PT1500329E

PT1500329E - Anticorpos humanos que se ligam especificamente ao tnf alfa humano

Info

Publication number: PT1500329E
Application number: PT04013481T
Authority: PT
Inventors: Sue Klapholz; Michael Mendez; Aya Jakobovits; Larry Green; Rajau Kucherlapati
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1996-12-03
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2012-06-18
Also published as: WO1998024893A2; CA2722378A1; EP2314625B1; CA2616914A1; EP2314625A1; EP1500329A3; EP2314625A8; EP0942968A2; EP2305027A3; ES2301183T3; EP0942968B1; EP1500329B1; JP4808412B2; ES2384942T3; CA2273194A1; CA2273194C; PT942968E; KR100942002B1; AU5702298A; CA2722378C

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS HUMANOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE AO TNF ALFA HUMANO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos humanos que se ligam especificamente ao TNFa humano.

ANTECEDENTES DA TECNOLOGIA A capacidade para clonar e reconstruir loci humanos na escala de megabases em YAC e para introduzi-los na linha germinal de murganho proporciona uma abordagem poderosa para elucidar os componentes funcionais de loci muito grandes ou grosseiramente mapeados, assim como produzir modelos úteis de doença humana. Além disso, a utilização dessa tecnologia para a substituição de loci de murganho com os seus equivalentes humanos poderia proporcionar conhecimentos únicos sobre a expressão e regulação de produtos génicos humanos durante o desenvolvimento, a sua comunicação com outros sistemas e a sua participação na indução e progressão de doença.

Uma aplicação prática importante de uma tal estratégia é a "humanização" do sistema imunitário humoral de murganho. A introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana em murganhos, nos quais os genes Ig endógenos foram inactivados, oferece a 1 oportunidade para estudar os mecanismos subjacentes à expressão programada e montagem de anticorpos, assim como o seu papel no desenvolvimento da célula B. Além disso, essa estratégia pode proporcionar uma fonte ideal para a produção de anticorpos monoclonais (Mab) totalmente humanos - um marco importante no sentido de cumprir a promessa da terapia por anticorpos na doença humana. É esperado que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas e alérgicas intrínsecas a Mab de murganho ou derivados de murganho e aumentem, assim, a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. Pode-se esperar que a utilização de anticorpos totalmente humanos proporcione uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crónicas e recorrentes, tais como inflamação, autoimunidadde e cancro, as quais requerem administrações repetidas de anticorpo.

Uma abordagem no sentido deste objectivo foi a manipulação de estirpes de murganho deficientes na produção de anticorpos de murganho com fragmentos grandes dos loci de Ig humana, em antecipação que tais murganhos produziriam um grande repertório de anticorpos humanos na ausência de anticorpos de murganho. Os fragmentos grandes de Ig humana preservariam a grande diversidade de genes variáveis, assim como a regulação apropriada da produção e expressão de anticorpos. Através da exploração da maquinaria de murganho para a diversificação e selecção de anticorpos e a ausência de tolerância imunológica às proteínas humanas, o reportório reproduzido de anticorpos humanos nestas estirpes de murganho deve produzir anticorpos de elevada afinidade contra qualquer antigénio de interesse, incluindo antigénios humanos. Utilizando a tecnologia de hibridoma, podiam ser prontamente produzidos e seleccionados Mab humanos específicos de antigénio com a especificidade desejada. 2

Esta estratégia geral foi demonstrada relativamente à produção, pela requerente, das primeiras estirpes XenoMouse™ como publicado em 1994. Ver Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). As estirpes XenoMouse™ foram manipuladas com fragmentos de configuração de linha germinal de tamanhos 245 kb e 190 kb dos loci da cadeia pesada humana e dos loci da cadeia leve kapa, respectivamente, que continham sequências de regiões do núcleo variáveis e constantes id. Os cromossomas artificiais de levedura (YAC) contendo Ig humana provaram ser compatíveis com o sistema de murganho para o rearranjo e para a expressão de anticorpos e foram capazes de substituir os genes de Ig de murganho inactivados. Isto foi demonstrado pela sua capacidade para induzir o desenvolvimento de células B e para produzir um reportório humano de tipo adulto de anticorpos totalmente humanos e para criar Mab humanos específicos de antigénio. Estes resultados também sugeriram que a introdução de porções maiores dos loci de Ig humana contendo maior número de genes V, elementos reguladores adicionais e regiões constantes de Ig humana pode recapitular substancialmente o reportório completo que é característico da resposta humoral humana à infecção e imunização.

Tal abordagem é, ainda, discutida e delineada nos Pedidos de Patente U.S. com o N° de Série 07/466008 apresentado a 12 de Janeiro de 1990, 07/610515 apresentado a 8 de Novembro de 1990, 07/919297 apresentado a 24 de Julho de 1992, 07/922649 apresentado a 30 de Julho de 1992, 08/031801 apresentado a 15 de Março de 1993, 08/112848 apresentado a 27 de Agosto de 1993, 08/234145 apresentado a 28 de Abril de 1994, 08/376279 apresentado a 20 de Janeiro de 1995, 08/430938, 27 de Abril de 1995, 08/46584 apresentado a 5 de Junho de 1995, 08/464582 apresentado a 5 de Junho de 1995, 08/463191 apresentado a 5 de 3

Junho de 1995, 08/462837 apresentado a 5 de Junho de 1995, 08/486853 apresentado a 5 de Junho de 1995, 08/486857 apresentado a 5 de Junho de 1995, 08/486859 apresentado a 5 de

Junho de 1995, 08/462513 apresentado a 5 de Junho de 1995 e 08/724752 apresentado a 2 de Outubro de 1996. Ver também a Patente Europeia N° EP0463151 Bl, concessão publicada a 12 de Junho de 1996, o Pedido de Patente Internacional N° WO 94/02602, publicado a 3 de Fevereiro de 1994, o pedido de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicado a 31 de Outubro de 1996 e o Pedido PCT N° PCT/US96/05928 apresentado a 29 de Abril de 1996. O documento WO 96/33735 divulga anticorpos humanos produzidos por administração de um antigénio a um XenoMouse.

Numa abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem de "minilocus". Na abordagem de minilocus, um locus de Ig exógeno é mimetizado através da inclusão de partes (genes individuais) do locus de Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes Jh, uma região constante mu e uma segunda região constante (de um modo preferido, uma região constante gama) são formados numa construção para inserção num animal. Esta abordagem é descrita na Patente U.S. N° 5545807 de Surani et al. e Patentes U.S. N° 5545806 e 5625825, ambas de Lonberg e Kay, e nos Pedidos de Patente U.S. da GenPharm International com o N° de série 07/574748 apresentado a 29 de Agosto de 1990, 07/575962 apresentado a 31 de Agosto de 1990, 07/810279 apresentado a 17 de Dezembro de 1991, 07/853408 apresentado a 18 de Março de 1992, 07/904068 apresentado a 23 de Junho de 1992, 07/990860 apresentado a 16 de Dezembro de 1992, 08/053131 apresentado a 26 de Abril de 1993, 08/096762 apresentado a 22 de Julho de 1993, 08/155301 apresentado a 18 de Novembro de 1993, 08/161739 apresentado a 3 de Dezembro de 1993, 08/165699 apresentado a 4 10 de Dezembro de 1993, 08/209741 apresentado a 9 de Março de 1994. Ver também o Pedido de Patente Internacional N° WO 94/25585, publicado a 10 de Novembro de 1994, WO 93/12227, publicado a 24 de Junho de 1993, WO 92/22645, publicado a 23 de Dezembro de 1992, WO 92/03918, publicado a 19 de Março de 1992. Ver ainda Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) e Tuaillon et al., (1995).

Os inventores de Surani et al., citados acima e atribuído ao Medicai Research Counsel (o "MRC"), produziram um murganho transgénico que possui um locus de Ig através da utilização da abordagem de minilocus. Os inventores no trabalho da GenPharm International, citado acima, Lonberg e Kay, seguindo o exemplo da presente requerente, propuseram a inactivação do locus de Ig endógeno de murganho acoplado com duplicação substancial do trabalho de Surani et al.

Uma vantagem da abordagem de minilocus é a rapidez com que construções que incluem porções do locus de Ig são criadas e introduzidas em animais. Proporcionadamente, contudo, uma desvantagem significativa da abordagem de minilocus é que, em teoria, é introduzida diversidade insuficiente através da inclusão de pequenos números de genes V, D e J. De facto, o trabalho publicado parece apoiar esta preocupação. O desenvolvimento de células B e a produção de anticorpos de animais produzidos através da utilização da abordagem de minilocus parecem atrofiados. Deste modo, a presente requerente procurou consistentemente a introdução de porções grandes do locus de Ig de modo a conseguir uma maior diversidade e num esforço para reconstituir o reportório imunitário dos animais. 5

Desta forma, seria desejável proporcionar animais transgénicos contendo sequências de linha germinal mais completas e configuração do locus de Ig humana. Seria adicionalmente desejável proporcionar esse locus contra uma base inactivada de Ig endógenas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos seguintes itens: 1. Um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao TNFa humano, ou uma porção de ligação a antigénio do referido anticorpo, em que o referido anticorpo: a) reduz a ligação do TNFa humano a um receptor do TNFa humano; b) compreende uma cadeia pesada IgG2 humana; c) compreende uma cadeia leve kapa humana; e d) liga-se ao TNFa humano com: i) uma KD menor do que 2 x IO”10 M; ii) uma Ka maior do que 0,5 x 106 M_1S_1; ou iii) uma KD menor do que 2 x IO”10 M e uma Ka maior do que 0,5 x 106 M-1S-1; 2. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KD menor do que 2 x IO-10 M. 6 3. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma Ka maior do que 0,5 x 106 M^S'1. 4. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com o item 3, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KD de 1,89-8, 06 x IO-10 M. 5. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com o item 3, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KA de 1,2-5,3 x 101M_1. 6. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com o item 3, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KA de 1,2-3,9 x 101M_1. 7. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KD menor do que 2 x 1CT2 M e uma Ka maior do que 0,5 x 106 M-1S-1. 8. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer um dos itens 3-7, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma Ka de 1,6-2, 9 x 106 M_1S_1. 7 1 O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com 2 qualquer um dos itens 3-7, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma Ka maior do que 2 x 106 M_1S_1. 10. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer um dos itens 1-9, em que o referido anticorpo é monoclonal. 11. Utilização do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer um dos itens 1 a 10 na preparação de um medicamento. 12. Utilização do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer um dos itens 1 a 10 na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença humana crónica ou recorrente, tais como inflamação, autoimunidade e cancro. 13. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer um dos itens 1 a 10 para a utilização como um medicamento. 14. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer um dos itens 1 a 10 para utilização no tratamento de uma doença humana crónica ou recorrente, tais como inflamação, autoimunidade e cancro. 15. Um método para reduzir a ligação do TNFa humano a um receptor do TNFa humano compreendendo o passo de contacto do TNFa humano com o anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10. 16. Um método para produzir o anticorpo humano isolado de acordo com qualquer um dos itens 1-10, compreendendo os passos de: (a) imunização de um murganho transgénico capaz de (b) expressar um anticorpo totalmente humano para um antigénio de interesse, com TNFa humano: e isolar o anticorpo humano. 8 17. Uma célula que expressa anticorpo, derivada de um murganho transgénico imunizado pelo método de acordo com o item 16. 18. A célula que expressa anticorpo de acordo com o item 17, em que a referida célula é uma célula imortalizada. 19. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando um ou mais polipéptidos seleccionados do grupo consistindo de: (a) a cadeia pesada do anticorpo humano de acordo com qualquer um dos itens 1-10; (b) a cadeia leve do anticorpo humano de acordo com qualquer um dos itens 1-10; e (c) uma porção de ligação a antigénio de (a) ou (b). 20. Um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com o item 19. 21. Uma célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com o item 19 ou o vector de acordo com o item 20. 22. Uma célula hospedeira de acordo com o item 21, em que a célula hospedeira compreende: (a) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando a cadeia pesada do anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1-10 ou de uma sua porção de ligação a antigénio; e (b) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando a cadeia leve do 9 anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1-10 ou de uma sua porção de ligação a antigénio. 23. Um método para a produção do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer um dos itens 1-10, compreendendo os passos de cultivo de uma célula hospedeira de acordo com o item 22 e recuperação do anticorpo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é uma representação esquemática dos YAC reconstruídos dos loci da cadeia pesada humana e da cadeia leve kapa humana, introduzidos em murganhos preferidos, aqui descritos. Os YAC cobrindo os loci proximais da cadeia pesada humana (1H, 2H, 3H e 4H) e da cadeia leve kapa humana (1K, 2K, e 3K) foram clonados a partir de bibliotecas YAC humanas. As posições dos diferentes YAC relativamente aos loci de Ig humana (adoptado de Cook e Tomlinson, 1995, e Cox et ai., 1994), os seus tamanhos e sequências não de Ig são indicadas (não mostradas à escala). Os YAC foram recombinados em levedura num processo de dois passos (ver Materiais e Métodos) para reconstruir os YAC da cadeia pesada e cadeia leve kapa humana. yH2, o YAC contendo a cadeia pesada humana foi, ainda, readaptado com uma sequência do gene Y2 humano. yK2, era o YAC contendo a cadeia leve kapa humana. Os elementos do vector YAC são indicados: telómero A, centrómero ·, marcadores de selecção de mamífero (HPRT, Neo) e de levedura (TRP1, ADE2, LYS2, LEU2, URA3, HIS3) nos braços do vector YAC. Os segmentos de VH são classificados como genes com grelha de leitura aberta ·, pseudogenes □ e genes não sequenciados O. Os segmentos de VK são classificados como genes com grelha de leitura aberta · e 10 pseudogenes □. Os genes V gue se verificou serem utilizados pelo XenoMouse II são marcados (*) . A região de gene VH contida em yH2 é marcada por setas.

