CN105675880B - 快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法 - Google Patents

快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其包括以下步骤：(1)使用凝胶将从样品中提取的总蛋白质进行梯度分离；(2)将已梯度分离的总蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；(3)将印迹有所述总蛋白质的PVDF膜浸泡在100％甲醇中；(4)干燥经100％甲醇处理的所述PVDF膜；(5)对干燥的PVDF膜中的目标蛋白质进行显色检测。本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法提高低丰度蛋白质的检测效率，提供了更实用、更灵敏、更快速的检测手段。

Description

快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质检测方法，尤其涉及一种无封闭的蛋白质印迹法，适用于快速检测低丰度蛋白质。
背景技术
蛋白质印迹(western blot，简称WB)又称免疫印迹(immunoblotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，已成为当前分析蛋白质的常用分子生物学技术。
在蛋白质印迹过程中，经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过从PAGE胶转移到膜上固定，为了避免测试试剂的特异性抗体与膜发生非特异性结合，需要对膜上的潜在结合位点进行封闭处理；后续进行Western Blot的检测和显色。
蛋白质印迹常规流程：蛋白提取与样品制备——SDS-PAGE电泳——转膜——封闭——抗体杂交——底物染色。具体包括以下步骤：
1.提取样本总蛋白，并浓缩纯化，用超微量核酸蛋白浓度仪器测定样品提取液蛋白浓度。
2.按样本总蛋白梯度20mg进行上样，变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白。
3.目标蛋白质转移到PVDF膜。按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层。30mA恒流条件下，4℃转移过夜。
4.为了避免测试试剂的特异性抗体与膜发生非特异性结合，需要对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。加入封闭液后，一般在室温或者37℃在摇床上缓慢震荡1-2h，特殊情况在4℃过夜。
5.封闭完成后要洗膜，去除膜上未结合的封闭试剂。常规的洗涤液为TBST，洗3次，每次15分钟。
6.抗体孵育。膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。用TBST洗涤3次，每次15分钟。封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5小时，抗原抗体结合，用TBST洗涤3次，每次15分钟。再加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。用TBST洗涤3次，每次15分钟。
7.压片显影定影后观察。
每种动物细胞中所含的蛋白质一般占到7％--10％左右，谷类一般含蛋白质6％-10％，薯类含蛋白质2％-3％。而在花生组织中蛋白质含量虽然有15％左右，但杂质多，如色素，酚类和糖类多，影响蛋白质的提取。进一步地，植物蛋白质与动物蛋白质比较，成分有所不同，如水稻蛋白缺乏赖氨酸，大豆蛋白缺乏色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。因此，一般情况下，要分析的植物目标蛋白质在植物总蛋白质比例较低，采用常规的蛋白质印迹法进行检测常常效果差，蛋白曝光显影弱或者不出现显影，灵敏度低。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种更实用、更灵敏的针对低丰度蛋白质的蛋白质印迹法。
为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其包括以下步骤：
(1)使用凝胶将从样品中提取的总蛋白质进行梯度分离；
(2)将已梯度分离的总蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；
(3)将印迹有所述总蛋白质的PVDF膜浸泡在100％甲醇中；
(4)干燥经100％甲醇处理的所述PVDF膜；
(5)对干燥的PVDF膜中的目标蛋白质进行显色检测。
具体地，所述100％甲醇浸泡PVDF膜的时间为8～15s。
进一步地，所述经100％甲醇处理的PVDF膜的干燥方法为自然晾干。
优选地，所述晾干时间为10～15min。
更优选地，所述PVDF膜放置在滤纸上进行晾干。
进一步地，所述步骤(5)中对目标蛋白质的显色检测步骤包括：
(5.1)进行目标蛋白质与该目标蛋白质的抗体之间的免疫性结合；
(5.2)进行所述目标蛋白质的抗体与显色标记物之间的免疫性结合；
