图6A）。实验结果显示，5-氟胞嘧啶染料标记蛋白质的最小量为78ng，其可检测到的灵敏度和传统考马斯亮蓝染色方法检测到的蛋白灵敏度是一致的（图6B）。

实验例4用5-氟胞嘧啶染料优化Western blot检测方式的实验

1、实验方法

按照本专利中涉及到的三种染色方法中任何一种方法完成SDS-PAGE操作后，将转膜用的夹子（夹子的黑色部分在最下方）按照海绵—whatman 滤纸—胶—PVDF膜—whatman滤纸—海绵—透明夹子部分夹好后，用Bio-Rad湿式转膜装置进行转膜操作：将整个装置放置于大的冰盒中，加入转膜缓冲液（恒流：400mA）转2个小时；封闭：转膜完毕后，将转印有蛋白的PVDF膜用丽春红溶液染色10min检测转膜效果，之后用纯净水洗净，用5%的脱脂奶粉（用TBS配置）或者BSA的封闭液进行封闭，室温下2小时或者4℃封闭过夜；加入一抗：加入的比例与一抗的性质有关，一般为1：1000-1：3000，室温2小时或者4℃过夜；洗膜：TBST（TBS+0.1%Tween 20）洗5次，每次5min；加入二抗，稀释比例为1：5000，室温反应1-2小时；洗膜：TBST洗5次，每次5min；显色观察。

2、实验结果

实验结果显示在43kD左右可见一条清晰明显的IgG抗体蛋白质条带（图7）。结果显示，5-氟胞嘧啶染色方法可以很好的用于蛋白质检测操作中的Western blot 的后续操作，不影响蛋白质和转印膜的结合以及抗体对于目标蛋白的识别及结合。

Claims (11)

1.5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的用途。

2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白质包括蛋白质分子量标准物、质谱分析前端的目的蛋白或各种组织中提取的蛋白样品。

3.使用5-氟胞嘧啶对蛋白质染色的方法，其特征在于，在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶溶液。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，在聚丙烯酰胺凝胶聚合前加入5-氟胞嘧啶染色溶液，加入5-氟胞嘧啶溶液的体积为0.1%～5%。

5.使用5-氟胞嘧啶对蛋白质染色的方法，其特征在于，将5-氟胞嘧啶溶液加入聚丙烯酰胺凝胶组分丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液中。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，5-氟胞嘧啶溶液与聚丙烯酰胺凝胶组分丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液混合的体积优选比为1:50～1:500。

7.使用5-氟胞嘧啶对蛋白质染色的方法，其特征在于，将5-氟胞嘧啶溶液与蛋白质样品混合。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，5-氟胞嘧啶溶液与蛋白质样品混合的体积优选比为1:5～1:20。

9.使用5-氟胞嘧啶对蛋白质染色的方法，其特征在于，电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶放入5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶放入1.5g/100mL的5-氟胞嘧啶溶液中浸泡染色。

11.一种检测蛋白质的方法，包括如下步骤：

（a）按照权利要求3～10中任意一项所述的方法制备或处理聚丙烯酰胺凝胶或蛋白质；

（b）将蛋白样品上样到凝胶中；

（c）凝胶电泳分离蛋白质；

（d）用紫外线照射凝胶，检测蛋白质被染色后产生的荧光。