CN102174105B - 针对her-3的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合于HER-3的结合蛋白及其编码的核苷酸，也提供了用于生产本发明结合蛋白的表达载体和宿主细胞。此外，本发明还提供了用于诊断和治疗与HER-3介导的信号传导和/或其配体heregulin相关疾病的组分和方法。

Description

针对HER-3的抗体及其用途
本申请是申请号200680049887.7、申请日为2006年12月29日的同名专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及结合蛋白，包括结合于HER-3的抗体及其结合片段以及编码它们的多核苷酸序列。本发明也提供了用于生产本发明结合蛋白的表达载体和包含该表达载体的宿主细胞。此外，本发明还提供了用于诊断和治疗与HER-3介导的信号转导和/或其配体调蛋白(heregulin)相关疾病的组合物和方法。
技术背景
人类表皮生长因子受体3(HER-3，也称为ErbB3)是一种受体蛋白酪氨酸激酶，属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)亚家族，该家族还包括HER-1(也称为EGFR)、HER-2和HER-4(Plowman等人的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)，4905-4909；Kraus等人的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989)，9193-9197；以及Kraus等人的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)，2900-2904)。与典型的表皮生长因子受体一样，跨膜受体HER-3由÷胞外配体结合结构域(ECD)、ECD内的二聚体结构域、跨膜结构域，胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(TKD)和C端磷酸化结构域组成。
配体调蛋白(HRG)与HER-3的胞外结构域结合，并且通过促进其与其他人类表皮生长因子受体(HER)家族成员的二聚化，并且使HER-3的跨膜结构域磷酸化，从而激活受体介导的信号通路。HER家族成员间的二聚体放大了HER-3的信号电位，它既是信号多样化的方式也是信号放大的方式。例如，在HER家族成员中，HER-2/HER-3的异源二聚体诱导了最重要的促有丝分裂信号中的一个。
HER-3已被发现在一些类型的癌症如乳腺癌、胃肠癌和胰腺癌中过表达。有趣的是，已有研究表明HER-2/HER-3的表达和癌症从非侵袭阶段发展到侵袭阶段有相关性(Alimandi等人的Oncogene 10，1813-1821；deFazio等人的Cancer 87，487-498；Naidu等人的Br.J.Cancer 78，1385-1390)。因此，干扰HER-3介导的信号转导的制剂是令人期望的。已经报道了鼠源或嵌合型HER-3抗体，比如在专利US5968511、US5480968和WO03013602中。
最近研究表明，一种针对HER-2的人源化单克隆抗体赫赛
Figure BDA0000048852290000022
，干扰了HER-2介导的信号转导，对人类癌症有治疗效果(Fendly等人的Hybridoma 6，359-370；Hudziak等人的MoI.Cell.Biol.9，1165-1172；Stebbing等人的Cancer Treat.Rev.26，287-290)。已表明赫赛
Figure BDA0000048852290000023
可以通过两种不同的机制起作用，也就是免疫系统的效应细胞的参与和直接的细胞毒及凋亡诱导作用。
但是，只有那些高表达HER-2的患者对赫赛
Figure BDA0000048852290000024
的治疗反应显著，因此，限制了适合治疗的患者数目。而且，耐药性的发展或是肿瘤细胞中HER-2表达或其表位序列的改变可能会使那些有希望被治疗的患者不能与抗体反应从而消除了其治疗作用。因此，需要有更多的靶向治疗药物涉及HER家族的其它成员，如HER-3。
附图简要说明
图1表示了HER-3在一系列人类癌细胞系中的表达程度，表明HER-3在多种人类癌症均表达。
图2表示了FACS分析HER-3抗体与稳定表达HER家族不同成员的Rat1细胞或仅含有空载体的Rat1细胞的结合情况。
图3表示的是抗体竞争bins定位于HER3结构域。
图4表示的是利用本发明的抗HER-3抗体进行间接的FACSScatchard抗体亲和分析的结果。分析表明本发明的抗HER-3抗体对表达于细胞表面的HER-3具有高亲和力和高结合常数。
图5表示的是本发明的抗HER-3抗体加速了HER-3的内吞作用。
图6a-e表示的是利用本发明的抗HER-3抗体进行的配体竞争分析的结果。这些结果表明，本发明的抗体特异地降低了[125I]-α-HRG/[125I]-β-HRG与表达内源HER-3的细胞的结合。
图7a表示的是利用本发明的抗HER-3抗体进行HER-3磷酸酪氨酸酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果。本发明的抗体能够抑制β-HRG介导的HER-3活化，表现为受体酪氨酸磷酸化程度增加。图7b表示了利用滴定过的抗体进行本实验的代表性结果。
图8表示的是利用本发明的抗HER-3抗体与p42/p44MAP激酶进行酶联免疫吸附实验的结果。本发明的抗体能够降低β-HRG介导的p42/p44MAP-激酶活化，表现为MAP-激酶磷酸化程度增加。
图9表示的是利用本发明的抗HER-3抗体与磷酸AKT进行酶联免疫吸附实验的结果。本发明的抗体能够降低β-HRG介导的AKT活化，表现为AKT的磷酸化。
图10表示的是本发明的人抗HER-3抗体抑制了MCF7细胞增值。本发明的抗体抑制了人类癌细胞中HRG诱导的细胞增值。
图11表示的是本发明的人抗HER-3抗体抑制了MCF7细胞的转移。
图12a-i表示的是本发明的人抗HER-3抗体抑制了非贴壁依赖性细胞的生长。
图13表示的是本发明的人抗HER-3抗体对T47D人类乳腺癌细胞的异种移植生长的抑制。
图14表示的是通过对小鼠施用抗Her3(U1-59 and U1-53)或抗EGFR(爱必妥)抗体，减少了小鼠中BxPC3人类胰腺癌细胞数量。
图15表示的是本发明的人类抗HER-3抗体以及与抗EGFR(爱必妥)的抗体的联合，降低了人类胰腺癌细胞BxPC3的异种移植生长。
图16表明本发明的抗体延缓了黑色素瘤细胞(HT144)在nu/nu小鼠中的生长。
图17表示的是本发明的人类HER-3抗体(U1-53，U1-59 and U1-7)降低了人类结肠癌细胞HT-29的异种移植生长。
图18表示的是本发明的人类抗HER-3抗体(U1-59，U1-53 andU1-7)降低了人类肺癌细胞Calu-3的异种移植生长。
图19表示的是本发明的人类抗HER-3抗体(U1-7，U1-59 andU1-53)降低了人类胰腺癌细胞BxPC3的异种移植生长。
图20表明本发明的抗体(U1-59)导致HER-3在BxPC3人类胰腺癌异种移植中受到抑制。
发明概述
本发明的首要方面涉及一种结合于HER-3的分离的结合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，本发明的一种分离的结合蛋白包括：
重链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(CDR)，该CDR选自以下序列组成的群组：
(a)SEQ ID NOs：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH1；
(b)SEQ ID NOs：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH2；以及
(c)SEQ ID NOs：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH3；和/或
轻链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(CDR)，所述CDR选自以下序列组成的群组：
(d)SEQ ID NOs：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL1；
(e)SEQ ID NOs：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL2；以及
(f)SEQ ID NOs：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL3。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的一种分离的结合蛋白包括：
重链氨基酸序列，其选自以下序列组成的群组：
SEQ ID Nos：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230；和/或
轻链氨基酸序列，其选自以下序列组成的群组：
SEQ ID Nos：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232。
在本发明的另一个实施方案中，本发明分离的结合蛋白包括：
如下所示的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列：SEQ ID NOs：2和4、6和8、10和12、14和16、18和20、22和24、26和28、30和32、36和38、42和44、46和48、50和52、54和56、60和58、62和64、66和68、70和72、74和76、78和82、80和82、84和86、88和90、92和94、96和98、100和102、104和106、108和110、112和114、116和118、122和124、126和128、130和132、134和136，138和140、142和144、146和148、150和152、154和156、158和160、162和164、166和168、170和172、174和176、178和180、182和184、186和188、190和192、194和196、198和200、202和204、206和208、210和212、214和216、218和220、222和224、226和228、230和232；或者
SEQ ID NOs：34、40、60、62或120所示的重链氨基酸序列；或者
SEQ ID NOs：58或64所示的轻链氨基酸序列。
根据本发明，能与HER-3结合的分离的结合蛋白与HER-3胞外部分的至少一个表位相互作用。这些表位优选定位于L1结构域(第19-184位氨基酸)、S1(第185-327位氨基酸)和S2结构域(第500-632位氨基酸)或L2结构域(第328-499位氨基酸)，其中L1结构域是氨基端结构域，S1和S2结构域是两个富含半胱氨酸的结构域，L2位于两个富含半胱氨酸的结构域的两侧。这些表位也可定位于这些结构域的组合区域，但并不限于L1和S1部分组成的表位。更加优选的是这样一种分离的结合蛋白，它能够结合于成熟的HER-3、特别成熟的人类HER-3蛋白的1-160，161-358，359-575，1-358和/或359-604位氨基酸残基形成的三维结构。
优选的，本发明的一种分离结合蛋白是一种支架蛋白，具有抗体样的结合活性或是一种抗体，如抗HER-3的抗体。尤其是，抗HER-3的抗体选自下列抗体组成的群组：
U1-1抗体、U1-2抗体、U1-3抗体、U1-4抗体、U1-5抗体、U1-6抗体、U1-7抗体、U1-8抗体、U1-9抗体、U1-10抗体、U1-11抗体、U1-12抗体、U1-13抗体、U1-14抗体、U1-15抗体、U1-16抗体、U1-17抗体、U1-18抗体、U1-19抗体、U1-20抗体、U1-21抗体、U1-22抗体、U1-23抗体、U1-24抗体、U1-25抗体、U1-26抗体、U1-27抗体、U1-28抗体、U1-29抗体、U1-30抗体、U1-31抗体、U1-32抗体、U1-33抗体、U1-34抗体、U1-35抗体、U1-36抗体、U1-37抗体、U1-38抗体、U1-39抗体、U1-40抗体、U1-41抗体、U1-42抗体、U1-43抗体、U1-44抗体、U1-45抗体、U1-46抗体、U1-47抗体、U1-48抗体、U1-49抗体、U1-50抗体、U1-51抗体、U1-52抗体、U1-53抗体、U1-55.1抗体、U1-55抗体、U1-57.1抗体、U1-57抗体、U1-58抗体、U1-59抗体、U1-61.1抗体、U1-61抗体、U1-62抗体或者具有其中一种所述抗体的至少一条重链或轻链的抗体。特别优选的是U1-49抗体(SEQ IDNO：42/44)、U1-53抗体(SEQ ID NO：54/56)和U1-59抗体(SEQ ID NO：70/72)抗体或是具有其中一种所述抗体的至少一条重链或轻链的抗体。
此外，本发明的另外实施方案提供了偶联上一个标记基团或是效应基团的分离的结合蛋白。优选的，这种结合蛋白对治疗过增殖性疾病有用，特别是肿瘤疾病，例如：乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、睾丸癌、软组织肉瘤、头颈部癌、其他表达或过表达HER-3的癌症以及肿瘤转移的形成。
本发明的其他方面涉及编码本发明结合蛋白的分离的核酸分子、含有编码本发明结合蛋白的分离的核酸分子的载体和一种宿主细胞，例如：用所述的核酸分子或载体转化CHO细胞和NS/0骨髓瘤细胞。
本发明的另一方面涉及一种生产本发明结合蛋白的方法，该方法从分泌结合蛋白的宿主细胞来制备所述的结合蛋白。优选的，本发明的结合蛋白制备自分泌该结合蛋白的杂交瘤细胞株或是用编码本发明结合蛋白的核酸分子转化的CHO细胞或其他细胞类型。
本发明的另一方面涉及一种生产本发明结合蛋白的方法，该方法从针对编码本发明结合蛋白的一种或多种核酸分子的转基因动物、转基因植物或真菌的组织、产物或分泌物来制备所述的结合蛋白。优选的，本发明的结合蛋白制备自转基因动物如奶牛、绵羊、兔、鸡或者其他哺乳动物或禽类的组织、产物或分泌物，转基因植物如玉米、烟草或其他植物，或者转基因真菌如曲霉、毕赤酵母或其他真菌种类。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包括作为活性剂的本发明的至少一种结合蛋白与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂混合成的一种活性剂。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的药物组合物另外包括至少一种其他活性剂，例如：至少一种抗肿瘤剂。本发明的其他方面还涉及本发明的至少一种结合蛋白，任选的至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂混合在制备药物组合物的种的用途。这种药物组合物适用于诊断、预防或治疗一种过增殖性疾病，特别是肿瘤疾病，如乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、或其他表达或过表达HER-3的癌症以及肿瘤转移形成。
此外，本发明另一方面涉及诊断与HER-3表达相关的疾病或状况的一种方法，其中包括将含有至少一种本发明的结合蛋白与样品接触，并检测HER-3的存在。优选的疾病或状况包括上面提及的过增殖性疾病。
本发明的另一方面是在有需要的患者身上预防或治疗与HER-3表达相关的疾病或状态的一种方法，其中包括对患者施用有效量的本发明的至少一种结合蛋白，和任选的至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂。优选的患者是哺乳动物患者，更优选的是人类患者。优选的HER-3表达相关的疾病或状况是上面提及的过增殖性疾病。
本发明的另一个方面涉及诊断、预防或治疗与HER-3表达相关的疾病或状况的一种试剂盒，其中包括至少一个本发明的结合蛋白和/或核酸分子和/或载体。任选的是，本发明的试剂盒可进一步包含至少一种其他活性剂，例如至少一种抗肿瘤剂。优选的，与HER-3表达相关的疾病或状况是上面提及的过增殖性疾病。
详细说明
本发明的首要方面涉及一种结合至HER-3的分离的结合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的结合蛋白包括：
重链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(CDR)，该CDR选自以下序列组成的群组：
(a)SEQ ID NOs：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH1；
(b)SEQ ID NOs：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH2；以及
(c)SEQ ID NOs：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH3；和/或
轻链氨基酸序列，其包含至少一个互补决定区(CDR)，该CDR选自以下序列组成的群组：
(d)SEQ ID NOs：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL1；
(e)SEQ ID NOs：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL2；以及
(f)SEQ ID NOs：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL3。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的分离的结合蛋白包括：
重链氨基酸序列，其选自以下序列组成的群组：
SEQ ID Nos：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230；和/或
一条轻链氨基酸序列，选自以下序列组成的群组：
SEQ ID Nos：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232。
在本发明的另一个实施方案中，本发明分离的结合蛋白包括：
如下所示的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列：
SEQ ID NOs：2和4、6和8、10和12、14和16、18和20、22和24、26和28、30和32、36和38、42和44、46和48、50和52、54和56、60和58、62和64、66和68、70和72、74和76、78和82、80和82、84和86、88和90、92和94、96和98、100和102、104和106、108和110、112和114、116和118、122和124、126和128、130和132、134和136，138和140、142和144、146和148、150和152、154和156、158和160、162和164、166和168、170和172、174和176、178和180、182和184、186和188、190和192、194和196、198和200、202和204、206和208、210和212、214和216、218和220、222和224、226和228、230和232；或者
SEQ ID NOs：34、40、60、62或120所示的重链氨基酸序列；或者
SEQ ID NOs：58或64所示的轻链氨基酸序列。
根据本发明，应当理解的是本发明的结合蛋白的氨基酸并不仅限于20种常见氨基酸(见Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用被纳入本文)。例如，氨基酸分子可能包括20种常规氨基酸的立体异构体(如D-型氨基酸)、非天然氨基酸如α-，α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常见氨基酸。非常见氨基酸也可作为本发明结合蛋白的合适组分，其实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似氨基酸基亚氨基酸，如4-羟基脯氨酸。
此外，根据本发明，如果变异维持在SEQ ID NOs：1-232所示的氨基酸序列中的至少75％，较优选为至少80％、90％、95％，最优选为99％，那么SEQ ID NOs：1-232所示的氨基酸序列中的少量变异预期也包含在本发明中。这些变异可能发生在框架区(也就是在互补决定区外)、互补决定区内、或者同时在框架区和互补决定区内。SEQ IDNOs：1-232所示的氨基酸序列中的优选变异，也就是删除、插入和/或替代至少一个氨基酸，发生在靠近功能结构域的边界。结构和功能结构域可以通过核酸和/或氨基酸数据与公共或专有序列数据库比对来鉴定。计算机比对方法可以用来判别序列基序或预测出现在其他已知结构和/或功能的结合蛋白的蛋白构象结构域。判别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。参考Bowie等人的Science 253，164(1991)、Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman和Company，New York(1984))、Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))、和Thornton等人的Nature 354，105(1991)，其通过引用被纳入本文。因此，根据本发明，本领域技术人员能够识别序列基序和结构构象，它们可能用于定义结构和功能结构域。
SEQ ID NOs：1-174和1-232所示的氨基酸序列中特别优选的变异是那些能够导致结合蛋白降低对蛋白水解或氧化敏感性、改变糖基化形式或者改变结合亲和力或者赋予或修饰其他物化或功能特性。尤其是，保守氨基酸的替代也是预期的。保守的替代是发生在与侧链相关的氨基酸的家族内。优选的氨基酸家族如下：酸性家族＝天冬氨酸、谷氨酸；碱性家族＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及无电荷极性氨基酸家族＝甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。较优选的氨基酸家族是：脂肪羟基家族＝丝氨酸和苏氨酸；含酰胺家族＝天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及芳香族氨基酸＝苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理的预测，亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸、冬氨酸用谷氨酸、苏氨酸用丝氨酸的单独的替代；或者一种氨基酸用一种结构相关的氨基酸的相似的替代不会对结合蛋白的结合或特性产生主要影响，特别是当替代不包括框架区位点的氨基酸。但是，所有其他所有可能的氨基酸替代也预期属于本发明。一种氨基酸的改变是否产生一种有功能的结合蛋白，也就是说，产生的结合蛋白能够与HER-3结合并降低HER家族成员的信号转导，可以很容易用酶联免疫吸附实验(ELISA)或FACS分析产生的蛋白结合HER-3的特异活性或者体内或体外功能分析来确定。
根据本发明，本发明的结合蛋白至少与HER-3胞外部分的至少一个表位相互作用。这些表位优选定位于L1结构域(第19-184位氨基酸)，S1(第185-327位氨基酸)和S2结构域(第500-632位氨基酸)或L2结构域(第328-499位氨基酸)，或位于HER-3结构域的组合，其中L1结构域是氨基端结构域，S1和S2结构域是两个富含半胱氨酸的结构域，它们位于L2结构域的两侧。这些表位也可定位于这些结构域的组合区域，但并不限于L1和S1部分组成的表位。此外，本发明的结合蛋白的进一步特征是其能结合于HER-3并降低了HER-3介导的信号转导。根据本发明，HER-3介导的信号转导的降低可能，例如会由于HER-3的下调所致，从而导致至少HER-3分子从细胞表面的部分消失；或者由于HER-3基本上以一种非活性形式稳定在细胞表面，也就是与非稳定形式相比表现出较低信号转导的一种形式。或者，HER-3介导的信号转导的降低可能也是由于影响(例如降低或者抑制)了配体或HER家族的另一成员与HER-3的结合以及GRB2与HER-2或SHC的结合，其通过抑制受体酪氨酸磷酸化、AKT磷酸化、PYK2酪氨酸磷酸化或ERK2磷酸化，或者通过降低肿瘤的侵袭性来实现。或者，HER-3介导的信号转导的降低可能也是由于影响(例如降低或者抑制)了HER-3与其他HER家族成员形成二聚体。其他实施例中的一个实施例可以是降低或抑制了HER-3-EGFR蛋白复合物的形成。
优选的，本发明的结合蛋白是一种支架蛋白，具有抗体样结合活性或是一种抗体，也就是抗HER-3的抗体。
本发明文本中所使用的术语“支架蛋白”是指含有暴露的表面区域的一条多肽链或蛋白，其对氨基端插入、替代或缺失高度耐受。根据本发明可以使用的支架蛋白的实例是金黃色葡萄球菌的A蛋白、大菜粉蝶的胆素结合蛋白、或者其他lipocalins、锚蛋白重复蛋白及人纤连蛋白(见综述：Binz and Plückthun，Curr Opin Biotechnol，16，459-69)。支架蛋白的工程化可视为移植或整合亲和功能到稳定折叠蛋白的结构框架表面或内部。根据本发明，亲和功能是指蛋白结合亲和力。支架可以结构上独立于赋予结合特性的氨基酸序列。一般说来，显现出适合发展这种人工亲和试剂的蛋白可通过合理的、或最常见的、组合蛋白工程技术如针对HER-3筛选，采用纯化的蛋白或展示在细胞表面的蛋白，作为结合试剂用于人工支架库体外展示，这些技术是本领域熟知的(Skerra，J.Mol.Recog.，2000；Binz and Plückthun，2005)。此外，具有抗体一样结合活性的支架蛋白可以来源于含有该支架结构域的受体多肽，其可以用受体多肽的结合结构域移植并赋予包含这种支架结构域的受体多肽具有供体多肽的结合特性。所述的插入结合域可以是，例如，抗体的互补决定区(CDR)，特别是抗HER-3抗体的CDR。插入可以是通过各种本领域抑制的方法实现，例如，多肽合成、编码氨基酸的核酸合成以及通过本领域技术人员熟知的各种重组方法。
此外，本文中所使用术语“抗体”或“抗HER-3抗体”指一种单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等人，Nature321(1986)，522-525；Riechmann等人，Nature 332(1988)，323-329；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2(1992)，593-596)、嵌合抗体(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(1984)，6851-6855)、由至少两个抗体组成的多特异抗体(例如双特异抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包括上述提及的抗体的任意部分，优选的是它们的抗原结合或可变区。抗体片段的范例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体(Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)，6444-6448)、单链抗体分子(Plückthun in：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113，Rosenburg and Moore，EDS，Springer Verlag，N.Y.(1994)，269-315)和其他片段，只要表现出所需的结合HER-3能力。
此外，本文中所使用术语“抗体”或“抗HER-3抗体”可以包含抗体样分子包括工程化抗体亚结构域或天然发生的抗体变异体。这些抗体样分子可以是单结构域抗体如单一的VH或VL结构域，其或者是天然来源如camelids(Muyldermans等人，Reviews in MolecularBiotechnology 74，277-302)，或者通过人类、camelids或其他物种体外展示库获得(Holt等人，Trends Biotechnol.，21，484-90)。
根据本发明，“Fv片段”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这一区域由一条重链或轻链通过紧密的非共价结合形成的二聚体组成。正是在这种构造中每个可变区的三个互补决定区相互作用确定了VH-VL二聚体的表面抗原结合位点。总的说来，这六个互补决定区赋予了抗体的抗原结合特性。但是，即使单独一个可变结构域(或者包含仅三个抗原特异的互补决定区的半个Fv片段)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力要比完整结合位点低。“Fab片段”也包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。“Fab片段”不同于与“Fab′片段”，其在重链CH1结构域的羧基端添加了一些残基，包括来源于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。“F(ab′)2”最初产生于一对“Fab′片段”，其中间含有铰链半胱氨酸。制备这些抗体片段的方法如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，都是本领域技术人员所熟知的。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的抗HER-3抗体是IgA-、IgD-、IgE-、IgG-或IgM-类型，优选的是IgG-或IgM-类型，包括(但不限于)IgG1-、IgG2-、IgG3-、IgG4-、IgM1-和IgM2类型。在最优选实施例中，抗体是IgG1-、IgG2-、或IgG4-类型。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明抗HER-3的抗体是针对HER-3胞外结构域(ECD)产生的抗HER-3抗体。
在某些方面，例如与作为治疗候选物的抗HER-3抗体的产生有关，理想的是本发明的抗HER-3抗体能够固定补体并参与补体依赖的细胞毒作用(CDC)。许多抗体同种型能够相同，包括(但不限于)下列：鼠IgM、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgG1、人lgG3和人IgA。应当了解，产生的抗体最初不需要具有这种同种型，相反，产生的抗体可以具有任意同种型，这种抗体可以是转变的同种型，其通过在合适的表达载体中，用本领域熟悉的传统生物学技术，将分子克隆的V区域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定区基因或cDNA分子中，然后通过本领域熟知的技术在宿主细胞中表达该抗体。这种同种型转变的抗体也可具有Fc区域，其已经通过分子工程来实现具有比自然发生的变异体更好的补体依赖的细胞毒作用(Idusogie等，JImmunol.，166，2571-2575)，并可通过本领域熟知的技术在宿主细胞中重组表达。这些技术包括直接重组技术的使用(见美国专利No.4,816,397)、细胞融合技术(见美国专利No s.5,916,771和6,207,418)等等。在细胞融合技术中，制备了具有任何想要的同种型重链的骨髓瘤或其他细胞株如CHO，制备了具有的轻链的其他骨髓瘤细胞或其他细胞株例如CHO。这些细胞然后可以被融合，表达完整抗体细胞株就可以被分离到。作为一个例子，一种人抗-HER-3 IgG4抗体，具有想要的结合于HER-3抗原的能力，可以通过简单的同种型转变来产生人IgM、人IgG1或IgG3同种型，同时仍具有相同的可变区(其定义了抗体的特异性和一些亲和性)。这样的分子然后可能能够固定补体和参与补体依赖的细胞毒。
此外，也比较理想的是，本发明的抗HER-3抗体能够结合于效应细胞(如单核细胞和自然杀伤细胞(NK))的Fc受体，并参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。有许多抗体的同种型能够有同样的功能，包括(但不限于)下列：鼠源IgG2a、鼠源IgG2b、鼠源IgG3、人IgG1和人IgG3。应当了解的是，产生的抗体最初不需要具有这种同种型，相反，产生的抗体可以具有任意同种型，这种抗体可以是转变的同种型，其通过在合适的表达载体中，用本领域熟悉的传统生物学技术，将分子克隆的V区域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定区基因或cDNA分子中，然后通过本领域熟知的技术在宿主细胞中表达该抗体来实现。这种同种型转变的抗体也可具有Fc区域，其已经通过分子工程使具有比自然发生的变异体更好的抗体依赖的细胞毒作用(Shields等人，J Biol Chem.，276，6591-6604)，并可通过本领域熟知的技术在宿主细胞中重组表达。这些技术包括直接重组技术的使用(见美国专利No.4,816,397)、细胞融合技术(见美国专利No s.5,916,771和6,207,418)等等。在细胞融合技术中，制备了具有任何想要的同种型重链的骨髓瘤或其他细胞株如CHO，制备了具有的轻链的其他骨髓瘤细胞或其他细胞株例如CHO。这些细胞然后可以被融合，表达完整抗体细胞株就可以被分离到。作为一个例子，一种人抗-HER-3 IgG4抗体，具有想要的结合于HER-3抗原的能力，其可以通过简单的同种型转变来产生人IgG1或IgG3同种型，同时仍具有相同的可变区(其定义了抗体的特异性和一些亲和性)。这样的分子然后可能能够与效应细胞的FcγR结合并能够参与抗体依赖的细胞毒作用。
