KR20080099235A - Ｈｅｒ-３ 지향 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HER-3 에 결합하는 결합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 결합 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본 발명은 HER-3 매개 신호 전달 및/또는 이것의 리간드 헤레굴린 (heregulin) 관련 질환의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
인간 상피 성장 인자 수용체(HER)-3, HER-3 지향 항체, HER-3 매개 신호 전달, 헤레굴린 관련 질환

Description

ＨＥＲ-３ 지향 항체 및 그 용도{ANTIBODIES DIRECTED TO HER-3 AND USES THEREOF}
본 발명은 HER-3 에 결합하는 항체 및 그 결합 단편을 포함하는 결합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 결합 단백질 생산을 위한 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 이외에도, 본 발명은 HER-3 매개 신호 전달(HER-3 mediated signal transduction) 및/또는 이것의 리간드 헤레굴린(heregulin) 관련 질환의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
인간 상피 성장 인자 수용체 3(HER-3, 또한 ErbB3 로도 공지됨)는 수용체 단백질 티로신 키나제로서, HER-1(또한 EGFR 로도 공지됨), HER-2 및 HER-4 를 또한 포함하는, 수용체 단백질 티로신 키나제의 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 아군(subfamily)에 속한다(Plowman et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 86 (1989), 9193-9197 ; 및 Kraus et aㅣ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). 원형적 상피 성장 인자 수용체와 마찬가지로, 경막(transmembrane) 수용체인 HER-3 는 세포외 리간드-결합 도메인(ECD), ECD 내 이합체화 도메인, 경막 도메인, 세포내 단백질 티로신 키나제 도메인(TKD) 및 C-말단 인산화 도메인으로 구성되어 있다.
리간드 헤레굴린(HRG)은 HER-3 의 세포외 도메인에 결합하여, 다른 인간 상피 성장 인자 수용체(HER)군 일원과의 이합체화와 그 세포내 도메인의 인산전달을 촉진시킴으로써 수용체-매개 신호전달 경로를 활성화시킨다. HER 군 일원간의 이합체 형성은 HER-3 의 신호전달 잠재능을 확장시키므로, 이는 신호 다양화뿐만 아니라 신호 증폭을 위한 수단이 된다.
HER-3 는 유방암, 위장관암 및 췌장암 같은 여러 유형의 암에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, HER-3/HER-3 의 발현과 비-침습 단계로부터 침습 단계로의 진행 사이에는 연관성이 있는 것으로 제시되었다(Alimandi et al ., Oncogene 10, 1813-1821 ; deFazio et al ., Cancer 87, 487-498 ; Naidu et al ., Br . J. Cancer 78, 1385-1390). 따라서, HER-3 매개 신호전달을 방해하는 약제가 요망된다. 제 US5968511 호, 제 US5480968 호 및 제 WO03013602 호에서와 같이 마우스의(murine) HER- 3 항체 또는 키메라 HER-3 항체가 보고된 바 있다.
HER-2 에 대한 인간화 모노클로날 항체, Herceptin® 이 HER-2 매개 신호전달을 방해하는 것으로 최근 제시되었는 바, 이는 인체 내에서 치료 효과를 나타낸다(Fendly et al ., Hybridoma 6, 359-370 ; Hudziak et al ., Mol . Cell. Biol . 9, 1165-1172 ; Stebbing et al ., Cancer Treat . Rev . 26, 287-290). Herceptin® 은 상이한 두 메카니즘 즉, 면역계의 효과기(effector) 세포의 진입 및 직접적인 세포독성적 세포사멸 유도 효과를 통해 작용하는 것으로 제시되었다.
그러나, 고 증폭된 HER-2 보유 환자만이 Herceptin® 치료요법에서 현저히 반응하는 바, 이는 치료요법에 적합한 환자의 수를 제한한다. 게다가, 종양 세포 상의 HER-2 의 에피토프 서열 또는 그 발현에서의 변화 또는 약물에 대한 내성의 발생은 상기의 접근가능한 환자조차도 항체에 대해 무반응성이 되도록 하고, 이에 따라 그 치료상의 이득을 무효로 만들 수도 있다. 그러므로 HER-3 와 같이, HER 군의 또 다른 일원을 다루는 표적 기반 치료요법에 대한 더 많은 약물들이 요구된다.
도 1 은 인체의 암 세포주의 패널에서 HER-3 발현의 정도를 나타내는 것으로, HER-3 이 각종 인체 암에서 발현됨을 입증하고 있다.
도 2 는 HER 군의 상이한 일원들 또는 단지 공(empty) 벡터를 안정적으로 발현하는 Rat1 세포에 대한 HER-3 항체 결합을 FACS 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 은 HER-3 도메인에 대한 항체 결합 경합 bin 들의 매핑 (mapping)을 나타낸 것이다.
도 4 는 본 발명의 항-HER-3 항체를 사용하여 수행한 간접 FACS 스캐차드(Satchard) 항체 친화도 분석의 결과를 나타낸 것이다. 이 분석에 따르면, 본 발명의 항-HER-3 항체는 세포 표면상에 발현된 HER-3 에 대해 높은 친화도 및 강력한 결합 상수를 가진다.
도 5 는 본 발명의 항-HER-3 항체에 의해 유도된 HER-3 의 내포작용 (endocytosis) 촉진을 나타낸 것이다.
도 6a-e 는 본 발명의 항-HER-3 항체를 사용하여 수행한 리간드 경합 분석의 결과를 나타낸 것이다. 이 결과에 따르면, 본 발명의 항체 가 내인성 HER-3 을 발현하는 세포에 대한 [125I]α-HRG/[125I]-β-HRG 의 결합을 특이적으로 감소시킴이 입증된다.
도 7a 는 본 발명의 항-HER-3 항체를 사용하여 수행한 HER-3 포스포티로신 ELISA 의 결과를 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 항체는 수용체 티로신 인산화 증가에 의해 표시된 바와 같이 β-HRG-매개 HER-3 활성화를 억제할 수 있었다. 더 나아가, 도 7b 는 역가 항체를 사용한 본 실험의 대표적 결과를 나타낸 것이다.
도 8 은 본 발명의 항-HER-3 항체를 사용하여 수행한 p42/p44 MAP-키나제 ELISA 의 결과를 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 항체는 MAP-키나제 인산화 증가에 의해 표시된 바와 같이 β-HRG-매개 p42/p44 MAP-키나제 활성화를 감소시킬 수 있었다.
도 9 는 본 발명의 항-HER-3 항체를 사용하여 수행한 포스포-AKT ELISA 의 결과를 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 항체는 AKT 인산화 증가에 의해 표시된 바와 같이 β-HRG-매개 AKT 활성화를 감소시킬 수 있었다.
도 10 은 본 발명의 인간 항-HER-3 항체에 의한 MCF7 세포 증식의 억제를 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 항체는 인체 암 세포에서 HRT-유도성 세포 성장을 억제시킨다.
도 11 은 본 발명의 인간 항-HER-3 항체에 의해 억제된 MCF7 세포의 투과이동을 나타낸 것이다.
도 12a-i 는 본 발명의 인간 항-HER-3 항체에 의한 고정(anchorage) 비의존성 세포 성장의 억제를 나타낸 것이다.
도 13 은 본 발명의 인간 항-HER-3 항체에 의한 T47D 인체 유방암의 이종이식편 성장의 억제를 나타낸 것이다.
도 14 는 항-HER-3(U1-59 및 U1-53) 항체 또는 항-EGFR(에르비툭스, Erbitux) 항체 투여후, 마우스내 BxPC3 인체 췌장암 세포의 감소를 나타낸 것이다.
도 15 는 본 발명의 인간 항-HER-3 항체 단독 및 항-EGFR(에르비툭스) 항체와의 배합에 의한 BxPC3 인체 췌장암 세포의 이종이식편 성장 감소를 나타낸 것이다.
도 16 은 본 발명의 항체가 nu/nu 마우스에서 인체 흑색종(HT144) 세포 성장을 지연시킴을 입증한 것이다.
도 17 은 본 발명의 인간 항-HER-3 항체(U1-53, U1-59 및 U1-7)에 의한 HT-29 인체 결장 암종 세포의 이종이식편 성장 감소를 나타낸 것이다.
도 18 은 본 발명의 인간 항-HER-3 항체(U1-59, U1-53 및 U1-7)에 의한 Calu-3 인체 폐암 세포의 이종이식편 성장 감소를 나타낸 것이다.
도 19 는 본 발명의 인간 항-HER-3 항체(U1-7, U1-59 및 U1-53)에 의한 BxPC3 인체 췌장암 세포의 이종이식편 성장 감소를 나타낸 것이다.
도 20 은 본 발명의 항체(U1-59)가 BxPC3 인체 췌장암 이종이식편에서 HER-3 의 억제를 유발시킴을 입증한 것이다.
발명의 요약
본 발명의 제 1 양태는 HER-3 에 결합하는, 분리된 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 분리된 결합 단백질은 다음의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다 : 상기 중쇄 아미노산 서열은 다음의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함하고, (a) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH1 ; (b) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH2 ; (c) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH3 ; 상기 경쇄 아미노산 서열은 다음의 (d), (e) 및 (f) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함한다 (d) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL1 ; (e) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL2 ; (f) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL3.
본 발명의 다른 실시형태에서는, 본 발명의 분리된 결합 단백질은 다음의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다 : 상기 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 중에서 선택한 것이고 ; 상기 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 중에서 선택한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 분리된 결합 단백질은 SEQ ID NOs : 2 및 4, 6 및 8, 10 및 12, 14 및 16, 18 및 20, 22 및 24, 26 및 28, 30 및 32, 36 및 38, 42 및 44, 46 및 48, 50 및 52, 54 및 56, 60 및 58, 62 및 64, 66 및 68, 70 및 72, 74 및 76, 78 및 82, 80 및 82, 84 및 86, 88 및 90, 92 및 94, 96 및 98, 100 및 102, 104 및 106, 108 및 110, 112 및 114, 116 및 118, 122 및 124, 126 및 128, 130 및 132, 134 및 136, 138 및 140, 142 및 144, 146 및 148, 150 및 152, 154 및 156, 158 및 160, 162 및 164, 166 및 168, 170 및 172, 174 및 176, 178 및 180, 182 및 184, 186 및 188, 190 및 192, 194 및 196, 198 및 200, 202 및 204, 206 및 208, 210 및 212, 214 및 216, 218 및 220, 222 및 224, 226 및 228, 230 및 232 에 제시된 경쇄 아미노산 서열 및 중쇄 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs : 34, 40, 60, 62 또는 120 에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs : 58 또는 64 에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, HER-3 에 결합할 수 있는, 분리된 결합 단백질은 HER-3 의 세포외 부분에 있는 적어도 하나의 에피토프와 상호작용한다. 이들 에피토프는 아미노 말단 도메인에 해당하는 도메인 L1(aa 19-184), 두 개의 시스테인-풍부 도메인에 해당하는 도메인 S1(aa 185-327) 및 도메인 S2(aa 500-632), 또는 상기 두 개의 시스테인-풍부 도메인을 양측에 두고 있는 도메인 L2(aa 328-499) 내에 위치하는 것이 바람직하다. 이들 에피토프는 L1 과 S1 의 일부분에 해당하는 에피토프와 같은(이들로만 한정되지 않음) 도메인 결합부 내에 위치할 수도 있다. 더 바람직한 것은 성숙된 HER-3, 특히 성숙된 인간 HER-3 의 아미노산 잔기 1-160, 161-358, 359-575, 1-358 및/또는 359-604 에 의해 형성된 3-차원 구조에 결합하는 분리된 결합 단백질이다.
본 발명의 분리된 결합 단백질로는 항체 유사 결합 활성을 가진 골격(scaffold) 단백질 또는 항체, 예를 들어 항-HER-3 항체가 바람직하다. 구체적으로, 항-HER-3 항체는 U1-1 항체, U1-2 항체, U1-3 항체, U1-4 항체, U1-5 항체, U1-6 항체, U1-7 항체, U1-8 항체, U1-9 항체, U1-10 항체, U1-11 항체, U1-12 항체, U1-13 항체, U1-14 항체, U1-15 항체, U1-16 항체, U1-17 항체, U1-18 항체, U1-19 항체, U1-20 항체, U1-21 항체, U1-22 항체, U1-23 항체, U1-24 항체, U1-25 항체, U1-26 항체, U1-27 항체, U1-28 항체, U1-29 항체, U1-30 항체, U1-31 항체, U1-32 항체, U1-33 항체, U1-34 항체, U1-35 항체, U1-36 항체, U1-37 항체, U1-38 항체, U1-39 항체, U1-40 항체, U1-41 항체, U1-42 항체, U1-43 항체, U1-44 항체, U1-45 항체, U1-46 항체, U1-47 항체, U1-48 항체, U1-49 항체, U1-50 항체, U1-51 항체, U1-52 항체, U1-53 항체, U1-55.1 항체, U1-55 항체, U1-57.1 항체, U1-57 항체, U1-58 항체, U1-59 항체, U1-61.1 항체, U1-61 항체, U1-62 항체 및 하나의 상기 항체 중 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄를 가진 항체 중에서 선택한다. 특히, 바람직한 것은 항체 U1-49(SEQ ID NO : 42/44), U1-53(SEQ ID NO : 54/56) 및 U1-59(SEQ ID NO : 70/72) 또는 하나의 상기 항체 중 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄를 가진 항체이다.
또한, 본 발명의 추가적 실시형태는 표지 그룹 또는 효과기 그룹에 결합된, 분리된 결합 단백질을 제공한다. 바람직하게, 이러한 결합 단백질은 과다증식성(hyperproliferative) 질환, 특히 유방암, 위장관암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 방광암, 신경교종, 흑색종, 고환암, 연부조직 육종, 두경부암, 또는 다른 HER-3 발현 또는 과다발현 암과 같은 종양성 질환, 및 종양 전이 형성을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 기타 다른 양태는 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자, 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 가진 벡터, 및 상기한 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포, 예를 들면 CHO 세포, NS/0 골수종 세포에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 본 발명의 결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 결합 단백질을 제조함으로써 본 발명의 결합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 결합 단백질은 결합 단백질을 분비하는 하이브리도마 세포주 또는 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환시킨 CHO 또는 기타 다른 세포 유형으로부터 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자들로 형질전환된 동물, 식물 또는 진균의 조직, 산물 또는 분비물로부터 상기 결합 단백질을 제조함으로써, 본 발명의 결합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 결합 단백질은 소, 양, 토끼, 닭 또는 기타 다른 포유동물 또는 조류 종 같은 형질전 환 동물, 옥수수, 담배 또는 기타 다른 식물 같은 형질전환 식물, 또는 아스퍼질루스(Aspergillus), 피치아(Pichia) 또는 기타 다른 진균류 종과 같은 형질전환 진균의 조직, 산물 또는 분비물로부터 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태는 활성제로서 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질을, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제와의 부가혼합물 형태로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 약학적 조성물이 부가적으로 적어도 1 종의 다른 활성제, 예를 들면 적어도 1 종의 항신생물제를 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태는 약학적 조성물의 제조를 위한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제와의 부가혼합물의 형태로 된, 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질, 및 임의로 적어도 1 종의 기타 다른 활성제, 예를 들면 적어도 1 종의 항신생물제의 용도에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 과다증식성 질환, 특히 유방암, 위장관암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 방광암, 신경교종, 흑색종, 또는 다른 HER-3 발현 또는 과다발현 암과 같은 종양성 질환, 및 종양 전이 형성의 진단, 예방 또는 치료에 적합하다.
또한, 추가의 양태에서 본 발명은 샘플을 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질과 접촉시키고, HER-3 의 존재를 검출하는 것을 포함하는, HER-3 발현 관련 질환 또는 증상의 진단 방법에 관한 것이다. 바람직한 질환 또는 증상으로는 상기 언급된 과다증식성 질환이 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태는 유효량의 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질 및 임의로 적어도 1 종의 다른 활성제, 예를 들면 적어도 1 종의 항신생물제를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 상기 환자내 HER-3 발현 관련 질환 또는 증상의 예방 또는 치료 방법이다. 상기 환자로는 포유동물 환자가 바람직하며, 인체 환자가 더욱 바람직하다. HER-3 발현 관련 질환 또는 증상으로 바람직한 것은 상기에서 언급한 과다증식성 질환이다.
본 발명의 추가 양태는 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질, 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는, HER-3 발현 관련 질환 또는 증상의 진단, 예방 또는 치료용 키트에 관한 것이다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 적어도 1 종의 다른 활성제, 예를 들면 적어도 1 종의 항신생물제를 추가로 포함할 수 있다. HER-3 발현 관련 질환 또는 증상으로는 상기 언급된 과다증식성 질환이 바람직하다.
본 발명의 제 1 양태는 HER-3 에 결합하는, 분리된 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 분리된 결합 단백질은 다음의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다 : 상기 중쇄 아미노산 서열은 다음의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함하고, (a) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH1 ; (b) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH2 ; (c) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH3 ; 상기 경쇄 아미노산 서열은 다음의 (d), (e) 및 (f) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함한다 (d) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL1 ; (e) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL2, ; (f) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL3.
본 발명의 다른 실시형태에서는, 본 발명의 분리된 결합 단백질은 다음의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다 : 상기 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 중에서 선택한 것이고 ; 상기 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 중에서 선택한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 분리된 결합 단백질은 SEQ ID NOs : 2 및 4, 6 및 8, 10 및 12, 14 및 16, 18 및 20, 22 및 24, 26 및 28, 30 및 32, 36 및 38, 42 및 44, 46 및 48, 50 및 52, 54 및 56, 60 및 58, 62 및 64, 66 및 68, 70 및 72, 74 및 76, 78 및 82, 80 및 82, 84 및 86, 88 및 90, 92 및 94, 96 및 98, 100 및 102, 104 및 106, 108 및 110, 112 및 114, 116 및 118, 122 및 124, 126 및 128, 130 및 132, 134 및 136, 138 및 140, 142 및 144, 146 및 148, 150 및 152, 154 및 156, 158 및 160, 162 및 164, 166 및 168, 170 및 172, 174 및 176, 178 및 180, 182 및 184, 186 및 188, 190 및 192, 194 및 196, 198 및 200, 202 및 204, 206 및 208, 210 및 212, 214 및 216, 218 및 220, 222 및 224, 226 및 228, 230 및 232 에 제시된 경쇄 아미노산 서열 및 중쇄 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs : 34, 40, 60, 62 또는 120 에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs : 58 또는 64 에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 결합 단백질의 아미노산 서열이 20 종의 통상적인 아미노산으로만 한정되지 않는 것으로 이해하여야 한다{본원에 참고로 인용된 문헌 [Immunology-A Synthesis(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)] 참조}. 예시로, 아미노산에는 20 종의 통상적 아미노산의 입체이성체(예, D-아미노산), α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타 비통상적 아미노산 같은 비천연 아미노산류가 포함될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질에 적합한 성분이 될 수 있는 비통상적 아미노산의 일례로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사 아미노산류 및 이미노산류, 예를 들면 4-히드록시프롤린이 포함된다.
더 나아가, 본 발명에 따르면, SEQ ID NOs : 1-232 에 제시된 아미노산 서열 내 소규모 변이는 아미노산 서열 내 변이가 SEQ ID NOs : 1-232 에 제시된 서열의 적어도 75 %, 더욱 바람직하게는 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 및 가장 바람직하게는 99 % 를 유지하고 있다면 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 변이는 골격 영역(즉, CDR 외부)내, CDR 내, 또는 골격 영역과 CDR 내에서 발생할 수 있다. SEQ ID NOs : 1-232 에 제시된 아미노산 서열 내 바람직한 변이 즉, 적어도 하나의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환은 기능적 도메인의 경계 근방에서 일어난 것이다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 공개적 또는 사유적 서열 데이타베이스에 대비시킴으로써 동정할 수 있다. 구조 및/또는 기능이 공지된 기타 다른 결합 단백질에서 발생하는 도메인 내 예상 단백질 입체형태 또는 서열 모티프를 동정하는데에는 컴퓨터처리된 비교 방법이 사용될 수 있다. 공지된 3-차원적 구조로 접혀지는 단백질 서열을 동정하는 방법은 공지되어 있다. 예시로, 모두 본원에 참고로 인용된 문헌들인 [Bowie et al., Science 253, 164 (1991) ; Proteins , Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)) ; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) ; 및 Thornton et al ., Nature 354, 105 (1991)] 참조하라. 따라서, 해당 업계의 숙련자라면 서열 모티프 및 구조적 입체형태를 인지 할 수 있으며, 이를 이용하여 본 발명에 따른 구조적 및 기능적 도메인을 규정할 수 있다.
