CN103910800A - 抗her2的多克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种抗HER2的多克隆抗体及其制备和应用，其中抗HER2的多克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。所述的抗HER2的多克隆抗体在制备用于诊断HER2过度表达产生的恶性肿瘤的试剂盒中的应用。本发明给HER2蛋白抗原检测提供一种高特异性、高灵敏度的优质的抗体。

Description

抗HER2的多克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是指一种抗HER2的多克隆抗体及其制备和应用。

背景技术

HER2，即人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2)，又名ErbB2/neu，为表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族成员之一。1987年，Slamon等在一项189名人乳腺癌的研究中首次报道了HER2在乳腺癌癌细胞中的表达，指出HER2基因在乳腺癌的生物学行为和发病机制中有重要作用。HER2基因，最初是通过乙基亚硝脲诱导大鼠神经/胶质纤维瘤中发现的一种转化基因，定位于人染色体17q21上，编码分子量为185KD的跨膜蛋白，亦称作p185，HER2蛋白由1255个氨基酸组成，包括胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和细胞内结构域(ICD)三部分，其中第1-22个氨基酸是信号肽，23-652个氨基酸是胞外区，跨膜区由22个氨基酸组成强疏水区，胞内区由580个氨基酸组成络氨酸酶活性区。HER2结合在细胞膜表面，具有酪氨酸激酶活性，参与细胞的生长和分化的信号传导。EGFR家族其它配体无法激活HER2，但HER2可与自身结合形成同源配体二聚体，且可与ErbB其他家族成员结合形成异源二聚体，进而激活胞内受体酪氨酸激酶结构域，通过Ras-MAPK途径或PI3K-AKT途径，促进细胞的增殖和分化。

HER2在正常组织中可有微弱的表达，但无基因扩增，其在组织中基因扩增及过度表达与细胞的癌变及多种恶性肿瘤的预后密切相关。

HER2是最重要的乳腺癌预后判断因子之一，HER2阳性的乳腺癌，其生物学行为和临床特点有极其特殊的表现，治疗方法和模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。乳腺癌(mammarycarcinoma)是女性最主要的恶性肿瘤，全国乳腺癌发病率以每年3%的比率递增，成为发病率增长最快的恶性肿瘤。乳腺癌术后经系统的化疗、放疗或内分泌治疗等治疗方法，可获得临床症状缓解，但HER2基因的扩增可导致肿瘤复发和临床预后较差，可出现复发或转移。根据个体差异来选择合适的乳腺癌治疗方法，并有效地预防其复发或转移，是乳腺癌治疗中亟待解决的最重要问题。研究发现，20%～30%的乳腺癌患者存在HER2的过表达，HER2的过表达常提示肿瘤的恶性程度高。HER2基因的扩增和过度表达不仅能有效预测乳腺癌患者的预后，而且可以预测乳腺癌对多种治疗方法，包括内分泌治疗和化疗是否敏感，更成为是否选用Herceptin单抗治疗复发转移性乳腺癌的必要条件。目前，HER2的表达情况已作为乳腺癌独立预后指标及选择治疗的重要标准，临床上对乳腺癌患者进行预后的判断主要依据免疫组化(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交技术(fluorescentinsituhybridization，FISH)的结果，而IHC是乳腺癌检测的金标准方法，该方法灵敏度高，特异性强，定位准确，可发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定，为临床合理的治疗方案提供可靠依据。

发明内容

本发明采用重组HER2抗原，采用鸡免疫技术制备多克隆抗体IgY，获得了有高结合效价的多克隆抗体IgY。因此，本发明一方面提供了一种对HER2蛋白具有高结合效价的多克隆抗体IgY。

本发明另一方面提供了由上述的鸡免疫技术所制备的多克隆抗体，或其活性片段或其保守性突变体。进一步地，本发明的抗体可根据其抗原结合区域（例如重链和轻链可变区）发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或者预防由HER2过度表达产生的恶性肿瘤，如人源化抗体。