此外，根据本发明，应当了解的是，本发明的抗HER-3抗体是一种全人或人源化抗体。人类抗体避免了异种抗体(例如，具有鼠源或大鼠来源的可变区和/或恒定区的抗体)引起的某些问题。异种来源的蛋白如鼠源或大鼠来源的蛋白可导致患者针对抗体产生免疫应答，接着通过抗体中和以及/或严重的、甚至威胁生命的变态反应，导致抗体的快速清除、失去治疗效果。
优选的，本发明的抗HER-3抗体选自以下抗体组成的群组：
U1-1抗体、U1-2抗体、U1-3抗体、U1-4抗体、U1-5抗体、U1-6抗体、U1-7抗体、U1-8抗体、U1-9抗体、U1-10抗体、U1-11抗体、U1-12抗体、U1-13抗体、U1-14抗体、U1-15抗体、U1-16抗体、U1-17抗体、U1-18抗体、U1-19抗体、U1-20抗体、U1-21抗体、U1-22抗体、U1-23抗体、U1-24抗体、U1-25抗体、U1-26抗体、U1-27抗体、U1-28抗体、U1-29抗体、U1-30抗体、U1-31抗体、U1-32抗体、U1-33抗体、U1-34抗体、U1-35抗体、U1-36抗体、U1-37抗体、U1-38抗体、U1-39抗体、U1-40抗体、U1-41抗体、U1-42抗体、U1-43抗体、U1-44抗体、U1-45抗体、U1-46抗体、U1-47抗体、U1-48抗体、U1-49抗体、U1-50抗体、U1-51抗体、U1-52抗体、U1-53抗体、U1-55.1抗体、U1-55抗体、U1-57.1抗体、U1-57抗体、U1-58抗体、U1-59抗体、U1-61.1抗体、U1-61抗体、U1-62抗体。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白偶联上了一个标记基团。这种结合蛋白特别适合于诊断应用。本文中所使用的术语“标记基团”是指一种可检测的标记，例如放射性标记的氨基酸或生物素化部分，其可以通过标记的抗生物素蛋白来检测(例如：结合上荧光标记的链霉亲和素或可使用光学或比色方法来检测的酶活性)。用来标记多肽或糖蛋白如抗体的本领域技术人员熟知的各种方法，可以用于完成本发明。适合的标记基团的实例包括(但不限于)下列：放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N，、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如：FITC、罗丹明、镧系无机发光材料)、酶基团(例如：辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或者可由第二报告体识别的预定多肽表位(例如：亮氨酸拉链型配对序列、第二抗体的结合位置、金属结合结构域、表位标签)。在某些实施方案中，可能想到的是，标记基团是利用不同长度的间隔臂连接的，以降低潜在的空间位阻。
可选的，在本发明的另一个优选方案中，本发明的结合蛋白可以偶联到一个效应基团上。这种结合蛋白特别适合于治疗应用。本文中所使用的术语“效应基团”系指细胞毒基团如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗基团或本领域熟知的其他效应基团。合适的效应基团的实例是放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N，、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、加里刹霉素、海兔毒素类似物如auristatins、以及化疗试剂如geldanamycin和美登素衍生物，包括DM1。在某些实施方案中，可能想到的是，效应基团是利用不同长度的间隔臂连接的，以降低潜在的空间位阻。
本发明的一个次要方面涉及制备本发明分离的结合蛋白的过程，包括从分泌本结合蛋白的宿主细胞中制备本结合蛋白的步骤。根据本发明，可使用的宿主细胞是杂交瘤细胞；真核细胞如哺乳动物细胞，例如仓鼠、兔、大鼠、猪、小鼠或其他动物细胞；植物细胞；真菌细胞，例如酿酒酵母、毕赤酵母；原核细胞如大肠杆菌；或者本领域熟知的其他细胞，用来生产结合蛋白。从宿主细胞中用于制备和分离结合蛋白(如支架蛋白或者抗体)的各种方法是本领域熟知的，可用来实施本发明。此外，用于制备结合蛋白片段(如支架蛋白片段或抗体片段)的方法，例如：木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化、现代克隆技术、单链抗体分子的制备技术(参见Plückthun：The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies 113，Rosenburg and Moore，EDS，SpringerVerlag，N.Y.(1994)，269-315)和双抗体(Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)，6444-6448)，这些方法是本领域技术人员熟知的，可用来实施本发明。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白制备于分泌该结合蛋白的杂交瘤细胞。见Kǒhler等人的Nature 256(1975)，495.
在本发明的一个较优选的实施方案中，本发明的结合蛋白通过重组制备，其中在宿主细胞中优化或/和放大表达结合蛋白、并从所述的细胞中分离该结合蛋白。为了这个目的，在合适的条件下宿主细胞用编码结合蛋白的DNA或含有编码结合蛋白DNA的载体转化或转染，以产生本发明的结合蛋白。参见：如美国专利No.4,816,567。优选的宿主细胞可以是CHO细胞、NS/0杂交瘤细胞、人胚肾293细胞、大肠杆菌和酿酒酵母。
关于那些是抗体的结合蛋白，这些抗体可以从遗传工程化的动物产生全人抗体或者从噬菌体、酵母、核糖体或大肠杆菌抗体展示库中制备。参见例如：Clackson等人，Nature 352(1991)，624-628，Marks等人，J.Mol.Biol.222(1991)，581-597，Feldhaus and SiegelJ Immunol Methods.290，69-80，Groves and Osbourn，Expert OpinBiol Ther.，5，125-135 and Jostock and Dubel，Comb Chem HighThroughput Screen.8，127-133。
人类抗体避免和具有鼠源或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的问题。存在这些鼠源或大鼠来源的蛋白会导致这些抗体被患者快速清除或导致患者针对这种抗体产生免疫反应。为了避免使用鼠源或大鼠来源的抗体，全人抗体可经由导入有功能的人类抗体座位到啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生，以使该啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生全人抗体。
产生完整人类抗体的方法是通过使用
Figure BDA0000048852290000201
株小鼠，其已被工程化含有人类重链座位和κ-轻链座位的245kb和190kb大小的种系构型片段。其他XenoMouse株小鼠含有人类重链座位和κ-轻链座位的980kb和800kb大小的种系构型片段。还有其他XenoMouse株小鼠含有人类重链座位和κ-轻链座位的980kb和800kb大小的种系构型片段加上740kb大小种系构型的完整的人类λ-轻链座位。见Mendez等人的Nature Genetics 15：146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。
Figure BDA0000048852290000202
株小鼠可从Abgenix，Inc.(Fremont，CA)获得。
Figure BDA0000048852290000203
小鼠的生产深入讨论和说明于下列美国专利申请序列号：07/466,008，申请于1990年1月12日、07/610,515，申请于1990年11月8日、07/919,297，申请于1992年7月24日、07/922,649，申请于1992年7月30日、08/031,801，申请于1993年3月15日、08/112,848，申请于1993年8月27日、08/234,145，申请于1994年4月28日、08/376,279，申请于1995年1月20日、08/430,938，申请于1995年4月27日、08/464,584，申请于1995年6月5日、08/464,582，申请于1995年6月5日、08/463,191，申请于1995年6月5日、08/462,837，申请于1995年6月5日、08/486,853，申请于1995年6月5日、08/486,857，申请于1995年6月5日、08/486,859，申请于1995年6月5日、08/462,513，申请于1995年6月5日、08/724,752，申请于1996年10月2日、和08/759,620，申请于1996年12月3日；美国专利公开号：2003/0217373，申请于2002年11月20日；和美国专利Nos.6,833,268、6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598和日本专利No s.3068180B2，3068506B2，and 3068507B2。同样参见欧洲专利：EP 0463151B1，授权公告于1996年6月12日；国际专利申请No.，WO 94/02602，出版于1994年2月3日；国际专利申请No.WO 96/34096，出版于1996年10月31日；WO 98/24893，出版于1998年6月11日、WO00/76310，出版于2000年12月21日。各个上述引用的专利、专利申请和文献的公开内容在此通过引用整体纳入本文中。
在一种可选的方法中，包括GenPharm国际的其他公司，已经采用一种“迷你座位”方法。在迷你座位方法中，通过包含来自Ig座位的单个基因来模仿外源性Ig座位。因此，一个或更多的VH基因、一个或多个DH基因、一个或果个JH基因、μ-恒定结构域、及第二恒定结构域(优选为γ-恒定结构域)形成构件体，以嵌入动物体中。这种方法在下列专利中有描述：
授予Surani等人的美国专利5,545,807和授予Lonberg和Kay的美国专利Nos.5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458，；授予Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和6,023.010；授予Berns等人的美国专利Nos.5,612,205、5,721,367和5,789,215和授予Choi和Dunn美国专利No.5,643,763；和GenPharm国际的美国专利申请序列号07/574,748，1990年8月29日申请、07/575,962，1990年8月31日申请、07/810,279，1991年12月17日申请、07/853,408，1992年3月18日申请、07/904,068，1992年6月23日申请、07/990,860，1992年12月16日申请、08/053,131，1993年4月26日申请、08/096,762，1993年7月22日申请、08/155,301，1993年11月18申请、08/161,739，1993年12月3日申请、08/165,699，1993年12月10日申请、08/209,741，1994年3月9日申请，各个上述引用的公开内容在此通过引用纳入到本文中。也见欧洲专利No.0546073B1，国际专利申请Nos.WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884及美国专利No.5,981,175；上述引用的公开内容在此通过引用整体纳入到本文中。
Kirin也描述过小鼠中人类抗体的产生，在其中通过微细胞融合，大片段的染色体或整个染色体被导入。参见欧洲专利申请Nos.773,288和843,961，其公开内容在此通过引用结合到本文中。可选的KMTM-小鼠也已产生，它是Kirin的Tc小鼠与Medarex的迷你座位(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的转染色体HC和转基因Medarex小鼠的κ-轻链(Ishida等人，Cloning Stem Cells，(2002)4：91-102)。
人类抗体也可以通过体外方法衍生。合适的实例包括(但不限于)：噬菌体展示(由Cambridge Antibody Technology、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(以前叫Proliferon)、Affimed商业化)、核糖体展示(由Cambridge Antibody Technology商业化)、酵母展示等等。
文本中所述的抗体，通过利用技术制备，描述如下。这种小鼠能够产生人类免疫球蛋白分子和抗体，但是缺乏产生鼠源免疫球蛋白分子和抗体的能力。实现同样的目的利用的技术在文本的背景技术部分公开的专利、专利申请和文献中公开。不过，特别指出。一个产生转基因小鼠及从其中产生抗体的优选实施方案公开于美国专利申请序列No.08/759,620，申请于1996年12月3日，和公开于1998年6月11日的国际专利申请No.WO 98/24893和公开于2000年12月21日的国际申请专利No.WO 00/76310，其引用的公开内容在此通过引用纳入本文中。也可参见Mendez等人的Nature Genetics15：146-156(1997)，其公开的内容在此通过引用纳入到文本中。
通过使用此技术，产生了针对一系列抗原的完整的人类单克隆抗体。实质上，
Figure BDA0000048852290000231
系小鼠用感兴趣的一种抗原(如HER-3)免疫，从表达抗体的小鼠中重新获得淋巴细胞(如B细胞)，然后获得的细胞系与骨髓类细胞系融合，制备成永生化杂交瘤细胞系，其能够产生针对感兴趣抗原的特异抗体。本文提供的是用产生抗HER-3特异性抗体的多种骨髓瘤细胞系的生产方法。此外，本文还提供表征这类细胞株产生的抗体的方法，包括这些抗体重链和轻链的核苷酸及氨基酸序列的分析。
一般说来，通过融合的杂交瘤细胞产生的抗体是人类IgG1重链和完整的人类κ-轻链。这里描述的抗体具有人类IgG4重链和IgG1重链。抗体也可以是其他的人类同种型，包括IgG2和IgG3。在用固相和基于细胞的技术测定时，这些抗体具有高亲和力，典型的具有从大约10-6到大于10-13M或以下的KD值。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的结合蛋白的一种分离的核酸分子。在本发明的文本中使用的术语“分离的核酸分子”系指基因组、cDNA或合成的多核苷酸或其某些组合，根据其来源，“分离的核酸分子”(1)不与其中天然发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分结合，(2)与原本非天然联结的多核苷酸进行可操作性连接，或(3)不会在自然界中以较大序列的一部分出现。此外，本文中使用的术语“核酸分子”系指长度上至少是10个碱基的核苷酸聚合体形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一核酸类型的修饰形式，例如含有修饰的或替代的糖基团以及诸如此类的核酸。该术语也包括单链或双链形式的DNA。
在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸分子操作性连接到一段控制序列上。本文中所使用的术语“控制序列”指其连接的编码序列为了进行表达及处理而必须的多核苷酸序列。此类控制序列的性质差异依宿主生物体而定。在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位置、及转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子与转录终止序列。根据本发明，术语“控制序列”应至少包括所有为了表达与加工处理必要的成分，也可包括其他有益的成分，例如：前导序列与融合对象序列(fusion partner sequence)。此外，文本中使用的术语“可操作性连接”系指所述元件的位置与允许它们以预期方式发挥功能有关系。此外，根据本发明，表达控制序列可操作性连接到一段编码序列是以表达此编码序列的方式连接的，在与表达控制序列相容的条件实现。
本发明的另一个方面是含有编码本发明结合蛋白核酸分子的载体。此核酸分子能够可操作性连接到一段控制序列。此外，载体可能还含有一个复制起点或一个选择标记基因。根据本发明可以使用的载体的实例是：质粒、柯斯质粒(cosmid)、噬菌体、病毒等等。
本发明的另一个方面涉及用本发明的质粒或核酸分子转化的宿主细胞。转化可以用任何熟知的将多核苷酸导入宿主细胞中的方法实现，包括例如：将多核苷酸包装在病毒中(或在病毒载体)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者用本领域熟悉的转染程序，如美国专利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455所示例。这些专利在此处通过引用结合到本文中。特别指出，将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域熟悉的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、在脂质体中包装该多核苷酸和直接将DNA注射入细胞核。根据本发明可使用的宿主细胞的实例是杂交瘤真核细胞如哺乳动物细胞，例如：仓鼠、兔、大鼠、猪、小鼠或其他哺乳动物细胞；植物细胞和真菌细胞，例如玉米、烟草、酿酒酵母、毕赤酵母；原核细胞如大肠杆菌；以及本领域用来抗体生产的其他细胞。尤其是，可用作表达宿主的哺乳动物细胞株是本领域熟知的，包括许多永生性的细胞株，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，包括(但不限于)中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(如HepG2)和许多其他细胞株。
本发明的另一方面是一种作为有效成分的药物组合物，其包括本发明的至少一种结合蛋白与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。文本中使用的术语“药物组合物”系指当正确对患者给药时能诱导期望的治疗效果的化合物或组分(The McGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms，Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985)，此处通过引用结合到本文中)。根据本发明，本发明药物组合物的效力是基于至少一种结合蛋白与HER-3的结合。优选的，这种结合导致HER-3介导的信号转导的降低。
此外，本文所使用的术语“载体”，包括载体、药用辅料或者在使用的剂量和浓度下将细胞或哺乳动物暴露于其中无害的稳定剂。通常生理可接受的载体是一种水溶性pH缓冲溶液或脂质体(由各种脂类、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡，对药物释放到哺乳动物中有用)。生理可接受载体的实例包括缓冲液如磷酸、柠檬酸和替他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子(少于十个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，多糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇和山梨醇；形盐平衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如吐温(TWEENTM)、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
在本发明的一个实施方案中，包含在药物组合物中的本发明的至少一种结合蛋白偶联到一个效应基团，例如加里刹霉素、Auristatin-PE、放射性同位素或有毒的化疗试剂如geldanamycin和美登素。特别的，这些结合蛋白的偶联物在表达HER-3的目标细胞(例如癌细胞)，有利于其消除的。
此外，本发明的结合蛋白连接上放射性同位素，例如，对肿瘤的治疗提供了优势。与化疗或其它癌症治疗的方式不同，放射免疫治疗或给药放射性同位素结合蛋白的组合直接针对癌细胞，对周围正常健康的组织伤害最小。利用这种“魔力子弹”，患者可以用与当今可获得的其他治疗形式相比非常少量的放射性同位素来治疗。优选的放射性同位素包括钇90(90Y)、铟111(111In)、131I、99mTc、放射性银-111、放射性银-199、和Bismuth213。同位素与本发明结合蛋白的连接可以，例如用传统的双功能螯合剂操作。因为银是单价的，对于放射性银-111和放射性银-199的连接，基于硫的接头可以被使用(Hazra等人，Cell Biophys.24-25，1-7(1994))。银同位素的连接可能包括用抗坏血酸减少免疫球蛋白。此外，tiuxetan是一种MX-DTPA接头螯合剂，连接到ibritumomab形成了ibritumomab tiuxetan(Zevalin)(Witzig，T.E，Cancer Chemother.Pharmacol.48 Suppl 1，91-5(2001)。Ibritumomab tiuxetan能够与同位素如铟111(111In)或90Y反应，分别形成111In-ibritumomab tiuxetan和90Y-ibritumomabtiuxetan。
此外，本发明的结合蛋白，特别是当用于治疗癌症时，可以结合上有毒的化疗药物如加里刹霉素(Hamann等人，Bioconjug.Chem.13(1)，40-6(2002)、geldanamycin(Mandler等人，J.Natl.CancerInst，92(19)，1549-51(2000))和美登素，例如美登素类药物DM1(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：8618-8623(1996))。在酸性或还原的条件下或暴露于特异蛋白酶中时，释放药物的不同接头可通过此技术被使用。根据本发明，本发明的结合蛋白可以按照本领域描述的方法被结合。
例如，Auristatin-PE，一种抗微管试剂，是海洋无壳类软体动物肽类组分dolastatin 10的一种结构修饰物。Auristatin-PE具有抗肿瘤活性和抗肿瘤血管活性(Otani等人，Jpn.J.Cancer Res.91(8)，837-44(2000))。例如，Auristatin-PE在胰腺癌细胞株中抑制细胞生长并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡(Li等人，Int.J.Mol.Med.3(6)，647-53(1999))。相应的，为了特异地将auristatin-PE抗肿瘤活性和抗肿瘤血管活性导向特异的肿瘤，auristatin-PE可能被结合到本发明的结合蛋白上。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包括至少一种另外的活性成分。根据本发明可被使用的另外的活性成分的实例是抗体或者是其他受体蛋白激酶(例如EGFR、HER-2、HER-4、IGFR-1)的低分子量的抑制剂、或c-met、受体配体如血管内皮生长因子(VEGF)、细胞毒试剂如阿霉素、顺式二胺二氯铂或卡铂、细胞因子、细胞因子或抗肿瘤药物。许多抗肿瘤剂是本领域当前熟知的。在一个实施方案中，抗肿瘤剂选自有疗效的蛋白质群组，包括(但不限于)抗体或免疫调节蛋白。在另一个实施方案中，抗肿瘤剂选自小分子抑制剂或化疗药物组成的群组，包括有丝分裂抑制剂、激酶抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、嵌合抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂、抗存活试剂、生物应答修饰剂、抗荷尔蒙、例如抗雄激素、抗血管生成剂。当抗肿瘤试剂是放射物时，治疗可通过内源(近距离放射疗法：BT)或外源(外放射治疗：EBRT)实现。
发明的药物组分特别适用于诊断、预防或治疗增殖性疾病。此增殖性疾病可以是，例如：与HER家族信号传导增强相关的。特别是，这类疾病可以与HER-3磷酸化程度提高、HER-3与HER家族其他成员之间复合物形成程度提高或与PI3-激酶增强和/或c-jun-末端激酶活性和/或AKT活性增强和/或ERK2活性和/或PYK2活性的提高有关。优选的是，增殖性疾病选自下列组成的群组：乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、睾丸癌、软组织肉瘤、头颈部癌、其他表达或过表达HER-3的癌症以及肿瘤转移形成。
根据本发明，本文所使用的术语“预防或治疗”系指药物治疗和防治或预防措施，其中有需要的患者预防或减缓(减弱)目标性的病理状态或机能失调。有需要的预防或治疗的患者包括那些已经出现机能失调的和那些有机能失调倾向的或那些机能失调可被预防的患者。需要预防或治疗的患者是哺乳动物患者，也就是归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物、动物园的动物、比赛用的动物和宠物，如狗、猫、绵羊、马、绵羊、猪、山羊、兔等等。优选的，有需要的动物是人类患者。
根据本发明，本发明的药物组合物可以通过将活性剂与生理可接受载体、稀释剂和/或佐剂、以及任选的常包括在配方中的其他成分(用于提供改进的转移、释放、耐受等等)混合来配制。本发明的药物组合物可以配置成例如：冷冻配方形式、水溶液、分散剂或固体制剂，如药片、糖衣丸或胶囊。许多合适的配方可在所有药学家熟知的处方集中找到：Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，MackPublishing Company，Easton，PA(1990))，特别是其中Block，Lawrence编写的第87章。这些配方包括，例如：粉末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂类、含颗粒的(阳离子或阴离子型)脂类(如LipofectinTM)、DNA偶联物、无水吸附糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳化蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体胶以及含有碳化蜡的半固体混合物。根据本发明，任意前面的混合物在处理和治疗中是合适的，只要配方中的活性成分不会因配方失活，并且配方的给药方式也是生理相容和耐受的。也可参见Baldrick P.，″Pharmaceuticalexcipient development：the need for preclinical guidance.″，Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)，210-218(2000)；Wang W.，″Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals.″，Int.J.Pharm.203(1-2)，1-60(2000)；Charman W.N.，″Lipids，lipophilic drugs，and oral drugdelivery-some emerging concepts.″，J.Pharm.Sci.89(8)，967-978(2000)；Powell等人，″Compendium of excipients forparenteral formulations″，PDA J.Pharm.Sci.Technol.52，238-311(1998)；文本中所引用的与配方、辅料和载体相关的附加信息是药物化学家熟知的。
本发明的另一个方面涉及到本发明的至少一种分离的结合蛋白和任选的至少一种其他的活性组分，例如，至少一种上面描述的抗肿瘤药物与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂混合，用于生产用于诊断、预防和治疗过增殖性疾病的药物组合物种的用途。任选的，该药物组合物是上面描述的药物组合物，该过增殖性疾病是上面提及的一种过增殖性疾病。
本发明的另一方面是关于诊断疾病的方法或与HER-3表达相关的条件，包括将样品与含有本发明结合蛋白的样品接触和检测样品中HER-3的存在。此样品可以是表达HER-3的细胞，如肿瘤细胞，血样，或者其他合适的样品。在本发明的一个优选实施方案中，与HER-3表达相关的疾病或条件是上面定义的过增殖性疾病。
根据本发明，这种方法可以，例如：用于细胞中HER-3抗原的检测、用于测定患有上述过增殖性疾病的患者的HER-3抗原的浓度或患者身上过增殖性疾病的分期。为了在研究目标中分期过增殖性疾病的发展，或为了定义研究受试者对治疗阶段的反应，血液的样品可以，例如取自该受试者，样品中存在的HER-3抗原的浓度也被测定。所得到的浓度用于鉴别在浓度的哪个范围数值下降。所鉴别的范围与发展的阶段或与在诊断对象的各种人群中鉴定的治疗阶段相关，因此在研究对象中提供一个阶段。疾病(如癌症)的活体检查，取自于患者的组织也可用来评估HER-3抗原提呈的数量。疾病组织中HER-3抗原提呈的数量可以用本发明的HER-3抗体进行通过免疫组化、ELISA或抗体分析来评价。诊断感兴趣的其他参数是二聚体状态和HER-3蛋白二聚体的配体以及它和其配体的活化状态。测定这些参数的蛋白质分析方法是本领域熟知的，其中western blot和免疫共沉淀技术、FACS分析、化学交联、生物发光共振能量转移(BRET)、荧光共振能量转移(FRET)等等(例如：Price等人，Methods in Molecular Biology，218：255-268(2002)或the eTag technology(WO0503707，WO04091384，WO04011900)。
此外，本发明的另一方面涉及到在患者身上预防或治疗与HER-3表达相关疾病或状况的方法，包括对有需要的患者给药有效量的至少一种本发明的结合蛋白。优选的，与HER-3表达相关的疾病或状况是上面定义的过增殖性疾病。本发明的需要预防或治疗的患者是哺乳动物患者，也就是归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物、动物园的动物、比赛用的动物和宠物，如狗、猫、绵羊、马、羊、猪、山羊、兔等等。优选的，有需要的动物是人类患者。
在本发明的一个优选实施方案中，在有需要的患者身上预防或治疗过增殖性疾病的方法包括：对患者给药有效量的本发明的至少一种结合蛋白以及加上至少一种其他的有效成分，例如至少一种上面提及的抗肿瘤剂。优选的是，本方法用于抑制不正常的细胞生长、迁移或侵袭。
除了潜在的结合蛋白疗法的给药的经典模式，例如通过上面提到的模式，根据本发明，新发展的给药形式也是有用的。例如，用131I标记的单克隆抗体局部给药用于外科切除后的原发性脑瘤治疗已被报道。此外，直接的立体定向脑内注射单克隆抗体及其片段也在临床或临床前研究。用偶联有人类单克隆抗体的药物进行颈动脉高渗灌注是针对原发性脑恶性肿瘤的一种实验策略。
取决于被治疗患者的类型和状况的严重程度，大约1μg/kg到15mg/kg本发明的至少一种结合蛋白可以给药于有需要的患者，例如：通过一次或多次独立的给药或持续输注。典型的每日剂量在约1μg/kg至100mg/kg范围内或更高，取决于上面提到的因素。对超过几天或更长时间的重复给药，取决于被治疗患者的状态，治疗一直持续到疾病症状发生了理想的减轻。
至少一种的抗肿瘤剂的给药剂量取决于一系列因素。例如，药物的性质、肿瘤类型或是给药的途径。必须强调的是本发明不限于任何剂量。
最后，本发明的另一方面涉及用于诊断、预防和治疗与HER-3介导的信号转导相关的过增殖性疾病的试剂盒，其包括至少一种本发明的结合蛋白和/或核酸分子和/或载体。此外，本发明的试剂盒可以进一步包含至少一种其它的活性剂，例如：至少一种上述提及的其他抗肿瘤剂。
本发明将通过以下的实例和所附的图作进一步说明。
下列实施例，包括开展的实验和获得的结果，仅是用作说明目的，不能理解为限于本发明。
域(ECD)的cDNA，其中用基于HER-3序列(Genebank提交号码NM_001982)的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)从pcDNA3-HER-3(含有全长的人类HER-3的表达载体，C.Wallasch等，EMBO J.14，4267-4275)获得。
