CN105585627A - 一种抗原多肽及由其构建抗gbm肾炎模型的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Goodpasture病的一种致病性抗原多肽P14及其在构建抗GBM肾炎模型的应用，涉及生物医药和医学动物模型领域。本发明中的致病性抗原多肽为人类Goodpasture抗原上的致病性抗原表位，其氨基酸序列为TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF；该致病性抗原多肽可用来构建抗GBM肾炎的动物模型。本发明构建的动物模型高度模拟人类抗GBM肾炎，抗原制备简单，取材廉价，仅需单次免疫，成功率高、重复性好，可成为研究自身免疫性疾病的发病机制和干预治疗的很好的工具。

Description

一种抗原多肽及由其构建抗GBM肾炎模型的应用
技术领域
本发明涉及一种致病新抗原多肽及其用途，尤其涉及Goodpasture病的一种致病性抗原多肽P14及其在构建抗GBM肾炎模型的应用。
背景技术
抗肾小球基底膜(glomerularbasementdisease，GBM)病，是自身免疫功能紊乱的一组疾病。该病的特点是循环产生抗GBM抗体，在肺脏和/或肾脏沉积。累及肾脏形成新月体肾炎，一方面表现为肾小球囊壁层上皮细胞显著增生，堆积成层，在毛细血管丛周围形成的新月形小体，新月形小体主要由增生的壁层上皮细胞和渗出的单核细胞构成，还可有中性粒细胞和淋巴细胞浸润，以上成分附着于球囊壁层，在毛细血管球外侧呈新月状或环状结构分布；另一方面累及肺脏表现为弥漫性肺泡出血，肺和肾同时受累，称为Goodpasture病。该病进展迅速，预后极差。抗GBM抗体识别的靶抗原是基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1，简称为α3(IV)NC1，即Goodpasture抗原。该抗原由234个氨基酸组成，是具有复杂空间结构的蛋白质分子，其中精确的诱导疾病发生的线性抗原决定簇并不明确。
既往学者发现，Goodpasture抗原上的线性肽段可以诱发实验动物产生抗GBM肾炎模型。ChenL等人发现大鼠α3NC1上第14-26位的氨基酸序列SQTTANPSCPEGT，ReynoldsJ等人发现大鼠α3NC1上第10-23位的氨基酸序列FTRHSQTTANPSCP，均可以诱发WKY大鼠出现新月体肾炎。RobertsonJ等人发现小鼠α3NC1上位于第14-26位的氨基酸序列SQTTANPSCPEGT可以诱发WKY大鼠出现新月体肾炎。OoiJD等人在转基因小鼠上，发现小鼠α3NC1上位于第132-151位的氨基酸序列CPQDWVSLWKGFSFIMFTSA具有致肾炎作用。这些研究为寻找抗GBM病的起始的致病性线性抗原表位提供了重要证据。但是这些序列均来自动物，并不能真正反映人类抗GBM病患者α3NC1上的致病性抗原表位。LuoAM等人曾尝试用人类α3NC1上位于第78-93位的氨基酸序列RNDYDYWLSIPALMP和位于第153-168位的氨基酸序列SEGTGQALASPGSCLE免疫WKY大鼠，仅有部分大鼠发生轻度的肾小球肾炎，不能产生典型的新月体肾炎，因此并非Goodpasture抗原上理想的的致病性抗原表位。
各种已报道的Goodpasture抗原的线性抗原多肽列举如下：
截至目前，国际上尚没有利用人类Goodpasture抗原上的线性肽段诱导实验动物发生抗GBM肾炎的成功方案。
发明内容
为了解决现有技术中已有的人源抗原序列只能引起大鼠轻度的肾小球肾炎而不能诱导典型的Goodpasture病的症状，并且国内外也缺乏人源抗原的高度模拟人类抗GBM肾炎的动物模型等问题，本发明提供一种基于Goodpasture病的致病性抗原多肽及其在构建抗GBM肾炎模型的应用。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种抗原多肽P14，具有Goodpasture病的致病性，其致病活性位点氨基酸包括人类基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1的第136位色氨酸W、第137位异亮氨酸I、第139位亮氨酸L和第140位色氨酸W。
其中，所述抗原多肽P14的氨基酸序列为TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF，包括如上所述的位于人类基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1的致病活性位点氨基酸。特别是，P14所示的抗原多肽来源于人类基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1(α3(IV)NC1)的氨基酸序列。