A Figuras 2 é uma série de análises de Transferência de Southern e de caracterizações do YAC da cadeia pesada humana, yH2, integrado em células ES e em estirpes XenoMouse. A Figura 2a é uma série de análises de Transferência de Southern de ADN (2 pg) digerido com EcoRI (a, c) e BamHI (b, d, e) preparado a partir da linha celular CGM1 de linfoblasto B

imortalizado derivada da biblioteca de YAC da Washington University (Brownstein et al., 1989), yH2 YAC (0,5 pg de YAC adicionado a 2 pg de ADN 3B1), E14TG.3B1 (3B1) não modificado e linha celulares ES contendo yH2: LIO, J9.2, L18, L17, e J17. As sondas utilizadas para a transferência foram VH1 (a), DH (b) [o fragmento de 18 kb na pista de CGMI representa segmentos D no cromossoma 16], VH3 (c), Cp (d) e JH (e) de humano. A Figura 2b é uma série de análises de Transferência de Southern de ADN (10 pg) digerido com EcoRI (a-b) e BamHI (c-d) que foi preparado a partir de caudas de murganhos de tipo selvagem (WT, 129xB57BL/6J), XM2A-1 e XM2A-2 (2 proles individuais) ou a partir das linhas celulares ES contendo yH2 parentais LIO (ligeiramente subcarregadas relativamente a outras amostras), J9.2 e a linha celular ES contendo yK2 J23.1. As sondas utilizadas foram VH1 humana (a) , VH4 (b) , γ-2 humana (c) e intensificador 3' de murganho (d, a banda de 5 kb representa o fragmento do intensificador 3' endógeno de murganho). São indicados os tamanhos dos fragmentos de marcadores de peso molecular (em kb). A Figura 3a é uma série de análises de Transferência de Southern que caracterizam o YAC da cadeia leve kapa humana, yK2, 11 integrado em células ES e em Estirpes de XenoMouse 2A. A Figura 2a é uma série de análises de Transferência de Southern de ADN digerido (2 pg) com EcoRI (a, c, d) e BamHI (b, e) preparado a partir da linha celular CGM1 (Brownstein et al., 1989, supra), yK2 YAC (0,5 pg de ADN de YAC adicionado a 2 pg de ADN de 3B1), E14TG.3B1 (3B1) não modificado e linhas celulares ES contendo yK2: J23.1 e J23.7. As sondas utilizadas foram Va (a), Kde (b) , VKII (c), VKIII (d) e CK (e) de humanos. A Figura 2b é uma série de análises de Transferência de Southern de ADN (2 pg) digerido com EcoRI que foi preparado a partir das caudas de murganhos de tipo selvagem (WT, 129xB6), XM2A-1 e XM2A-2 (2 proles individuais) ou a partir da linha celulares ES contendo yH2 parentais LIO (ligeiramente subcarregada relativamente a outras amostras), J9.2 e linha celular ES contendo yK2 J23.1. As sondas que foram utilizadas foram VkI humana (a), VkIV (b) , VKVI (c) e intensif icador 3' (d). São indicados os tamanhos dos fragmentos de marcadores de peso molecular (em kb). A Figura 4 mostra reconstituição de células B e expressão à superfície de cadeias p, δ e k humanas em células B derivadas de XenoMouse e mostram análises de citometria de fluxo de sangue periférico (Fig. 4a) e linfócitos de baço (Fig. 4b) de murganhos de tipo selvagem (WT), murganhos duplamente inactivados (Dl) e estirpes XenoMouse 2A-1 e 2A-2 (XM2A-1, XM2A-2). Foi realizada análise de citometria de fluxo de quatro cores utilizando anticorpos para o marcador B220 específico de células B em combinação com p, δ, k anti-humano ou p, δ, k ou λ de murganho. A percentagem de células coradas positivamente é mostrada em cada quadrante. O isolamento e coloração das células foram realizados como descrito nos Materiais e Métodos. As populações de células p+ e δ+ foram determinadas após primeiro circunscrever para células B220+. É indicada a percentagem de células positivas 12 dentro de uma região ou quadrante. Os perfis de FAC mostrados são representativos de várias experiências realizadas em cada uma das estirpes. A Figura 5 mostra que os anticorpos humanos derivados de XenoMouse bloqueiam a ligação dos seus antigénios específicos às células. A Figura 5a mostra à inibição da ligação de [ 1125 ]IL —8 marcado a neutrófilos humanos pelo anticorpo anti-IL-8 humano de murganho (R & D Systems) (□) e o Mab totalmente humanos Dl. 1 (♦), K2.2 (·), K4.2 (A), e K4.3(T). A ligação de fundo de [ 1125 ] IL — 8 marcado na ausência de anticorpo foi de 2657 cpm. A Figura 5b mostra a inibição de [I125]EGF marcado aos seus receptores em células A431 por anticorpos anti-EGFR humano 225 e 528 de murganho (□, v, respectivamente; Calbiochem) e os anticorpos totalmente humanos El.l(·), E2.4(A), E2.5(T) e E2.ll (♦) . A ligação de fundo de [I125]EGF na ausência de anticorpos foi de 1060 cpm. A Figura 5c mostra inibição da ligaçao de [I ]TNF-α marcado aos seus receptores em células U937 pelo anticorpo anti-TNF-α humano de murganho (R & D Systems) (□) e Mab totalmente humanos T22.1 (♦), T22.4 (·), T22.8(A) e Τ22.9(·). A ligação de fundo de [ I125] TNF-α na ausência de anticorpo foi de 4010 cpm. Anticorpo de mieloma IgG2 humano de controlo (Ξ) . A Figura 6 mostra o reportório e a hipermutação somática em Mab totalmente humanos derivados de XenoMouse. As sequências de aminoácidos previstas de quatro anti-IL-8 (Fig. 6a) e quatro anti-EGFR (Fig. 6b) Mab IgG2k humanos, divididos em CDR1, CDR2 e CDR3 e as regiões constantes, CY2 e Ck. São indicados os genes D e J de cada anticorpo. As substituições de aminoácidos das sequências de linha germinal são indicadas em letras a cheio. 13 A Figura 7 é um diagrama esquemático do genoma da cadeia pesada humana e do genoma da cadeia leve kapa humana. A Figura 8 é outro diagrama esquemático que mostra a construção do YAC yH2 (cadeia pesada humana). A Figura 9 é outro diagrama esquemático que mostra a construção do YAC yK2 (cadeia leve kapa humana). A Figura 10 é outro diagrama esquemático que mostra a construção do YAC yK2 (cadeia leve kapa humana). A Figura 11 mostra uma série de análises de Transferência de Southern que demonstram a integração intacta do YAC yH2 (cadeia pesada humana) em células ES e no genoma de murganho. É proporcionada discussão detalhada em relação à Figura 2. A Figura 12 mostra uma série de análises de Transferência de Southern que demonstram a integração intacta do YAC yK2 (cadeia leve kapa humana) em células ES e no genoma de murganho. É proporcionada discussão detalhada em relação à Figura 3. A Figura 13 mostra reconstituição de células B e expressão à superfície de cadeias μ, δ e k humanas e cadeias λ de murganho em células B derivadas de XenoMouse e mostram análises de citometria de fluxo de sangue periférico. São proporcionados detalhes adicionais em relação à Figura 4. A Figura 14 mostra níveis de produção de anticorpos humanos por estirpes XenoMouse II em comparação com a produção de anticorpos de murino por murganhos de tipo selvagem. 14 A Figura 15 é uma análise do reportório de transcriptos da cadeia pesada humana expressos em estirpes XenoMouse II. A Figura 16 é uma análise do reportório de transcriptos da cadeia leve kapa humana expressos em estirpes XenoMouse II. A Figura 17 é outra representação da utilização diversa de genes VH e Vk humanos que foram observados como utilizados em estirpes XenoMouse II. A Figura 18 mostra os títulos da produção de anticorpos humanos em estirpes XenoMouse II. A Figura 19 é uma representação da utilização génica de anticorpos anti-IL-8 derivados de estirpes XenoMouselI. A Figura 20 mostra sequências de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpos anti-IL-8 derivados de estirpes

XenoMouse II. A Figura 21 mostra sequências de aminoácidos da cadeia leve kapa de anticorpos anti-IL-8 derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 22 mostra o bloqueio da ligação de IL-8 a neutrófilos humanos por anticorpos anti-IL-8 humana derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 23 mostra a inibição da expressão de CDllb em neutrófilos humanos por anticorpos anti-IL-8 humanos derivados de estirpes XenoMouse II. 15 A Figura 24 mostra a inibição do influxo de cálcio, induzido por IL-8, por anticorpos anti-IL-8 humana derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 25 mostra a inibição da quimiotaxis de IL-8 RB/293 por anticorpos anti-IL-8 humana derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 26 é um diagrama esquemático de um modelo de coelho de inflamação dérmica induzida por IL-8 humana. A Figura 27 mostra a inibição da inflamação dérmica induzida por IL-8 humana no modelo de coelho da Figura 26 com anticorpos anti-IL-8 humana derivado de estirpes XenoMouse II. A Figura 28 mostra a inibição da angiogénese de células endoteliais num modelo da bolsa corneana de ratos por anticorpos anti-IL-8 humana derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 29 é uma representação da utilização génica de anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 30 mostra sequências de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 31 mostra o bloqueio da ligação de EGF a células A431 por anticorpos anti-EGFR humano derivado de estirpes XenoMouse II. 16 A Figura 32 mostra a inibição da ligação de EGF a células SW948 por anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 33 mostra que anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II inibem o crescimento de células SW948 in vitro. A Figura 34 mostra a inibição da ligação de TNF-α a células U937 através da utilização de anticorpos anti-TNF-α humanos derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 35 mostra sequências de aminoácidos da cadeia leve kapa de anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Descreve-se aqui a criação e caracterização de diversas estirpes de murganhos contendo loci de Ig humana na escala de megabases, substancialmente em configuração de linha germinal. É proporcionada a primeira demonstração de reconstrução dos grandes e complexos loci de Ig humana em YAC e a introdução bem sucedida de YAC de escala de megabases em murganhos, para substituir funcionalmente os loci de murganho correspondentes.

Estirpes de Murganho

As seguintes estirpes de murganho sao aqui descritas e/ou utilizadas: 17

Estirpe Duplamente Inactivada (Dl): A estirpe Dl de murganhos são murganhos que não produzem Ig endógenas funcionais de murganho. De um modo preferido, os murganhos Dl possuem uma região JH de murganho inactivada e uma região Ck de murganho inactivada. A construção desta estirpe é discutida extensivamente noutras partes. Por exemplo, as técnicas utilizadas para a criação das estirpes Dl são descritas em detalhe no Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/466008 apresentado a 12 de Janeiro de 1990, 07/610515 apresentado a 8 de Novembro de 1990, 07/919297 apresentado a 24 de Julho de 1992, 08/031801 apresentado a 15 de Março de 1993, 08/112848 apresentado a 27 de Agosto de 1993, 08/234145 apresentado a 28 de Abril de 1994, 08/724752 apresentado a 2 de Outubro de 1996. Ver também Patente Europeia N° EP 0463151 Bl, concessão publicada a 12 de Junho de 1996, Pedido de Patente Internacional N° WO 94/02602, publicado a 3 de Fevereiro de 1994, Pedido de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicado a 31 de Outubro de 1996 e Pedido PCT N° PCT/US96/05928 apresentado a 29 de Abril de 1996. Foi observado e descrito que murganhos Dl possuem um desenvolvimento de células B muito imaturo. Os murganhos não produzem células B maduras, apenas pró-células B.

Estirpe de XenoMouse I: A concepção, construção e análise da estirpe XenoMouse I foi discutida em detalhe em Green et ai., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Esses murganhos produziam anticorpos IgMk contra um fundo Dl. Os murganhos mostraram função melhorada das células B quando comparados à estirpe Dl de murganhos que tinham pouco ou nenhum desenvolvimento das células B. Embora as estirpes XenoMouse I de murganhos fossem capazes de montar uma resposta imunitária comensurável à estimulação antigénica, pareciam ser ineficientes na sua produção de células B e possuíam uma resposta limitada a diferentes 18 antigénios que aparentemente estava relacionada com o seu reportório limitado do gene V.

Estirpe L6: A estirpe L6 é um murganho que produz anticorpos IgMk contra um fundo Dl de Ig endógena de murganhos. Os murganhos L6 contêm uma cadeia pesada humana introduzida e uma cadeia leve kapa humana introduzida. A estirpe L6 é criada através do cruzamento de um murganho contendo uma inserção da cadeia pesada contra um fundo duplamente inactivado (L6H) e um murganho que tem uma inserção da cadeia leve kapa contra um fundo duplamente inactivado (L6L). A inserção da cadeia pesada compreende uma inserção intacta de ADN humano de aproximadamente 9 70 kb de um YAC contendo aproximadamente 66 segmentos de VH, começando em VH6-1 e terminando em VH3-65 e incluindo os aglomerados principais do gene D (aproximadamente 32), genes JH (6), o intensificador intrónico (Em), Cp e ao longo de cerca de 25 kb após Cõ, em configuração de linha germinal. A inserção da cadeia leve compreende uma inserção intacta de ADN humano de aproximadamente 800 kb de um YAC que contém, aproximadamente, 32 genes VK, começando em Vk_B3 e terminando em Vk_0pn. A inserção de 800 kb contém uma delecção de, aproximadamente, 100 kb começando em Vk_Lpl3 e terminando em Vk_Lp5. Contudo, o ADN está numa configuração de linha germinal desde Vk_Lpl3 até 100 kb após vk-oP^i e contém também os genes Jk, os intensificadores intrónico e 3', o gene Ck constante e Kde. Foi demonstrado que os murganhos L6H e L6L acedem ao espectro total dos genes variáveis incorporados no seu genoma. É esperado que os murganhos L6 acedam, de modo semelhante, ao espectro total dos genes variáveis no seu genoma. Além disso, os murganhos L6 apresentarão expressão predominante da cadeia leve kapa humana, uma população grande de células B maduras e níveis normais de anticorpos IgMk humanos. Esses murganhos montarão uma resposta 19 vigorosa de anticorpos humanos a imunogénios múltiplos, produzindo em última análise Mab totalmente humanos específicos de antigénio com afinidades subnanomolares.

Estirpe XenoMouse lia: Os murganhos XenoMouse lia representam a segunda geração de estirpes XenoMouse™, da requerente, equipadas com loci de Ig humana de escala de megabases em configuração de linha germinal, contra um fundo Dl, de modo gue os murganhos não produzam Ig endógena funcional. Essencialmente, os murganhos são eguivalentes em construção à estirpe L6, mas incluem, adicionalmente, o gene γ2 humano com as suas seguências de comutação e regulação inteiras e o intensificador 3' de murganho em cis. Os murganhos contêm loci da cadeia pesada de, aproximadamente, 1020 kb e da leve kapa de aproximadamente 800 kb, reconstruídos em YAC, os quais incluem a maioria dos genes das regiões variáveis humanas, incluindo genes da cadeia pesada (aproximadamente 66 VH) e genes da cadeia leve kapa (aproximadamente 32 Vk) , genes da região constante pesada humana (μ, δ e γ) e genes da região constante kapa (Ck) e todos os principais elementos reguladores identificados. Foi demonstrado que estes murganhos acedem ao espectro total dos genes variáveis incorporados no seu genoma. Além disso, apresentam eficiente comutação de classe e hipermutação somática, expressão predominante da cadeia leve kapa humana, uma população grande de células B maduras e níveis normais de anticorpos IgMk IgGk humanos. Esses murganhos montam uma resposta vigorosa de anticorpos humanos a imunogénios múltiplos, incluindo IL-8 humana, receptor de EGF humano (EGFR) e factor-a de necrose tumoral humano (TNF-α), produzindo em última análise Mab totalmente humanos, específicos de antigénio, com afinidades subnanomolares. Este último resultado demonstra conclusivamente XenoMouse™ como uma fonte excelente para o isolamento rápido de 20

Mab terapêuticos totalmente humanos, de elevada afinidade contra um vasto espectro de antigénios com qualquer especificidade desejada.

Como será entendido da introdução acima, a estirpe XenoMouse II parece passar por desenvolvimento de células B maduras e montar poderosas respostas imunitárias de tipo humano adulto a estímulos antigénicos. A estirpe L6, como previsto dos dados em relação aos murganhos L6L e L6H, parece também passar por desenvolvimento de células B maduras e montar poderosas respostas imunitárias de tipo humano adulto a estímulos antigénicos. Quando murganhos Dl são comparados com estirpes XenoMouse I e estirpes Dl e XenoMouse I são comparadas com estirpes L6 e XenoMouse II, é observado um perfil acentuadamente diferente de desenvolvimento de células B. Devido a esta diferença, parece que a quantidade e/ou qualidade das sequências da região variável introduzidas nos animais são essenciais à indução da maturação e desenvolvimento das células B e à criação de uma resposta imunitária de tipo humano adulto. Assim, além da utilização clara das estirpes na criação de anticorpos humanos, as estirpes proporcionam uma ferramenta valiosa para estudar a natureza dos anticorpos humanos na resposta imunitária normal, assim como na resposta anómala, característica da doença auto-imunitária e outros distúrbios.

