CN103097412B - 抗人呼吸道合胞病毒(rsv)抗体以及使用方法 - Google Patents

抗人呼吸道合胞病毒(rsv)抗体以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供免疫特异性地结合呼吸道合胞病毒(RSV)的融合(F)蛋白的抗体或其抗原结合片段。本文还提供用于预防、治疗和诊断病毒感染和/或治疗RSV介导的疾病的一种或多种症状的方法。本文还提供产生免疫特异性地结合RSV F蛋白的抗体的方法。

Description

抗人呼吸道合胞病毒(RSV)抗体以及使用方法
相关申请
要求于2010年7月9日提交的Robert Anthony Williamson、Jehangir Wadia、Gabriel Pascual、Elissa Keogh的题为“针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体以及使用方法”的美国临时申请编号61/399,310以及于2010年11月5日提交的Robert AnthonyWilliamson、Jehangir Wadia、Gabriel Pascual和Elissa Keogh的题为“抗人呼吸道合胞病毒(RSV)抗体以及使用方法”的美国临时申请编号61/456,454的优先权。上文所引用的每个申请的主题整体援引加入本文。
本申请涉及2010年8月13日提交的公开为US-2011-0076268 A1并且题为“针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体以及使用方法”的美国申请编号12/806,498以及2010年8月13日提交的公开为国际PCT申请号WO 2011/020079并且题为“针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体以及使用方法”的国际申请号PCT/US10/045549，两者均要求于2009年8月13日提交的题为“针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体以及使用方法”的美国临时申请编号61/274,395的优先权。
上文所引用的每个申请的主题整体援引加入本文。
援引加入电子提供的序列表
与本申请一起提交序列表的电子版，其内容整体援引加入本文。该电子文件的大小为458千字节，并且题为1161seq.PC1.txt。
技术领域
提供了免疫特异性地结合呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白和/或免疫特异性地结合RSV和/或中和RSV的抗体及其抗原结合片段。还提供了采用抗RSV抗体及其抗原结合片段的诊断和治疗方法。所述治疗方法包括施用所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用于预防或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状，例如婴儿中的感染以及与器官移植相关的感染。本文所提供的多种不同抗RSV抗体及其抗原结合片段的组合和/或与其他抗RSV抗体及其抗原结合片段的组合可以用于联合治疗。还提供了含有抗RSV抗体及其抗原结合片段的混合物的组合物。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿和幼儿中严重呼吸道疾病的重要原因，并且是婴儿细支气管炎的主要原因(Welliver(2003)J Pediatr143:S112)。估计全世界6.4×107例呼吸道疾病和160,000例死亡可归因于RSV诱导的疾病。仅在美国，数万婴儿住院是由于副粘病毒感染，例如RSV和副流感病毒(PIV)(Shay et al.(1999)JAMA 282:1440-1446)。严重RSV感染最常发生在儿童和婴儿中，特别是早产儿。诸如慢性肺疾病或先天性心脏病的潜在的健康问题可以显著增加严重疾病的风险。RSV感染还可以在老人、患有慢性肺疾病的个体和免疫低下的成人(例如骨髓移植接受者)中引起严重疾病。
已研究预防和治疗RSV感染的几种方法，包括疫苗开发、抗病毒化合物(利巴韦林)、反义药物、RNA干扰技术以及抗体产品，例如免疫球蛋白或静脉注射单克隆抗体。分离自供体的静脉注射免疫球蛋白(RSV-IGIV;RespiGam)和单克隆抗体帕利珠单抗(SYNAGISTM)已被批准用于高风险儿童中的RSV预防。然而，尚没有RSV的疫苗或可商购的治疗。仅利巴韦林被批准用于治疗RSV感染。由于其低特异性，需要高剂量、频繁施用和/或大量抗体产品(例如RSV-IG和帕利珠单抗)来有效治疗RSV感染。而且，诸如静脉注射免疫球蛋白的产品的使用取决于供体可用性。因此，需要用于预防或治疗RSV感染的其他物质。
发明内容
本文提供用于预防和治疗呼吸道合胞病毒(RSV)感染以及RSV介导的疾病或疾病状况的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。本文还提供用于诊断和/或监测RSV感染的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。本文提供免疫特异性地结合并中和RSV的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，当本文所提供的多肽包含在抗体或抗原结合片段中时，本文所提供的多肽免疫特异性地结合并中和RSV。本文还提供含有本文所提供的多肽的抗体和抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地结合并中和RSV。本文所提供的多肽、抗体和抗原结合片段可以特异性结合F蛋白以及中和RSV。本文提供可以中和RSV A和B亚型的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。本文提供免疫特异性地结合RSV的F蛋白的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。
本文提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:405、411、417、423、429、437-441、458、464、470或482-484所示的氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:405、411、417、423、429、437-441、458、464、470或482-484具有至少或至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的氨基酸序列的VHCDR1；具有SEQ ID NO:406、412、418、424、430、459、465或471所示的氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:406、412、418、424、430、459、465或471具有至少或至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的氨基酸序列的VH CDR2；具有SEQ IDNO:407、413、419、425、431、460、466或472所示的氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:407、413、419、425、431、460、466或472具有至少或至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的氨基酸序列的VH CDR3；具有SEQ ID NO:408、414、420、426、432、461、467或473所示的氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:408、414、420、426、432、461、467或473具有至少或至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的氨基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO:409、415、421、427、433、462、468或474所示的氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:409、415、421、427、433、462、468或474具有至少或至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的氨基酸序列的VL CDR2；以及具有SEQ ID NO:410、416、422、428、434、463、469或475所示的氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:410、416、422、428、434、463、469或475具有至少或至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的氨基酸序列的VL CDR3，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白和/或中和RSV。
具体地，本文提供包含SEQ ID NO:405或437所示的VHCDR1、SEQ ID NO:406所示的VHCDR2、SEQ ID NO:407所示的VHCDR3、SEQ ID NO:408所示的VLCDR1、SEQ ID NO:409所示的VLCDR2和SEQ ID NO:410所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:405-410或437中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:464或483所示的VHCDR1、SEQ ID NO:465所示的VHCDR2、SEQ ID NO:466所示的VHCDR3、SEQ ID NO:467所示的VLCDR1、SEQ ID NO:468所示的VLCDR2和SEQ ID NO:469所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:464-469或483中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:411或438所示的VHCDR1、SEQ ID NO:412所示的VHCDR2、SEQ ID NO:413所示的VHCDR3、SEQ ID NO:414所示的VLCDR1、SEQ ID NO:415所示的VLCDR2和SEQ ID NO:416所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:411-416或438中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:417或439所示的VHCDR1、SEQ ID NO:418所示的VHCDR2、SEQ ID NO:419所示的VHCDR3、SEQ ID NO:420所示的VLCDR1、SEQ ID NO:421所示的VLCDR2和SEQ ID NO:422所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:417-422或439中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:423或440所示的VHCDR1、SEQ ID NO:424所示的VHCDR2、SEQ ID NO:425所示的VHCDR3、SEQ ID NO:426所示的VLCDR1、SEQ ID NO:427所示的VLCDR2和SEQ ID NO:428所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:423-428或440中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:429或441所示的VHCDR1、SEQ ID NO:430所示的VHCDR2、SEQ ID NO:431所示的VHCDR3、SEQ ID NO:432所示的VLCDR1、SEQ ID NO:433所示的VLCDR2和SEQ ID NO:434所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:429-434或441中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:458或482所示的VHCDR1、SEQ ID NO:459所示的VHCDR2、SEQ ID NO:460所示的VHCDR3、SEQ ID NO:461所示的VLCDR1、SEQ ID NO:462所示的VLCDR2和SEQ ID NO:463所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:458-463或482中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
本文还提供包含SEQ ID NO:470或484所示的VHCDR1、SEQ ID NO:471所示的VHCDR2、SEQ ID NO:472所示的VHCDR3、SEQ ID NO:473所示的VLCDR1、SEQ ID NO:474所示的VLCDR2和SEQ ID NO:475所示的VLCDR3的抗体，或者包含与SEQ ID NO:470-475或484中任一个具有至少或约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的CDR的抗体。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:396所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:396的氨基酸1-121所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:395所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:395的氨基酸1-110所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为30D8。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:396所示的重链和SEQID NO:395所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:405或437所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:406所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:407所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:408所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:409所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:410所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:398所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:398的氨基酸1-125所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:397所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:397的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为104E5。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:398所示的重链和SEQID NO:397所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:411或438所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:412所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:413所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:414所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:415所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:416所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:400所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:400的氨基酸1-124所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:399所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:399的氨基酸1-108所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为38F10。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:400所示的重链和SEQID NO:399所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:417或439所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:418所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:419所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:420所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:421所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:422所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:402所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:402的氨基酸1-125所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:401所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:401的氨基酸1-113所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为14G3。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:402所示的重链和SEQID NO:401所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:423或440所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:424所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:425所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:426所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:427所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:428所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:404所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:404的氨基酸1-123所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:403所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:403的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为90D3。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:404所示的重链和SEQID NO:403所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:429或441所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:430所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:431所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:432所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:433所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:434所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:452所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:452的氨基酸1-124所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:453所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:453的氨基酸1-111所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为56E11。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:452所示的重链和SEQID NO:453所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:458或482所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:459所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:460所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:461所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:462所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:463所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:454所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:454的氨基酸1-133所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:455所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:455的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为17C9。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:454所示的重链和SEQID NO:455所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:464或483所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:465所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:466所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:467所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:468所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:469所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:456所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域具有如SEQ ID NO:456的氨基酸1-118所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:457所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域具有如SEQ ID NO:457的氨基酸1-109所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为69F6。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:456所示的重链和SEQID NO:457所示的轻链的抗体或抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其具有SEQ ID NO:470或484所示的氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:471所示的氨基酸序列；以及VH CDR3，其具有SEQ ID NO:472所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VLCDR1，其具有SEQ ID NO:473所示的氨基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO:474所示的氨基酸序列；以及VL CDR3，其具有SEQ ID NO:475所示的氨基酸序列。