特别是，P14所示的抗原多肽可以诱发实验动物产生与人类抗GBM病表现一致的新月体性肾小球肾炎。
为实现本发明的目的，本发明另一方面提供Goodpasture病的一种抗原多肽在构建抗GBM肾炎模型的用途。
为实现本发明的目的，本发明再一方面提供一种抗GBM肾炎模型从而研究Goodpasture病的发病机制。
为实现本发明的目的，本发明再一方面提供一种抗GBM肾炎模型的构建方法，其特征在于，包括：
1)将合成并纯化后的Goodpasture病的抗原多肽与完全弗氏佐剂等体积混合，使其充分乳化，制得该抗原多肽的免疫原；
2)将制得的所述免疫原免疫动物，获得抗GBM肾炎初级模型；
3)通过对获得的抗GBM肾炎初级模型进行鉴定，将具有Goodpasture病的病理症状的抗GBM肾炎初级模型选作所述抗GBM肾炎模型。
尤其是，所述合成并纯化后的Goodpasture病的抗原多肽的活性片段P14，具有Goodpasture病的致病性，其致病活性位点氨基酸包括人类基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1的第136位色氨酸W、第137位异亮氨酸I、第139位亮氨酸L和第140位色氨酸W。
优选的，所述抗原多肽P14的氨基酸序列为TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF。
特别是，制备模型所选用的动物为大鼠。
尤其是，在构建抗GBM肾炎模型中，在将制得的抗原多肽免疫原免疫动物时采用免疫方式是腹腔注射、肌肉注射和皮下注射中的一种或多种。
优选地，在构建抗GBM肾炎模型中，在将制得的抗原多肽免疫原免疫动物时采用免疫方式是腹腔注射。
特别是，在构建抗GBM肾炎模型中，将制得的抗原多肽免疫原免疫大鼠时只需采用单次免疫。
特别是，所述将制得的抗原多肽免疫原免疫大鼠的免疫剂量为0.67-2μg/g。
优选地，所述将制得的抗原多肽免疫原免疫大鼠的免疫剂量为1.3ug/g。
尤其是，在抗原多肽免疫原免疫大鼠后第4至5周内即出现Goodpasture病的临床和病理症状，得到抗GBM肾炎初级模型。
本发明的优点：
1、本发明是首次利用人类Goodpasture抗原的线性肽段成功诱导实验动物发生抗GBM肾炎，该动物模型出现严重的蛋白尿、水肿、肾功能受损，病理切片发现大量的新月体形成，这些临床表现和发病机制都与人类抗GBM病高度一致，可以作为优选的肾炎机制实验研究的工具。
2、本发明在构建动物模型中还发现大鼠体内不仅存在识别抗原多肽的抗体，也存在识别人类α3NC1的抗体，肾脏洗脱液中还存在人类α1-5NC1的抗体，证明免疫过程中发生了分子内和分子间的抗原表位扩展，更加有利于肾炎机制实验的研究。
3、本发明构建的动物模型高度模拟人类抗GBM肾炎，抗原制备简单，取材廉价，仅需单次免疫，成功率高、重复性好，可成为研究自身免疫性疾病的发病机制和干预治疗的很好的工具。
4.本发明发现人Goodpasture抗原上第136位的色氨酸(W)、第137位的异亮氨酸(I)、第139位的亮氨酸(L)和第140位的色氨酸(W)是P14上的关键氨基酸，不仅为抗GBM病病因学的研究打下了基础，而且根据致病位点的氨基酸性质将可能开发出针对抗GBM肾炎的特异性的预防和治疗手段。
附图说明
图1是本发明实施例1中抗原多肽P14的HPLC纯化结果图；
图2是本发明实施例1中抗原多肽P14的质谱分析结果图；
图3是本发明实施例2中免疫原免疫大鼠后的血肌酐检测结果图，A图为血肌酐浓度水平与时间关系的折线图，B图是血肌酐浓度水平的散点分布图；
图4是本发明实施例2中免疫原免疫大鼠后的血尿素氮检测结果图，A图为血尿素氮浓度水平与时间关系的折线图，B图是尿素氮浓度水平的散点分布图；血浆生化检测和尿蛋白检测结果图；
图5是本发明实施例2中免疫原免疫大鼠后的尿蛋白水平检测结果图，A图为尿蛋白浓度水平与时间关系的折线图，B图是尿蛋白浓度水平的散点分布图；
图6是本发明实施例3中免疫原免疫大鼠后光镜下肾脏的病理检测结果图，其中A图是阳性对照组，B图是P14处理组，C图是阴性对照组，D图是阳性对照、P14处理组和阴性对照组新月体比例的比较统计图；
图7是本发明实施例3中免疫原免疫大鼠后荧光显微镜下肾脏组织上IgG的沉积检测结果图，其中A图是阳性对照图，B图是P14处理组，C图是阴性对照组；
图8是本发明实施例3中在电镜下观察处理组新月体形成后的结果图，箭头所指方向为新月体；
图9是本发明实施例4中在免疫原免疫大鼠后循环中的抗体检测结果图。其中，图A为P14组大鼠循环中识别P14以及α1-α5的抗体检测结果图；图B为P14抗体和α3抗体之间的交叉抑制实验结果图；图C为P14组大鼠肾脏洗脱液中识别P14以及α1-α5的抗体检测实验结果图。