Região Variável - Diversidade Quantitativa É previsto que a especificidade dos anticorpos (i. e., a capacidade para criar anticorpos para um vasto espectro de antigénios e, de facto, para um vasto espectro de epitopos independentes aí presentes) seja dependente dos genes da região 21 variável no genoma da cadeia pesada (VH) e na cadeia leve kapa (Vk) . 0 genoma da cadeia pesada humana inclui, aproximadamente, 95 genes funcionais que codificam regiões variáveis da cadeia pesada humana de moléculas de imunoglobulina. Além disso, o genoma da cadeia leve humana inclui, aproximadamente, 40 genes na sua extremidade proximal que codificam regiões variáveis da cadeia leve kapa humana de moléculas de imunoglobulina. A requerente demonstrou que a especificidade dos anticorpos pode ser aumentada através da inclusão de uma pluralidade de genes que codificam cadeias variáveis leves e pesadas. São descritos murganhos transgénicos que têm uma porção substancial do locus de Ig humana, de um modo preferido, incluindo um locus da cadeia pesada humana e um locus da cadeia leve kapa humana. Deste modo, são utilizados, de um modo preferido, mais de 10% dos genes VH e Vk humanos. De um modo mais preferido, são utilizados mais do que cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou, ainda, 70% ou mais, de genes VH e VK. Numa forma de realização preferida, são utilizadas construções incluindo 32 genes na região proximal do genoma da cadeia leve VK e 66 genes na porção VH do genoma. Como será entendido, os genes podem ser incluídos sequencialmente, i. e., na ordem encontrada no genoma humano ou fora de sequência, i. e., numa ordem diferente daquela encontrada no genoma humano ou numa sua combinação. Assim, a título de exemplo, pode ser utilizada uma porção totalmente sequencial do genoma de VH ou VK, ou podem ser omitidos vários genes V no genoma de VH ou VK enquanto se mantém um arranjo sequencial global ou podem ser reordenados os genes V dentro do genoma de VH ou Vk e semelhantes. De um modo preferido, a totalidade do locus introduzido é proporcionada em configuração substancialmente de linha germinal como encontrada nos humanos. Em todo o caso, é esperado, e os resultados aqui 22 descritos demonstram que a inclusão de uma disposição diversa de genes do genoma de VH e Vk conduz a especificidade aumentada do anticorpo e, em último caso, a afinidades aumentadas do anticorpo.

Além disso, de um modo preferido, esses murganhos incluem a região DH inteira, a região JH inteira, a região constante mu humana e o podem, adicionalmente, ser equipados com outras regiões constantes humanas para a codificação e criação de isotipos adicionais de anticorpos. Esses isotipos podem incluir genes que codificam γι, γ2, γ3, γ4, α, ε e δ e outros genes que codificam a região constante com sequências de comutação e regulação apropriadas. Como será entendido e como discutido mais detalhadamente abaixo, uma variedade de sequências de comutação e regulação podem ser utilizadas, apropriadamente, em relação com qualquer selecção de região constante particular. A seguinte Tabela indica a diversidade das combinações de anticorpo que são possíveis em humanos com base estritamente em junção aleatória de V-D-J e combinação com cadeias leves kapa, sem consideração de eventos de N-adição ou mutação somática. Com base nestas considerações, existem mais de 3,8 milhões de combinações de anticorpo possíveis em humanos, de qualquer isotipo particular. 23

TABELA I

Região Cadeia Pesada Cadeia Leve Kapa Variável "V" -95 40 Diversidade "D" >32 - Junção "J" 6 5 Combinações (VxDxJ) 18.240 200 Total de Combinações (Combinações CP x Combinações 3,65 x 106 CL)

Através da inclusão de cerca de 66 genes VH e 32 genes VK num murganho com um complemento completo de genes DH, Jh e Jk, a diversidade possível da produção de anticorpo é na ordem de 2, 03 x 106 anticorpos diferentes. Como antes, esse cálculo não considera eventos de N-adição ou mutação somática. Deste modo, deve ser entendido que murganhos aqui descritos, tais como as estirpes L6 e XenoMouse II, oferecem diversidade de anticorpo substancial. De um modo preferido, os murganhos são concebidos para terem a capacidade de produzirem mais de 1 x 106 diferentes combinações V-D-J da cadeia pesada e combinações V-J da cadeia leve kapa, sem se considerarem os eventos de N-adições ou mutação somática.

Região Variável - Diversidade Qualitativa

Além da diversidade quantitativa, a selecção quantitativa de genes V (i. e., números grandes e diversos de genes V) e/ou a selecção qualitativa de genes V (i. e., selecção de genes V 24 particulares) parecem desempenhar um papel no que é aqui referido como "diversidade qualitativa." A diversidade qualitativa, como aqui utilizado, refere-se à diversidade de rearranjos V-D-J em que são introduzidos eventos de diversidade de junção e/ou mutação somática. Durante o rearranjo da cadeia pesada, determinadas enzimas (RAG-1, RAG-2 e, possivelmente, outras) são responsáveis pelo corte do ADN que representa as regiões codificantes dos genes do anticorpo. A actividade da terminal desoxinucleotidilo transferase (Tdt) é regulada positivamente, a qual é responsável por adições N-terminal de nucleótidos entre os segmentos génicos V-D e D-J. Enzimas semelhantes e outras (SCID e outras enzimas de reparação de ADN) são responsáveis pela delecção que ocorre nas junções destes segmentos codificantes. Relativamente à diversidade de junção, tanto os eventos de N-adição como de formação da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) estão incluídos dentro deste termo. Como será entendido, a CDR3 está localizada através da região D e inclui os eventos de junção V-D e D-J. Assim, as N-adições e as delecções durante o rearranjo D-J e o rearranjo V-D são responsáveis pela diversidade de CDR3.

Foi demonstrado que existem determinadas diferenças entre as diversidades de junção de murino e humanas. Em particular, alguns investigadores descreveram que os comprimentos de N-adição e os comprimentos de CDR3 de murino são geralmente mais curtos que os comprimentos de N-adição e os comprimentos de CDR3 típicos humanos. Esses grupos descreveram que, em humanos, são, tipicamente, observadas em média N-adições de cerca de 7,7 bases de comprimento. Yamada et al., (1991). As N-adições de tipo murganho são mais frequentemente em média na ordem de cerca de 3 bases de comprimento. Feeney et al. (1990) . De modo semelhante, os comprimentos de CDR3 de tipo humano são mais 25 longos que os CDR3 de tipo murganho. No homem, são comuns comprimentos de CDR3 entre de 2 e 25 resíduos, com uma média de 14 resíduos. Em murganhos, alguns grupos descreveram comprimentos de CDR3 médios mais curtos. A diversidade de junção criada pelas N-adições e adições de CDR3 desempenham um papel claro no desenvolvimento de especificidade de anticorpo. São descritas sequências génicas V-D-j rearranjadas que mostram comprimentos de N-adição que são comparáveis aos comprimentos de N-adição de humanos adultos previstos. Além disso, as sequências de aminoácidos através da grelha de leitura aberta (ORF) que corresponde às sequências de CDR3 mostram comprimentos de CDR3 que são comparáveis aos comprimentos de CDR3 de humanos adultos previstos. Esses dados são indicativos de que a diversidade quantitativa da região variável e/ou a diversidade qualitativa da região variável resulta na diversidade de junção de tipo humana. É esperado que essa diversidade de junção conduza a uma especificidade de anticorpo mais de tipo humano.

Região Variável - Afinidades

Embora a requerente não tenha demonstrado conclusivamente uma ligação causal directa entre a inclusão aumentada de região variável e a especificidade de anticorpo, parece, e é esperado, que através da provisão de tal diversidade, a capacidade do murganho para montar uma resposta imunitária para uma vasta gama de antigénios seja possível e aumentada. Adicionalmente, esses murganhos parecem mais equipados para montar respostas 26 imunitárias para uma vasta gama de epitopos em antigénios ou imunogénios individuais. Dos dados da requerente parece também que os anticorpos produzidos de acordo com a presente invenção possuem afinidades aumentadas. Esses dados incluem comparações entre murganhos aqui descritos e as estirpes XenoMouse I, assim como consideração dos resultados publicados da GenPharm International e MRC. Em relação às estirpes XenoMouse I, como acima mencionado, esses murganhos possuíam produção ineficiente de células B e uma resposta limitada a diferentes antigénios. Esse resultado pareceu relacionado, em parte, com o reportório limitado do gene V. De modo semelhante, os resultados descritos pela GenPharm International e MRC indicam uma resposta limitada a antigénios diversos.

Sem se desejar estar limitado por qualquer teoria ou modo de operação particular da invenção, poderá parecer que afinidades aumentadas pareciam resultar da provisão do número grande de regiões V. Dos dados da requerente, a provisão de números maiores e/ou a selecção de qualidades das sequências do gene V, aumenta a diversidade de junção (N-adições e diversidade de formação da região determinante de complementaridade 3 ("CDR3")) que é típica de uma resposta imunitária de tipo humano adulto e que desempenha um papel substancial na maturação da afinidade dos anticorpos. Também pode ser que esses anticorpos são mais eficazes e eficientes em eventos de mutação somática que conduzem a afinidades aumentadas. Cada dos eventos de diversidade de junção e de mutação somática é discutido em detalhe adicional abaixo.

Relativamente às afinidades, as velocidades e constantes de afinidade de anticorpo derivadas da utilização de genes VH e Vk plurais (i. e., a utilização de 32 genes na região proximal do 27 genoma da cadeia leve VK e 66 genes na porção VH do genoma) resultam em velocidades de associação (ka em M_1S_1) maiores do que cerca de 0,50 x 106, de um modo preferido, maior que 2, 00 x 106 e, de um modo mais preferido, maior do que cerca de 4.00 x 106; velocidades de dissociação (kd em S-1) menores do que cerca de 1,00 x 10-4, de um modo preferido, menor do que cerca de 2.00 x 10-4 e, de um modo mais preferido, menor do que cerca de 4.00 x 10”4; e constante de dissociação (em M) menor do que cerca de 1,00 x 10-10, de um modo preferido, menor do que cerca de 2.00 x 10-10 e, de um modo mais preferido, menor do que cerca de 4.00 x 10-10.

De um modo preferido, esses murganhos não produzem, adicionalmente, imunoglobulinas endógenas funcionais. Isto é conseguido, e. g., através da inactivação (ou interrupção) de loci da cadeia pesada e leve endógena. Por exemplo, a região J da cadeia pesada de murganho e a região J da cadeia leve kapa de murganho e a região Ck são inactivadas através da utilização de vectores de recombinação homóloga que substituem ou removem a região.

Região Variável - Desenvolvimento de Células B O desenvolvimento de células B é revisto em Klaus B Lymphocytes (IRL Press (1990)) e Capítulos 1-3 de Inmunoglobulin Genes (Academic Press Ltd. (1989). De forma geral, em mamíferos, o desenvolvimento de células sanguíneas, incluindo linfócitos de células B e T, tem origem a partir de uma célula estaminal pluripotente comum. Os linfócitos, depois, evoluem de uma célula progenitora linfóide comum. Após um período gestacional inicial, 28 a iniciação da células B desloca-se do fígado para e medula óssea onde permanece ao longo da vida do mamífero.

No ciclo de vida de uma célula B, a primeira célula geralmente reconhecida é uma pro-pré-célula B que é encontrada na medula óssea. Uma tal célula começou o rearranjo V-D-J da cadeia pesada, mas ainda não produz a proteína. A célula depois evolui para uma pré-célula B I grande, de divisão rápida que é uma célula μ” citoplasmática. Esta pré-célula B I pára então de se dividir, encolhe e sofre rearranjo V-J da cadeia leve tornando-se uma pré-célula B II que expressa IgM de superfície, a qual deixa a medula como célula B imatura. A maioria das células B imaturas emergentes continua a desenvolver e a produzir IgD de superfície, indicativo da sua conclusão de diferenciação e desenvolvimento como células B periféricas imunocompetentes, totalmente maduras, as quais residem, principalmente, no baço. Contudo, é possível de eliminar a região constante delta e, ainda, obter células imunocompetentes. 0 desenvolvimento e diferenciação da célula B pode ser monitorizado e/ou seguido através da utilização de marcadores de superfície. Por exemplo, o antigénio B220 é expresso em abundância relativa em células B maduras em comparação com pré-células B I ou II. Assim, as células que são B22CT e IgNT de superfície (μ“) podem ser utilizadas para determinar a presença de células B maduras. Adicionalmente, as células podem ser rastreadas para a expressão de IgD de superfície (δ-). Outro antigénio, o antigénio termoestável, é expresso por pré-células B II à medida que transitam para a periferia (i. e., à medida que se tornam μ~ e/ou μ”, δ“) . 29

TABELA II

Medula Óssea Baço Marcador pró-pré- pré- Pré-célula B célula B célula B célula B célula II célula B imatura madura B I emergente B220 - - ± + ++ HSA - - + + - μ - - + + + δ* — — — — + * Assumindo a presença de uma cópia funcional do gene Cõ no transgene.

Através da utilização de marcadores de células B, tal como aqueles mencionados acima, o desenvolvimento e diferenciação da célula B pode ser monitorizado e avaliado. A requerente demonstrou previamente que murganhos Dl (murganhos que não sofrem rearranjo V-D-J da cadeia pesada ou rearranjo V-J da cadeia leve) não produzem células B maduras. De facto, esses murganhos param na produção de pro-pré-células B e as células B nunca se movem da medula óssea para tecidos periféricos, incluindo o baço. Assim, o desenvolvimento de células B e a produção de anticorpos são totalmente parados. 0 mesmo resultado é observado em murganhos que são inactivados apenas na cadeia pesada; o desenvolvimento e diferenciação de células B para na medula óssea. A estirpe XenoMouse I, da requerente, produziu células B um tanto maduras, funcionais. Contudo, o número de células B na 30 medula óssea e em tecidos periféricos, foi reduzido significativamente em relação aos murganhos de tipo selvagem.

Em contraste, as estirpes XenoMouse II e estirpes L6 da requerente possuem inesperadamente quase completa reconstituição de células B. Deste modo, a requerente demonstrou que através de inclusão quantitativa ou inclusão qualitativa de genes de regiões variáveis, a diferenciação e desenvolvimento de células B pode ser muito reconstituída. A reconstituição da diferenciação e desenvolvimento de células B é indicativo de reconstituição do sistema imunitário. Em geral, a reconstituição de células B é comparada com controlos de tipo selvagem. Assim, de um modo preferido, as populações de murganhos que introduziram regiões variáveis humanas possuem mais do que cerca de 50% da função das células B quando comparadas a populações de murganhos de tipo selvagem.

Além disso, é interessante assinalar que a produção de anticorpos humanos, preferência a anticorpos de murganho é substancialmente elevada em murganhos que têm um fundo de inactivação de Ig endógena. Isso para dizer que os murganhos que contêm um locus de Ig humana e um locus de Ig da cadeia pesada endógena funcionalmente inactivado produzem, anticorpos humanos numa taxa de, aproximadamente, 100 a 1000 vezes tão eficientemente quanto murganhos que apenas contêm um locus de Ig humana e não estão inactivados para o locus endógeno.

Comutação de Isotipo

Como é aqui discutido em detalhe, como esperado, os murganhos XenoMouse II sofrem comutação eficiente e eficaz de 31 isotipo a partir do isotipo mu codificado pelo transgene humano para o isotipo gama-2 codificado pelo transgene. A reguerente desenvolveu também as estirpes XenoMouse II que contêm e codificam a região constante gama-4 humana. Como acima mencionado, os murganhos aqui descritos podem adicionalmente ser equipados com outras regiões constantes humanas para a criação de isotipos adicionais. Esses isotipos podem incluir genes que codificam γι, γ2, Y3, Y4, α, ε, δ e outros genes que codificam a região constante. Podem ser incluídas regiões constantes alternativas no mesmo transgene, i. e., a jusante da região constante mu humana ou, alternativamente, essas outras regiões constantes podem ser incluídas noutro cromossoma. Deve ser entendido que nos casos em que essas outras regiões constantes são incluídas no mesmo cromossoma, como o cromossoma incluir o transgene que codifica a região constante mu humana, pode ser realizada permutação cis para o outro isotipo ou isotipos. Por outro lado, nos casos em que essa outra região constante é incluída num cromossoma diferente do cromossoma contendo o transgene que codifica a região constante mu humana, pode ser realizada permutação trans para o outro isotipo ou isotipos. Esse arranjo permite grande flexibilidade na concepção e construção de murganhos para a criação de anticorpos para uma vasta gama de antigénios.