SEQ ID NOs : 1-174 및 1-232 에 제시된 아미노산 서열에서 특히 바람직한 변이는 본 결합 단백질의 단백질분해 혹은 산화에 대한 감수성을 감소시키도록 하거나, 글리코실화 패턴 혹은 결합 친화도를 변화시키거나, 또는 기타 다른 물리화학적 혹은 기능적 특성을 부여 혹은 변경시키는 것이다. 구체적으로, 보존적 아미노산 치환이 고려된다. 보존적 치환이란 해당 측쇄 내 관련 아미노산군 내에서 발생하는 것을 말한다. 바람직한 아미노산군으로는 다음과 같은 것들이 있다 : 산성군 = 아스파르테이트, 글루타메이트 ; 염기성군 = 리신, 아르기닌, 히스티딘 ; 비-극성군 = 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ; 및 비전하 극성군 = 글리신, 아르파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 더욱 바람직한 군으로는 지방족-히드록시군 = 세린 및 트레오닌 ; 아미드-함유군 = 아스파라긴 및 글루타민 ; 지방족군 = 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신 ; 및 방향족군 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 있다. 특히 해당 치환이 골격 부위 내 아미노산을 수반하지 않는 것이라면 예를 들어, 루이신을 이소루이신이나 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 개별 치환시키거나, 또는 특정 아미노산을 구조적으로 관련된 다른 아미노산으로 유사 치환시키는 것이, 결과된 결합 단백질의 결합 또는 그 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것이라는 것은 충분히 예상가능하다. 한편, 모든 다른 가능한 아미노산 치환 또한 본 발명에 포함된다. 아미노산 변화가 기능적 결합 단백질 내에서 다시 말해, HER-3 에 결합하여 HER 군 일원의 신호 전달을 감소시키는 기능을 하는 결합 단백질 내에서 일어났는지의 여부는 HER-3 결합에 대한 ELISA 혹은 FACS, 또는 생체 외 혹은 생체 내 기능 분석으로 상기 결과된 결합 단백질의 특이적 활성을 분석함으로써 쉽게 측정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 결합 단백질은 HER-3 의 세포 외 부분에 있는 적어도 하나의 에피토프와 상호작용한다. 이들 에피토프는 아미노 말단 도메인에 해당하는 도메인 L1(aa 19-184), 두 개의 시스테인-풍부 도메인에 해당하는 도메인 S1(aa 185-327) 및 도메인 S2(aa 500-632), 상기 두 개의 시스테인-풍부 도메인들을 양측에 두고 있는 도메인 L2(aa 328-499) 또는 HER-3 도메인들의 결합부 내에 위치하는 것이 바람직하다. 이들 에피토프가 L1 과 S1 의 일부분에 해당하는 에피토프와 같은(이들로만 한정되지 않음) 도메인 결합부 내에 위치할 수도 있다. 더욱이, 본 발명의 결합 단백질은 HER-3 에 결합함으로써 HER-3-매개 신호 전달을 감소시킨다는 특징이 추가로 규명되었다. 본 발명에 따르면, HER-3-매개 신호 전달의 감소는 예를 들자면 세포 표면에서 HER-3 분자를 적어도 부분적으로나마 소멸시키는 결과를 초래하는 HER-3의 하향조절에 의하여 야기되거나 또는 세포 표면상의 HER-3 를 실질적 불활성 형태로 즉, 비-안정된 형태와 비교하여 보다 낮은 신호 전달을 보이는 형태로 안정화시킴으로써 야기될 수 있다. 대안적으로, HER-3-매개 신호 전달의 감소는 리간드 또는 HER 군의 다른 일원의 HER-3 에 대한 결합, GRB2 의 HER-2 에 대한 결합, 또는 GRB2 의 SHC 에 대한 결합을 저하 또는 억제하는 것과 같은 영향을 줌으로써, 수용체 티로신 인산화, AKT 인산화, PYK2 티로신 인산화 또는 ERK2 인산화를 억제함으로써, 또는 종양 침습성을 저하시킴으로써 야기될 수도 있다. 대안적으로, HER-3 매개 신호 전달의 감소는 기타 다른 HER 군 일원과의 HER-3 함유 이합체의 형성을 저하 또는 억제하는 것과 같은 영향을 줌으로써 야기될 수도 있다. 그 중 하나의 예시로 HER-EGFR 단백질 복합체 형성의 저하 또는 억제를 들 수 있다.
본 발명의 결합 단백질로는 항체 유사 결합 활성을 지닌 골격 단백질 또는 항체, 즉 항-HER-3 항체가 바람직하다.
본 발명의 문맥상, 본원에서 사용된 용어 "골격 단백질" 은 아미노산 삽입, 치환 또는 결실이 폭넓게 허용되는 노출 표면적을 가진 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 골격 단백질의 일례로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래된 단백질 A, 피에리스 브라시카에(Pieris brassicae)로부터 유래된 빌린(bilin) 결합 단백질 또는 기타 리포칼린류(lipocalins), 안키린 (ankyrin) 반복 단백질류, 및 인간 피브로넥틴이 있다(문헌 [Binz and Plueckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-69]에 보고됨). 골격 단백질의 조작이란 안정적으로 접혀진 단백질의 구조적 골격상으로 또는 골격내부로 친화성 기능을 이전 또는 통합시키는 것으로 생각될 수 있다. 친화성 기능이란 본 발명에 따른 단백질의 결합 친화성을 의미한다. 골격은 결합 특이성을 부여하는 아미노산 서열로부터 구조적으로 분리가능한 것일 수 있다. 일반적으로 상기한 인위적 친화성 시약의 개발에 적합한 단백질은 해당 업계에 공지된 기술로, 생체 외에서 제시된 인위적 골격 라이브러리에 있는 결합제와 관련하여, 정제 단백질이든 세포 표면상에 제시된 단백질이든 HER-3 에 대해 패닝(panning)하는 것과 같은 논리적, 또는 가장 보편적으로 조합적인 단백질 조작 기술에 의해 수득할 수 있다(Skerra, J. Mol. Recog., 2000 ; Binz and Plueckthun, 2005). 또한, 항체 유사 결합 활성을 가진 골격 단백질은 공여자(donor) 폴리펩티드의 결합 도메인을 접합시킴으로써 상기 공여자 폴리펩티드의 결합 특이성을 골격 단백질 함유 수용자(acceptor) 폴리펩티드 상에 부여할 수 있는, 골격 도메인을 함유하는 수용자 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 상기 삽입된 결합 도메인의 일례로는 항체, 특히 항-HER-3 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 들 수 있다. 삽입은 예를 들면 폴리펩티드 합성, 코딩 아미노산의 핵산 합성을 비롯하여 해당 업계의 숙련자들에게 공지된 다양한 방법뿐만 아니라, 해당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 다양한 형태의 재조합 방법에 의해 수행할 수 있다.
반면, 본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항-HER-3 항체" 는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간화 항체(Jones et al ., Nature 321 (1986), 522-525 ; Riechmann et al ., Nature 332 (1988), 323-329 ; 및 Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2 (1992), 593-596), 키메라 항체 (Morrison et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), 적어도 2 개의 항체로부터 형성된 다중특이성(multispecific) 항체(예, 이중특이성 항체), 또는 이들의 항체 단편을 의미한다. 용어 "항체 단편"은 상기-언급된 항체, 바람직하게는 이들의 항체 결합 또는 가변 영역의 임의 부분을 포함한다. 항체 단편의 일례로는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디(Hollinger et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), 단쇄 항체 분자(Plueckthun in : The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) 및 목적하는 HER-3 결합 능력을 보이는 기타 다른 단편이 포함된다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항-HER-3 항체" 는 항체의 조작된 서브-도메인 또는 자생적(또는, 자연적으로 발생하는 ; naturally occurring) 항체 변이체를 포함하는 항체-유사 분자를 포함할 수도 있다. 이들 항체-유사 분자로는 카멜리드(camelids)와 같은 천연 공급원으로부터 유래되거나(Muyldermans et al ., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302) 또는 인간, 카멜리드 또는 기타 종들로부터의 라이브러리의 생체 외 디스플레이를 통해 얻어진(Holt et al ., Trends Biotechnol ., 21, 484-90) VH-도메인 또는 VL-도메인 같은 단일-도메인 항체도 가능하다.
본 발명에 따르면, "Fv 단편" 은 완전한 항체-인식 및 -결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비-공유 결합으로 연결된 이합체로 구성된다. 이러한 입체형태상, 각 가변 도메인별로 세 개의 CDR 은 상호작용에 의해 VH-VL 이 합체의 표면상에 항원-결합 부위를 규정하게 된다. 총체적으로는, 6 개의 CDR 이 항체에 항원-결합 특이성을 부여하게 되는 것이다. 그러나, 하나의 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단 3 개의 CDR 을 포함하는 Fv 의 절반)도 비록 전체 결합 부위에 비해서 보통은 낮은 친화력이기는 하지만, 항원을 인지하고 결합하는 능력을 지니고 있다. "Fab 단편" 은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. "Fab 단편" 은 항체 경첩(hinge) 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단부에 수개의 잔기들이 첨가되었다는 점에서 "Fab" 단편" 과는 다르다. "F(ab')2 단편" 은 원래 경첩 시스테인을 사이에 두고 있는 한 쌍의 "Fab 단편" 으로 생산된다. 파파인 또는 펩신 분해와 같은, 이러한 항체 단편의 제조 방법이 해당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 항-HER-3 항체가 IgA-형, IgD-형, IgE-형, IgG-형 또는 IgM-형, 바람직하게는 IgG1-형 IgG2-형 IgG3-형 IgG4-형 IgM1-형 및 IgM2-형을 포함하지만, 이들로만 한정되지 않는 IgG-형 또는 IgM-형의 항체이다. 가장 바람직한 실시형태에서는, 항체가 IgG1-형, IgG2-형 또는 IgG4-형의 항체이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 항-HER-3 항체가 HER-3 의 세포 외 도메인(ECD) 지향성의 항-HER-3 항체이다.
예를 들어 HER-3 에 대한 치료 후보물질로서 항체의 생성과 관련한 특정 경우에서, 본 발명의 항-HER-3 항체로는 보체를 고정시켜 보체-의존성 세포독성(CDC)에 참여할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체로는 다음과 같은 것을 비-한정으로 포함하는 다수의 항체 이소타입(isotype)이 있다 : 마우스 IgM, 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1, 인간 IgG3, 및 인간 IgA. 생성된 항체가 처음부터 상기한 이소타입을 보유할 필요는 없으나, 오히려 생성된 항체는 어떠한 이소타입도 보유할 수 있으며, 해당 업계에 잘 알려진 통상의 분자 생물학적 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터 내에 분자차원으로 클로닝된 불변 영역 유전자 또는 cDNA 에 분자차원으로 클로닝된 V 영역 유전자 또는 cDNA 을 첨부한 후, 해당 업계에 공지된 기술을 이용하여 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 항체를 상기한 이소타입으로 전환시킬 수 있다. 이소타입-전환된 항체는 또한 자생적 변이체 보다 월등한 CDC 를 보유하도록 분자차원으로 조작되어(Idusogie et al ., I Immunol ., 166, 2571-2575), 해당 업계에 공지된 기술을 이용하여 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 바 있는 Fc 영역을 보유할 수도 있다. 이러한 기술로는 그중에서도 특히, 직접 재조합 기술(예시로 미국 특허 번호 제 4,816,397 호 참조), 세포-세포 융합 기술(예시로 미국 특허 번호 제 5,916,771 호 및 제 6,207,418 호 참조)을 사용하는 것이 포함된다. 세포-세포 융합 기술에서는, 목적하는 이소타입을 가진 중쇄를 보유하는 골수종 또는 CHO 같은 기타 세포주를 제조하고, 경쇄를 보유하는 다른 골수종 또는 CHO 같은 기타 세포주를 제조한다. 이후 이러한 세포를 융합시키고, 원형의 항체를 발현하는 세포주를 분리할 수 있다. 일례로, 목적하는 HER-3 항원 결합 능력을 보유한 인간 항-HER-3 IgG4 항체는 동일한 가변 영역(항체의 특이성과 일부 친화성을 규정하는)을 여전히 보유하면서 인간 IgM, 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 이소타입을 생성하도록 쉽게 이소타입 전환시킬 수 있다. 상기한 분자는 이후 보체 고정과 CDC 참여를 할 수 있게 된다.
한편, 본 발명의 항-HER-3 항체는 또한 단핵구 및 자연 킬러(NK) 세포와 같은 효과기 세포상의 Fc 수용체에 결합하여, 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체로는 다음과 같은 것을 비-한정으로 포함하는 다수의 항체 이소타입이 있다 : 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 인간 IgG1 및 인간 IgG3. 생성된 항체가 처음부터 상기한 이소타입을 보유할 필요는 없으나, 오히려 생성된 항체는 어떠한 이소타입도 보유할 수 있으며, 해당 업계에 잘 알려진 통상의 분자 생물학적 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터 내에 분자차원으로 클로닝된 불변 영역 유전자 또는 cDNA 에 분자차원으로 클로닝된 V 영역 유전자 또는 cDNA 을 첨부한 후, 해당 업계에 공지된 기술을 이용하여 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 항체를 상기한 이소타입으로 전환시킬 수 있다. 이소타입-전환된 항체는 또한 자생적 변이체 보다 월등한 ADCC 를 보유하도록 분자차원으로 조작되어(Shields et al ., J Biol Chem ., 276, 6591-6604), 해당 업계에 공지된 기술을 이용하여 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 바 있는 Fc 영역을 보유할 수도 있다. 이러한 기술로는 그중에서도 특히, 직접 재조합 기술(예시로 미국 특허 번호 제 4,816,397 호 참조), 세포-세포 융합 기술(예시로 미국 특허 번호 제 5,916,771 호 및 제 6,207,418 호 참조)을 사용하는 것이 포함된다. 세포-세포 융합 기술에서는, 목적하는 이소타입을 가진 중쇄를 보유하는 골수종 또는 CHO 같은 기타 세포주를 제조하고, 경쇄를 보유하는 다른 골수종 또는 CHO 같은 기타 세포주를 제조한다. 이후 이러한 세포를 융합시키고, 원형의 항체를 발현하는 세포주를 분리할 수 있다. 일례로, 목적하는 HER-3 항원 결합 능력을 보유한 인간 항-HER-3 IgG4 항체는 동일한 가변 영역(항체의 특이성과 일부 친화성을 규정하는)을 여전히 보유하면서 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 이소타입을 생성하도록 쉽게 이소타입 전환시킬 수 있다. 상기한 분자는 이후 효과기 세포상의 FcγR 에 결합하여 ADCC 참여를 할 수 있게 된다.
더 나아가, 본 발명에 따르면, 본 발명의 항-HER-3 항체를 완전 인간 또는 인간화 항체인 것으로 이해한다. 인간 항체를 사용하면 이종(xenogeneic) 항체, 예를 들면 마우스 또는 랫의 가변 및/또는 불변 영역을 보유한 항체와 관련된 특정 문제점들이 해소된다. 마우스 또는 토끼 유래성 단백질 같은 이종-유래성 단백질의 존재는 환자로 하여금 항체에 대한 면역 반응의 발생을 유발시키고, 그 후 항체의 급 소멸, 항체 중화를 통한 치료 효용의 상실 및/또는 심각한, 생명-위협적이기도 한 알레르기 반응을 초래할 수 있다.
본 발명의 항-HER-3 항체는 U1-1 항체, U1-2 항체, U1-3 항체, U1-4 항체, U1-5 항체, U1-6 항체, U1-7 항체, U1-8 항체, U1-9 항체, U1-10 항체, U1-11 항체, U1-12 항체, U1-13 항체, U1-14 항체, U1-15 항체, U1-16 항체, U1-17 항체, U1-18 항체, U1-19 항체, U1-20 항체, U1-21 항체, U1-22 항체, U1-23 항체, U1-24 항체, U1-25 항체, U1-26 항체, U1-27 항체, U1-28 항체, U1-29 항체, U1-30 항체, U1-31 항체, U1-32 항체, U1-33 항체, U1-34 항체, U1-35 항체, U1-36 항체, U1-37 항체, U1-38 항체, U1-39 항체, U1-40 항체, U1-41 항체, U1-42 항체, U1-43 항체, U1-44 항체, U1-45 항체, U1-46 항체, U1-47 항체, U1-48 항체, U1-49 항체, U1-50 항체, U1-51 항체, U1-52 항체, U1-53 항체, U1-55.1 항체, U1-55 항체, U1-57.1 항체, U1-57 항체, U1-58 항체, U1-59 항체, U1-61.1 항체, U1-61 항체 및 U1-62 항체 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 표지 그룹(labelling group)에 결합된다. 이러한 결합 단백질은 진단 용도에 특히 적합하다. 본원에서 사용된 용어 "표지 그룹" 은 검출가능한 마커, 예를 들면 방사성표지된 아미노산 또는 표식된 아미딘에 의해 검출할 수 있는 비오니틴 성분(예, 광학적 또는 비색적 방법에 의해 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성에 결합된 스트렙타비딘)을 지칭한다. 항체 같은 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법들이 해당 업계에 공지되어 있으므로, 본 발명 실시하는데 이를 사용할 수 있다. 적당한 표지 그룹의 일례로는 다음과 같은 것들이 포함되나, 이들로만 한정되지 않는다 : 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광체 그룹(예, FITC, 로다민, 란탄족 원소 형광체), 효소 그룹(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광체 그룹, 비오티닐 그룹 또는 이차 리포터에 의해 인지되는 소정(predetermined)의 폴리펩티드 에피토프(예, 루이신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 특정 경우에서는, 잠재적 입체 장애를 줄이고자 다양한 길이의 스페이서 암(spacer arms)을 상기 표지 그룹에 부착하는 것이 바람직할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서는 본 발명의 결합 단백질을 효과기 그룹에 연결시킬 수도 있다. 이러한 결합 단백질은 치료 용도에 특히 적합하다. 본원에서 사용된 용어 "효과기 그룹" 은 방사성동위원소나 방사성핵종 같은 세포독성 그룹, 독소, 치료제 그룹 또는 해당 업계에 공지된 기타 다른 효과기 그룹을 지칭한다. 적당한 효과기 그룹의 일례로는 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 칼리케아미신(calicheamicin), 아우리스타틴스(auristatins) 같은 돌라스타틴(dolastantin) 유사체류, 및 겔다나마이신(geldanamycin) 및 DM1 을 포함한 메이탄신(maytansine) 유도체 같은 화학요법제류가 있다. 특정 경우에서는, 잠재적 입체 장애를 줄이고자 다양한 길이의 스페이서 암을 상기 효과기 그룹에 부착하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 제 2 양태는 본 발명의 결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 결합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 본 발명의 분리된 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 숙주 세포로는 하이브리도마 ; 포유동물 세포, 예를 들면 햄스터, 토끼, 랫, 돼지, 마우스 또는 기타 다른 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 같은 진핵 세포 ; E. coli 같은 원핵 세포 ; 및 결합 단백질 생산을 위해 해당 업계에서 사용되는 기타 다른 세포가 있다. 숙주 세포로부터 골격 단백질 또는 항체 같은 결합 단백질을 제조하고 분리하는 다양한 방법이 해당 업계에 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는데 이를 사용할 수 있다. 또한, 파파인 또는 펩신 분해, 근대적 클로닝 기술, 단쇄 항체 분자(Plueckthun in : The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) 및 디아바디(Hollinger et al ., Proc . Natl. Acad . Sci U.S.A. 90 (1993), 6444-6448) 제조 기술과 같이, 결합 단백질 단편, 예를 들면 골격 단백질 단편 또는 항체 단편을 제조하는 방법 또한 해당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는데 이를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 결합 단백질을 이 결합 단백질을 분비하는 하이브리도마로부터 제조한다. 예시로 문헌 [Koehler et al ., Nature 256 (1975), 495] 참조하라.
본 발명의 추가적 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 숙주 세포에서 이 결합 단백질의 발현을 최적화 및/또는 증폭시키고 상기 숙주 세포로부터 이 결합 단백질을 분리함으로써 재조합 방식으로 제조한다. 이를 위해, 상기 결합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 상기 결합 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유한 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키고, 본 발명의 결합 단백질을 생산하기 적합한 조건 하에서 이를 배양한다. 예시로 미국 특허 번호 제 4,816,567 호를 참조하라. 바람직한 숙주 세포로는 CHO 세포, NS/0 골수종 세포, 인간 배아 신장 293 세포, E. coli 및 사카로마이세스 세레비시아에를 들 수 있다.
항체가 결합 단백질인 경우와 관련하여, 이들 항체는 완전 인간 항체를 생산하도록 유전자 조작된 동물로부터 또는 박테리오파지, 효모, 리보솜 또는 E. coli 에서 제작된 항체 디스플레이 라이브러리로부터 제조할 수도 있다. 예시로 문헌 [Clackson et al ., Nature 352 (1991), 624-628, Marks et al ., J. MoI . Biol . 222 (1991), 581-597, Feldhaus and Siegel J Immunol Methods . 290, 69-80, Groves and Osbourn, Expert Opin Biol Ther ., 5, 125-135 및 Jostock and Dubel, Comb Chem High Throughput Screen . 8, 127-133] 참조하라.
인간 항체를 사용하면 마우스 또는 랫 가변 및/또는 불변 영역을 보유한 항체와 관련된 일부 문제점들이 해소된다. 이러한 마우스 또는 랫 유래성 단백질의 존재는 해당 항체의 급 소멸을 야기시킬 수 있거나 또는 환자로 하여금 해당 항체에 대한 면역 반응의 발생을 야기시킬 수 있다. 마우스 또는 랫 유래성 항체를 사용하지 않기 위해서는, 기능성 인간 항체 좌위(loci)를 설치류의 기타 다른 포유동물 또는 동물 내로 도입시켜 설치류의 기타 다른 포유동물 또는 동물이 완전한 인간 항체를 생산하도록 함으로써 완전 인간 항체를 생성할 수 있다.
완전 인간 항체의 생성 방법 중 하나는 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위의 245 kb 및 190 kb-크기 생식계열 배치 단편을 포함하도록 조작된 바 있는 XENOMOUSE® 변종을 사용하는 것이다. 마우스의 기타 다른 제노마우스 변종은 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위의 980 kb 및 800 kb-크기 생식계열 배치 단편을 포함한다. 마우스의 또 다른 제노마우스 변종은 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위의 980 kb 및 800 kb-크기 생식계열 배치 단편과 더불어 740 kb-크기의 생식계열 배치형 완전 인간 람다 경쇄 좌위를 포함한다. 예시로 문헌 [Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) 및 Green and Jakobovits J. Exp . Med . 188:483-495 (1998) 참조하라. XENOMOUSE® 변종은 아브제닉스, 인코포레이티드(Abgenix, Inc. ; Fremont, CA)로부터 입수가능하다.
XENOMOUSE® 마우스의 생산과 관련해서는 미국 특허 출원 일련번호 제 07/466,008 호(1990 년 1 월 12 일자 제출), 제 07/610,515 호(1990 년 11 월 8 일자 제출), 제 07/919,297 호(1992 년 7 월 24 일자 제출), 제 07/922,649 호(1992 년 7 월 30 일자 제출), 제 08/031,801 호(1993 년 3 월 15 일자 제출), 제 08/112,848 호(1993 년 8 월 27 일자 제출), 제 08/234,145 호(1994 년 4 월 28 일자 제출), 제 08/376,279 호(1995 년 1 월 20 일자 제출), 제 08/430,938 호(1995 년 4 월 27 일자 제출), 제 08/464,584 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 제 08/464,582 호(1995 년 6 월 5일자 제출), 제 08/463,191 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 제 08/462,837 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 제 08/486,853 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 제 08/486,857 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 제 08/486,859 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 제 08/462,513 호(1995 년 6 월 5 일자 제출), 08/724,752(1996 년 10 월 2 일자 제출), 및 제 08/759,620 호(1996 년 12 월 3 일자 제출), 미국 특허 공개 제 2003/0217373 호(2002 년 11 월 20 일자 제출), 및 미국 특허 번호 제 6,833,268 호, 제 6,162,963 호, 제 6,150,584 호, 제 6,114,598 호, 제 6,075,181 호, 및 제 5,939,598 호 및 일본 특허 번호 제 3 068 180 B2 호, 제 3 068 506 B2 호, 및 제 3 068 507 B2 호에 추가 논의 및 설명되어 있다. 또한 유럽 특허 번호 제 EP 0 463 151 B1 호(1996 년 6 월 12 일자 등록 공고), 국제 특허 공개 번호 제 WO 94/02602 호(1994 년 2 월 3 일자 공개), 국제 특허 공개 번호 제 WO 96/34096 호(1996 년 10 월 31 일자 공개), 제 WO 98/24893 호(1998 년 6 월 11 일자 공개), 제 WO 00/76310 호(2000 년 12 월 21 일자 공개)를 참조하라. 상기-인용된 특허, 출원 및 참고문헌 각각에 대한 개시는 전문이 본원에 참고로 인용된 것이다.