图10是P14上的氨基酸进行逐一替换后，肽段的致病作用。A：尿蛋白；B：血肌酐；C：血尿素氮；D：肾脏形成新月体的肾小球百分比。红色线是根据正常对照组大鼠得到的cut-off值
图11是大鼠循环抗体对替换后免疫肽段及α3(IV)NC1的识别。A：用替换掉第136位色氨酸(W)的P14肽段免疫大鼠，可以产生针对该肽段的抗体但没有抗α3(IV)NC1的抗体；B：用替换掉第137位异亮氨酸(I)的P14肽段免疫大鼠，可以产生针对该肽段的抗体但没有抗α3(IV)NC1的抗体；C：用替换掉第139位的亮氨酸(L)的P14肽段免疫大鼠，可以产生针对该肽段的抗体但没有抗α3(IV)NC1的抗体；D：用替换掉第140位的色氨酸(W)的P14肽段免疫大鼠，可以产生针对该肽段的抗体但没有抗α3(IV)NC1的抗体；E：用替换掉第143位苯丙氨酸(F)的P14肽段分别免疫大鼠，没有可以产生针对该肽段及α3(IV)NC1的抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明涉及包含免疫学有效量的所述抗原肽的组合物，正如本领域技术人员所熟知的，抗原肽的免疫学有效量通常为每剂每千克体重2-5毫克；但是正如免疫和治疗领域所熟知的，给药剂量也可根据免疫动物的年龄、健康状况和个体反应等进一步调整本发明抗原肽可以和药学上可接受的载体如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等制成疫苗等药物形式，而且本发明中的一些实验过程，如组织玻片的制备、冰冻切片和电镜切片的制备以及抗体ELISA实验等均是本领域技术人员所熟知的常规实验方法。
实施例1抗GBM肾炎模型的构建
实验动物与材料：
WKY大鼠：18只雌性大鼠、4-6周龄，购买于北京维通利华公司，SPF级饲养，恒温恒湿，每天照明12小时；
PBS购于吉诺生物医药技术有限公司，型号为GNM20012。
1、抗原多肽P14的构建
抗原多肽P14的氨基酸序列为TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF，由北京中科亚光生物科技有限公司合成，得到抗原多肽P14。
抗原多肽序列P14的HPLC纯化结果图和质谱分析图见图1、图2，如图所示，合成并纯化后的P14的纯度达到要求，序列正确。
2、牛α(IV)NC1抗原多肽的制备
2.1肾小球的处理
购买新鲜小牛肾脏，剥离肾脏脂肪组织及被膜，将肾皮质切下，切成1mm见方的小块，用平底小瓶单方向挤压肾皮质组织分别通过50目、80目和150目的筛网，同时用0.01MPBS含0.02％叠氮钠(PBS-NaN3)冲洗筛网，从而将组织破碎后分离出来肾小球，得到肾小球-PBS-NaN3混悬液；将肾小球-PBS-NaN3混悬液进行离心，离心的条件设置为：离心力为1700g，温度为4℃，离心时间为5min；离心完毕后，弃上清而收集沉淀；然后采用PBS-NaN3缓冲液冲洗沉淀2次并再次离心，离心条件与前相同，最后得到冲洗干净后的肾小球沉淀；然后将分离出的肾小球全部加入到5nMTris-HCL缓冲液中充分混匀，最终得到肾小球-Tris-HCL-NaN3混悬液，4℃静置1h，备用。
其中，所述Tris-HCL缓冲液中还包含蛋白酶抑制剂及0.02％的NaN3。
对得到的肾小球-Tris-HCL-NaN3进行验证，观察肾小管是否达到比例要求，具体是：将混悬液滴于玻片上，在显微镜下观察肾小球-Tris-HCL-NaN3混悬液，并计算分离出的肾小球分散在5nMTris-HCL缓冲液中的比例，当肾小管所占的比例小于5％即为达到要求。
2.2GBM粗抗原的制备
按照1g沉淀物中加入2mg胶原酶的比例加入胶原酶，将步骤2.1所得到的沉淀物溶解在胶原酶中，37℃慢速磁力搅拌20小时；待沉淀物溶解充分之后在60℃水浴10min，用于灭活胶原酶；再将其进行离心并弃沉淀，得到的上清即为胶原酶消化后的可溶的肾小球基底膜粗抗原，其中，离心条件为：离心力为6500g，温度为4℃，离心时间为30min。最后测定得到的可溶的肾小球基底膜粗抗原的OD280nm和OD260nm值，并根据粗抗原的OD280nm和OD260nm值计算所得到的GBM粗抗原的量。
2.3牛GBM抗原α(IV)NC1的提纯
2.3.1GBM粗抗原通过超滤去除<10KD的分子，并经50mMTris-HCL(PH＝7.5)透析过夜。使用阴离子交换树脂ResourceQ在FPLC仪器上分离纯化粗抗原，其中，ResourceQHR5/5柱体积为1ml，上样缓冲液(A液)为50mMTris-HCl，洗脱缓冲液为(B液)50mMTris-HCl加1MNaCl。先用5mlA液冲洗层析柱，上样量为10ml，设置流速为1ml/min。用10mlA液洗去未结合蛋白，为穿过峰，经过20ml从0％B液到达100％B液，再用4ml100％B液清洗层析柱，最后用5mlA液对层析柱进行再平衡，收集得到的穿过峰即为提纯后的α(IV)NC1。