用于扩增HER-3的引物如下：
正向引物：5′-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3′(SEQ ID NO：233)
反向引物：5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAACAGTCTTG-3′(SEQ ID NO：234)
PCR产物用BamHl和XbaI消化，然后连入用BamHl和XbaI消化的pcDNA3(Invitrogen)。通过磷酸钙方法将质粒转染入HEK293细胞。通过Ni-NTA亲和层析从收获条件的培养基中纯化HER-3-HIS融合蛋白。
Ratl HER-3细胞通过反转录病毒基因转移获得。简要地说，GP+E86细胞(3×105个)接种于60毫米培养盘然后通过磷酸钙方法用2μg/ml pIXSN载体或pIXSN-HER-3cDNA(C.Wallasch，PhD Thesis，Max-Planck Insitute of Biochemistry，Martinsried，德国)转染。24小时后换成新鲜培养基，培养GP+E 86细胞4至8小时。在凝聚胺(4mg/ml；Aldrich)的存在下，近汇合Rat1细胞(每个6厘米盘含2×105个细胞)然后与释放高滴度pLXSN或pLXSN-HER-3，p病毒C的GP+E86细胞的上清孵育4至12小时。在更换培养基后，开始用G418选择Rat1细胞。通常，稳定的克隆在21天后被挑选到。
实施例2：HER-3在人癌细胞株中的表达。
受体酪氨酸激酶，例如HER-3，在过增殖性疾病的起始和发展中(例如从良性增生性细胞生长转变为恶性肿瘤)起着决定性的作用。因为HER-3的表达在肿瘤细胞和正常细胞中不同，所以HER-3表达的分析是鉴定那些将获益于用本发明的结合蛋白治疗的患者亚群的一个重要因子。因此，定量HER-3在一组癌细胞株的表达可阐明HER-3在人类癌症发生中的作用。癌细胞株用ATCC推荐的条件培养。详细地说，105个细胞用PBS中的10mM EDTA收集，用FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化物)清洗一次，然后接种于圆底96孔板。细胞用1000rpm离心3分钟移除上清，然后重悬于α-HER-3抗体2D1D12(WO03013602)(3μg/ml)。细胞悬液在冰上孵育1小时、用FACS缓冲液清洗两次，然后重悬于用FACS缓冲液按1∶50稀释的驴抗人-PE二抗(100μl/孔)。细胞悬液在冰上和黑暗中孵育30分钟，用FACS缓冲液清洗两次，然后分析(FACS，Beckman Coulter)。图1表示的是分析的代表性结果，表明HER-3在一系列人类癌症中表达。
实施例3：免疫和效价测定
实施例1中所述的HER-3ECD蛋白和C32细胞(人类黑色素瘤，ATCC #CRL-1585)中制备用作抗原。抗HER-3单克隆抗体通过连续免疫
Figure BDA0000048852290000321
小鼠(
Figure BDA0000048852290000322
株：XMG1和XMG4，Abgenix，Inc.Fremont，CA)获得。
Figure BDA0000048852290000323
动物通过足跖途径注射免疫。每次注射的总量是每只小鼠50μl，每个足跖25μl。
对于群组#1(10XMG1小鼠)而言，每只小鼠最初的免疫是用10μg的HER-3ECD蛋白与TITERMAX
Figure BDA0000048852290000324
(Sigma，Oakville，ON)的混合物(体积比1∶1)。接下来的5次加强免疫用10μg的HER-3ECD蛋白与100μg明矾凝胶(Sigma，Oakville，ON)的混合物(体积比1∶1)。第6次加强免疫由10μg的HER-3ECD蛋白与TITERMAX
Figure BDA0000048852290000325
按1∶1(体积比)组成。第7次注射由10μg的HER-3ECD蛋白与100μg明矾凝胶按1∶1(体积比)组成。最后一次加强用无热源DPBS中的10μg HER-3ECD蛋白，不含免疫佐剂。按此程序，
Figure BDA0000048852290000331
小鼠在第0、4、7、11、15、20、24、和29天被免疫，在第33天融合。两次取血是在在第13天第四次加强免疫后通过眼球后取血程序和在第19天第六次加强免疫后。没有群组#2。
对于群组#3(10 XMG1小鼠)和群组#4(10XMG4小鼠)，每只小鼠第一次注射是用无热源的Dulbecco’s PBS(DPBS)中的107个C32细胞与TITERMAX按1∶1(体积比)混合。接下来的四次加强免疫每只小鼠是用无热源的DPBS中的107个C32细胞与25μg的Adju-Phos和10μg CpG的混合物。第六次加强免疫每只小鼠是用无热源的DPBS中的107个C32细胞与TITERMAX
Figure BDA0000048852290000333
按1∶1(体积比)混合。第七次、八次、九次加强每只小鼠是用无热源的DPBS中的107个C32细胞与25μg的Adju-Phos和10μg CpG的混合物。第十次到第十四次加强每只小鼠是用无热源的DPBS中5μg HER-3ECD蛋白与25μg的Adju-Phos和10μg CpG的混合物。最后一次加强由无热源的DPBS中5μg HER-3ECD蛋白组成，不含免疫佐剂。群组#3和群组#4的
Figure BDA0000048852290000334
小鼠在第0、3、7、11、14、17、21、24、28、33、35、38、42和45天按此程序被免疫，融合在第49天实施。三次取血是在第12天第四次加强免疫后通过眼球后取血程序和在第19天第六次加强后和第40天第12次加强后。
通过滴度选择收获抗体的动物。
对于群组1，抗HER-3抗体在免疫的
Figure BDA0000048852290000335
小鼠血清中的滴度通过抗HER-3ECD蛋白ELISA实验测定。每种
Figure BDA0000048852290000336
动物的特异效价通过650nm的光密度测定，其结果如下表1所示。滴度值是OD读数二倍于背景的血清最大稀释度的倒数。因此，该数值越大，对HER-3 ECD的体液免疫越强。
表1群组#1，XMG1
Figure BDA0000048852290000341
对于群组#3和#4，抗HER-3抗体在免疫的
Figure BDA0000048852290000342
小鼠血清中的滴度用Rat1/HER-3细胞(抗原阳性细胞株)和Rat1/pLSXN细胞(抗原阴性细胞株)通过FACS测定。数据用一系列稀释的血清样品染色的抗HER-3细胞的几何平均(GeoMean)荧光强度表示。
表2
群组#3.XMG1
Figure BDA0000048852290000343
Figure BDA0000048852290000351
表3
群组#4.XMG4
Figure BDA0000048852290000361
实例4：淋巴细胞的回收，B细胞分离、融合和杂交瘤细胞的产生。
处死免疫的小鼠，收集和合并每个群组的淋巴结。在DMEM中研磨淋巴细胞使其解离并从组织中释放出细胞，该细胞悬浮于DMEM。计数细胞，按每1亿个淋巴细胞0.9ml DMEM加入到细胞沉淀，温和并充分地重悬细胞。按每1亿个细胞使用100μl CD90+磁珠，该细胞通过与磁珠在4℃孵育15分钟被标记。含有达到108个阳性细胞(或总数达到2×109个细胞)的磁标记的细胞悬液被加载到LS+柱上，并用DMEM淋洗柱子。所有的流出液均被收集作为CD90阴性部分(大多数这类细胞预期是B细胞)。
融合操作是将上面淋洗富集的B细胞和非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(购自ATCC，目录号CRL 1580)(Kearney等，J.Immunol.123，1979，1548-1550)按照1∶1混合。细胞混合物通过800g离心温和地离心沉淀。经完全移除上清后，细胞用2至4ml的链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，目录号53702，0.5mg/ml溶于PBS)处理2分钟。然后加入3至5ml FBS终止酶活性，上清用电细胞融合溶液，ECFS(0.3M蔗糖，Sigma，目录号S7903，0.1mM醋酸镁，Sigma，目录号M2545，0.1mM醋酸钙，Sigma，目录号C4705)调整到总体积为40ml。离心移除上清，然后将细胞重悬于40ml ECFS。这一清洗步骤重复一次，然后细胞重悬于ECFS使浓度为2×106个细胞/ml。
电细胞融合通过融合发生器(model ECM2001，Genetronic，Inc.，San Diego，CA)操作。所用的融合室尺寸是2.0ml，通过以下仪器设定值：调整条件：电压：50伏，时间：50秒；细胞膜破裂：电压：3000伏，时间30微秒；融合后持续时间：3秒。
电融合后，在无菌条件下小心移除细胞悬液，然后转移到一个无菌管，其中含有相同体积的杂交瘤培养培养基(DMEM(JRHBiosciences)，15％FBS(Hyclone)，添加由L-谷氨酰胺、pen/strep、OPI(草酰乙酸，丙酮酸，牛胰岛素)(均来自Sigma)和白介素-6(Boehringer Mannheim)。这些细胞在37℃下培养15至30分钟，然后400g离心5分钟。这些细胞轻轻地重悬于小体积的杂交瘤选择培养基(杂交瘤培养基添加0.5×HA(Sigma，目录号A9666)，基于最终的每个96孔板总共有5×106个B细胞以及每个孔为200μl用更多的杂交瘤选择培养基恰当地调整体积，。这些细胞被轻轻混匀然后加入到96孔板中使其生长。7或10天左右，移除一半培养基，细胞用杂交瘤选择培养基继续喂饲。
实施例5：通过ELISA筛选候选抗体
经过14天的培养，群组#1(群组1中的小鼠被随机分为融合#1和#2)杂交瘤细胞上清中HER-3特异的抗体可采用纯化的带his-标签的HER-3ECD通过ELISA进行初筛，并通过使用山羊抗hulgGFc-HRP(Caltag Inc.，目录号H10507，使用浓度按1∶2000稀释)的ELISA进行针对不相关的his-标签蛋白的反筛选，以检测人类IgG与固定在ELISA平板上的HER-3 ECD的结合。根据初筛结果，阳性杂交瘤细胞生长的旧的培养基上清被移除，HER-3阳性杂交瘤细胞用新鲜的杂交瘤培养基悬浮，然后转移到24孔板。培养两天后，这些上清已经为第二次确定筛选准备好。在第二次确定筛选HER-3特异的完整人类IgGk抗体，第一次的阳性细胞通过ELISA进行筛选，采用两套检测抗体：山羊抗hulgGFc-HRP(Caltag Inc.，目录号H10507，使用浓度按1∶2000稀释)来检测人类γ-链，山羊抗hlgκ-HRP(SouthernBiotechnology，目录号2060-05)来检测人类κ轻链。从群组#1中共产生了91种人类IgG/κHER-3特异的单克隆抗体。
实施例6：用FMAT/FACE选择候选抗体
经过14天的培养，群组#3和#4(融合#3和#4)杂交瘤的上清通过FMAT来筛选HER-3特异的单克隆抗体。在第一轮筛选中，杂交瘤上清以最终1∶10的稀释度与表达人HER-3的Rat1-Her3细胞和400ng/ml Cy5偶联的山羊F(ab′)2抗人IgG、Fc特异的抗体(JacksonImmunoResearch，目录号109-176-098)在室温下孵育6小时。抗体以及检测抗体复合物与细胞的结合用FMAT(Applied Biosystems)测定。抗体与细胞的非特异结合可通过其与亲本Rat1细胞的结合来检测。总共420株产生HER-3特异抗体的杂交瘤选自融合#3的第一轮筛选。这些扩大培养物的上清用同样的FMAT方法检测，其中262株被证实能特异地结合表达HER-3的细胞。总共193株产生HER-3特异抗体的杂交瘤选在融合#4的第一轮筛选。这些扩大培养物的上清用FACS测定，其中138株被证实能特异地结合表达HER-3的细胞。在FACS证实分析中，Rat1-Xher3细胞和亲本Rat1细胞(用作阴性对照)与杂交瘤上清(按1∶2稀释)在含2％FBS的PBS中在40℃下孵育1小时。在用PBS清洗后，抗体与细胞的结合用2.5μg/ml的Cy5偶联的山羊F(ab′)2抗人IgG、Fc特异的抗体(JIR#109-176-098)及5μg/ml PE-偶联的山羊F(ab′)2抗人κ-特异的抗体(SB#2063-09)检测。用PBS清洗移除未结合的抗体，然后用1∶4稀释的cytofix(BD#51-2090KZ)固定细胞，用FACS Calibur分析细胞。
实施例7：用于克隆的杂交瘤的选择
选择来源于群组1和2的抗体用于杂交瘤克隆，其基于用纯化的重组胞外蛋白结构域(如可从R&D Biosystems获得)在ELISA中HER-3对HER-1(EGFR)，HER-2和HER-4的特异性；FACS分析表达不同HER家族成员的人类肿瘤细胞株；HER-3阳性细胞在FACS染色中有一次平均荧光强度增加超过背景5倍以上。基于这些标准，采用有限稀释法细胞植板选出总共23株杂交瘤用于克隆。
来源于群组3和4的抗体用于选择杂交瘤克隆，其基于HER-3对HER-1(EGFR)，HER-2和HER-4的特异性和另外3个标准。第一个标准是用含有HER-3 L2结构域中的表位通过ELISA筛选抗体(见本发明实施例“抗HER-3抗体的结构分析”)。
第二个标准是，在基于FACS的分析中，生物素标记的调蛋白-α与表达HER-3的细胞结合的中和。收集SKBR-3细胞、用培养基清洗、离心沉淀后用培养基悬浮。重悬的细胞平均分装到96孔细胞板。离心该细胞板使细胞沉淀。按每孔25μl的量加入倒出的杂交瘤上清中的实验抗体，在冰上孵育1小时使抗体结合。每孔加入50μl 10nM的调蛋白-α(R&D Biosystems，Minneapolis，MN)溶液，使终浓度为5nM，然后冰上放置1.5小时。用150μl PBS清洗细胞，离心沉淀细胞，去除上清。细胞重悬于50μl的山羊抗-HRG-α多克隆抗体，使其浓度为10μg/ml，冰上孵育45分钟。用200μl PBS清洗细胞，离心沉淀细胞，去除上清。加入50μl Cy5标记的兔抗山羊多抗(终浓度为5μg/ml)和7AAD(终浓度为10μg/ml)，冰上孵育15分钟。用2001PBS清洗细胞，离心沉淀细胞，去除上清。细胞重悬于100μl FACS缓冲液，用FACS读数。与调蛋白-α结合力下降的测试HER-3抗体是那些具有最低荧光强度的。按1∶5梯度稀释的从10,000ng/ml至16ng/ml的小鼠HER-3单抗(105.5)或人IgG1 HER-3单抗U1-49被用作阳性对照。阴性对照是单独的调蛋白-α、单独的细胞、单独的山羊抗调蛋白-α多克隆抗体和单独的Cy5-标记的兔抗山羊多克隆抗体。
第三个标准是：用表达HER-3的细胞系进行FACS，其亲和力的相对排序和/或较高的相对平均荧光强度。亲和力相对排序的操作是标准化HER-3特异抗体的浓度和对从下面限制抗原的ELISA得到的数据作图。
用高抗原ELISA标准化抗原特异的抗体浓度
运用ELISA方法标准化上清中抗原特异的抗体浓度。利用群组1中已知浓度的两个抗-HER-3人类IgG1抗体进行平行的滴度实验，产生一条标准曲线。群组3和4中测定的杂交瘤上清中的抗原特异的抗体的数量可与标准曲线进行比较。按照这种方法，估算每组杂交瘤培养物中人类HER3 IgG抗体的浓度。
中性抗生物素蛋白板的制作是在Costar 3368培养基结合板上包被1×PBS/0.05％叠氮钠中8μg/ml的中性抗生素蛋白(50μl/孔)，并在4℃下孵育过夜。第二天，该平板用1×PBS/1％脱脂牛奶封闭。1×PBS/1％脱脂牛奶中500纳克/ml的光生物素his-标签-HER-3ECD通过室温孵育1小时与中性抗生物素蛋白平板结合。杂交瘤上清用1XPBS/1％脱脂牛奶/0.05％叠氮钠按1∶2.5进行梯度稀释，从开始的1∶31到最后的1∶7568，按50μl/孔添加，然后在室温下作用20小时。梯度稀释用来保证每个未知样品获得的OD读数在分析的线性范围内。接着，溶于1×PBS/1％脱脂牛奶中、400ng/ml的检测二抗山羊抗人IgG、Fc HRP按50μl/孔被加入。室温孵育1小时后，平板用水清洗5次，在每孔中加入50μl单组分的TMB底物。30分钟后，在每孔中加入50μl 1M盐酸终止反应，然后细胞板在波长450nm处读数。标准曲线产生自群组1中的两种IgG1 HER-3单抗，其按照1∶2从1000ng/ml到0.06ng/ml进行梯度稀释，然后用上面的方法通过ELISA来估算。对于每一个未知样品，分析过程中在线性范围内的OD读数被用来估算每组样品中人类HER-3IgG的浓度。
有限的抗原分析是制备自B细胞培养上清的抗原特异的抗体相对于所有其他抗原特异的抗体的亲和力排列的一种方法。当存在非常低的抗原包被时，只有最高亲和力的抗体能够结合于平衡时的任意可检测水平。(参考：例如PCT出版的WO/03048730A2，题目为″IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTIONSCREENING″，2003年6月12日出版)。在这种情况下，来源于群组1的已知浓度和已知KD的单抗，在分析中作为基准。
中性抗生物素蛋白板的制作是在Costar 3368培养基结合板上包被溶于1×PBS/0.05％叠氮钠的8μg/ml的中性抗生素蛋白(50μl/孔)，然后在4℃下孵育过夜。第二天，该平板用1×PBS/1％脱脂牛奶封闭。生物素标记的his-tagged-HER-3 ECD(50μl/孔)在1×PBS/1％脱脂牛奶中按5种浓度(125，62.5，31.2，15.6，and 7.8ng/ml)与96孔中性抗生物素蛋白板室温结合1小时。每块板用水清洗5次。用1×PBS/1％脱脂牛奶/0.05％叠氮钠按1∶31稀释的杂交瘤上清按50μl/孔加入。在振荡器上室温孵育20小时后，平板用蒸馏水清洗5次。接下来，按50μl/孔加入1×PBS/1％脱脂牛奶中的400ng/ml的检测二抗，山羊抗人IgG Fc HRP(辣根过氧化物酶)。室温作用1小时后，平板用蒸馏水清洗5次，在每孔加入50μl单组分TMB底物。30分钟后，在每孔中加入50μl 1M盐酸终止反应，然后细胞板在波长450nm处读数。从抗原浓度得到的OD读数所产生的在线性范围内的OD值用来数据分析。
用可相对估算特异的抗体浓度(详见上面)的高抗原数据对有限的抗原OD作图，来描述相对较高的亲和力的抗体，例如，当上清中具有较低量IgG HER-3抗体时，那些结合的抗体在有限的抗原分析中具有较高OD。
在这些分析中，来源于群组3和4的产生33种表现最佳抗体的杂交瘤通过有限稀释法杂交瘤植板被进一步克隆。
可选的是，Rat1/pLXSN和Rat1/HER-3细胞中HER-3表达的FACS分析表现出相似的结果(没有与内源大鼠表位的交叉反应)(图2)。
详细的步骤是，用含10mM EDTA的PBS收集1×105个细胞，用FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮盐)清洗一次，然后接种于96孔圆底平板。将这些细胞在1000rpm离心3分钟去除上清，然后重悬于特异的HER-家族抗体(3μg/ml)。细胞悬液在冰上孵育45分钟，用FACS缓冲液清洗两次，然后用FACS缓冲液按1∶50稀释的二抗(100μl/孔)驴抗人-PE(Jackson Immunoresearch，PA)重悬细胞。这些细胞悬液在冰上和暗处孵育30分钟，用FACS缓冲液清洗两次并分析(FACS，Beckman Coulter)。
实施例8：本发明的抗HER-3抗体的结构分析
下面的讨论中提供了本发明制备的抗体的相关结构信息。为了分析本发明产生的抗体结构，从特异的杂交瘤中扩增了编码重链和轻链片段的基因。如下完成测序：
通过反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，从96孔板中单独的杂交瘤克隆扩增出VH和VL转录本。用Fast-Track试剂盒(Invitrogen)从大约2×105个杂交瘤细胞分离Poly(A)+-mRNA。对每组杂交瘤细胞运行4组PCR反应：两组用于轻链(κ)，两组用于重链(γ)。QI AGEN公司的OneStep室温PCR试剂盒用于扩增(Qiagen，目录号210212)。在此偶联的室温PCR反应中，用对应于C-κ，或对应于Cγ基因CH1区域一致序列的反义序列的特异引物通过室温酶(Omniscript andSensiscript)的混合物合成出cDNA。50℃反应1小时完成反转录，接下来该cDNA用高特异和高灵敏的热启动Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。每个PCR反应使用的是混合的5′-正义引物，其序列是基于Vbase网址(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)中VH和VK的前导序列。
PCR反应的运行首先是在94℃下热启动15分钟，接着进行40循环：94℃，30秒(变性)，60℃，30秒(退火)和72℃，1分钟(延伸)。
纯化PCR产物，然后用正向和反向PCR引物，通过ABI PRISMBigDye terminator cycle sequencing ready reaction试剂盒(PerkinElmer)直接进行测序。两条链均用Prism dye-terminator测序试剂盒和ABI 377测序仪进行测序。
序列分析
HER3抗体的人类V重链和VκcDNA序列的分析通过使用自主研发的软件Abgnix5AS对HER-3序列与人类种系V重链和Vκ序列比对来完成。比对软件鉴定了V基因、D基因和J基因的使用以及重组接头处的核酸插入和体细胞突变。用计算机产生的氨基酸序列也用来鉴定体细胞突变。使用商品化的序列分析软件和公开可用的人类V、D和J基因的信息，例如：Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，获得了相似的结果。
单抗U1-59的分子克隆
从含有多个杂交瘤谱系(包括分泌抗体U1-59的杂交瘤谱系)的组织培养孔提取总RNA。用5′-leader VH家族引物和3′-C-γ引物扩增重链可变区。用VH4引物扩增出了一条主带，未见其他条带。VH4-34γ片段克隆到pCDNA表达载体的人类γ1恒定区基因读码框内。
用5′VH家族特异引物和3′mu恒定区引物扩增IgM重链可变区。用VH2引物扩增出一条主带，未见其它条带。VH2-5mu片段克隆到pCDNA表达载体的人类mu恒定区基因读码框内。扩增和测序Vκ链。鉴定了四条κ链RT-PCR产物。该产物经测序和分析计算机翻译的序列，其中3条序列含有开放阅读框。这3条有功能的κ链克隆到基于Vκ基因鉴定为(1)VK1A3-JK2，(2)VK1A20-JK3和(3)B3-JK1的寡克隆U1-59杂交瘤孔。所有Vκ克隆到pCDNA表达载体的人类κ轻链恒定区基因读码框内。
转染
转染每条重链和每条κ轻链，在瞬时转染中总共形成了6对重链/κ轻链。转染γ链和A20κ链产生了较差的抗体表达，当A20κ链与mu链共转化时，没有抗体分泌或没有检测到抗体。总共有3个IgG亚群和两个IgM亚群适用于HER-3结合分析。
  链   VH   D   J   恒定区   ORF
  重链   VH4-34   D1-20   JH2   γ   是
  重链   VH2-5   D6-6   JH4b   Mu   是
  轻链   A3   JK2   κ   是
  轻链   A20   JK3   κ   是
  轻链   B3   JK1   κ   是
  轻链   A27   JK3   κ   否
与HER-3阳性细胞株的结合活性用VH4-34和B3κ链组成的IgG1单抗通过FACS来检测。在用HER-3阳性细胞株进行FACS时，没有其他VH/Vκ组合产生超过背景的荧光信号。
抗HER-3抗体的结合竞争
实施发表文献Jia等人的J Immunol Methods.288，91-98(2004)中的Multiplexed competitive antibody binning来评价竞争结合HER-3的HER-3抗体的簇群。根据结合竞争，来源于群组1的实验HER-3抗体聚成5bins。
  Bin#1   Bin#2   Bin#3   Bin#4   Bin#5
  U1-42   U1-48   U1-52   U1-38   U1-45
  U1-44   U1-50   U1-39   U1-40
  U1-62   U1-51   U1-41
  U1-46   U1-43
  U1-47   U1-49   U1-61
  U1-58   U1-53
  U1-55
抗HER-3抗体的表位鉴定
鉴定了本发明中人类抗HER-3抗体的表位。首先，用测试的抗HER-3抗体(U1-59、U1-61、U1-41、U1-46、U1-53、U1-43、U1-44、U1-47、U1-52、U1-40、U1-49)进行点杂交分析了还原和变性的HER-3-His标签纯化的ECD蛋白，证明了所有表位对二硫键的还原敏感，表明都具有不连续表位。接着，通过工程化的各种人-鼠HER-3嵌合抗体，在HER-3分子上定位了抗体定义的结构域，基于HER-3胞外结构域分为四种结构域：
1)L1(D1)：次要配体结合结构域，
2)S1(D2)：第一个半胱氨酸富集结构域，
3)L2(D3)：主要配体结构域，和
4)S2(D4)：第二个半胱氨酸富集结构域。
人类HER-3胞外结构域(ECD)的cDNA扩增自RAT1-HER-3细胞。通过RT-PCR从鼠肝RNA中扩增大鼠HER-3cDNA，然后通过测序来确定。将表达人类ECD和大鼠Her3的cDNA克隆到哺乳动物表达载体形成V5-His融合蛋白。通过使用Mfel、BstXl和DraIII内源酶切位点，来自人类HER-3 ECD的结构域被置换入大鼠HER-3 ECD提供的支架蛋白中。通过这种方式，构建了各种嵌合型大鼠/人类HER-3 ECD HIS融合蛋白(1-160、161-358、359-575、1-358、359-604位氨基酸)，通过瞬间感染HEK293T细胞表达。用抗人类HER-3的大鼠单克隆抗体确定该构建的蛋白的表达。用ELISA来测试人类单克隆抗体与分泌的嵌合ECDs的结合。
两种人类抗体，包括抗体U1-59，与大鼠HER-3交叉反应。为了指定结合结构域，测定了这些单克隆抗体对HER-3的一种截短形式的抗体活性，其中，HER-3截短形式由L1-S1-V5 his标签的蛋白组成，其纯化于用编码HER3 L1-S1胞外结构域的质粒DNA转染的HEK 293T细胞的上清。在ELISA实验中，单抗U1-59结合于L1-S1蛋白，表明其表位在L1-S1。mAb2.5.1不结合至L1-S1蛋白、表明其表位位于L2-S2。通过使用SELDI时间飞行质谱和单抗-HER-3 ECD复合物的芯片上蛋白酶消化，完成了抗体U1-59的进一步定位。
利用SELDI定位U1-59表位
通过使用SELDI时间飞行质谱和单抗-HER-3ECD复合物的芯片上蛋白酶消化进一步定位U1-59抗体。A蛋白共价结合于PS20蛋白芯片阵列，用于捕获单抗U1-59。然后PS20蛋白芯片与单克隆抗体的复合物与HER-3-His纯化的蛋白孵育。接下来用高浓度的Asp-N消化抗体抗原复合物。洗涤芯片，结果在芯片上仅保留HER-3。通过SELDI测定表位，通过质谱鉴定片段。鉴定的6814D片段对应于部分消化HER-3-his ECD产生的两条可能期望的多肽。两条重叠的多肽都定位与S1结构域。通过结合SELDI和结果与构建的HER-3缺失体，将表位定位于251位至325位。
被本发明人类抗HER-3单抗所识别的HER-3胞外部分结合结构域的位置总结于表4。表位结构域的定位结果与抗体竞争结合bins得到的结果一致，相互交叉竞争结合HER-3的抗体也定位于HER-3上相同的结构域(图3)。
表4
基于ELISA分析结果的单抗结合结构域总结
Figure BDA0000048852290000461
XR＝交叉反应-反应
实施例9：典型抗体类别的测定
Chothia等人根据“典型类别”描述了抗体每条免疫球蛋白链超变区的结构(J.Mol.Biol.，1987 Aug 20，196(4)：901-17)。分析了许多免疫球蛋白的Fab和VL片段，确定了其氨基酸序列与其抗原结合位点的三维结构的关系。Chothia等人发现相对很少的残基通过其堆积力、氢键作用或采取不常见的phi，psi或omega构型，主要负责了高变区的主链构型。这些残基常被发现出现在高变区内的位点，位于保守的β-折叠框架内。通过观测具有未知结构的免疫球蛋白的序列，Chothia等人表明许多免疫球蛋白具有与一种已知结构的大小相似的高变区，而且，其还含有负责观测到的构型的位点的一致残基。
它们的发现表明这些高变区具有与已知结构的高变区相同的构象。对于5种高变区，构象库似乎被限于相对较小数量的分散的结构类别。这些在高变区常出现的主链构象称为“经典构象”。Chothia等人(Nature，1989 Dec 21-28，342(6252)：877-83)和其他人(Martin等人，J.Mol.Biol.，1996 Nov 15，263(5)：800-15)证实了有六种抗体高变区中至少五种主链构象的小库。
分析了上面描述的每种抗体的CDRs以决定其经典类别。众所周知，经典类别已被归为抗体重链的CDR1和CDR2连同抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3。下表总结了分析的结果。经典类别数据是以HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3的形式，其中“HCDR”是指重链CDR，“LCDR”是指轻链CDR。因此，例如，经典类别1-3-2-1-5是指某抗体具有一条HCDR1，属于经典类别1；一条HCDR2，属于经典类别3；一条LCDR1，属于经典类别2；一条LCDR2，属于经典类别1；一条LCDR3，属于经典类别5。
与定义每个经典类别的氨基酸具有70％或更高同一性的抗体，被归为特定的经典类别。定义每种抗体的氨基酸可以从例如上面参考的Chothia等人的文章中找到。表5和表6报道了每种HER-3抗体的经典类别数据。当同一性低于70％，此经典类别归类用星号(“*”)标记，表明已经基于每条CDR的长度和数据的整体性，对合适的经典类别做了最好的预测。当没有相同的CDR长度匹配的经典类别时，经典类别用字母s和数字标记，例如“s18”，意思是CDR的大小为18。当获取不到一条重链或轻链的序列数据时，该经典类别用“Z”标记。
表5
Figure BDA0000048852290000471
表7是每个类别抗体数量的分析。具有标在左栏中特定典型类别的抗体数量表示于右栏中。四种单克隆抗体缺少一条链序列数据，因此在典型归类中具有“Z”构象，它们不包括在本计算内。
最常见的结构是3-1-2-1-1：含有重链和轻链序列的41中单抗中的21种单抗具有这种组合。
表6
  H1-H2-L1-L2-L3   计数
  1-1-3-1-1   2
  1-1-4-1*-1   1
  1-2-2-1-1   4
  1-2-8-1-1   1
  1-3-2-1-1   3
  1-3-4-1-1   1
  3-1-2-1-1   21
  3-1-4-1-1   5
  3-1-8-1-1   2
  3-s18-2-1-1   1
实施例10：抗体亲和力的测定
用间接FACS Scatchard分析测定本发明的抗HER-3抗体的亲和力。为此，用含10mM EDTA的PBS收集105个感兴趣的细胞或SK-Br 3细胞，用FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮物)清洗后接种于96孔圆底细胞板。细胞用1000rpm离心3分钟去除上清，然后悬浮于α-HER-3抗体(3μg/ml)或悬浮于任何抗体稀释液(100μl/孔)，其开始为20μg/ml，然后按1∶2的步骤稀释。细胞悬液在冰上孵育1小时，用FACS缓冲液清洗两次，然后重悬于按1∶50稀释于FACS缓冲液的驴抗人-PE(Jackson)二抗(100μl/孔)。细胞悬液在冰上和暗处孵育30分钟，然后用FACS缓冲液清洗两次并分析(FACS，BeckmanCoulter)。根据FACS Scatchard分析，计算每次测量的荧光平均值。背景染色(无一抗)从每个荧光平均值中扣除。用x值＝荧光平均值和y值＝荧光平均值/单抗(nM)浓度来产生Scatchard绘图。KD被视为线性方程式的1/m的绝对值。图4显示了使用本发明的U1-59抗体的动力学分析。下表8给出了用该方法选择的本发明的某些抗体的亲和力测定。
表7
Figure BDA0000048852290000491
实施例11：本发明的抗HER-3抗体诱导了HER-3受体内吞
已经确定，HER-3通过作为HER家族介导的细胞信号转导的“看门人”，可以影响过增殖性疾病的发生和发展。因此，如果通过受体内化从细胞表面/细胞膜上有效地清除HER-3，就可以最终消除或阻止细胞信号转导及引起的转变和/或恶性肿瘤中细胞的维持。
为了研究本发明的抗HER-3抗体是否能够诱导HER-3内吞加速，比较了用本发明的抗HER-3抗体处理了0.5小时和4小时的细胞其表面HER-3分子的相对量。3×105个细胞接种于24孔盘中正常的培养基并让其过夜生长。细胞与10μg/ml的抗HER-3单抗在正常培养基中37℃预孵育指定的时间。用10mM EDTA分离细胞，然后在清洗缓冲液(PBS，3％FCS，0.04％叠氮化合物)与10μg/ml的抗HER-3单抗在4℃孵育45分钟。细胞用清洗缓冲液清洗两次，与按1∶100稀释的驴抗人-PE二抗(Jackson)在4℃孵育45分钟，用清洗缓冲液清洗两次后用FACS(BeckmanCoulter，EXPO)分析。