대안적 방안으로, 젠팜 인터내쇼날, 인코포레이티드(GenPharm International, Inc.)를 포함한 다른 업체에서는 "미니좌위(minilocus)" 를 이용해 왔다. 미니좌위 방안에서는, Ig 좌위로부터 조각들을(개별 유전자) 포함시킴으로써 외인성 Ig 좌위를 유사하게 만든다. 즉, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변 영역 및 제 2 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)을 동물내 삽입을 위한 구성체로 형성시킨다. 이러한 방안은 본원에 참고로 인용된 문헌들인 미국 특허 번호 제 5,545,807 호(Surani et al .) 및 미국 특허 번호 제 5,545,806 호, 제 5,625,825 호, 제 5,625,126 호, 제 5,633,425 호, 제 5,661,016 호, 제 5,770,429 호, 제 5,789,650 호, 제 5,814,318 호, 제 5,877,397 호, 제 5,874,299 호, 및 제 6,255,458 호(각각 Longerg and Kay), 미국 특허 번호 제 5,591,669 호 및 제 6,023,010 호 (Krimpenfort and Berns), 미국 특허 번호 제 5,612,205 호, 제 5,721,367 호, 및 제 5,789,215 호(Berns et al .) 및 미국 특허 번호 제 5,643,763 호(Choi and Dunn), 및 젠팜 국제 미국 특허 출원 일련 번호 제 07/574,748 호(1990 년 8 월 29 일자 제출), 제 07/575,962 호(1990 년 8 월 31 일자 제출), 제 07/810,279 호(1991 년 12 월 17 일자 제출), 제 07/853,408 호(1992 년 3 월 18 일자 제출), 제 07/904,068 호(1992 년 6 월 23 일자 제출), 제 07/990,860 호(1992 년 12 월 16 일자 제출), 제 07/053,131 호(1993 년 4 월 26 일자 제출), 제 08/096,762 호(1993 년 7 월 22 일자 제출), 제 08/155,301 호(1993 년 11 월 18 일자 제출), 제 08/161,739 호(1993 년 12 월 3 일자 제출), 제 08/165,699 호(1993 년 12 월 10 일자 제출), 제 08/209,741 호(1994 년 3 월 9 일자 제출)에 기술되어 있다. 또한 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌들인 유럽 특허 번호 제 0 546 073 B1 호, 국제 특허 출원 번호 제 WO 92/03918 호, 제 WO 92/22645 호, 제 WO 92/22647 호, 제 WO 92/22670 호, 제 WO 93/12227 호, 제 WO 94/00569 호, 제 WO 94/25585 호, 제 WO 96/14436 호, 제 WO 97/13852 호, 및 제 WO 98/24884 호 및 미국 특허 번호 제 5,981,175 호 참조하라. 추가로, 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌들인 [Taylor et al ., 1992, Chen et al ., 1993, Tuaillon et al ., 1993, Choi et al ., 1993, Lonberg et al ., (1994), Taylor et al ., (1994), 및 Tuaillon et al ., (1995), Fishwild et al ., (1996)] 참조하라.
키린(Kirin)은 미세세포(microcell) 융합에 의해 대형 염색체 조각 또는 전체 염색체를 도입시킨 마우스로부터 인간 항체를 생성하는 것을 입증하였다. 본원에 참고로 인용된 문헌인 유럽 특허 출원 번호 제 773 288 호 및 제 843 961 호를 참조하라. 부가적으로, 키린의 Tc 마우스와 메다렉스(Medarex)의 미니좌위(Humab)를 교배한 결과로 KM™-마우스가 생성된 바 있다. 이들 마우스는 키린 마우스의 HC 트랜스염색체(transchromosome)과 메다렉스 마우스의 카파쇄 트랜스유전자(transgene)를 보유한다(Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
인간 항체는 또한 생체 외 방법에 의해서도 유도될 수 있다. 적합한 예시로는 파지 디스플레이(Cambridge Antibody Technology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (이전 명칭 : Proliferon), Affimed 에서 시판), 리보솜 디스플레이(Cambridge Antibody Technology 에서 시판), 효모 디스플레이 등이 포함되나, 이들로만 한정되지 않는다.
본원에 개시된 항체는 후술 된 바와 같이 XENOMOUSE® 기술을 이용하여 제조하였다. 이러한 마우스는 이후 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있으며, 마우스의 면역글로불린 분자 및 항체 생성에는 결함이 있다. 이를 실시하는데 이용할 수 있는 기술에 대한 것은 본원 배경 부분에 개시된 특허, 출원 및 참고문헌에 기술되어 있다. 반면에, 특히 마우스 및 이로부터 유래 된 항체를 형질전환 생산하는 바람직한 실시형태는 본원에 참고로 인용된 문헌들인 미국 특허 출원 일련 번호 제 08/759,620 호(1996 년 12 월 3 일자 제출) 및 국제 특허 공개 번호 제 WO 98/24893 호(1998 년 6 월 11 일자 공개) 및 제 WO 00/76310 호(2000 년 12 월 21 일자 공개)에 개시되어 있다. 또한 본원에 참고로 인용된 문헌인 [Mendez et al . Nature Genetics 15:146-156 (1997)] 참조하라.
이러한 기술을 이용함으로써, 각종 항원에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생산한 바 있다. 기본적인 것들만 설명하면, 마우스의 XENOMOUSE® 계열을 관심 항원(예, HER-3)으로 면역시키고, 항체를 발현한 마우스로부터 림프 세포(B-세포 같은)를 회수하여 이 회수한 세포주를 골수-형 세포주와 융합하여 불멸의 하이브리도마 세포주를 제조한다. 관심 항원에 특이적인 항원을 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하기 위해 이들 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하였다. 본원에는 HER-3 에 특이적인 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마 세포주를 생산하는 방법이 제공되어 있다. 추가로, 본원에는 상기한 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 비롯하여, 상기한 세포주에 의해 생산된 항체를 특징규명하는 것이 제공되어 있다.
일반적으로, 융합 하이브리도마에 의해 생산된 항체는 완전 인간 카파 경쇄를 가진 인간 IgG1 중쇄이었다. 본원에 기술된 항체는 인간 IgG1 중쇄 뿐만 아니라 IgG4 중쇄도 보유하고 있다. 항체들은 IgG2 또는 IgG3 를 비롯한, 기타 다른 인간 이소타입의 항체도 가능하다. 이 항체들은 고상 및 세포-기반 기술에 의해 측정시, 통상적으로 약 10-6 내지 약 10-13 M 또는 그 미만의 KD 를 가지는 고 친화도를 보유하고 있었다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, 본원에서 사용된 용어 "분리된 핵산 분자" 는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부 조합체를 의미하는 것으로, 그 기원상 "분리된 핵산 분자" 는 (1) 자연상에서 발견되는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전체 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부분과 결합되어 있지 않거나, (2) 자연상에서는 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합되어 있거나, 또는 (3) 대형 서열의 일부로서 자연상에 존재하지 않는 것이다. 추가로, 본원에서 지칭된 용어 "핵산 분자" 는 리보뉴클레오티드 혹은 데옥시뉴클레오티드 유형의 길이가 적어도 10 염기인 뉴클레오티드의 중합체 형태 또는 변형되거나 치환된 슈가 그룹 등을 가진 뉴클레오티드와 같이 뉴클레오티드 유형의 변형 형태를 의미한다. 이 용어는 또한 단일 가닥 및 이중 가닥의 DNA 형태를 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서는, 본 발명의 핵산 분자가 제어 서열에 작동가능하게 결합된다. 본원에서 사용된 용어 "제어 서열" 은 이들이 결찰되어 있는 코딩 서열의 발현과 프로세싱을 실행하는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 제어 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 달라진다. 원핵생물에서는, 이러한 제어 서열이 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다. 진핵생물에서는 일반적으로 이러한 제어 서열이 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 본 발명에 따라, 용어 "제어 서열" 은 발현과 프로세싱에 반드시 필요한 모든 성분을 최소한으로 포함하는 것으로, 유리하게 작용하도록 하는 부가적 성분, 예를 들면 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수도 있다. 더 나아가, 본원에서 사용된 용어 "작동가능하게 결합된" 이란, 해당 성분이 그 의도하는 방식으로 기능하도록 하는 관계에 위치하고 있음을 지칭한다. 한편, 본 발명에서는, 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열에 적합한 조건 하에서 이루어지도록 하는 방식으로, 코딩 서열에 작동가능하게 결합된 발현 제어 서열이 결찰되어 있다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터이다. 이 핵산 분자는 제어 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다. 더 나아가, 벡터는 복제 기원 또는 선별용 마커 유전자를 부가적으로 포함할 수도 있다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 벡터의 일례를 예시하면 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등이 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포에 관한 것이다. 형질전환은 예를 들자면 바이러스 내에(또는 바이러스성 벡터 내로) 폴리뉴클레오티드를 패키징하고 이 바이러스(또는 벡터)를 숙주 세포에 형질도입하는 것을 포함하여, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의 공지 방법에 의해 또는 본원에 참 고로 인용된 특허인 미국 특허 번호 제 4,399,216 호, 제 4,912,040 호, 제 4,740,461 호, 및 제 4,959,455 호에 의해 예시된 바와 같이 해당 업계에 공지된 형질감염 절차에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 이종성(heterologous) 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 해당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 것으로는 덱스트란-매개 형질감염법, 칼슘 포스페이트 침전법, 폴리브렌 매개 형질감염법, 원형질체 융합법, 전기천공법, 리포솜 내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 방법 및 DNA 의 핵내 직접 미세주사 방법이 포함된다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 숙주 세포의 일례로는 하이브리도마 ; 포유동물 세포, 예를 들면 햄스터, 토끼, 랫(rat), 돼지, 마우스 또는 기타 다른 동물 세포 ; 식물 세포 및 진균 세포, 예를 들면 옥수수, 담배, 사카로마이세스 세레비시아에, 피치아 파스토리스 같은 진핵 세포 ; 또는 E. coli 같은 원핵 세포 ; 및 항체 생산을 위해 해당 업계에서 사용되는 기타 다른 세포가 있다. 특히 발현용 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 해당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 것으로는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수가능한 다수의 불멸화 세포주가 포함되는데, 그 일례로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종(예, Hep G2), 및 다수의 기타 다른 세포주가 포함되나, 이들로만 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 활성제로서 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물이다. 본원에서 사용된 용어 "약학적 조성물" 은 환자에게 적절히 투여하였을 때 목적하는 치료 효과를 유도해낼 수 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다(본원에 참고로 인용된 문헌인 [The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)]). 본 발명에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 효능은 적어도 1 종의 결합 단백질이 HER-3 에 결합하는 것을 기반으로 한다. 바람직하게는, 이러한 결합이 HER-3-매개 신호 전달의 감소를 야기시킨다.
더 나아가, 본원에서 사용된 용어 "담체" 는 사용된 투여량 및 농도에서 세포 또는 포유동물에게 노출시 이들에게 무독성을 나타내는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 때로는 생리적으로 허용가능한 담체가 pH 완충 수용액 또는 리포좀(약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소형 소포체)이다. 생리적으로 허용가능한 담체의 일례로는 완충제류, 예를 들면 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산 ; 항산화제류, 예를 들면 아스코르브산 ; 저 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드류 ; 단백질류, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린 ; 친수성 중합체류, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈 ; 아미노산류, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 ; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물류, 예를 들면 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린 ; 킬레이트제류, 예를 들면 EDTA ; 슈가 알코올류, 예를 들면 만니톨 또는 솔비톨 ; 염-형성 반대이온류, 예를 들면 나트륨 ; 및/또는 비이온성 계면활성제류, 예를 들면 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PULRONICS™ 이 포함된다.
본 발명의 한 실시형태에서는, 상기 약학적 조성물에 함유된 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질이 칼리케아미신, 아우리스타틴-PE 같은 작동제, 방사성동위원소 또는 겔다나마이신 및 메이탄신 같은 독성 화학요법제에 결합되어 있다. 특히, 이들 결합 단백질 접합체는 세포, 예를 들면 제거 대상인 HER-3 발현 암 세포를 표적화하는데 유용하다.
또한, 방사성동위원소에 본 발명의 결합 단백질을 결합시키는 것은 예를 들자면 종양 치료에 이점들을 제공한다. 화학요법 및 기타 다른 형태의 암 치료와는 달리, 방사성면역요법이나 방사성동위원소-결합 단백질 결합체 투여는 주변의 정상적인 건강 조직에는 최소한의 손상을 주면서 직접 암 세포를 표적으로 한다. 이러한 "마법 탄환(magic bullet)" 의 사용으로, 현시점에서 이용가능한 다른 치료 형태에 비해 훨씬 소량의 방사성동위원소를 사용하여 환자를 치료할 수 있다. 바람직한 방사성동위원소로는 이트륨90(90Y), 인듐111(111In), 131I, 99mTc, 방사성실버-111, 방사성실버-199 및 비스무스213이 포함된다. 본 발명의 결합 단백질에 방사성동위원소를 결합시키는 것은 예를 들면 통상의 이작용성 킬레이트를 사용하여 실시할 수 있다. 실버가 1 가이므로, 방사성실버-111 및 방사성실버-199 결합의 경우에는, 황-계열의 링커(linker) 사용이 가능하다(Hazra et al ., Cell Biophys. 24-20, 1-7 (1994)). 실버 방사성동위원소의 결합은 아스코르브산으로 면역글로불린을 환원시키는 것을 수반할 수 있다. 더 나아가, 티우세탄(tiuxetan)은 이브리투모맵(ibritumomab)에 부착된 MX-ETPA 링커 킬레이터로, 이브리투모맵 티우세탄(Zevalin)을 형성한다[(Witzig, T.E, Cancer Chemother . Pharmacol . 48 Suppl 1, 91-5 (2001)]. 이브리투모맵 티우세탄은 인듐 111(111In) 또는 90Y 와 같은 방사성동위원소와 반응하여 111In-이브리투모맵 티우세탄 및 90Y-이브리투모맵 티우세탄을 각각 형성할 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 결합 단백질은 특히 암 치료용도로 사용시, 칼리케아미신(Hamann et al ., Bioconjug . Chem . 13(1), 40-6 (2002)), 겔다나마이신(Mandler et al ., J. Natl . Cancer Inst ., 92(19), 1549-51 (2000)) 및 메이탄신, 예를 들면 마이탄시노이드 약물인 DM1(Liu et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 93:8618-8623 (1996)) 같은 독성의 화학치료성 약물과 접합시킬 수도 있다. 산성 또는 환원 조건하에서 또는 특정 프로테아제에 노출시 약물을 방출하는 상이한 링커를 본 기술에 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 결합 단백질을 해당 업계에 개시된 바와 같이 접합시킬 수 있다.
일례로, 아우리스타틴-PE 는 무-외피 해양 연체동물 펩티드 구성 돌라스타틴(dolastatin) 10 의 구조 변형체인 항미세관제(antimicrotubule agent)이다. 아우리스타틴-PE 는 항-종양 활성과 항-종양 혈관성 활성을 둘 다 가지고 있다(Otani et al ., Jpn . J. Cancer Res . 91(8), 837-44 (2000)). 예를 들면, 아우리스타틴-PE 는 췌장암 세포주에서 세포 성장을 억제하고 세포 주기 저지 및 세포사멸을 유도한다(Li et al ., Int . J. MoI . Med . 3(6), 647-53 (1999)). 따라서, 특정 종양에 대해 아우리스타틴-PE 의 항-종양 활성과 항-종양 혈관성 활성을 특이적으로 표적하기 위해, 아우리스타틴-PE 를 본 발명의 결합 단백질에 접합할 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, 약학적 조성물은 적어도 1 종의 추가 활성제를 포함한다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 추가 활성제에 대한 일례로는 EGFR, HER-2, HER-4, IGFR-1 또는 c-met 같은 기타 다른 수용체 단백질 키나제의 항체 또는 저 분자량 저해제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 같은 수용체 리간드, 독소루비신(doxorubicin), 시스-플라틴(cis-platin) 또는 카르보플라틴(carboplatin) 같은 세포독성 제제, 사이토카인 또는 항신생물제가 있다. 다수의 항신생물제가 현재 해당 업계에 공지되어 있다. 한 실시형태에서는, 항체 또는 면역조절성 단백질을 포함하되, 이들로만 한정되지 않는 치료성 단백질 그룹으로부터 상기 항신생물제를 선택한다. 다른 실시형태에서는, 유사분열 저해제, 키나제 저해제, 알킬화제, 항-대사산물, 삽입성(intercalating) 항생제, 성장 인자 저해제, 세포 주기 저해제, 효소, 토포이소머라제 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 항-생존제, 생체 반응 조절제, 항-호르몬, 예를 들면 항-안드로겐 및 항-혈관신생제로 이루어진 소 분자 저해제 또는 화학요법제의 그룹으로부터 상기 항신생물제를 선택한다. 항신생물제가 방사선인 경우에는, 내부 광원(근접치료법 ; BT) 또는 외부 광원(외부 빔 방사선 치료법; EBRT)을 사용하여 치료를 수행할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 과다증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료에 특히 적합하다. 이러한 과다증식성 질환은 예를 들면 HER 군 신호 전달 증가와 연관될 수 있다. 구체적으로, 이 질환은 HER-3 인산화 증가 및/또는 HER-3 과 HER 군의 다른 일원간의 복합체 형성 증가 및/또는 PI3 키나제 활성 증가 및/또는 c-jun 말단 키나제 활성 및/또는 AKT 활성 증가 및/또는 ERK2 활성 및/또는 PYK2 활성 증가와 연관될 수 있다. 과다증식성 질환은 유방암, 위장관암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 방광암, 신경교종, 흑색종, 또는 다른 HER-3 발현 또는 과다발현 암, 및 종양 전이 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 본원에서 사용된 용어 "예방 또는 치료" 는 이를 필요로 하는 환자에게서 상기 표적된 병리학적 증상 또는 질환을 예방하거나 저속 경감(완화)시키고자 하는 경우, 치료차원의 처치 및 예방차원이나 방지차원의 조치 둘 다를 지칭한다. 예방 또는 치료를 요하는 자는 질환 보유 경향이 있는 자뿐 아니라 이미 이 질환을 보유하고 있는 자 또는 이 질환을 예방하고자 하는 자가 포함된다. 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자는 포유동물 환자 즉, 인체, 가축용 및 농장용 동물, 및 동물원용, 스포츠용 또는 애완용 동물을 비롯하여 포유동물로 분류되는 임의의 동물들, 예를 들면 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 말한다. 치료를 필요로 하는 환자가 인체 환자인 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제, 그리고 임의로, 이전, 전달, 허용성 등을 향상시키고자 제형 내로 통상 혼입하는 기타 다른 제제와 활성제(들)를 혼합함으로써 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면 동결건조 제형, 수용액, 현탁액, 또는 정제, 당의정 또는 캡슐 같은 고형 제제의 형태로 제형화할 수 있다. 다수의 적절한 제형들이 모든 약제 화학자들에게 알려진 처방전 문헌인 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), 특히 그 중 87 장(Block, Lawrence)]에 밝혀져 있다. 이러한 제형에는 일례로 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예, Lipofectin™), DNA 접합체, 무수 흡수성 페이스트, 수중유형 및 유중수형 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고형 겔, 및 카르보왁스 함유 반-고형 혼합물이 포함된다. 제형내 활성제가 해당 제형에 의해 불활성화되지 않으며, 이 제형이 생리적으로 상용가능하고 투여 경로에 허용되는 것이면, 상기한 혼합물 중 어떠한 것이라도 본 발명에 따른 치료와 치료요법에 적절히 사용될 수 있다. 또한 문헌 [Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.", Regul . Toxicol . Pharmacol . 32(2), 210-218 (2000); Wang W., "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.", Int . J. Pharm . 203(1-2), 1-60 (2000); Charman W.N., "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.", J. Pharm . Sci . 89(8), 967-978 (2000); Powell et al ., "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. Pharm . Sci . Technol . 52, 238-311 (1998)] 및 약제 화학자에게 잘 알려진 제형, 부형제 및 담체 관련 부가적 정보에 대한 상기 문헌 내 인용문헌 참조하라.
본 발명의 다른 양태는 과다증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위해 적어도 1 종의 본 발명의 분리된 결합 단백질 및 임의로 적어도 1 종의 다른 활성제, 예를 들면 전술한 바와 같이 적어도 1 종의 항신생물제를, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제와의 부가혼합물 형태로 사용하는 용도에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 전술한 바의 약학적 조성물이고, 과다증식성 질환은 전술한 바의 과다증식성 질환인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태는 샘플을 본 발명의 결합 단백질과 접촉시키고, 이 샘플에서 HER-3 의 존재를 검출하는 것을 포함하는, HER-3 발현 관련 질환 또는 증상을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 샘플로는 종양 세포와 같이 HER-3 발현을 나타내는 세포, 혈액 샘플 또는 다른 적합한 샘플이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, HER-3 발현 관련 질환 또는 증상은 상기에서 정의한 과다증식성 질환이다.
본 발명에 따르면, 상기 방법은 예를 들면 세포 내 HER-3 항원의 검출에, 상기 언급된 과다증식성 질환을 앓고 있는 환자 내 HER-3 항원 농도의 측정에, 또는 환자 내 상기 과다증식성 질환의 단계결정에 사용할 수 있다. 연구중에 있는 피실험자에서 과다증식성 질환의 진행 단계를 결정하기 위해, 또는 치료 과정에 대한 피실험자의 반응을 특징짓기 위해서는, 혈액 샘플을 예를 들면 상기 피실험자로부터 채취하고, 이 샘플 내에 존재하는 HER-3 항원의 농도를 측정한다. 이렇게 수득한 농도를 사용하여 그 수치가 속하는 농도 범위를 확인한다. 이렇게 확인된 범주는 다양한 진단 피실험자 집단에서 확인된 진행 단계 또는 치료 단계와 관련성이 있으며, 이를 통해 연구중에 있는 피실험자의 단계가 정해진다. 환자로부터 수득한 질환, 예를 들면 암 조직의 생체조직편을 사용하면 HER-3 항원의 존재량을 또한 측정할 수 있다. 질환 조직 내에 존재하는 HER-3 항원의 양은 본 발명의 HER-3 항체를 사용하는 면역조직화학법, ELISA 또는 항체 에레이에 의해 측정할 수도 있다. 진단상 중요한 다른 파라미터는 HER-3 단백질의 이합체화 파트너뿐 아니라, 이합체화 상태 및 이들의 활성화 상태이다. 해당 업계에는 상기 파라미터를 측정하는 단백질 분석 방법이 잘 알려져 있으며, 이러한 것으로는 그중에서도 웨스턴 블롯 및 면역침전 기술, FACS 분석법, 화학적 가교법, 생물발광 공명 에너지 전이법(BRET), 형광 공명 에너지 전이법(FRET) 등 (예, Prince et al., Methods in Molecular Biology, 218:255-268 (2002)) 또는 eTag 기술(제 WO0503707 호, 제 WO04091384 호, 제 WO04011900 호)이 있다.