(5.3)进行显色反应并且展示显色结果。
进一步地，所述步骤(5.1)还包括将未结合的所述目标蛋白质的抗体进行漂洗的步骤：将结合有所述目标蛋白质的抗体的PVDF膜置于含有TBST的洗涤液中漂洗两次，每次8～15s。
优选地，所述步骤(5.2)还包括将未结合的所述显色标记物进行漂洗的步骤：将结合有所述显色标记物的PVDF膜置于含有TBST的洗涤液中漂洗两次，每次8～15s。
进一步优选地，所述样品来源于植物或动物。
与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
(1)本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法中，利用PVDF膜进行常规转膜步骤之后，用100％甲醇浸泡该PVDF膜，以增强该PVDF膜对已附着在膜上的蛋白质分子的吸附能力，避免低丰度的蛋白分子在操作过程中弥散或者逃逸；
(2)本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法中，让固着有蛋白质的PVDF膜干燥，以恢复PVDF膜的疏水性，也可以避免在抗体孵育过程中发生非特异性结合，以此替代常规的用脱脂奶粉进行非特异性位点的封闭步骤；
(3)本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法中，甲醇是公知的溶剂，也易于挥发，用甲醇处理PVDF膜不仅可以洗去膜上的其他溶液，也辅助该膜迅速干燥；
(4)本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法中，由于对PVDF膜进行了改进性的处理，对应地对抗体的漂洗过程也需要进行优化，具体是只需要进行短时间的漂洗，即可达到实验要求，大大缩短了检测时间；
(5)本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，减少了长时间封闭和漂洗过程中对目标蛋白质的损失，极大地提高了低丰度的目标蛋白质在PVDF膜的固着量，并且，避免了一抗孵育过程中脱脂奶粉和目标蛋白质之间发生对抗体的吸附竞争，由此对目标蛋白质的显色也更明显、更清晰；
(6)本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，没有引入专用设备和专用试剂，易于实现，并且简化了实验步骤，缩短了实验时间，因此对推动蛋白质印迹法在蛋白质研究中的作用具有重要意义。
附图说明
图1为用常规的蛋白质印迹法对提取的花生叶片总蛋白进行检测，其中，目标蛋白质AhNCED蛋白的曝光显影弱。
图2为用常规的蛋白质印迹法中的电泳和转膜对提取的花生叶片蛋白进行印迹，之后将PVDF膜用100％甲醇处理，后续进行常规的抗体孵育步骤和显色，其中，目标蛋白质AhNCED蛋白曝光显影明显可见。
图3为用发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法对提取的花生叶片蛋白进行检测，其中，目标蛋白质AhNCED蛋白曝光显影突出。
图4为本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法的流程示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
以下以花生叶片低丰度9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(简称AhNCED蛋白)的检测为例对本发明进行详细介绍。
对比例
常规的蛋白质印迹法检测AhNCED蛋白
(1)取约2g花生叶片放在预冷的研钵中用液氮研磨至白绿色粉末，转移至离心管中，加入蛋白提取液5mL，在4℃的条件下以12000rpm离心10min，取上清液后再于4℃条件下12000rpm离心5min。使用10kd孔径的超滤管(约为目标蛋白质大小的1/3)对目标蛋白质进行截留，在4℃的条件下4000rpm离心约40min，最后获得的蛋白液量约500ul。
(2)取所述蛋白液100ul并且加入400ul甲醇，然后分别加100ul氯仿和300ul的双蒸水，剧烈混合(上下摇动20s)之后在4℃条件下放置30min，之后，在4℃的条件下以12000rpm离心15min，取中间的蛋白沉淀。将所述取出的蛋白沉淀进行瞬时离心以去除多余的液体，然后加入100ul的TBS，25ul的5倍浓缩(5×)的蛋白buffer，高温变性10min。取变性后的上清液测定蛋白质浓度。
(3)通过变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳对样品蛋白进行梯度分离，上样量为2mg总蛋白；下一步的转膜步骤中，使用PVDF膜，转膜条件为30mA恒流，4℃条件下过夜。
(4)对转移了蛋白质的PVDF膜进行封闭，具体方法是让所述PVDF膜浸泡在封闭液中，在37℃的条件下置于摇床上缓慢震荡1-2h。封闭完毕用TBST洗涤液洗涤3次，每次15分钟。
(5)加入一抗(即目标蛋白质的抗体)室温孵育1.5h，采用TBST洗涤液洗涤3次，每次15min.加入HRP标记的二抗(即显色标记物)以结合一抗，室温孵育1h，用TBST洗涤3次，每次15min。