由于本发明的多克隆抗体IgY对于HER2蛋白有高水平的中和效果，所以本发明提供了本发明的多克隆抗体IgY或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合在制备用于检测HER2抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

本发明的再一方面提供了试剂、药剂或试剂盒，其包括本发明所述的多克隆抗体IgY或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合。所述试剂、药剂或试剂盒可用于检测HER2抗原，从而可进一步用于诊断由HER2过度表达产生的恶性肿瘤。

本发明提供的HER2抗原的检测方法，优选的，采用免疫组化法进行HER2蛋白的检测。即以人组织细胞作为抗原，根据抗原与抗体特异性结合原理，当加入抗HER2的多克隆抗体IgY时，如果组织细胞中含有HER2蛋白，多克隆抗体IgY便会与HER2进行特异性结合，最后通过标记抗体的显色反应来确定组织细胞内的抗原，从而对HER2进行定位、定性及定量的研究，借此对由HER2过度表达引起的恶性肿瘤进行临床诊断。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种抗HER2的多克隆抗体，其制备方法如下：

（a）免疫原的制备

通过基因克隆和原核表达HER2蛋白，并通过包涵体破碎得到部分可溶蛋白，再经过亲和层析纯化得到HER2蛋白；

首次免疫用弗氏完全佐剂（FCA），以后的加强免疫用弗氏不完全佐剂（FIA）；

（b）蛋鸡免疫

取刚开始产蛋的蛋鸡进行免疫，一共进行4次，每次间隔15天；

（c）免疫效果监测

免疫后由鸡翅下取血，分离血清进行ELISA血清效价检测，与免疫前鸡血清进行比较，收集免疫后比免疫前血清效价提高6～8倍的鸡蛋；

（d）IgY提取与分离

分离蛋黄，粗提IgY，超滤浓缩后采用沉淀法沉淀IgY，离心取沉淀，PBS复溶后备用；

（e）IgY纯化

将经过步骤（d）处理后的IgY采用疏水层析法进行层析纯化，线性梯度洗脱，收集单峰即为IgY抗体，纯度大于98%以上。

作为优选的技术方案，所述（a）中按每只鸡200μgHER2蛋白免疫量计算，将HER2与佐剂按1:1的比例混合，并完全乳化。

作为优选的技术方案，所述的抗HER2的多克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。

作为优选的技术方案，所述免疫检测工具为试剂盒、试剂、药剂。

作为优选的技术方案，所述的抗HER2的多克隆抗体在制备用于诊断HER2过度表达产生的恶性肿瘤的试剂盒中的应用。

一种用于检测HER2抗原的免疫组化试剂盒，包含IgY多克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段。

有益效果

本发明给HER2蛋白抗原检测提供一种高特异性、高灵敏度的优质的抗体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1IgY疏水层析图；

图2为本发明实施例1IgY纯化后电泳图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

多克隆抗体IgY的制备

1.1免疫原的制备

1.1.1根据HER2基因序列，自行设计引物:

上游引物：CGAGCTCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCT，下游引物：CCGCTCGAGTTACGTCAGAGGGCTGGCTCTCTGCT，以HER2的DNA为模版，通过PCR扩增目的基因，构建重组质粒，转化大肠杆菌，诱导表达得到包涵体表达的HER2蛋白，包涵体经过复性，采用亲和层析纯化得到高纯度抗原蛋白HER2。

1.1.2按首次免疫采用弗氏完全佐剂（FCA），之后加强免疫采用弗氏不完全佐剂（FIA）。

1.1.3弗氏完全佐剂（FCA）配制

1.1.3.1轻质液体石蜡与司盘-80按体积比85：15。

如配制200mLFCA，取轻质液体石蜡170mL×0.847（相对密度）=144g；司盘-80：30mL×0.969(相对密度)=29.07g，混匀，120℃高压灭菌30min，备用。