图5所示的数据表明用HER-3抗体处理细胞导致了受体内化。数据用内化百分率表示，指的是抗HER-3处理样品相对于对照处理样品的平均荧光强度的减少。
实施例12：用本发明的人抗HER-3抗体抑制配体与人类癌症细胞 SKBr3的结合
进行放射性配体竞争实验用于细胞分析中定量本发明的抗HER-3抗体抑制配体结合HER-3的能力。为此，HER-3受体结合实验的操作使用了4×105个SK-BR-3细胞，其与各种浓度的抗体在冰上孵育了30分钟。然后在每孔中加入1.25nM[125I]-α-HRG/[125I]-β-HRG，冰上孵育2小时。酶标板清洗5次，空气干燥后用液闪仪计数。图6a-e表示了用本发明代表性的抗HER-3抗体操作实验的结果，其表明本发明的抗体能够特异地降低[125I]-α-HRG/[125I]-β-HRG与表达内源HER-3的细胞的结合。
实施例13：用本发明的抗HER-3抗体抑制配体诱导的HER-3磷酸 化
进行ELISA实验来研究本发明的抗体是否能够阻断配体β-HRG介导的HER-3的激活。配体介导的HER-3的激活用增强的受体酪氨酸磷酸化检测。
第一天：1×96孔板用含20μg/mlI型胶原蛋白的0.1M醋酸在37℃包被4小时。接种2.5×105个细胞于正常培养基。
第二天：细胞在100μl不含血清的培养基中饥饿24小时。
第三天：细胞与10μg/ml的抗HER-3单抗在37℃提前孵育1小时，然后与30ng/ml β-HRG-EGF结构域(R&D Systems)作用10分钟。轻弹去除培养基，用含4％甲酰胺溶液的PBS在室温下固定细胞1小时。移除甲酰胺溶液，用清洗缓冲液(PBS/0.1 ％Tween 20)清洗细胞。用含1％H2O2，0.1％NaN3的清洗缓冲液quench细胞，在室温下孵育20分钟，然后用NET-Gelantine在4℃下封闭5小时。加入一抗phospho-HER-3(Tyr1289)(多克隆兔；Cell signaling #4791；1∶300)4℃作用过夜。
第4天：酶标板用清洗缓冲液清洗3次，然后在每孔中加入按1∶3000稀释于PBS-0.5％BSA的POD标记的抗兔抗，室温作用1.5小时。酶标板用清洗缓冲液清洗3次，用PBS清洗一次。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)并于650nm处监测。加入100μl 250nM HCl终止反应，使用Vmax酶标板读数器(Thermo Lab Systems)读数450nm处的吸光值，以650nm作为参考波长。
图7a表示了本实验的代表性结果，表明本发明的抗HER-3抗体能够降低配体介导的HER-3活化，表现为受体酪氨酸磷酸化的降低。数据以治疗性抗体相对于对照抗体的降低百分率表示。
为了测定单抗U1-53抑制配体诱导的HER-3活化的潜力，MCF-7细胞饥饿24小时后与单抗U1-53在37℃孵育1小时，然后用10nMHRG-β刺激10分钟。裂解物转移到1B4(小鼠抗HER-3单抗)ELISA板，用抗体4G10进行分析HER的磷酸化。如图7b所示，HER-3的磷酸化基本全部被抑制，并呈现剂量依赖关系(IC50为0.14nM)。
实施例14：本发明的人类抗-HER-3抗体抑制了配体诱导的 p42/p44 MAP-激酶磷酸化
接下来进行的ELISA实验是为了研究本发明的抗体是否能够阻断配体β-HRG介导的p42/p44 MAP激酶的活化。用增强的蛋白磷酸化(Thr202/Tyr204)检测配体介导的HER-3的活化。
第一天：1×96孔板用含有20μg/mlI型胶原蛋白的0.1M醋酸在37℃包被4小时。接种3×105个细胞于正常培养基。
第二天：细胞在100μl不含血清的培养基中饥饿24小时。
第三天：细胞与5μg/ml的抗HER-3单抗在37℃提前孵育1小时，然后与20ng/ml β-HRG-EGF结构域(R&D Systems)作用10分钟。轻弹去除培养基，用含4％甲酰胺溶液的PBS在室温下固定细胞1小时。甲酰胺溶液被移除，细胞用清洗缓冲液(PBS/0.1 ％Tween 20)清洗。用含1％ H2O2，0.1 ％ NaN3的清洗缓冲液quench细胞，在室温下孵育20分钟，然后用PBS/0.5％BSA在4℃下封闭5小时。加入一抗phospho-p44/p42 MAP激酶(Thr202/Tyr204)(多克隆兔；Cellsignaling #9101；1∶3000)4℃作用过夜。
第4天：酶标板用清洗缓冲液清洗3次，然后每孔加入按1∶5000稀释于PBS-0.5％BSA的HRP标记的抗兔抗体，室温作用1.5小时。酶标板用清洗缓冲液清洗3次，用PBS清洗一次。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)并于650nm处监测。加入100μl 250nM HCl终止反应，使用Vmax酶标板读数器(Thermo Lab Systems)读数450nm处的吸光值，以650nm作为参考波长。
图8表示了本实验的代表性结果。本发明的抗HER-3抗体能够降低配体介导的p42/p44 MAP激酶的活化，表现为磷酸化的降低。数据以治疗性抗体相对于对照抗体的降低百分率表示。
实施例15：用本发明的抗HER-3抗体抑制β-HRG诱导的 phospho-AKT磷酸化
在下面的ELISA实验中，我们研究了本发明的抗HER-3抗体是否能够阻断配体β-HRG介导的AKT激酶的活化。配体介导的AKT活化用增强的蛋白磷酸化(Ser473)检测。
第一天：1×96孔板用含有20μg/ml I型胶原蛋白的0.1M醋酸在37℃包被4小时。接种3×105个细胞于正常培养基。
第二天：细胞在100μl不含血清的培养基中饥饿24小时。
第三天：细胞与5μg/ml的抗HER-3单抗在37℃提前孵育1小时，然后与20ng/ml β-HRG-EGF结构域(R&D Systems)作用10分钟。轻弹去除培养基，细胞用含4％甲酰胺溶液的PBS在室温下固定1小时。移除甲酰胺溶液，用清洗缓冲液(PBS/0.1 ％Tween 20)清洗细胞。用含1％H2O2，0.1％NaN3的清洗缓冲液quench细胞，在室温下孵育20分钟，然后用PBS/0.5％BSA在4℃下封闭5小时。加入一抗phospho-Akt(Ser473)(多克隆兔；Cell signaling #9217；1∶1000)4℃作用过夜。
第四天：酶标板用清洗缓冲液清洗3次，然后每孔加入按1∶5000稀释于PBS-0.5％BSA的HRP标记的抗兔抗体，室温作用1.5小时。酶标板用清洗缓冲液清洗3次，用PBS清洗一次。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)并于650nm处监测。加入100μl 250nM HCl终止反应，使用Vmax酶标板读数器(Thermo Lab Systems)读数450nm处的吸光值，以650nm作为参考波长。
图9表示了本实验的代表性结果。本发明的抗HER-3抗体能够降低β-HRG介导的AKT，表现为磷酸化的降低。数据以治疗性抗体相对于对照抗体的降低百分率表示。
实施例16：用本发明的抗HER-3抗体抑制α-HRG/β-HRG介导的 MCF7细胞增殖
进行体外实验以测定本发明的抗体抑制HRG刺激的细胞增殖。在含FCS培养基的96孔板接种2000个MCF7细胞，过夜培养。细胞按一式四份与用含0.5％FCS的培养基稀释的抗体在37℃预孵育1小时。直接添加30ng/ml α-或20ng/ml β-HRG(R&D Systems)配体到抗体溶液中刺激细胞，然后让细胞生长72小时。加入AlamarBlueTM(BIOSOURCE)37℃于暗处作用。每30分钟在590nm处测定吸光值。数据在加入AlamarBlue90分钟后记录。图10中显示的结果表明本发明代表性的抗体抑制了HRG诱导的人类癌细胞的生长。数据用治疗性抗体相对于对照抗体的降低百分率表示。
实施例17：用本发明的抗HER-3抗体抑制β-HRG-诱导的MCF7细 胞迁移
进行迁移实验以研究本发明的抗体是否能够阻断细胞迁移。在血清饥饿的MCF7细胞的细胞悬液中加入指定量的本发明抗体在37℃预孵育45分钟。500μl细胞悬液(50,000个细胞)被置于I型胶原包被的transwells顶部小室(BD Falcon，8μm pores)。在底部小室使用不含有或含有配体β-HRG-EGF结构域(R&D Systems)的750μl培养基(MEM、氨基酸、Na-丙酮酸、Pen.-Strept、0.1％BSA，无胎牛血清)。让细胞在37℃迁移8小时，然后用DAPI染色。
人工计数染色的细胞核，抑制百分比表示为相对于对照抗体的抑制。
图11表示了实验的结果，表明本发明的代表性的抗HER-3抗体降低了HRG诱导的细胞迁移。
实施例18：克隆形成分析(软琼脂分析)
实施软琼脂分析是为了研究本发明的抗HER-3抗体对非贴壁依赖性细胞生长的抑制能力。软琼脂克隆形成实验是标准体外分析方法，用于测试被转化细胞，因为只有这些被转化细胞能够在软琼脂上生长。
750至2000孔(取决于细胞株)与IMDM培养基(Gibco)中10μg/ml的指示抗体预孵育30分钟，然后重悬于0.4％的Difco纯化琼脂(noble agar)。细胞悬液按一式四份涂布于96孔板的底层含有20％FCS的0.75％琼脂糖上。放置14天使克隆形成，然后用50μl0.5mg/ml溶于PBS的MTT染色过夜。图12a-i表示了利用本发明的3中代表性抗体操作这些实验的结果。结果表明本发明的抗HER-3抗体降低了以下非贴壁依赖性细胞的生长：MDA-MB361和NCI-ADR乳腺癌细胞(图12a，b)、MKN-28胃癌细胞(图12c)、HT144黑色素瘤细胞(图12d)、Skov3卵巢癌细胞(图12e)、PPC-1前列腺癌细胞(图12f)、BX-PC3胰腺癌细胞(图12g)、A431表皮样癌细胞(图12h)和肺癌细胞(图12i)。利用Scanalyzer HTS camera system(Lemnatec，Wuerselen)进行克隆计数。
实施例19：人类抗HER-3抗体抑制了人类乳腺癌在裸鼠中的生长
治疗性抗体的抗肿瘤疗效常常通过在人类移植瘤的研究中进行评价。在此类研究中，采用人类肿瘤如移植瘤在免疫力低下的小鼠中生长，通过肿瘤生长被抑制的程度来衡量抗体的疗效。为了确定抗HER-3抗体的加入是否干扰了人类乳腺癌细胞在裸鼠中的生长，将5×106个T47D细胞植入到雌性NMRI裸鼠/裸鼠中。皮下移植肿瘤，在动物的背部生长。肿瘤移植8天后，平均体积达到20mm3，此时开始进行治疗。第一次治疗前，随机挑选小鼠进行统计检测以保证整个治疗组中开始的肿瘤体积统一(平均值，中位数和标准偏差)。治疗开始时采用首剂量50mg/kg，随后采用每周25mg/kg的剂量进行腹腔注射。一条对照前臂注射了阿霉素(药品级)。所有的受试动物每周腹腔注射雌激素0.5mg/kg。
下面给出了治疗组的详细信息。
Figure BDA0000048852290000551
*阿霉素治疗参考Boven等人的描述方法(Cancer Research，1992)。
平均肿瘤体积的数据(图13)表明，给药抗HER-3抗体后，肿瘤的生长速度减慢。
实施例20：人类抗HER-3抗体抑制了人类胰腺肿瘤在SCID小鼠 中的生长。
为了检测抗HER-3抗体对其它类型的实体肿瘤细胞的潜在治疗作用，抗HER-3抗体U1-53和U1-59在小鼠中对来源于胰腺肿瘤细胞系BxPC3的肿瘤进行了检测。对照组的小鼠使用溶剂对照，PBS，或者已经确定的治疗性抗体爱必妥(Erbitux)处理。5×106个BxPC3细胞(无Matrigel)皮下移植到CB17 SCiD小鼠中。荷有平均体积为140mm2肿瘤的小鼠通过腹腔注射50mg/kg U1-53、U1-59、爱必妥或者等体积的PBS。此后，在整个研究过程中小鼠每周一次注射剂量为25mg/kg。
实验结果如图14所示。U1-53和U1-59通过一种抑制方式降低了人类胰腺肿瘤的生长速度。在这个实验中，明显的是U1-53和U1-59比EGFR-靶向抗体在延迟肿瘤的生长中的作用更加有效。这些数据表明了抗HER-3抗体的疗效相当于一种基准治疗药剂。
实施例21：人类抗HER-3抗体与抗-EGFR抗体结合增加了抗肿瘤 的活性
对于过增殖性疾病采用靶向抗体的单一疗法常常被一些问题所妨碍，比如，一方面是对耐药性的发展，另一方面是抗原性的改变。例如，在延长的治疗后抗原性的丧失可能使肿瘤细胞对疗效抗体不敏感，这是由于那些不表达或者丧失靶向抗原的肿瘤细胞具有选择生长优势。这些问题可以通过与一种靶向肿瘤细胞不同受体的疗效抗体，或者与另一种抗肿瘤药物共同使用而避开。介入多个信号通路或者甚至相关的途径只要在多个干预水平上也可以提供疗效。这些综合性的治疗方法好像是更加有效，因为他们综合了两种不同的抗-癌药物，每种药物通过不同的作用机理发挥作用。
为了表明抗HER-3抗体的可实施性，U1-53和U1-59作为合适的组合药剂，我们比较了U1-53或者U1-59单一给药疗法与U1-53或者U1-59与抗-EGR特异抗体爱必妥相结合的给药疗法的效果。5×106个BxPC3细胞(含Matrigel)皮下移植到CB17 SCID小鼠中。当肿瘤体积达到200mm3后，小鼠被随机分成治疗组。每周通过腹腔单独给药U1-53，U1-59和爱必妥或者抗-HER3抗体与爱必妥一起给药或者与作为两种抗HER-3抗体的联合给药。所有的抗体的首剂量为每周50mg/kg，随后每周注射25mg/kg，持续注射6周。对照组每两周给药吉西他滨(120mg/kg)，每周注射混合的人类IgG或者溶剂PBS。方案如下所述：
Figure BDA0000048852290000561
实验结果如图15所示。当单独给药抗体U1-53或者U1-59时，与吉西他滨同等程度地延迟了人的胰腺肿瘤的生长，吉西他滨通常被用来作为抗-胰腺癌的化疗标准药物。当U1-53或者U1-59与爱必妥一起给药时，与单独给药U1-53，U1-59或者爱必妥相比，能够明显地降低肿瘤的生长。因此，通过综合使用抗-HER-3抗体与合适的针对肿瘤抗原独特的靶向抗体，可以得到有效的治疗效果。
总之，抗-HER-3抗体在体内对人类肿瘤具有有效的疗效。与其它抗-肿瘤药物综合使用，可以提高抗-肿瘤活性。
实施例22：人类抗HER-3抗体抑制人类黑色素瘤的在nu/nu小鼠 内生长
受体erbB家族的成员，包括Her3，在许多上皮性肿瘤中不正常表达，它们在许多实体瘤的生长和存活中起着重要的作用。这些实体瘤包括黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌以及前列腺癌、神经胶质瘤、胃癌、乳腺癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌。为了确定本发明的抗-Her 3抗体并不限于其对单一类型肿瘤(如胰腺癌，实施例21)的抗癌活性，而且也可以用于治疗许多HER-3依赖的肿瘤，我们另外在移植瘤实验中测试了U1-53和U1-59。图16显示了一个实例。5×105个黑色素瘤细胞HT144被皮下注射入CB17 SCID小鼠，接着立即腹腔注射50mg/kg的U1-53和U1-59，以及等体积的PBS或200mg/kg的Dacarbacin(DITC)。此后，小鼠每周接受25mg/kg的U1-53和U1-59，而DITC按200mg/kg每两周给药一次。
图16表示了来源于每个小组的肿瘤体积的中间值。与用对照溶液处理的肿瘤相比，给药本发明的抗体导致了黑色素瘤的生长降低。这些结果表明本发明的抗体不限于其治疗潜力，能以表达HER-3的多种癌症为攻击对象。
实施例23：人抗-HER-3抗体抑制了小鼠中结肠癌移植瘤的生长
HT-29人类结肠癌细胞与Matrigel以2∶1悬浮于培养基，使最终浓度为10×106个/ml。0.2ml的细胞悬液皮下注射到4到5周龄CD1nu/nu小鼠的右侧。总共使用95只小鼠。
小鼠被随机选择分为对照和处理组。在同一天开始处理。处理时间持续29天。在研究完成后，收集每个小组给药处理3小时后的3个肿瘤。这些肿瘤被快速冷冻并置于-80℃。
按照如下的处理方法进行操作：
对照组：非特异的人IgG，25mg/kg，每周两次，腹腔注射
处理组：抗体U1-53，25mg/kg，每周两次，腹腔注射
处理组：抗体U1-7，25mg/kg，每周两次，腹腔注射
处理组：抗体U1-59，25mg/kg，每周两次，腹腔注射
5-FU处理组：5-氟尿嘧啶，50mg/kg，9d×5，腹腔注射
图17表示了来源于每个小组的肿瘤体积的中间值。与用非特异的人IgG1处理的肿瘤相比，给药本发明的抗体导致了结肠癌HT-29的生长降低。
实施例24：人类抗HER-3抗体抑制了小鼠中肺癌的生长
Calu-3非小细胞肺癌细胞按1∶1与Matrigel混合，悬浮于培养基至终浓度为5×106个细胞/ml。0.05ml的细胞悬液皮下注射到9周龄雌性CB17 scid小鼠的右侧。总共使用60只小鼠。
小鼠被随机选择分为对照和处理组。在同一天开始处理。处理时间持续32天。
按照如下的处理方法进行操作：
PBS组
hG对照组：非特异的人类IgG：(25mg/kg)，一周两次，腹腔注射
抗体U1-53处理组：25mg/kg，一周两次，腹腔注射
抗体U1-7处理组：25mg/kg，一周两次，腹腔注射
抗体U1-59处理组：25mg/kg，一周两次，腹腔注射
图18表示了来源于每个对照组和处理组的肿瘤体积的中间值。与用PBS对照处理或用非特异的人IgG处理的肿瘤相比，给药本发明的抗体导致了人类非小细胞肺癌移植瘤的生长降低。
实施例25：人类抗-HER-3抑制人类胰腺癌在Balb/C小鼠中的生 长
人类胰腺癌BxPC3肿瘤细胞与Matrigel按照2∶1悬浮于培养基，使终浓度为每5×106个细胞/ml。0.2ml的细胞悬液皮下注射入5-7周龄的雌性BalbC nu/nu小鼠的右侧。总共使用100只小鼠。
小鼠被随机分成对照组和处理组。处理开始于同一天，一共持续27天。
按照如下的处理方法进行操作：
hIgG对照组：非特异的人类IgG2，25mg/kg，一周两次，腹腔注射
处理组：抗体U1-53，25mg/kg，一周两次，腹腔注射
处理组：抗体U1-7，25mg/kg，一周两次，腹腔注射
处理组：抗体U1-59，25mg/kg，一周一次，腹腔注射
Gemzar处理组：吉西他滨，80mg/kg，一周一次，腹腔注射
图19表示了来源于每个对照组和处理组的肿瘤体积的中间值。与用非特异的人IgG或用Gemzar处理的肿瘤相比，给药本发明的抗体导致了人类胰腺癌的生长降低。
在人类胰腺癌中HER-3的抑制也表现在药效学实验中。BxPC3肿瘤移植物的生长如上所述。3只小鼠用500μg IgG1对照抗体处理，3只小鼠用抗500μg HER-3抗体U1-59处理。在第一天和第四天处理这些小鼠，然后在第五天处死，测定抗体依赖的的HER-3磷酸化(pHER-3)。
肿瘤在加有蛋白酶抑制剂的标准的RIPA缓冲液中匀浆。50μg澄清的裂解液用4-20％Tris-甘氨酸胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，并用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。免疫印迹的操作采用抗-pHER-3抗体(抗体21D3，Cell Signaling technology)。抗肌动蛋白抗体(ABa-2066，Sigma)用作对照。
表达的检测使用增强的发光法(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。图像用Versadoc 5000成像系统(BioRad，Hercules，CA)捕获。
图20表示了该结果。在给药人抗-HER-3抗体U1-59后，HER-3的磷酸化不能再被检测到。因此，本发明的抗体能够明显地降低人类胰腺癌细胞中HER-3的活化。
实施例26：利用本发明的抗-HER-3抗体作为诊断试剂
抗-HER-3单抗可用于恶性肿瘤疾病的诊断。HER-3在肿瘤中的表达方式与正常的组织相比非常不同，因此，HER-3的表达分析将能帮助：初步诊断实体肿瘤、实体肿瘤病理分期和组织学分级、过增殖性疾病和肿瘤的预后标准的评价、HER-3阳性肿瘤的患者的风险管理。
A.样品中HER-3抗原的检测
酶联免疫吸附分析(ELISA)用于检测样品中HER-3抗原的方法已经发展。在该分析中，微量滴定板(如96孔微量滴定板或384孔微量滴定板)的孔被抗HER-3抗原的全人单克隆抗体一抗吸附几个小时。此固定的抗体用于捕获测试样品中可能存在的任意HER-3抗原。所有孔均被冲洗，用封闭试剂如牛奶蛋白或白蛋白处理以避免分析物中的非特异吸附。
接下来酶标板孔用疑似含有HER-3抗原的测试样本、或用含有标准量HER-3抗原的溶液处理。这样的样本是，例如：血液样本，其来源对象中疑似含有的循环的HER-3抗原被认为是病理诊断水平。当冲洗掉测试样本或标准品后，酶标板孔用偶联有生物素标记的本发明的全人类抗HER-3二抗处理。标记的抗HER-3抗体用作检测抗体。当冲洗掉过量的二抗后，酶标板孔用偶联上辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素蛋白和合适的显色底物处理。测试样本中HER-3抗原的浓度通过与标样得到的标准曲线比较来确定。
B.免疫组化法(IHC)中HER-3抗原的检测
为了用免疫组化法测定组织切片中的HER3抗原，石蜡包埋组织首先用二甲苯脱蜡两次，每次5分钟，然后用100％乙醇脱水2次，每次3分钟，95％乙醇脱水1分钟，再用蒸馏水冲洗。暴露被福尔马林固定和石蜡包埋遮蔽的抗原表位可通过表位遮蔽解除(epitopeunmasking)、酶消化或皂甙。表位遮蔽解除方法是将石蜡切片置于表位恢复溶液(例如：2N pH1.0的盐酸溶液)中，在蒸锅、水浴或微波炉中加热20-40分。对于酶消化，组织切片置于不同的酶溶液(如蛋白酶K、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶等)在37℃孵育10-30分钟。
冲洗掉表位恢复溶液或过量的酶之后，组织切片用封闭液处理以防止非特异反应。一抗用稀释缓冲液稀释合适的比例后在室温下孵育1小时或过夜。过量的一抗被冲洗掉，切片在过氧化物酶封闭液中在室温下孵育10分钟。在另一个清洗步骤后，组织切片与二抗孵育，该二抗标记上了可作为酶锚定物的基团。实例是生物素标记的二抗，可被偶联有辣根过氧化物酶的链霉亲和素识别。所述的抗体/酶复合物的检测可通过与合适的发光底物孵育来实现。
C.患者血清中HER-3抗原浓度的测定
建立了夹心ELISA法用于定量人血清中的HER-3水平。在夹心ELISA法中使用了两种全人类单克隆抗HER-3抗体，其识别HER-3分子不同的结构域，但不竞争结合，例如，见实施例8。此ELISA操作如下：50μl抗HER-3包被抗体在包被溶液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)以2μg/ml的浓度包被于酶标板(Fisher)。4℃孵育过夜后，酶标板用200μl的封闭液(0.5％BSA，0.1％吐温20，0.01％硫柳汞，溶于PBS)在25℃作用1小时。酶标板用含0.05％吐温20的PBS(清洗液，WB)清洗3次。正常血清或患者血清(Clinomics，Bioreclaimation)含有50％人血清的封闭液稀释。酶标板与血清样品在4℃孵育过夜，用清洗液清洗，然后与生物素标记的抗HER-3检测抗体(100μl/孔)在25℃孵育1小时。清洗后，酶标板与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育15分钟，按前面的方法清洗，然后按100μl/孔与溶于过氧化氢中的邻苯二胺(Sigma显影液)作用来产生颜色。用2M硫酸(50μl/孔)终止该反应，用酶标板读数器在492nm处分析。血清样本中HER-3抗原的浓度通过与纯化的HER-3抗原的稀释度比较用4参数曲线拟合程序来计算。
患者癌症的分期
基于项目A、B和C阐述和讨论的结果，通过本发明的运用，可能根据HER-3抗原的表达水平在研究对象上分期癌症。在给定的癌症类型中，血液样本取自研究对象，其被诊断为在疾病发展中的各个阶段和/或在治疗的各个时间点。血液样本中存在的HER-3抗原的浓度通过特异测定存在的抗原量的方法测定。此方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，例如在项目A和B中描述的方法。使用提供了对发展或治疗的每个时期有统计学意义的结果样本群体，指定了可被视为每个时期特征的HER-3抗原的浓度范围。
为了在研究中分期研究对象癌症的发展，或为了定义研究对象对治疗的反应，采集了研究对象的血液样本并测定了样本中存在的HER-3抗原的浓度。所得到的浓度用于确定在何种浓度范围数值下降。确定的范围与在各种诊断对象的群体鉴定的发展或治疗的时期相关，因此提供了研究中对象的时期。
实施例27：利用本发明的抗HER-3抗体和抗体偶联物来治疗或预 防过增殖性疾病
许多实体瘤被HER家族介导的信号转导所调控，已经阐明HER-3是一个关键性配体，其可以与HER-1、HER-2及HER-4形成复合物。因此，HER-3介导的信号降低或消除将影响其他HER家族成员和破坏细胞信号，其带来了广泛的治疗干扰和与其他靶向药物、生物和细胞毒药物整合治疗的潜力。因此，本发明的抗HER-3抗体能够用来治疗某些增殖或HER-3相关的机能失调，其基于许多因素如HER-3的表达。肿瘤类型如乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、其他HER-3表达或过表达的癌症是当前优选的适应症，但适应症并不限于前面的名单。此外，以下的患者群体将从抗HER-3单抗治疗中获益。
对抗HER-2单抗治疗有耐药性的患者
不适合用抗HER-2单抗治疗的患者
对抗HER-1单抗或小分子抗EGFR抑制剂有耐药性的患者
对erlotinib或gefitinib有耐药性的小细胞肺癌患者
本发明的抗-HER-3抗体将用于单一疗法或与一种或药剂组分结合为所谓的“混合疗法”。所述的混合疗法可包括(但不限于)本发明签名定义的药剂。使用抗HER-3抗体和其他药剂的混合疗法可延长患者的存活和肿瘤发生的时间或提高患者的生活质量。规程和给药设计将描述治疗效果和降低标准治疗(以化疗和放疗为例)的常规剂量的能力。
用本发明的抗HER-3抗体治疗人类
为了确定抗HER-3抗体治疗人类肿瘤患者的体内效果，人类患者在特定时间被注射了有效量的本发明的抗HER-3抗体。在治疗周期内，人类患者被监测以确定其肿瘤是否在发展，特别是肿瘤是否在生长和扩散。
与用当前标准的护理治疗的肿瘤患者的肿瘤的生长和扩散水平相比，用本发明的抗HER-3抗体治疗的肿瘤患者含有低水平的肿瘤生长和/或转移。
用本发明的抗HER-3抗体偶联物治疗
为确定本发明抗HER-3标记抗体的体内效果，人类患者或表现为肿瘤的动物在特定时间被注射了有效量的本发明的抗HER-3标记抗体。例如，给药的抗HER-3标记抗体是DM1标记的抗HER-3标记抗体、auristatin标记的抗HER-3抗体或同位素标记的抗HER-3抗体。在治疗周期内，人类患者或动物被监测以确定其肿瘤是否在发展，特别是肿瘤是否在生长和扩散。
与经过替代方法治疗的对照组患者或表现肿瘤的动物相比，经过例如DM1标记的抗HER-3标记抗体或同位素标记的抗HER-3抗体治疗的人类患者或表现肿瘤的动物，含有低水平的肿瘤生长和转移。可在动物中使用的对照DM1标记的抗体包括DM1组成的标记物，其连接到本发明的抗HER-3抗体的同型抗体上，不过特别的是，该抗体不具有结合HER-3肿瘤抗原的能力。可在动物测试使用的对照同位素标记的抗体包括由同位素组成的标记物，其连接到本发明的抗HER-3抗体的同型抗体上，不过特别的是，该抗体不具有结合HER-3肿瘤抗原的能力。注意：不对人类给药对照标记物。
一般说明
前面的书面说明是考虑了足以使本领域的技术人员实践本发明。本发明并不限于已递交解释的范围，因为递交的实例是目的是作为本发明的特定对象的单一描述，功能上等效的任意解释都在本发明的领域内。文本中递交的材料并不承认文本中包含的书面说明是不足以实践本发明任一对象，包括其最好的模式，也不是将权利要求书的范围限于其特定的描述中。
前面的说明和实例详述了本发明的某些优选实例，描述了发明者预期的最好模式。但是，应当了解，不管出现在文中的前述是多么详尽，本发明可以通过很多方式实践，本发明应当解释附属的权利要求书及其等同物。
此外，除非另有规定，所使用的与本发明相关的科学和技术术语所含意义应当能被本领域技术人员理解。而且，除非本中另有需要，单数形式的术语也应包括复数形式，复数形式的术语也应包括单数形式。一般说来，文本中使用的与细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质、寡核苷酸与多聚核苷酸化学以及杂交相关的命名和技术是本领域熟知和常规使用的。重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如：电穿孔、脂质体转染)使用是标准技术。酶反应和纯化技术的操作按照厂家说明或本领域的常规操作或根据本文中的描述。前述的技术和步骤的操作通常根据本领域熟知的常规方法或根据本说明中引用或讨论的各种常规或特殊文献中描述的方法。例如见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》(第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))，其通过引用结合到文本中。文本中使用的与分析化学、合成有机化学以及药物化学相关的命名和实验程序和技术是本领域熟知和常规使用的。化学合成、化学分析、药物制备、配方和释放以及患者的治疗使用的是标准技术。
引证归并
文本中所有引用的参考资料，包括专利、专利申请、论文、教材等等，包括此处引用的参考文献，在此通过引用整体纳入到本文中。
序列表
抗体        U1-39
1   重链DNA：
    GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
    TCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
    CCAGGGAAGGGGCTGGATTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGCACATACTACGCA
    GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTT
    CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGCAGTGG
    CTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
2   重链蛋白质：
    EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLDWVSVIYSGGSTYYA
    DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGQWLDVWGQGTTVTVSS
3   轻链DNA：
    GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC
    ATCTCCTGCAGGTCAAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGG
    TACCTGCAGAGGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGTTCTATTTGGGTTTTCATCGGGCC
    TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC
    AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCAGGCAAGCTCTACAAACTCCG
    CTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
4   轻链蛋白质：
    DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQRPGQSPQLLFYLGFHRA
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQALQTPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-40
5   重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGTACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTCCAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    AGGGAACTGGAACTTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG
    GTCACCGTCTCCTC