더 나아가, 다른 양태에서 본 발명은 유효량의 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여, 환자에서 HER-3 발현 관련 질환 또는 증상을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. HER-3 발현 관련 상기 질환 또는 증상으로는 상기에서 정의한 과다증식성 질환이 바람직하다. 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자는 포유동물 환자, 즉, 인체, 가축용 및 농장용 동물, 및 동물원용, 스포츠용 또는 애완용 동물을 비롯하여 포유동물로 분류되는 임의의 동물, 예를 들면 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 말한다. 상기 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자가 인체 환자인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게서 과다증식성 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 상기 환자에게 유효량의 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질과 부가적으로 상기에서 언급된 적어도 1 종의 다른 활성제, 예를 들면 적어도 1 종의 항신생물제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 이 방법이 비정상적 세포 성장, 이동 또는 침습을 억제하기 위한 것이다.
예를 들면 상기 언급된 제형에 의한 잠재적 결합 단백질 치료제의 전통적인 투여 방식 외에, 새로이 개발된 투여 방식을 본 발명에서 사용하는 것도 또한 가능하다. 그 일례로, 외과적 절제후 원발성 뇌 종양의 치료를 위해 131I-표지된 모노클로날 항체를 국소 투여한 것이 보고된 바 있다. 부가적으로, 모노클로날 항체 및 그 단편의 직접적인 정위방사선(stereotactic) 뇌 내 주사 또한 임상적 및 전-임상적으로 연구중에 있다. 경동맥 내 고삼투압성 관류가 약물 접합된 인간 모노클로날 항체를 원발성 뇌 악성종양으로 표적화하는 실험적 방법이다.
치료하고자 하는 증상의 유형과 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏ 의 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질을, 예를 들면 1 회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 해당 치료를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 통상적인 1 일 투여용량은 상기 언급된 요인들에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범주로 할 수 있다. 수일 또는 보다 장기간에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 치료하고자 하는 증상에 따라서는, 질환 증세가 목적하는 수준으로 억제될 때까지 해당 치료를 지속한다.
투여한 적어도 1 종의 항신생물제의 용량은 각종 요인에 따라 좌우된다. 이러한 요인의 예로는 약제의 특성, 종양 유형 또는 투여 경로가 있다. 본 발명은 임의 용량으로 한정되지 않음을 명심하여야 한다.
마지막으로, 추가 양태에서 본 발명은 적어도 1 종의 본 발명의 결합 단백질 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는, HER-3 매개 신호 전달 관련 과다증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 키트에 관한 것이다. 부가하여, 본 발명의 키트는 상기 언급된 바와 같은 적어도 1 종의 다른 활성제, 예를 들면 적어도 1 종의 다른 항신생물제를 추가로 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명은 이하 실시예 및 첨부된 도면에 의해 설명된다.
실시된 실험과 달성된 결과를 포함하는 다음의 실시예들은 단지 예시를 목적으로 제공된 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 : HER -3 항원 및 세포주 제조
본 연구에서는, 재조합 HER-3 단백질을 제조하였다. HER-3 서열(Genebank AccNr. 제 NM－001982 호)을 기반으로 프라이머를 가진 pcDNA3-HER-3(전장 인간 HER-3 를 가진 발현 벡터, C. Wallasch et al., EMBO J. 14, 4267-4275)로부터 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 HER-3(ECD) cDNA 의 세 포외 도메인을 클로닝하였다.
HER-3 의 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같았다 : 전방 프라이머 : 5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3' (SEQ ID NO: 233) 역방 프라이머 : 5'-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAACAGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 234)
PCR 산물을 BamH1 및 XbaI 으로 분해하고 이를 BamH1 및 XbaI 으로 분해한 pcDNA3(Invitrogen) 내로 결찰하였다. CaPO4 방법을 이용하여 상기 플라스미드를 HEK293 세포(제 ATCC No. CRL-1573 호)내로 형질감염시켰다. Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 통해, 수확된 조건 배지로부터 HER-3-HIS 융합 단백질을 정제하였다.
레트로바이러스성 유전자 전이에 의해 Rat1 HER-3 세포를 생성하였다. 간략하게 설명하면, GP+E 86 세포(제 ATCC No. CRL-9642 호, 3 x 105)를 60 mm 배양 디스크상에 씨딩하고, 칼슘 포스페이트 방법을 이용하여 이를 2 ㎍/㎖ pIXSN 벡터 또는 pIXSN-HER-3 cDNA(C. Wallasch, PhD Thesis, Max-Planck lnsitute of Biochemistry, Martinsried, Germany)로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 배지를 신선한 배지로 교체하고, GP+E 86 세포를 4-8 시간 동 안 배양하였다. 그 후, 미충만 Rat1 세포(6 cm 접시 당 2 x 105 세포수)를, 폴리브렌(4 ㎎/㎖ ; Aldrich)의 존재하에서 4-12 시간 동안 고 역가 pLXSN(Clontech Laboratories, Inc.) 또는 pLXSN-HER-3, p 바이러스(> 1 X 106 G418 c.f.u./㎖ ; m.o.i. of 10)를 배출하는 GP+E 86 세포의 상층액과 함께 배양하였다. 배지 교환 후, G418 를 사용하여 Rat1 세포를 선별하기 시작하였다. 보통은, 21 일간 선별후, 안정된 클론이 채취되었다.
실시예 2 : 인체 암 세포주내 HER -3 발현
일례로 HER-3 같은 수용체 티로신 키나제는 양성의 증식성 세포 성장으로부터 악성 암종으로 전이되는 것와 같은 과다증식성 질환의 발병과 진행에 결정적인 역할을 한다. 종양 세포와 정상 조직간에는 HER-3 발현이 다르게 나타나므로, HER-3 발현에 대한 분석은 본 발명의 결합 단백질을 사용한 치료에 효과를 보이게 되는 환자 소그룹의 식별에 결정적 요인이 된다. 따라서, 인체 암 형성시 HER-3 의 역할을 입증하기 위해 인체 암 세포주의 패널에서 HER-3 발현을 정량하였다. ATCC 에서 추천한 바대로 암 세포주를 성장시켰다. 상세히 설명하면, 105 개의 세포를 PBS 중의 10mM EDTA 를 사용하여 수확하고, FACS 완충액(PBS, 3 % FCS, 0.4 % 아지드)으로 1 회 세척한 후, 이를 96-웰 원형 바 닥 플레이트상에 씨딩하였다. 이 세포를 1000 rpm 에서 3 분 동안 회전시켜 상층액을 제거한 후, 이를 α-HER-3 항체 2D1D12(WO03013602)(3 ㎍/㎖)와 함께 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 1 시간 동안 빙상에서 배양하고, FACS 완충액으로 2 회 세척한 후, FACS 완충액에 1:50 으로 희석시킨 2 차 항체(100 ㎕/웰) 당나귀(donkey)-항-인간-PE(Jackson)와 함께 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 30 분 동안 암실내 빙상에서 배양하고, FACS 완충액으로 2 회 세척한 후, 분석하였다(FACS, Beckman Coulter). 도 1 에는 대표적인 분석 결과가 제시되어 있으며, 이는 HER-3 이 각종 인체 암에서 발현됨을 입증하고 있다.
실시예 3 : 면역화 및 역가측정
상기 실시예 1 에 기술된 바와 같이 제조한 HER-3 ECD 단백질과 C32 세포(인체 흑색종 ; 제 ATCC #CRL-1585 호)를 항원으로 사용하였다. XenoMouse® 마우스(XenoMouse® 변종 : XMG1 및 XMG4, Abgenix, Inc. Fremont, CA)를 연속적으로 면역시켜 HER-3 에 대한 모노클로날 항체를 발생시켰다. 모든 주사에 대해 족저 경로를 통해 XenoMouse® 동물을 면역시켰다. 각 주사별 총 용적은 마우스 당 50 ㎕, 족저 당 25 ㎕ 이었다.
코호트(cohort) #1(10 XMG1 마우스)의 경우, 초기 면역화는 마우스 당 TITERMAX GOLD®(Sigma, Oakville, ON)과 1:1(v/v) 부가혼합된 HER-3 ECD 단백질 10 ㎍ 을 사용하여 실시하였다. 무-피로겐 D-PBS 중의 명반 겔(Sigma, Oakville, ON) 100 ㎍ 과 1:1(v/v) 부가혼합된 HER-3 ECD 단백질 10 ㎍ 을 사용하여 연속 5 회 부스트 처리하였다. 6 차 부스트는 TITERMAX GOLD® 와 1:1(v/v) 부가혼합된 HER-3 ECD 단백질 10 ㎍ 으로 이루어졌다. 7 차 주사는 100 ㎍ 명반 겔과 1:1(v/v) 부가혼합된 HER-3 ECD 단백질 10 ㎍ 으로 이루어졌다. 최종 부스트는 면역보조제(adjuvant) 없이 무-피로겐 DPBS 에서 HER-3 ECD 10 ㎍ 을 사용하여 실시하였다. 금번 프로토콜에서는 0 일, 4 일, 7 일, 11 일, 15 일, 20 일, 24 일 및 29 일차에 XenoMouse® 마우스를 면역시키고, 33 일차에 융합을 실시하였다. 4 차 부스트 후 13 일차에 그리고 6 차 부스트 후 19 일차에 안와후부(Retro-Orbital) 채혈 절차에 의해 두 차례 채혈을 실시하였다. 코호트 #2 는 없다.
코호트 #3(10 XMG1 마우스) 및 코호트 #4(10 XMG4 마우스)의 경우에는, 마우스 당 TITERMAX GOLD®와 1;1(v/v) 부가혼합된 무-피로겐 둘베코스 PBS(DPBS) 에서 C32 세포 107 개로 1 차 주사를 실시하였다. 마우스 당 아주-포스(Adju-Phos) 25 ㎍ 및 CpG 10㎍ 과 부가혼합된 무-피로겐 DPBS 에서 C32 세포 107 개를 사용하여 다음 4 회 부스트 처리하였다. 6 차 부스트는 마우스 당 TITERMAX GOLD® 와 1:1(v/v) 부가혼합된 무-피로 겐 DPBS 에서 C32 세포 107 개를 사용하여 실시하였다. 7 차, 8 차 및 9 차 부스트는 마우스 당 아주-포스 25 ㎍ 및 CpG 10㎍ 과 부가혼합된 무-피로겐 DPBS 에서 C32 세포 107 개를 사용하여 실시하였다. 10 차 내지 14 차 부스트는 마우스 당 아주-포스 25 ㎍ 및 CpG 10 ㎍ 과 부가혼합된 무-피로겐 DPBS 에서 HER-3 ECD 단백질 5 ㎍ 을 사용하여 실시하였다. 최종 부스트는 면역보조제 없이 무-피로겐 DPBS 에서 HER-3 ECD 단백질 5 ㎍ 으로 이루어졌다. 코호트 #3 및 코호트 #4 둘 다에 대해, 금번 프로토콜에서는 0 일, 3 일, 7 일, 11 일, 14 일, 17 일, 21 일, 24 일, 28 일, 33 일, 35 일, 38 일, 42 일 및 45 일차에 XenoMouse® 마우스를 면역시키고, 49 일차에 융합을 실시하였다. 4 차 부스트 후 12 일차에, 6 차 부스트 후 19 일차에 그리고 12 차 부스트 후 40 일차에 안와후부 채혈 절차에 의해 세 차례 채혈을 실시하였다.
역가에 의한 수확용 동물의 선별
코호트 #1 의 경우, HER-3 ECD 단백질에 대한 ELISA 에 의해, 면역된 XenoMouse® 마우스로부터 수득한 혈청내 항-HER-3 항체 역가를 측정하였다. 650 nm 에서의 광학적 밀도로부터 XenoMouse® 동물별 특이적 역가를 측정하였으며, 그 결과가 하기 표 1 에 제시되어 있다. 역가 수치는 배경값의 2 배 OD 값을 나타내는 혈청의 최대 희석배수의 역수이다. 그러므로, 숫자가 클수록, HER-3 ECD 에 대해 더 큰 체액성 면역 반응이 일어남을 나타냈다.
Figure 112008046186434-PCT00001
코호트 #3 및 #4 의 경우는, Rat1/HER-3 세포(항원 양성 세포주) 및 Rat1/pLSXN 세포(항원 음성 세포주)를 사용한 FACS 에 의해, 면역된 XenoMouse® 마우스로부터 혈청내 항-HER-3 항체 역가를 측정하였다. 그 데이타가 혈청 샘플의 계열 희석액에 의한 세포 항-HER-3 세포 염색의 기하 평균(GeoMean) 형광 강도로서 제시되어 있다.
Figure 112008046186434-PCT00002
Figure 112008046186434-PCT00003
실시예 4 : 림프구 회수, B-세포 분리, 융합 및 하이브리도마 생성
면역된 마우스를 희생시켜, 각 코호트로부터 림프절을 수확하여 취합하였다. DMEM 중에서 분쇄함으로써 상기 림프성 세포를 분해시켜 조직으로부터 세포가 방출되도록 하고, 이 세포를 DMEM 중에 현탁시켰다. 이 세포를 계수한 후, 100 x 106 개의 림프구 당 0.9 ㎖ 의 DMEM 을 상기 세포 펠릿에 첨가하여 상기 세포를 부드럽게 완전히 재현탁시켰다. 100 x 106 개의 세포 당 CD90+ 자성 비드 100 ㎕ 를 사용하여, 세포를 4 ℃ 에서 15 분 동안 상기 자성 비드와 함께 상기 세포를 배양함으로써 세포를 표지시켰다. 양성 세포를 108 개 이하로(또는 전체 세포를 2 x 109 개 이하로) 함유하는 상기 자성-표지된 세포 현탁액을 LS+ 컬럼상으로 로딩하고 이 컬럼을 DMEM 으로 세척하였다. 전체 용출물을 CD90-음성 분획으로서 수거하였다(이들 세포의 대부분은 B 세포로 예상되었다).
상기로부터 수득한 B 세포가 풍부한 세척물과 ATCC 로부터 구매한 비분비성 골수종 P3X63Ag8.653 세포(Cat. No. 제 CRL 1580 호)(Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550)를 1:1 의 비율로 혼합함으로써 융합을 실시하였다. 세포 혼합물을 800 g 에서 원심분리하여 천천히 펠릿으로 만들었다. 상층액을 완전히 제거한 후, 세포를 2 분 이하로 2-4 ㎖ 의 프로나제 용액(CalBiochem, Cat. No. 53702 ; PBS 에서 0.5 mg/ml)에 의해 처리하였다. 이후, 3-5 ㎖ 의 FBS 를 첨가하여 효소 활성을 저지시키고, 전기 세포 융합 용액, ECFS(0.3 M 수크로즈, Sigma, Cat. No. S7903, 0.1 mM 마그네슘 아세테이트, Sigma, Cat. No. M2545, 0.1 mM 칼슘 아세테이트, Sigma, Cat. No. C4705)를 사용하여 상기 현탁액을 총 용적 40 ㎖ 로 조정하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 40 ㎖ 의 ECFS 에 재현탁시켰다. 이러한 세척 단계를 반복하고, 세포를 ECFS 에 재차 재현탁시켜 2 x 106 세포수/㎖ 의 농도가 되도록 하였다.
융합 발생기, 모델 ECM2001(Genetronic, Inc., San Diego, CA)을 사용하여 전기-세포 융합을 실시하였다. 사용된 융합실 크기는 2.0 ㎖ 이었으며, 다음과 같이 기구 세팅이 이루어졌다 : 설정 조건 : 전압 : 50 V, 시간 : 50 초 ; 막 파열시 : 전압 : 3000 V, 시간 : 30 마이크로초 ; 융합 후 유지 시간 : 3 초.
ECF 후, 멸균 조건하에서 세포 현탁액을 융합실로부터 조심스럽게 제거하여 동량의 하이브리도마 배양 배지[DMEM(JRH Biosciences)], 15 % FBS(Hyclone), L-글루타민, pen/strep, OPI(옥살로아세테이트, 피루베이트, 소 인슐린)(모두 Sigma 로부터 입수) 및 IL-6[(Boehringer Mannheim) 보강]를 함유하는 멸균 튜브로 이전시켰다. 이 세포를 37 ℃ 에서 15-30 분 동안 배양한 후, 이를 400 g 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 세포를 소량의 하이브리도마 선별 배지[0.5 x HA(Sigma, Cat. No. A9666)이 보강된 하이브리도마 배양 배지] 에 부드럽게 재현탁시키고, 96-웰 플레이트 당 총 5 x 106 개의 B 세포 그리고 웰 당 200 ㎕ 로 최종 도말하는 것을 기준으로, 더 많은 하이브리도마 선별 배지를 사용하여 용적을 조정하였다. 세포를 부드럽게 혼합하고 96-웰 플레이트내로 피펫팅하여 성장하도록 하였다. 7 일차 또는 10 일차에, 배지의 절반을 제거하고, 세포에 하이브리도마 선별 배지를 재-공급하였다.
실시예 5 : ELISA 에 의한 후보 항체의 선별
배양 14 일 후, 코호트 #1(코호트 1 의 마우스를 임의적으로 융합체 #1 및 #2 로 분리)로부터 수득한 하이브리도마 상층액을 HER-3-특이성 항체에 대하여, 정제된 his-태그형(tagged) HER-3 ECD 를 사용한 ELISA 에 의해 1 차 스크리닝하고, 염소 항-huIgGFc-HRP(Caltag Inc., Cat. No. H10507, 1:2000 희석배수 농도 사용)를 사용한 ELISA 에 의해 무관련 hig-태그형 단백질에 대한 역-스크리닝을 실시하여 ELISA 플레이트상에 고정된 HER-3 ECD 에 대한 인간 IgG 결합을 검출하였다. 1 차 스크리닝시 양성 하이브리도마 세포 성장 웰로부터 수득한 오래된(old) 배양 상층액을 제거하고, HER-3 양성 하이브리도마 세포를 신선한 하이브리도마 배양 배지로 현탁시키고, 이를 24-웰 플레이트로 이전시켰다. 배양 2 일 후, 이 상층액을 2 차 확인 스크리닝용으로 준비하였다. HER-3 특이성 완전 인간 IgGk 항체에 대한 2 차 확인 스크리닝에서는, 두 세트의 검출용 항체 : 인간 감마쇄 검출용 염소 항-huIgGFc-HRP(Caltag Inc., Cat. No. H10507, 1:2000 희석배수 농도 사용) 및 인간 카파 경쇄 검출용 염소 항-hIg 카파-HRP(Southern Biotechnology, Cat. No. 2060-05)를 사용한 ELISA 에 의해, 상기 1 차 스크리닝에서의 양성체를 스크리닝하였다. 코호트 #1 로부터 91 개의 완전 인간 IgG/카파 HER-3 특이성 모노클로날 항체가 생성되었다.
실시예 6 : FMAT / FACS 에 의한 후보 항체의 선별
배양 14 일 후, 코호트 #3 및 #4(융합체 #3 및 #4)로부터의 하이브리도마 상층액을 HER-3-특이성 모노클로날 항체에 대하여 FMAT 에 의해 스크리닝하였다. 1 차 스크리닝에서, 1:10 으로 최종 희석시킨 하이브리도마 상층액을 실온에서 6 시간 동안 인간 HER-3 을 발현하는 Rat1-Her-3 세포 및 400 ng/㎖ Cys5-접합된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG, Fc-특이성 항체(Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-176-098)와 함께 배양하였다. 세포에 대한 항체 및 검출 항체 복합체의 결합을 FMAT(Applied Biosystems)에 의해 측정하였다. 세포에 대한 항체의 비-특이적 결합은 Rat1 모세포에 대한 결합에 의해 측정하였다. HER-3-특이성 항체를 생산하는 총 420 개의 하이브리도마를 융합체 #3 의 1 차 스크린으로부터 선별하였다. 동일한 FMAT 프로토콜을 이용하여 이들 팽창된 배양물로부터의 상층액을 재차 시험한 결과, 이 중 262 개가 HER-3 발현 세포에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. HER-3-특이성 항체를 생산하는 총 193 개의 하이브리도마를 융합체 #4 의 1 차 스크린으로부터 선별하였다. FACS 에 의해 이들 팽창된 배양물로부터의 상층액을 시험한 결과, 이 중 138 개가 HER-3 발현 세포에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. FACS 확인 분석에서, Rat1-Xher3 세포 및 Rat1 모세포(음성 대조군으로서)를 2 % FBS 함유 PBS 에서 40 ℃ 로 1 시간 동안 1:2 희석배수로 하이브리도마 상층액과 함께 배양하였다. PBS 로 세척한 후, 2.5 ㎍/㎖ Cy5-접합된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG, Fc-특이성 항체(JIR#109-176-098) 및 5 ㎍/㎖ PE-접합된 염소 F(ab')2 항-인간 카파-특이성 항체(SB#2062-09)에 의해, 세포에 대한 항체의 결합을 검출하였다. PBS 로 세척하여 미결합 항체를 제거한 후, 1:4 희석배수로 사이토픽스(cytofix)(BD# 51-2090KZ)에 의해 세포를 고정시키고, 이를 팍스칼리버(FACSCalibur)에 의해 분석하였다.
실시예 7 : 클로닝용 하이브리도마의 선별
예를 들면 R&D 바이오시스템즈(Biosystems)로부터 입수가능한 정제된 재조합 세포외 도메인을 사용한 ELISA, 및 상이한 HER 군 일원을 발현하는 인간 종양 세포주의 FACS-기반 분석으로, HER1 (EGFR), HER-2 및 HER-4 를 능가하는 HER-3 에 대한 특이성, 그리고 HER-3 양성 세포에 대한 FACS 염색에서 배경값 대비 > 5-배 증가된 평균 형광 강도에 의거하여, 코호트 #1 및 #2 로부터 하이브리도마 클로닝용 항체를 선별하였다. 상기한 기준에 의거하여, 제한 희석 세포 도말에 의해 총 23 개의 클로닝용 하이브리도마 주를 선별하였다.
HER-1 (EGFR), HER-2 및 HER-4 를 능가하는 HER-3 에 대한 특이성과 더불어 다른 3 개의 기준에 의거하여, 코호트 #3 및 #4 로부터 하이브리도마 클로닝용 항체를 선별하였다. 첫번째 기준은 HER-3 의 L2 도메인내에 포함된 에피토프를 사용한 항체에 대한 ELISA 스크린이었다(본 발명의 실시예 "항-HER-3 항체의 구조적 분석" 참조).