1.1.3.2按疫苗总量5mg/mL称取卡介苗冻干粉，采用无菌生理盐水溶解，于小型研钵中倒入菌液适量，研磨至完全乳化。

1.1.4弗氏不完全佐剂（FIA）配制

FIA不含卡介苗，其配制过程同1.3。

1.1.5疫苗配制

每只鸡25μgHER2蛋白计算抗原免疫量，与佐剂按体积比1:1混合，充分乳化。

1.2动物免疫

对鸡的免疫一共进行4次，每次间隔15天，首次免疫用完全弗氏佐剂，以后的加强免疫用不完全弗氏佐剂。注射点每只鸡按1mL分4点肌肉注射，胸肌两侧各一点，双翅下肌肉各一点。免疫时采用注射器注射，对照组采用生理盐水进行免疫注射，体积同免疫组。

1.3免疫血清效价监测

第二次免疫后第7天可由鸡翅下取血，分离血清进行ELISA血清效价检测，与对照组鸡血清进行比较，如果免疫组比对照组效价提高6-8倍，开始收集鸡蛋。鸡蛋表面用75%乙醇消毒，编号后保存于4℃冰箱，鸡蛋收集数达到一定数量时进行IgY提取。

1.4多克隆抗体IgY提取与纯化

1.4.1IgY提取

1.4.1.1卵黄分离

取出4℃下贮存4～7天的免疫蛋，用40℃左右的纯化水，将蛋壳表面洗净并浸泡几分钟，使蛋清变稀，以便于卵黄分离，然后用75%酒精将蛋壳消毒；打破蛋壳采用卵黄分离器滤掉卵清。

1.4.1.2洗涤卵黄

用无菌纯水调节温度45～50℃，将盛卵黄的小漏勺在水中上下左右摆动，荡净卵黄表面蛋清刷掉系膜，放入洁净无菌容器内计量。当纯水洗至浑浊起泡时，应换水，如此重复3-5次。

1.4.1.3卵黄稀释

将蛋黄搅碎并调匀，按蛋黄与纯化水体积比为1:9的比例加入纯化水，充分混合均匀；采用HAC调节pH为5.0～5.2，密封后置于-20℃冰箱中完全结冻。

1.4.1.4过滤

取出完全结冻的卵黄稀释液，在4～6℃下完全融化，采用中性滤纸真空过滤，收集滤液，备用。

1.4.1.5絮凝澄清

于上述过滤液中按照质量体积比（以下比例均为质量体积比），加入0.06～0.07%壳聚糖，充分搅伴均匀；再加入0.04%海藻酸钠，继之加入0.02%的氯化钙，最后加入0.04%的三聚磷酸钠。每加一次物料，均要求充分搅匀，再静置7～8min，使之反应完全，再加下一个物料。这样形成的沉淀，会更紧实，便于过滤。物料全部加好后，密封，4℃静置24h，再次采用中性滤纸真空过滤。