本文提供包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链的分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地与包含SEQ ID NO:396、398、400、402、404、452、454或456所示的重链以及SEQ ID NO:395、397、399、401、403、453、455或457所示的轻链的抗体或其抗原结合片段结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH互补决定区1(CDR1)，所述VH互补决定区1(CDR1)具有SEQ ID NO:405、411、417、423、429、437-441、458、464、470或482-484所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH CDR2，所述VH CDR2具有SEQ ID NO:406、412、418、424、430、459、465或471所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH CDR3，所述VH CDR3具有SEQ ID NO:407、413、419、425、431、460、466或472所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL CDR1，所述VL CDR1具有SEQID NO:408、414、420、426、432、461、467或473所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL CDR2，所述VL CDR2具有SEQ ID NO:409、415、421、427、433、462、468或474所示的氨基酸序列。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL CDR3，所述VL CDR3具有SEQ ID NO:410、416、422、428、434、463、469或475所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其中所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:405、411、417、423、429、437-441、458、464、470或482-484所示；VH CDR2，其中所述VH CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:406、412、418、424、430、459、465或471所示；以及VH CDR3，其中所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:407、413、419、425、431、460、466或472所示。在一些实例中，本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含：VL CDR1，其中所述VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:408、414、420、426、432、461、467或473所示；VL CDR2，其中所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:409、415、421、427、433、462、468或474所示；以及VL CDR3，其中所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:410、416、422、428、434、463、469或475所示。
本文提供免疫特异性地结合RSV F蛋白的一部分的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段，所述部分具有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
本文提供包含抗原结合结构域的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段，其为人或人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，本文所提供的分离的多肽、抗体或抗原结合片段为嵌合抗体。在一些实例中，所述分离的多肽、抗体或抗原结合片段为单链Fv(scFv)、Fab、Fab′、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体(diabody)、Fd或Fd’片段。在一些实例中，本文所提供的分离的多肽、抗体或抗原结合片段包含肽接头。在一些实例中，所述肽接头包含约1-约50个氨基酸。
在一些实例中，本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段缀合至聚乙二醇(PEG)。在一些实例中，本文所提供的分离的多肽、抗体或抗原结合片段包含治疗剂或诊断剂。示例性诊断剂包括但不限于酶、荧光化合物、电子转移剂和放射性标记。
本文提供包含蛋白转导结构域的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述蛋白转导结构域选自具有SEQ ID NO:284-355所示的氨基酸序列的肽。在一些实例中，所述蛋白转导结构域为HIV-TAT蛋白转导结构域。
本文提供多价抗体，所述多价抗体包含：第一抗原结合部分，其包含缀合至多聚化结构域的本文所提供的多肽、抗体或其抗原结合片段；以及第二抗原结合部分，其包含缀合至第二多聚化结构域的抗病毒抗体的抗原结合片段。在这类实例中，所述第一多聚化结构域与所述第二多聚化结构域是互补的或相同的，从而所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分形成多价抗体。在一些实例中，本文所提供的多价抗体包含1、2、3、4或5个额外的抗原结合部分。示例性多价抗体包括二价、三价、四价、五价、六价或七价抗体。本文所提供的多价抗体包括异二价(heterobivalent)或同二价(homobivalent)抗体。本文所提供的多价抗体包括多特异性抗体。在一些实例中，所述多特异性抗体为双特异性、三特异性或四特异性抗体。在一些实例中，本文所提供的多价抗体包含抗原结合片段，所述抗原结合片段为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。本文所提供的多价抗体的第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分可以通过共价或非共价键缀合至多聚化结构域。在一些实例中，所述抗原结合部分通过接头(例如化学接头或多肽接头)缀合至所述多聚化结构域。一些实例中，本文所提供的多价抗体的多聚化结构域选自免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补疏水区、互补亲水区或相容的蛋白-蛋白相互作用结构域。在一些实例中，所述Fc结构域为IgG、IgM或IgE Fc结构域。
在一些实例中，本文所提供的多价抗体包含两个或更多个抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一具体实例中，本文所提供的多价抗体包含两个或更多个抗RSV抗体或其抗原结合片段。
本文提供多价抗体，所述多价抗体包含：第一抗原结合部分，其包含缀合至多聚化结构域的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段；以及第二抗原结合部分，其包含缀合至第二多聚化结构域的选自帕利珠单抗、莫他珠单抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L 1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
本文提供多价抗体，所述多价抗体包含：第一抗原结合部分，其包含缀合至多聚化结构域的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段；以及第二抗原结合部分，其包含缀合至第二多聚化结构域的抗病毒抗体，所述抗病毒抗体免疫特异性地结合副流感病毒(PIV)抗原或人偏肺病毒(hMPV)抗原。
本文提供组合，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段或者本文所提供的多价抗体，以及抗病毒剂。在一些实例中，所述抗病毒剂为利巴韦林。本文提供组合，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段和抗病毒剂，所述分离的多肽、抗体或其抗原结合片段和抗病毒剂配制为单一组合物或分离的组合物。
本文提供组合，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段或者本文所提供的多价抗体，以及一种或多种额外的抗病毒抗体。在一些实例中，所述组合包含两种或更多种不同的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述组合包含两种或更多种不同的选自本文所提供的抗体或抗原结合片段的抗RSV抗体或抗原结合片段。在一些实例中，所述组合包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段以及选自帕利珠单抗、莫他珠单抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段的抗体。在一些实例中，所述组合包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段以及选自免疫特异性地结合副流感病毒(PIV)抗原或人偏肺病毒(hMPV)抗原的抗体或其抗原结合片段的抗体。在一些实例中，所述PIV抗原为人PIV 1型、人PIV 2型、人PIV 3型和/或人PIV 4型的抗原。在一些实例中，所述PIV抗原选自PIV核衣壳磷蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋白、PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D蛋白、PIV C蛋白以及它们的等位变体。在一些实例中，所述hMPV抗原为hMPV A型或hMPV B型的抗原。在一些实例中，所述hM PV抗原为hMPV A1亚型、hMPV A2亚型、hMPV B1亚型或hMPV B2亚型的抗原。在一些实例中，所述hM PV抗原选自hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水蛋白、hMPV RNA依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白以及它们的等位变体。
本文提供组合，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段或者本文所提供的多价抗体，以及一种或多种额外的抗病毒抗体，其中所述一种或多种额外的抗病毒抗体为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。
本文提供药物组合物，其包含本文所提供的任何分离的多肽、抗体或其抗原结合片段，本文所提供的任何多价抗体，或者本文所提供的任何组合以及药学可接受的载体或赋形剂。在一些实例中，本文所提供的药物组合物配制为凝胶剂、软膏剂、液体制剂、混悬剂、气雾剂、片剂、丸剂、散剂或鼻腔喷雾剂。在一些实例中，配制本文所提供的药物组合物用于肺部、鼻内或肠胃外施用。在一些实例中，配制本文所提供的药物组合物用于单剂量施用。在一些实例中，配制本文所提供的药物组合物用于缓释。
本文提供药物组合物，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段或者本文所提供的多价抗体，以及一种或多种额外的抗病毒抗体。在一些实例中，所述药物组合物包含两种或更多种不同的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述药物组合物包含两种或更多种不同的选自本文所提供的抗体或抗原结合片段的抗RSV抗体或抗原结合片段。在一些实例中，所述药物组合物包含本文所提供的抗体或抗原结合片段以及选自帕利珠单抗、莫他珠单抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段的抗体。在一些实例中，所述药物组合物包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段以及选自免疫特异性地结合副流感病毒(PIV)抗原或人偏肺病毒(hMPV)抗原的抗体或其抗原结合片段的抗体。在一些实例中，所述PIV抗原为人PIV1型、人PIV 2型、人PIV 3型和/或人PIV 4型的抗原。在一些实例中，所述PIV抗原选自PIV核衣壳磷蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋白、PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D蛋白、PIV C蛋白以及它们的等位变体。在一些实例中，所述hMPV抗原为hMPV A型或hMPV B型的抗原。在一些实例中，所述hMPV抗原为hMPV A1亚型、hMPV A2亚型、hMPV B1亚型或hMPV B2亚型的抗原。在一些实例中，所述hMPV抗原选自hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水蛋白、hMPV RNA依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白以及它们的等位变体。
本文提供药物组合物，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或抗原结合片段或者本文所提供的多价抗体，以及一种或多种额外的抗病毒抗体，其中所述一种或多种额外的抗病毒抗体为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。
本文提供药物组合物，其包含本文所提供的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段或者本文所提供的多价抗体，以及抗病毒剂。在一些实例中，所述抗病毒剂为利巴韦林。
本文提供治疗对象中的病毒感染的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物。本文提供治疗或抑制对象中的病毒感染的一种或多种症状的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物。本文还提供预防对象中的病毒感染的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物。在一具体实例中，所述病毒感染为RSV感染。在一具体实例中，所述RSV感染为上呼吸道感染。
可以通过任何合适的途径进行施用，包括但不限于体表(topically)、肠胃外、局部或全身，例如鼻内、肌肉内、皮内、腹腔内、静脉内、皮下、口服施用，或者通过肺部施用。在一些实例中，通过雾化吸入器或吸入器施用本文所提供的药物组合物。可以将本文所提供的药物组合物施用于任何合适的对象，例如哺乳动物，如人。
在一些实例中，将本文所提供的药物组合物施用于人类婴儿，早产或有为RSV感染住院的风险的人类婴儿，老年人，患有囊性纤维化、支气管肺发育不良、先天性心脏病、先天性免疫缺陷、获得性免疫缺陷、白血病或非霍奇金淋巴瘤的人类对象，或者具有移植物(例如骨髓移植物或肝移植物)的人类对象。
在一些实例中，在RSV季节(例如，10月至5月)期间施用本文所提供的药物组合物1次、2次、3次、4次或5次。在一些实例中，在RSV季节之前1个月、2个月或3个月内施用本文所提供的药物组合物1次、2次、3次、4次或5次。
在一些实例中，本文所提供的药物组合物可以与一种或多种抗病毒剂一起施用。在一些实例中，所述抗病毒剂为利巴韦林。在一些实例中，所述药物组合物与所述抗病毒剂配制为单一组合物或分离的组合物。在本文所提供的方法中，所述药物组合物与所述抗病毒剂可以顺序、同时或间歇施用。
在一些实例中，本文所提供的药物组合物可以与激素治疗、免疫治疗或抗炎剂一起施用。在一些实例中，本文所提供的药物组合物可以与一种或多种额外的抗病毒抗体或其抗原结合片段一起施用。所述药物组合物与所述一种或多种额外的抗病毒抗体配制为单一组合物或分离的组合物。所述药物组合物与所述一种或多种额外的抗RSV抗体可以顺序、同时或间歇施用。在一些实例中，所述抗原结合片段为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。
在一些实例中，本文所提供的药物组合物可以与一种或多种额外的抗病毒抗体一起施用，所述抗病毒抗体选自抗RSV抗体或其抗原结合片段，例如帕利珠单抗、莫他珠单抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段。
在一些实例中，本文所提供的药物组合物可以与一种或多种额外的抗病毒抗体一起施用，所述抗病毒抗体选自免疫特异性地结合副流感病毒(PIV)抗原或人偏肺病毒(hMPV)抗原的抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述PIV抗原为人PIV 1型、人PIV 2型、人PIV 3型和/或人PIV 4型的抗原。在一些实例中，所述PIV抗原选自PIV核衣壳磷蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋白、PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D蛋白、PIV C蛋白以及它们的等位变体。在一些实例中，所述hMPV抗原为hMPV A型或hMPV B型的抗原。在一些实例中，所述hMPV抗原为hMPV A1亚型、hMPV A2亚型、hMPV B1亚型或hMPV B2亚型的抗原。在一些实例中，所述hMPV抗原选自hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水蛋白、hMPV RNA依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白以及它们的等位变体。
本文提供检测RSV感染的方法，其包括(a)利用本文所提供的抗体或其抗原结合片段测定流体、细胞或组织样品中的RSV抗原水平；(b)将所测定RSV抗原水平与对照水平比较，其中与RSV抗原的对照水平相比，所测定的RSV抗原水平的提高代表RSV感染。在一些实例中，所述细胞或组织样品获得自人类对象。在一些实例中，所述细胞或组织样品为血液、尿、唾液、肺痰、灌洗或淋巴样品。
本文提供分离的核酸，其编码本文所提供的多肽、抗体或其抗原结合片段。本文提供载体，其包含编码本文所提供的多肽、抗体或其抗原结合片段的核酸。
本文提供分离的细胞，其包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的核酸或者本文所提供的载体。本文所提供的细胞可以为例如原核细胞或真核细胞。本文还提供转基因动物，其包含本文所提供的核酸或本文所提供的载体。本文还提供表达分离的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达所编码的抗体的条件下培养本文所提供的分离的细胞或者通过从本文所提供的转基因动物分离所述抗体或抗原结合片段。在一些实例中，所述抗体或抗原结合片段分离自所述转基因动物的血清或乳汁。
本文提供试剂盒，其包含在一个或多个容器中的本文所提供的多肽、抗体或抗原结合片段，本文所提供的多价抗体，或者本文所提供的组合，以及使用说明。
本文还提供本文所提供的抗体或其抗原结合片段用于预防对象中的病毒感染的用途。本文还提供本文所提供的抗体或其抗原结合片段用于治疗对象中的病毒感染的用途。本文还提供本文所提供的抗体或其抗原结合片段用于治疗或抑制对象中的病毒感染的一种或多种症状的用途。
本文还提供本文所提供的抗体或抗原结合片段在配制预防对象中的病毒感染的药物中的用途。本文还提供本文所提供的抗体或抗原结合片段在配制治疗对象中的病毒感染的药物中的用途。本文还提供本文所提供的抗体或抗原结合片段在配制治疗或抑制对象中的病毒感染的一种或多种症状的药物中的用途。
本文提供抗RSV中和抗体或其抗原结合片段，其中在所述抗体或其抗原结合片段的存在下，RSV在超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多轮病毒复制后不产生逃脱所述抗体或其抗原结合片段中和的病毒。本文还提供抗RSV中和抗体或其抗原结合片段，其中在所述抗体或其抗原结合片段的存在下，RSV在多达20轮病毒复制后不产生逃脱所述抗体或其抗原结合片段中和的病毒。在一些实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段特异性地与称为30D8的抗体结合相同表位。在其他实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段称为30D8。在一些实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段特异性地结合RSV F蛋白。在其他实例中，所述抗RSV抗体或抗原结合片段为Fab或scFv。
附图说明
图1：图1为预融(prefusion)构象的RSV F蛋白的3D模型。实施例12中鉴定为对抗体58C5的结合很重要的氨基酸残基以黑色的空间填充模型显示。当所述残基展示在预融RSV F蛋白的3D模型上时，它们聚集在尖刺(spike)的受限区域并说明抗体58C5的抗体足迹。
图2：图2示出预融和融后(postfusion)构象的RSV F蛋白D3区的3D模型X-射线结构，所述RSV F蛋白D3区包含对抗体58C5的结合很重要的RSV F蛋白残基。如图2所示，对抗体58C5的结合很重要的残基仅在预融模型中聚集。在融后模型中，所述残基分布在大面积的蛋白表面中。
图3：图3为预融构象的RSV F蛋白的3D模型。实施例12中鉴定为对抗体30D8的结合很重要的氨基酸残基以黑色的空间填充模型显示。所述残基聚集在茎/梗区上的棒棒糖(lollipop)的基部的D1结构域中。
具体实施方式
提纲
A.定义
B.综述
1.呼吸道合胞病毒
C.抗RSV抗体
1.一般抗体结构和功能结构域
a.抗体的结构和功能结构域
b.抗体片段
2.示例性抗RSV抗体
a.衍生抗体
i.单链抗体
ii.抗独特型抗体
iii.多特异性抗体和抗体多聚化
D.抗RSV抗体的额外修饰
1.降低免疫原性的修饰
2.Fc修饰
3.聚乙二醇化
4.可检测部分的缀合
5.治疗性部分的缀合
6.提高结合特异性的修饰
E.分离抗RSV抗体的方法
F.制备抗RSV抗体及其修饰或变体形式以及编码抗体的核酸的方法
1.核酸
2.载体
3.细胞表达系统
a.原核表达
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
4.抗体的纯化
G.评价RSV抗体特性和活性
1.结合测定
4.用于评价抗RSV抗体的效力的体内动物模型
H.诊断用途
1.病原感染的体外检测
2.病原感染的体内检测
3.监测感染
I.预防和治疗用途
1.治疗对象
2.剂量
3.施用途径
4.联合治疗
a.用于联合治疗的抗病毒抗体
i.抗RSV抗体
ii.抗其他呼吸道病毒的抗体
5.基因治疗
J.药物组合物、组合和制成品/试剂盒
1.药物组合物
2.制成品/试剂盒
3.组合
K.实施例
A.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的意义。除非另有说明，整个公开中提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站和其他公开的材料整体援引加入本文。如果本文的术语有多种定义，则以本节中的定义为准。当提及URL或者其他这样的标识符或地址时，应当理解这类标识符可以改变，并且在网络上特定的信息可以交流，但是通过搜索网络可以找到等同的信息。对其引用证明这类信息的可得性和公开传播。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例如抗RSV抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003);Chapter 1;p3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。
如本文所用，“治疗性抗体”指为了治疗包括人在内的动物而施用的任何抗体或其抗原结合片段。这类抗体可以通过任何已知的用于制备多肽的方法来制备，并且因此包括但不限于重组产生的抗体、合成产生的抗体以及提取自细胞或组织和其他来源的治疗性抗体。在分离自任何来源或制备时，治疗性抗体可以是长度异质的或者翻译后修饰不同，例如糖基化(即糖含量)不同。治疗性抗体的异质性也可以不同，取决于所述治疗性抗体的来源。因此，提及治疗性抗体时指制备或分离的异质群体。当预期同质制品时，其会被这样陈述。适当地，本文中提及治疗性抗体是关于它们的单体、二聚体、或其他多聚体形式。
如本文所用，“中和抗体”是结合病原体并干扰所述病原体在对象中感染细胞和/或引起疾病的能力的任何抗体或其抗原结合片段。中和抗体的实例为结合病毒、细菌和真菌病原体的中和抗体。典型地，本文所提供的中和抗体结合所述病原体的表面。在所述病原体为病毒的实例中，结合所述病毒的中和抗体典型地结合所述病毒表面上的蛋白。根据所述病毒的类别，所述表面蛋白可以是衣壳蛋白(例如无包膜病毒的衣壳蛋白)或病毒包膜蛋白(例如，包膜病毒的病毒包膜蛋白)。在一些实例中，所述蛋白为糖蛋白。例如所述病毒抑制病毒感染性的能力可以通过体外中和测定来测量，例如利用非洲绿猴肾细胞(Vero)宿主细胞的空斑减少测定。
如本文所用，“包膜病毒”是具有外膜或包膜的动物病毒，所述外膜或包膜是围绕病毒衣壳的包含病毒蛋白的脂双层。病毒的包膜蛋白参与感染性颗粒的装配，并且还涉及病毒进入，其通过结合存在于宿主细胞上的受体并诱导病毒包膜与宿主细胞膜之间的融合。包膜病毒可以是球形或丝状(杆状)的。示例性包膜病毒包括但不限于疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)以及波纳病毒科(Bornaviridae)的成员。呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科、肺病毒亚科(Pneumovirinae)的负义单链RNA有包膜病毒。
如本文所用，“无包膜病毒”或“裸病毒”是缺少病毒包膜的病毒。为了感染宿主细胞，无包膜病毒使用病毒衣壳的蛋白附着至靶细胞。示例性无包膜病毒包括但不限于腺病毒科(Adenoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomavirinae)、细小病毒科(Parvoviridae)、多瘤病毒科(Polyomavirinae)、圆环病毒科(Circoviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)以及星状病毒科(Astroviridae)。
如本文所用，病原体的“表面蛋白”是位于所述病原体的外表面上的任何蛋白。所述表面蛋白可以部分或全部暴露于外部环境(即外表面)。表面蛋白的实例为膜蛋白，例如位于病毒包膜或细菌外膜表面上的蛋白(例如，膜糖蛋白)。膜蛋白可以是跨膜蛋白(即穿越脂双层的蛋白)或非跨膜细胞表面相关蛋白(例如，锚定或共价连接至膜表面，如附着至所述病原体表面上的另一蛋白)。其他示例性表面蛋白包括至少部分暴露于外部环境的无包膜包膜病毒的病毒衣壳蛋白。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917;和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标示为L和L’)和两个抗体结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的人抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，Fv抗体片段由通过非共价相互作用连接的一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链(VL)结构域组成。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fd片段是包含抗体重链的可变结构域(VH)和一个恒定区结构域(CH1)的抗体片段。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，Fd’片段是包含F(ab’)2片段的一个重链部分的抗体片段。
如本文所用，Fv’片段是仅包含抗体分子的VH和VL结构域的片段。
如本文所用，hsFv指抗体片段，其中正常存在于Fab片段中的恒定结构域已用异二聚卷曲螺旋结构域取代(参见，例如，Arndt et al.(2001)J Mol Biol.7:312:221-228)。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
如本文所用，术语“衍生物”指包含抗RSV抗体或其片段的氨基酸序列的多肽，其已例如通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加，通过将任何类型的分子共价连接指所述多肽(例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连接至细胞配体或其他蛋白)来修饰。抗RSV抗体或其抗原结合片段的衍生物可以利用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化。而且，抗RSV抗体或其抗原结合片段的衍生物可以包含一个或多个非经典氨基酸。通常，多肽衍生物具有与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段相似或相同的功能(例如中和RSV)。