3、大鼠抗GBM肾炎模型的构建
将18只雌性WKY大鼠适应性饲养1～2周后，随机平均分为3组，将其中的一组免疫P14，用于构建大鼠抗GBM肾炎模型，作为处理组。另外两组分别作为免疫纯化的牛α(IV)NC1的阳性对照组，和免疫PBS的阴性对照组，用于鉴定该模型是否建立成功。具体步骤如下：
3.1免疫原的制备
将上述步骤得到的纯化后的P14多肽、以及牛α(IV)NC1和PBS(购自于吉诺生物医药技术有限公司的GNM20012产品)分别与弗氏完全佐剂等体积混合，使其充分乳化，制得P14多肽免疫原、牛α(IV)NC1免疫原和PBS阴性样品。
3.2动物免疫
将制得的P14多肽免疫原、α(IV)NC1免疫原、PBS阴性样品分别对处理组、阳性对照组和阴性对照组的大鼠进行腹腔注射，单次免疫，免疫剂量为1.3ug/g，得到大鼠抗GBM肾炎模型以及阳性对照大鼠和阴性对照大鼠。
实施例2肾脏损伤的评估
1血肌酐水平及血尿素氮水平的检测
在大鼠免疫前的一周及免疫后的六周，每周对大鼠抗GBM肾炎模型、阳性对照大鼠和阴性对照大鼠进行一次眦静脉取血，将每次取得的血液样本分别进行离心处理以便获得大鼠血清，其中，离心离心力为2000r/min，离心时间为15min。采用常规的碱性苦味酸比色法检测大鼠血清中血肌酐水平，采用常规的脲酶法检测血尿素氮水平，均在北京大学第一医院检验科的自动生化仪上完成。根据检测结果做出血肌酐水平标准图，如图3所示，和血尿素氮水平标准图，如图4所示。
根据图3中所示的血肌酐水平的折线图A和散点分布图B可知，以及根据图4所示的血尿素氮水平折线图A和散点分布图B可知，阳性对照组和处理组P14血清中肌酐和尿素氮的浓度随时间的推移，浓度逐渐增大，在第7周时达到顶峰，而阴性对照组血清中肌酐和尿素氮的浓度变化不明显，并且随着时间的推移逐渐增高。表明P14处理组大鼠肾功能出现了与阳性对照组大鼠一样的损伤，并且随着时间推移逐渐加重，是一个进行性加重的病程，跟人的GBM病表现一样，可见，被P14免疫后的大鼠出现了与人类抗GBM病表现一样的由肾功能损伤引起的肌酐和尿素氮的浓度增加的症状。
2、血浆尿蛋白的检测
在大鼠免疫前的一周及免疫后的六周，每周对大鼠抗GBM肾炎模型、阳性对照大鼠和阴性对照大鼠采集一次代谢笼留取的24h尿液，并记录尿量，记录结果如表1所示。用磺基水杨酸进行尿蛋白定性检测，其操作步骤如下：首先，配置20％的磺基水杨酸试剂，即称取磺基水杨酸20g，加水补至100ml，再取一支试管，向其中加入澄清尿液2-3ml，再滴加磺基水杨酸试剂0.1ml，立即轻轻摇匀，1分钟内观察结果，并记录，记录结果如表2所示，清晰透明则标记为阴性(-)；黑色背景下仅见轻度混浊标记为微量(±)；明显白雾柱状混浊，无颗粒则标记为弱阳性(+)；呈明显混浊并出现颗粒标记为阳性(++)，明显絮状浑浊(+++)，大量絮状沉淀，且有大凝块(++++)。尿液中总蛋白的定量测定采用常规的双缩脲法进行，在北京大学第一医院检验科完成，检测结果如图5所示。
表1免疫前后的尿量统计
第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周 第七周
P14 4.3ml 5.9ml 6.9ml 8.2ml 9.3ml 8.3ml 7.2ml
阳性对照 3.1ml 3.2ml 4.0ml 5.1ml 3.3ml 7.1ml 10.9ml
阴性对照 3.6ml 7.9ml 8.2ml 6.8ml 7.5ml 7.5ml 8.6ml
表2尿蛋白定性观察结果
第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周 第七周
P14 - - +++～++++ ++++ ++++ ++++ ++++
阳性对照 - + +++～++++ ++++ ++++ ++++ ++++
阴性对照 - - - - - - -
根据表1统计的尿量数据可知，处理组大鼠和阳性对照组以及阴性对照组每周24小时尿量无显著差异。
根据表2的尿蛋白定性观察结果可知，P14诱导的抗GBM病肾炎模型出现了和阳性对照一样严重的蛋白尿。结合图5所示的尿蛋白水平的折线图A和散点分布图B可知，阳性对照组和处理组P14尿液中尿蛋白水平随时间的推移，逐渐增大，在第7周时达到顶峰，而阴性对照组尿液中尿蛋白水平变化不明显，说明P14诱导产生的抗GBM肾炎大鼠的肾功能受损是进行性加重的进程，跟人抗GBM病的疾病进程一样。
实施例3大鼠肾脏的病理检测
1光镜观察大鼠肾脏切片
分别向实施例1构建的免疫7周后的抗GBM肾炎模型、阳性对照大鼠和阴性对照大鼠注射5％的巴比妥那进行麻醉，分离大鼠体内的肾脏，并除去肾脏上的被膜，在肾脏上切取一小块肾皮质组织，进行肾脏石蜡标本制作，其操作过程如下：