6   重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYSSGSTY
    VNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRELELYYYYYGMDVWGQGTT
    VTVS
7   轻链DNA：
    GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC
    ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGG
    TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC
    TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC
    AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCG
    CTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
8   轻链蛋白质：
    DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-38
9   重链DNA：
    CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTG
    ACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGCACTAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGATCCGT
    CAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGACTGGCTTGCACTCATTTATTGGAATGATGATAAGCGC
    TACAGCCCATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTG
    GTCCTTACAATGACCAACATGGATCTTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGTACACAGA
    GACGAAGTTCGAGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
10  重链蛋白质：
    QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALDWLALIYWNDDKR
    YSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDLVDTATYYCVHRDEVRGFDYWGQGTLVTVSS
11  轻链DNA：
    GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC
    ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATACAGTGATGGATACACCTACTTGCATTGG
    TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTTATTTATAAGGTTTCTAACTGGGAC
    TCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATC
    AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTGCACACTGGCCG
    ATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
12  轻链蛋白质：
    DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGYTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNWD
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGAHWPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-41
13  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGGTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAGAT
    CGGGAACTTGAGGGTTACTCCAACTACTACGGTGTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG
    GTCACCGTCTCCTC
14  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARDRELEGYSNYYGVDVWGQGTT
    VTVS
15  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGCCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGAATAATAGTCTCCCGATCACCTTCGGCCAA
    GGGACACGACTGGAGATTAAA
16  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNSLPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-42
17  重链DNA：
    GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATG
    CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATAC
    AGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC
    CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGAA
    AACTACGGTGACTACAACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
18  重链蛋白质：
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRY
    SPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHENYGDYNYWGQGTLVTVSS
19  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCTTCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCACTTTACTGCTGTCAACAGAGTAACGGTTCCCCGCTCACTTTCGGCGGA
    GGGACCAAGGTGGAGATCAAA
20  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFALYCCQQSNGSPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-43
21  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAGGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    AGAGAGAGAGAGTGGGATGATTACGGTGACCCCCAAGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGG
    ACCACGGTCACCGTCTCCTC
22  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDREREWDDYGDPQGMDVWGQG
    TTVTVS
23  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTACATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATGCTGCATCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTAACCCGCTCACTTTCGGCGGA
    GGGACCAAGGTGGAGATCCAA
24  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLHWYQQKPGKAPKLLIHAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPLTFGGGTKVEIQ
    抗体    U1-44
25  重链DNA：
    GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATG
    CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTGGCCTGGTGACTCTGATACCATATAC
    AGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC
    CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGAA
    AACTACGGTGACTACAACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
26  重链蛋白质：
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIWPGDSDTIY
    SPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHENYGDYNYWGQGTLVTVSS
27  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCGAAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCG
    GGGAATGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCACTTTACTACTGTCAACAGAGTATCAGTTCCCCGCTCACTTTCGGCGGA
    GGGACCAAGGTGGAGATCAAA
28  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGNAPKLLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFALYYCQQSISSPLTFGGGTKVEIK
    抗体    (U1-45)
29  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTC
    TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCC
    ACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTAACAGTGGTGACACTGGCTAT
    GCACAGGTGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCTGGAACACCTCCATAAGCACAGCCTAC
    ATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATTTGGG
    GATCTCCCGTATGACTACAGTTACTACGAATGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTG
    GTCACCGTCTCCTC
30  重链蛋白质：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGDTGY
    AQVFQGRVTMTWNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGDLPYDYSYYEWFDPWGQGTL
    VTVS
31  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGCCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAGACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCAGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGCTCACTTTCGGCGGA
    GGGACCAAGGTGGAGATCAAA
32  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQRPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
    抗体    (U1-46
33  重链DNA：
    CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTC
    ACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGG
    CAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTAT
    AATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAAC
    CAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCA
    AGAGATCTCTACGATTTTTGGAGTGGTTATCCCTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGC
    CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC
34  重链蛋白质：
    QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWY
    NDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDLYDFWSGYPYYYGMDVWG
    QGTTVTVS
    抗体    U1-47
35  重链DNA：
    CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTC
    ACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGG
    CAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTAT
    AATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAAC
    CAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCA
    AGAGATTACTATGGTTCGGGGAGTTTCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAA
    GGGACCACGGTCACCGTCTCCTC
36  重链蛋白质：
    QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWY
    NDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDYYGSGSFYYYYGMDVWGQ
    GTTVTVS
37  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
38  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKVLIYAASNLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-48
39  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCC
    GCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCATATCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAAC
    CCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTG
    AAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGCGATT
    TTTGGAGTGGGCCCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC
    ACCGTCTCCTC
40  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPAGKGLEWIGHIYTSGSTNYN
    PSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREAIFGVGPYYYYGMDVWGQGTTV
    TVS
    抗体    U1-49
41  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTC
    TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCC
    CCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAATATTGGTGGCACAAACTGT
    GCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTAC
    ATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGA
    CGGTATAGCAGCAGCTGGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC
    ACGGTCACCGTCTCCTC
42  重链蛋白质：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNIGGTNC
    AQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGRYSSSWSYYYYGMDVWGQGT
    TVTVS
43  轻链DNA：
    GATATTCTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCC
    ATCTCCTGCAAGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCTTAGTGATGGAGGGACCTATTTGTATTGG
    TACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTATGAAGTTTCCAACCGGTTC
    TCTGGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATC
    AGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTATGCAGCTTCCG
    ATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAAATTAAA
44  轻链蛋白质：
    DILMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLLSDGGTYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRF
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSMQLPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-50
45  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGG
    CAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAAC
    TACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGG
    GGGGACAGTAACTACGAGGATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGG
    ACCACGGTCACCGTCTCCTC
46  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTN
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGDSNYEDYYYYYGMDVWGQG
    TTVTVS
47  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCATCTATTTACATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCTTGATCTCTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCGTCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGAAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACACTTCCCCGATCACCTTCGGCCAA
    GGGACACGACTGGAGATTAAA
48  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISIYLHWYQQKPGKAPKLLISAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQSYTSPITFGQGTRLEIK
49  抗体    U1-51
    重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCC
    CCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAAC
    CCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGCACCAGTTCTCCCTG
    AAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATTCGAGT
    TACTATGATAGTAGTGGTTATTACTTATACTACTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGG
    ACCACGGTCACCGTCTCCTC
50  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYN
    PSLKSRVTISVDTSKHQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSSYYDSSGYYLYYYAMDVWGQG
    TTVTVS
51  轻链DNA：
    GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACC
    ATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCT
    TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTCCTGGGCATCTACCCGG
    GAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACC
    ATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATACTACT
    CCTCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
52  轻链蛋白质：
    DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTR
    ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPLTFGPGTKVDIK
    抗体    U1-53
53  重链DNA：
    GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
    TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTATCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCT
    CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTAGTAGTACCATATACTAC
    GCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTAT
    CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGG
    GGTGACTTCGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
54  重链蛋白质：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYY
    ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDRGDFDAFDIWGQGTMVTVSS
55  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTACCAACTATTTGAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATATTGCAACATATAACTGTCAACAGTGTGAAAATTTCCCGATCACCTTCGGCCAA
    GGGACACGACTGGAGATTAAA
56  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPS
    RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYNCQQCENFPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-55
57  轻链DNA：
    GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC
    ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATACAAGTATTTGGATTGG
    TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC
    TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC
    AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTATTGCATGCAGGCTCTACAAACTCCG
    ATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
58  轻链蛋白质： ptein：
    DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYKYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPITFGQGTRLEIK
    抗体    (U1-55.1)
59  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAACTGGATCCGG
    CAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCAATTACAGTGGGAGCACCAAC
    TACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    CGAGAACTGGAACTTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG
    GTCACCGTCTCCTC
60  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGGYYWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGSTN
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRELELYYYYYGMDVWGQGTT
    VTVS
    抗体    (U1-57)
61  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCTGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAACTGGATCCGG
    CAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCAATTACAGTGGGAGCACCAAC
    TACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    CGAGAACTGGAACTTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG
    GTCACCGTCTCCTC
62  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGGYYWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGSTN
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRELELYYYYYGMDVWGQGTT
    VTVS
    抗体    U1-57.1
63  轻链DNA：
    GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC
    ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATACAAGTATTTGGATTGG
    TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCATGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC
    TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC
    AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTATTGCATGCAGGCTCTACAAACTCCG
    ATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
64  轻链蛋白质：
    DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYKYLDWYLQKPGQSPQLMIYLGSNRA
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-58
65  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC
    TCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCT
    CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTAT
    GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
    CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGCAGCT
    CGCCTTGACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCC
    TCA
66  重链蛋白质：
    QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAARLDYYYGMDVWGQGTTVTVS
    S
67  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCTCC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACAGCTATTTAAATTGGTTTCAGCAGAAGCCA
    GGGAAAGCCCCTCAGCTCCTGATCTTTGGTGCATCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTTCCCCGCTCACCTTCGGCCAA
    GGGACACGACTGGAGATTAAA
68  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQSINSYLNWFQQKPGKAPQLLIFGASGLQSGVPS
    RFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCQQSYSSPLTFGQGTRLEIK
    抗体    U1-59
69  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCC
    CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAAC
    CCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGAAACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTG
    AAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAAGTGG
    ACCTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
70  重链蛋白质：
    QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYN
    PSLKSRVTISVETSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSS
71  轻链DNA：
    GACATCGAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACC
    ATCAACTGCAGGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAGCAATAGGAACTACTTAGCT
    TGGTACCAGCAGAACCCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCTTCTACCCGG
    GAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACC
    ATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACT
    CCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
72  轻链蛋白质：
    DIEMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSSNRNYLAWYQQNPGQPPKLLIYWASTR
    ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPRTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-52
73  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTGAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGGG
    GGAACTGGAACCAATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG
    GTCACCGTCTCCTC
74  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWMGNIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSENQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGTGTNYYYYYGMDVWGQGTT
    VTVS
75  轻链DNA：
    GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
    CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA
    CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCTGGGCCACTGGCATCCCA
    AACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG
    CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGC
    GGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
76  轻链蛋白质：
    EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSWATGIP
    NRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-61
77  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGTCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGATGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGAAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    TCCGAGTCCGAGTATAGCAGCTCGTCGAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC
    ACGGTCACCGTCTCCTC
78  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSISSGGYYWSWIRQHPGMGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSESEYSSSSNYGMDVWGQGT
    TVTVS
    抗体    U1-61.1
79  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGTCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGATGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGAAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    TCCGAGTCCGAGTATAGCAGCTCGTCGAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC
    ACGGTCACCGTCTCCTC
80  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSISSGGYYWSWIRQHPGMGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSESEYSSSSNYGMDVWGQGT
    TVTVS
81  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAGGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGCAGTGTATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCGTCAGCAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTAACCCGCTCACTTTCGGCGGA
    GGGACCAAGGTGGAGATCAAA
82  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQTISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPS
    RFSGSVSGTDFTLTVSSLQPEDFATYYCQQSYSNPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-62(2.9.1)
83  重链DNA：
    GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGTTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATG
    CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATAC
    AGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATGTCAGCCGACAAGTCCATCAGTACCGCCTAC
    CTGCAGCTGAGCAGCCATGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACAGAT
    GGCTGGAAACTACGTACATCACGGGTGATCGAGACGTCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC
    ACCGTCTCCTC
84  重链蛋白质：
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRY
    SPSFQGQVTMSADKSISTAYLQLSSHEGLGHRHVLLCETDGWKLRTSRVIETSWGQGTTV
    TVS
85  轻链DNA：
    GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
    CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATCAGCATCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA
    CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA
    GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG
    CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGCAGTTTTGGC
    CAGGGGACCAAACTGGAGATCAAA
86  轻链蛋白质：
    EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVISIYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP
    DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCSFGQGTKLEIK
    抗体    U1-2
87  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAGGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
88  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
89  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGATACCT
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAACAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATGGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
90  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQIPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCLQHNGYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-7
91  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCG C
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
92  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
93  轻链DNA：
    GACTTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTCGAAATGATTTAGGCTGGTATCGGCAGAAACCT
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
94  轻链蛋白质：
    DFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYRQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-9
95  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAATAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAATGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
96  重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWNGYFDYWGQGTLVTV
    SS
97  轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCGGCAGAAACCT
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
98  轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYRQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-10
99  重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTACACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGACTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCA
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
100 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPTQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRLTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
101 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAATTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
102 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNNYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-12
103 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGTTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
104 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
105 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAATTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
106 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNNYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-13
107 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAG
    GACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
108 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREDDGMDVWGQGTTVTVSS
109 轻链DNA：
    GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC
    ATTTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGAATGG
    TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCCCCACAGTTCATGATTTATTTGGGGTCTAATCGGGCC
    TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC
    AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCG
    ATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
110 轻链蛋白质：
    DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLEWYLQKPGQSPQFMIYLGSNRA
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-14
111 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGTACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGGTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
112 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQYPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
113 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATACTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
114 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-15
115 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGG
    CAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAAC
    TACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    GGGGACGTGGATACAGCTATGGTCGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTC
    ACCGTCTCCTCA
116 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTN
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGDVDTAMVDAFDIWGQGTMV
    TVSS
117 轻链DNA：
    GAAATTGTATTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
    CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTTTAAGCGGCAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAG
    CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCATCATCTGTGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA
    GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACAAGACTGGAG
    CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGATAGGTCACCGCTCACTTTCGGC
    GGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
118 轻链蛋白质：
    EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLSGNYLAWYQQKPGQAPRLIICGASSRATGIP
    DRFSGSGSGTDFTLTITRLEPEDFAVYYCQQYDRSPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-19
119 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGA
    GATTACGATTTTTGGAGTGGAGAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
120 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDYDFWSGEFDYWGQGTLVTV
    SS
    抗体    U1-20
121 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATGACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGGTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAT
    CAGGGGCAGGACGGATACAGCTATGGTTACGGCTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGC
    CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC
122 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYDSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDQGQDGYSYGYGYYYGMDVWG
    QGTTVTVS
123 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGTTGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTGTGATAATCTCCCTCTCACTTTCGGCGGA
    GGGACCAAGGTGGAGATCAAA
124 轻链蛋白质：
124 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPS
    RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQCDNLPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-21
125 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTC
126 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    S
127 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCGGCAGAAACCT
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
128 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYRQKPGKAPKRLIYAASRLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-22
129 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
130 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
131 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAATGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
132 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQNGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-23
    抗体    U1-23
133 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTC
    TCCTC
134 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGILVTV
    S
135 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATTTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
136 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-24
137 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGTTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAATGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
138 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWNGYFDYWGQGTLVTV
    SS
139 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAATTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
140 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNNYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-25
141 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
142 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
143 轻链DNA：
    GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAATGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
144 轻链蛋白质：
    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQNGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-26
145 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGTACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGGGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTC
146 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQYPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLGSVTAADTAVYFCARADYDFWSGYFDFWGQGTLVTV
    S
147 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATGGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