Deve ser entendido que as regiões constantes reconhecem sequências de comutação e regulação a que estão associadas. Todos os genes da região constante humana e de murino foram sequenciadas e publicadas até 1989. Ver Honjo et al., "Constant Region Genes of the Immunoglobulin Heavy Chain and the Molecular Mechanism of Class Switching" em Immunoglobulin Genes (Honjo et al., eds., Academic Press (1989)). Por exemplo, no Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/574748, a clonagem da região 32 constante gama-1 humana foi prevista com base em informação de sequência conhecida da técnica anterior. Foi exposto que no gene não arranjado, não permutado, a região de comutação inteira foi incluída numa sequência que começa a menos de 5 kb da extremidade 5' do exão constante da primeira γ-l. Deste modo, a região de comutação foi também incluída no fragmento 5' HindIII de 5,3 kb que foi divulgado em Ellison et al. Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982). De modo semelhante, Takahashi et al., Cell 29:671-679 (1982) também descreveu que o fragmento divulgado em Ellison continha a sequência de comutação e este fragmento conjuntamente com o fragmento HindIII a BamHI de 7, 7 kb deve incluir todas as sequências necessárias para a construção do transgene de comutação de isotipo da cadeia pesada.

Assim, deve ser entendido que qualquer região constante humana de escolha pode ser prontamente incorporada em murganhos, aqui descritos, sem experimentação desnecessária. Essas regiões constantes podem ser associadas com as suas sequências de comutação nativas (i. e., uma região constante γι, 2, 3 ou 4 humana com um comutador γι, 2, 3 ou 4 humano, respectivamente) ou podem ser associadas com outras sequências de comutação (i. e., uma região constante γ4 humana com um comutador y2 humano). Podem também ser utilizadas várias sequências de intensificador 3', tais como de murganho, humano ou rato, para referir apenas algumas. De modo semelhante, podem também ser incluídas sequências reguladoras.

Como uma alternativa e/ou, adicionalmente à, comutação de isotipo in vivo, as células B podem ser rastreadas para a secreção de anticorpos "quiméricos". Por exemplo, os murganhos L6, além de produzirem anticorpos IgM totalmente humanos, produzem anticorpos que têm regiões V, D, J da cadeia pesada totalmente humanas acopladas às regiões constantes de murganho, 33 tal como uma variedade de gamas (i. e., IgGl, 2, 3, 4 de murganho) e semelhantes. Esses anticorpos são altamente úteis por direito próprio. Por exemplo, as regiões constantes humanas podem ser incluídas nos anticorpos através de técnicas de comutação de isotipo in vitro, bem conhecidas na matéria. Alternativamente, e/ou adicionalmente, podem ser preparados fragmentos (i. e., fragmentos F(ab) e F(ab')2) desses anticorpos que contêm poucas ou nenhumas regiões constantes de murganho.

Como acima discutido, o factor mais crítico para a produção de anticorpos é a especificidade para um antigénio ou epitopo desejado no antigénio. A classe do anticorpo, posteriormente, torna-se importante de acordo com a necessidade terapêutica. Por outras palavras, será o índice terapêutico de um anticorpo aumentado por provisão de um isotipo ou classe particular? A consideração dessa pergunta levanta questões de fixação do complemento e semelhantes, as quais conduzem depois a selecção da classe ou isotipo particular de anticorpo. As regiões constantes gama ajudam na maturação da afinidade de anticorpos. Contudo, a inclusão de uma região constante gama humana num transgene não é requerida para atingir essa maturação. Em vez disso, o processo parece prosseguir também relativamente a regiões constantes gama de murganho que são trans-comutadas para o transgene codificado por mu.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os seguintes Materiais e Métodos foram utilizados, relativamente à criação e caracterização de murganhos, aqui descritos. Esses Materiais e Métodos pretendem ser ilustrativos. 34

Clonagem de YAC derivados de Ig Humana: As bibliotecas humanas-YAC da Washington University (Brownstein et al., 1989) e da CEPH (Abertsen et al., 1990) foram rastreadas para YAC contendo sequências dos loci humanos da cadeia pesada e leve kapa como previamente descrito (Mendez et al. 1995). A clonagem e caracterização dos YAC 1H e 1K foi descrita por Mendez et al., (1995). Os YAC 3H e 4H foram identificados a partir da biblioteca da Washington University utilizando uma sonda Vh3 (0,55 kb Pstl/Ncol, Berman et al., 1988) . O YAC 17H foi clonado a partir da biblioteca YAC GM1416 e determinou-a conter 130 kb de sequências variáveis da cadeia pesada e uma região quimérica de 150 kb na sua extremidade 3' Matsuda et al., 1993. Os YAC 2K e 3K foram recuperados a partir da biblioteca CHEF utilizando um iniciador específico de VkII (Albertsen et al., 1990).

Direccionamento de YAC e recombinação: Foram utilizados métodos convencionais para crescimento de leveduras, cruzamentos, esporulação e teste de fenótipo (Sherman et al., 1986) . O direccionamento de YAC e de braços do vector YAC com marcadores de selecção de levedura e mamíferos, para facilitar o rastreio de recombinantes YAC em levedura da integração de YAC em células, foi realizada por transformação com acetato de lítio (Scheistl e Geitz (1989). Após cada passo de direccionamento e recombinação, o(s) YAC modificado(s) foi (foram) analisado(s) por electroforese de campo pulsado e Transferência de Southern convencional para determinar a integridade de todas as sequências.

Os vectores de direccionamento de YAC foram utilizados para a interconversão de braços centricos e acentricos para reorientar 17H e para readaptar o seu braço 5' com os genes LEU2 e URA3 e o seu braço 3' com o gene HIS3. Ver Fig. la e Mendez 35 et al., 1993. 0 braço 4H centrico foi readaptado com o gene ADE2 de levedura e os marcadores de selecção HPRT humanos. Para o primeiro passo de recombinação, uma estirpe diplóide de levedura foi criada e seleccionada em que todos os três YAC, 17H, 3H e 4H, estavam presentes, intactos e estavelmente mantidos. Uma recombinação homóloga de três vias entre as regiões de sobreposição de YAC foi induzida por esporulação e o recombinante desejado foi encontrado através da selecção dos marcadores de selecção da levedura externos (ADE2 e HIS3) e selecção negativa (perda) do marcador URA3 interno. A recombinação bem sucedida criou um YAC de 880 kb contendo 80% da região variável de IgH, começando em VH2-5 e estendendo-se 20 kb no sentido 5' do gene VH3-65. Para a recombinação do YAC de 880 kb para 1H, ο 1H foi readaptado com plCL, o qual adiciona o gene LYS2 no braço centrico (Hermanson et al., 1991). Utilizando-se cruzamento convencional de leveduras, foi seleccionada um estirpe diplóide contendo 1H e o YAC de 880 kb. Após esporulação e através da utilização de homologia de sobreposição, foi realizada a recombinação YAC-levedura. Com selecção positiva para os marcadores externos de levedura (ADE2 e URA3) e rastreio para a perda de marcadores internos (TRP1, LYS2, HIS3), foi encontrado um YAC de 970 kb intacto consistindo de aproximadamente 66 segmentos de VH, começando em VH6-1 e terminando em VH3-65. O YAC também continha os principais aglomerados do gene D, genes JH, o intensificador intrónico (Εμ), Cp, até 25 kb após o Cõ, em configuração de linha germinal. Este YAC de 970 kb foi depois readaptado com um vector de direccionamento incluindo um fragmento genómico EcoRI de 23 kb do gene γ-2 humano, incluindo os seus elementos de comutação e regulação, um fragmento Xbal de 7 kb do intensif icador 3' da cadeia pesada de murino, o gene da neomicina accionado pelo promotor da metalotionina (MMTNeo) e o gene LYS2 de levedura. 36

Este vector, ao trazer estas sequências no braço 3' de YAC, interrompe o gene URA3.

Como um primeiro passo para criar o YAC yK2, através de cruzamento de leveduras convencional, foi seleccionada uma estirpe diplóide de levedura, na qual os YAC 1K e 3K readaptados estavam ambos presentes, intactos e mantidos estavelmente. Utilizando o mesmo processo como descrito em relação à construção de IgH, foi realizada a recombinação YAC-levedura. Através da utilização de selecção positiva para os marcadores externos de levedura (LYS2, TRIP1) e rastreio para a perda de marcadores internos (URA3, TRP1), foi encontrado um produto recombinante intacto de 800 kb que continha 32 Vk, começando em VK-b3 e terminando em Vk-opii· O YAC de 800 kb contém uma delecção de, aproximadamente, 100 kb, começando em Vk_Lp-i3 e terminando em Vk-LP-5. Contudo, o YAC está em configuração de linha germinal de Vk-Lp-i3 até 100 kb após Vk_0p-i. O YAC também contém Jk, os intensificadors 3' e intrónico, o Ck constante e Kde.

Introdução de YAC em células ES e murganhos: Esferoplastos de levedura contendo YAC foram fundidos com células ES E14.TG3B1 como descrito (Jakobovits et al., 1993a; Green et al., 1994). As colónias resistentes a HAT foram expandidas para análise. A integridade de YAC foi avaliada por análise de Transferência de Southern utilizando protocolos e sondas descritos em Berman et al., (1988) e Mendez et al., (1994) e condições de hibridação como descritas por Gemmil et al., (1991). Os murganhos quiméricos foram criados por microinjecção de células ES em blastocistos C57BL/6. A prole contendo YAC foi identificada através de análise por PCR do ADN da cauda, como descrito (Green et al., 1994) . A integridade de YAC foi avaliada por análise de Transferência de Southern utilizando sondas e condições 37 previamente descritas, excepto que a transferência sondada com Vh3 humano foi lavada a 50 °C.

Análise de citometria de fluxo: Os linfócitos de sangue periférico e baço obtidos de XenoMice e murganhos de controlo com 8-10 semanas de idade foram purificados em Lympholyte M (Accurate) e tratados com o receptor Fc CD32/CD16 anti-murganho purificado (Pharmingen, 01241D) para bloquear a ligação não especifica a receptores Fc, corados com anticorpos e analisados num FACStarPLUS (Becton Dickinson, software CELLQuest). Anticorpos utilizados: anti-B220 com aloficocianina (APC) (Pharmingen, 01129A); IgM anti-humana com biotina (Pharmingen, 08072D); IgM anti-murganho com biotina (Pharmingen, 02202D); IgD anti-humana de F(ab')2 de cabra com isotiocianato de fluorosceina (FITC) (Southern Biotechnology, 2032-02); IgDa anti-murganho com FITC (Pharmingen, 05064D); Anti-mIgDb com FITC (Pharmingen, 05074D); λ anti-murganho com FITC (Pharmingen, 02174D); k anti-humana com PE (Pharmingen, 08175A); k anti-murganho com PE (Pharmingen, 02155A). Foi utilizado RED613™ com estreptavidina (GibcoBRL, 19541-010) para detectar anticorpos biotinilados.

Imunização e produção de hibridoma: Foram imunizados intraperitonealmente XenoMice (8 a 10 semanas de idade) com 25 g de IL-8 humana recombinante ou com 5 g de TNF-α (Biosource International) emulsionado em adjuvante completo de Freund para a imunização primária e em adjuvante incompleto de Freund para imunizações adicionais realizadas em intervalos de duas semanas. Para a imunização de EGFR foram imunizados intraperitonealmente XenoMice com 2 x 107 células A431 (ATCC CRL-7907) ressuspensas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Esta dose foi repetida três vezes. Quatro dias antes da fusão, os murganhos receberam uma injecção final de antigénio ou células em PBS. Os 38 linfócitos de baço e de nódulos linfáticos de murganhos imunizados foram fundidos com a linha NS0-bcl2 de mieloma não secretor (Ray e Diamond, 1994) e foram submetidos a selecção de HAT como previamente descrito (Galfre e Milstein, 1981).

Ensaio de ELISA: Os ELISA para determinação de anticorpos específicos de antigénio no soro de murganho e em sobrenadantes de hibridoma foram realizados como descrito (Coligan et al., 1994) utilizando IL-8 humana recombinante e TNF-α e EGFR purificado por afinidade a partir de células A431 (Sigma, E-3641) para capturar os anticorpos. A concentração de imunoglobulinas humanas e de murganho foi determinada utilizando os seguintes anticorpos de captação: IgG anti-humana de coelho (Southern Biotechnology, 6145-01), Igk anti-humana de cabra (Vector Laboratories, Ai-3060), IgM anti-humana de murganho (CGI/ATCC, HB-57), para Ig humana γ, k e μ, respectivamente, e IgG anti-murganho de cabra (Caltag, M 30100), Igk anti-murganho de cabra (Southern Biotechnology, 1050-01), IgM anti-murganho de cabra (Southern Biotechnology, 1020-01) e λ anti-murganho de cabra (Southern Biotechnology, 1060-01) para capturar Ig de murganho λ, k, μ, respectivamente. Os anticorpos de detecção utilizados em experiências de ELISA foram IgG-HRP anti-murganho de cabra (Caltag, M-30107), Igk-HRP anti-murganho de cabra (Caltag, M 33007), IgG2-HRP anti-humana de murganho (Southern Biotechnology, 9070-05), IgM-HRP anti-humana de murganho (Southern Biotechnology, 9020-05) e kapa-biotina anti-humana de cabra (Vector, BA-3060). Os padrões utilizados para a quantificação de Ig humana e de murganho foram: IgG2 humana (Calbiochem, 400122), igMk humana (Cappel, 13000), IgG2k humana (Calbiochem, 400122), igGK de murganho (Cappel 55939), IgMk de murganho (Sigma, M-3795) e IgG3À de murganho (Sigma, M-9019). 39

Determinação de constantes de afinidade de Mab totalmente humanos por BIAcore: A medição da afinidade de anticorpos monoclonais humanos purificados, fragmentos Fab ou sobrenadantes de hibridoma por ressonância de plasmão foi realizada utilizando o instrumento BIAcore 2000, utilizando processos gerais delineados pelos fabricantes. A análise cinética dos anticorpos foi realizada utilizando antigénios imobilizados sobre a superfície do sensor numa baixa densidade: IL-8 humana -81 RU, EGFR solúvel purificado de membranas de células A431 (Sigma, E-3641)- 303 RU e TNF-oí-107 RU (1000 RU correspondem a cerca de l ng/mm2 de proteína imobilizada). As velocidades de dissociação (kd) e associação (ka) foram determinadas utilizando o software proporcionado pelos fabricantes, BIAevaluation 2.1.