将切下的肾皮质组织立即浸泡在中性福尔马林溶液中，使其迅速凝固；再将其依次在70％，80％，90％，95％，100％浓度的酒精中梯度脱水，把得到的脱水后的肾皮质组织浸入到二甲苯溶液中将酒精置换出来，得到组织透明的肾皮质组织，最后浸入熔点为60-62℃的石蜡中进行固定，固定后，再将其用石蜡包埋成规整的长方形块状物体，并置于切片机上切成2-3μm的切片，得到大鼠肾脏切片。
为了便于观察大鼠肾脏的病理特征，对大鼠肾脏进行染色处理，具体操作为：将大鼠肾脏切片置于二甲苯中使石蜡溶解，并置于100％，95％，90％，80％，70％的浓度梯度递减的酒精中用于去除组织中的二甲苯；然后采用1％过碘酸水溶液浸泡切片10min，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基，再用蒸馏水洗去过碘酸，并采用雪夫试剂与其反应15min，使醛基与雪夫试剂结合，形成紫红色产物，随后用流水冲洗15min，洗去残余的雪夫试剂，使用苏木素复染肾脏组织的细胞核5min后，浸入到1％的盐酸酒精中洗去浮色后，再用1％的氨水酒精返蓝；随后使用梯度依次递增的酒精中脱水，依次为70％，80％，90％，95％，100％；再将切片浸入二甲苯溶液将酒精置换出来，使组织透明；随后采用中性树胶封片，得到染色后的大鼠肾脏切片。
将染色后的切片置于光镜下观察，观察结果如图6所示，其中A图是阳性对照组，B图是P14处理组，C图是阴性对照组，D图是阳性对照、P14处理组和阴性对照组新月体比例的比较统计图。由A图可以明显看出阳性对照组大鼠肾脏肾小球内有新月体形成(如图中标示β所示)，新月体比例占全部肾小球比例的64.4％±32.5％(如图D所示)，还发生了间质炎症细胞浸润及小管萎缩，如图A中的标示α所示；图B的P14组大鼠肾脏也出现了大量的新月体(如图中标示β所示)，新月体比例占全部肾小球的比例为82.4％±24.5％(如图D所示)还发生了间质炎症细胞浸润及小管萎缩，如图A中的标示α所示。两组肾脏间质均有淋巴细胞和单核细胞的浸润伴灶状肾小管萎缩。而C图的阴性对照组大鼠肾脏无明显病理改变。表明免疫P14后构建的抗GBM肾炎大鼠出现典型的与抗GBM肾炎病人一样的新月体肾炎的病理改变。
2荧光检查大鼠肾脏上免疫球蛋白G(简称IgG)的沉积
2.1冰冻切片的制作
从本实施例的步骤1得到的除去被膜的肾脏上切下一块新鲜的肾皮质组织，立即冻入液氮冷冻。再将冷冻后的肾皮质组织置于按压式冷冻切片包埋剂中进行包埋得到肾皮质冰冻标本(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)，利用温度为-22℃的恒冷箱切片机将肾皮质冰冻标本切成厚度为5um的薄片，贴于阳离子防脱玻片(购买于北京中山金桥生物技术公司，货号：ZLI-9506)上，盖上盖玻片，制得肾皮质组织冰冻切片。冻存于-80℃保存。
2.2肾组织IgG沉积检测
取出冰冻切片，用预冷至4℃的丙酮中固定20min，并置于通风橱使丙酮挥发10min；再使用PBS将其冲洗3次，3min/次、37℃条件下于3％BSA中封闭30min；最后向其中加入FITC标记的羊抗大鼠IgG荧光抗体20μl，避光，在37℃温箱孵育30min，然后再使用PBS冲洗3次，3min/次；最后滴加1滴含有DAPI的封片剂(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)进行封片，避光保存，在荧光显微镜下检测肾组织上IgG的沉积情况，观察结果如图7所示，其中A图是阳性对照图，B图是P14处理组，C图是阴性对照组。
如图7所示的观察结果，可以明显看出，A图所示的阳性对照组GBM与B图所示的处理组P14中均具有绿色荧光并沿着GBM呈线条样沉积，而C图所示的阴性对照组却没有。表明P14诱导的抗GBM肾炎大鼠出现了和人抗GBM病一样的肾脏IgG沉积情况，发生了与人抗GBM病的病理症状一样的IgG沉积。
3电镜切片的制备与镜检
取新鲜肾皮质组织，组织体积约超过1mm3，迅速将其置于4％戊二醛中4℃固定2-4h，再用0.1％-0.2％的磷酸氢二钠溶液漂洗0.5-2h，防止其与锇起化学反应，影响固定效果，随后用1％锇酸固定液在4℃下固定1-2h，PH条件为7.3-7.4，固定完毕后，用含有1％锇酸的磷酸盐缓冲液漂洗20min，进行脱水，得到固定后的组织标本。将固定后的组织依次在50％、70％、80％、90％浓度的乙醇或者丙酮进行梯度脱水，每个梯度的脱水时间为10-15min，最后用100％乙醇或者丙酮脱水20-30min，重复两次，得到脱水后的组织标本。将完成脱水的组织标本转入由100％乙醇或丙酮与等分的包埋剂混合的浸透剂中浸泡30min至4h，之后再转入环氧树脂包埋剂中包埋组织，在60℃的烤箱中加温24-36h，形成包埋块。