148 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNGYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-27
149 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGTACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGGGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTC
150 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQYPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLGSVTAADTAVYFCARADYDFWSGYFDFWGQGTLVTV
    S
151 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATGGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
152 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNGYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-28
153 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCG
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
154 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDSWGQGTLVTV
    SS
155 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGATACCT
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATGGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
156 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQIPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNGYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-31
157 重链DNA：
    CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTC
    TCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAACTATGGTATCAGCTGGGTGCGGCAGGCC
    CCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACGATGGTTACAGAAACTAT
    GCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGACCACTGCCTAC
    ATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGTT
    CAAGACTACGGTGACTACGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
158 重链蛋白质：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYDGYRNY
    AQKLQGRVTMTTDTSTTTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDVQDYGDYDYFDYWGQGTLVTV
    SS
159 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGATTCAGGGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT
    GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCCATCACCTTCGGCCAA
    GGGACACGACTGGAGATTAAA
160 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPS
    RFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-32
161 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGACCACCTAC
    TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    GCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
162 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPLQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGTTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLNSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
163 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAGGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTCAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCTCTCTCACAATCTCCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
164 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQGIRNDLGWYQQKPGKAPQRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-35
165 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTC
    TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCT
    CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATATATTAGTAGTAGTGGTAATAACATATACCAC
    GCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT
    CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGA
    TATAGTGGCTACGACGACCCTGATGGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACC
    GTCTCTTCA
166 重链蛋白质：
    QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGNNIYH
    ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYSGYDDPDGFDIWGQGTMVT
    VSS
167 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAGTTGGTTTCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCTTCA
    AGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATCCCCCGTGCAGTTTTGCCCAG
    GGGACCAAGCTGGAGATCAAA
168 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLSWFQQKPGKAPKLLIHDASNLETGVPS
    RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNPPCSFGQGTKLEIK
    抗体U1-36
169 重链DNA：
    CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC
    ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTTATTACTACTGGAGCTGGATCCGC
    CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGACCACCTAC
    TACAATCCGTCCTTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC
    TCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCC
    GATTACGATTTTTGGAGTGGTCACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTCA
170 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGYYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGTTY
    YNPSFKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGHFDYWGQGTLVTV
    SS
171 轻链DNA：
    GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
    ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA
    GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA
    AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT
    GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAA
    GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
172 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-37
173 重链DNA：
    CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTC
    TCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCC
    CCTGGACAAGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACGATGGTCACACAAACTAT
    GCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAACACAGCCTAC
    ATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAGACCCC
    CATGACTACAGTAACTACGAGGCTTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
    TCCTC
174 重链蛋白质：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYDGHTNY
    AQKLQGRVTMTTDTSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPHDYSNYEAFDFWGQGTLVTV
    S
175 轻链DNA：
    atgaggtcccctgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtg
    acatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccat
    cacttgccgggcaagtcagagcattagcagttatttaaattggtatcagcagaaaccaggg
    aaagcccctaacctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaagat
    tcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaaga
    ttttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccccatcaccttcggccaagggaca
    cgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatg
    agcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga
    ggccaaagtacagtggaaggtggataacgcc
176 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSR
    FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-34
177 重链DNA：
    accatggactggacctggagggtccttttcttggtggcagcagcaacaggtgcccactccca
    ggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcct
    gcaaggcttctggttacacctttaccaactatggtatcagctgggtgcggcaggcccctgga
    caagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacgatggttacagaaactatgcacagaa
    gctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgaccactgcctacatggagctga
    ggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagatgttcaagactacggt
    gactacgactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcttccac
    caagggcccatccgtcttccccctggtgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccg
    ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg
178 重链蛋白质：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYDGYRNYA
    QKLQGRVTMTTDTSTTTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDVQDYGDYDYFDYWGQGTLVTVSS
179 轻链DNA：
    cagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtgacatccagatgaccc
    agtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaag
    tcagagcattagcagttatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaacctc
    ctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaagattcagtggcagtggat
    ctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttacta
    ctgtcaacagagttacagtacccccatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa
    cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctg
    gaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtg
    gaaggtggataacgcc
180 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSR
    FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK
    抗体    U1-1
181 重链DNA：
    catctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagc
    tgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgt
    ctctggtggctccatcaacagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccaggg
    aagggcctggagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccc
    tcaagagtcgagttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgag
    ctctgtgactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagcagattacgatttttgg
    agtggttactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccacca
    agggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacaacggc
    cctgg
182 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSINSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
103 轻链DNA：
    atgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtga
    catccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
    cttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaa
    gcccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcag
    cggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttg
    caacttattactgtctacagcataatagttacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg
    gaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt
    gaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaag
    tacagtggaaggtggataacgc
184 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSR
    FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-3
185 重链DNA：
    tggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgcagga
    gtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtg
    gctccatcagcagtggtggttactactggagctggatccgccagcacccagggaagggcctg
    gagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcg
    agttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgactg
    ccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagatggctatgatagtagtggttattaccac
    ggctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaaggg
    cc
186 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGYDSSGYYHGYFDYWGQGTLVT
    VSS
187 轻链DNA：
    H3_130_1N1K
    caggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggggacatcgtgatgaccc
    agtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccag
    ccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagcttggtaccagcagaaacca
    ggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgacc
    gattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctga
    agatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactccgctcactttcggcggaggg
    accaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctg
    atgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccag
    agaggccaaagtacagtggaaggtggataacgc
188 轻链蛋白质：
    DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-4
    H3_133_1N1G1
189 重链DNA：
    ctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgca
    ggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctg
    gtggctccatcagtagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaagggc
    ctggagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagag
    tcgagttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagttgagctctgtga
    ctgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagccgattacgatttttggagtggttat
    tttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatc
    ggtcttccccctggcaccctc
190 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
191 轻链DNA：
    H3_133_1N1K
    gtgcccgctcagcgcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtgacatcc
    agatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttg
    ccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcc
    cctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcg
    gcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgc
    aacttattactgtctacagcataataattacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg
    gaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagt
    tgaaatctggaactg
192 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRF
    SGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNNYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-5
193 重链DNA：
    H3_138_1N1G1
    tggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgcagga
    gtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtg
    gctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaagggcctg
    gagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcg
    agttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgactg
    ccgcggacacggccgtgtatttctgtgcgagagccgattacgatttttggagtggttatttt
    gactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcc
194 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYN
    PSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
195 轻链DNA：
    H3_138_1N1K
    atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtga
    catccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
    cttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaa
    gcccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcag
    cggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttg
    caacttattactgtctacagcataatacttacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg
    gaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt
    gaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaag
    tacagtggaaggtggataacgc
196 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-6
197 重链DNA：
    H3_162_1N1G1
    tggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgcagga
    gtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtg
    gctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaagggcctg
    gagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcg
    agttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgactg
    ccgcggacacggccgtgtatttctgtgcgagagccgattacgatttttggaatggttatttt
    gactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggccc
198 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARADYDFWNGYFDYWGQGTLVTV
    SS
199 轻链DNA：
    H3_162_1N1K
    atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtga
    catccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
    cttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaa
    gcccctaagcgcctgatctatgctgcttccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcag
    cggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttg
    caacttattactgtctacagcataatacttacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg
    gaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt
    gaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaag
    tacagtggaaggtggataacgcc
200 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-8