Medição de afinidade por radioimunoensaio: IL-8 humana marcada com 125I (1,5 x 10~n M ou 3 x 10-11 M) foi incubada com anticorpos humanos anti-IL-8 purificados a concentrações variáveis (5 x 1CT13 M a 4 x 10“9 M) em 200 pL de PBS com 0,5% de BSA. Após 15 horas de incubação à temperatura ambiente, foram adicionados 20 pL de Proteína A Sepharose CL-4B em PBS (1/1, v/v) para precipitar o complexo anticorpo-antigénio. Após 2 horas de incubação a 4 °C, o complexo anticorpo-125I-IL-8 ligado a Proteína A sepharose foi separado por filtração de 125I-IL-8 livre utilizando placas de filtração de 96 poços (Millipore, N° de Cat. MADVN65), recolhido em frasquinhos de cintilação e contado. A concentração de anticorpos ligados e livres foi calculada e a afinidade de ligação dos anticorpos ao antigénio específico foi obtida utilizando análise de Scatchart (2). 40

Ensaios de ligação de receptor: 0 ensaio de ligação de receptor IL-8 foi realizado com neutrófilos humanos preparados a partir de sangue acabado de tirar ou de crostas inflamatórias como descrito (Lusti-Marasimhan et al., 1995). As concentrações variáveis dos anticorpos foram incubadas com 0,23 nM de [125I] IL — 8 (Amersham, IM-249) durante 30 minutos a 4 °C em placas de filtração Multiscreen de 96 poços (Millipore, MADV N6550) pré-tratadas com tampão de ligação PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino e 0,02% de NaN3, a 25 °C, durante 2 horas. Foram adicionados 4 x 105 neutrófilos a cada poço e as placas foram incubadas durante 90 minutos a 4 °C. As células foram lavadas 5 vezes com 200 pL de PBS gelado, o qual foi removido por aspiração. Os filtros foram secos ao ar, adicionados a fluido de cintilação e contados num contador de cintilações. A percentagem de [125I] IL—8, especificamente, ligada foi calculada como a cpm média detectada na presença do anticorpo dividida pela cpm detectada na presença apenas de tampão.

Os ensaios de ligação para o receptor do TNF foram realizados de um modo semelhante aos ensaios de IL-8 acima descritos. Contudo, a linha do monócito humano U937 foi utilizada em vez da linha de neutrófilo utilizada em relação aos ensaios de IL-8. Os anticorpos foram pré-incubados com 0,25 nM de [125] TNF (Amersham, IM-206). Foram colocadas 6 x 105 células U937 em cada poço. O ensaio de ligação do receptor do EGF foi realizado com células A431 (0,4 x 106 células por poço) que foram incubadas com concentrações variáveis de anticorpos em tampão de ligação de PBS durante 30 minutos a 4 °C. Foi adicionado 0,1 nM de [125I]EGF (Amersham, IM-196) a cada poço e as placas foram incubadas, durante 90 minutos, a 4 °C. As placas foram lavadas cinco vezes, 41 secas ao ar e contadas num contador de cintilações. Foram utilizados anticorpos anti-EGFR de murganho 225 e 528 (Calbiochem) como controlos.

Análise do reportório de transcritos de Ig humana expressos em XenoMice e os seus Mab humanos derivados: Foi isolado ARNm Poli(A)- de baço e nódulos linfáticos de XenoMice imunizados e não imunizados utilizando um kit Fast-Track (Invitrogen). A preparação de ADNc de iniciação aleatória foi seguida por PCR. Foram utilizados iniciadores de região variável específicos da família de VH humano ou VK humano (Marks et al., 1991) ou um

iniciador universal de VH humano, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) conjuntamente com iniciadores específicos para as regiões constantes humanas Cp (hpP2) ou Ck (hkP2) como anteriormente descrito (Green et al., 1994) ou a região constante humana γ2 MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3'. Os iniciadores de PCR foram clonados em pCRII utilizando um kit de clonagem TA (Invitrogen) e ambas as cadeias foram sequenciadas utilizando kits de sequenciação Prism-dye-terminator e um sequenciador ABI 377. As sequências de transcritos humanos da cadeia kapa e pesada derivada de Mab foram obtidas por sequenciação directa de produtos de PCR produzidos de ARN poli(A“) utilizando os iniciadores descritos acima. Todas as sequências foram analisadas por alinhamentos com o "directório de sequência V BASE" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido) utilizando os programas de software MacVector e Geneworks.

Preparação e purificação de Fragmentos Fab de anticorpo: Os fragmentos Fab de anticorpo foram produzidos através da utilização de papaina imobilizada (Pierce). Os fragmentos Fab foram purificados com um esquema cromatográfico de dois passos: 42

Coluna HiTrap (Bio-Rad) Proteína A para capturar os fragmentos Fc e qualquer anticorpo não digerido, seguido por eluição dos fragmentos Fab retidos no escoamento de uma coluna de permuta catiónica forte (PerSeptive Biosystems), com um gradiente linear de sal até 0,5 M de NaCl. Os fragmentos Fab foram caracterizados por SDS-PAGE e MALDI-TOF MS sob condições redutoras e não redutoras, demonstrando o fragmento não reduzido de ~50 kDa e o dupleto reduzido de ~25 kD esperados. Este resultado demonstra a cadeia leve intacta e a cadeia pesada clivada. MS sob condições redutoras permitiu a identificação não ambígua de ambas as cadeias leve e pesada clivada, uma vez que a massa da cadeia leve pode ser determinada precisamente por redução de todo o anticorpo não digerido.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e resultados atingidos são proporcionados para fins ilustrativos.

Exemplo 1: Reconstrução de locl da cadeia pesada humana em

YAC A estratégia que se utilizou para reconstruir as regiões variáveis da cadeia pesada humana e cadeia leve kapa humana foi, primeiro, rastrear bibliotecas humanas-YAC para YAC que abraçam os loci de Ig humana grandes (na escala de megabases) e, segundo, recombinar YAC que abarcam essas regiões em YAC individuais contendo os loci desejados predominantemente em configuração de linha germinal. 43 acima, 0 esquema de recombinação de YAC progressiva, explorou a alta frequência de recombinação homóloga meiótico-induzida em levedura e a capacidade para seleccionar os recombinantes desejados pelos marcadores de levedura presentes nos braços do vector dos YAC recombinados {Ver Figura 1 e Green et al., supra., ver também Silverman et al., 1990 e denDunnen et al., 1992) .

Em relação à estratégia da requerente, identificaram-se quatro YAC, 1H (240 kb), 2H (270 kb), 3H (300 kb) e 4H (340 kb), os quais abarcam cerca de 830 kb, de cerca de 1000 kb, da região variável da cadeia pesada humana no cromossoma 14q. Os YAC 1H, 2H, 3H e 4H foram utilizados para reconstrução do locus (Ver Figura IA) . A Electroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) e a análise de Transferência de Southern confirmaram que os YAC estão intactos, em configuração de linha germinal, com a excepção de 150 kb na extremidade 3' do YAC 2H que continha determinadas sequências não IgH {Ver Figura 1; Matsuda et al., 1990) . O YAC 1H, o YAC que foi previamente introduzido no XenoMouse™ de primeira geração da requerente (Green et al., supra., Mendez et al., 1995), é compreendido das regiões Cõ, Cp, JH e Dh dos primeiros 5 genes VH em configuração de linha germinal. Os outros três YAC cobrem a maioria da região VH, de VH2-5 até VH3-65, contribuindo assim, aproximadamente, com 61

genes VH adicionais diferentes. Antes da recombinação, o YAC 4H foi readaptado com um marcador de selecção HPRT. Através da utilização das sequências de sobreposição contidas nos YAC, os quatro YAC (1H, 2H, 3H e 4H) foram recombinados em levedura através de uma estratégia de recombinação progressiva {Ver Figura IA) . Essa estratégia de recombinação gerou um YAC recombinante de 980 kb {Ver Figura 1). Análise do YAC por PFGE e análise de transferência de Southern confirmou a presença do 44 locus da cadeia pesada humana da região Cõ até 2 0 kb no sentido 5' do gene VH3-65 em configuração de linha germinal. Não foram observadas delecções ou rearranjos aparentes. O braço acentrico de YAC foi direccionado com um vector contendo a região constante γ2 completa humana, o intensificador 3' de murganho e o gene de resistência à neomicina, para produzir o YAC da cadeia pesada final de 1020 kb, yH2. O YAC yH2 continha a maioria da região variável humana, i. e., 66 dos 82 genes VH, DH completo (32 genes) e regiões JH (6 genes) e três regiões constantes diferentes (Cp, Cõ e Cy) com as suas sequências reguladores correspondentes (Ver Figura IA) . Isto foi a construção da cadeia pesada utilizada para a produção das estirpes XenoMouse II da requerente.

Exemplo 2: Reconstrução de loci da cadeia leve kapa humana em YAC

Foi utilizada uma estratégia semelhante de recombinação progressiva para reconstrução do locus da cadeia leve kapa humana. Foram identificados três YAC que abarcam os loci da kapa humana. Os YAC foram designados 1K, 2K e 3K. O YAC 1K, o qual tinha um comprimento de, aproximadamente, 180 kb, tinha sido previamente introduzido no XenoMouse™ de primeira geração da requerente. Esse YAC continha o elemento de delecção de kapa (Kde), os intensificadores kapa 3' e intrónico, Ck, Jk e os três genes VK no aglomerado B (Green et al., 1994; Mendez et al., 1995) . O YAC 2K (aproximadamente 480 kb) e 3K (aproximadamente 380 kb) abrangem conjuntamente a maioria da região variável proximal da cadeia kapa no cromossoma 2p. Um delecção de, aproximadamente, 100 kb abarca a região L13-15 (Fig. 1B; Huber 45 et al., 1993). Visto que a região distai kapa duplica a região proximal e como os genes VK proximais são aqueles mais geralmente utilizados em humanos (Weichold et al., 1993; Cox et al., 1994), a região proximal foi o foco da estratégia de reconstrução da requerente (Fig. 1B) . Através de recombinação homóloga dos três YAC, foi recuperado um YAC recombinante de 800 kb, yK2. O tamanho e integridade do YAC recombinante foram confirmados por PFGE e análise de transferência de Southern. Essa análise demonstrou que cobria a parte proximal do locus da cadeia kapa humana, com 32 genes VK em configuração de linha germinal à excepção da delecção descrita na região Lp (Fig. 1B) . Os braços centrico e acentrico de yK2 foram modificados para conter os marcadores de selecção HPRT e neomicina, respectivamente, como descrito (Materiais e Métodos). Isto foi a construção da cadeia leve kapa utilizada para a produção das estirpes XenoMouse II da requerente.

Os YAC aqui descritos, yH2 e yK2, representam os primeiros loc de Ig humana reconstruídos à escala de megabases a conterem a maioria do reportório de anticorpo humano, predominantemente em configuração de linha germinal. Esta realização confirmou adicionalmente a recombinação homóloga em levedura como uma abordagem poderosa para reconstrução bem sucedida de loci grandes, complexos e instáveis. A selecção de recombinantes YAC estáveis contendo porções grandes dos loci Ig em levedura proporcionou fragmentos de Ig humana requeridos para equipar os murganhos com o reportório de anticorpo humano, regiões constantes e elementos reguladores necessários para reproduzir a resposta de anticorpo humano em murganhos. 46

Exemplo 3: Introdução de YAC yH2 e yK2 em células ES

De acordo com a estratégia da requerente, introduziu-se os YAC, yH2 e yK2, em células estaminais embrionárias (ES) de murganho. Uma vez isoladas as células ES contendo o ADN de YAC, essas células ES foram utilizadas para a criação de murganhos através de reprodução apropriada.

Deste modo, foram introduzidos, nesta experiência, os YAC yH2 e yK2 em células ES através de fusão de esf eroplastos de levedura contendo YAC com células ES de murganho deficientes em HPRT E14.TG3B1 como previamente descrito (Jakobovits et al., 199á; Green et al., 1994). Os clones de células ES HPRT-positivas foram seleccionados a uma frequência de 1 clone/15-20 x 106 células fundidas e foram analisados para a integridade de YAC através de Análises de transferência de Southern e CHEF (Figs. 2A-2E).

Verificou-se que sete dos trinta e cinco clones de células ES (referidos como LIO, J9.2, L17, L18, J17, L22, L23) derivados da fusão de células ES com leveduras contendo yH2, continham todos os fragmentos EcoRI BamHI de yH2 esperados detectados por sondas que abarcam a inserção inteira: intensificador 3' de murganho, intensificador intrónico humano, regiões constantes humanas CY2, Cõ e Cp, DH, JH e todas as diferentes famílias de VH: VH1, Vh2, Vh3, Vh4, Vh5 e VH6 (dados mostrados para 5 clones na Figs. 2A-2E) . A análise de CHEF confirmou, ainda, que estes clones, os quais representam 20% de todos os clones analisados, continham o YAC yH2 intacto inteiro sem delecções ou rearranjos aparentes (dados não mostrados).

Os clones de células ES derivados da fusão de leveduras contendo yK2 foram analisados, de modo semelhante, para a integridade de YAC, utilizando sondas especificas para o Kde humano, intensificadores kapa 3' e intrónico, Ck, JH e toas as diferentes famílias VK: VkI, VKII, VkIII, VkIV, VkVI. Vinte clones dos sessenta clones tiveram o YAC intacto e inalterado, o que representa 30% do total de clones analisados (dados mostrados para dois clones ES nas Figs. 3A-3E). Foram detectadas quantidades variáveis de sequências genómicas de levedura em clones de células ES contendo yH2 e yK2 (dados não mostrados) .

Estes resultados são a primeira demonstração da introdução de construções à escala de megabase abrangendo loci humanos reconstruídos, predominantemente em configuração de linha germinal, em células de mamíferos. A frequência, relativamente alta, de YAC intactos integrados no genoma de murganho validou adicionalmente a metodologia de fusão de esferoplastos de levedura-células ES como uma abordagem eficaz para a introdução fiel de grandes fragmentos genómicos humanos em células ES.

Exemplo 4: Criação de estirpes XenoMouse II

De modo a criar murganhos a partir das células ES contendo o ADN YAC, foi conduzido microinjecção de blastocistos, seguida por reprodução. Assim, clones de células ES contendo yH2 e yK2 foram expandidos e microinjectados em blastocistos C57BL/6J de murganho (Green et al., 1994) e os machos quiméricos produzidos foram avaliados para a transmissão da linha germinal. A prole com YAC transmitido foram identificados por análise de PCR e a integridade de YAC foi confirmada por análise de transferência de Southern. Em todos os murganhos transgénicos analisados, foi 48 demonstrado que o YAC estava na forma intacta (Figs. 2F-2I, 3F-3I). Todos os sete clones yH2-ES microinjectados e dois dos oito clones yK2-ES foram transmitidos através da linha germinal de murganho.