(6)压片后显影定影。本领域技术人员知晓，蛋白质印迹结果的显色方法主要有四种，包括：放射自显影、底物化学发光ECL、底物荧光ECF和底物DAB显色。根据目标蛋白质的性质和所选用的显色体系，可以合理选用合适的显色方法。
显影结果如图1所示，通过检测可见原核表达目标蛋白，但是，花生叶片AhNCED蛋白显影非常弱，以致无法观察。
实施例一
改进的蛋白质印迹法检测AhNCED蛋白
步骤(1)～(3)同上述的对比例。
(4)对转移了蛋白质的PVDF膜进行甲醇处理，具体方法是让所述PVDF膜浸泡在100％甲醇中15s，然后让经甲醇处理的PVDF膜进行自然晾干。晾干的目的有两个：挥发甲醇，以消除甲醇对后续实验步骤的影响；干燥PVDF膜，恢复PVDF膜的疏水特性。为了不影响固着在所述PVDF膜上的蛋白质分子，该PVDF膜优选放在滤纸上进行自然晾干。
步骤(5)和(6)同上述的对比例。
显影结果如图2所示，花生叶片AhNCED蛋白曝光显影可见，但表达强度不如原核表达蛋白，经分析是TBST洗涤时间过长造成的。
实施例二
改进的蛋白质印迹法检测AhNCED蛋白
步骤(1)～(4)同上述的实施例一。
(5)加入一抗(即目标蛋白质的抗体)室温孵育1.5h，采用TBST洗涤液漂洗2次，每次10s。加入HRP标记的二抗(即显色标记物)以结合一抗，室温孵育1小时，TBST洗涤液漂洗2次，每次10s。这里所述的“漂洗”的实现方式区别于前述的“洗涤”，具体为用镊子夹持所述PVDF膜的一角，在所述TBST洗涤液中轻柔地、小幅度地晃动。
(6)压片后显影定影。该步骤同上述对比例的步骤(6)。
显影结果如图3所示，花生叶片AhNCED蛋白曝光显影明显，与原核表达蛋白强度相当，表明实验过程达到了预期的实验效果。
总结上述实施例，并且参考图4，本发明的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法包括以下步骤：
S1：从样品中提取总蛋白质；
S2：使用SDS-PAGE将所述样品的总蛋白质进行梯度分离；
S3：将已梯度分离的总蛋白质从SDS-PAGE印迹到PVDF膜上，该过程即理解为本领域的通用术语“转膜”；
S4：将印迹有所述总蛋白质的PVDF膜浸泡在100％甲醇中；
S5：晾干经100％甲醇处理的所述PVDF膜；
S6：对晾干的PVDF膜中的目标蛋白质进行显色检测，具体是使用上述的一抗和二抗分别进行免疫性杂交，最后进行显色反应并且展示显色结果。其中，对所述一抗和二抗的洗涤步骤分别为用TBST洗涤液漂洗2次，每次8～15s。
综上所述，本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法提高低丰度蛋白质的检测效率，提供了更实用、更灵敏、更快速的检测手段。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)使用凝胶将从样品中提取的总蛋白质进行梯度分离；
(2)将已梯度分离的总蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；
(3)将印迹有所述总蛋白质的PVDF膜浸泡在100％甲醇中，浸泡时间为8～15s；
(4)干燥经100％甲醇处理的所述PVDF膜；
(5)对干燥的PVDF膜中的目标蛋白质进行显色检测。
2.如权利要求1所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于：所述经100％甲醇处理的PVDF膜的干燥方法为自然晾干。
3.如权利要求2所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于：所述晾干时间为10～15mi n。
4.如权利要求2所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于：所述PVDF膜放置在滤纸上进行晾干。
5.如权利要求1所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于，所述对目标蛋白质的显色检测步骤包括：
(5.1)进行目标蛋白质与该目标蛋白质的抗体之间的免疫性结合；
(5.2)进行所述目标蛋白质的抗体与显色标记物之间的免疫性结合；
(5.3)进行显色反应并且展示显色结果。
6.如权利要求5所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于，所述步骤(5.1)还包括将未结合的所述目标蛋白质的抗体进行漂洗的步骤：将结合有所述目标蛋白质的抗体的PVDF膜置于含有TBST的洗涤液中漂洗两次，每次8～15s。
7.如权利要求5所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于，所述步骤(5.2)还包括将未结合的所述显色标记物进行漂洗的步骤：将结合有所述显色标记物的PVDF膜置于含有TBST的洗涤液中漂洗两次，每次8～15s。
8.如权利要求1所述的快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其特征在于：所述样品来源于植物或动物。
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