두번째 기준은 FACS 기반 분석에 의해 측정된, HER-3 발현 세포에 대한 비오티닐화 헤레굴린-알파의 결합에 대한 중화반응이었다. SKBR-3 세포(제 ATCC No. HTB-30 호)를 수확하고, 배양 배지에서 세척한 후, 원심분리를 통해 펠릿으로 만들고, 이를 배양 배지에서 재현탁시켰다. 재현탁 세포를 96-웰 플레이트 내로 분취하였다. 이 플레이트를 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 배출 하이브리도마 상층액내 시험 항체를 25 ㎕/웰로 첨가하고, 이를 빙상에서 1 시간 동안 배양하여 항체 결합이 이루어지도록 하였다. 50 ㎕ 의 10 nM 헤레굴린-알파(R&D Biosystems, Minneapolis, MN) 용액을 최종 농도가 5 nM 로 되도록 각 웰에 첨가하고, 이를 빙상에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 세포를 150 ㎕ 의 PBS 에서 세척하고, 원심분리에 의해 펠릿으로 만든 후, 상층액을 제거하였다. 세포를 50 ㎕ 의 염소 항-HRG-알파 폴리클로날 항체(10 ㎍/㎖) 에 재현탁시키고 45 분 동안 빙상 배양하였다. 세포를 200 ㎕ 의 PBS 에서 세척하고, 원심분리에 의해 펠릿으로 만든 후, 상층액을 제거하였다. 토끼 Cy5-표지형 항-염소 폴리클로날 항체(5 ㎍/㎖)와 7AAD(10 ㎍/㎖)의 용액 50 ㎕ 를 첨가하고 빙상에서 15 분 동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕ 의 PBS 에서 세척하고, 원심분리에 의해 펠릿으로 만든 후, 상층액을 제거하였다. 이 세포를 100 ㎕ 의 FACS 완충액에 재현탁시키고, FACS 로 판독하였다. 헤레굴린-알파의 결합을 감소시킨 시험 HER-3 항체는 형광 강도 최하치를 나타낸 것이었다. 양성 대조군으로서, 10,000 ng/㎖ 내지 16 ng/㎖ 의 마우스 HER-3 mAb(105.5) 또는 인간 IgG1 HER-3 mAb, U1-49 로부터 제조한 1:5 계열 희석액을 사용하였다. 음성 대조군으로는 헤레굴린-알파 단독, 세포 단독, 염소 항-헤레굴린-알파 폴리클로날 항체 단독 및 토끼 Cy5-표지형 항-염소 폴리클로날 항체 단독을 사용하였다.
세번째 기준은 HER-3 발현 세포주를 사용하는 FACS 에 의한, 친화도 및/또는 고 상대 평균 형광 강도에 대한 상대적 순위결정이었다. 친화도에 대한 상대적 순위결정은 다음과 같이 HER-3-특이성 항체 농도를 표준화하고, 제한 항원 ELISA 로부터의 데이타에 대하여 플로팅함으로써 수행하였다.
고 항원 ELISA 를 사용한 항원 특이성 항체 농도의 표준화
ELISA 방법을 이용하여, 항원 특이성 항체의 농도에 대해 상층액을 표준화하였다. 나란히 적정된 기지 농도의 코호트 #1 로부터의 2 종의 항-HER-3 인간 IgG1 항체를 사용하여, 표준 곡선을 산출하고, 코호트 #3 및 #4 로부터 수득한 시험용 하이브리도마 상층액내 항원 특이성 항체의 양을 상기 표준과 비교하였다. 이러한 방식으로, 각 하이브리도마 배양액 별로 인간 HER3 IgG 항체의 농도를 평가하였다.
코스타(Costar) 3368 배지 결합 플레이트상에서 1XPBS/0.05 % 나트륨 아지드의 뉴트라비딘 @ 8 ㎍/㎖ 을 50 ㎕/웰로 4 ℃ 에서 밤새 배양하여 코팅함으로써 뉴트라비딘(neutravidin) 플레이트를 제작하였다. 다음날, 이 플레이트를 1XPBS/1 % 스킴 밀크를 사용하여 블로킹하였다. 실온에서 1 시간 동안 배양함으로써 1XPBS/1 % 스킴 밀크에서 광비오티닐화 his-태그형-HER-3 ECD @ 500 ng/㎖ 가 뉴트라비딘 플레이트에 결합되도록 하였다. 1XPBS/1 % 스킴 밀크/0.05 % 아지드에서 1:31 의 개시 희석배수로부터 1:7568 의 최종 희석배수까지 1:2.5 계열 희석된 하이브리도마 상층액을 50 ㎕/웰로 첨가한 후, 이를 실온에서 20 시간 동안 배양하였다. 계열 희석액은 선형의 분석 범주에서 미지의 각각에 대해 얻어진 OD 판독값을 확인하기 위해 사용되었다. 다음으로, 1XPBX/1 % 스킴 밀크에서 이차 검출 항체, 염소 항 인간 IgG Fc HRP(400 ng/㎖)를 50 ㎕/웰에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 후, 이 플레이트를 물로 5 회 재차 세척하고, 50 ㎕ 의 일-성분 TMB 기질을 각 웰에 첨가하였다. 30 분 후 50 ㎕ 의 1 M 염산을 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시키고, 이 플레이트를 파장 450 nm 에서 판독하였다. 코호트 #1 로부터의 2 종의 IgG1 HER-3 mAb 를 1000 ng/㎖ 에서 0.06 ng/㎖ 까지 1:2 로 계열 희석시키고 상기 프로토콜을 이용하여 ELISA 로 평가하여 표준 곡선을 산출하였다. 미지의 각각에 대해서는 선형의 분석 범주에 있는 OD 판독값을 사용하여 각 샘플별로 인간 HER-3 IgG의 농도를 추정하였다.
제한 항원 분석은 모든 다른 항원-특이성 항체에 대하여 B-세포 배양 상층액에서 제조한 항원-특이성 항체의 친화도 순위를 결정하는 방법이다. 매우 낮은 항원 코팅 하에서는, 최상의 친화도를 가진 항체만이 평형상태에서 검출가능한 수준으로 결합할 수 있게 된다(예시로, 2003 년 6 월 12 일자 공개된 "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" 라는 표제의 PCT 공개 제 WO/03048730A2 호 참조). 본 경우에서는 농도와 KD 둘 다 알고있는 코호트 #1 로부터의 2 종의 mAb 를 분석시 벤치마크(benchmarks)로서 사용하였다.
코스타 3368 배지 결합 플레이트상에서 1XPBS/0.05 % 나트륨 아지드에서 뉴트라비딘(8 ㎍/㎖)을 50 ㎕/웰에 4 ℃ 에서 밤새 배양하여 코팅함으로써 뉴트라비딘 플레이트를 제작하였다. 다음날, 이 플레이트를 1XPBS/1 % 스킴 밀크를 사용하여 블로킹하였다. 실온에서 1 시간 동안 1XPBS/1 % 스킴 밀크에서 비오티닐화 his-태그형-HER-3 ECD(50 ㎕/웰)를 5 가지 농도 : 125, 62.5, 31.2, 15.6 및 7.8 ng/㎖ 로 96-웰 뉴트라비딘 플레이트에 결합되도록 하였다. 각 플레이트를 물로 5 회 세척하였다. 1XPBS/1 % 스킴 밀크/0.05 % 아지드에서 1:31 로 희석시킨 하이브리도마 상층액을 50 ㎕/웰에 첨가하였다. 진탕기상에서 실온으로 20 시간 배양한 후, 이 플레이트를 dH2O 로 5 회 재차 세척하였다. 다음에는, 1XPBS/1 % 스킴 밀크에서 이차 검출 항체, 염소 항 인간 IgG Fc HRP(호스 래디쉬 퍼옥시다제)(400 ng/㎖)를 50 ㎕/웰에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 후, 이 플레이트를 dH2O 로 5 회 재차 세척하고, 50 ㎕ 의 일-성분 TMB 기질을 각 웰에 첨가하였다. 30 분 후 50 ㎕ 의 1 M 염산을 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시키고, 이 플레이트를 파장 450 nm 에서 판독하였다. 선형 범주에서 OD 수치를 산출하는 항원 농도로부터 수득한 OD 판독값을 데이타 분석에 사용하였다.
제한 항원 OD 에 대하여 특이성 항체 농도(상기의 상세한 설명 참조)를 비교 추정하는 고 항원 데이타에 대한 플로팅은 상대적으로 친화도가 높은 항체를 나타내는데, 예를 들면 결합된 것이 상층액에서는 소량의 IgG HER-3 항체를 가지지만 제한 항원 분석에서는 고 OD 값을 나타냈다.
이러한 일련의 분석에서 최상의 결과를 나타내는 33 개의 항체에 대해 코호트 #3 및 #4 로부터의 하이브리도마를 제한 희석 하이브리도마 도말에 의해 클로닝하는 단계로 진행시켰다.
대안적으로 Rat1/pLXSN 및 Rat1/HER-3 세포의 HER-3 발현에 대한 FACS 분석은 유사한 결과(내인성 랫 에피토프와 무 교차반응)를 나타냈다(도 2).
상세히 설명하면, PBS 에서 10 mM EDTA 를 사용하여 1 x 105 개의 세포를 수확하고, 이를 FACS 완충액(PBS, 3% FCS, 0.4% 아지드)으로 1 회 세척한 후, 96-웰 원형 바닥 플레이트상에 씨딩하였다. 이 세포를 1000 rpm 에서 3 분 동안 회전시켜 상층액을 제거한 후, 이를 특이성 HER-군 항체(3 ㎍/㎖)과 함께 재현탁하였다. 이 세포 현탁액을 빙상에서 45 분 동안 배양하고, 이를 FACS 완충액으로 2 회 세척한 후, FACS 완충액에서 1:50 으로 희석한 이차 항체(100 ㎕/웰) 당나귀-항-인간-PE(Jackson Immunoresearch, PA)와 함께 재현탁하였다. 세포 현탁액을 암실내 빙상에서 30 분 동안 배양하고, 이를 FACS 완충액으로 2 회 세척한 후, 분석(FACS, Beckman Coulter)하였다.
실시예 8 : 본 발명의 항- HER -3 항체에 대한 구조적 분석
이하 논의에서는, 본 발명에 따라 제조된 항체에 관한 구조적 정보가 제공된다. 본 발명에 따라 생산된 항체의 구조 분석을 위해, 중쇄 및 경쇄 단편을 코딩하는 유전자를 특정 하이브리도마로부터 증폭시켰다. 다음과 같이 서열분석을 실시하였다 :
역 전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 96 웰 플레이트에서 개별 하이브리도마 클론으로부터 VH 및 VL 전사체를 증폭하였다. 패스트-트랙 키트(Fast-Track kit ; Invitrogen)를 사용하여 대략 2 x 105 개의 하이브로도마 세포로부터 폴리(A)+-mRNA 를 분리하였다. 각 하이브리도마별로 4 번 : 경쇄(카파(κ))에 대해 2 번 그리고 중쇄(감마(γ))에 대해 2 번의 PCR 반응을 실시하였다. 증폭용으로 QIAGEN 일단계 실온-PCR 키트를 사용하였다(Qiagen, Catalog No.210212). 결합된 실온-PCR 반응에서 C-κ 또는 Cγ 유전자의 CH1 영역의 공통부에 대응하는 안티센스 서열 특이성 프라이머를 사용하여 실온 효소(Omniscript and Sensiscript)의 혼합물로 cDNA 를 합성하였다. 50 ℃ 에서 1 시간 동안 역 전사를 수행하고, 후속해서 고 특이성 및 감수성을 위해 핫스타(HotStar) Taq DNA 폴리머라제에 의해 cDNA 의 PCR 증폭을 실시하였다. 각 PCR 반응별로 5'-센스 프라이머의 혼합물을 사용하였는데 ; 이 프라이머 서열은 Vbase 웹사이트(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)에서 입수가능한 VH 및 VK 의 리더 서열을 기반으로 한 것이었다.
PCR 반응은 94 ℃ 에서 15 분간 초기 과열 개시로 진행하고, 후속해서 94 ℃ 에서 30 초간(변성), 60 ℃ 에서 30 초간(결합) 및 72 ℃ 에서 1 분간(신장) 과정을 40 회 실시하였다.
PCR 산물을 정제하고 ABI PRISM 빅다이 종결기 사이클 서열결정 준비 반응 키트(the ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reaction Kit ; Perkin Elmer)에 의해, 전방 및 역방 PCR 프라이머를 사용하여 직접 서열결정하였다. 프리즘 다이-종결기 서열결정 키트 및 ABI 377 서열결정 기구를 사용하여 양 가닥을 서열결정하였다.
서열 분석
아브제닉스 인-하우스(Abgenix in-house) 소프트웨어(5AS)를 사용하여 인간 생식계 V 중쇄 및 V 카파쇄 서열에 의해 HER-3 서열을 정렬함으로써 HER-3 항체의 인간 V 중쇄 및 V 카파쇄 cDNA 서열 분석을 수행하였다. 이 소프트웨어는 V 유전자, D 유전자 및 J 유전자뿐 아니라 재조합 연결 및 체세포 돌연변이에서의 뉴클레오티드 삽입의 사용도 식별하였다. 컴퓨터 가상 실험(in silico)으로 또한 아미노산 서열을 산출하여 체세포 돌연변이를 확인하였다. 시판용 서열 분석 소프트웨어와 인간 V, D 및 J 유전자의 서열에 대한 공개 입수가능한 정보, 예를 들면 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 이용한 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
mAb U1 - 59 의 분자 클로닝
항체 U1-59 를 분비하는 하이브리도마 계대를 비롯하여, 다수의 하이브리도마 계대를 함유하는 조직 배양 웰로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 3'-C-감마 프라이머를 가진 5'-리더 VH 군 특이성 프라이머를 사용하여 중쇄 가변 영역을 증폭시켰다. VH4 프라이머를 사용하여 주요 밴드를 증폭시켰으며, 다른 밴드들은 전혀 육안으로 관찰되지 않았다. VH4-34 감마 단편을 인간 감마 1 불변 영역 유전자를 가진 프레임내 pCDNA 발현 벡터(Invitrogen Corporation)내로 클로닝하였다.
3' 뮤(mu) 불변 영역 프라이머를 가진 5' VH 군 특이성 프라이머를 사용하여 IgM 중쇄 가변 영역을 증폭시켰다. VH2 프라이머를 사용하여 주요 밴드를 증폭시켰으며, 다른 밴드들은 전혀 육안으로 관찰되지 않았다. VH2-5 뮤 단편을 인간 뮤 불변 영역 유전자를 가진 프레임내 pCDNA 발현 벡터내로 클로닝하였다. V 카파 연쇄를 증폭시키고 서열결정하였다. 4 종의 카파 연쇄 RT-PCR 산물을 동정하였다. 이 산물들을 서열결정하고, 컴퓨터 가상 해독을 통해 서열 분석한 결과, 이중 단 3 개가 오픈-리딩 프레임(open-reading frame)을 가지고 있었다. V 카파 유전자 사용을 기반으로 (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 및 (3) B3-JK1 으로 확인된 올리고클론 U1-59 하이브리도마로부터 이들 3 개의 기능성 카파 연쇄를 클로닝하였다. 모든 V-카파를 인간 카파 경쇄 불변 영역 유전자를 가진 프레임내 pCDNA 발현 벡터내로 클로닝하였다.
형질감염
총 6 개의 중쇄/카파 경쇄 쌍에 대해 일시적 형질감염으로 각 중쇄를 각각의 카파 연쇄로 형질감염시켰다. A20 카파 연쇄를 사용하여 감마 연쇄를 형질감염시킨 결과, 미약한 항체 발현이 나타났으나, A20 카파 연쇄를 뮤 연쇄와 공동-형질감염시켰을 때에는 항체가 전혀 분비 또는 검출되지 않았다. 총 3 개의 IgG sups 및 2 개의 IgM sups 가 HER-3 결합 분석에 이용가능하였다.
Figure 112008046186434-PCT00004
VH4-34 로 이루어진 IgG1 mAb 및 B3 카파 연쇄를 사용한 FACS 에 의해, HER-3+ 세포주에 대한 결합 활성을 검출하였다. HER-3+ 세포주를 사용한 FACS 에서 다른 VH/Vk 조합체는 전혀 배경값 이상의 형광 신호를 나타내지 않았다.
항-HER-3 항체의 결합 경합
HER-3 에 결합하기 위해 경합하는 HER-3 항체의 클러스터 평가를 위해, 문헌 [Jia et al. J Immunol Methods . 288, 91-98(2004)]에 공개된 바와 같이 다중 경합성 항체 결합을 실시하였다. 코호트 #1 로부터 유래된 시험 HER-3 항체를 결합에 대한 경합을 기반으로 5 개의 bin 으로 분류하였다.
Figure 112008046186434-PCT00005
항- HER -3 항체의 에피토프 특징규명
본 발명의 인간 항-HER-3 항체의 에피토프를 특징규명하였다. 우선, 환원, 변성된 HER-3-His 태그형의 정제된 ECD 단백질의 도트 블롯 분석 결과, 시험한 항-HER-3 항체(U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44, U1-47, U1-52, U1-40, U1-49)에 의한 결합이 부재로 나타났는데, 이는 모두가 디술피드 결합의 환원에 민감한 에피토프를 가지고 있음을 입증하는 것으로, 모두가 불연속 에피토프를 가지고 있음을 나타낸다. 다음에는, HER-3 세포외 도메인을 다음 4 개의 도메인으로 분류하는 것을 기반으로, 다양한 인간-랫 HER-3 키메라 분자를 조작함으로써, HER-3 분자내 특정 도메인으로 항체를 매핑하였다 : 1) L1(D1) : 마이너 리간드 - 결합 도메인, 2) S1(D2) : 제 1 시스테인 - 풍부 도메인, 3) L2(D3) : 메이저 리간드 - 결합 도메인, 및 4) S2(D4) : 제 2 시스테인 - 풍부 도메인.
RAT1-HER-3 세포로부터 인간 HER-3 cDNA 의 세포외 도메인(ECD)을 증폭시켰다. 랫의 간 RNA 로부터 RT-PCR 에 의해 랫 HER-3 cDNA 를 증폭시키고, 서열결정에 의해 이를 동정하였다. 인간 및 랫 Her-3 의 ECD 를 발현하는 cDNA 를 V5-His 융합 단백질로서 포유동물 발현 벡터내로 클로닝하였다. Mfe1, BstX1 및 DraIII 내부 제한 부위를 사용함으로써 랫 HER-3 ECD 에 의해 제공된 골격내로 인간 HER-3 ECD 로부터의 도메인을 스와핑(swapping)하였다. 그 결과, 다양한 키메라 랫/인간 HER-3 ECD HIS 융합 단백질(아미노산 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604)을 구성하고, HEK 293T 세포의 일시적 형질감염을 통해 이를 발현하였다. 인간 HER-3 에 대한 랫 폴리클로날 항체를 이용하여 상기 구성체의 발현을 확인하였다. 분비된 키메라 ECD 결합에 대해 ELISA 로 인간 모노클로날 항체를 시험하였다. 상기 재조합 인간 HER-3 및 랫 HER-3 V5-His 융합 단백질의 구성과 발현은 다음과 같습니다 : 인간 HER-3 cDNA 의 세포외 도메인(ECD)은 인간 HER-3 로 형질감염시킨 RAT1 세포로부터 RT-PCR 에 의해 증폭되었고, 이러한 PCR 산물에 NotΙ 및 SaⅡ 제한 효소(RE) 부위를 삽입하였다. 랫 HER-3 ECD cDNA 는 랫 간의 총 RNA(BD Lifescienes)로부터 RT-PCR 에 의해 증폭되었고, 이러한 PCR 산물에 NotΙ 및 XhoⅠ 제한 효소 부위를 삽입하였다. 인간 및 랫 HER-3 의 ECD 를 발현하는 cDNA 를 서열결정하여 확인하고 포유동물 발현 벡터인 pCEP4(Invitrogen Corporation)내로 클로닝시켰으며, 이때의 pCEP4 는 프레임 내(in-frame) V5-His 융합 단백질로서 각각 NotⅠ/XhoⅠ 제한 효소 부위를 사용하였다. pCEP4/V5-His 융합 벡터는 주형으로 pcDNA3.1/V5-His(Invitrogen Corporation)를 사용하여 XhoⅠ 및 BamHⅠ제한 효소 부위를 삽입한 프라이머를 사용하여 V5-His DNA 를 첫 번째 증폭시킴으로써 구성할 수 있다. 결과적으로 형성된 PCR 산물은 XhoⅠ 및 BamHⅠ 제한 효소로 절단할 수 있고, 절단된 pCEP4 XhoⅠ/BamHⅠ로 결찰될 수 있으며, 프레임 내 C-말단 V5-His 융합 단백질로부터 만들어진 pCEP4-V5-His 가 발현될 수 있다. MfeⅠ, BstXⅠ 및 DraⅢ 내부 제한효소 부위를 사용함으로써 랫 HER-3 ECD 에 의해 제공된 골격내로 인간 HER-3 ECD 로부터의 도메인을 스와핑시킬 수 있다. 이러한 방법에 의해, 다양한 키메라 랫/인간 HER-3 ECD V5-His 융합 단백질은 구성될 수 있다(아미노산 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604). HER-3 ECD V5-His 융합 단백질은 HEK 293T 세포(제 ATCC NO. CRL-11268 호)의 일시적인 형질감염을 통해 발현된다. 293T 세포 상층액에 존재하는 단백질의 발현은 ELISA 분석에서의 인간 HER-3(R&D)에 대한 비오티닐화된 랫 폴리클로날 항체를 사용하여 확인하였다. 인간 항-HER-3 모노클로날 항체는 분비된 키메라 랫/인간 HER-3 ECD V5-His 융합 단백질의 결합에 대한 ELISA 에 의해 시험하였다.
항체 U1-59 를 포함하여 2 종의 인간 항체가 랫 HER-3 과 교차-반응하였다. 결합 도메인 지정을 위해, HER-3 의 L1-S1 세포외 도메인의 발현을 코딩하는 플라스미드 DNA 로 형질감염시킨 HEK 293T 세포(제 ATCC No. CRL-11268 호)의 상층액으로부터 정제된 L1-S1-V5his 태그형 단백질로 이루어진 절단형 HER-3 에 대해 이들 mAb 를 시험하였다. mAb U1-59 가 ELISA 에서 L1-S1 단백질에 결합하였는데, 이는 해당 에피토프가 L1-S1 내에 있음을 암시한다. mAb 2.5.1 은 L1-S1 단백질에 결합하지 않았는데, 이는 해당 에피토프가 L2-S2 내에 있음을 암시한다. mAb-HER-3 ECD 복합체의 온-칩(on-chip) 단백질분해성 분해물을 사용한 비행 질량 분광기(flight mass spectroscopy) 의 SELDI 시간을 이용하여 항체 U1-59 에 대한 추가 매핑을 수행하였다.