用锋利的刀片将组织四周以45℃角削去多余的包埋剂，使之呈锥形，再将修好的组织块在超薄切片机上切成0.5-2微米的切片，捞至玻璃片上，用甲苯胺蓝染色，光镜下定位，使须观察的部位保证在超薄切片上。将定位满意的环氧树脂包埋块置于超薄切片机上，切成厚度为50-70nm的切片，捞在富有支持膜的铜网上，用醋酸铀和枸橼酸铅染色后置于投射电子显微镜下观察，观察结果如图8所示。
从图8所示的图中可以明显看出肾皮组织发生了基底膜的损伤和断裂，出现了新月体(如图中所示的箭头处)，表明P14诱导的大鼠抗GBM肾炎的病理表现与人类抗GBM病一致。
实施例4抗体的检测
大鼠免疫前一周及免疫后的每周分别对处理组，即大鼠GBM肾炎模型、阳性对照大鼠和阴性对照大鼠采用毛细管内眦静脉取血1-2ml，持续采血7周；采完血后对血液进行离心，转速为2000r/min，离心时间为15min，收集上层血清，-20℃冻存备用。
1重组纯化人α1(IV)NC1-α5(IV)NC1
1.1质粒转染细胞
用含250μg/ml10％胎牛血清的DMEM培养基(购买于Gibco，Invitrogen公司)培养HEK293细胞(由瑞典Lund大学赠送)，传代至直径为10cm的培养皿中，待细胞长至80％融合时，换新鲜，无抗生素的DMEM培养基，15min后转染。分别将人α1(IV)NC1-α5(IV)NC1的质粒(由瑞典Lund大学赠送)5μg溶于0.5mlDMEM培养基中，轻轻混匀。将转染脂质体(购买于Roche公司)20μl溶于0.5mlDMEM培养基中，轻轻混匀。将二者轻轻混合，室温孵育20min。均匀的滴加至有细胞的培养皿上。转染72h后换液为含有250μg/ml潮霉素(购买于Invitrogen公司)、250μg/mlG418(购买于Abcam公司)、10％胎牛血清的DMEM培养基。以后每3天换液或传代一次。待细胞长满20瓶后，换为含有50μg/mlAscorbat(购买与sigma公司)的DMEM培养基，此后每两天收集一次细胞上清，共2周，-20℃冻存。
1.2纯化人α1(IV)NC1-α5(IV)NC1
将表达蛋白的细胞培养液4℃溶解，按313g/L加入硫酸铵沉淀蛋白，4℃搅拌过夜。第二天13,000转/分离心20min，弃去上清。用上样缓冲液(包含NaH2PO4·2H2O1.56g，NaCl14.61g，咪唑0.68g，去离子水500ml)溶解沉淀。每200ml培养液产生的沉淀用约8ml上样缓冲液溶解。收集溶解蛋白后的液体，离心6,000转/分，过膜。使用镍柱亲和层析纯化蛋白，镍柱柱体积为1ml，洗脱缓冲液包含(NaH2PO4·2H2O1.56g，NaCl14.61g，咪唑17g，去离子水500ml)平衡5倍柱体积，上样10ml，上样缓冲液15倍柱体积洗去未结合蛋白，20％洗脱缓冲液洗去非特异结合。100％洗脱缓冲液10倍柱体积洗脱目的蛋白，100.01MPBS透析，用OD280nm/1.43计算蛋白浓度和ELISA检测抗原性后-20℃冻存。
2血清抗体的ELISA检测
用0.05mol/L、pH为7.6的PBST将实施例1制得的P14多肽稀释至10μmol/L，将α1(IV)NC1-α5(IV)NC1分别稀释至2μg/ml，包被一半酶标板(Nunc)(抗原包被孔)，另一半酶标板则仅用碳酸盐缓冲液包被(非抗原包被孔)，其中，稀释量为50μl/孔，温度为37℃，时间为60min；包被完后，将包被板拍干，用PBST洗板3次，其中，采用PBST洗涤时，每孔的加入量为300μl/L，每次洗涤时间各1min；随后，将待测血清用0.05mol/L的PBST分别按照1:100稀释，加入每组4孔中(包括两个抗原包被孔，2个非抗原包被孔)进行反应，其中，加入量为50μl/孔，温度为37℃，时间为30min；同样洗板3次，操作同前所述；用碱性磷酸酶标记的羊抗大鼠IgG以1:5000稀释，加入各孔，其中，加入量为50μl/孔，温度为37℃，时间为30min；同样洗板3次，操作如同前述；随后，加入碱性磷酸酶底物显色液，其中，加入量为50μl/孔，温度为37℃，时间为30min，最后待显色反应完毕后，使用酶标仪在405nm处读取合适OD值。测定结果如图9所示的A图。
由图9所示的A图可以看出，在注射免疫原后，血液循环中出现了针对P14的抗体，同时也有针对α3(IV)NC1的抗体，说明经P14免疫后得到的抗体发生了分子内的抗原表位的扩展。两种抗体的浓度在4到5周内达到最高峰，随后逐渐消减，而且α3(IV)NC1的抗体浓度要明显低于P14的抗体的浓度，此外，血液中没有检测到针对α1(IV)NC1、α2(IV)NC1、α4(IV)NC1和α5(IV)NC1的抗体。
3P14与α3抗体的交叉检测