如本文所用，当指抗体片段来源于另一抗体时，例如单克隆抗体，短语“来源于”指保留原抗体的结合特异性的抗体片段(例如，Fab、F(ab′)、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段)的工程化。这类片段可以通过本领域已知的各种方法获得，包括但不限于酶促切割、化学交联、重组方法或者它们的组合。通常，衍生的抗体片段享有相同或基本上相同的亲本抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，从而抗体片段与亲本抗体结合相同的表位。
如本文所用，“亲本抗体”或“源抗体”指抗体片段(例如，Fab、F(ab′)、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段)所来自的抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，嵌合多肽指包含来自至少两个不同多肽的部分或者来自单个多肽的两个不连续部分的多肽。因此，嵌合多肽一般包括来自一个多肽的全部或部分的氨基酸残基序列以及来自另一不同多肽的全部或部分的氨基酸序列。这两部分可以直接或间接连接，并且可以通过肽键、其他共价键或者在平衡条件和生理条件下(例如在等渗pH7缓冲盐水中)有足够强度以维持该嵌合多肽的主要部分的完整性的其他非共价相互作用来连接。为了本文的目的，嵌合多肽包括含有连接至另一多肽(例如，多聚化结构域、异源免疫球蛋白恒定结构域或框架区、或者诊断性或治疗性多肽)的全部或部分抗RSV抗体的嵌合多肽。
如本文所用，融合蛋白是工程化以包含对应于两种不同多肽的氨基酸序列的多肽，例如通过从载体表达所述融合蛋白来将这两种不同多肽连接在一起，所述载体包含沿载体长度互相靠近(例如相邻)的编码这两种多肽的两种核酸。通常，本文所提供的融合蛋白指这样的多肽，其包含具有抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的多肽以及具有异源多肽或肽(例如，诊断性或治疗性多肽)的氨基酸序列的多肽或肽。相应地，融合蛋白指包含通过肽键直接或间接连接的来自两种或更多种蛋白或肽的两个或更多个部分的嵌合蛋白。这两个分子可以在构建体中相邻或者通过接头或间隔多肽来分开。间隔区可以编码改变所述多肽的特性(例如溶解性或胞内运输)的多肽。
如本文所用，“接头”或“间隔”肽指连接两个多肽序列的短氨基酸序列(或者编码这样的氨基酸序列的核酸)。“肽接头”指连接两个多肽序列的短氨基酸序列。多肽接头的实例是将肽转导结构域连接至抗体的接头或者连接合成抗体片段(例如scFv片段)中的两条抗体链的接头。接头是公知的，并且任何已知的接头可以用于所提供的方法。多肽接头的实例是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n氨基酸序列。其他示例性接头如本文所述；任何这些和其他已知的接头可以用于所提供的组合物和方法。
如本文所用，“抗体铰链区”或“铰链区”指天然存在于γ、δ和α抗体同种型的重链中CH1和CH2结构域之间的与其他抗体结构域没有同源性的多肽区。这个区富含脯氨酸残基，并且赋予IgG、IgD和IgA抗体柔性，允许Fab部分的两个“臂”(每个包含一个抗体结合位点)移动，在它们结合抗原时相对呈现各种角度。这种柔性允许Fab臂移动以便将抗体结合位点排列至与细胞表面上的表位或其他抗原相互作用。铰链区内的两个链间二硫键稳定两条重链之间的相互作用。在本文所提供的一些实施方案中，合成产生的抗体片段包含一个或多个铰链区，例如，以通过两条抗体链之间的相互作用提高稳定性。铰链区是二聚化结构域的实例。
如本文所用，双抗体是二聚体scFv；双抗体通常具有比scFv短的肽接头，并且优选二聚化。
如本文所用，人源化抗体指修饰以包括“人”氨基酸序列的抗体，从而施用于人而不引起免疫应答。人源化抗体通常包含来源于非人物种免疫球蛋白的互补决定区(CDR)以及主要来源于人免疫球蛋白的抗体分子的剩余部分。用于制备这类抗体的方法是已知的。例如，可以通过重组DNA技术改变编码单克隆抗体的DNA以编码其中非可变区的氨基酸组成是基于人抗体的抗体。鉴定这类区域的方法是已知的，包括设计用于鉴别免疫球蛋白的可变区和非可变区的计算机程序。
如本文所用，独特型指免疫球蛋白分子可变区特异性的一组一种或多种抗原决定簇。
如本文所用，抗独特型抗体指针对抗体或T细胞受体序列的抗原特异性部分的抗体。原理上抗独特型抗体抑制特异性免疫应答。
如本文所用，Ig结构域是本领域技术人员这样识别的结构域，其通过称为免疫球蛋白(Ig)折叠的结构来鉴别，所述免疫球蛋白(Ig)折叠包含两个β折叠，每个包含通过环连接的氨基酸的反向平行的β链。Ig折叠中的两个β折叠通过疏水相互作用和保守的链内二硫键夹在一起。抗体链内的单个免疫球蛋白结构域可以基于功能来进一步区别。例如，轻链包含一个可变区结构域(VL)和一个恒定区结构域(CL)，而重链包含一个可变区结构域(VH)以及3个或4个恒定区结构域(CH)。每个VL、CL、VH和CH结构域均为免疫球蛋白结构域的实例。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)，CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”、“抗原结合位点(antigen-binding site)”、“抗原结合位点(antigen combining site)”和“抗体结合位点”同义地用来指识别并与同种(cognate)抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补性决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“HV”、“互补性决定区”和“CDR”和“抗体CDR”可交换地用来指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述，本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如，Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序列方面，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域，而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM包含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，抗体的功能区是包含该抗体的至少VH、VL、CH(例如CH1、CH2或CH3)、CL或铰链区结构域或者至少其功能区的部分抗体。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于病毒中。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)病毒抗原或病毒的抗体是以约或1×107M-1或1x108M-1或更大的亲和常数Ka(或者1x10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述病毒抗原(或者至所述病毒中的抗原或者至所述病毒)。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich andMyszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54;Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989)；还参见描述用于计算抗RSV抗体的结合亲和力的示例性SPR和ITC方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，BiaCore2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。免疫特异性地结合病毒抗原(或病毒)的抗体可以相等或较低的结合亲和力结合其他肽、多肽或蛋白或者病毒。通常，本文所提供的免疫特异性地结合RSV F蛋白(或RSV病毒)的抗体或其抗原结合片段不与其他抗原交叉反应，或者以对这类抗原大幅(至少10-100倍)降低的亲和性交叉反应。例如，可以通过免疫测定(如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA))、表面等离子共振或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定免疫特异性地结合特定病毒抗原(例如RSV F蛋白)的抗体或抗原结合片段。免疫特异性地结合RSV F蛋白上的表位的抗体或其抗原结合片段通常是如利用实验技术(例如但不限于免疫测定、表面等离子共振或本领域技术人员已知的其他技术)所测定的，以比结合任何交叉反应表位更高的结合亲和力结合所述表位(存在于所述蛋白或病毒中)的抗体或其抗原结合片段。免疫特异性地结合分离的RSV蛋白(即重组产生的蛋白)，如RSV F蛋白，并不必须表示该抗体会表现出对该病毒相同的免疫特异性结合和/或中和。这类测量和特性是不同的。可以测定抗体或抗原结合片段对病毒或存在于该病毒中的抗原的亲和力。为了本文的目的，当描述亲和力或相关术语时，会鉴定靶，例如分离的蛋白或病毒。
如本文所用，术语“表面等离子共振”指允许例如利用BiaCore系统(GEHealthcare Life Sciences)通过检测生物传感器矩阵内蛋白浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象。
如本文所用，“多价”抗体是包含两个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体包括二价、三价、四价、五价、六价、七价或更高价的抗体。
如本文所用，“单特异性”是包含两个或更多个抗原结合位点的抗体，其中每个抗原结合位点免疫特异性地结合相同表位。
如本文所用，“多特异性”抗体是包含两个或更多个抗原结合位点的抗体，其中至少两个抗原结合位点免疫特异性地结合不同表位。
如本文所用，“双特异性”抗体是包含两个或更多个抗原结合位点并且可以免疫特异性地结合两个不同表位的多特异性抗体。“三特异性”抗体是包含三个或更多个抗原结合位点并且可以免疫特异性地结合三个不同表位的多特异性抗体，“四特异性”抗体是包含四个或更多个抗原结合位点并且可以免疫特异性地结合四个不同表位的多特异性抗体，等等。
如本文所用，“异二价”抗体是包含两个抗原结合位点的双特异性抗体，其中每个抗原结合位点免疫特异性地结合不同表位。
如本文所用，“同二价”抗体是包含两个抗原结合位点的单特异性抗体，其中每个抗原结合位点免疫特异性地结合相同表位。同二价抗体包括但不限于常规全长抗体，工程化或合成的全长抗体，两个相同抗原结合片段的任何聚合物，或者包含相同抗原结合结构域的两个抗原结合片段的任何聚合物。
如本文所用，多聚化结构域指促进多肽分子与一个或多个额外的多肽分子的稳定相互作用的氨基酸序列，每个额外的多肽分子包含互补多聚化结构域以与第一个结构域形成稳定的聚合物，所述互补多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域。通常，多肽直接或间接连接至多聚化结构域。示例性多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区以及相容的蛋白-蛋白相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM以及它们的修饰形式的Fc结构域或其部分。
如本文所用，二聚化结构域是促进两个多肽序列(例如但不限于抗体链)之间的相互作用的多聚化结构域。二聚化结构域包括但不限于包含促进形成两个多肽序列之间的二硫键的半胱氨酸残基的氨基酸序列，例如全部或部分全长抗体铰链区；或者一个或多个二聚化序列，其为已知促进多肽之间相互作用的氨基酸序列(例如，亮氨酸拉链、GCN4拉链)。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”指包含抗体重链的恒定区但不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgE的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，或者IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。任选地，Fc结构域可以包括全部或部分的这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG的示例性Fc结构域，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3，以及任选存在的Cγ1与Cγ2之间的铰链的全部或部分。Fc区的边界可以变化，但是通常包括至少部分铰链区。此外，Fc还包括任何等位或物种变体或者任何变异或修饰形式，例如改变结合FcR或改变Fc介导的效应子功能的任何变异或修饰形式。
如本文所用，“Fc嵌合体”指嵌合多肽，其中一个或多个多肽直接或间接连接至Fc区或其衍生物。通常，Fc嵌合体组合免疫球蛋白的Fc区与另一多肽，例如抗RSV抗体片段。修饰的Fc多肽的衍生物为本领域技术人员已知。
如本文所用，“蛋白转导结构域”或“PTD”是肽结构域，其可以缀合至蛋白(例如本文所提供的抗体)以促进所述蛋白附着至和/或摄入靶细胞。
如本文所用，“标签”或“表位标签”指通常添加至多肽(例如本文所提供的抗体)的N端或C端的氨基酸序列。标签融合至多肽可以促进多肽纯化和/或检测。通常，标签或标签多肽指这样的多肽，其具有足够的残基以提供被抗体识别的表位或者可以服务于检测或纯化，但是其足够短从而不干扰其连接的嵌合多肽的活性。标签多肽通常足够独特，因此特异性结合标签多肽的抗体基本上不与该标签多肽所连接的多肽中的表位交叉反应。合适的标签多肽一般具有至少5或6个氨基酸残基，并且通常约8-50个氨基酸残基，典型9-30个残基。标签可以连接至聚合物中的一个或多个嵌合多肽，并且允许检测该聚合物或者从样品或混合物回收该聚合物。这类标签是公知的，并且可以很容易合成和设计。示例性标签多肽包括用于亲和纯化的标签多肽，并且包括His标签、流感血凝素(HA)标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:2159-2165)；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(参见，例如，Evan et al.(1985)Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616)；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.(1990)ProteinEngineering 3:547-553(1990)。用来检测表位标记抗体的抗体在本文中通常指二抗。
如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。
如本文所用，“肽”指长度为2至约或40个氨基酸的多肽。
如本文所用，“氨基酸”是包含氨基和羧酸基团的有机化合物。多肽包含两个或更多个氨基酸。为了本文的目的，所提供的抗体中包含的氨基酸包括20种天然存在的氨基酸(表1)、非天然氨基酸以及氨基酸类似物(例如，其中α-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，存在于本文出现的多肽的各种氨基酸序列中的氨基酸根据它们公知的3-字母或1-字母缩写来显示(参见表1)。存在于各种核酸分子和片段中的核酸分子用本领域常规使用的标准单字母命名来命名。
如本文所用，“氨基酸残基”指多肽在其肽键处化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基一般为“L”异构形式。“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要该多肽保留期望的功能特性。NH2指存在于多肽的氨基端的游离氨基。COOH指存在于多肽的羧基端的游离羧基。与J.Biol.Chem.,243:3557-59(1968)中所述的标准多肽命名一致，并且采用37 C.F.R.§§ 1.821-1.822，氨基酸残基的缩写如表1所示：
表1对应表
本文中通过通式来表示的所有氨基酸残基序列具有氨基端至羧基端的常规方向从左至右的的方向。此外，短语“氨基酸残基”定义为包括对应表(表1)中所列的氨基酸，修饰的、非天然的和稀有氨基酸。而且，氨基酸残基序列的开始或末尾的破折号表示肽键，其连接至一个或多个氨基酸残基的另一序列，或者连接至诸如NH2的氨基端基团，或者连接至诸如COOH的羧基端基团。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biology ofthe Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
这类取代可以按照以下表2所示的示例性取代进行：
表2
原有残基 保守取代
Ala(A) Gly;Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln;His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala;Pro
His(H) Asn;Gln
Ile(I) Leu;Val
Leu(L) Ile;Val
Lys(K) Arg;Gln;Glu
Met(M) Leu;Tyr;Ile
Phe(F) Met;Leu;Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe
Val(V) Ile;Leu
其他取代也是允许的，并且可以凭经验或根据其他已知的保守或非保守取代来确定。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”指存在于多肽中的20种L-氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”指有机化合物，其具有与天然氨基酸相似的结构，但是在结构上修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性。因此非天然存在的氨基酸包括例如除20种天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并且包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸为本领域技术人员已知，并且包括但不限于2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(Baad)、β-丙氨酸/β-氨基-丙酸(Bala)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁酸/piperidinic acid(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2,4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链素(Des)、2,2′-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟赖氨酸(Hyl)、别-羟赖氨酸(Ahyl)、3-羟脯氨酸(3Hyp)、4-羟脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别-异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)以及鸟氨酸(Orn)。
如本文所用，“天然多肽”或“天然核酸”分子分别是可以在自然界中找到的多肽或核酸分子。天然多肽或核酸分子可以是多肽或核酸分子的野生型形式。天然多肽或核酸分子可以是多肽的优势形式或者其任何等位或其他天然变体。本文所提供的变体多肽和核酸分子与天然多肽和核酸分子相比可以具有修饰。
如本文所用，多肽或核酸分子的野生型形式是由基因编码或该基因所编码的编码序列编码的形式。通常，基因的野生型形式或其编码的分子不含改变功能或结构的突变或其他修饰。术语野生型还包括具有种内和种间发生的等位变异的形式。如本文所用，多肽或核酸分子的优势形式指该分子的形式，其为从基因产生的主要形式。“优势形式”随来源变化。例如，不同细胞或组织类型可以产生不同形式的多肽，例如通过可变剪接和/或通过可变蛋白加工。在各种细胞或组织类型中，不同多肽可以是“优势形式”。
如本文所用，“等位变体”或“等位变异”引用占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变自然发生，并且可以导致群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有变化)，或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。在本文中术语“等位变体”还用来表示基因的等位变体所编码的蛋白。通常基因的参考形式编码来自物种的群体或单个参照成员的多肽的野生型形式和/或优势形式。通常，包括种间和种内变体的等位变体通常与来自相同物种的野生型和/或优势形式具有至少或约80%、85%、90%、95%或更高的氨基酸相同性；相同程度取决于基因以及比较是种间或种内的。通常，种内等位变体与野生型和/或优势形式具有至少或约80%、85%、90%或95%相同性或更高，包括与多肽的野生型和/或优势形式96%、97%、98%、99%或更高的相同性。在本文中关于等位变体一般指相同物种的成员之间的变异和蛋白。
如本文所用，在本文中与“等位变体”可交换使用的“等位基因”指基因或其部分的可选形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当对象具有基因的两个相同等位基因时，据称所述对象对于该基因或等位基因是纯合的。当对象具有基因的两个不同等位基因时，所述个体对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因可以在单个核苷酸或几个核苷酸互相不同，并且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因还可以是包含突变的基因形式。
如本文所用，“物种变体”指不同物种之间多肽的变体，包括不同哺乳动物物种(例如小鼠和人)以及微生物物种(例如病毒和细菌)。
如本文所用，多肽“结构域”是结构上和/或功能上可区别或可定义的多肽的部分(3个或更多个，一般5个、10个或更多个氨基酸的序列)。多肽结构域的实例是可以形成由一个或多个结构基序(例如通过环区连接的α螺旋和/或β链的组合)组成的多肽内的独立折叠结构的多肽的部分，和/或通过特定功能活性(例如酶促活性、二聚化或抗原结合)识别的多肽的部分。多肽可以具有一个或多个不同结构域，通常超过一个。例如，所述多肽可以具有一个或多个结构结构域以及一个或多个功能结构域。单个多肽结构域可以基于结构和功能来区分。结构域可以包含氨基酸的连续线性序列。或者，结构域可以包含多个不连续的氨基酸部分，其沿着所述多肽的氨基酸的线性序列是不连续的。通常，多肽包含多个结构域。例如抗体分子的每条重链和每条轻链均包含多个免疫球蛋白(Ig)结构域，每个免疫球蛋白(Ig)结构域长度为约110个氨基酸。
本领域技术人员熟悉多肽结构域，并且可以通过与其他这样的结构域的结构和/或功能同源性来鉴定它们。为了在本文中例证，提供定义，但是应当理解通过名称识别特定结构域在本领域技术内是公知的。如果需要，可以采用适当的软件鉴定结构域。
如本文所用，多肽的功能区是包含至少一个功能结构域(其赋予特定功能，例如与生物分子相互作用的能力，例如通过抗原结合、DNA结合、配体结合或二聚化，或者通过酶促活性，例如激酶活性或蛋白水解活性)的多肽区域；多肽的功能区的实例为抗体结构域(例如VH、VL、CH、CL及其部分，如CDR，包括CDR1、CDR2和CDR3)或抗原结合部分(例如抗体结合位点)。
如本文所用，多肽的结构区是包含至少一个结构结构域的多肽区域。
如本文所用，诸如抗体的多肽的“特性”指多肽所表现出的任何特性，包括但不限于结合特异性、结构构型或构象、蛋白稳定性、蛋白水解抗性、构象稳定性、热耐受性以及对pH条件的耐受性。特性的变化可以改变多肽的“活性”。例如，抗体多肽的结合特异性的变化可以改变结合抗原的能力，和/或各种结合活性，例如亲和力或亲和性，或者多肽的体内活性。
如本文所用，诸如抗体的多肽的“活性”或“功能活性”指该多肽所表现出的任何活性。这类活性可以凭经验确定。示例性活性包括但不限于与生物分子相互作用的能力(例如，通过抗原结合、DNA结合、配体结合、或者二聚化)，酶促活性(例如激酶活性或蛋白水解活性)。对于抗体(包括抗体片段)，活性包括但不限于特异性结合特定抗原的能力、抗原结合的亲和力(例如高或低亲和力)、抗原结合的亲合性(例如高或低亲合性)、结合速率、解离速率、效应子功能(例如促进抗原中和或清除的能力)、病毒中和以及体内活性(例如预防病原体感染或侵染的能力、或者促进清除的能力、或者渗入体内的特定组织或流体或细胞的能力)。可以利用公认的测定在体外或体内评价活性，例如ELISA、流式细胞术、测量结合或解离速率的表面等离子共振或者等效测定、免疫组织化学以及免疫荧光组织学和显微术、基于细胞的测定、流式细胞术以及结合测定(例如，淘选测定)。例如，对于抗体多肽，可以通过体外测量结合亲和力、亲合性和/或结合系数(例如，结合/解离速率)以及其他活性，或者通过体内测量各种效应，例如免疫效应，如抗原清除，抗体对组织的渗入或定位，防护疾病(例如感染)，血清或其他流体抗体滴定，或者本领域公知的其他测定来评价活性。显示多肽表现出活性的这类测定的结果可以与体内多肽活性关联，其中体内活性可以称为治疗活性或生物学活性。修饰的多肽的活性可以是未修饰的多肽的活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰的多肽相比1%的活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高的活性。确定修饰(例如变异)的抗体的功能性或活性的测定是本领域公知的。
如本文所用，“治疗活性”指治疗性多肽的体内活性。通常，治疗活性是用来治疗疾病或疾病状况的活性。修饰的多肽的治疗活性可以是未修饰的多肽的治疗活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰的多肽相比1%的活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高的治疗活性。
如本文所用，“表现出至少一种活性”或“保留至少一种活性”指与不含修饰的靶或未修饰的多肽相比，修饰的多肽例如根据所提供的方法制备的变体多肽，例如修饰的如变体抗体或其他治疗性多肽(例如修饰的抗RSV抗体或其抗原结合片段)所表现出的活性。保留靶多肽的活性的修饰或变体多肽可以表现出提高的活性或者保持未修饰的多肽的活性。在某些情况下，修饰或变体多肽可以保留与靶或未修饰的多肽相比提高的活性。在某些情况下，修饰或变体多肽可以保留与未修饰的或靶多肽相比降低的活性。修饰或变体多肽的活性可以是未修饰的或靶多肽的活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰的或靶多肽相比1%的活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高活性。在其他实施方案中，活性变化为比未修饰的或靶多肽高至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。保留活性的测定取决于待保留的活性。这类测定可以在体外或体内进行。例如，利用本领域已知以及下文实施例所述的活性的测定，例如但不限于ELISA和淘选测定，可以测量活性。与未修饰的或靶多肽相比的修饰或变体多肽的活性还可以根据体内治疗活性或生物学活性或者施用该多肽之后的结果来评价。
如本文所用，术语“评价”旨在包括在某种意义上获得样品中存在的蛋白酶或其结构域的活性的绝对值的定量和定性测定，并且还包括获得指示活性水平的指数、比值、百分率、视觉或其他值的定量和定性测定。评价可以是直接或间接的，并且实际检测的化合物当然不需要是蛋白水解产物本身，但是例如可以是其衍生物或某些其他物质。例如，补体蛋白切割产物的检测，如通过SDS-PAGE和用考马斯蓝染色蛋白。