1.4.1.6超滤浓缩

采用50KD超滤膜进行超滤浓缩，浓缩体积为原体积的1/10。

1.4.1.6沉淀

1.4.1.6.1饱和硫酸铵配制

精确称取硫酸铵767g，加入纯化水1L，充分溶解后0.45μm水膜真空过滤，室温保存，备用。

1.4.1.6.2沉淀IgY

取多克隆卵黄抗体IgY的超滤浓缩液，加入饱和硫酸铵进行沉淀，操作步骤如下：

1)于室温中将免疫球蛋白粗提液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，避免产生气泡；

2)按照IgY浓缩液体积1:1加入饱和硫酸铵溶液，加入时缓慢匀速滴入，滴入时可以采用隔膜泵泵入进行滴加；

3)饱和硫酸铵滴加至1/2时溶液逐渐变浑浊，表明有蛋白沉淀生成，此时可以适当加快搅拌速度，但是同样要避免气泡产生；

4)饱和硫酸铵滴加完后将磁力搅拌器移入2～8℃冰箱中继续搅拌6～8h；

5)高速冷冻离心：4℃，13000×g，20min；

6)弃上清，取沉淀，PBS复溶，0.45μm水膜过滤，2-8℃保存，备用。

1.4.2IgY层析纯化

1.4.2.1磷酸缓冲液配制（PBS）

20mMPB，150mMNaCl，pH7.4，0.45μm水膜真空过滤，2～8℃保存，备用。

1.4.2.2疏水层析

1)层析柱：苯基琼脂糖高性能疏水相互作用层析填料（PhenylSepharoseHighPerformance）；

2)平衡缓冲液：20mMPB，1.5M(NH₄)₂SO₄，pH7.4；

3)洗脱缓冲液：20mMPB，pH7.4；

4)上样样品：复溶的IgY滤液，冰上放置，待上样；

5)层析设备：GE公司AKTA系列蛋白纯化仪；

6)层析方法：先用平衡缓冲液平衡柱子10个柱体积，流速10mL/min，待紫外吸收基线稳定后上样，上样流速5mL/min。上样完成后再用平衡缓冲液平衡5个柱体积，待紫外吸收基线恢复至上样前吸收后进行洗脱，洗脱方法如下：

20min增加洗脱缓冲液至100%，洗脱10个柱体积，待洗脱液到达100%后再洗脱5个柱体积，收集所有洗脱峰，层析过程如图1所示；

7)纯度鉴定：采用SDS-PAGE检测免疫球蛋白，纯度大于98%以上。

结果，将层析过柱后收集的蛋白单峰进行SDS-PAGE，所获得的HER2纯度及分子量如图2所示。

对收集的多克隆卵黄抗体IgY超滤浓缩后冷冻干燥成冻干粉，保存于4℃，如要长期保存需置于-20℃保存。

实施例2

多克隆抗体IgY效价检测

2.1ELISA法检测IgY效价

采用ELISA间接法检测IgY效价，流程如下：

1)采用50mM碳酸盐缓冲液将HER2抗原稀释至浓度为5μg/mL，加入酶标板，每孔120μL，密封，4℃包被过夜；

2)次日取出，甩去包被液，于吸水纸上扣干，加入封闭液，每孔250μL，封闭液为PBST溶解的1%BSA，密封，4℃封闭过夜；

3)次日取出，洗板3次，吸水纸上扣干，37℃干燥30min；

4)将实施案例1中所获得的多克隆卵黄抗体IgY冻干粉采用PBST按1mg/mL溶解，之后用PBST以此为起始进行2倍系列稀释，加入按此稀释的待测样品，同时设置阴性对照和空白对照，每孔100μL，加样时避免产生气泡，密封后置于37℃孵育60min；

5)取出酶标板，甩去样品液，洗板3次，加入PBST稀释的抗鸡IgY酶标二抗，稀释浓度为1:10000，每孔120μL，密封后置于37℃孵育30min；

6)加入底物溶液显色，每孔100μL；2MH₂SO₄作为终止液终止反应，每孔50μL。读取λ=450/630nm时的OD值。

表1：HER2多克隆抗体IgY效价检测结果

2.2检测结果：

2.2.1空白对OD值小于0.100，试验成立；

2.2.2计算阴性对照OD值的平均值的2.1为Cut-off值，按照大于Cut-off值的样品的最大稀释倍数为多克隆卵黄抗体IgY的效价。

2.2.3多克隆卵黄抗体IgY的效价为16384，效价较高，能够作为试剂、药剂或试剂盒的特异性抗体使用。

实施例3

在免疫组化法检测HER2抗原中的应用

3.1HER2免疫组化诊断试剂盒法的制备

3.1.1IgY抗体制备：经纯化的多克隆卵黄抗体IgY（纯化方法见实施例1），采用灭菌后的PBS溶解为浓度为2mg/mL，按照1:1的比例加入无菌甘油，保存于-80℃低温冰箱。