De modo a criar murganhos que produziam anticorpos humanos com exclusão de anticorpos endógenos, foram reproduzidos murganhos transgénicos yH2 ou yK2 com estripes de murganhos duplamente inactivadas (Dl). As estirpes Dl de murganhos são homozigóticas para os loci da cadeia kapa e pesada de murganho com genes direccionados-inactivados e são, assim, deficientes na produção de anticorpos (Jakobovis et al., 1993b; Grenn et al., 1994) . Duas das estirpes de murganhos transgénicos yH2, LIO e J9.2, e uma das estirpes de murganhos transgénicos yK2, J23.1, foram cruzadas com murganhos Dl para criar YAC contendo um fundo inactivado homozigótico de cadeia kapa e pesada de murganho (yH2;DI e yK2;DI). Cada das estirpes transgénicas yH2;DI foram cruzadas com a estirpe transgénica yK2;DI para criar duas estirpes XenoMouse II, 2A-1 (LIO; J23.1;DI) e 2A-2 (L9.2; J23.1;DI), respectivamente, contendo os YAC da cadeia leve e pesada no fundo Dl homozigótico. A LIO é totalmente homozigótica e J9.2 e J23.1 estão no processo de serem reproduzidas com sucesso até à homozigocidade. A integridade dos YAC da cadeia pesada e kapa humanas em estirpes XenoMouse II foi confirmada por análise de transferência de Southern. Como mostrado na Fig. 2 e Fig. 3, em ambas as estirpes XenoMouse analisadas, yH2 e yK2 foram transmitidos inalterados através de múltiplas gerações sem delecções ou rearranjos aparentes. 49

Exemplo 5: Desenvolvimento de células B e produção de anticorpos humanos por murganhos XenoMouse II

De modo a caracterizar adicionalmente as estirpes XenoMouse II, foi estudado o seu desenvolvimento de células B e

a sua produção de anticorpos humanos. A reconstituição do desenvolvimento de células B e a produção de anticorpos em estirpes XenoMouse II por YAC yH2 e yK2 foi avaliada por citometria de fluxo e ELISA. Em contraste com os murganhos D H os guais carecem totalmente de células B maduras, XenoMouse II manifestou essencialmente o desenvolvimento normal de células B com a população de células B maduras no sangue a totalizar mais de 50% do nivel observado em murganhos de tipo selvagem (Figs. 4A-4H). Foi mostrado gue todas as células B expressam IgM humana e níveis elevados de B220 (IgM+ humana/B22 0hl) , com 60% desta população também a expressar IgD humana. Foram obtidos resultados semelhantes a partir da análise do baço e nódulos linfáticos de XenoMouse (não mostrados). Estes resultados correlacionam-se bem com as características de células B maduras em murganhos de tipo selvagem, indicando maturação apropriada de células B em XenoMouse. A maioria das células B de XenoMouse (75-80%) expressam exclusivamente a cadeia leve (k) kapa humana, enguanto gue apenas 15% expressou a cadeia leve (λ) lambda de murganho (Fig. 4). Este razão de distribuição da cadeia leve (hk/mX: 75:15) é comparável àguela observada em murganhos de tipo selvagem, indicando um regulação de tipo murganho da utilização da cadeia leve. Em contraste, XenoMouse I, como descrito em Green et ai., 1994, mostrou uma razão hk/mX: 55:45 (dados não mostrados). Foram feitas observações semelhantes para células B de baço (Figs. 4I-4T) e nódulos linfáticos (não 50 mostrados), indicando que a maioria das células B de XenoMouse II produziram, exclusivamente, anticorpos totalmente humanos. Os níveis de células B que expressam mX foram reduzidos de 15% para 7% em estirpes XenoMouse II homozogóticas para yK2 (dados não mostrados).

Exemplo 6: Criação da Estirpe L6 A estirpe L6 de murganhos foi criada de modo idêntico ao processo acima descrito em relação à criação de estirpes

XenoMouse II. Contudo, devido a um evento de delecção durante a criação da linha de células ES L6, a linha de células ES e, subsequentemente, o murganho L6 evoluiu sem uma porção da sequência distai para Cõ, eliminando assim a região constante Cy e as suas sequências reguladoras. Após conclusão da reprodução, os murganhos L6 conterão a construção yK2 inteira e a construção yH2 inteira, à excepção da região constante Cy que falta.

Exemplo 7; Produção de Anticorpos Humanos A expressão das cadeias leves humanas Cp, Cy2 e k foi detectada em soros não imunizados de XenoMouse II em níveis máximos de 700, 600 e 800 pg/mL, respectivamente. Para determinar como estes valores se comparam ao tipo selvagem, foram medidos os níveis máximos das cadeias leves de murganho Cp, Cy2 e k em murganhos C57BL/6J x 129 mantidos sob condições semelhantes sem patogénios. Os valores para a cadeia leve Cp, Cy2 e k em murganhos de tipo selvagem foram 400, 2000 e 2000 pg/mL, respectivamente. Após imunização, os níveis da

cadeia γ humana aumentaram para, aproximadamente, 2,5 mg/mL. A 51 concentração de γ de murganho foi apenas 70 pg/mL, confirmando adicionalmente a utilização preferida da cadeia kapa humana.

Estas observações confirmaram a capacidade dos YAC de Ig humana introduzidos para induzir o apropriado rearranjo génico de Ig e a comutação de classe e para criar niveis significativos de anticorpos IgM e IgG totalmente humanos antes e depois da imunização.

Exemplo 8: Um reportório diverso de anticorpos humanos em XenoMouse II

De modo a compreender adicionalmente a reconstituição do reportório de anticorpos em estirpes XenoMouse II, foram estimulados murganhos com diversos antigénios e preparadas linhas celulares de hibridoma segregando esses anticorpos. Como será compreendido, a recapitulação da resposta de anticorpo humano em murganhos requer a utilização diversa dos diferentes genes variáveis humanos contidos nos YAC yH2 e yK2. A diversidade dos anticorpos humanos produzidos pelas estirpes XenoMouse II foi determinada por clonagem e sequenciação de transcritos da cadeia leve kapa e cadeia pesada (μ e γ) humana de nódulos linfáticos de XenoMouse. Com base nos dados da requerente à data, a análise de sequência demonstra que XenoMouse II utiliza, pelo menos, 11 dos 37 genes VH funcionais presentes em yH2, oito segmentos diferentes de DH e três genes JH (JH3, Jh4 Jh6) (Tabela III, JHs foi, também, detectado em relação aos anticorpos de sequenciação a partir de hibridomas). As sequências V-D-J foram ligadas as regiões constantes humanas μ ou γ2 (não mostradas). 52

Os genes VH utilizados estão amplamente distribuídos ao longo de toda a região variável e representam quatro das sete famílias de VH (Tabela III). A utilização predominante dos genes V das famílias VH3 e VH4 é semelhante ao perfil de utilização de VH em humanos adultos, a qual é proporcional ao tamanho da família (Yamada et al. 1991; Brezinshek et ai., 1995). A utilização predominante de JH4 é, também, reminiscente daquela detectada em células B humanas (Brezinshek et al., 1995). Foi também observado adição de nucleótidos não de linha germinal (N-adições) em ambas as junções V-D e D-J, variando a partir de 1-12 pb. Essas N-adições produziram regiões determinantes de complementaridade 3 (CDR3) com comprimentos a partir de 8 a cerca de 19 resíduos de aminoácidos, as quais são muito comparáveis àquelas observadas em células B de humanos adultos (Yamada et al. 1991; Brezinshek et al., 1995). Esses comprimentos de CDR3 observados no XenoMouse II são muito mais longos do que os comprimentos de CDR3 observados, geralmente em murganhos (Feeny, 1990).

Um reportório altamente diverso foi, também, encontrado nos dez transcritos da cadeia kapa sequenciados. Além de apresentar 8 de 25 grelhas de leitura aberta (ORF) funcionais de VK em yK2, todos os genes de Jk foram detectáveis (Tabela IV). Os diferentes genes VK utilizados estavam amplamente dispersos ao longo de yK2, representando todas as quatro famílias principais do gene VK. Todos os produtos de recombinação VkJk foram ligados correctamente a sequências Ck. A escassez de N-adições nos transcritos está de acordo com a actividade de transferase de desoxinucleótido terminal muito reduzida na fase do rearranjo da cadeia kapa. O comprimento médio de CDR3 de 9-10 aminoácidos que se observa nos transcritos da cadeia kapa é idêntico àquele observado em células B humanas (Marks et al., 1991). 53

Nas Tabelas III e IV abaixo, são apresentadas as análises do reportório de transcritos da cadeia leve kapa e pesada humana expressos em estirpes XenoMouse II. Os ARNm humanos específicos de μ, γ e k foram amplificados por PCR, clonados e analisados por sequenciação como descrito nos Materiais e Métodos. A Tabela III mostra uma série de sequências de nucleótidos de 12 clones únicos da cadeia pesada humana, divididos em segmentos de VH, D, Jh e N, como identificados por homologia com sequências de linha germinal publicadas (Materiais e Métodos). Cada atribuição do segmento D é baseada em, pelo menos, 8 bases de homologia. A Tabela IV mostra uma série de sequências de nucleótidos de junções V-J de 8 clones de k humana independentes. As sequências são divididas em segmentos Vk, Jk e N e identificadas com base na homologia com sequências VK e Jk publicadas. Em cada uma das Tabelas, as N-adições e delecções (indicados como _) foram determinadas pela ausência de homologia de sequência com sequências V, D ou J. 54

TABELA III

Análise do Repertório de Transcritos da Cadeia Pesada Humana

Clone v„ N dh N Jh A2.2.1 5-51 (DP73) 4 XP5rc 12 JH4 GACTACTGGGGC TTACTGTGCGAGACA (TAGG) AATCAT (GGGAGC TACGGG) B2.1.5 3-33(DP—50) 7 3rc 7 JH4_ _CTTTGACTACTGGGGC TTACTGTGC GAGAGA (TCGGGGA) AATAGCA (CTGGCCT) B4.2.4 3-15(DP-38) 1 Kl 11 JH6_ _C TAC TAC TAC TACGGT TTACTGTACCACAGA (G) GGCTAC (ACTAACTACCC) B4.2.5 4-59(DP—71) 10 4 6 JH6_ _ACTACTACTACTACGGT T TAC T G T GCGAGAGA (TAGGAGTGTT) GTAGTACCAGCTGCTAT (ACCCAA) D2.2.5 4-34(DP-63) 2 NI 4 JH4 _CTTTGACTACTGGGGC T TAC T G T GCGAGAG_ (GG) GCAGCAGCTG (CCCT) D2.1.3 3-48(DP—51) 4 XPl 2 JH6 _C TAC TAC TAC TACGGT TTACTGTGCGAGAGA (TCTT) GATATTTTGACTGGT (CT) D2.2.8 4-31 (DP—65) 2 A4 5 JH4 T T T GAC TAC T GGGGC TTACTGTGCGAGAGA (GA) GACTGCAG (CGGTT) A2.2.4 3-21(DP—77) 2 IR3 3 JH6_ _T AC T AC T AC T AC T ACGGT TTACTGTGCGAGAGA (TT) GGGGCTGG (ACC) D4.2 . 4-44/4 35 1 NI 2 JH4 _CTTTGACTACTGGGGC 11 ATTACTGTOCGA (A) TATAGCAGTGGCTGGT (GT) Cl.2.1 1-18(DP—14) 0 XP'1/21-7 0 JH4 GACTACTGGGGC TATTACTGTGCGAG_ GTTA C3.1.2 4-39(DP—79) 2 3 6 JH4 _CTTTGACTACTGGGGC TATTACTGTGCG_ (GCC) GGATATAGTAGTGG (TCGGGC) D2.2 . 7 5-51(DP73) 4 Kl 9 JH3 ATGCTTTGATATCTGGGG TTACTGTGCGAGACA (TGGC) AGTGGCT (GGTACTCTG) 55

TABELA IV

Análise do Repertório de Transcritos da Cadeia Leve Kapa Humana

Clone vt N Jk F2.2.3 02(DPK9) TTAAACGAACAGTACCCC 0 Jk5 GATCACCTTCGGCCAA F4.1.8 L5(DPK5) ACAGGC TAACAGTTTCCCTC_ 0 Jkl _GGACGTTCGGCCAA F4.1.6 A20(DPK4) AAGTATAACAGTGCCCC_ 0 Jk3 ATTCACTTTCGGCCCT F2.2.5 08 ACAGTATGATAATCTCCC_ 0 Jk4 GCTCACTTTCGGCGGA F2.1.5 LI AAAGTATAATAGTTACCC_ 0 Jk5 GATCACCTTCGGCCAA F2.1.4 A3 0 CAGCATAATAGTTACCC_ 0 Jk3 ATTCACTTTCGGCCCT F2.1.3 B3(DPK24) AATATTATAGTACTCC 0 Jk4 GCTCACTTTCGGCGGA F4.1.3 A27(DPK22) CAGTATGGTAGCTCACCTC 1 (G) Jk2_CACTTTTGGCCAG

Estes resultados, conjuntamente com sequência de hibridomas derivados de XenoMouse descritos mais tarde, demonstram uma utilização de tipo humano adulto muito diversa, de genes V, D e J, que parece demonstrar que a totalidade da regiões variáveis da cadeia kapa e pesada humana presentes nos YAC yH2 e yK2 são acessíveis ao sistema de murganho para rearranjo de anticorpo e estão a ser utilizadas de um modo não baseado na posição. Além disso, o comprimento médio das N-adições e CDR3 para os transcritos da cadeia pesada e kapa são muito semelhantes àqueles observados em células B de humano adulto, indicando que o ADN de YAC contido nos murganhos direcciona a maquinaria do murganho para produzir um reportório imunitário do tipo humano adulto em murganhos. 56

Em relação aos seguintes Exemplos, foram preparados anticorpos de elevada afinidade para diversos antigénios. Em particular, os antigénios foram preparados IL-8 humana e EGFR humano. A fundamentação para a selecção de IL-8 e EGFR é como se segue. A IL-8 é um membro da família das quimiocinas C-X-C. A IL-8 actua como o quimioatractivo primário para neutrófilos implicados em muitas doenças, incluindo ARDS, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, glomerulonefrite, psoríase, hepatite alcoólica, lesão por reperfusão, para referir algumas. Além disso, a IL-8 é um factor angiogénico potente para células endoteliais. Nas Figuras 22-28, demonstrou-se que anticorpos anti-IL-8 humana derivados de estirpes XenoMouse II são eficazes na inibição das acções da IL-8 numa variedade de vias. Por exemplo, a Figura 22 mostra o bloqueio da ligação de IL-8 a neutrófilos humanos por anti-IL-8 humana. A Figura 23 mostra a inibição da expressão de CDllb em neutrófilos humanos por anti-IL-8 humana. A Figura 24 mostra a inibição do influxo de cálcio induzido por IL-8 através de anticorpos anti-IL-8 humana. A Figura 25 mostra a inibição da quimiotaxis de IL-8 RB/293 por anticorpos anti-IL-8 humana. A Figura 26 é um diagrama esquemático de um modelo de coelho da inflamação dérmica induzida por IL-8 humana. A Figura 27 mostra a inibição da inflamação dérmica induzida por IL-8 humana no modelo de coelho da Figura 26 com anticorpos anti-IL-8 humana. A Figura 28 mostra a inibição da angiogénese de células endoteliais num modelo da bolsa corneana de ratos por anticorpos anti-IL-8 humana. 0 EGFR é visto como um alvo anticancerígeno. Por exemplo, o EGFR é sobre-expresso, até 100 vezes, numa variedade de células 57 cancerígenas. A estimulação do crescimento mediada por ligando (EGF e TNF) desempenha um papel crítico na iniciação e progressão de determinados tumores. A este respeito, os os anticorpos de EGFR inibem a ligação do ligando e conduzem à paragem do crescimento da célula tumoral e, conjuntamente com agentes quimioterapêuticos, induzem apoptose. De facto, foi demonstrado que uma combinação de Mab de EGFR resultou em erradicação tumoral em modelos de tumor xenogénico de murino. A Imclone conduziu ensaios clínicos de Fase I utilizando um Mab quimérico (C225) que provou ser seguro. Nas Figuras 31-33, a requerente demonstrou dados relacionados com os seus anticorpos anti-EGFR humano. A Figura 30 mostra sequências de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II. A Figura 31 mostra bloqueio da ligação do EGF a células A431 por anticorpos anti-EGFR humano. A Figura 32 mostra a inibição da ligação do EGF a células SW948 por anticorpos anti-EGFR humano. A Figura 33 mostra que anticorpos anti-EGFR humano derivados de estirpes XenoMouse II inibem o crescimento de células SW948 in vitro.

Exemplo 9: Mab humanos específicos de antigénio de alta afinidade produzidos por XenoMouse II

Perguntou-se se a utilização demonstrada do vasto reportório humano em XenoMouse II pode ser aproveitada para criar anticorpos humanos para antigénios múltiplos, em particular, antigénios humanos de interesse clínico significativo.