如本文所用，“核酸”指至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。术语“核酸”还包括核酸的类似物，例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA以及其他这样的类似物和衍生物或者它们的组合。核酸还包括DNA和RNA衍生物，其包含例如核苷酸类似物或除磷酸二酯键之外的“骨架(backbone)”键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。该术语还包括由核苷酸类似物组成的RNA或DNA的等同物、衍生物、变体和类似物，单链(正义或反义)和双链核酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基为尿苷。
核酸可以包含核苷酸类似物，包括例如质量修饰核苷酸，其允许质量区分核酸分子；包含可检测标记的核苷酸，例如荧光、放射性、发光或化学发光标记，其允许检测核酸分子；或者包含反应基团的核苷酸，例如生物素或硫醇基，其促进核酸分子固定至固体支持物。核酸还可以包含一个或多个可选择性切割的骨架键，例如，可化学、酶促或光解切割。例如，核酸可以包括一个或多个脱氧核糖核苷酸，之后是一个或多个核糖核苷酸，其后可以是一个或多个脱氧核糖核苷酸，这样的序列可以通过碱水解在核糖核苷酸序列处切割。核酸还可以包含一个或多个对切割相对耐受的键，例如嵌合寡核苷酸引物，其可以包括通过肽核酸键连接的核苷酸以及在3′端通过磷酸二酯键或其他合适的键连接的至少一个核苷酸，并且能够通过聚合酶延伸。肽核酸序列可以利用公知的方法来制备(参见，例如，Weiler etal.(1997)Nucleic Acids Res.25:2792-2799)。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸还包括DNA和RNA衍生物，其包含例如核苷酸类似物或除磷酸二酯键之外的“骨架”键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。多核苷酸(核酸分子)包括单链和/或双链多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及RNA或DNA的类似物或衍生物。该术语还包括由核苷酸类似物组成的RNA或DNA的等同物、衍生物、变体和类似物，单链(正义或反义)和双链多核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基为尿苷。多核苷酸可以包含核苷酸类似物，包括例如质量修饰核苷酸，其允许质量区分多核苷酸；包含可检测标记的核苷酸，例如荧光、放射性、发光或化学发光标记，其允许检测多核苷酸；或者包含反应基团的核苷酸，例如生物素或硫醇基，其促进多核苷酸固定至固体支持物。多核苷酸还可以包含一个或多个可选择性切割的骨架键，例如，可化学、酶促或光解切割。例如，多核苷酸可以包括一个或多个脱氧核糖核苷酸，之后是一个或多个核糖核苷酸，其后可以是一个或多个脱氧核糖核苷酸，这样的序列可以通过碱水解在核糖核苷酸序列处切割。多核苷酸还可以包含一个或多个对切割相对耐受的键，例如嵌合寡核苷酸引物，其可以包括通过肽核酸键连接的核苷酸以及在3′端通过磷酸二酯键或其他合适的键连接的至少一个核苷酸，并且能够通过聚合酶延伸。肽核酸序列可以利用公知的方法来制备(参见，例如，Weiler et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:2792-2799)。本文所提供的核酸分子(多核苷酸)的实例为寡核苷酸，包括合成寡核苷酸、寡核苷酸双链体、引物(包括补平引物)以及寡核苷酸双链体盒。
如本文所用，“DNA构建体”是单链或双链、线性或环状DNA分子，其包含以自然中不存在的方式结合和并置的DNA片段。DNA构建体作为人为操纵的结果存在，并且包括所操纵的分子的克隆和其他拷贝。
如本文所用，“DNA区段”是具有特定属性的较大的DNA分子的部分。例如，编码特定多肽的DNA区段是诸如质粒或质粒片段的较长DNA分子的部分，当从5’至3’方向阅读时，其编码所述特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，正链多核苷酸指“正义链”或多核苷酸双链体，其与负链或“反义”链互补。在编码基因的多核苷酸的情况下，正义链是与翻译为多肽的mRNA链相同的链，而反义链与该链互补。双链体的正链和负链互相互补。
如本文所用，遗传元件指编码多肽或蛋白或它们的区域的基因或其任何区域。在一些实例中，遗传元件编码融合蛋白。
如本文所用，核酸分子的调控区表示积极或消极影响可操作地连接的基因的表达的顺式作用核苷酸序列。调控区包括赋予基因的诱导型(即，增加的转录需要物质或刺激)表达的核苷酸序列。当诱导物存在或浓度增加时，可以增加基因表达。调控区还包括赋予基因表达的抑制(即，物质或刺激减少转录)的序列。当阻遏物存在或浓度增加时，可以减少基因表达。已知调控区影响、调节或控制许多体内生物学活性，包括细胞增殖、细胞生长和死亡、细胞分化以及免疫调谐。调控区通常结合一个或多个反式作用蛋白，这导致增加或减少的基因转录。
基因调控区的具体实例为启动子和增强子。启动子是位于转录或翻译起始位点周围的序列，通常位于翻译起始位点的5’。启动子通常位于翻译起始位点的1Kb内，但是可以位于较远的位置，例如，2Kb、3Kb、4Kb、5Kb或更多，多达并包括10Kb。已知增强子在位于基因的5’或3’时，或者在位于外显子或内含子中或者是部分外显子或内含子时影响基因表达。增强子还可以在距离基因显著的距离发挥功能，例如，在约3Kb、5Kb、7Kb、10Kb、15Kb或更远的距离。
除了启动子区，调控区还包括但不限于促进翻译的序列，内含子的剪接信号(维持基因的正确读框以允许mRNA的符合读框的翻译)，以及终止密码子，前导序列和融合配对物序列，用于产生多基因的内部核糖体进入位点(IRES)元件，或者多顺反子、信息、提供所关注的基因的转录物的适当多腺苷酸化的多腺苷酸化信号，以及终止密码子；并且可以任选地包括在表达载体中。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，编码前导肽的核酸可以可操作地连接编码多肽的核酸，从而这些核酸可以转录和翻译以表达功能融合蛋白，其中所述前导肽影响融合多肽的分泌。在某些情况下，编码第一多肽(例如，前导肽)的核酸可操作地连接至编码第二多肽的核酸，并且这些核酸作为单一mRNA转录物转录，但是所述mRNA转录物的翻译可以导致表达两种多肽之一。例如，琥珀终止密码子可以位于编码第一多肽的核酸与编码第二多肽的核酸之间，从而，当引入部分琥珀抑制细胞时，所得的单一mRNA转录物可以翻译以产生包含第一和第二多肽的融合蛋白，或者可以翻译以仅产生第一多肽。在另一实例中，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
如本文所用，关于例如合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成”指通过重组方法和/或通过化学合成方法所产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用，利用重组DNA方法通过重组方法产生表示使用分子生物学的公知方法表达克隆的DNA所编码的蛋白。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。在一实例中，宿主细胞为遗传包装(genetic package)，可以诱导在其表面上表达变体多肽。在另一实例中，用遗传包装感染宿主细胞。例如，宿主细胞可以是噬菌体展示相容的宿主细胞，其可以用噬菌体或噬粒载体转化并提供表达包含变体多肽的融合蛋白的噬菌体的包装。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，术语“寡核苷酸”和“寡核苷酸(oligo)”同义使用。寡核苷酸是在长度上包含有限数量的核苷酸的多核苷酸。本领域技术人员认识到寡核苷酸在长度上一般少于或约250个，一般少于或约200个，一般少于或约100个核苷酸。通常，本文所提供的寡核苷酸为合成寡核苷酸。合成寡核苷酸在长度上包含少于或约250或200个核苷酸，例如，在长度上少于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个核苷酸。通常，寡核苷酸为单链寡核苷酸。结尾“聚体(mer)”可以用来表示寡核苷酸的长度。例如，“100-聚体”可以用来指在长度上包含100个核苷酸的寡核苷酸。本文所提供的合成寡核苷酸的实例为正链和负链寡核苷酸、随机化寡核苷酸、参考序列寡核苷酸、模板寡核苷酸以及补平引物。
如本文所用，合成寡核苷酸是通过化学合成产生的寡核苷酸。化学寡核苷酸合成方法是公知的。任何已知的合成方法可以用来制备所提供的方法中设计和使用的寡核苷酸。例如，合成寡核苷酸通常通过化学连接包含保护基团的单核苷酸单体或核苷酸三聚体来制备。通常，包含保护基团的亚磷酰胺、单核苷酸一次添加一个。合成通常由寡核苷酸的3’端开始。将最3’的亚磷酰胺附着于固体支持物，并且通过将每个亚磷酰胺添加至最后的5’端来进行合成。每次添加之后，从最近添加的碱基上的5’磷酸酯基团去除保护基团，允许添加另一亚磷酰胺。自动合成仪一般可以合成长度多达约150-约200个核苷酸的合成寡核苷酸。通常，所提供的方法中设计和使用的寡核苷酸是利用标准氰乙基化学从亚磷酰胺单体合成的。通过这种标准方法制备的合成寡核苷酸可以购自Integrated DNATechnologies(IDT)(Coralville,IA)或TriLink Biotechnologies(San Diego,CA)。
如本文所用，“引物”指在适当条件下(例如，在4种不同核苷三磷酸以及诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的聚合试剂存在的情况下)，在适当的缓冲液中及合适的温度下可以作为模板指导的核酸合成的起始点的核酸分子(更典型地，指具有序列相同性的这类分子的池)。应当理解某些核酸分子可以作为“探针”和“引物”。然而，引物具有用于延伸的3’羟基。引物可以用于多种方法，包括例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄PCR、捕获PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导的PCR以及其他扩增方案。
如本文所用，“引物对”指一组引物(例如两个引物池)，其包括与待扩增(例如通过PCR)的序列的5′端特异性杂交的5′(上游)引物以及与待扩增的序列的3′端互补物(complement)特异性杂交的3′(下游)引物。因为“引物”可以指相同核酸分子的池，引物对通常是一对两个引物池。
如本文所用，“单引物”和“单引物池”同义地指引物池，其中该池中的每条引物包含与其他引物成员的序列相同性，例如，其中成员具有至少或约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%相同性的引物池。单引物池中的引物(全部享有序列相同性)作为5′(上游)引物(与待扩增(例如通过PCR)的序列的5′端特异性杂交)以及作为3′(下游)引物(与待扩增的序列的3′端互补物特异性杂交)。因此，在没有其他引物的情况下，单引物可以用来在聚合酶扩增反应中引发互补链的合成并扩增核酸。
如本文所用，关于两个核苷酸，互补性指在两个核酸分子杂交时所述两个核苷酸互相碱基配对的能力。享有互补性的两个核酸分子称为互补核酸分子；互补核酸分子的实例为多核苷酸双链体中的正链和负链。如本文所用，当核酸分子或其区域与另一核酸分子或其区域互补时，这两个分子或区域互相特异性杂交。两个互补的核酸分子可以用互补性百分比来描述。例如，每个长度为100个核苷酸，互相特异性杂交但是彼此包含5个错配的两个核酸分子称为95%互补。对于以100%互补性杂交的两个核酸分子，互补性不必存在于这两个分子的整个长度。例如，在长度上包含20个连续核苷酸的核酸分子可以特异性杂交至在长度上包含500个连续核苷酸的核酸分子的连续20个核苷酸部分。如果沿这20个核苷酸部分不存在错配，那么该20个核苷酸的分子以100%互补性杂交。通常，互补核酸分子以互补核苷酸之间少于25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%错配比对(换句话说，至少或约75%、80%、85%、90%、95、96%、97%、98%或99%互补性)。在另一实例中，互补核酸分子包含或约或至少或约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95、96%、97%、98%或99%互补性。在一实例中，互补核酸分子包含少于5、4、3、2或1个错配核苷酸。在一实例中，互补核苷酸是100%互补的。如果需要，会说明互补性的百分比。通常选择两个分子，使得它们在高严格性条件下会特异性杂交。
如本文所用，核酸分子的互补链指核苷酸序列，例如与所述分子特异性杂交的核酸分子，如多核苷酸双链体中所述核酸分子的相反链。例如，在多核苷酸双链体中，正链寡核苷酸的互补链是双链体中特异性杂交至所述正链寡核苷酸的负链寡核苷酸。在所提供的方法的一实例中，聚合酶反应用来合成多核苷酸的互补链以形成双链体，通常通过将寡核苷酸引物杂交至多核苷酸来起始。
如本文所用，“特异性杂交”指核酸分子(例如寡核苷酸或多核苷酸)通过互补碱基配对退火至另一核酸分子。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的体外和体内参数，例如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别有关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液组成以及盐浓度。两个核酸分子不必表现出100%互补性以便互相特异性杂交。例如，享有序列互补性，例如或约或至少或约99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%互补性的两个互补核酸分子可以互相特异性杂交。用于本文所提供的体外杂交方法的参数(例如，缓冲液组分、时间和温度)可以调整严格性以改变两个核酸分子特异性杂交所需的互补性百分比。技术人员可以很容易调整这些参数以实现适合特定应用的核酸分子与靶核酸分子特异性杂交。
如本文所用，“一级序列”指多肽中的氨基酸残基序列或核酸分子中的核苷酸序列。
如本文所用，两个蛋白或核酸之间的“相似性”指所述蛋白的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以基于残基序列以及其中所含的残基的相同性程度。用于评价蛋白或核酸之间的相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在评价序列相似性的一种方法中，以获得序列之间相同性的最大水平的方式比对两个氨基酸或核苷酸序列。“相同性”指氨基酸或核苷酸序列不变的程度。氨基酸序列以及某种程度上核苷酸序列的比对还可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守性差异和/或常见取代。保守性差异是保留所涉及的残基的理化特性的差异。比对可以是整体的(在序列的整个长度并包括所有残基的所比较序列的比对)或局部的(仅包括最相似区域或多个区域的部分序列的比对)。
如本文所用，当多肽或核酸分子或其区域与另一多肽或核酸分子或区域包含或具有“相同性”或“同源性”时，这两个分子和/或区域享有大于或等于或约40%序列相同性，并且通常大于或等于或约50%序列相同性，例如至少或约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相同性；如果需要，可以说明相同性的精确百分比。与第二核酸分子或区域相同或同源的核酸分子或其区域可以特异性杂交至与所述第二核酸分子或区域100%互补的核酸分子或区域。或者，可以在两个理论核苷酸或氨基酸序列之间或者在核酸或多肽分子与理论序列之间比较相同性。
序列“相同性”本身具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysisof Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987;and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.& Lipman,D.,SIAM J AppliedMath48:1073(1988))。
沿着两个多核苷酸或多肽的全长比较的序列相同性指沿着分子的全长相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。例如，如果多肽A具有100个氨基酸，而多肽B具有95个氨基酸，其与多肽A的氨基酸1-95相同，然后当沿着多肽A的全长与多肽B的全长比较序列相同性时，多肽B具有95%相同性。或者，可以沿着每个多肽的区域(例如20个氨基酸的类似区域)比较多肽A与多肽B之间的序列相同性。在这种情况下，如果多肽A和B沿着该区域具有20个相同氨基酸，那么该区域的序列相同性为100%。或者，可以沿着分子的长度与另一分子的区域比较序列相同性。或者，可以沿着相同长度但是具有氨基酸置换(例如保守氨基酸置换或非氨基酸置换)的多肽比较多肽A与多肽B之间的序列相同性。如下文所讨论以及本领域技术人员已知，用于评价相同性的各种程序和方法是本领域技术人员已知的。高水平的相同性，例如90%或95%相同性，可以不用软件很容易确定。
任何两个核酸分子是否具有至少或约60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%“相同”的核苷酸序列可以利用已知的诸如“FASTA”程序的计算机算法来确定，如在Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中利用例如默认参数(其他程序包括GCG程序包(Devereux,J.et al.(1984)Nucleic Acids Research 12(I):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul,S.F.et al.(1990)J.Molec.Biol.215:403;Guide toHuge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和Carrilloet al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，国家生物技术信息中心数据库的BLAST功能可以用来确定相同性。其他可商购或公开的程序包括DNAStar″MegAlign″程序(Madison,WI)和威斯康辛大学遗传学计算机集团(UWG)“Gap”程序(Madison WI))。例如，蛋白和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以通过利用GAP计算机程序比较序列信息来确定(例如，Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443，由Smith and Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482修订)。简单地说，GAP程序将相似性定义为用比对的相似的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的总符号数目。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(1表示相同，0表示不同)和Gribskov et al.(1986)Nucl.AcidsRes.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,ATLAS OF PROTEINSEQUENCE AND STRUCTURE,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每个空位罚分3.0并且每个空位中的每个符号另外罚分0.1；以及(3)末端空位不罚分。
总的来说，为了确定序列相同性百分比，比对序列从而获得最高等级的匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford UniversityPress,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;和SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。对于序列相同性，保守氨基酸的数目通过标准比对算法程序来确定，并且可以与各个供应者(supplier)建立的默认空位罚分一起使用。基本上同源的核酸分子通常在中等严格性或高度严格性下与所关注的核酸在整个长度上杂交。还考虑包含代替杂交核酸分子中的密码子的简并密码子的核酸分子。
因此，当与特定数目相关时，术语“相同性”表示第一和第二多肽或多核苷酸或其区域的序列之间和/或理论核苷酸或氨基酸序列之间的比较。如本文所用，术语至少“90%相同”指相对于多肽的第一核酸或氨基酸序列相同性百分比为90-99.99。90%或更高水平的相同性表明，为了例证目的假设，比较长度为100个氨基酸的第一和第二多肽，第一多肽中不超过10%(即100中的10)的氨基酸与第二多肽的氨基酸不同。相似比较可以在第一和第二多核苷酸之间进行。第一和第二序列之间的这类差异可以表示为随机分布在多肽的整个长度的点突变，或者它们可以集中在一个或多个位置，其具有不同长度至高达最大允许例如10/100氨基酸差异(约90%相同性)。差异定义为核酸或氨基酸残基取代、插入、添加或缺失。在约85-90%以上的同源性或相同性水平，结果独立于程序和空位参数设置；这样高水平的相同性经常可以容易地通过手动比对而不依赖于软件来评价。
如本文所用，比对序列指使用同源性来比对两个或更多个核苷酸或氨基酸序列。通常，比对50%或更多相同性相关的两个或更多个序列。一组比对的序列指在相应位置比对的2个或更多个序列，并且可以包括比对与基因组DNA序列比对的来源于诸如EST和其他cDNA的RNA的序列。
相关或变体多肽或核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法来比对。这类方法通常最大化匹配，并且包括诸如利用手动比对和通过利用许多可用的比对程序(例如，BLASTP)的方法以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽或核酸的序列，本领域技术人员可以利用保守和相同的氨基酸残基作为指导鉴定类似的部分或位置。而且，本领域技术人员还可以采用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导以找到人和非人序列之间和人和非人序列中的对应的氨基酸或核苷酸残基。相应位置还可以基于结构比对，例如通过利用计算机模拟的蛋白结构比对。在其他情况下，可以鉴定相应区域。本领域技术人员还可以采用保守氨基酸残基作为指导以找到人和非人序列之间和人和非人序列中的对应的氨基酸残基。
如本文所用，“类似”和“对应”部分、位置或区域是当利用本领域技术人员已知的比对方法以最大化匹配来比对两个或更多个相关多肽或核酸序列(包括分子的序列、分子的区域和/或理论序列)从而获得最高等级匹配时，互相对齐的部分、位置或区域。换句话说，在两个或更多个多肽或核酸序列最适比对时，两个类似位置(或部分或区域)对齐。当比对两个或更多个序列时，基于沿线性核酸或氨基酸序列的位置鉴定类似部分/位置/区域。类似部分不必互相享有任何序列相似性。例如，每个长度为100个核苷酸的两个同源核酸分子序列的比对(从而最大化匹配)可以显示100个核苷酸中的70个相同。包含其他不同的30个氨基酸中的一些或全部的这些核酸分子的部分是不享有序列相同性的类似部分。或者，类似部分可以互相包含一些序列相同性百分比，例如或约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，或者其分数。在一实例中，相似部分是100%相同的。
如本文所用，“修饰”指多肽的氨基酸序列或核酸分子的核苷酸序列的修饰，并且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，例如通过利用重组DNA方法。
如本文所用，当指核酸或多肽序列时，“缺失”指与诸如靶多核苷酸或多肽或者天然或野生型序列的序列相比的一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失。
如本文所用，当指核酸或氨基酸序列时，“插入”描述在靶、天然、野生型或其他相关序列内包含一个或多个额外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比包含一个或多个插入的核酸分子在序列的线性长度内包含一个或多个额外的核苷酸。如本文所用，对核酸和氨基酸序列的“添加”描述与另一序列相比，添加核苷酸或氨基酸至任一末端。
如本文所用，“取代”指用可选核苷酸或氨基酸置换天然、靶、野生型或其他核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸，不改变分子的长度(如残基数目所述)。因此，分子中的一个或多个取代不改变该分子的氨基酸残基或核苷酸的数目。与特定多肽相比的取代突变可以用沿所述多肽序列长度的氨基酸残基的编号来表示。例如，在氨基酸序列的第19位处具有半胱氨酸(Cys;C)取代异亮氨酸(Ile;I)的修饰的修饰多肽可以表示为I19C、Ile19C，或者简写C19以显示在修饰的第19位处的氨基酸为半胱氨酸。在这个实例中，具有取代的分子在未修饰的多肽的Ile19处具有修饰。
如本文所用，结合特性是诸如多肽的分子的特征，涉及其是否以及如何结合一个或多个结合配对物。结合特性包括结合结合配对物的能力，其结合结合配对物的亲和力(例如高亲和力)，其结合结合配对物的亲合性，与结合配对物的键的强度以及与结合配对物结合的特异性。
如本文所用，亲和力描述诸如结合配对物的两个或更多个分子之间相互作用的强度，典型为两个结合配对物之间非共价相互作用的强度。抗体或其抗原结合片段对抗原表位的亲和力是单个抗体结合位点与所述表位之间全部非共价相互作用的强度的度量。低亲和力抗体-抗原相互作用很弱，并且分子趋于快速解离，而高亲和力抗体-抗原结合很强，并且分子保持结合较长时间。计算亲和力的方法是公知的，例如测定结合/解离常数的方法。可以凭经验估计亲和力，或者可以比较测定亲和力，例如通过比较一个抗体和另一抗体对特定抗原的亲和力。
如本文所用，抗体亲合性指多价抗体与其抗原之间的多重相互作用的强度，例如包含多个相关结合位点的抗体与具有重复表位的抗原或表位阵列的相互作用。与低亲合性抗体相比，高亲合性抗体具有较高强度的这类相互作用。
如本文所用，“结合”指分子参与与另一分子的任何吸引相互作用，导致稳定的关联，其中所述两个分子互相靠近。结合包括但不限于非共价键、共价键(例如可逆和不可逆共价键)，并且包括分子之间的相互作用，所述分子例如但不限于蛋白、核酸、糖类、脂质和小分子，如包括药物在内的化合物。结合的实例为抗体-抗原相互作用和受体-配体相互作用。当抗体“结合”特定抗原时，结合指抗体通过在抗体结合位点的同源抗体-抗原相互作用特异性识别抗原。结合还可以包括多肽的多条链的关联，例如通过二硫键相互作用的抗体链。
如本文所用，“亲和常数”指用来测量抗体对抗原的亲和力的结合常数(Ka)。亲和常数越高，抗体对抗原的亲和力越大。亲和常数以倒数摩尔浓度(即M-1)的单位表示，并且可以如通过抗体反应的标准动力学方法(例如，免疫测定、表面等离子共振或本领域已知的其他动力学相互作用测定)所测量的从结合-解离反应的速率常数计算。
如本文所用，当用于指抗体结合亲和力时，术语“相同”表示结合常数(Ka)在参考抗体的约1-100倍或1-10倍内(比参考抗体高1-100倍的亲和力或低1-100倍的亲和力，或者在这类范围内的任何数值或范围或值)。
如本文所用，当用于指结合常数(Ka)时，“基本上相同”表示结合常数在大于或小于参考抗体的结合常数Ka约5-5000倍内(比参考抗体大5-5000倍或小5-5000倍)。抗体的结合亲和力还可以表示为解离常数或Kd。解离常数是结合常数的倒数，Kd=1/Ka。
如本文所用，当用来相对于另一抗体而描述抗体时，短语“具有相同的结合特异性”表示抗体和参考抗体特异性结合(免疫特异性地结合或特异性结合病毒)相同抗原表位的全部或部分。因此，具有与名为58c5或30D8的抗体相同的结合特异性的抗RSV抗体或其抗原结合片段与名为58c5或30D8的抗RSV抗体或其抗原结合片段特异性结合相同的表位的全部或部分。所述表位可以在分离的蛋白中，或者在病毒中的蛋白中。两个抗体结合相同表位的能力可以通过本领域已知的测定来确定，例如，表面等离子共振测定和抗体竞争测定。通常，免疫特异性地结合相同表位的抗体可以竞争结合所述表位，这可以利用本领域已知的技术例如通过体外结合竞争测定(例如竞争ELISA)来测量。通常，免疫特异性地与第二抗体结合相同的表位的第一抗体可以约或30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%竞争结合所述表位，其中竞争百分比是测量的第二抗体代替第一抗体结合所述表位的能力。在示例性竞争测定中，将抗原在预定的限制稀释的标记抗体(例如，50-70%饱和浓度)以及连续稀释的未标记的竞争抗体存在的情况下温育。通过测量在竞争抗体存在的情况下标记抗体结合抗原的结合的任何减少来测定竞争。这类测定的变化是本领域已知的，包括各种标记技术和检测方法，包括例如辐射、荧光、酶促和比色检测。第一抗体与第二抗体结合相同的表位的能力还可以例如利用抗单克隆抗体突变体(MARM)通过病毒中和测定来确定。例如，当第一抗RSV抗体中和野生型RSV但不中和特定突变RSV时，中和所述野生型RSV但不中和所述特定突变RSV的第二抗体一般与所述第一抗体结合相同的RSV上的表位。当第一抗RSV抗体中和野生型RSV但不中和特定突变RSV时，中和所述野生型RSV和所述特定突变RSV的第二抗体一般不与所述第一抗体结合相同的RSV上的表位。