SELDI 를 이용한 U1 -59 에피토프의 매핑
mAb-HER-3 ECD 복합체의 온-칩 단백질분해성 분해물을 사용한 비행 질량 분광기의 SELDI 시간을 이용하여 증폭된 항체 U1-59 의 추가 매핑을 수행하였다. 단백질 A 를 PS20 단백질 칩 어레이에 공유 결합시키고, 이를 mAb U1-59 포획에 사용하였다. 그 후, PS20 단백질 칩과 모노클로날 항체의 복합체를 HER-3-His 정제된 항원과 함께 배양하였다. 다음에, 항체-항원 복합체를 고 농도의 Asp-N 을 사용하여 분해시켰다. 이 칩을 세척한 결과, 칩상의 항체에 결합된 HER-3 펩티드만이 잔류하게 되었다. SELDI 에 의해 에피토프를 측정하고, 단편의 질량에 의해 이를 동정하였다. 동정된 6814 D 단편은 HER-3-his ECD 의 부분 분해물로부터 생성된 2 종의 가능성이 예상되는 펩티드에 해당된다. 중복된 두 개의 펩티드를 도메인 S1 에 매핑하였다. SELDI 결과를 HER-3 결실 구성체에 대한 결합과 결부시킨 결과, 이 에피토프는 잔기 251 내지 325 로 매핑되었다.
본 발명의 인간 항-HER-3 mAb 에 의해 인지되는 HER-3 의 세포외 부분내 결합 도메인의 위치가 하기 표 4 에 요약되어 있다. 에피토프 도메인 매핑 결과는, HER-3 상의 동일 도메인으로 또한 매핑하는 HER-3 결합에 대해 서로 교차-경합하는 항체를 사용한 항체 경합 결합 경합 bins 로부터 얻은 결과와 일치하였다.
Figure 112008046186434-PCT00006
실시예 9 : 항체의 정준적 ( canonical ) 분류에 대한 결정
초티아와 그의 동료들(Chothia, et al.)은 각 면역글로불린 연쇄의 초가변 영역에 대해 "정준적 분류" 에 근거하여 항체 구조를 설명하였다(J. Mol . Biol ., 1987 Aug 20, 196(4): 901-17). 아미노산 서열과 항원 결합 부위의 3-차원적 구조간의 연관성을 결정하고자 다양한 면역글로불린의 Fab 및 VL 단편의 원자 구조를 분석하였다. 초티아와 그의 동료들은 충전(packing), 수소 결합 또는 비정상 파이, 프사이 또는 오메가 입체형태를 가지는 능력을 통해 비교적 적은 수의 잔기가 초가변 영역의 주쇄 입체형태를 주로 결정짓는다는 사실을 밝혀냈다. 이러한 잔기들은 초가변 영역내 부위들에 그리고 보존된 β-시트 골격내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 미지의 구조를 가진 면역글로불린의 서열을 검사한 결과, 초티아와 그의 동료들은 많은 면역글로불린들이 기지 구조중 하나와 크기 면에서 유사하고, 관찰된 입체형태를 결정짓는 부위에 동일한 잔기를 부가적으로 포함하는 초가변 영역을 보유하고 있음을 제시하였다.
이러한 사실은 이들 초가변 영역이 기지의 구조와 근접한 입체형태를 지니고 있음을 암시하는 것이었다. 5 종의 초가변 영역의 경우, 그 입체형태의 레퍼토리가 비교적 소수의 별도의 구조적 분류로 한정되는 것으로 나타났다. 이러한 보편적으로 존재하는 초가변 영역의 주쇄 입체형태가 "정준 구조(canonical structure)" 로 지칭되었다. 초티아와 그의 동료들에 의한 추가 작업(Nature , 1989 Dec 21-28, 342 (6252): 877-83) 및 기타의 것들(Martin, et al . J. Mol . Biol ., 1996 Nov 15, 263(5): 800-15)에 의해, 항체내 6 개의 초가변 영역중 적어도 5 개에 대해 주쇄 입체형태의 작은 레퍼토리가 존재하는 것으로 확인되었다.
전술된 각 항체의 CDRs 을 그 정준 분류 결정을 위해 분석하였다. 알려진 바와 같이, 항체 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 과 함께, 항체 중쇄의 CDR1 및 CDR2 에 대해서만이 정준 분류를 지정하였다. 하기 표는 이러한 분석 결과를 요약한 것이다. 정준 분류 데이타는 HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3 의 형태로 제시되며, 이때 "HCDR" 은 중쇄 CDR을 지칭하고, "LCDR" 은 경쇄 CDR 을 지칭한다. 이에 따라, 일례로, 1-3-2-1-5 의 정준 분류는 정준 분류 1 에 속하는 HCDR1, 정준 분류 3 에 속하는 HCDR2, 정준 분류 2 에 속하는 LCDR1, 정준 분류 1 에 속하는 LCDR2, 및 정준 분류 5 에 속하는 LCDR3 을 가진 항체를 지칭한다.
항체 내 아미노산이 각 정준 분류별로 규정된 아미노산과 비교하여 70 % 또는 그 이상의 동일성을 나타내는 경우, 특정 정준 분류로 지정하였다. 각 항체별로 규정된 아미노산은 예시하자면 상기에서 언급한 초티아와 그의 동료들에 의한 논문에서 발견할 수 있다. 표 5 및 표 6 은 HER-3 항체 각각에 대한 정준 분류 데이타를 보고한 것이다. 동일성이 70 % 미만인 경우에는, 각 CDR 의 길이와 데이타 전반에 의거하여 적정 정준 분류에 대한 최상의 추정이 이루어졌음을 나타내고자 별표("*")로 정준 분류를 표시하였다. 동일한 CDR 길이와 정준 분류의 매칭이 이루어지지 않는 경우에는 CDR 의 크기가 18 임을 의미하는 "s18" 과 같이, 문자 s 와 숫자로 정준 분류를 표시하였다. 중쇄 또는 경쇄 중 하나에 대해 이용가능한 서열 데이타가 전혀 없는 경우는, 정준 분류를 "Z" 로 표시하였다.
Figure 112008046186434-PCT00007
표 7 은 분류 당 항체의 수를 분석한 것이다. 좌측란에 명시된 특정 정준 분류를 가진 항체의 수가 우측란에 제시되어 있다. 하나의 연쇄 서열 데이타가 부족하여 정준 지정시 "Z" 로 표시한 4 종의 mAb 는 계수에 포함시키지 않았다.
가장 공통적으로 나타난 구조가 3-1-2-1-1 로 : 중쇄와 경쇄 서열을 둘 다 가진 41 종의 mAb 중에서 21 종이 이러한 조합을 나타냈다.
Figure 112008046186434-PCT00008
실시예 10 : 항체 친화도 측정
본 발명의 항-HER-3 항체의 친화도 측정은 간접 FACS 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 수행하였다. 따라서, 105 개의 관심 세포 및 SK-Br 3 세포를 PBS 에서 10 mM EDTA 로 수확하고, FACS 완충액(PBS, 3 % FCS, 0.4 % 아지드)으로 1 회 세척한 후, 96-웰 원형 바닥 플레이트상에 씨딩하였다. 이 세포를 1000 rpm 에서 3 분 동안 회전시켜 상층액을 제거한 후, 이를 α-HER-3 항체(3 ㎍/㎖) 또는 FACS 완충액에서 20 ㎍/㎖ 인간 모노클로날 항체로 출발하여 1:2 희석 단계로 희석시킨 항체 희석액(100 ㎕/웰)과 함께 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 빙상에서 1 시간 동안 배양하고, 이를 FACS 완충액으로 2 회 세척한 후, FACS 완충액 에서 1:50 으로 희석시킨 이차 항체(100 ㎕/웰) 당나귀-항-인간-PE(Jackson)와 함께 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 암실내 빙상에서 30 분 동안 배양한 후, FACS 완충액으로 2 회 세척하여 분석(FACS, Beckman Coulter)하였다. FACS 스캐차드 분석에 따라, 각 측정별로 형광도 평균치를 산출하였다. 각 형광도 평균치로부터 배경 염색값(= 1st 항체 부재상태)을 공제하였다. x-값 = 형광도 평균치 및 y-값 = 형광도 평균치/mAb 의 농도(nM)를 사용하여 스캐차드 플롯을 산출하였다. KD 를 선형 방정식의 1/m 의 절대값으로 취하였다. 도 4 는 본 발명의 U1-59 를 사용한 동적(kinetic) 분석을 나타낸 것이다. 하기 표 8 에는, 상기한 방식으로 선별한 본 발명의 특정 항체에 대한 친화도 측정값이 제공되어 있다.
Figure 112008046186434-PCT00009
실시예 11 : 본 발명의 항-HER-3 항체에 의한 HER-3 수용체 내포작용( endocytosis ) 유도
HER-3 은 HER 군 매개 세포 신호전달에서 중요한 문지기 역할을 함으로써, 과다증식성 질환의 발병 및 진행에 영향을 줄 수 있는 인자로 확인되었다. 따라서, HER-3 이 수용체 내부화에 의해 세포 표면/막으로부터 효과적으로 소멸된다면, 세포 신호전달 및 이에 따른 세포의 형질전환 및/또는 세포의 악성 유지가 궁극적으로 감소되거나 또는 억제될 수 있다.
본 발명의 항-HER-3 항체가 HER-3 의 내포작용 촉진을 유도할 수 있는지의 여부를 연구하고자, 본 발명의 항-HER-3 와 함께 세포를 0.5 및 4 시간 배양한 후, 세포 표면상의 HER-3 분자의 상대적 양을 비교하였다. 24-웰 접시내 정상 성장 배지에 3 x 105 개의 세포를 씨딩하고 밤새 성장하도록 방치하였다. 소정의 시간 동안 37 ℃ 에서 정상 성장 배지에 세포를 10 ㎍/㎖ 항-HER-3 mAbs 와 함께 예비배양하였다. 세포를 10 mM EDTA 로 탈착시키고, 이를 4 ℃ 에서 45 분 동안 세척용 완충액(PBS, 3 % FCS, 0.04 % 아지드) 에서 10 ㎍/㎖ 항-HER-3 mAbs 와 함께 배양하였다. 세척용 완충액으로 세포를 2 회 세척하고, 4 ℃ 에서 45 분 동안 1:100 으로 희석시킨 당나귀-항-인간-PE 이차 항체(Jackson)와 함께 배양한 후, 세척용 완충액으로 2 회 세척하고 FACS(Beckman Coulter, EXPO) 에 의해 분석하였다.
도 5 에 제시된 데이타는 항-HER-3 항체를 사용한 세포 처리로 수용체의 내부화가 유도됨을 입증한 것이다. 데이타는 내부화율(%)로 제시되어 있으며, 이는 대조군-처리 샘플 대비 항-HER3 처리 샘플의 평균 형광 강도 감소를 나타낸다.
실시예 12 : 본 발명의 인간 항- HER -3 항체에 의한 인체 암 세포 SKBr3 에 대한 리간드 결합의 억제
세포 기반 분석에서 HER-3 에 대한 리간드 결합을 억제시키는 본 발명의 항-HER-3 항체의 능력을 측정하고자, 방사성리간드 경합 실험을 수행하였다. 따라서, 빙상에서 30 분 동안 항체의 농도를 달리하여 배양시킨 4 x 105 개의 SK-BR-3 세포를 사용하여 HER-3 수용체 결합 분석을 수행하였다. 각 웰에 1.25 nM [125I]-α-HRG/[125I]-β-HRG 를 첨가하고, 빙상에서 2 시간 동안 계속 배양하였다. 이 플레이트를 5 회 세척하고, 대기-건조시킨 후, 섬광 계수기로 계수하였다. 도 6a-e 에는 본 발명의 대표적인 항-HER-3 항체를 사용하여 수행한 본 실험의 결과가 제시되어 있으며, 이는 본 발명의 항체가 내인성 HER-3 을 발현하는 세포에 대한 [125I]-α-HRG/[125I]-β-HRG 의 결합을 특이적으로 감소시킬 수 있음을 입증하고 있다.
실시예 13 : 본 발명의 인간 항- HER -3 항체에 의한 리간드 -유도성 HER-3 인산화의 억제
본 발명의 항체가 HER-3 의 리간드 β-HRG-매개 활성화를 차단할 수 있는지의 여부를 연구하고자 ELISA 실험을 수행하였다. 리간드-매개 HER-3 활성화는 수용체 티로신 인산화 증가에 의해 검출하였다.
1 일차 : 37 ℃ 에서 4 시간 동안 0.1 M 아세트산에서 20 ㎍/㎖ 콜라겐 I 로 1 x 96 웰 접시를 코팅하였다. 정상 성장 배지에 2.5 x 105 개의 세포를 씨딩하였다.
2 일차 : 24 시간 동안 100 ㎕ 의 무 혈청 배지에서 세포를 결식시켰다.
3 일차 : 37 ℃ 에서 1 시간 동안 10 ㎍/㎖ 항-HER-3 mAb 와 함께 세포를 예비배양한 후, 이를 10 분 동안 30 ng/㎖ β-HRG-EGF 도메인(R&D Systems)으로 처리하였다. 배지는 털어내 버리고, 실온에서 1 시간 동안 세포를 PBS 에서 4 % 포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 포름알데히드 용액을 제거한 후, 세포를 세척용 완충액(PBS/0.1 % 트윈 20)으로 세척하였다. 이 세포를 세척용 완충액에서 1 % H2O2, 0.1 % NaN3 로 퀀칭(quenching)시키고, 실온에서 20 분 동안 배양한 후, 이를 4 ℃ 에서 5 시간 동안 NET-겔란틴(NET-Gelantine)으로 차단하였다. 4 ℃ 에서 밤새 일차 항체 포스포-HER-3(Tyr1289)(폴리클로날 토끼 ; 세포 신호전달 #4791 ; 1:300)을 첨가하였다.
4 일차 : 세척용 완충액으로 플레이트를 3 회 세척한 후, 이를 PBS 에서 1:3000 으로 희석시킨 항-토끼-POD 로 배양하고, 각 웰에 0.5 % BSA 를 첨가한 후, 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 이 플레이트를 세척용 완충액으로 3 회 그리고 PBS 로 1 회 세척하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB, Calbiochem)을 첨가하고, 650 nm 에서 모니터링하였다. 100 ㎕ 의 250 nM HCl 을 첨가하여 반응을 중단시키고, Vmax 플레이트 판독기(Thermo Lab Systems)를 사용하여 650 nm 를 기준 파장으로 450 nm 에서 흡광도를 판독하였다.
도 7a 는 본 실험의 대표적인 결과를 나타낸 것으로, 이는 본 발명의 항-HER-3 항체가 수용체 티로신 인산화 감소에 의해 표시된 바와 같이 리간드-매개 HER-3 활성화를 감소시킬 수 있음을 입증하고 있다. 데이타는 대조용 항체 대비 치료용 항체에 의한 감소 비율(%)로서 표시되어 있다.
리간드 유도성 HER-3 활성화를 억제시키는 mAb U1-53 의 효능을 시험하고자, MCF-7 세포(제 ATCC No. HTB-22 호)를 24 시간 동안 결식시키고, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 mAb U1-53 과 함께 배양한 후, 이를 10 분 동안 10 nM HRG-β 로 자극하였다. 용해물을 1B4(마우스 항-HER-3 mAb) ELISA 플레이트로 이전시키고, 항체 4G10 을 사용하여 HER-3 의 인산화를 분석하였다. 도 7b 에 제시된 바와 같이 HER-3 의 인산화는 IC50 이 0.14 nM 로, 용량 의존 방식에 의해 거의 완전히 억제되었다.
실시예 14 : 본 발명의 인간 항- HER -3 항체에 의한 리간드 -유도성 p42/p44 MAP - 키나제 인산화의 억제
다음에는 본 발명의 항체가 p42/p44 MAP-키나제의 리간드 β-HRG-매개 활성화를 차단할 수 있는지의 여부를 연구하고자 ELISA 실험을 수행하였다. 리간드-매개 HER-3 활성화는 단백질(Thr202/Tyr204) 인산화 증가에 의해 검출하였다.
1 일차 : 37 ℃ 에서 4 시간 동안 0.1 M 아세트산에서 20 ㎍/㎖ 콜라겐 I 로 1 x 96 웰 접시를 코팅하였다. 정상 성장 배지에 3 x 105 개의 세포를 씨딩하였다.
2 일차 : 24 시간 동안 100 ㎕ 의 무 혈청 배지에서 세포를 결식시켰다.
3 일차 : 37 ℃ 에서 1 시간 동안 5 ㎍/㎖ 항-HER-3 mAb 와 함께 세포를 예비배양한 후, 이를 10 분 동안 20 ng/㎖ β-HRG-EGF 도메인(R&D Systems)으로 처리하였다. 배지는 털어내 버리고, 실온에서 1 시간 동안 세포를 PBS 에서 4 % 포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 포름알데히드 용액을 제거한 후, 세포를 세척용 완충액(PBS/0.1 % 트윈 20) 으로 세척하였다. 이 세포를 세척용 완충액에서 1 % H2O2, 0.1 % NaN3 로 퀀칭시키고, 실온에서 20 분 동안 배양한 후, 이를 4 ℃ 에서 5 시간 동안 PBS/0.5 % BSA 로 차단하였다. 4 ℃ 에서 밤새 일차 항체 포스포-p44/p42 MAP 키나제(Thr202/Tyr204)(폴리클로날 토끼 ; 세포 신호전달 #9101 ; 1:3000)를 첨가하였다.
4 일차 : 세척용 완충액으로 플레이트를 3 회 세척한 후, 이를 PBS 에서 1:5000 으로 희석시킨 항-토끼-HRP 로 배양하고, 각 웰에 0.5 % BSA 를 첨가한 후, 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 이 플레이트를 세척용 완충액으로 3 회 그리고 PBS 로 1 회 세척하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB, Calbiochem)을 첨가하고, 650 nm 에서 모니터링하였다. 100 ㎕ 의 250 nM HCl 을 첨가하여 반응을 중단시키고, Vmax 플레이트 판독기(Thermo Lab Systems)를 사용하여 650 nm 를 기준 파장으로 450 nm 에서 흡광도를 판독하였다.
도 8 은 본 실험의 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 항체는 인산화 감소에 의해 표시된 바와 같이 리간드-매개 p42/p44 MAP-키나제 활성화를 감소시킬 수 있었다. 데이타는 대조용 항체 대비 치료용 항체에 의한 감소 비율(%)로서 표시되어 있다.
실시예 15 : 본 발명의 인간 항- HER -3 항체에 의한 β- HRP -유도성 포스포- AKT 인산화의 억제
이하 ELISA 실험에서, 본 발명자들은 본 발명의 항-HER-3 항체가 AKT-키나제의 리간드 β-HRG-매개 활성화를 차단할 수 있는지의 여부를 연구하였다. 리간드-매개 AKT 활성화는 단백질(Ser473) 인산화 증가에 의해 검출하였다.
1 일차 : 37 ℃ 에서 4 시간 동안 0.1 M 아세트산에서 20 ㎍/㎖ 콜라겐 I 로 1 x 96 웰 접시를 코팅하였다. 정상 성장 배지에 3 x 105 개의 세포를 씨딩하였다.
2 일차 : 24 시간 동안 100 ㎕ 의 무 혈청 배지에서 세포를 결식시켰다.
3 일차 : 37 ℃ 에서 1 시간 동안 5 ㎍/㎖ 항-HER-3 mAb 와 함께 세포를 예비배양한 후, 이를 10 분 동안 20 ng/㎖ β-HRG-EGF 도메인(R&D Systems)으로 처리하였다. 배지는 털어내 버리고, 실온에서 1 시간 동안 세포를 PBS 에서 4 % 포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 포름알데히드 용액을 제거한 후, 세포를 세척용 완충액(PBS/0.1 % 트윈 20)으로 세척하였다. 이 세포를 세척용 완충액에서 1 % H2O2, 0.1 % NaN3 로 퀀칭시키고, 실온에서 20 분 동안 배양한 후, 이를 4 ℃ 에서 5 시간 동안 PBS/0.5 % BSA 로 차단하였다. 4 ℃ 에서 밤새 일차 항체 포스포-Akt(Ser473)(폴리클로날 토끼 ; 세포 신호전달 #9217 ; 1:1000)를 첨가하였다.
4 일차 : 세척용 완충액으로 플레이트를 3 회 세척한 후, 이를 PBS 에서 1:5000 으로 희석시킨 항-토끼-HRP 로 배양하고, 각 웰에 0.5 % BSA 를 첨가한 후, 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 이 플레이트를 세척용 완충액으로 3 회 그리고 PBS 로 1 회 세척하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB, Calbiochem)을 첨가하고, 650 nm 에서 모니터링하였다. 100 ㎕ 의 250 nM HCl 을 첨가하여 반응을 중단시키고, Vmax 플레이트 판독기(Thermo Lab Systems)를 사용하여 650 nm 를 기준 파장으로 450 nm 에서 흡광도를 판독하였다.
도 9 는 본 실험의 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 항-HER-3 항체는 인산화 감소에 의해 표시된 바와 같이 β-HRG-매개 AKT 를 감소시킬 수 있었다. 데이타는 대조용 항체 대비 치료용 항체에 의한 감소 비율(%)로서 표시되어 있다.
실시예 16 : 본 발명의 인간 항- HER -3 항체에 의한 α- HRG /β- HRG -매개 MCF7 세포 증식의 억제
HRG-자극 세포 증식을 억제하는 본 발명의 항체의 능력을 측정하고자, 생체외 실험을 실시하였다. 96-웰 플레이트 상에서 FCS-함유 배지에 2000 개의 MCF7 세포를 밤새 씨딩하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 동안 0.5 % FCS 를 포함하는 배지에서 희식시킨 항체와 함께 세포를 4 중으로 예비-배양하였다. 30 ng/㎖ α- 또는 20 ng/㎖ β-HRG(R&D Systems)를 항체 용액에 직접 첨가하여 세포를 상기 리간드로 자극한 후, 이를 72 시간 동안 성장하도록 방치하였다. AlamarBlue™(BIOSOURCE)를 첨가하고, 37 ℃ 의 암실에서 배양하였다. 30 분마다 590 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 알마 블루 첨가 후 90 분에 데이타를 취득하였다. 도 10 에 제시된 결과는 본 발명의 대표적인 항체가 인체 암 세포에서 HRG-유도성 세포 성장을 억제함을 나타낸다. 데이타는 대조용 항체 대비 치료용 항체에 의한 감소 비율(%)로서 표시되어 있다.