采用0.05mol/L的PBST将实施例1制得的P14多肽稀释至10μmol/L，作为固相抗原包被酶标板，其中，稀释量为50μl/孔，温度为37℃，时间为60min；采用0.05mol/L的PBST稀释抗原α3(IV)NC1作为抑制抗原时，稀释后的原α3(IV)NC1抑制抗原浓度分别为0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml；采用0.05mol/L的PBST稀释抗原P14作为抑制抗原时，稀释后的抗原P14抑制抗原浓度分别为0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml；选取抗P14和抗α3(IV)NC1抗体均阳性的血清用0.05mol/L的PBST按1:100稀释；随后与上述稀释后的抑制抗原共孵育，孵育条件为：温度为37℃，时间为60min；随后，将孵育反应后的血清加入酶标板，与包被的固相抗原P14进行反应，加入量为50μl/孔，反应条件为：温度为37℃，时间为30min；反应完毕，采用0.05mol/L的PBST洗涤酶标板3次，每次洗涤时，加入PBST的量为300μl/L，洗涤时间每次各1min；随后，用碱性磷酸酶标记的羊抗大鼠IgG以1:5000稀释，加入洗涤后的酶标板的各反应孔，每孔的加入量为50μl/L，反应条件为：温度为37℃，时间为30min；然后，洗板三次，洗涤条件如前述；随后，加入碱性磷酸酶底物显色液，其中，加入量为50μl/L，显色反应条件为：37℃，30min；最后待显色反应完毕后，使用酶标仪在405nm处读取合适OD值。本实验中以包板的同种抗原为抑制物，作为抑制试验的阳性对照，并绘制抑制物在不同浓度时，抗体反应吸光度值的剂量曲线，测定结果如图9中的B图所示。
由图9B可以看出，抗P14的抗体不能被α3(IV)NC1所抑制，即抗α3(IV)NC1抗体与抗P14抗体之间不存在交叉反应，说明P14不仅诱导产生了针对自身的抗体，并且诱导产生了针对α3(IV)NC1的抗体，两者具有不同的抗原表位，表明P14诱导的抗体发生了分子内抗原表位的扩展。进一步说明P14诱导动物肾损伤后，可以导致更多抗原表位的暴露以及抗体的产生，使损伤进一步加重。这与抗GBM病患者的临床表现类似。
4肾脏洗脱液中抗体的检测
4.1肾脏抗体洗脱
取经免疫荧光显微镜下鉴定有IgG线样沉积的大鼠肾脏组织置于冰上，剪碎放入预冷的PBS溶液中，使用组织匀浆仪，仪器条件设置：调到小档，匀浆5min；在匀浆的过程中随后观察一直到看不到明显颗粒时关闭组织匀浆仪，从而得到捣碎均匀后的肾脏-PBS混浊液；随后将肾脏-PBS混浊液离心，离心条件设置为：离心力为2500g，温度为4℃，离心时间为10min；随后，采用冷PBS多次洗涤，每次洗涤之后进行离心，离心条件与上相同，洗涤直至上清透明为止，最后弃去上清，得到肾脏组织的沉淀物；将肾脏组织的沉淀物用5倍体积的甘氨酸溶液充分混悬，混悬震荡操作在摇床内进行，仪器条件设置为：温度为4℃，时间控制为2h；随后，对混悬形成的肾脏组织混悬液进行离心，离心条件设置为：离心力10000g，4℃离心30min；留上清，用pH值为7.6的Tris-HCl溶液滴定中和，透析过夜；然后进行离心操作，离心条件设置为：离心力10000g，温度为4℃，离心20min；最后取上清，得到肾脏的待测洗脱液分装后冻存于-80℃，备用。
4.2肾脏洗脱抗体鉴定
用0.05mol/L的PBST(PH＝7.6)稀释P14至10μmol/L，α1(IV)NC1-α5(IV)NC1稀释至2μg/ml，包被一半酶标板(Nunc)(抗原包被孔)，另一半酶标板则仅用碳酸盐缓冲液包被(非抗原包被孔)，加入量为50μl/孔，温度为37℃，包被时间为60min；包被完毕之后拍干，用0.05mol/L的PBST进行洗涤，每孔加入量300μl/L，洗板3次，每次各1min；随后，将待测洗脱液用PBST分别按照1:5稀释，加入每组4孔中(包括两个抗原包被孔，2个非抗原包被孔)，条件为：50μl/孔，温度为37℃，反应时间30min；反应完毕之后拍干，用0.05mol/L的PBST进行洗涤，每孔加入量300μl/L，洗板3次，每次各1min。随后，用碱性磷酸酶标记的羊抗大鼠IgG以1:5000稀释，加入各孔，加入量为50μl/L，温度为37℃，孵育时间30min；再次洗板3次，洗涤条件同前；随后，加入碱性磷酸酶底物显色液，每孔50μl/L显色条件为：温度为37℃，显色时间30min；显色完毕后，使用酶标仪在405nm处读取合适OD值，测定结果如图9所示。
由图9所示，从有IgG线样沉积的大鼠肾组织上洗脱下来的抗体对P14和α1(IV)NC1-α5(IV)NC1均有不同程度的识别，表明在抗原多肽P14免疫过程中发生了分子内或分子间的抗原表位扩展。表明P14诱导肾脏损伤后，可以导致更多抗原表位的暴露，进而产生更多的抗体，造成肾脏更严重的损伤。这与人类的抗GBM病的发病有着同样的机制。因为在抗GBM患者中，随着患者肾脏损伤的加重，患者循环中识别的抗体也从基底膜上的α3(IV)NC1和α5(IV)NC1链扩展到了基底膜上α1(IV)NC1-α5(IV)NC1五条链，同样存在抗原表位的扩展。由此可见P14诱导大鼠产生的抗GBM病模型与人类抗GBM病的发病有着同样的机制。