如本文所用，也称为“单克隆抗体逃逸突变体”的“抗单克隆抗体突变体”(MARM)是表现出对单克隆抗体(其中和野生型RSV病毒)中和的抗性的突变呼吸道合胞病毒(RSV)。在实践中，中和50%的RSV MARM所需的抗体浓度必须比中和等量的MARM(认为已逃脱所述抗体)的参考野生型感染性病毒颗粒所需的抗体浓度大至少约或至少10倍。
通过在这样的单克隆抗体存在的情况下培养野生型RSV来产生MARM，在所述抗体存在的情况下经过连续数轮的病毒复制，从而在连续的每轮病毒复制之后，需要增加抗体浓度以产生病毒中和效应。在增加浓度的抗体存在的情况下直至突变病毒不再被所述抗体有效中和，这才观察到致细胞病变效应(CPE)。如果与第二抗体相比，在第一抗体存在的情况下MARM的出现需要更多轮的复制，可以得出结论所述第一抗体结合与所述第二抗体结合的表位不同的表位。如果第一抗体可以中和针对第二抗体产生的MARM，可以得出结论所述抗体特异性结合不同表位或与不同表位相互作用。与竞争结合测定相比，MARM可以更精细作图抗体的抗原结合表位，从而一个抗体可以对另一抗体竞争结合抗原，但是仍然可以中和其竞争者的MARM。对于一些抗体，仅需要几轮选择以产生MARM；对于其他抗体，需要更多轮。对于本文所提供的某些抗体，10、11、12、13、14、15、20、25、30或更多轮后未产生MARM。在某些情况下，不可能产生MARM。
如本文所用，EC50指在体外中和测定中抗体可以抑制病毒感染50%的有效浓度，例如，如本文所述的病毒空斑减少测定(例如，利用非洲绿猴肾细胞宿主细胞或其他宿主细胞用于感染的空斑减少测定)或本领域已知的其他病毒中和测定。通常，中和病毒是在诸如病毒空斑减少测定的体外中和测定中的病毒抑制具有2nM或更少的EC50的病毒。
如本文所用，“结合配对物”指与另一分子例如通过共价或非共价相互作用(例如抗体与同种抗原的相互作用)而特异性相互作用的分子(例如多肽、脂质、糖脂、核酸分子、糖类或其他分子)。结合配对物可以天然或合成产生。在一实例中，利用一种或多种结合配对物选择期望的变体多肽，例如利用体外或体内方法。体外方法的实例包括利用偶联至固体支持物(例如珠、板、柱、介质或其他固体支持物)的结合配对物来选择；或者利用偶联至另一种可选择的分子(诸如生物素分子)的结合配对物，然后通过将所述另一种可选择的分子偶联至固体支持物来选择。通常，体外方法包括洗涤步骤以去除未结合的多肽，然后洗脱所选的变体多肽。所述过程可以在迭代过程中重复一次或多次以从所选的多肽中选择变体多肽。
如本文所用，二硫键(也称S-S键或二硫桥)是来源于硫醇基偶联的单共价键。蛋白中的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇基之间形成，并且稳定诸如抗体结构域的多肽结构域之间的相互作用。
如本文所用，“偶联”或“缀合”表示通过共价或非共价相互作用连接。
如本文所用，当指诸如诊断或治疗性部分的部分连接至抗体或其抗原结合片段时，短语“缀合至抗体”或“连接至抗体”或者其语法变化表示所述部分通过任何已知的用于连接肽的方法连接至所述抗体或其抗原结合片段，例如，通过重组方法或通过化学方法翻译后产生融合蛋白。缀合可以采用各种连接剂中的任一种以实现缀合，包括但不限于肽或化合物接头或者化学交联剂。
如本文所用，“噬菌体展示”指在丝状噬菌体的表面上表达多肽。
如本文所用，“噬菌体展示相容细胞”或“噬菌体展示相容宿主细胞”是可以被噬菌体感染并且因此可以支持产生展示包含多肽(例如，变体多肽)的融合蛋白的噬菌体并且因此可以用于噬菌体展示的宿主细胞，通常为细菌宿主细胞。噬菌体展示相容细胞的实例包括但不限于XL1-blue细胞。
如本文所用，“淘选”指一种基于亲和力的选择方法，其用于分离噬菌体，所述噬菌体展示具有对结合配对物的特异性的分子，所述结合配对物例如，捕获分子(例如抗原)或者氨基酸或核苷酸的序列或者其中的表位、区域、部分或位点。
如本文所用，“展示蛋白”或“遗传包装展示蛋白”表示用于展示遗传包装上的多肽的任何遗传包装多肽，从而在展示蛋白融合至(例如作为融合蛋白的部分)所关注的多肽(例如，期望减少表达的多肽)时，该多肽展示在遗传包装的外表面上。展示蛋白通常存在于遗传包装的外表面或外室(例如，膜、细胞壁、外壳或其他外表面或室)之上或之内，遗传包装例如病毒遗传包装，如噬菌体，从而当融合至所关注的多肽时，该多肽展示于遗传包装上。
如本文所用，外壳蛋白为展示蛋白，其至少部分存在于遗传包装的外表面上，从而在其融合至所关注的多肽时，该多肽展示于遗传包装的外表面上。通常，外壳蛋白为病毒外壳蛋白，例如噬菌体外壳蛋白。在宿主细胞中装配期间，诸如噬菌体外壳蛋白的病毒外壳蛋白与病毒颗粒相关。在一实例中，外壳蛋白在本文中用于在遗传包装上展示多肽；外壳蛋白表达为融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含外壳蛋白的氨基酸序列以及所展示的多肽的氨基酸序列。外壳蛋白可以是全长外壳蛋白或者是能够在遗传包装的表面上展示多肽的外壳蛋白的任何部分。
外壳蛋白的实例为噬菌体外壳蛋白，例如但不限于(i)丝状噬菌体的次要外壳蛋白，如基因III蛋白(gIIIp,cp3)，和(ii)丝状噬菌体的主要外壳蛋白(以10个拷贝或更多，例如数十、数百或数千个拷贝存在于病毒外壳中)，如基因VIII蛋白(gVIIIp,cp8)；与其他噬菌体外壳蛋白(如基因VI蛋白、基因VII蛋白或基因IX蛋白(参见，例如，WO 00/71694))的融合物；以及这些蛋白的部分(例如，结构域或片段)，例如但不限于稳定并入噬菌体颗粒的结构域，例如gIIIp或gVIIIp的锚结构域。此外，可以使用为表达较大肽而优化的gVIIIp突变体，例如具有改进的表面展示特性的突变体，如突变gVIIp(参见，例如，Sidhu et al.(2000)J.Mol.Biol.296:487-495)。
如本文所用，“疾病或病症”指在生物中由以下原因或条件导致并且通过可识别的症状来表征的病理状况，所述原因或条件包括但不限于感染、后天条件、遗传条件。本文所关注的疾病和病症是涉及RSV感染或者增加RSV感染风险的疾病和病症。
如本文所用，“感染”和“RSV感染”指宿主中RSV生命周期的所有阶段(包括但不限于细胞或身体组织中RSV的侵染和复制)，以及RSV的侵染和复制所导致的病理状态。RSV的侵染和增殖包括但不限于以下步骤：RSV颗粒停靠至细胞，病毒与细胞膜融合，病毒遗传信息引入细胞，表达RSV蛋白，产生新RSV颗粒以及RSV颗粒从细胞释放。RSV感染可以是上呼吸道RSV感染(URI)、下呼吸道RSV感染(LRI)或它们的组合。在一些实例中，RSV的侵染和复制所导致的病理状态为急性RSV疾病。
如本文所用，“急性RSV疾病”指作为RSV感染的结果的肺或下呼吸道中的临床重大疾病，其可以表现为肺炎和/或细支气管炎，其中这类症状可以包括例如低氧、呼吸暂停、呼吸窘迫、呼吸急促、喘息和发绀。急性RSV疾病要求所影响的个体获得医疗干预，例如住院、给氧、插管和/或通气。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“防止”或预防以及它们的语法相当形式指将发展疾病或疾病状况的风险降低的方法。
如本文所用，“药学有效物质”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、传统治疗药物，包括小分子药物和治疗性蛋白。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“治疗效力”指物质、化合物、材料或包含化合物的组合物在已施用所述物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的对象中产生疗效的能力。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性，或者减少病毒感染的发生率。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文所用，与所提供的抗体联合的术语“免疫治疗地”或“免疫治疗”表示预防以及治疗施用。因此，可以将所提供的治疗性抗体施用于有染上病毒感染(例如RSV感染)的风险的对象以便减少疾病的可能性和/或严重性，或者施用于已证实活跃的病毒感染(例如RSV感染)的对象。
如本文所用，通过治疗(如通过施用药物组合物或其他治疗)改善特定疾病或病症的症状，指可以归因于或关联于施用组合物或治疗的任何的症状减轻，无论永久或暂时的，持续或短暂的。
如本文所用，术语“诊断有效”量指含有可检测化合物的物质、化合物、材料或组合物的量，其至少足以在施用于对象之后检测所述化合物。通常，施用于对象用于检测的诊断有效量的抗RSV抗体或其抗原结合片段，如可检测标记的抗体或其抗原结合片段或者可以通过第二物质检测的抗体或其抗原结合片段，是这样的所述抗体或其抗原结合片段的量，其足以使得能够检测具有所述抗体或其抗原结合片段特异性的RSV抗原的位点。在本文所提供的抗体用于抗原的体内检测中，以诊断有效的剂量给予可检测标记的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，标记(label)或可检测部分是可以直接或间接附着或连接至分子(例如，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段)或与其相关联并且可以体内和/或体外检测的可检测的标记物(marker)(例如，荧光分子、化学发光分子、生物发光分子、造影剂(例如，金属)、放射性核素、发色团、可检测的肽、或者催化可检测的产物的形成的酶)。检测方法可以是本领域已知的任何方法，包括已知的体内和/或体外检测方法(例如，通过目视检查成像、磁共振(MR)波谱学、超声信号、X-射线、γ射线光谱学(例如，正电子成像术(PET)扫描、单光子发射计算机断层显像(SPECT))、荧光光谱学或吸收)。间接检测指测量直接或间接结合所述可检测部分的原子、分子或组合物的物理现象，例如能量或粒子发射或吸收(例如，检测结合第一抗体(例如，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段)的标记的第二抗体或其抗原结合片段)。
如本文所用，术语“对象”指动物，包括哺乳动物，如人。
如本文所用，患者指人对象。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类，包括人、大猩猩和猴；啮齿类，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、羊；猪和其他动物。非人动物排除人作为预期动物。本文所提供的多肽来自任何来源，动物、植物、原核和真菌。大多数多肽为动物来源，包括哺乳动物来源。
如本文所用，“老年人”指由于年龄而具有减少的免疫应答并具有减少的对疫苗接种的应答的对象。典型地，老年对象是65岁和更高龄的人，更典型地，70岁和更高龄。
如本文所用，“人类婴儿”指少于或约24个月(例如，少于或约16个月龄、少于或约12个月龄、少于或约6个月龄、少于或约3个月龄、少于或约2个月龄、或者少于或约1个月龄)的人。通常，人类婴儿在超过38周的胎龄出生。
如本文所用，“早产的人类婴儿”指在少于或约40周胎龄出生的人，通常，少于或约38周胎龄。
如本文所用，“单位剂量形式”指适合人和动物对象并且如本领域已知的独立包装的物理上分离的单位。
如本文所用，“单剂量剂型”指用于直接施用的制剂。
如本文所用，“制成品(article of manufacture)”是制造和销售的产品。如整个本申请所用，该术语旨在包括包含在包装物品中的本文所提供的任何组合物。
如本文所用，“流体”指可以流动的任何组合物。因此流体包括半固体形式的组合物、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳膏剂以及其他这样的组合物。
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白(例如分离的抗体或其抗原结合片段)或其生物活性部分(例如分离的抗原结合片段)基本上不含细胞物质或来自蛋白所源自的细胞或组织的其他污染蛋白，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。如果通过标准分析方法测定制品看起来不含容易检出的杂质，则可以确定其基本上不含杂质，所述分析方法例如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，本领域技术人员将这些方法用于评价这样的纯度或者足够纯从而进一步纯化不会可检测地改变物质的物理和化学性质，如酶促和生物活性。纯化化合物以制备基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这样的情况下，进一步纯化可以增加化合物的特定活性。如本文所用，“细胞提取物”或“裂解物”指从裂解或破裂的细胞制备的制品或级分。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
如本文所用，“对照”指与测试样品基本上相同的样品，除了未用测试参数处理，或者，如果是血浆样品，其可以来自未受所关注的疾病状况影响的正常志愿者。对照还可以是内参。
如本文所用，“组合物”指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或者它们的任何组合。
如本文所用，“组合”指两个或更多个项目之间或之中的任何关联。组合可以是两个或更多个不同项目，例如两个组合物或两个收集品，可以是它们的混合物，例如两个或更多个项目的单一混合物，或者它们的任何变异。组合的元件一般是功能上关联或相关的。
如本文所用，联合治疗指施用两种或更多种不同治疗剂，例如两种或更多种不同抗RSV抗体和/或抗RSV抗体及其抗原结合片段。不同治疗剂可以分别、顺序、间歇提供和施用，或者可以以单一组合物提供。
如本文所用，试剂盒是包装组合，其任选包括其他元件，例如额外的试剂以及使用所述组合或其元件的说明书，以用于包括但不限于活化、施用、诊断和评价生物学活性或特性的目的。
如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。因此，例如，提到包含“免疫球蛋白结构域”的多肽包括具有一个或多个免疫球蛋白结构域的多肽。
如本文所用，术语“或”用来表示“和/或”，除非明确表示仅指可选物或可选物互相排斥。
如本文所用，范围和量可以表达为“约”特定值或范围。约还包括确切的量。因此“约5个氨基酸”表示“约5个氨基酸”，并且还表示“5个氨基酸”。
如本文所用，“任选”或“任选地”表示随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或条件发生的情况和不发生的情况。例如，任选变异的部分表示该部分变异或未变异。
如本文所用，除非另有说明，任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写与其常见用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(参见，Biochem.(1972)11(9):1726-1732)一致。
B.综述
提供结合并中和呼吸道合胞病毒的抗RSV抗体或其抗原结合片段。本文所提供的抗RSV抗体是识别RSV表面上的一个或多个表位的中和抗体。特别地，本文所提供的抗体结合RSV融合(F)蛋白。本文所提供的抗体可以用于预防疗法。本文所提供的抗体还可以用作治疗剂。
例如，所提供的抗体可以用于预防和/或传播致病性疾病，包括但不限于抑制对象之间的病毒传播、抑制宿主中病毒感染的建立以及减少对象中的病毒载量。所述抗体还可以用于预防、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症状，或者用于减少RSV感染的持续时间。相应地，用本文所提供的抗体治疗患者可以降低与RSV感染相关的死亡率和/或发病率。
RSV持久性与不能被抗体中和的逃逸突变体的产生有关。因此，开发治疗性抗病毒抗体的主要挑战是产生或鉴定具有中和表位的抗体，其1)在不同病毒株或血清型中保守，并且2)演化中的病毒难以产生针对其的逃逸突变体。本文所提供的抗体结合各种RSV亚组和病毒株。本文所提供的抗体还表现出与现有技术中存在的抗体相比提高的病毒中和活性。所提供的抗体在连续数轮复制中有效中和病毒，其中RSV通常会产生逃逸突变体以抗中和。限制MARM的产生的能力表示本文所提供的抗体结合对所产生的逃逸突变体形式中的变化较不敏感的表位。因此，这种表位不同于其他已知的抗RSV抗体的表位。因此，除了预防疗法，所提供的抗RSV抗体还用于治疗RSV感染。目前，没有已知并批准的针对RSV感染的抗体治疗剂。因此，本文所提供的抗体对于治疗老年患者中的RSV感染特别重要，例如团体或养老院中的老年患者，其接近性增加病毒在患者中传播的风险。用本文所提供的抗体治疗在剂量方案的不依从性增加病毒逃逸的风险的情况下也很重要，如用帕利珠单抗预防治疗RSV中的不依从性日益导致病毒抗性(参见，例如，Adams et al.,(2010)Clin InfectDis.51(2):185-188)。
通常，本文所提供的抗RSV抗体以高亲和力结合RSV F蛋白。与现有批准的抗RSV抗体(例如帕利珠单抗；Synagis)相比，本文所提供的高亲和力抗RSV抗体允许较低频率的施用，用于预防和/或治疗RSV感染，用于预防、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症状，或者用于减少RSV感染的持续时间。因此，本文所提供的抗RSV抗体用作治疗性抗体，即，用于治疗RSV感染。较低频率的施用允许施用方案的较容易的依从性，并且因此减少漏服的可能性，漏服导致增加的对抗RSV抗体的病毒抗性。较低剂量的免疫特异性地结合RSV的抗体还可以减少免疫球蛋白疗法的副作用的可能性。
通常，本文所提供的抗RSV抗体具有抑制或减少病毒的一种或多种活性(例如，病毒与靶细胞膜的关联、病毒与靶细胞膜的融合和/或进入细胞、新病毒颗粒的产生)的能力，包括抑制病毒复制或者感染的细胞与另一细胞的细胞至细胞融合(即合胞体形成)。所提供的抗RSV抗体还可以用来增加针对RSV感染的免疫应答。
1.呼吸道合胞病毒
人RSV是副粘病毒科肺病毒(Pneumovirus)亚科的成员。人RSV有两个不同亚组，A组和B组。此外，每个亚型进一步分为两种病毒株，A1和A2，以及B1和B2。RSV是有包膜的非分段的负义RNA病毒，具有由编码11种病毒蛋白的约15,000个核苷酸组成的基因组。
RSV编码两种主要表面糖蛋白，糖蛋白G和糖蛋白F。糖蛋白G或附着蛋白介导病毒结合至细胞受体，而糖蛋白F或融合蛋白促进病毒与细胞膜的融合，允许病毒核糖核蛋白侵入细胞质(Lopez et al.(1998)J.Virology 72:6922-6928)。糖蛋白F还促进所感染的细胞的膜与相邻细胞的膜融合，导致合胞体的形成。F蛋白包含两个二硫键连接的亚基F1和F2，这是通过无活性的N-糖基化前体的蛋白酶切割产生的。G蛋白是80-90kDa的II型跨膜糖蛋白，包含连接至32kDa前体蛋白的N-联和O-联寡糖。
据证实针对RSV F或G糖蛋白制备的抗体在体外高效中和RSV，并且在体内具有预防效果(参见例如，Walsh et al.(1986)J.Gen.Microbiol.67:505;Beeler et al.(1989)J.Virol.63:2941-2950,Garcia-Borreno et al.(1989)J.Virol.63:925-932,Taylor etal.(1984)Immunology 52:137-142,以及美国专利第5,824,307号和第6,818,216号)。针对RSV F蛋白的抗体还有效抑制RSV感染的细胞与邻近未感染的细胞融合。
免疫特异性地结合RSV F蛋白的各种单克隆抗体的分析已导致鉴定3个不重叠的抗原位点A、B和C以及一个桥位点AB(Beeler et al.(1989)J.Virol.63:2941-2950)。每个抗原位点包含不同表位。在一组18种单克隆抗体的一个研究中，基于单克隆抗体逃逸突变体(MARM)鉴定了抗原位点A的5个表位、抗原位点B的4个表位以及抗原位点C的4个表位(参见，例如，Beeler et al.(1989)J.Virol.63:2941-2950)。结合抗原位点A表位4的单克隆抗体1129(Beeler et al.(1989)J.Virology 63(7):2841-2950)是产生人源化帕利珠单抗(SYNAGIS)的亲本抗体(参见Johnson et al.(1997)J.Infect.Diseases176:1215-1224和美国专利第5,824,307号)。还已鉴定额外的RSV F蛋白表位。例如，人抗RSV Fab片段Fab19(参见Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10164-10168和Crowe etal.,(1994)Proc.Natl.Acad Sci USA 91:1386-1390)结合与Beeler等人所鉴定的表位不同的抗原位点A中的表位(参见Crowe et al.(1998)Virology 252:373-375)和Barbas etal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10164-10168)。
RSV F蛋白跨越RSV A和B亚组表现出超过91%相似性，而RSV G蛋白在RSV A和RSVB亚组之间仅表现出53%氨基酸相似性(Sullender(2000)Clin.Microbiol.Rev.13:1-15)。因为A和B病毒亚型在大多数RSV流行中共传播，所以期望中和RSV的A和B亚型的抗体，例如本文所提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。
正如大多数RNA病毒，人RSV具有在选择压力下进行快速突变的能力。利用单克隆抗体在体外选择RSV逃逸突变体(MARM)是充分记录的(例如Garcia-Barreno et al.(1989)J.Virol.63:925-932)。例如，已证实氨基酸残基N262、I266、N268、K272、S275、N276、P389或R429处的单个氨基酸突变，或者F32和K272或者A241和K421处的双氨基酸突变影响已知的抗RSV单克隆抗体的逃逸(参见，例如，Crowe et al.(1998)Virology 252:373-375;Zhaoet al.,(2004)J.Infectious Disease 190:1941-1946和Liu et al.,(2007)VirologyJournal4:71)。此外，已证实帕利珠单抗(SYNAGIS)在体外以及体内选择逃逸突变体，并且一些分离的突变体在棉鼠中完全耐受帕利珠单抗预防(参见例如，Zhao et al.(2005)J.Virol.79:3962-3968和Zhao et al.(2004)J.Infect.Dis.190:1941-1946)。例如，已证实RSV F蛋白中的单个氨基酸突变导致逃脱帕利珠单抗(参见，Zhao et al.,(2004)J.Infectious Disease 190:1941-1946)。因此，优选在连续数轮的复制中有效中和RSV病毒而不产生逃逸突变体的抗体，如本文所提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。
呼吸道合胞病毒(RSV)感染是婴儿和小儿中下呼吸道疾病的主要原因。RSV感染还是美国1岁以下儿童中细支气管炎、或者肺中小气道炎症以及肺炎的最常见原因。此外，还认为RSV感染是老年人中呼吸系统疾病的重要原因。与RSV感染相关的症状和疾病状况包括例如哮喘、喘息、反应性气道疾病(RAD)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。相应地，如本文所述，本文所提供的抗RSV抗体可以用于预防和治疗RSV感染和/或缓解这类RSV介导的疾病的一种或多种症状。
C.抗RSV抗体
本文提供抗RSV抗体或其抗原结合片段，其可以用于治疗、预防和诊断用途。例如，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用于对象针对RSV的被动免疫，或者用于治疗患有病毒感染的对象。在一实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用于预防，即防止RSV感染。在另一实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用作治疗性抗体，即用于治疗RSV病毒感染。在另一实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用于对象针对RSV的被动免疫。所提供的抗-RSV抗体或其抗原结合片段还可以在体外和体内用于检测RSV感染或用于监测RSV感染。
1.一般抗体结构和功能结构域
天然通过B细胞以膜结合和分泌形式产生抗体。抗体通过同种(cognate)相互作用特异性识别和结合抗原表位。抗体结合同种抗原可以启动多重效应子功能，这引起毒素、病原体和其他传染性物质的中和和清除。
由于B细胞发育期间的重组事件天然地产生抗体特异性的多样性。通过这些事件，编码抗体分子的可变区的多个抗体V、D和J基因区段的各种组合与恒定区基因连接以产生具有大量不同抗体的天然抗体谱。人抗体谱包含超过1010种不同抗原特异性，并且因此理论上可以特异性识别任何外源抗原。抗体包括这样自然产生的抗体，以及合成，即重组产生的抗体，例如抗体片段，包括本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
在折叠的抗体多肽中，结合特异性是由包含部分重链和/或轻链可变区结构域的抗原结合位点结构域赋予的。抗体分子上的其他结构域通过参与诸如细胞转导以及与其他细胞、多肽和生物分子相互作用的事件来服务于效应子功能。这些效应子功能引起抗体识别的感染物质的中和和/或清除。抗体多肽的结构域可以根据本文的方法变化以改变特定特性。
a.抗体的结构和功能结构域
全长抗体包含多个链、结构域和区域。全长常规抗体包含两条重链和两条轻链，每条包含多个免疫球蛋白(Ig)结构域。Ig结构域的特征在于称为Ig折叠的结构，其包含两个β折叠，每个包含通过环连接的反向平行的β链。Ig折叠中的两个β折叠通过疏水相互作用和保守的链内二硫键夹在一起。抗体链中的Ig结构域为可变(V)和恒定(C)区结构域。每条重链通过二硫键连接至轻链，并且两条重链通过二硫键互相连接。重链的连接是通过称为铰链区的重链的柔性区介导的。
每条全长常规抗体轻链包含一个可变区结构域(VL)和一个恒定区结构域(CL)。每条全长常规重链包含一个可变区结构域(VH)以及三个或四个恒定区结构域(CH)以及在某些情况下铰链区。由于上文所讨论的重组事件，编码可变区结构域的核酸序列在抗体之间不同，并且赋予特定抗体抗原特异性。另一方面，恒定区由在抗体之间更保守的序列编码。这些结构域赋予抗体功能特性，例如，与免疫系统的细胞和血清蛋白相互作用以便引起传染性物质的清除的能力。不同类别的抗体(例如IgM、IgD、IgG、IgE和IgA)具有不同的恒定区，允许它们服务于不同的效应子功能。
每个可变区结构域包含称为互补性决定区(CDR)或高变(HV)区的三个部分，其由高度可变的核酸序列编码。CDR位于连接可变区Ig结构域的β折叠的环内。三个重链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和三个轻链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)一起组成抗体的常规抗原结合位点(antigen-binding site)(抗体结合位点(antibody combining site))，其与同种抗原物理相互作用并提供抗体的特异性。全抗体包含两个相同的抗体结合位点，每个由来自一条重链和一条轻链的CDR组成。因为它们包含在连接β链的环内，三个CDR沿可变区的线性氨基酸序列是不连续的。当抗体多肽折叠时，CDR环非常接近，组成抗原结合位点。可变区结构域的β折叠形成框架区(FR)，其包含对于抗体的其他特性(例如，稳定性)很重要的更保守的序列。