실시예 17 : 본 발명의 인간 항-HER-3 항체에 의한 β- HRG -유도성 MCF7 세포 이동의 억제
본 발명의 항체가 세포 이동을 차단하는지의 여부를 연구하고자, 통과이동(transmigration) 실험을 수행하였다. 소정량의 항체를 세포 현탁액에 첨가하여 혈청-결식시킨 MCF7 세포를 예비배양하고 37 ℃ 에서 45분 동안 배양하였다. 이후, 500 ㎕ 의 세포 현탁액(50,000 개의 세포)을 콜라겐 I-코팅한 트랜스웰(BD Falcon, 8 ㎛ 공극)의 상단실에 위치시켰다. 하단실에는 750 ㎕ 의 배지(MEM, 아미노산, Na-피루베이트, Pen.-Strept., 0.1 % BSA, 우태아 혈청 부재)를 단독으로 또는 리간드 β-HRG-EGF 도메인(R&D Systems)을 포함시켜 사용하였다. 37 ℃ 에서 8 시간 동안 세포가 이동하도록 방치하고, 이를 DAPI 로 염색시켰다.
염색된 핵을 수동으로 계수하고; 억제 비율(%)을 대조용 항체 대비 억제율로서 표시하였다.
도 11 은 본 발명의 대표적인 항-HER-3 항체가 HRG-유도성 세포 이동을 감소시킴을 입증하는 실험의 결과를 나타낸 것이다.
실시예 18 : 콜로니 형성 분석(연질 한천 분석)
고정(anchorage) 비의존적 세포 성장을 억제하는 본 발명의 항-HER-3 항체의 능력을 연구하고자, 연질 한천 분석을 실시하였다. 형질전환 세포만이 연질 한천에서 성장할 수 있으므로, 연질 한천 콜로니 형성 분석은 형질전환시킨 세포 시험을 위한 표준적인 생체외 분석이다.
750 내지 2000 개의 세포(세포주에 따라)를 30 분 동안 IMDM 배지(Gibco) 에서 해당 항체(10 ㎍/㎖)와 함께 예비배양하고, 이를 0.4 % 디프코 노블 한천(Difco noble agar) 에서 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 96-웰 플레이트내에서 4 중으로 20 % FCS 를 함유하는 0.75 % 아가로즈 기층상에 도말하였다. 14 시간 동안 콜로니가 형성되도록 방치한 후, 밤새 50 ㎕ 의 MTT(PBS 에서의 0.5 ㎎/㎖)로 염색하였다. 도 12a-i 는 본 발명의 3 종의 대표적인 항체로 수행한 본 실험의 결과를 나타낸 것이다. 이들 결과는 본 발명의 항-HER-3 항체가 MDA-MB361(제 ATCC No. HTB-27 호) 및 NCI-ADR 유방암 세포(미국 메릴랜드에 소재하는 NCI-Frederick 에서 입수-http://dctd.cancer.gov/default.htm, 도 12a 및 도 12b), MKN-28 위암 세포(제 JCRB 0253 호-http://cellbank.nibio.go.jp, 도 12c), HT144 흑색종 세포(제 ATCC No. HTB-63 호, 도 12d), Skov3 난소 암종 세포(제 ATCC No. HTB-77 호, 도 12e), PPC-1 전립선암 세포(미국 메릴랜드에 소재하는 NCI-Frederick 에서 입수-http://dctd.cancer.gov/default.htm, 도 12f), BX-PC3 췌장암 세포(제 ATCC No. CRL-1687 호, 도 12g), A431 표피양 암종 세포(제 ATCC No. CRL-1555 호, 도 12h) 및 폐 암종 세포(도 12i)의 고정 비의존적 세포 성장을 감소시킴을 입증하고 있다. 스캐날라이저(Scanalyzer) HTS 카메라 시스템(Lemnatec, Wuerselen)으로 콜로니를 계수하였다.
실시예 19 : 인간 항-HER-3 항체에 의한 누드 마우스내 인체 유방 암종 성장 억제
치료용 항체의 항-종양 효능은 때론 인체 이종이식편(xenograft) 종양 연구를 통해 평가된다. 이들 연구에서, 인체 종양은 면역타협된 마우스에서 이종이식편으로서 성장하며, 종양 성장 억제 정도에 의해 치료 효능을 측정한다. 본 발명의 항-HER-3 항체가 누드 마우스에서 인체 유방암 세포의 종양 성장을 방해하는 경우, 이를 측정하기 위해, 5 x 106 개의 T47D 세포(제 ATCC No. HTB-133 호)를 암컷의 NMRI 누드/누드 마우스에 이식하였다. 종양이 동물의 등에서 피하 성장하였다. 이식후 8 일차에 종양의 평균 용적이 20 mm3 에 도달하였을때 치료를 개시하였다. 1 차 치료에 앞서, 치료군 전체에 걸쳐 출발 종양 용적에 일률성(평균값, 중간값 및 표준 오차)을 확보하고자 마우스를 무작위 추출하여 통계 시험을 수행하였다. 50 ㎎/㎏ 의 로딩 용량으로 치료를 개시하고, 후속해서 복강내 주사에 의해 1 주일에 한번씩 25 ㎎/㎏ 을 주사하였다. 대조용으로 앞다리에는 독소루비신(doxorubicin)(의약 등급)을 투여하였다. 모든 동물에게 복강내 주사로 0.5 ㎎/㎏/주의 오에스트로겐(oestrogen)을 보충해주었다.
치료군에 대한 세부사항이 이하 제시되어 있다.
Figure 112008046186434-PCT00010
중간값의 종양 용적에 대한 데이타(도 13)를 통해 본 발명의 항-HER-3 항체의 투여로 종양 성장이 감소하는 결과가 초래됨이 입증되었다.
실시예 20 : 인간 항- HER -3 항체에 의한 SCID 마우스내 인체 췌장 종양 성장의 억제
기타 다른 충실성 종양 유형에서 항-HER-3 항체의 치료적 효능을 시험하고자, 인체 췌장 종양 세포주 BxPC3 으로부터 유래된 종양이 수립된 마우스에서 항-HER-3 항체, U1-53 및 U1-59 를 시험하였다. 대조군으로, 대조용 비히클, PBS 또는 수립된 치료용 항체, 에르비툭스(Erbitux)로 치료한 마우스 세트를 포함시켰다. 5 x 106 개의 BxPC3 세포를 마트리겔 없이 CB17 SCID 마우스내로 피하 접종하였다. 평균 용적이 140 mm2 인 만성 종양을 가지고 있는 마우스에게 50 ㎎/㎏ 의 U1-53, U1-59, 에르비툭스 또는 동량의 PBS 를 복강내 주사를 통해 투여하였다. 그 후, 연구 기간 중에, 상기 마우스에게 25 ㎎/㎏ 의 주사를 주당 1 회 제공하였다.
본 실험에 대한 결과가 도 14 에 제시되어 있다. U1-53 및 U1-59 는 세포증식억제(cytostatic) 방식으로 인체 췌장 종양의 성장을 감소시켰다. 본 실험에서 주목할 만한 사실은, U1-53 및 U1-59 가 종양 성장 지연에 있어 EGFR-표적 항체 에르비툭스에 비해 더욱 효과적이라는 것이었다. 이들 데이타를 통해, 벤치마크 치료제와 비교하여, 본 발명의 항-HER-3 항체의 치료적 효능이 입증되었다.
실시예 21 : 인간 항- HER -3 항체와 항- EGFR 항체의 결합에 의한 항-종양 활성의 증대
표적된 항체를 사용한 과다증식성 질환의 단일요법은 한편으로는 약물에 대한 내성의 발생과 다른 한편으로는 항원성의 변화와 같은 문제들에 의해 때로는 방해받기도 한다. 일례로, 장기간의 치료후 항원성의 상실로 종양 세포가 치료용 항체에 대해 무감수성이 될 수도 있는데, 이는 표적된 항원을 발현하지 않거나 또는 이를 소실한 종양 세포가 선택적 성장 이점을 가지기 때문이다. 이러한 문제점은 종양 세포상의 상이한 수용체를 표적으로 하는 치료용 항체 또는 다른 항신생물제와 함께 본 발명의 항체를 사용함으로써 해소할 수 있다. 다수의 신호전달 경로 또는 다수의 중재 단계를 제외한 관련 경로에서의 개입이 또한 치료적 이득을 제공할 수도 있다. 이러한 병용 치료 방식이 각기 상이한 작용 기전을 통해 작동하는 2 종의 항암제를 병용한 것이므로, 더 효과적일 것으로 보인다.
본 발명의 항-HER-3 항체, U1-53 및 U1-59 의 적절한 배합제로서의 실현가능성을 입증하고자, 본 발명자들은 U1-53 또는 U1-59 를 단일치료제로 투여한 경우와 U1-53 또는 U1-59 를 항-EGR 특이성 항체, 에르비툭스와 배합한 경우를 비교하였다. 5 x 106 개의 BxPC3 세포를 마트리겔과 함께 CB17 SCID 마우스내로 피하 접종하였다. 종양 용적이 200 mm3 에 도달한 후, 마우스를 개별 치료군으로 무작위 분류하였다. U1-53, U1-59 및 에르비툭스를 단일 제제로서, 또는 항-HER3 항체와 에르비툭스의 배합물 또는 2 종의 항 HER-3 항체의 칵테일을 매주 복강내 투여하였다. 모든 항체는 50 ㎎/㎏/주의 단일 로딩 용량으로 투여하고, 후속해서 6 주간 25 ㎎/㎏ 을 매주 주사하였다. 대조용으로 팔에 겜시타빈 (Gemcitabine; 120 ㎎/㎏)을 2 주 마다, 취합한 인간 IgG 를 매주 또는 비히클(PBS)을 매주 주사로 투여하였다. 그 투여계획은 이하에 상세히 설명되어 있다.
Figure 112008046186434-PCT00011
이 실험에 대한 결과는 도 15 에 제시되어 있다. 항체 U1-53 및 U1-59 는 단일 제제로 투여시, 표준 항-췌장암 화학요법제로서 자주 사용되고 있는 겜시타빈과 동일한 정도로 인체 췌장 종양의 성장을 지연시켰다. 에르비툭스를 U1-53 또는 U1-59 와 공동-투여한 결과, U1-53, U1-59 또는 에르비툭스의 단일 제제 투여시 관찰된 바에 비해 현저히 큰 종양 성장 감소 효과가 나타났다. 즉, 본 발명의 항-HER-3 항체는 별개의 종양 항원을 표적으로 하는 적절한 항체와 배합함으로써, 유리한 치료 반응을 달성할 수 있다.
요약하자면, 본 발명의 항-HER-3 항체는 생체내에서 인체 종양에 대해 강력한 치료 효능을 가지고 있다. 항-종양 활성 증대를 위해서는 이들을 기타 다른 항-신생물 치료제와 배합하는 것이 효과적일 수 있다.
실시예 22 : 인간 항- HER -3 항체에 의한 nu / nu 마우스내 인체 흑색종 종양 성장의 억제
Her3 을 포함하여, erbB 군의 수용체 일원들은 아주 다양한 상피암에서 비정상적으로 발현하며, 다수의 이들 충실성 종양의 성장 및 생존시 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 종양으로는 흑색종, 두경부 편평상피 세포암, 비-소 세포성 폐암, 전립선암, 신경교종, 위암, 유방암, 결장직장암, 췌장암 및 난소암이 포함된다. 본 발명의 항-Her3 항체가 항암 활성면에서 개별적 종양 유형, 예를 들어 췌장암(실시예 21 참조)으로만 제한되지 않고, 다수의 HER-3-의존성 종양에 대해 치료제로서 사용될 수 있음을 입증하고자, 본 발명자들은 부가적인 이종이식편 연구에서 U1-53 및 U1-59 를 시험하였다. 하나의 일례가 도 16 에 제시되어 있다. 5 x 105 개의 인체 흑색종 세포 및 HT144 를 CB17 SCID 마우스내로 피하 주사하고, 바로 연이어서 50 ㎎/㎏ 의 U1-53 및 U1-59, 동량의 PBS 또는 다카바신(Dacarbacin)(DTIC)을 200 ㎎/㎏ 으로 복강내 주사하였다. 이후, 마우스에게 25 ㎎/㎏ 의 U1-53 또는 U1-59 를 1 주에 1 회 제공하고, 반면에 DTIC 는 200 ㎎/㎏ 씩 2 주에 한번씩 제공하였다.
각 치료군으로부터 얻은 중간값의 종양 용적이 도 16 에 제시되어 있다. 본 발명의 항체를 투여한 결과, 대조용 비히클로 처리했던 종양과 비교하여 인체 흑색종의 성장이 감소되었다. 이러한 결과는 본 발명의 항체가 그 치료 효능에 있어 제한이 없으며 광범위한 HER-3 발현 암을 표적으로 하고 있음을 입증하고 있다.
실시예 23 : 인간 항- HER -3 항체에 의한 마우스내 결장 암종 이종이 식편 성장의 억제
마트리겔을 2:1 의 비율로 포함하는 배지중에 HT-29 인체 결장 암종 세포(제 ATCC No. HTB-38 호)를 최종 농도가 10 x 106 세포수/㎖ 로 되도록 현탁시켰다. 4-5 주령의 CD1 nu/nu 마우스의 우측 측복부내로 0.2 ㎖ 의 세포 현탁액을 피하 주사하였다. 총 95 마리의 마우스가 사용되었다.
마우스를 대조군과 치료군으로 무작위 배정하였다. 동일한 날에 치료를 개시하였다. 치료 기간은 29 일로 하였다. 연구 종결시, 치료제 투여후 3 시간 째에 해당 군당 3 개의 종양을 수거하였다. 이 종양을 급속 동결시키고, -80 ℃ 에서 유지시켰다.
다음의 치료 프로토콜을 수행하였다: 대조군: 비-특이성 인간 IgG, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-53, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-7, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-59, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군 5-FU : 5-FU(5-플루오로우라실), 50 ㎎/㎏, 9d x 5, 복강내 투여
각 군별로 얻은 중간값의 종양 용적이 도 17 에 제시되어 있다. 본 발명의 항체를 투여한 결과, 비-특이성 인간 IgG1 으로 치료했던 종양과 비교하여 HT-29 결장 암종 종양의 성장이 감소되었다.
실시예 24 : 인간 항- HER -3 항체에 의한 마우스내 폐암 성장의 억제
마트리겔을 1:1 의 비율로 포함하는 배지에서 Calu-3 인체 비-소 세포 폐암 세포(제 ATCC No. HTB-55 호)를 최종 농도가 5 x 106 세포수/㎖ 로 되도록 현탁시켰다. 9-주령의 암컷 CB17 SCID 마우스의 우측 측복부내로 0.05 ㎖ 의 세포 현탁액을 피하 주사하였다. 총 60 마리의 마우스가 사용되었다.
마우스를 대조군과 치료군으로 무작위 선별하였다. 동일한 날에 치료를 개시하였다. 치료 기간은 32 일로 하였다.
다음의 치료 프로토콜을 수행하였다: PBS 비히클군 hG 대조군: 비-특이성 인간 IgG, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-53, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-7, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-59, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여
각 대조군 및 치료군별로 얻은 중간값의 종양 용적이 도 18 에 제시되어 있다. 본 발명의 항체를 투여한 결과, 대조용 PBS 비히클 또는 비-특이성 인간 IgG 로 치료했던 종양과 비교하여 인체 비-소 폐암 이종이식편의 성장이 감소되었다.
실시예 25 : 인간 항- HER -3 항체에 의한 Balb /C- 마우스내 인체 췌장 종양 성장의 억제
마트리겔을 2:1 의 비율로 포함하는 배지에서 인체 췌장 BxPC 종양 세포를 최종 농도가 5 x 106 세포수/㎖ 로 되도록 현탁시켰다. 5-7-주령의 암컷 BalbC nu/nu 마우스의 우측 측복부내로 0.2 ㎖ 의 세포 현탁액을 피하 주사하였다. 총 100 마리의 마우스가 사용되었다.
마우스를 대조군과 치료군으로 무작위 배분하였다. 동일한 날에 치료를 개시하였다. 치료 기간은 27 일로 하였다.
다음의 치료 프로토콜을 수행하였다: hIgG 대조군: 비-특이성 인간 IgG2, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-53, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-7, 25 ㎎/㎏, 1 주에 2 회 복강내 투여 치료군: 항체 U1-59, 25 ㎎/㎏, 1 주마다 복강내 투여 겜자르(Gemzar) 치료군: 겜시타빈, 80 ㎎/㎏, 1 주마다 복강내 투여
각 대조군 및 치료군별로 얻은 중간값의 종양 용적이 도 19 에 제시되어 있다. 본 발명의 항체를 투여한 결과, 비-특이성 인간 IgG 또는 겜자르로 치료했던 종양과 비교하여 인체 췌장 종양의 성장이 감소되었다.
인체 췌장 종양에서의 HER-3 의 억제는 또한 약력학 실험으로 밝혀질 수 있다. BxPC 종양 이종이식편을 전술한 바와 같이 성장시켰다. 3 마리의 마우스를 500 ㎍ 의 IgG1 대조용 항체로 치료하고, 3 마리의 마우스를 500 ㎍ 의 항-HER-3 항체 U1-59 로 치료하였다. 1 일차 및 4 일차에 마우스를 치료한 후, 5 일차에 이를 희생시켜 HER-3 인산화(pHER-3)의 항체-의존적 억제를 측정하였다.
종양을 프로테아제 저해제를 함유한 표준 RIPA 완충액에서 균질화시켰다. 50 ㎍ 의 투명한 용해물을 4-20 % 트리스-글리신 겔상에서 분리시키고, 이를 니트로셀룰로즈 막으로 이전시켜 3 % 소 혈청 알부민(BSA)에서 차단시켰다. 항-pHER-3 항체(항체 21D3, Cell Signaling technology)를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 대조용으로는 항-액틴(actin) 항체(AB a-2066, Sigma)를 사용하였다.
증광 화학발광기(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 의해 발현을 검출하였다. 버사독(Versadoc) 5000 영상화 시스템(BioRad, Hercules, CA)으로 영상을 포착하였다.
그 결과가 도 20 에 제시되어 있다. 인간 항-HER-3-항체 U1-59 투여후, HER-3 의 인산화가 더이상 검출되지 않았다. 따라서, 본 발명의 항체는 인체 췌장 종양 세포에서 HER-3 활성화를 현저히 감소시킬 수 있다.
실시예 26 : 진단제로서 본 발명의 항- HER -3 항체의 용도
항-HER-3 mAb 는 악성 질환의 진단제로 사용될 수 있다. HER-3 은 정상 조직과 비교하여 매우 독특한 방식으로 종양 세포상에 발현되므로, HER-3 의 발현 분석이 충실성 종양의 일차적 진단, 충실성 종양의 단계 및 등급결정, 증식성 질환과 신생물형성에 대한 예후 기준의 평가 및 HER-3 양성 종양 환자의 위험성 관리에 도움을 줄 수 있게 된다.
A. 샘플내 HER -3 항원의 검출
샘플내 HER-3 항원의 검출을 위한 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 개발되었다. 본 분석에서는, 96-웰 미량적정 플레이트 또는 384-웰 미량적정 플레이트 같은 미량적정 플레이트의 웰에 수시간 동안 HER-3 항원 지향성 제 1 의 완전 인간 모노클로날 항체를 흡착시킨다. 고정된 항체가 시험 샘플내에 존재할지도 모르는 임의의 HER-3 항원에 대한 포착용 항체로서 제공된다. 웰을 헹구고, 이를 분석물의 비특이적 흡착을 방지하고자 우유 단백질 또는 알부민 같은 차단제로 처리한다.
연속해서, 상기 웰을 HER-3 항원을 함유하는 것으로 추정되는 시험 샘플 또는 기준량의 HER-3 항원을 함유하는 용액으로 처리한다. 이러한 샘플의 예로는 병변을 진단하는 정도의 HER-3 항원의 혈중 수준을 가지는 것으로 추정되는 피실험자로부터 채취한 혈청이 있다. 시험 샘플 또는 표준물질을 헹군 후, 비오틴 접합에 의해 표지된 본 발명의 제 2 의 완전 인간 모노클로날 항-HER-3 항체로 상기 웰을 처리한다. 이러한 표지된 항-HER-3 항체가 검출용 항체로서 제공된다. 과량의 제 2 항체를 헹군 후에, 아비딘-접합된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 및 적절한 발색용 기질로 상기 웰을 처리한다. 기준 샘플로부터 취득한 표준 곡선과 비교함으로써 시험 샘플내 HER-3 항원의 농도를 결정한다.
B. 면역조직화학법(IHC)에 의한 HER -3 항원의 검출
IHC 에 의해 조직편에 있는 HER-3 항원을 측정하고자, 파라핀-삽입된 조직을 우선 2 x 5 분 동안 크실렌에서 파라핀제거한 후, 이를 100 % 에탄올로 2 x 3 분, 95 % 에탄올로 1 분 수화시키고 증류수에서 헹군다. 포르말린-고정 및 파라핀-삽입에 의해 마스킹된 항원성 에피토프를 에피토프 마스킹제거과정(unmasking), 효소 분해 또는 사포닌에 의해 노출시킨다. 에피토프 마스킹제거과정을 위해, 파라핀 절편을 증기기구, 수조 또는 마이크로웨이브 오븐에서 20-40 분 동안 예를 들면 2N HCl 용액(pH 1.0)과 같은 에피토프 복원용 용액(retrieval solution)에서 가열시킨다. 효소 분해의 경우에는, 조직편을 37 ℃ 에서 10-30 분 동안 프로테나제K, 트립신, 프로나제, 펩신 등과 같은 상이한 효소 용액에서 배양한다.
에피토프 복원용 용액 또는 과량의 효소를 헹구어낸 후, 비특이적 상호작용을 방지하고자 조직편을 차단용 완충액으로 처리하였다. 일차 항체를 실온에서 1 시간 동안 또는 밤새 희석용 완충액에서 적당한 희석배수로 하여 배양한다. 과량의 일차 항체를 헹구어낸 후, 이 절편을 실온에서 10 분 동안 퍼옥시다제 차단용 용액에서 배양한다. 별도의 세척 단계 후, 효소 고정물질의 역할을 할 수 있는 그룹으로 표지된 이차 항체와 함께 이 조직편을 배양한다. 이에 따른 일례로는 호스래디쉬 퍼옥시다제에 결합된 스트렙타비딘에 의해 인지되는 비오틴 표지된 이차 항체가 있다. 적절한 발색 기질과 함께 배양함으로써, 상기 항체/효소 복합체의 검출이 이루어진다.