201 重链DNA：
    H3_174_1N1G1
    ttggtggcagcagctacaggcacccacgcccaggtccagctggtacagtctggggctgaggt
    gaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggatacaccctcactgaat
    tatccatgtactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatgggaggttttgat
    cctgaagatggtgaaacaatctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgagga
    cacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgt
    attactgtgcaactgggtggaactacgtctttgactactggggccagggaaccctggtcacc
    gtctcctcagcctccaccaagggccc
202 重链蛋白质：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMYWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYA
    QKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGWNYVFDYWGQGTLVTVSS
203 轻链DNA：
    H3_174_1N1K
    ggatccagtggggatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggaga
    gccggcctccatctcctgcaggtccagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaactatt
    tggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttggattctcat
    cgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaa
    aatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctctacaaactc
    cgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtc
    ttcatcttcccgccat
204 轻链蛋白质：
    DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLDSHRA
    SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-11
205 重链DNA：
    H3_178_1N1G1
    tggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgcagga
    gtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtg
    gctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaagggcctg
    gagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcg
    agttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgactg
    ccgcggacacggccgtgtatttctgtgcgagagccgattacgatttttggagtggttatttt
    gactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcgag
    tcttccccctgg
206 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTY
    YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTV
    SS
207 轻链DNA：
    H3_178_1N1K
    atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtg
    acatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccat
    cacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccaggg
    aaagcccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggt
    tcagcggcagtggatctgggacaaaattcactctcactatcagcagcctgcagcctgaaga
    ttttgcaacttattactgtctacagcataatacttacccgtggacgttcggccaagggacc
    aaggtggaaatcagacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatg
    agcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga
    ggccaaagtacagtggaaggtggataacgcc
208 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVP
    SRFSGSGSGTKFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPWTFGQGTKVEIR
    抗体    U1-16
209 重链DNA：
    H3_221_1N1G1
    accatgaaacatctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtccc
    aggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcac
    ctgcactgtctctggtggctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccag
    cacccagggaagggcctggagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactaca
    acccgtccctcaagagtcgagttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccct
    gaagctgagctctgtgactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagcggattac
    gatttttggagtggttattttgactactggggccagggaatcctggtcaccgtctcctcag
    cctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagaacacctctggggg
    cacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcctgg
    aactcaggcgccctg
210 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGILVTVSS
    211轻链DNA：
    H3_221_1N1K
    atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgt
    gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc
    atcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaacca
    gggaaagcccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatca
    aggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcct
    gaagattttgcaacttattactgtctacagcataatagttacccgtggacgttcggccaa
    gggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca
    tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat
    cccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgcc
212 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSR
    FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-17
213 重链DNA：
    H3_224_1N1G1
    tggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgcagg
    agtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctgg
    tggctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaagggc
    ctggagtggattggatacatctattacagtgggagcacctactacaattcgtccctcaaga
    gtcgagttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctctgt
    gactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagcggattacgatttttggagtggt
    tattttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcc
    catcg
214 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NSSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
215 轻链DNA：
    H3_224_1N1K
    ggtgccaggtgtgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggag
    acagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatca
    gcagaaacctgggaaagcccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggg
    gtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcc
    tgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagcacaatagttacccgtggacgtt
    cggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc
    ccgcca
216 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-18
217 重链DNA：
    H3_227_1N1G1
    aggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgcagg
    agtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctgg
    tggctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaagggc
    ctggagtggattggatacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaaga
    gtcgagttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctctgt
    gactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagccgattacgatttttggagtggt
    tattttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcc
    catcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctggg
    ctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccct
218 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
219 轻链DNA：
    H3_227_1N1K
    atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtga
    catccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
    cttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaa
    gcccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcag
    cggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttg
    caacttattactgtctacagcataatagttacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg
    gaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt
    gaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaag
    tacagtggaaggtggataacg
220 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS
    RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-33
221 重链DNA：
    H4_14_1N1G4
    ctgtggttcttccttctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcagctgc
    aggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctc
    tggtggctccatcagcagtggtgattactactggagctggatccgccagcacccagggaag
    ggcctggagtggattgggtacatctattacagtgggagcacctactacaacccgtccctca
    agagtcgagttaccatgtcagtagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgagctc
    tgtgactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagccgattacgatttttggagt
    ggtcactttgactgctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcttccaccaagg
    gccccatccgtcttccccc
222 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYY
    NPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDFWSGHFDCWGQGTLVTVSS
    223轻链DNA：
    H4_14_1N1K
    atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtga
    catccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
    cttgccgggcaagtcagggcattagagatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaa
    gcccctaagcgcctgatctatgctgaatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcag
    cggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttg
    caacttattactgtctacagcatcatagttacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg
    gaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcc
224 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRDDLGWYQQKPGKAPKRLIYAESSLQSGVPSR
    FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHHSYPWTFGQGTKVEIK
    抗体    U1-29
225 重链DNA：
    H4_107_1N1G4
    tggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctgg
    tggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtc
    tggattcaccttcaatagctatgacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctg
    gagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagg
    gccgattcaccatctctagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcct
    gagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaccgcttgtgtactaatggtgta
    tgctatgaagactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcag
    cttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagag
    cacagccgccctgggc
226 重链蛋白质：
    QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFNSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYA
    DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLCTNGVCYEDYGMDVWGQGTTV
    TVSS
227 轻链DNA：
    H4_107_1N1K
    atgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggctctcaggtgccagatgtga
    catccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
    cttgccaggcgagtcaggacattagcaactatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaa
    gcccctaaggtcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcag
    tggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttg
    caacatattactgtcaacactatgatactctcccgctcactttcggcggagggaccaaggtg
    gagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt
    gaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaag
    tacagtgg
228 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYDASNLETGVPSR
    FSGSGSGTDFTFTISSLQPEDVATYYCQHYDTLPLTFGGGTKVEIK
    抗体    U1-30
229 重链DNA：
    H4_116_1_1N1G4
    ggactgtgcaagaacatgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatg
    ggtcctgtcccaggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagcctttacagaccc
    tgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtggtgattactactggagctgg
    atccgccagcacccagggaagggcctggagtggattgggtacatctattacagtgggaccac
    ctactacaacccgtccctcaagagtcgagttaccatatcagtagacacgtctaagaaccagt
    tcgccctgaagctgaactctgtgactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagcc
    gattacgatttttggagtggttattttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctc
    ctcagcttccaccaagggcccatccgtcttccccctgg
230 重链蛋白质：
    QVQLQESGPGLVKPLQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGTTYY
    NPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLNSVTAADTAVYYCARADYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
231 轻链DNA：
    H4_116_1_1N1K
    atgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggtgccaggtgtg
    acatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccat
    cacttgccgggcaggtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccaggg
    aaagcccctcagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggt
    tcagcggcagtggatctgggacagaattctctctcacaatctccagcctgcagcctgaaga
    ttttgcaacttattactgtctacagcataatagttacccgtggacgttcggccaagggacc
    aaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatg
    agcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga
    ggccaaagtacagtggaaggtggataacgcccttccaatcggg
232 轻链蛋白质：
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQGIRNDLGWYQQKPGKAPQRLIYAASSLQSGVPSR
    FSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIK
序列表
引物(SEQ ID NO：233)：
CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC
引物(SEQ ID NO：234)：
GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAA
CDR序列表
Figure BDA0000048852290000951
Figure BDA0000048852290000961
Figure BDA0000048852290000971
Figure BDA0000048852290000981
Figure BDA0000048852290000991
Figure IDA0000048852340000011
Figure IDA0000048852340000021
Figure IDA0000048852340000031
Figure IDA0000048852340000041
Figure IDA0000048852340000051
Figure IDA0000048852340000061
Figure IDA0000048852340000071
Figure IDA0000048852340000081
Figure IDA0000048852340000091
Figure IDA0000048852340000101
Figure IDA0000048852340000111
Figure IDA0000048852340000121
Figure IDA0000048852340000131
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Claims (26)

1.一种结合于HER-3的分离的抗体，
其特征在于其重链CDR1由序列GGSFSGYYWS构成，重链CDR2由序列EINHSGSTNYNPSLKS构成，重链CDR3由序列DKWTWYFDL构成；且其轻链CDR1由序列RSSQSVLYSSSNRNYLA构成，轻链CDR2由序列WASTRES构成，轻链CDR3由序列QQYYSTPRT构成。
2.一种结合于HER-3的分离的抗体，
其特征在于：其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示，和其轻链氨基酸序列如SEQ I D NO：72所示。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体在制备用于结合HER-3的胞外结构域的组合物中的用途。
4.根据权利要求1或2所述的分离的抗体在制备用于降低HER-3介导的信号转导的组合物中的用途。
5.根据权利要求1或2所述的分离的抗体在制备用于降低HER-3的磷酸化的组合物中的用途。
6.根据权利要求1或2所述的分离的抗体在制备用于降低细胞增殖的组合物中的用途。
7.根据权利要求1或2所述的分离的抗体在制备用于降低细胞迁移的组合物中的用途。
8.根据权利要求1或2所述的分离的抗体在制备用于提高HER-3的下调的组合物中的用途。
9.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中该抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人类抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、或其抗体片段，其中该抗体片段是Fab片段、Fab’片段，F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或者单链抗体分子，其中所述分离的抗体是IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-类型。
10.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中该分离的抗体偶联至标记基团。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体，其中该标记基团是放射性同位素或放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、或生物素基团。
12.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中该抗体偶联至效应基团，其中效应基团是放射性同位素或放射性核素、毒素、或是治疗或化疗基团，其中治疗或化疗基团选自加里刹霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登素及其DM1组成的群组。
13.一种分离的核酸分子，编码了权利要求1或2所述的分离的抗体。
14.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中该核酸分子可操作地连接控制序列。
15.一种载体，其含有权利要求13所述的核酸分子。
16.一种载体，其含有权利要求14所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其被权利要求15所述的载体所转化。
18.一种宿主细胞，其被权利要求16所述的载体所转化。
19.制备权利要求1或2所述的分离的抗体的方法，其包括从宿主细胞中分离所述的分离的抗体的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的宿主细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、或原核细胞。
21.一种药物组合物，其包括权利要求1或2所述的分离的抗体，和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂，其中所述的抗体作为活性剂。
22.权利要求21所述的药物组合物在制备用于治疗或预防患者中与HER-3有关的疾病的药物中的用途，其中所述的疾病选自胰腺癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤。
23.一种包含权利要求1或2所述的分离的抗体的试剂盒。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其包含进一步治疗的药物。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中进一步治疗的药物是抗肿瘤剂。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中抗肿瘤剂是抗肿瘤抗体或化疗剂。
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