b.抗体片段
本文所提供的抗体包括抗体片段，其为包含少于全长抗体的全序列但保留全长抗体的至少部分特异性结合能力的全长抗体的衍生物。抗体片段还可以包括抗体的抗原结合部分，其可以插入抗体框架(例如，嵌合抗体)以保留亲本抗体的结合亲和力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003);Chapter1;p3-25,Kipriyanov)。抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链，并且可以重组产生。抗体片段还可以包含合成的接头(例如肽接头)以连接两个或更多个结构域。用于产生抗原结合片段的方法是本领域公知的，并且可以用来修饰本文所提供的任何抗体。抗体分子的片段可以例如通过酶促切割产生。例如，当通过木瓜蛋白酶来蛋白酶切割时，重链恒定区的二聚体Fc结构域从两个Fab区(即包含可变区的部分)切下。
单链抗体可以通过连接特定抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)来重组工程化。可变区的特定核酸序列可以通过标准分子生物学方法克隆，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)和其他重组核酸技术。例如，制备sFv的方法如Whitlow and Filpula(1991)Methods,2:97-105;Bird et al.(1988)Science 242:423-426;Pack et al.(1993)Bio/Technology11:1271-77;以及美国专利号4,946,778、5,840,300、5,667,988、5,658,727、5,258,498)所述。单链抗体还可以通过筛选单链抗体文库中结合靶抗原的单链抗体来鉴定。构建和筛选这类文库的方法是本领域公知的。
2.示例性抗RSV抗体
本文提供结合并中和RSV的抗体或其抗原结合片段。具体地，所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地结合RSV F蛋白。例如，本文所提供的抗RSV抗体免疫特异性地结合分离或纯化或重组的RSV F蛋白。在另一实例中，本文所提供的抗RSV抗体免疫特异性地结合编码表面糖蛋白F(RSV F蛋白)的RSV病毒体或RSV病毒。
本文所提供的抗RSV抗体表现出有利的或与本领域的抗RSV抗体不同的特性。例如，本文所提供的抗体包括表现出较低或改善的对RSV F蛋白的结合亲和力的抗RSV抗体，如较低或改善的对分离或纯化或重组的RSV F蛋白或者对表达天然F蛋白的RSV病毒或病毒体的结合亲和力。在其他实例中，本文所提供的抗体包括表现出改善或更好的RSV中和活性的抗-RSV抗体。在具体实例中，本文所提供的抗RSV抗体包括结合RSV上的表位的抗体，其与其他现有技术或存在的抗RSV抗体相比对所产生的逃逸突变体(MARM)形式中的变化较不敏感。例如，在本文所提供的抗RSV抗体(例如抗体30D8或者其全长或其他抗体片段形式)的存在下，RSV不能在超过10轮病毒复制后产生逃逸突变体，并且一般不能在超过11、12、13、14、15、16、17、18、19或20轮后产生逃逸突变体。
抗RSV抗体包括抗体sc5或58c5，或者其全长或其他抗体片段形式(参见例如美国专利公开第US2011/0076268号和国际公开PCT申请第WO2011/020079号)。58c5为Fab片段，其包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链以及具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链。58c5的抗体或抗原-片段形式以及与58c5结合相同表位的抗体或抗原-片段形式包含重链和轻链，所述重链具有以下互补性决定区(CDR)：如GASINSDNYYWT(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:435所示的VH CDR1，如HISYTGNTYYTPSLKS(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR2，以及如CGAYVLISNCGWFDS(SEQ ID NO:4)所示的VH CDR3；所述轻链具有以下CDR：如QASQDISTYLN(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1，如GASNLET(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2，以及如QQYQYLPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3。通常，58c5的抗体片段形式包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-125所示的氨基酸序列的VH结构域以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸1-107所示的氨基酸序列的VL结构域。sc5为Fab片段，其包含具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链以及具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的轻链。sc5的抗体或抗原-片段形式以及与sc5结合相同表位的抗体或抗原-片段形式包含重链和轻链，所述重链具有以下互补性决定区(CDR)：如GDSISGSNWWN(SEQ ID NO:10)或SEQ ID NO:436所示的VH CDR1，如EIYYRGTTNYKSSLKG(SEQID NO:11)所示的VH CDR2，以及如GGRSTFGPDYYYYMDV(SEQ ID NO:12)所示的VH CDR3；所述轻链具有以下CDR：如RASQNIKNYLN(SEQ ID NO:14)所示的VL CDR1，如AASTLQS(SEQ ID NO:15)所示的VL CDR2，以及如QQSYNNQLT(SEQ ID NO:16)所示的VL CDR3。通常，sc5的抗体片段形式包括具有SEQ ID NO:9的氨基酸1-125所示的氨基酸序列的VH结构域以及具有SEQ IDNO:13的氨基酸1-107所示的氨基酸序列的VL结构域。
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、和抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、或者上述任一种的抗原结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过以下形式用于治疗和诊断的方法，包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、或者上述任一种的抗原结合片段。具体地，所述抗体包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
本文所提供的免疫特异性地结合RSV F蛋白的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段包括30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9和69F6，其为本文其他地方详述的Fab片段。本文所提供的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段还包括含有重链和/或轻链的抗RSV抗体或其抗原结合片段，所述重链包含30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的可变重(VH)结构域和恒定重结构域1(CH1)，所述轻链包含30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的可变轻(VL)结构域和恒定轻结构域(CL)。例如，本文所提供的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段包括含有重链和/或轻链的抗RSV抗体或其抗原结合片段，所述重链具有SEQ ID NO:396、398、400、402、404、452、454或456所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:395、397、399、401、403、453、455或457所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:396所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:395所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:398所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:397所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:400所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:399所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:402所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:401所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ IDNO:404所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:403所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:452所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:453所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:454所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:455所示的氨基酸序列。在一具体实例中，所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链具有SEQ ID NO:456所示的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:457所示的氨基酸序列。
本文所提供的抗体包括30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的全长抗体形式。本文所提供的抗体还包括含有30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗原结合位点(例如CDR)的全长抗体形式。本文所提供的全长抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含本领域已知的任何轻链和重链恒定区，例如本领域已知的任何人恒定区。例如，本文所提供的全长抗体可以包含轻链恒定区(CL)，其为人轻链κ(kappa)、人轻链λ(lambda)。本文所提供的全长抗体可以包含任何同种型的重链恒定区(CH1-接头-CH2-CH3)，具体地其为IgG。所述恒定区可以是IgG1亚类的恒定区(SEQ ID NO:356)、IgG2的恒定区(SEQ ID NO:357)、IgG3的恒定区(SEQ ID NO:358)或IgG4的恒定区(SEQ ID NO:359)。具体地，本文所提供的任何抗体的全长抗体形式包含IgG、IgG1亚类的恒定区。
本文所提供的抗体包括免疫特异性地结合RSV F蛋白的30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9和69F6的其他抗体片段形式。这类片段包括保留结合RSV F蛋白的能力的其任何抗原结合片段或者包含30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗原结合片段的工程化抗体。这类抗体包括例如嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、或者上述任一种的抗原结合片段。在具体实例中，所述抗体为Fab 30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6。
本文所提供的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段包括含有VH结构域和/或可变轻VL结构域的抗RSV抗体或其抗原结合片段，所述VH结构域和/或可变轻VL结构域分别具有30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的VH结构域和/或VL结构域的氨基酸序列。例如，抗体或其抗原结合片段可以包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域具有SEQID NO:398或402的氨基酸1-125、SEQ ID NO:396的氨基酸1-121、SEQ ID NO:404的氨基酸1-123、SEQ ID NO:400或452的氨基酸1-124、SEQ ID NO:454的氨基酸1-133或者SEQ IDNO:456的氨基酸1-118所示的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ ID NO:397、403或455的氨基酸1-107、SEQ ID NO:399的氨基酸1-108、SEQ ID NO:395的氨基酸1-110、SEQ ID NO:401的氨基酸1-113、SEQ ID NO:453的氨基酸1-111或者SEQ ID NO:457的氨基酸1-109所示的氨基酸序列。
本文所提供的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段包括含有VH结构域和/或VL结构域的抗RSV抗体或其抗原结合片段，所述VH结构域和/或VL结构域具有分别与30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的VH结构域和/或VL结构域至少或约80%相同性的氨基酸序列。例如，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域具有与SEQ ID NO:398或402的氨基酸1-125、SEQ ID NO:396的氨基酸1-121、SEQID NO:404的氨基酸1-123、SEQ ID NO:400或452的氨基酸1-124、SEQ ID NO:454的氨基酸1-133或者SEQ ID NO:456的氨基酸1-118所示的氨基酸序列80%相同性的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ ID NO:397、403或455的氨基酸1-107、SEQ ID NO:399的氨基酸1-108、SEQ ID NO:395的氨基酸1-110、SEQ ID NO:401的氨基酸1-113、SEQ ID NO:453的氨基酸1-111或者SEQ ID NO:457的氨基酸1-109所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域具有与SEQ ID NO:398或402的氨基酸1-125、SEQ ID NO:396的氨基酸1-121、SEQ ID NO:404的氨基酸1-123、SEQ ID NO:400或452的氨基酸1-124、SEQ IDNO:454的氨基酸1-133或者SEQ ID NO:456的氨基酸1-118所示的氨基酸序列至少或约81%、至少或约82%、至少或约83%、至少或约84%、至少或约85%、至少或约86%、至少或约87%、至少或约88%、至少或约89%、至少或约90%、至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%或者至少或约99%相同性的氨基酸序列，所述VL结构域具有与SEQ ID NO:397、403或455的氨基酸1-107、SEQ ID NO:399的氨基酸1-108、SEQ ID NO:395的氨基酸1-110、SEQ ID NO:401的氨基酸1-113、SEQ IDNO:453的氨基酸1-111或者SEQ ID NO:457的氨基酸1-109所示的氨基酸序列至少或约81%、至少或约82%、至少或约83%、至少或约84%、至少或约85%、至少或约86%、至少或约87%、至少或约88%、至少或约89%、至少或约90%、至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%或者至少或约99%相同性的氨基酸序列。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:396的氨基酸1-121所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:395的氨基酸1-110所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:398的氨基酸1-125所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:397的氨基酸1-107所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:400的氨基酸1-124所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:399的氨基酸1-108所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:402的氨基酸1-125所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:401的氨基酸1-113所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:404的氨基酸1-123所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:403的氨基酸1-107所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:452的氨基酸1-124所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:453的氨基酸1-111所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:454的氨基酸1-133所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:455的氨基酸1-107所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
因此，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:456的氨基酸1-118所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域，并且包含具有与SEQ ID NO:457的氨基酸1-109所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性，例如90%-99%或至少95%相同性，如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
还提供抗RSV抗体或其抗原结合片段，其包含选自30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的CDR的一个或多个VH互补性决定区(CDR)。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:405、411、417、423、429、437-441、458、464、470或482-484所示的氨基酸序列的VH CDR1。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列GFTFSGHTIA(SEQ ID NO:405)、GGTFDTYTIS(SEQ ID NO:411)、GFSITDFGIH(SEQ IDNO:417)、GASISSDNHYWS(SEQID NO:423)、GFTLKNYEMN(SEQ ID NO:429)、GHTIA(SEQ ID NO:437)、TYTIS(SEQ ID NO:438)、DFGIH(SEQ ID NO:439)、SDNHYWS(SEQ ID NO:440)、NYEMN(SEQ ID NO:441)、GVSINSNNYFWA(SEQ ID NO:458)、GDSFNDYFWT(SEQ ID NO:464)、GYSFTSYWIA(SEQ ID NO:470)、SNNYFWA(SEQ ID NO:482)、DYFWT(SEQ ID NO:483)或SYWIA(SEQ ID NO:484)的VH CDR1。
在另一实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:406、412、418、424、430、459、465或471所示的氨基酸序列的VH CDR2。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列WVSTNNGNTEYAQKIQG(SEQ ID NO:406)、RIIPSLGETNYAHKLQG(SEQ ID NO:412)、LISYNEVNIHYGESVRG(SEQ ID NO:418)、SIYYTGGTNYNPSLKS(SEQ ID NO:424)、YISSSGNVVKYVDSVQG(SEQ ID NO:430)、NIYYGGSTHYNASLQS(SEQ ID NO:459)、EISHSGSTNYSPSLKS(SEQ ID NO:465)或IIFPNDSDATYSPSFQG(SEQ ID NO:471)的VH CDR2。
在另一实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:407、413、419、425、431、460、466或472所示的氨基酸序列的VH CDR3。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列EWLVMGGFAFDH(SEQ ID NO:407)、RITGPVDWVWDYGMDV(SEQ ID NO:413)、DVWEDSWLSLACFQE(SEQ ID NO:419)、GLFFITARPYWYFDL(SEQ ID NO:425)或GFSIDKYDSSVDEY(SEQ ID NO:431)、SESIFWDYYYGLDV(SEQ ID NO:460)、GVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMDV(SEQ ID NO:466)或QYYLGSFES(SEQ IDNO:472)的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:405所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:406所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:407所示的氨基酸序列的VHCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:437所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:406所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:407所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:411所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:412所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:413所示的氨基酸序列的VHCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:438所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:412所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:413所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:417所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:418所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:419所示的氨基酸序列的VHCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:439所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:418所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:419所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:423所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:424所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:425所示的氨基酸序列的VHCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:440所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:424所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:425所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:429所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:430所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:431所示的氨基酸序列的VHCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:441所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:430所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:431所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:458所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:459所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:460所示的氨基酸序列的VH CDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:482所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:459所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:460所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:464所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:465所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:466所示的氨基酸序列的VH CDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:483所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:465所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:466所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:470所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:471所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ IDNO:472所示的氨基酸序列的VHCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:484所示的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:471所示的氨基酸序列的VH CDR2以及具有SEQ ID NO:472所示的氨基酸序列的VH CDR3。