C. 환자의 혈청내 HER -3 항원 농도의 측정
인간 혈청내 HER-3 수준을 정량하기 위한 샌드위치 ELISA 가 개발되었다. 샌드위치 ELISA 에 사용된 2 종의 완전 인간 모노클로날 항-HER-3 항체는 HER-3 분자상의 상이한 도메인을 인식하므로 결합에 대해 경합하지 않는다(예시로 상기 실시예 8 참조). 다음과 같이 ELISA를 수행한다 : 코팅용 완충액(0.1 M NaHCO3, pH 9.6)에서 포획용 항-HER-3 항체 50 ㎕ 를 2 ㎍/㎖ 의 농도로 ELISA 플레이트(Fisher)상에 코팅하였다. 4 ℃ 에서 밤새 배양한 후, 이 플레이트를 25 ℃ 에서 1 시간 동안 200 ㎕ 의 차단용 완충액(PBS중의 0.5 % BSA, 0.1 % 트윈 20, 0.01 % 티메로살)으로 처리하였다. PBS 에서 0.05 % 트윈 20(세척용 완충액, WB)을 사용하여 플레이트를 세척(3x)하였다. 50 % 인간 항체를 함유하는 차단용 완충액에서 정상 혈청 또는 환자 혈청(Clinomics, Bioreclaimation)을 희석시켰다. 이 플레이트를 4 ℃ 에서 밤새 혈청 샘플과 함께 배양하고, WB 로 세척한 후, 이를 25 ℃ 에서 1 시간 동안 100 ㎕/웰의 비오티닐화된 검출용 항-HER-3 항체와 함께 배양하였다. 세척후, 이 플레이트를 15 분 동안 HRP-스트렙타비딘과 함께 배양하고, 앞서와 같이 세척한 후, 발색을 위해 100 ㎕/웰의 H2O2 에서 o-페닐렌디아민(Sigma 발색용 용액)으로 처리하였다. 50 ㎕/웰의 H2SO4(2 M)을 사용하여 반응을 중단시키고, 492 nm 에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 분석하였다. 4 개 변수 곡선 적합 프로그램을 사용하여 정제된 HER-3 항원의 희석액과 비교함으로써 혈청 샘플내 HER-3 항원의 농도를 산출하였다.
환자내 암의 단계결정
상기 A, B 및 C 에서 설명 및 논의된 결과를 기반으로, 본 발명을 이용하면, HER-3 항원의 발현 수준에 의거한 피실험자에 대한 암의 단계결정이 가능하다. 해당 유형의 암에 대해, 질환 진행상의 다양한 단계 및/또는 암의 치료적 처치상의 다양한 시점에 있는 것으로 진단된 피실험자로부터 혈액 샘플을 채취한다. 항원의 존재량을 특이적으로 결정하는 방법을 이용하여 혈액 샘플내에 존재하는 HER-3 항원의 농도를 측정한다. 이러한 방법으로는 상기 A 및 B 에서 설명된 방법과 같은 ELISA 방법이 포함된다. 진행 또는 치료의 각 단계별로 통계학적으로 유의한 결과를 제공하는 샘플 집단을 이용하여, 각 단계별 특징으로 고려될 수 있는 HER-3 항원의 농도 범주를 지정한다.
연구중에 있는 피실험자에서 암의 진행 단계를 결정하기 위해, 또는 치료 과정에 대한 피실험자의 반응에 대한 특징을 규명하기 위해, 상기 피실험자로부터 혈액 샘플을 채취하고, 이 샘플내에 존재하는 HER-3 항원의 농도를 측정한다. 이렇게 수득한 농도를 이용하여 해당 수치가 어떤 농도 범주내에 속하는지 확인한다. 이렇게 확인된 범주는 다양한 진단 피실험자 집단에서 확인된 진행 단계 또는 치료 단계와 상호 관련이 있으며, 이것에 의해 연구중에 있는 피실험자에서의 단계가 제공된다.
실시예 27 : 과다증식성 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항- HER -3 항체 및 항체 접합체의 용도
많은 충실성 종양이 HER 군 매개 신호전달에 의해 진행되며, HER-3 이 HER-1, HER-2 및 HER-4 간의 복합체 형성에 중요한 파트너임이 입증된 바 있다. 그러므로, HER-3 매개 신호전달의 감소 또는 제거는 모든 다른 HER 군 일원에 영향을 주며, 기타 다른 표적된 제제, 생체물질 및 세포독성 제제와의 병용 치료시 광범위한 치료적 중재 및 그 효능에 이르게 하는 세포 신호전달에도 손상을 주게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 항-HER-3 항체는 예를 들어 HER-3 발현과 같은 다수의 요인들을 기반으로 하는 특정 과다증식성 또는 HER-3 관련 질환의 치료에 사용할 수 있다. 유방암, 위장관암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 방광암, 신경교종, 흑색종, 다른 HER-3 발현 또는 과다발현 암 같은 종양 유형에서 상기 바람직한 징후들이 나타나는 것으로 보이나, 이러한 징후들이 상기 나열된 것으로만 한정되지 않는다. 이외에도 다음과 같은 환자군에서 항-HER-3 지향 mAb 치료가 효과적이다 : ● 항-HER-2 mAb 치료에 대한 내성을 지닌 환자 ● 항-HER-2 mAb를 사용한 치료에 비적격인 환자 ● 항-HER-1 mAb 또는 소 분자 항-EGFR 저해제에 대한 내성을 지닌 환자 ● 에를로티닙(erlotinib) 또는 게피티닙(gefitinib)에 대한 내성을 지닌, 비-소 세포 폐암 환자
본 발명의 항-HER-3 항체는 단일요법으로 또는 소위 "병용 요법"이라 불리는 1 종 이상의 약제와의 배합물 형태로 사용할 수 있다. 상기한 병용 요법은 본 발명에서 앞서 명시한 약제를 포함할 수 있으나, 이들로만 한정되지 않는다. 항-HER-3 항체 및 기타 다른 약제를 사용한 병용 요법은 환자의 생존 연장, 종양 진행 시간 지연 또는 환자 생활의 질적 향상을 도모할 수 있다. 프로토콜 및 투여 계획은 치료 효능뿐 아니라 예를 들어 화학요법 또는 방사선 요법과 같은 표준 치료요법의 통상적 사용량을 감소시키는 능력을 제공할 것이다.
본 발명의 항- HER -3 항체를 사용한 인체 치료
종양을 가진 인체 환자에서 체내 항-HER-3 항체 치료 효과를 결정하기 위해, 이러한 인체 환자에게 특정 시간에 걸쳐 유효량의 본 발명의 항-HER-3 항체를 주사한다. 치료중 정기적으로 인체 환자를 모니터링하여 종양 진행 여부, 구체적으로 종양 성장 및 전이 여부를 측정한다.
본 발명의 항-HER-3 항체로 치료한 종양 환자는 현행 표준 관리 요법으로 치료한 종양 환자내 종양 성장 및 전이 수준과 비교하여 낮은 수준의 종양 성장 및/또는 전이를 나타낸다.
본 발명의 항- HER -3 항체 접합체를 사용한 치료
본 발명의 항-HER-3 항체 접합체의 체내 효과를 결정하기 위해, 종양을 나타내는 인체 환자 또는 동물에게 특정 시간에 걸쳐 유효량의 본 발명의 항-HER-3 항체 접합체를 주사한다. 예를 들면, 투여된 항-HER-3 항체 접합체는 DM1-항-HER-3 항체 접합체, 아우리스타틴-항-HER-3 항체 접합체 또는 방사성동위원소-항-HER-3 항체 접합체이다. 치료중 정기적으로 인체 환자 또는 동물을 모니터링하여 종양 진행 여부, 구체적으로 종양 성장 및 전이 여부를 측정한다.
종양을 나타내며, 예를 들어 DM1-항-HER-3 항체 또는 방사성동위원소-항-HER-3 항체 접합체로 치료를 진행중인 인체 환자 또는 동물은 종양을 나타내며 대안적 치료요법으로 치료를 진행중인 대조 환자 또는 동물과 비교시, 낮은 수준의 종양 성장 및 전이를 나타낸다. 동물에 사용할 수 있는 대조용 DM1-항체로는 본 발명의 항-HER-3 항체와 동일한 이소타입의 항체에 결합된 DM1 을 함유하되, 더욱 구체적으로는 HER-3 종양 항원 결합 능력을 지니지 않는 접합체가 포함된다. 동물 시험에 사용할 수 있는 대조용 방사성동위원소-항체로는 본 발명의 항-HER-3 항체와 동일한 이소타입의 항체에 결합된 방사성동위원소를 함유하되, 더욱 구체적으로는 HER-3 종양 항원 결합 능력을 지니지 않는 접합체가 포함된다. 주 : 대조용 접합체는 인체에 투여하지 않는다.
일반 사항
전술된 명세서는 해당 업계의 숙련자가 본 발명을 실시함에 있어 충분할 것으로 생각된다. 기탁된 실시형태는 본 발명의 특정 목적에 대한 하나의 예시에 불과하므로, 본 발명은 그 범주가 기탁된 구성물에 의해 제한되지 않아야 하며, 기능적으로 동등한 어떠한 구성물도 본 발명의 범주내에 속한다. 본원에서 물질의 기탁은 최상의 상태를 포함하여 본 발명의 어떠한 목적을 실시하는데 본원에 포함된 기술 내용이 불충분함을 인정하는 것이 아니며, 또한 청구 범위를 이것이 나타내는 특정 예시로 한정하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
상기 기술 내용 및 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시형태를 상세히 설명한 것으로, 본 발명자들에 의해 의도된 최상의 양태를 기술한 것이다. 그러나, 상기 내용이 본문에서 얼마나 상세히 제시되었는가와는 상관없이, 본 발명은 다수의 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구항과 그 동등물에 따라 해석되어야 한다.
더 나아가, 다르게 정의하지 않았다면, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 기술적 용어는 해당 업계의 숙련자들이 보편적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다. 더욱이, 문맥상 달리 요구되지 않았다면, 단수형의 용어는 복수형을 포함하고, 복수형의 용어는 단수형을 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명칭 및 관련 기술은 해당 업계에 잘 알려지고 보편적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양과 형질전환에는 표준 기술이 사용된다(예, 전기천공법, 리포펙션). 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명에 따라, 또는 해당 업계에서 보편적으로 이루어지는 바 혹은 본원에 기술된 바와 같이 실시된다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 해당 업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용 및 논의된 일반적이고 보다 구체적인 다양한 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예시로, 본원에 참고로 인용된 문헌인 [Sambrook et al . Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)] 참조하라. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약제 화학과 관련하여 사용된 명칭, 관련 실험 절차와 기술은 해당 업계에 잘 알려지고 보편적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제 제조, 제형화, 전달, 및 환자 치료에는 표준 기술이 사용된다.
참고문헌 인용
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등, 본원에 인용된 참고문헌을 포함하여 모든 본원 인용 문헌은 해당 전문이 본원에 참고로 인용된 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> U 3 Pharma AG Amgen Inc. <120> Antibodies directed to HER-3 and uses thereof <130> 33091P-WO <140> PCT/EP2006/012632 <141> 2006-12-29 <150> US60/755103 <151> 2005-12-30 <160> 582 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antibody <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggattg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atactacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggcagtgg 300 ctggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca 342 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ser 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gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagcg 300 gattacgatt tttggagtgg ttattttgac tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 154 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Antibody <400> 154 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 155 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antibody <400> 155 gacatccaga 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Ser 1 5 <210> 495 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-44-CDR-3l <400> 495 Gln Gln Ser Ile Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 496 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-45-CDR-1h <400> 496 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 10 <210> 497 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-45-CDR-2h <400> 497 Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Val Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 498 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-45-CDR-3h <400> 498 Phe Gly Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Ser Tyr Tyr Glu Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 499 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-45-CDR-1l <400> 499 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 500 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-45-CDR-2l <400> 500 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 501 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-45-CDR-3l <400> 501 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 502 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-46-CDR-1h <400> 502 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn 1 5 10 <210> 503 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-46-CDR-2h <400> 503 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 504 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-46-CDR-3h <400> 504 Asp Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 505 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-47-CDR-1h <400> 505 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn 1 5 10 <210> 506 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-47-CDR-2h <400> 506 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 507 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-47-CDR-3h <400> 507 Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 508 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-47-CDR-1l <400> 508 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 509 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-47-CDR-2l <400> 509 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 510 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-47-CDR-3l <400> 510 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 511 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-48-CDR-1h <400> 511 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 512 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-48-CDR-2h <400> 512 His Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 513 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-48-CDR-3h <400> 513 Glu Ala Ile Phe Gly Val Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 514 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-49-CDR-1h <400> 514 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 515 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-49-CDR-2h <400> 515 Trp Ile Asn Pro Asn Ile Gly Gly Thr Asn Cys Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 516 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-49-CDR-3h <400> 516 Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 517 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-49-CDR-1l <400> 517 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Leu Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 518 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-49-CDR-2l <400> 518 Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 519 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-49-CDR-3l <400> 519 Met Gln Ser Met Gln Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 520 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-50-CDR-1h <400> 520 Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 521 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-50-CDR-2h <400> 521 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 522 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-50-CDR-3h <400> 522 Gly Gly Asp Ser Asn Tyr Glu Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 523 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-50-CDR-1l <400> 523 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu His 1 5 10 <210> 524 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-50-CDR-2l <400> 524 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 525 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-50-CDR-3l <400> 525 Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 526 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-51-CDR-1h <400> 526 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 527 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-51-CDR-2h <400> 527 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 528 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-51-CDR-3h <400> 528 Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Ala 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 529 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-51-CDR-1l <400> 529 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 530 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-51-CDR-2l <400> 530 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 531 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-51-CDR-3l <400> 531 Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 532 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-52-CDR-1h <400> 532 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 533 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-52-CDR-2h <400> 533 Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 534 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-52-CDR-3h <400> 534 Gly Gly Thr Gly Thr Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 535 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-52-CDR-1l <400> 535 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 536 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-52-CDR-2l <400> 536 Gly Ala Ser Ser Trp Ala Thr 1 5 <210> 537 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-52-CDR-3l <400> 537 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 538 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-53-CDR-1h <400> 538 Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ser Met Asn 1 5 10 <210> 539 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-53-CDR-2h <400> 539 Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 540 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-53-CDR-3h <400> 540 Asp Arg Gly Asp Phe Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 541 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-53-CDR-1l <400> 541 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 542 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-53-CDR-2l <400> 542 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 543 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-53-CDR-3l <400> 543 Gln Gln Cys Glu Asn Phe Pro Ile Thr 1 5 <210> 544 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-55.1-CDR-1h <400> 544 Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 545 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-55.1-CDR-2h <400> 545 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 546 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-55.1-CDR-3h <400> 546 Asp Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 547 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-55-CDR-1l <400> 547 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 548 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-55-CDR-2l <400> 548 Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 549 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-55-CDR-3l <400> 549 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr 1 5 <210> 550 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-57.1-CDR-1l <400> 550 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 551 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-57.1-CDR-2l <400> 551 Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 552 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-57.1-CDR-3l <400> 552 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr 1 5 <210> 553 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-57_CDR-1h <400> 553 Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 554 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-57_CDR-2h <400> 554 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 555 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-57_CDR-3h <400> 555 Asp Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 556 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-58-CDR-1h <400> 556 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 557 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-58-CDR-2h <400> 557 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 558 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-58-CDR-3h <400> 558 Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 559 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-58-CDR-1l <400> 559 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 560 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-58-CDR-2l <400> 560 Gly Ala Ser Gly Leu Gln Ser 1 5 <210> 561 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-58-CDR-3l <400> 561 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 562 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-59-CDR-1h <400> 562 Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 563 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-59-CDR-2h <400> 563 Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 564 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-59-CDR-3h <400> 564 Asp Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 <210> 565 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-59-CDR-1l <400> 565 Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ser Asn Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 566 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-59-CDR-2l <400> 566 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 567 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-59-CDR-3l <400> 567 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 568 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61.1-CDR-1h <400> 568 Gly Val Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 569 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61.1-CDR-2h <400> 569 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 570 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61.1-CDR-3h <400> 570 Asp Ser Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 571 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61.1-CDR-1l <400> 571 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 572 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61.1-CDR-2l <400> 572 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly 1 5 <210> 573 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61.1-CDR-3l <400> 573 Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 574 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61-CDR-1h <400> 574 Gly Val Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 575 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61-CDR-2h <400> 575 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 576 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-61-CDR-3h <400> 576 Asp Ser Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 577 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-62-CDR-1h <400> 577 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 578 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-62-CDR-2h <400> 578 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 579 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-62-CDR-3h <400> 579 Gln Met Ala Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 580 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-62-CDR-1l <400> 580 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ile Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 581 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-62-CDR-2l <400> 581 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 582 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> U1-62-CDR-3l <400> 582 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Ser 1 5

Claims (52)

  1. 다음의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는, HER-3 에 결합하는 분리된 결합 단백질
    (a) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH1 ;
    (b) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH2 ;
    (c) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH3.
  2. 다음의 (d), (e) 및 (f) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, HER-3 에 결합하는 분리된 결합 단백질
    (d) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL1 ;
    (e) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL2 ;
    (f) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL3.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 다음의 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질
    상기 중쇄 아미노산 서열은 다음의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함하고,
    (a) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH1 ;
    (b) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH2 ;
    (c) SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 에 제시된 CDRH3 ;
    상기 경쇄 아미노산 서열은 다음의 (d), (e) 및 (f) 중에서 선택한 적어도 1 종의 CDR 을 포함한다
    (d) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL1 ;
    (e) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL2 ;
    (f) SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 에 제시된 CDRL3.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 다음의 중쇄 아미노산 서열 또는 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질
    SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 중 임의의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 ;
    SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 중 임의의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 를 포함하는 경쇄 아미노산 서열.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 다음의 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질
    SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 중 임의의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 ;
    SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 중 임의의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 를 포함하는 경쇄 아미노산 서열.
  6. 제 1 항에 있어서, 다음 중에서 선택한 중쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질
    SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230.
  7. 제 2 항에 있어서, 다음 중에서 선택한 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질
    SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232.
  8. 제 1 항에 있어서, 다음의 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질
    SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 중에서 선택한 중쇄 아미노산 서열 ;
    SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 중에서 선택한 경쇄 아미노산 서열.
  9. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NOs : 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 및 230 중 임의의 CDRH3 를 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, SEQ ID NOs : 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 및 232 중 임의의 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO : 42 의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO : 44 의 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO : 54 의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO : 56 의 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO : 70 의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO : 72 의 경쇄 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  14. 성숙한 HER-3, 특히 성숙한 인간 HER-3 의 아미노산 잔기 1-160 ; 161-358 ; 359-575 ; 1-358 ; 359-604 에 의해 형성된 3-차원 구조에 결합하 는 분리된 결합 단백질.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 HER-3 의 세포외 도메인에 대해 지향하는 것임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, HER-3 에 대한 상기 결합 단백질의 결합이 HER-3-매개 신호 전달(HER-3-mediated signal transduction)을 감소시킴을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, HER-3 에 대한 상기 결합 단백질의 결합이 HER-3 인산화를 감소시킴을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, HER-3 에 대한 상기 결합 단백질의 결합이 세포 증식을 감소시킴을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  19. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, HER-3 에 대한 상기 결합 단백질의 결합이 세포 이동을 감소시킴을 특징으로 하는 분리 된 결합 단백질.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, HER-3 에 대한 상기 결합 단백질의 결합이 HER-3 의 하향조절을 증대시킴을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 항체임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이성 (multispecific) 항체 또는 이들의 항체 단편임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 또는 단쇄 항체 분자임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 결 합 단백질이 IgG1-형, IgG2-형, IgG3-형 또는 IgG4-형의 항체임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 표지 그룹에 결합되어 있음을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 표지 그룹이 방사성동위원소나 방사성핵종, 형광체 그룹, 효소 그룹, 화학발광체 그룹, 비오티닐 그룹, 또는 소정(predetermined)의 폴리펩티드 에피토프임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  27. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 효과기 그룹 (effector group)에 결합되어 있음을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 효과기 그룹이 방사성동위원소나 방사성핵종, 독소, 또는 치료제나 화학요법제 그룹임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 치료제나 화학요법제 그룹이 칼리케아미신, 아우리스타틴-PE, 겔다나마이신, 메이탄신(maytansine) 및 이들의 유도체 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 분리된 결합 단백질.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 제어 서열에 작동가능하게 결합되어 있음을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  32. 제 30 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  33. 제 31 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  34. 제 32 항의 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포.
  35. 제 33 항의 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포.
  36. 숙주 세포로부터 결합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 단백질을 제조하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 원핵 세포임을 특징으로 하는 방법.
  38. 활성제로서 적어도 1 종의 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 치료학적 용도를 위한 조성물.
  40. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 진단학적 용도를 위한 조성물.
  41. 약학적 유효량의 제 38 항 또는 제 39 항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 실험대상에게 투여하여 환자에서 HER-3 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 질환이 과다증식성 질환임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 과다증식성 질환은 유방암, 위장관암, 췌장 암, 전립선암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 방광암, 신경교종, 흑색종, 고환암, 연부조직 육종, 두경부암, 다른 HER-3 발현 또는 과다발현 암 및 종양 전이 형성 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 상기 과다증식성 질환이 HER-3 인산화 증가, HER-2/HER-3 이종이합체화 증가 또는 PI3-키나제, c-jun-말단성 키나제, AKT, ERK2 및 PYK2 중 하나 또는 그 이상의 활성 증가와 연관된 것임을 특징으로 하는 방법.
  45. (a) 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질과 샘플을, 상기 결합 단백질이 HER-3 에 결합하도록 하는 적합한 조건하에서 접촉시키고 ;
    (b) HER-3 에 대한 상기 결합 단백질의 결합을 확인하는 것을 포함하는, HER-3 관련 질환을 진단하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 질환이 과다증식성 질환임을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 과다증식성 질환은 유방암, 위장관암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 갑상선암, 방광암, 신경교종, 흑색종, 다른 HER-3 발현 또는 과다발현 암, 고환암, 연부조직 육종, 두경부암, 및 종양 전이 형성 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 상기 과다증식성 질환이 HER-3 인산화 증가, HER-2/HER-3 이종이합체화 증가 또는 PI3-키나제, c-jun-말단성 키나제, AKT, ERK2 및 PYK2 중 하나 또는 그 이상의 활성 증가와 연관된 것임을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 단백질을 포함하는 키트.
  50. 제 49 항에 있어서, 추가의 치료제를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항신생물제임을 특징으로 하는 키트.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 항신생물제가 항-종양 항체 또는 화학요법제임을 특징으로 하는 키트.
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