Desta forma, crias individuais de XenoMouse II foram estimuladas, cada, com um a três alvos antigénicos diferentes, 58 IL-8 humana, EGFR humano e TNF-α humano. Os antigénios foram administrados em duas formas diferentes, como uma proteína solúvel, no caso de IL-8 e TNF-α ou expressos na superfície das células (células A431), no caso de EGFR. Para todos os três antigénios, ELISA realizados em soros de murganhos imunizados indicaram uma forte resposta de anticorpo humano (IgG, IgK) específica de antigénio com títulos tão elevados quanto 1,3 x 106. Foi detectada resposta λ de murganho negligível.

Os hibridomas foram derivados de tecidos do baço ou nódulos linfáticos através de tecnologia de hibridoma convencional e foram rastreados para a secreção de Mab humanos específicos de antigénio por ELISA.

Um XenoMouse II imunizados com IL-8 produziu um painel de 12 hibridomas, todos segregando Mab (hIgG2k) totalmente humanos específicos para IL-8 humana. Os anticorpos de quatro destes hibridomas, Dl.l, K2.2, K4.2 e K4.3, foram purificados do fluido ascítico e avaliados para a sua afinidade para IL-8 humana e a sua potência no bloqueamento da ligação de IL-8 aos seus receptores em neutrófilos humanos.

As medições de afinidade foram realizadas através de medições de fase sólida do anticorpo inteiro e fragmentos Fab utilizando ressonância de plasmão de superfície em BIAcore e em solução por radioimunoensaio (Materiais e Métodos). Como mostrado na Tabela V, os valores de afinidade medidos para os quatro Mab variaram de 1,1 x 109 até 4,8 x 1010 M_1. Embora houvesse alguma variação nas técnicas utilizadas, os valores de afinidade para todos os quatro anticorpos foram, consistentemente, maiores que 109 M_1. 59 A análise de ELISA confirmou que estes quatro anticorpos eram específicos para IL-8 humana e reagiram de forma cruzada com quimiocinas infimamente relacionadas MIP-Ioí, GROa, β e γ, ENA-78, MCP-1 ou RANTES (dados não mostrados). Além disso, a análise de competição no BIAcore indicou que os anticorpos reconhecem, pelo menos, dois epitopos diferentes (dados não mostrados). Todos os anticorpos inibem a ligação de IL-8 a neutrófilos humanos tão eficazmente quanto o anticorpo neutralizante anti-IL-8 humana de murino, enquanto que um anticorpo IgG2k humano de controlo não (Fig. 5A).

As experiências de fusão com XenoMouse II imunizado com EGFR produziram um painel de 25 hibridomas, todos segregando Mab IgG2k humanos específicos de EGFR. Dos treze Mab humanos analisados, quatro (E2.1, E2.4, E2.5, E2.ll) foram seleccionados pela sua capacidade para competir com o anticorpo 225 de murganho específico de EGFR, o qual foi previamente demonstrado que inibe a proliferação celular mediada por EGF e a formação de tumor em murganhos (Sato et al., 1983). Estes anticorpos humanos purificados de fluido ascítico, foram avaliados para a sua afinidade para EGFR e neutralização da ligação de EGF a células. As afinidades destes anticorpos para EGFR, como determinadas por medições de BIAcore, variaram de 2,9 x 109 a 2,9 x IO10 M_1 (Tabela V).

Todos os quatro anticorpos anti-EGFR bloquearam totalmente a ligação de EGF a células A431 (Fig. 5B) , demonstrando a sua capacidade para neutralizar a sua ligação a receptores de elevada e baixa afinidade nestas células (Kawamoto et al., 1983). A inibição completa da ligação de EGF ao EGFR expresso em células humanas de carcinoma do pulmão SW948 por todos os quatro anticorpos anti-EGFR humano também foi observada (dados não 60 mostrados). Em ambos os casos, os anticorpos totalmente humanos foram tão eficazes na inibição da ligação de EGF quanto o anticorpo 225 de murganho anti-EGFR e mais potente do que o anticorpo 528 (Gill et al., 1983). Em ambos os ensaios celulares, um anticorpo IgG2k humano de controlo não afectou a ligação do EGF (Fig.5B e dados não mostrados).

As experiências de fusão com XenoMouse II imunizados com TNF-α produziram um painel de 12 anticorpos IgG2k humanos. Quatro dos 12 foram seleccionados pela sua capacidade para bloquear a ligação de TNF-α aos seus receptores em células U937 (Fig. 5C) . As afinidades destes anticorpos foram determinadas como sendo na gama de 1,2-3,9 x 109 fT1 (Tabela V).

Os hibridomas derivados de XenoMouse descritos, produziram anticorpos em concentrações na gama de 2-19 pg/mL em condições de cultura estática. A caracterização dos anticorpos purificados em géis de proteína sob condições não redutoras revelou o peso molecular aparente previsto de 150 kD para o anticorpo IgG2k. Sob condições redutoras, foram detectados pesos moleculares aparentes previstos de 50 kD para a cadeia pesada e 25 kD para a cadeia leve (dados não mostrados). A Tabela V, abaixo, mostra constantes de afinidade de Mab totalmente humanos específicos de antigénio, derivados de XenoMouse. As constantes de afinidade de Mab IgG2k humanos derivados de XenoMouse específicos para IL-8, EGFR e TNF-α foram determinadas por BIAcore ou por radioimunoensaio, como descrito nos Materiais e Métodos. Os valores mostrados para IL-8 e EGFR são representativos de experiências independentes realizadas com anticorpos purificados, enquanto os valores mostrados para TNF-a são de experiências realizadas com sobrenadantes de hibridoma. 61

TABELA V

Mab IgG2k Humano Antigénio ka (M_1S_1) Kd (S_1) KA (M-1) KD (M) Densidade de Superfície [RU] Rádio-imunoensaio (M 1) Medições de Fase Sólida solução Dl. 1 IL-8 2,7xlOb 9, 9xl0~4 2,7xl09 3, 7xlO~10 81 2, OxlO10 Dl.l Fab IL-8 2,lxlOb 2, lxlCTJ 1,lxlO9 8, 8xl0~lu 81 4, 9X1011 K2.2 IL-8 0,9xlOb 2, 3xl0~4 4,OxlO9 2, 5xl0~lu 81 1,0xl0lu K4.2 IL-8 2,5xlOb 4, lxlO~4 6,3xl09 1, 6xl0~lu 81 ND K4.3 IL-8 4,3xlOb 9, 4xl0~4 4,5xl09 2, 2xl0~iu 81 2,1x10“ K4.3 Fab IL-8 6,0xl0b 2, lxlO~J 2,9xl09 3, 4xl0~iu 81 ELISA (M) EI. 1 EGFR 1,9xlOb 6, 5x1 CT^ 2,9xl09 3, 46xl0~iu 303 1, lxl0~lu E2.5 EGFR 2,lxl0b 1, 8xl0~4 1,2xl0lu 8, 44xl0~ix 303 3, 6xl0“lu E2.11 EGFR 1,7x10b 4, 7xlCT4 3,7xlOs 2, 68x1 CT1U 303 1, lxl0'lu E2.4 EGFR 2,8x10b 9,78x10^ 2,9xl0lu 3, 5χ10~χ1 818 1, lxl0~iu T22.1 TNF-a 1,6xlOb 1, 3xlO~J 1,2xl09 8, 06xl0~lu 107 T22.4 TNF-a 2,4xlOb 4, 6xl0“4 5,3xl09 1, 89xl0~iu 107 T22.8 TNF-a 1,7xlOb 7, 5xl0~4 2,3xl09 4, 3xl0~iu 107 T22.9 TNF-a 2,3xlOb 4, 9xl0~4 4,8xl09 2, llxl(Tiu 107 T22.ll TNF-a 2,9xlOb 7, 9xl0~4 N/A 2, 76xl0~iu 107

Exemplo 10: Utilização genica e hipermutação somática em anticorpos monoclonais sequências dos transcritos da humanos descritos de IL-8 e e Figuras [ [ ]]. Os quatro consistiram de, pelo menos, quatro dois

As dos Mab Figura 6 IL-8 de (Vh4-34/Vh4-21 r VH3_30 Θ VH5_51), (A1/A4, Kl, ir3rc e 21-10rc) e Jh4) . Três genes VK diferentes cadeia pesada e leve kapa EGFR foram determinadas, anticorpos específicos de três genes VH diferentes segmentos DH diferentes segmentos do gene JH (JH3 e (012, 018 e B3) combinados com 62 genes Jk3 e Jk4. Essa utilização diversa mostra que XenoMouse II é capaz de produzir um painel de anticorpos anti-IL-8 neutralizantes com regiões variáveis diversas.

Em contraste com os transcritos de anticorpo IL-8, as sequências dos anticorpos seleccionados pela sua capacidade para competir com Mab 225 mostraram utilização relativamente restrita do gene VH e VK, com três anticorpos, El.l, E2.4 e E2.5 partilhando o mesmo gene VH (4-31) e E2.ll contendo VH4-6ir o qual é altamente homólogo com VH4-3i. Foram detectados diferentes segmentos de D (2, A1/A4, XP1) e JH (Jh3 Jh4, Jh5). Foi mostrado que todos os quatro anticorpos partilham o mesmo gene VK (018). Três deles continham Jk4 e um, E2.5, continha Jk2. A maioria dos transcritos de hibridoma VH e VK mostraram extensas alterações de nucleótidos (7-17) relativamente aos correspondentes segmentos de linha germinal, enquanto não foram detectadas mutações nas regiões constantes. A maioria das mutações em segmentos V resultou em substituições de aminoácidos nas sequências de aminoácidos previstas do anticorpo (0-12 por gene V), muitas em regiões CDR1 e CDR2 (Figura _). É de assinalar as mutações que são partilhadas pelas sequências da cadeia pesada de anticorpos de EGFR, tal como a substituição Gly->Asp em CDR1, partilhada por todos os anticorpos ou a substituição Ser^Asn em CDR2 e Val->Leu na região 3 de estrutura partilhada por três anticorpos. Estes resultados indicaram que um processo extenso de hipermutação somática, conduzindo à maturação e selecção de anticorpo, está a ocorrer em XenoMouse II. 63

Discussão

Este presente pedido descreve a primeira substituição funcional de loci complexos de murganho, à escala de megabases, com fragmentos de ADN humano equivalentes em tamanho e conteúdo, reconstruídos em YAC. Com esta abordagem, o sistema imunitário humoral de murganho foi "humanizado" com loci de Ig humana à escala de megabases para reproduzir, substancialmente, a resposta de anticorpo humano em murganhos deficientes da produção de anticorpos endógenos. 0 sucesso na reconstrução fiel de uma grande porção dos loci humanos da cadeia pesada e leve kapa, quase em configuração de linha germinal, estabelece a recombinação de YAC em levedura como uma tecnologia poderosa para reconstituir fragmentos grandes, complexos e instáveis, tais como os loci de Ig (Mendez et al., 1995) e a sua manipulação para introdução em células de mamíferos. Além disso, a introdução bem sucedida dos dois grandes segmentos da cadeia pesada e leve kapa na linha germinal de murganho em forma intacta confirma a metodologia de fusão de esferoplastos de levedura-células ES como uma abordagem eficiente e de confiança para transferir os loci xenogénicos na linha germinal de murganho. A caracterização das estirpes XenoMouse II mostrou que os grandes loci de Ig foram capazes de restaurar o sistema de anticorpo, comparável na sua diversidade e funcionalidade àquele de murganhos de tipo selvagem e muito superior à resposta humoral produzida em murganhos contendo construções de minigene de Ig humana (Lonberg et al., 1994) ou pequenos YAC de Ig humana (Green et al., 1994). Esta diferença foi manifestada nos níveis de células B maduras, produção de Ig humana, eficiência de comutação de classe, diversidade, preponderância da produção de Igk humana relativamente a IgX de murino, e magnitude da resposta do anticorpo humano, e sucesso na criação de anticorpos monoclonais específicos de antigénio de elevada afinidade, para antigénios múltiplos.

Os níveis de células B maduras e anticorpos humanos em XenoMouse II são os mais elevados alguma vez descritos para murganhos transgénicos de Ig, representando um aumento de várias vezes sobre os níveis mostrados para os murganhos anteriores e aproximando-se dos de murganhos de tipo selvagem. Em particular, os níveis da IgG humana foram mais do que 100 vezes superiores àqueles descritos para murganhos contendo transgenes Ig de minilocus com o gene γΐ humano (Lonberg et al., 1994) . A comutação de classe mais eficiente em XenoMouse II foi provavelmente o resultado da inclusão das regiões inteiras de comutação, com os todos os seus elementos reguladores, assim como os elementos adicionais de controlo em yH2, os quais podem ser importantes para suportar e manter a comutação de classe apropriada. Os níveis elevados de células B maduras em estirpes XenoMouse II irão, provavelmente, resultar da frequência mais elevada do rearranjo e, assim, desenvolvimento melhorado de células B na medula óssea devido ao reportório aumentado do gene V. É esperado que a reconstituição de células B seja ainda mais pronunciada em estirpes XenoMouse II que são homozigóticas para o locus da cadeia pesada humana. A razão da expressão entre k humana e a cadeia leve λ de murganho por circulação de células B proporciona uma medida interna útil da utilização do locus transgénico da cadeia kapa. Enquanto que em murganhos contendo um alelo de YAC de Ig menor, foi observada uma distribuição aproximadamente igual de k humana 65 e λ de murganho, foi detectada uma preponderância significativa de k humana em estirpes XenoMouse II. Além disso, em animais homozigóticos para yK2 possuíam uma razão k:X que é idêntica a murganhos de tipo selvagem. Estas observações, conjuntamente com a vasta utilização do gene VK, sugerem fortemente que os genes VK proximais humanos no XenoMouse II são suficientes para suportar uma resposta diversa da cadeia leve e são consistentes com a tendência para a utilização do gene VK proximal em humanos (Cox et al., 1994) .

As estirpes XenoMouse II apresentaram diversidade de anticorpo altamente aumentada com genes V, D e J ao longo de toda a extensão dos loci acedidos pelo mecanismo de recombinação e incorporados em anticorpos maduros. Uma vez despoletado por ligação de antigénio, ocorre hipermutação somática extensa, conduzindo a maturação de afinidade dos anticorpos.

0 perfil de utilização dos genes V, D, J em XenoMouse II também indicou que estão disponíveis e utilizadas de um modo reminiscente da sua utilização em humanos, produzindo um reportório de anticorpos humanos de tipo adulto, o qual é diferente da utilização baseada na posição de yipo fetal, observada em murganhos contendo minigene de Ig (Taylor et al., 1992; Taylor et al., 1994; Tuaillon et al., 1993). A vasta utilização de muitos dos genes VH e VK funcionais conjuntamente com a multiplicidade de antigénios reconhecidos pelo murganho, realça a importância do grande reportório do gene V para a reconstituição bem sucedida de uma resposta de anticorpo funcional. 66 0 teste final para a extensão da reconstituição da resposta imunitária humana em murganhos é o espectro de antigénios aos quais os murganhos irão induzir uma resposta de anticorpo e a facilidade com que os Mab de elevada afinidade, específicos de antigénio, podem ser criados para diferentes antigénios. Ao contrário de murganhos manipulados com minigenes ou YAC de Ig humana menores, os quais produziram até à data apenas um número limitado de Mab humanos específicos de antigénio (Lonberg et ai., 1994; Green et ai., 1994; Fishwild et ai., 1996), o XenoMouse II criou Mab para todos os antigénios humanos testados até à data. As estirpes XenoMouse II montaram uma forte resposta do anticorpo humano para diferentes antigénios humanos apresentados como proteínas solúveis ou expressos à superfície das células. A imunização com cada um dos três antigénios humanos testados produziu um painel de 10-25 Mab de IgG2k humana específicos de antigénio. Para cada antigénio, foi obtido um conjunto de anticorpos com afinidades na gama de 109-1010 M_1. Foram realizadas diversas medições para confirmar que os valores de afinidade representam cinéticas de ligação univalente em vez de avidez: Os ensaios de BIAcore com anticorpos intactos foram realizados chips sensores revestidos com baixa densidade de antigénio para minimizar a probabilidade de ligação bivalente; para dois anticorpos, o ensaio foi repetido com fragmentos Fab monovalentes; alguns dos anticorpos foram, também, testados por radioimunoensaio em solução. Dos resultados destas medições, conclui-se que anticorpos com afinidades na gama de IO10 M'1 são prontamente atingíveis com o XenoMouse. Os valores de afinidade obtidos para os anticorpos derivados de XenoMouse são os mais elevados, descritos para anticorpos humanos contra antigénios humanos produzidos a partir de murganhos manipulados (Lonberg et al., Fishwild et al., 1996) ou de bibliotecas combinatórias (Vaughan et al., 1996). Estas elevadas afinidades combinadas com 67 a substituição de aminoácidos extensa como resultado da mutação somática nos genes V, confirma que o mecanismo de maturação de afinidade está intacto no XenoMouse II e comparável àquele em murganhos de tipo selvagem.