3.1.2免疫组化检测HER2方法的建立：通过对免疫组化试验条件的优化，建立了HER2定性检测方法，具体步骤如下：

1)切片，每张切片厚度为4μm，60℃烤片2～3h或过夜；

2)二甲苯脱蜡3次，各10min；

3)梯度酒精脱二甲苯至水化（100%→90%→75%→50%），各5min；

4)洗涤：PBS冲洗3次，各5min；

5)酶阻断：3%H2O2-甲醇孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性；

6)洗涤：纯化水冲洗3次，PBS浸泡5min；

7)抗原修复：pH6.0的柠檬酸钠缓冲液置于微波修复（总功率1200W，时间20min），即80%功率8min，60%功率6min，40%功率6min，连修复盒置冷水中冷却至室温；

8)洗涤：PBS冲洗3次，各5min；

9)血清封闭：1:10血清室温封闭15～30min（封闭血清尽可能与二抗来源一致，以PBS稀释，目的是在一抗孵育之前封闭非特异性的抗原表位）；

10)加一抗：直接弃去封闭用血清，勿洗。滴加一抗（PBS1:100稀释），37℃孵育2～3h或4℃过夜。以PBS代替一抗设为阴性对照；

11)洗涤：PBS冲洗3遍，各5min；

12)加二抗：滴加HRP标记的二抗，室温孵育20～30min；

13)洗涤：PBS冲洗3遍，各5min；

14)显色：滴加DAB显色液进行显色3～5min。DAB显色液配制：25uLDAB底物(40×)加至1mLDAB缓冲液中，混匀；

15)终止：流水冲洗终止显色，纯化水浸泡30min；

16)复染：苏木素复染5～10s，用流水蓝化；

17)封片：梯度酒精脱水（50%→75%→90%→100%→100%），二甲苯透明，中性树胶封片；

18)结果分析：显微镜观察进行判断。

3.2HER2免疫组化试剂盒检测病人样本

采用人乳腺细胞组织切片作为样本，按照上述建立的定性检测方法检测HER2抗原，并与罗氏公司的HER2诊断试剂盒（免疫组化法）进行对比，结果如表2所示：

表2：本发明抗体IgY与罗氏诊断试剂盒检测结果的比较

根据以上数据计算，阳性符合率符合率结果为90%，阴性符合率为100%。

3.3本发明的HER2抗体检测其他肿瘤阳性样本4份，均表现阴性。说明本多克隆卵黄抗体IgY与其他肿瘤细胞组织切片无交叉反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，其制备方法如下：

（a）免疫原的制备

通过基因克隆和原核表达HER2蛋白，并通过包涵体破碎得到部分可溶蛋白，再经过亲和层析纯化得到HER2蛋白；

首次免疫用弗氏完全佐剂，以后的加强免疫用弗氏不完全佐剂；

（b）蛋鸡免疫

取刚开始产蛋的蛋鸡进行免疫，一共进行4次，每次间隔15天；

（c）免疫效果监测

免疫后由鸡翅下取血，分离血清进行ELISA血清效价检测，与免疫前鸡血清进行比较，收集免疫后比免疫前血清效价提高6～8倍的鸡蛋；

（d）IgY提取与分离

分离蛋黄，粗提IgY，超滤浓缩后采用沉淀法沉淀IgY，离心取沉淀，PBS复溶后备用；

（e）IgY纯化

将经过步骤（d）处理后的IgY采用疏水层析法进行层析纯化，线性梯度洗脱，收集单峰即为IgY抗体，纯度大于98%以上。

2.根据权利要求1所述的一种抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，所述（a）中按每只鸡200μgHER2蛋白免疫量计算，将HER2与佐剂按1:1的比例混合，并完全乳化。

3.根据权利要求1所述的一种抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，所述的抗HER2的多克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

5.根据权利要求1所述的一种抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，所述的抗HER2的多克隆抗体在制备用于诊断HER2过度表达产生的恶性肿瘤的试剂盒中的应用。

6.一种用于检测HER2抗原的免疫组化试剂盒，包含权利要求1所述的IgY多克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段。