实施例5P14关键氨基酸鉴定
1P14线性肽段的设计和制备
为研究P14上的关键氨基酸基序，我们将P14上的22个氨基酸用丙氨酸(A)进行逐一替换。替换掉后，肽段序列如下：
上述肽段均有北京中科亚光生物技术有限公司合成，其中位于第141位的赖氨酸(K)被替换掉后，整个肽段疏水性太强，因此合成失败。
2用合成的肽段分别免疫WKY大鼠。免疫剂量、免疫方法同实施例1。定期收集血液尿液标本，免疫后7周处死收取肾脏组织制得肾脏石蜡切片、冰冻切片以及电镜切片。
3肾脏损伤以及肾脏病理的检测同实施例2和实施例3。检测结果发现将第136位的色氨酸(W)、第137位的异亮氨酸(I)、第139位的亮氨酸(L)、第140位的色氨酸(W)和第143位苯丙氨酸(F)替换后，P14的致病性消失。各组大鼠的尿蛋白、血肌酐、血尿素氮均在正常范围。各组大鼠肾脏病理表现未见异常损伤，没有新月体形成，未见IgG线条样沉积如图10所示。
4应用实施例4的方法检测大鼠循环抗体，检测结果发现将第136位的色氨酸(W)、第137位的异亮氨酸(I)、第139位的亮氨酸(L)和第140位的色氨酸(W)的肽段在免疫后第2周就可以诱发针对免疫肽段的抗体，第4或5周抗体滴度达到峰值，而替换掉第143位苯丙氨酸(F)的肽段免疫大鼠后，并没有产生针对免疫原的抗体如图11所示，这些大鼠均没有产生针对α3(IV)NC1的抗体。可见位于143位苯丙氨酸(F)影响了P14的免疫原性，或者由于其可溶性较差而使免疫的有效浓度过低。
根据上述检测结果可知，人Goodpasture抗原上第136位的色氨酸(W)、第137位的异亮氨酸(I)、第139位的亮氨酸(L)和第140位的色氨酸(W)是P14诱发EAG模型的关键氨基酸基序。在其他位置上被丙氨酸替换后依然可以诱导大鼠的抗GBM病模型。关键氨基酸基序的鉴定不仅为抗GBM病病因学的研究提供了基础，而且根据致病位点的氨基酸性质将可能开发出针对抗GBM肾炎的特异性的预防和治疗手段。

Claims (10)

1.一种抗原多肽P14，其特征在于，其具有Goodpasture病的致病性，其致病活性位点氨基酸包括人类基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1的第136位色氨酸W、第137位异亮氨酸I、第139位亮氨酸L和第140位色氨酸W。
2.一种抗原多肽P14，其特征在于，其氨基酸序列为TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF，包括如权利要求1所述的致病活性位点氨基酸。
3.根据权利要求1所述的Goodpasture病的抗原多肽，其特征在于，所示的抗原多肽P14来源于人类基底膜IV型胶原α3链的非胶原区1的氨基酸序列。
4.一种根据权利要求2所述的Goodpasture病的抗原多肽在构建抗GBM肾炎模型的用途。
5.一种利用权利要求3所述的抗GBM肾炎模型在研究Goodpasture病的发病机制的应用。
6.一种抗GBM肾炎模型的构建方法，其特征在于，包括：
1)将合成并纯化后的Goodpasture病的抗原多肽与完全弗氏佐剂等体积混合，使其充分乳化，制得该抗原多肽的免疫原；
2)将制得的所述免疫原对动物进行免疫，获得抗GBM肾炎初级模型；
3)通过对获得的抗GBM肾炎初级模型进行鉴定，将具有Goodpasture病的临床和病理症状的抗GBM肾炎初级模型选作所述抗GBM肾炎模型。
7.如权利要求5所述方法，所述合成并纯化后的Goodpasture病的抗原多肽的活性片段为P14(α3127-148)，序列是：TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF；其特征在于：第136位的色氨酸(W)、第137位的异亮氨酸(I)、第139位的亮氨酸(L)和第140位的色氨酸(W)是P14上的关键氨基酸。
8.根据权利要求5所述抗GBM肾炎模型的构建方法，其特征在于，在将制得的抗原多肽免疫原免疫动物时采用的免疫方式选自腹腔注射、肌肉注射和皮下注射中的一种或多种。
9.根据权利要求5所述抗GBM肾炎模型的构建方法，其特征在于，在将制得的抗原多肽免疫原对动物进行免疫时采用单次免疫或多次免疫。
10.根据权利要求5所述GBM肾炎模型的构建方法，其特征在于，在免疫后第4至5周内即出现Goodpasture病的临床和病理症状。
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