Estes resultados mostram que o grande reportório de anticorpos nos YAC de Ig humana está a ser explorado correctamente pela maquinaria do murganho para a diversificação e selecção de anticorpo e, devido à falta de tolerância imunológica às proteínas humanas, pode produzir anticorpos de elevada afinidade contra qualquer antigénio de interesse, incluindo antigénios humanos. A facilidade com que os anticorpos para antigénios humanos podem ser criados pelos genes de imunoglobulina humana nestes murganhos proporciona confirmação adicional que a auto-tolerância ao nível das células B é adquirida e não herdada. A capacidade para criar anticorpos totalmente humanos de elevada afinidade para antigénios humanos tem implicações práticas óbvias. É esperado que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas e alérgicas intrínsecas para Mab de murganho ou derivados de murganho e, assim, aumentar a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. XenoMouse II oferece a oportunidade de proporcionar uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crónicas e recorrentes, tais como inflamação, autoimunidadde e cancro, as quais requerem administrações repetidas de anticorpos. A rapidez e reprodutibilidade com que XenoMouse II produz um painel de anticorpos totalmente humanos de elevada afinidade indica o potencial avanço que oferece relativamente a outras tecnologias para a produção de anticorpos humanos. Por exemplo, em contraste com a apresentação de fagos, a qual requer esforços intensos 68 para aumentar a afinidade de muitos dos seus anticorpos derivados e produz Fvs ou Fabs de cadeia única, os anticorpos de XenoMouse II são imunoglobulinas totalmente intactas de elevada afinidade que podem ser produzidas de hibridomas sem mais manipulação adicional. A estratégia aqui descrita para a criação de um autêntico sistema imunitário humoral humano em murganhos pode ser aplicada para a humanização de outros loci multi-gene, tais como o receptor das células T ou o complexo de histocompatibilidade major, os quais governam outros compartimentos do sistema imunitário de murganho (Jakobovits, 1994). Esses murganhos teriam valor para a elucidação das relações estrutura-função dos loci humanos e o seu envolvimento na evolução do sistema imunitário.

Referências

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Abgenix, Inc. TRANSGÉNICOS E VK.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MAMÍFEROS

POSSUINDO LOCI DE IG HUMANA INCLUINDO VÁRIOS VH (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 80 (iv) ENDEREÇO DE CORREPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Fish & Neave (B) RUA: 1251 Avenue of Américas (C) CIDADE: Nova Iorque (D) ESTADO: NI (E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 10020 (v) FORMA DE LEITURA POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: IBM Compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ Versão 1.5 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE PEDIDO: 03-DEZ-1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/759620 77 (B) DATA DE PEDIDO: 03-DEZ-1996 (viii) INFORMAÇÃO DE MANDATÁRIO/AGENTE:

(A) NOME: James, Haley F (B) NÚMERO DE REGISTO: 27794 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE REGISTO: Cell 4.18 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 212-596-9000 (B) TELEFAX: 212-596-9090 (C) TELEX: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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TTACTGTGCG AGACA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:4: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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CTACTACTAC TACGGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:ll: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll: TTACTGTGCG AGAGA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 84 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12: TAGGAGTGTT 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 13: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 13: GTAGTACCAG CTGCTAT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 85

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(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 15: TTACTGTGCG AGAG 14 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 86 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:16: GCAGCAGCTG 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 17: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:17: CTTTGACTAC TGGGGC 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 18: 87 (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18: TTACTGTGCG AGAGA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° : 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

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GATATTTTGA CTGGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:20: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iv) ΑΝΤΙ SENSE: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: 89 (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:21: TTACTGTGCG AGAGA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:22: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:22: TTTCACTACT GGGGC 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 90 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:23: TTACTGTGCG AGAGA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:24: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:24: TACTACTACT ACTACGGT 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases 91 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:25: ATTACTGTGC GA 12 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:26: TATAGCAGTG GCTGGT 16 92 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:27: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:27: CTTTGACTAC TGGGGC 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 93 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:28: TATTACTGTG CGAG 14 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:29: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:29: GACTACTGGG GC 12 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 94

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:30: TATTACTGTG CG 12 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:31: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:31: GGATATAGTA GTGG 14 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 95 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:32: CTTTGACTAC TGGGGC 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:33: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:33: TTACTGTGCG AGACA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:34: 96 (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:34: ATGCTTTGAT ATCTGGGG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:35: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:35: 97 18

TTAAACGAAC AGTACCCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:36: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:36: GATCACCTTC GGCCAA 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: 98 (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:37: ACAGGCTAAC AGTTTCCCTC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:38: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:38: GGACGTTCGG CCAA 14 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 99 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:39: AAGTATAACA GTGCCCC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:40: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:40: ATTCACTTTC GGCCCT 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases 100 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:41 ACAGTATGAT AATCTCCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:42

GCTCACTTTC GGCGGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:43: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:43: AAAGTATAAT AGTTACCC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 102 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:44: GATCACCTTC GGCCAA 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:45: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:45: CAGCATAATA GTTACCC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 103

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:46: ATTCACTTTC GGCCCT 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:47: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:47: AATATTATAG TACTCC 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 104 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:48: GCTCACTTTC GGCGGA 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:49: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:49: CAGTATGGTA GCTCACCTC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:50: 105 (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 0 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:50 CACTTTTGGCCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:51 106

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Thr 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 80 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:52:

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 15 10 15

Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 20 25 30

Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 35 40 45

Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 65 70 75 80 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:53: 107 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 119 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:53:

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 1 5 10 ' 15

Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 20 25 30

Glu Ile Asn Gin Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 35 40 45

Arg Vai Ile Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gin Phe Ser Leu Lys 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 65 70 75 80

Glu Thr Pro His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr 85 90 95

Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro 100 105 ' 110

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Thr 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 120 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 108 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii ) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 1 5 10 Ί5

Trp Thr Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 20 25 30 *

Glu Ile Ile His His Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 35 40 45

Arg Vai Ser Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Thr 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 65 70 75 80

Gly Gly Ala Vai Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 85 90 95

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 100 105 110

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Thr 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 84 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 109 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ίν) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:55:

Ser His His Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 15 10 15

Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu 20 " 25 30

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro 35 40 45

Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr 50 55 60

Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr 65 70 75 80

Tyr Cys Ala Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: 110 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:56:

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 1 5 10 ' 15

Trp Ile Gly Trp Va, mg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 20 25 30

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 35 40 45

Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 50 55 60

Leu Gin Tip Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Ala Arg Gin Asp Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 85 90 95

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 100 105 110

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Thr 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 83 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:57: 111

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cvs Ala Ala Ser Glv Phe Thr Phe Ser Ser 1 5 10 ' 15

Tyr Gly Met His Trp Xaa Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 20 25 30

Vai Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Glv Ser Asn Lvs Tyr Tvr Ala Asp Ser 35 40 45

Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lvs Asn Thr Leu 50 55 60

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 65 70 75 80

Cys Ala Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 122 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:58: 112

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 15 10 15

Tyr Gly Met His Trp Xaa Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 20 25 30

Vai Ala Glu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Vai Asp Ser 35 40 45

Vai Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 50 ' 55 60

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 65 70 75 80

Cys Ala Arg Asp Arg Leu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 85 90 95

Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 100 105 110

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Thr 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:59:

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin 113 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 1 5 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Glv Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 20 25 30

Ser Asn Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tvr Tyr Cys Gin Gin Asp Asn Leu Pro 65 ' 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 114 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ίν) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:61:

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Lys Phe Leu Ser Trp 15 10 15

Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr 20 25 30

Ser Tyr Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Vai 50 55 60

Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Asp Asp Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Pro 65 70 75 80

Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 85 90 95

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 115 (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:62:

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lvs Ala Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile Tyr Ala Ala 20 25 30

Ser Asn Leu Glu Ala Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly 65 70 75 80

Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 85 90 95

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii ) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ 116

Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin 15 10 15

Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser 20 25 30

Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 35 40 45

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 50 55 60

Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 86 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:64: 117

Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin 15 10 15

Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 20 25 30

Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 35 * 40 45

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 50 55 60

Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 65 70 75 80

Thr Lys Vai Glu Ile Lys 85 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 82 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:65: 118

Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Vai Leu Tyr Ser Ser Asn Asn 15 10 15

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys 20 25 30

Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg 35 ' 40 45

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 50 55 60

Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser 65 70 75 ’ 80

Thr Pro (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 94 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ίν) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:66: 119

Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Vai Leu Tyr Ile Ser Asn Asn 15 10 15

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys 20 25 30

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Vai Pro Asp Arg 35 40 45

Phe Ser Glv Ser Gly Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 50 ’ 55' ' 60

Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Asp 65 70 75 ' 80

Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Glv Thr Lys Vai Asp Ile Lys 85 90 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (lav) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:67:

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 ’ 10 15

Ser Thr Ser Thr 20 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:68: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:68:

Vai Ser Glv Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 1 5 10 15

Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 121 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO DE FRAGMENTO (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:69:

Vai Ser Glv Gly Ser Ile Asn Ser Gly Asp Tyr Tvr Trp Ser Trp Ile 1 5 10 15

Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Asp Cys Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Lvs Leu Thr Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Vai Vai 65 70 75 ’ 80

Asn Pro Gly Trp Phe Asp Pro Trp Glv Gin Gly Tvr Leu Vai Thr Vai 85 90 95

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys 100 105 110

Ser Arg Ser Thr Ser Thr 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 117 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 122

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:70:

Vai Ser Gly Gly Ser Ue Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 15 10 15

Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Cys Tyr Cys Ala Arg Asn Ile Vai Thr 65 70 75 * 80

Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser 85 90 95

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 100 105 110

Arg Ser Thr Ser Thr 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 116 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: 123 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:71:

Vai Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile 15 10 15

Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Ser Met 35 40 45

Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Pro Vai Thr 65 70 75 80

Gly Gly Glu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 85 90 95

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 100 105 110

Ser Thr Ser Thr 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:72: 124

Vai Ser Gly Gly Ser Vai Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 15 10 15

Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cvs Ala Arg 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:73:

Vai Ser Gly Gly Ser Vai Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 15 10 15

Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Se- Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp thr Ala Vai Tyr Tyr Cvs Ala Arg 65 70 75 125 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 117 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

Vai Ser Gly Gly Ser Vai Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 1 5 10 15

Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Leu Tyr Tyr 20 ' 25 30

Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Leu Asp Thr Scr Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Aia Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Phe Leu Thr 65 70 75 ”80

Gly Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 85 90 ’ 95 ’

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 100 ' 105 110

Arg Ser Thr Ser Thr 115 126 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:75: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:75:

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 127 (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:76:

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 20 25 30

Ser Asn Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Glv Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Asn Leu Pro 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:77 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:77: 128

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile His Asp Ala 20 ^ 25 30

Ser Asn Leu Glu Thr Gly Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Gly Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly 65 70 75 80

Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 85 90 95

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii ) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ 129

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Thr Ile Tvr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Glv Lys Ala Pro Lvs Leu Leu Ile Asn Asp Ala 20 25 30

Ser Ser Leu Glu Thr Gly Vai Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly 65 ’ 70 75 80

Gly Thr Lvs Vai Ala Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 85 90 95

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO DE FRAGMENTO (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:79: 130

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp íle Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 20 25 30

Ser Asn Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Vai 50 55 60

Gly Thr Tyr Tyr Vai Gin Gin Glu Ser Leu Pro Cvs Gly Phe Gly Gin 65 70 75 80

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 85 90 95

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii ) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ 131

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lvs Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Asn Asp Ala 20 25 30

Ser Asp Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Arg Ile Ser Glv Ser Gly Ser 35 40 ' 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly 65 70 75 80

Gly Thr Lys Vai Glu Ile Arg Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 85 90 95

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100

Lisboa, 5 de Junho de 2012 132

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao TNFa humano ou uma porção de ligação a antigénio do referido anticorpo, em que o referido anticorpo: a) reduz a ligação do TNFa humano a um receptor do TNFa humano; b) compreende uma cadeia pesada IgG2 humana; c) compreende uma cadeia leve kapa humana; e d) liga-se ao TNFa humano com: i) uma KD menor do que 2 x 1CT10 M; ii) uma Ka maior do que 0,5 x 101 2 3 M_1S_1; ou iii) uma KD menor do que 2 x 10~10 M e uma Ka maior do que 0,5 x 102 M_1S_1;
2. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KD menor do que 2 x IO-10 M.
3. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma Ka maior do que 0,5 x 102 M_1S_1.
4. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KD de 1, 89-8, 06 x 10~10 M. 1 1 Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a 2 reivindicação 3, em que o anticorpo ou a porção de ligação a 3 antigénio se liga ao TNFa com uma KA de 1,2-5,3 x 109M_1. 6. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KA de 1,2-3,9 x ΙΟ9 ΝΓ1. 7 . Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma KD menor do que 2 x 1(Γ10 M e uma Ka maior do que 0,5 x 106 M'1S_1.
8. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-7, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma Ka de 1,6-2,9 x 106 M_1S_1.
9. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-7, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio se liga ao TNFa com uma Ka maior do que 2 x 106 M_1S_1.
10. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que o referido anticorpo é monoclonal.
11. Utilização do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 na preparação de um medicamento.
12. Utilização do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença humana crónica ou recorrente, tais como inflamação, autoimunidade e cancro. 2 13. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para a utilização como um medicamento.
14. Anticorpo ou porção de ligação a antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização no tratamento de uma doença humana crónica ou recorrente, tais como inflamação, autoimunidade e cancro.
15. Método in vitro para reduzir a ligação do TNFa humano a um receptor do TNFa humano compreendendo o passo de contacto do TNFa humano com o anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
16. Método para produzir o anticorpo humano isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, compreendendo os passos de: (a) imunização de um murganho transgénico capaz de expressar um anticorpo totalmente humano para um antigénio de interesse, com TNFa humano; e (b) isolar o anticorpo humano.
17. Célula que expressa anticorpo, derivada de um murganho transgénico imunizado pelo método de acordo com a reivindicação 16.
18. Célula que expressa anticorpo de acordo com a reivindicação 17, em que a referida célula é uma célula imortalizada.
19. Molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando um ou mais polipéptido(s) seleccionado(s) do grupo consistindo de: 3 (a) a cadeia pesada do anticorpo humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10; (b) a cadeia leve do anticorpo humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10; e (c) uma porção de ligação a antigénio de (a) ou (b).
20. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 19.
21. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 19 ou o vector de acordo com a reivindicação 20.
22. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 21, em que a célula hospedeira compreende: (a) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando a cadeia pesada do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 ou de uma sua porção de ligação a antigénio; e (b) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando a cadeia leve do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 ou de uma sua porção de ligação a antigénio.
23. Método para a produção do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, compreendendo os passos de cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22 e recuperação do anticorpo. Lisboa, 5 de Junho de 2012 4