还提供抗RSV抗体或其抗原结合片段，其包含选自30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的CDR的一个或多个VL互补性决定区(CDR)。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:408、414、420、426、432、461、467或473所示的氨基酸序列的VL CDR1。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列GANNIGSQNVH(SEQ ID NO:408)、RASQNIKTYLN(SEQ ID NO:414)、RASQSISNWLA(SEQ ID NO:420)、RSSQSLLDSDDGNTYLD(SEQ ID NO:426)、RASQSISNFLN(SEQ ID NO:432)、TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO:461)、RASQNINTWLA(SEQ ID NO:467)或QASDISNYLN(SEQ IDNO:473)的VL CDR1。
在另一实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:409、415、421、427、433、462、468或474所示的氨基酸序列的VL CDR2。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列DDRDRPS(SEQ ID NO:409)、AVSNLQS(SEQ ID NO:415),KASNLED(SEQ ID NO:421)、TLSYRAS(SEQ ID NO:427)、AASSLQG(SEQ ID NO:433)、EVTKRPS(SEQ ID NO:462)、AASFLQS(SEQ ID NO:468)或DASYLDT(SEQ ID NO:474)的VLCDR2。
在另一实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:410、416、422、428、434、463、469或475所示的氨基酸序列的VL CDR3。例如，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列QVWDSSRDQAVI(SEQ ID NO:410)、QQSFSIPLT(SEQID NO:416)、QQYNSYSGLS(SEQ ID NO:422)、MQRMEFPFT(SEQ ID NO:428)、QQTYISLYT(SEQID NO:434)、SSYAGSRHVV(SEQ ID NO:463)、QQANSFPRT(SEQ ID NO:469)或QQYDDLRGGFT(SEQ ID NO:475)的VLCDR3。
在一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:408所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:409所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ IDNO:410所示的氨基酸序列的VLCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:414所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:415所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ ID NO:416所示的氨基酸序列的VL CDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:420所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:421所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ ID NO:422所示的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:426所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:427所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQID NO:428所示的氨基酸序列的VLCDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:432所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:433所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ ID NO:434所示的氨基酸序列的VL CDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:461所示的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:462所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ ID NO:463所示的氨基酸序列的VL CDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQID NO:467所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:468所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ ID NO:469所示的氨基酸序列的VL CDR3。在另一具体实例中，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:473所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:474所示的氨基酸序列的VL CDR2以及具有SEQ ID NO:475所示的氨基酸序列的VL CDR3。
可以选择本文所提供的CDR的任何组合用于产生抗体或其抗原结合片段，只要该抗体或抗原结合片段保留免疫特异性地结合RSV F蛋白的能力。所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含本领域已知的抗体框架区。示例性框架区包括分离的天然存在的或共有的框架区，包括人框架区(参见，例如，Chothia et al.(1998)J.Mol.Biol.278:457-479)。在一些实例中，所述抗体框架区为人抗体框架区。在一些实例中，所述抗体或抗原结合片段包含30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的框架区。
本文所提供的示例性分离的抗RSV抗体或其抗原结合片段包括免疫特异性地与本文所提供的任何抗体结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白上的相同表位的任何抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一实例中，本文提供与30D8结合相同表位的抗体，30D8是包含SEQID NO:396所示的重链和SEQ ID NO:395所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与104E5结合相同表位的抗体，104E5是包含SEQ ID NO:398所示的重链和SEQ ID NO:397所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与38F10结合相同表位的抗体，38F10是包含SEQ IDNO:400所示的重链和SEQ ID NO:399所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与14G3结合相同表位的抗体，14G3是包含SEQ ID NO:402所示的重链和SEQ ID NO:401所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与90D3结合相同表位的抗体，90D3是包含SEQ ID NO:404所示的重链和SEQ ID NO:403所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与56E11结合相同表位的抗体，56E11是包含SEQ ID NO:452所示的重链和SEQ ID NO:453所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与17C9结合相同表位的抗体，17C9是包含SEQ ID NO:454所示的重链和SEQ ID NO:455所示的轻链的抗体。在另一实例中，本文提供与69F6结合相同表位的抗体，69F6是包含SEQ ID NO:456所示的重链和SEQ ID NO:457所示的轻链的抗体。通常，这类抗体包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链或其抗原结合片段。
本文所提供的抗体或抗原结合片段表现出至少或约1×108M-1、至少或约2.5×108M-1、至少或约5×108M-1、至少或约1×109M-1、至少或约5×109M-1、至少或约1×1010M-1、至少或约5×1010M-1、至少或约1×1011M-1、至少或约5×1011M-1、至少或约1×1012M-1、至少或约5×1012M-1、至少或约1×1013M-1、至少或约5×1013M-1、至少或约1×1014M-1、至少或约5×1014M-1、至少或约1×1015M-1或者至少或约5×1015M-1的对RSV F蛋白表位的结合亲和常数(Ka)。本文所提供的抗体可以表现出对重组纯化的F蛋白的结合亲和力，例如SEQ ID NO:25所示的RSV A2病毒株F蛋白的细胞外结构域。本文所提供的抗体还可以表现出对天然RSV F蛋白的结合亲和力，例如通过细胞中RSV的感染和表达所产生的RSV F蛋白。本文所提供的抗体可以具有相同或不同的对重组F蛋白对天然RSV F蛋白的结合亲和力。例如，实施例5显示30D8对重组F蛋白具有比对天然RSV F蛋白更高的结合亲和力。相比之下，无论RSV F蛋白是天然或重组F蛋白，sc5(参见例如美国专利公开第US2011/0076268号和国际公开PCT申请第WO2011/020079号)表现出相似的结合亲和力。
在一些实例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段具有少于或约1×10-8M、少于或约4×10-9M、少于或约2×10-9M、少于或约1×10-9M、少于或约2×10-10M、少于或约1×10-10M、少于或约2×10-11M、少于或约1×10-11M、少于或约2×10-12M、少于或约1×10-12M、少于或约2×10-13M、少于或约1×10-13M、少于或约2×10-14M、少于或约1×10-14M、少于或约2×10-15M、少于或约1×10-15M或者少于或约2×10-16M的对RSV F蛋白表位的解离常数(Kd)。
在一些实例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段在体外微量中和测定中中和RSV的的EC50为少于或约0.005nM、少于或约0.01nM、少于或约0.025nM、少于或约0.05nM、少于或约0.075nM、少于或约0.1nM、少于或约0.5nM、少于或约0.75nM、少于或约1nM、少于或约少于或约1.25nM、少于或约1.5nM、少于或约1.75nM、少于或约2nM。在具体实例中，本文所提供的分离的抗RSV抗体或抗原结合片段在体外空斑减少测定中中和RSV的EC50为少于或约0.005nM至少于或约2nM；少于或约0.005nM至少于或1nM；少于或约0.005nM至少于或约0.5nM；少于或0.01nM至少于或约1nM；少于或约0.05nM至少于或约1nM；少于或约0.05nM至少于或约0.5nM；或者少于或约0.1nM至少于或约0.5nM。
在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段在中和RSV的体外微量中和测定中中和针对各种抗RSV抗体的单克隆抗体逃逸突变体(MARM)。在一具体实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段中和MARM，该中和的EC50与中和产生MARM的亲本RSV病毒株的EC50相同或大约相同。如果第一抗体可以中和针对第二抗体产生的MARM，可以得出结论所述抗体特异性结合不同表位或与不同表位相互作用。
在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段结合对所产生的逃逸突变体(MAR MS)形式中的变化较不敏感的表位。在一些实例中，在本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的存在下，RSV在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多轮连续的病毒复制后不能产生逃逸突变体。在一具体实例中，在本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的存在下，RSV在11、12、13、14、15或更多轮连续的病毒复制后不产生逃逸突变体。在另一具体实例中，RSV不能从本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段逃脱。例如，实施例11A显示在30D8的存在下，12轮病毒复制后RSV不能逃脱。相比之下，仅在7轮病毒复制后RSV就能够逃脱Motavizumab
在一些实例中，相对于所述抗RSV抗体或其抗原结合片段不存在的情况下RSV与其宿主细胞受体的结合，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制RSV与其宿主细胞受体的结合至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中，相对于所述抗RSV抗体或其抗原结合片段不存在的情况下的RSV复制，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制RSV复制至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
在一些实例中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段具有15天或更长、20天或更长、25天或更长、30天或更长、40天或更长、45天或更长、50天或更长、55天或更长、60天或更长、3个月或更长、4个月或更长或者5个月或更长的半衰期。增加本文所提供的抗体或其抗原结合片段的半衰期的方法是本领域已知的。这类方法包括例如，如本文其他地方所述的聚乙二醇化、糖基化和氨基酸取代。
a.衍生抗体
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用来产生衍生抗体，例如嵌合抗体或其他抗原结合片段，如Fab、Fab′、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段。通常，来源于亲本抗体的衍生抗体或抗原结合片段保留所述亲本抗体的结合特异性。抗体片段可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，利用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)的酶通过蛋白酶切割免疫球蛋白分子可以产生Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。此外，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以利用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的抗原结合可变区可以重组融合至本领域已知的一个或多个恒定区以产生嵌合全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2或其他抗原结合片段。从抗体片段产生全长抗体的示例性方法是本领域已知的，并且如本文所提供。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的(参见例如，Morrison(1985)Science 229:1202;Oi etal.(1986)BioTechniques 4:214;Gillies et al.(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202;以及美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397)。
包含来自本文所提供的抗RSV抗体的一个或多个CDR以及来自异源免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体可以利用本领域已知的各种技术产生，包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公开第WO 91/09967号；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰或重塑(EP 592,106;EP 519,596;Padlan(1991)Molecular Immunology 28(4/5):489-498;Studnicka et al.(1994)Protein Engineering 7(6):805-814;和Roguska et al.(1994)PNAS 91:969-973)以及链改组(美国专利第5,565,332号)。
在一些实例中，抗体包含30D8的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:405-410和437所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，
抗体包含104E5的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:411-416和438所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，抗体包含38F10的一个或多个CDR(例如，SEQ IDNO:417-422和439所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，抗体包含14G3的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:423-428和440所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，抗体包含90D3的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:429-434和441所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，抗体包含56E11的一个或多个CDR(例如，SEQID NO:458-463和482所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，抗体包含17C9的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:464-469和483所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。在一些实例中，抗体包含69F6的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:470-475和484所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。框架区中的框架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变，例如提高抗原结合。通过本领域公知的方法来鉴定这些框架取代，例如，通过模拟CDR与框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合很重要的框架残基以及序列比较以鉴定在特定位置的罕见框架残基(参见，例如，美国专利第5,585,089号；以及Riechmann etal.(1988)Nature 332:323)。
在一些实例中，衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段具有至少或约1×8M-1、至少或约2.5×8M-1、至少或约5×8M-1、至少或约1×9M-1、至少或约5×9M-1、至少或约1×10M-1、至少或约5×10M-1、至少或约1×11M-1、至少或约5×11M-1、至少或约1×12M-1、至少或约5×12M-1、至少或约1×13M-1、至少或约5×13M-1、至少或约1×14M-1、至少或约5×14M-1、至少或约1×15M-1或者至少或约5×15M-1的对RSV F蛋白表位的结合亲和常数(Ka)。
在一些实例中，衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段具有少于或约1×10-8M、少于或约4×10-9M、少于或约2×10-9M、少于或约1×10-9M、少于或约2×10-10M、少于或约1×10-10M、少于或约2×10-11M、少于或约1×10-11M、少于或约2×10-12M、少于或约1×10-12M、少于或约2×10-13M、少于或约1×10-13M、少于或约2×10-14M、少于或约1×10-14M、少于或约2×10-15M、少于或约1×10-15M或者少于或约2×10-16M的对RSV F蛋白表位的解离常数(Kd)。
在一些实例中，衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段在中和RSV的体外微量中和测定中中和针对各种抗RSV抗体的单克隆抗体逃逸突变体(MARM)。在一具体实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段中和MARM，该中和的EC50与中和产生MARM的亲本RSV病毒株的EC50相同或大约相同。
在一些实例中，衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段结合对所产生的逃逸突变体形式中的变化较不敏感的表位。在一些实例中，在本文所提供的衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段的存在下，RSV在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多轮连续的病毒复制后不能产生逃逸突变体。在另一具体实例中，RSV不能从本文所提供的衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段逃脱。
在一些实例中，衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段在体外微量中和测定中中和RSV的EC50为少于或约0.005nM、少于或约0.01nM、少于或约0.025nM、少于或约0.05nM、少于或约0.075nM、少于或约0.1nM、少于或约0.5nM、少于或约0.75nM、少于或约1nM、少于或约少于或约1.25nM、少于或约1.5nM、少于或约1.75nM或者少于或约2nM。在具体实例中，衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段在体外空斑减少测定中中和RSV的EC50为少于或约0.005nM至少于或约2nM；少于或约0.005nM至少于或1nM；少于或约0.005nM至少于或约0.5nM；少于或0.01nM至少于或约1nM；少于或约0.05nM至少于或约1nM；少于或约0.05nM至少于或约0.5nM；或者少于或约0.1nM至少于或约0.5nM。
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的任何衍生物可以用于治疗方案、预防疗法和/或诊断技术，例如用于所提供的方法。例如，所述衍生抗体或其抗原结合片段可以用来结合RSV，用于治疗、预防和/或检测RSV感染或者缓解RSV感染的一种或多种症状。
i.单链抗体
在具体实例中，所述抗RSV抗体为单链抗体。单链抗体可以从本文所提供的任何抗RSV抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域产生。利用重组技术产生单链抗体的方法是本领域已知的，例如Marasco et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893,Whitlow and Filpula(1991)Methods,2:97-105;Bird et al.(1988)Science 242:423-426;Pack et al.(1993)Bio/Technology 11:1271-77;以及美国专利号4,946,778、5,840,300、5,667,988、5,658,727所述的方法。
单链抗体可以包含本文所提供的任何抗RSV抗体或其抗原结合片段的轻链可变(VL)结构域或其功能区以及重链可变(VH)结构域或其功能区。在一些实例中，所述单链抗体的VL结构域或其功能区包含本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的互补性决定区1(CDR1)、互补性决定区2(CDR2)和/或互补性决定区3(CDR3)。在一些实例中，所述单链抗体的VH结构域或其功能区包含本文所提供的任何抗RSV抗体或其抗原结合片段的互补性决定区1(CDR1)、互补性决定区2(CDR2)和互补性决定区3(CDR3)。在一些实例中，所述单链抗体进一步包含肽接头。在这类实例中，肽接头可以位于轻链可变结构域(VL)与重链可变结构域(VH)之间。
所述单链抗体可以包含该抗体的一个或多个结构域之间的肽间隔物或接头。例如，抗体的轻链可变结构域(VL)可以通过柔性接头肽偶联至重链可变结构域(VH)。各种肽接头是本领域公知的，并且可以用于所提供的方法。肽接头可以包括一系列甘氨酸残基(Gly)或丝氨酸(Ser)残基。多肽接头的实例为具有氨基酸序列(Gly-Ser)n、(GlymSer)n或(SermGly)n的肽，其中m为1-6，通常为1-4，并且典型为2-4，而n为1-30，或者1-10，并且典型为1-4，具有分散的一些谷氨酸(Glu)或赖氨酸(Lys)残基以增加溶解性(参见，例如，国际PCT申请第WO 96/06641号，其提供用于缀合物的示例性接头)。示例性肽接头包括但不限于具有序列GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:267)、GSGRSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:268),EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:269)、EGKSSGSGSESKSTQ(SEQ ID NO:270)、
EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:271)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:272)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:273)和ESGSVSSEELAFRSLD(SEQ ID NO:274)的肽。通常，接头肽的长度为约1-50个氨基酸。本文所用的接头还可以增加细胞内可用性、血清稳定性、
特异性和溶解性，或者提供增加的柔性或解除空间位阻。连接部分例如Huston etal.(1988)Proc Natl Acad Sci USA85:5879-5883,Whitlow et al.(1993)ProteinEngineering6:989-995,和Newton et al.,(1996)Biochemistry 35:545-553所述。其他合适的肽接头包括美国专利第4,751,180号或第4,935,233号所述的任何肽接头，这些文献援引加入本文。
ii.抗独特型抗体
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用来利用本领域技术人员公知的技术产生“模拟”RSV F蛋白抗原(与所述抗体免疫特异性地结合)的抗独特型抗体(参见，例如，Greenspan & Bona(1989)FASEB J.7(5):437-444;和Nissinoff(1991)J.Immunol.147(8):2429-2438)。例如，如本领域公知的测定所确定的，本文所提供的结合并竞争性抑制RSV结合其宿主细胞受体的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用来产生“模拟”RSV抗原并结合RSV受体的抗独特型，即与病毒竞争结合宿主细胞，因此降低宿主细胞的病毒感染率。在一些实例中，抗抗独特型可以通过技术人员公知的技术产生。所述抗抗独特型模拟所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的结合结构域，并且因此结合和中和RSV。
iii.多特异性抗体和抗体多聚化
可以将本文所提供的两个或更多个抗体或其抗原结合片段工程化以形成多价衍生抗体或聚合物，例如二价、三价、四价、五价、六价、七价或更多价(即，包含2、3、4、5、6、7或更多个抗原结合位点)衍生抗体。这类多价衍生抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的。
在一些实例中，所述多价衍生抗体是单特异性的，包含两个或更多个免疫特异性地结合相同表位的抗原结合结构域。在一些实例中，所述多价衍生抗体是多特异性的，包含两个或更多个免疫特异性地结合两个或更多个不同表位的抗原结合结构域。在一些具体实例中，所述多价衍生抗体是二价的，包含两个抗原结合结构域。这类二价抗体可以是同二价或异二价抗体，它们分别免疫特异性地结合相同或不同表位。
在一些实例中，所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV的两个或更多个不同表位。工程化多特异性抗体的技术是本领域已知的，并且包括例如通过共价、非共价或化学连接的两个或更多个抗原结合片段的连接。在某些情况下，多价衍生抗体可以通过两个或更多个抗RSV抗体或其抗原结合片段的二聚化形成。两个抗RSV抗体或抗原结合片段之间的多聚化可以是自发的，或者可以由于两个或更多个多肽的强迫连接而发生。在一实例中，抗RSV抗体的聚合物可以通过不同抗RSV抗体上的半胱氨酸残基之间形成的二硫键来连接。在另一实例中，多价衍生抗体可以包括通过与融合至抗体或其抗原结合片段的肽部分的共价或非共价相互作用连接的抗RSV抗体或其抗原结合片段。这类肽可以是肽接头(间隔物)，或者是具有促进多聚化的特性的肽。在一些实例中，多价衍生抗体可以在两个抗体之间通过化学连接形成，例如通过异双功能接头。
任何多特异性和/或多价衍生抗体可以从本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段产生，只要抗体是生物相容的(例如，用于施用动物，包括人)并且保持其活性，例如结合RSV的一个或多个表位和/或中和RSV。对于本文所提供的多特异性和多价衍生抗体，所述衍生抗体至少对30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6识别的表位是免疫特异性的。本文所提供的多特异性和多价衍生抗体还可以对58c5或sc5识别的表位是免疫特异性的。
在一些实例中，所述多特异性和/或多价抗体包含具有SEQ ID NO:2、10、405、411、417、423、429、435-441、458、464、470或482-484所示的氨基酸序列的VH CDR1，具有SEQ IDNO:3、11、406、412、418、424、430、459、465或471所示的氨基酸序列的VH CDR2，具有SEQ IDNO:4、12、407、413、419、425、431、460、466或472所示的氨基酸序列的VH CDR3，具有SEQ IDNO:6、14、408、414、420、426、432、461、467或473所示的氨基酸序列的VL CDR1，具有SEQ IDNO:7、15、409、415、421、427、433、462、468或474所示的氨基酸序列的VL CDR2，具有SEQ IDNO:8、16、410、416、422、428、434、463、469或475所示的氨基酸序列的VL CDR3，或者它们的任何组合。
在一些实例中，可以产生多特异性抗体，其免疫特异性地结合RSV F蛋白(例如，具有SEQ ID NO:282、382或485所示的氨基酸序列的RSV F蛋白)的两个或更多个表位。例如，所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的A、B或C抗原区中的两个或更多个不同表位。在一些实例中，可以产生多特异性抗体，其免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和另一RSV表位。例如，所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和另一RSV表面糖蛋白的表位。在一些实例中，所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和选自以下RSV蛋白的表位：RSV附着蛋白(例如，具有SEQ ID NO:275所示的氨基酸序列)、RSVRNA聚合酶β亚基大结构蛋白(L蛋白)(例如具有SEQ ID NO:276所示的氨基酸序列)、RSV核壳蛋白(例如，具有SEQ ID NO:277所示的氨基酸序列)、RSV核蛋白(N)(例如，具有SEQ ID NO:278所示的氨基酸序列)、RSV磷蛋白P(例如具有SEQ ID NO:279所示的氨基酸序列)、RSV基质蛋白(例如具有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列)、RSV小疏水(SH)蛋白(例如具有SEQ ID NO:281所示的氨基酸序列)、RSV RNA依赖性聚合酶、RSV G蛋白(例如具有SEQ ID NO:282所示的氨基酸序列)，或者上述任何蛋白的等位变体。在一些实例中，所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和RSV G蛋白的表位。
在一些实例中，所述多特异性抗体包含来源于30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗RSV抗原结合片段以及来源于另一抗RSV抗体的抗RSV抗原结合片段。例如，另一抗RSV抗体可以是来源于58c5或sc5的抗体或抗原结合片段。在一些实例中，所述多特异性抗体包含来源于30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗RSV抗原结合片段以及来源于选自以下抗RSV抗体的抗RSV抗原结合片段：帕利珠单抗(SYNAGIS)，及其衍生物，例如但不限于莫他珠单抗(NUMAX)、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S(参见，例如，美国专利第5,824,307号和第6,818,216号)。在一些实例中，所述多特异性抗体包含来源于30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗RSV抗原结合片段以及来源于人抗RSV抗体的抗RSV抗原结合片段，所述人抗RSV抗体例如但不限于rsv6、rsv11、rsv13、rsv19(即Fab19)、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1和RF-2(参见，例如，美国专利第6,685,942号和第5,811,524号)。在一些实例中，所述多特异性抗体包含来源于30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗RSV抗原结合片段以及来源于抗RSV小鼠单克隆抗体的抗RSV抗原结合片段，所述抗RSV小鼠单克隆抗体包括但不限于MAbs 1153、1142、1200、1214、1237、1129、1121、1107、1112、1269、1269、1243(Beeler et al.(1989)J.Virology63(7):2841-2950)、MAb151(Mufson et al.(1987)J.Clin.Microbiol.25:1635-1539)、MAbs43-1和13-1(Fernie et al.(1982)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171:266-271)、MAbs1436C、1302A、1308F、和1331H(Anderson et al.(1984)J.Clin.Microbiol.19:934-936)，以及它们的人源化衍生物。可以用来产生包含来源于30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗RSV抗原结合片段的多特异性抗体的额外的示例性抗体或其抗原结合片段包括但不限于例如美国专利号6,413,771、5,840,298、5,811,524、6,656,467、6,537,809、7,364,742、7,070,786、5,955,364、7,488,477、6,818,216、5,824,307、7,364,737、6,685,942和5,762,905以及美国专利公开号2007-0082002、2005-0175986、2004-0234528、2006-0198840、2009-0110684、2006-0159695、2006-0013824、2005-0288491、2005-0019758、2008-0226630、2009-0137003和2009-0092609所述的抗RSV抗体或其抗原结合片段。以下表2A和2B示出抗RSV抗体重链(表2A)和轻链(表2B)的SEQ ID NO。其中所示包括重链和轻链的全长序列，重链和轻链可变结构域的序列，以及CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、DRL2和/或CDRL3的序列。
在一些实例中，多特异性抗体或抗原结合片段可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位以及另一异源多肽或其他抗原物质的表位，例如固体支持物质(参见，例如，国际PCT公开号WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360和WO 92/05793；美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；Tutt,et al.,(1991)J.Immunol.147:60-69；以及Kostelny et al.,(1992)J.Immunol.148:1547-1553)。
(1)通过肽接头多聚化
肽接头可以用来制备多价抗体，例如，其中一个多聚化配对物为本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的聚合物。在一实例中，肽接头可以融合至第一多肽的C末端和第二多肽的N末端。这个结构可以重复多次，从而至少1个，例如2、3、4或更多个可溶性多肽通过在它们各自末端的肽接头互相连接。例如，聚合物多肽可以具有序列Z1-X-Z2，其中Z1和Z2各自为抗RSV抗原结合片段序列(例如抗RSV单链抗体；参见，例如，美国专利第6,759,518号，描述单链抗体的多聚化)，并且其中X为肽接头序列。在某些情况下，Z1和/或Z2是本文所提供的抗RSV抗原结合片段。在另一实例中，Z1和Z2是不同抗RSV抗原结合片段，其中至少Z1或Z2来源于本文所提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。在一些实例中，所述聚合物多肽具有Z1-X-Z2-(X-Z)n序列，其中“n”为任何整数，即一般为1或2。通常，所述肽接头具有足够长度以允许每个抗RSV抗原结合片段结合其各自的表位而不干扰抗体的结合特异性。
(2)通过异双功能连接剂多聚化
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段连接至另一抗RSV抗体或抗原结合片段以产生多价抗体可以是直接或间接的。例如，两个或更多个抗RSV抗体或抗原结合片段的连接可以通过化学连接实现或者通过异双功能接头来促进，例如本领域已知或本文所提供的任何异双功能接头。
用来形成氨基与硫醇基之间的共价键以及将硫醇基引入蛋白的许多异双功能交联剂是本领域技术人员已知的(参见，例如，the PIERCE CATALOG,ImmunoTechnologyCatalog & Handbook,1992-1993，其描述这类试剂的制备和用途，并且提供这类试剂的商业来源；还参见，例如，Cumber et al.,(1992)Bioconjugate Chem.3:397-401;Thorpe etal.,(1987)Cancer Res.47:5924-5931;Gordon et al.,(1987)Proc.Natl.Acad Sci.84:308-312;Walden et al.,(1986)J.Mol.Cell Immunol.2:191-197;Carlsson et al.,(1978)Biochem.J.173:723-737;Mahan et al.,(1987)Anal.Biochem.162:163-170;Wawryznaczak et al.,(1992)Br.J.Cancer66:361-366;Fattom et al.,(1992)Infection& Immun.60:584-589)。这些试剂可以用来形成两个抗体之间或每个抗体与接头之间的共价键。示例性试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP；二硫键接头)；磺基琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫代)-丙酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SPDP)；琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT，受阻焦硫酸盐接头)；琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫代)丙酰胺基]-己酸酯(LC-SPDP)；磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)；琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SPDB；受阻二硫键接头)；磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(SAED)；磺基-琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(SAMCA)；磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶二硫代)甲苯甲酰胺基]-己酸酯(磺基-LC-SMPT)；1,4-二-[3′-(2′-吡啶二硫代)3-戊酮-酰氨基]丁烷(DPDPB)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶硫代)甲苯(SMPT，受阻焦硫酸盐接头)；磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-嘧啶基二-硫代)甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SMPT)；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(MBS)；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB；硫代酸酯接头)；磺基琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)；琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)；以及叠氮苯甲酰基酰肼(ABH)。在一些实例中，所述接头可以与肽接头联用，例如增加柔性或溶解性或者提供或消除空间位阻的肽接头。可以采用本领域技术人员已知的将多肽分子连接至另一分子的任何其他接头。
(3)多肽多聚化结构域
两个或更多个抗原结合片段相互作用以形成多价和/或多特异性衍生抗体可以通过它们直接或间接连接至本身能够相互作用以形成稳定结构的任何部分或其他多肽来促进。例如，分别编码的多肽链可以通过多聚化连接，所述多肽的多聚化由多聚化结构域介导。通常，所述多聚化结构域提供第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间稳定的蛋白-蛋白相互作用的形成。嵌合多肽包括例如具有多聚化结构域的抗体或其抗原结合片段的一条链(例如，可变重结构域链或可变轻链结构域)的连接(直接或间接)。通常，所述多聚化结构域连接至所述抗体或其抗原结合片段的重链结构域。这类嵌合多肽可以利用将编码所述抗体链的核酸融合至编码所述多聚化结构域的核酸的重组技术作为融合蛋白产生。
对于本文所提供的多价和/或多特异性衍生抗体，至少一个多聚化配对物是直接或间接连接至多聚化结构域的抗RSV抗体或其抗原结合片段。同或异多聚体多肽可以从单独的嵌合多肽的共表达产生。所述第一和第二嵌合多肽可以相同或不同。
通常，多聚化结构域包括能够与另一多肽形成稳定的蛋白-蛋白相互作用的任何多肽。所述多聚化结构域可以例如通过免疫球蛋白序列(例如，Fc结构域)、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区或者形成同源聚合物或异源聚合物的嵌合分子之间的分子间二硫键的游离硫醇来相互作用。此外，多聚化结构域可以包括包含突起的氨基酸序列，所述突起与包含洞或口袋的氨基酸序列互补，例如美国专利第5,731,168号所述。这样的多聚化区可以工程化，使得空间相互作用不仅促进稳定的相互作用，而且进一步促进从嵌合单体的混合物形成异源二聚体超过同源二聚体。
在一些实例中，多价和/或多特异性抗体通过多聚化结构域连接两个抗RSV抗原结合片段产生。在这类实例中，至少一个抗原结合片段来源于本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，例如，58c5、sc5、30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6。
抗原结合多肽，例如抗RSV抗原结合片段可以缀合至多聚化结构域以形成嵌合多肽。对于包含超过一条链(例如，可变重结构域和可变轻链结构域)的抗RSV抗原结合片段，所述多聚化结构域可以缀合至一条链，通常为重链。所述抗原结合片段通常通过其N端或C端连接至所述多聚化结构域的N端或C端来连接至所述多聚化结构域。通常，所述多聚化结构域缀合至所述抗原结合片段的C端(例如，单链抗体的C端或者所述抗原结合片段的一条链的C端)。所述连接可以是直接的，或者是通过接头间接的。而且，所述嵌合多肽可以是融合蛋白，或者可以通过化学连接形成，例如通过共价或非共价相互作用。例如，当制备包含多聚化结构域的嵌合多肽时，编码全部或部分抗RSV抗原结合片段的核酸可以可操作地连接至编码所述多聚化结构域序列的核酸，直接或间接或任选通过接头结构域。通常，构建体编码嵌合蛋白，其中所述抗-RSV抗原结合片段(或者所述抗原结合片段的单链)的C端连接至所述多聚化结构域的N端。
本文所提供的多价抗体包含通过将两个相同或不同的抗RSV抗原结合片段直接或间接连接至多聚化结构域产生的两个嵌合蛋白。在一些实例中，当所述多聚化结构域为多肽时，将编码所述抗RSV抗原结合片段(或者所述抗原结合片段的单链)多聚化结构域嵌合多肽的基因融合物插入适当的表达载体。所得的抗RSV抗原结合片段-多聚化结构域嵌合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许装配为聚合物，其中所述多聚化结构域相互作用以形成多价抗体。多聚化结构域化学连接至抗RSV抗原结合片段还可以如上文所讨论利用异双功能接头实现。在一些实例中，所述多价抗体是来源于结合不同表位的两个或更多个抗RSV抗原结合片段的多特异性抗体。
所得嵌合多肽以及由其形成的多价抗体可以通过本领域已知的任何合适的方法纯化，例如，通过在A蛋白或G蛋白柱上亲和层析。当编码不同抗RSV抗原结合嵌合多肽的两个核酸分子转化入细胞时，同源二聚体和异源二聚体的形成会发生。可以调整表达条件，从而异源二聚体的形成优于同源二聚体的形成。
(a)免疫球蛋白结构域
多聚化结构域包括包含游离硫醇部分的多聚化结构域，所述游离硫醇部分能够与具有其他氨基酸序列的多聚化结构域反应以形成分子间二硫键。例如，多聚化结构域可以包括免疫球蛋白分子的部分，例如来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgM和IgE。通常，选择用作多聚化结构域的免疫球蛋白的部分为恒定区(Fc)。已描述包含融合至抗体来源多肽的各种部分(包括Fc结构域)的多肽的融合蛋白的制备(参见，例如，Ashkenazi et al.(1991)PNAS 88:10535;Byrn et al.(1990)Nature,344:677;和Hollenbaugh and Aruffo,(1992)“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,”in Current Protocolsin Immunology,Suppl.4,pp.10.19.1-10.19.11)。
在人中，有基于它们的重链分类的5个抗体同种型，表示为δ、γ、μ、α和ε，分别产生抗体的IgD、IgG、IgM、IgA和IgE类别。IgA和IgG类别包含亚类IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白重链之间的序列差异导致不同同种型的差别在于例如恒定(C)结构域的数目、铰链区的存在以及链间二硫键的数目和位置。例如，IgM和IgE重链包含代替铰链区的额外的C结构域(C4)。IgG、IgD和IgA的Fc区通过它们的Cγ3、Cδ3和Cα3结构域互相配对，而IgM和IgE的Fc区通过它们的Cμ4和Cε4结构域二聚化。IgM和IgA分别形成具有10个和4个抗原结合位点的多价结构。
本文所提供的抗原结合嵌合多肽包括全长免疫球蛋白多肽(即，包括全长的免疫球蛋白的所有结构域)。在一些实例中，所述抗原结合嵌合多肽小于全长(例如，所述嵌合多肽可以包含抗原结合结构域以及用于多聚化的一个或多个免疫球蛋白结构域，其中所述嵌合多肽不是全长免疫球蛋白)。在一些实例中，所述抗RSV抗原结合嵌合多肽装配为单价或异多价或同多价抗体，例如二价、三价、四价、五价、六价、七价或更高价抗体。不同结构的链或基本单元(例如，一个或多个异源恒定区或结构域)可以用来装配单价和异多价和同多价抗体。抗RSV抗原结合嵌合多肽可以通过用适当的核酸分子转化的哺乳动物细胞很容易产生和分泌。在一些实例中，一个或超过一个核酸融合分子可以转化入宿主细胞以产生多价抗体，其中所述多价抗体的抗RSV抗原结合部分相同或不同。通常，所述多价抗体的至少一个抗RSV抗原结合部分来源于本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，例如，58c5、sc5、30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6。
(i)Fc结构域
可以用来产生包含本文所提供的抗RSV抗原结合片段的多价和/或多特异性抗体的示例性多聚化结构域包括来源于所选免疫球蛋白分子的重链恒定区或结构域的多肽。人IgG亚型的重链恒定区的示例性序列如SEQ ID NOS:356(IgG1)、SEQ ID NO:357(IgG2)、SEQID NO:358(IgG3)和SEQ ID NO:359(IgG4)所示。例如，对于SEQ ID NO:356所示的示例性重链恒定区，CH1结构域对应氨基酸1-103，铰链区对应氨基酸104-119，CH2结构域对应氨基酸120-223，而CH3结构域对应氨基酸224-330。
在一实例中，免疫球蛋白多肽嵌合蛋白可以包括免疫球蛋白多肽的Fc区。通常，这样的融合物至少保留免疫球蛋白重链恒定区的功能活性铰链、CH2和CH3结构域。例如，IgG1的全长Fc序列包括SEQ ID NO:356所示序列的氨基酸104-330。hIgG1的示例性Fc序列如SEQID NO:360所示，并且包含对应于SEQ ID NO:356的氨基酸104-119的铰链序列，以及如SEQID NO:356所示的CH2和CH3结构域的完整序列。另一示例性Fc多肽如PCT申请WO 93/10151所示，并且是从N端铰链区延伸至人IgG1抗体Fc区的天然C端的单链多肽(SEQ ID NO:361)。进行连接的精确位点不是关键：具体位点是本领域公知的，并且可以选择以便优化所述抗RSV抗原结合嵌合多肽的生物学活性、分泌或结合特征。例如，其他示例性Fc多肽序列开始于SEQ ID NO:356所示序列的氨基酸C109或P113(参见例如，美国2006/0024298)。
除了hIgG1 Fc，其他Fc区也可以包括在本文所提供的抗RSV抗原结合嵌合多肽内。例如，Fc融合物可以包含基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白序列，所述抗体类别包括但不限于抗体的IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE和IgM类别。
在一些实例中，可以基于结构域的功能特性选择Fc结构域，例如，Fc结构域在介导免疫应答中的效应子功能。例如，当最小化Fc/FcγR相互作用所介导的效应子功能时，可以使用与难以募集补体或效应细胞的IgG同种型，例如IgG2或IgG4的Fc的融合物。
本文还考虑修饰的Fc结构域用于具有抗RSV抗原结合片段的嵌合体，示例性修饰参见例如美国专利第7,217,797号；以及美国专利公开号2006/0198840、2006/0024298和2008/0287657；以及国际专利公开第WO 2005/063816号。Fc结构域的示例性氨基酸修饰还在本文其他地方提供。
通常，二价抗体是通过将两个相同或不同的抗RSV抗原结合片段直接或间接连接至Fc多肽所产生的两个嵌合蛋白的二聚体。在一些实例中，将编码所述嵌合蛋白的基因融合物插入适当的表达载体。所得的嵌合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许装配，其中Fc部分之间形成链间二硫键以产生二价抗RSV抗体。通常，宿主细胞和表达系统为哺乳动物表达细胞以允许所述嵌合蛋白的糖基化。所得的包含Fc部分的嵌合多肽以及由其形成的多价抗体可以在A蛋白或G蛋白柱上通过亲和层析轻易纯化。当编码不同抗RSV嵌合多肽的两个核酸转化入细胞时，异源二聚体的形成必须生化实现，因为携带Fc-结构域的抗RSV嵌合分子还会表达为二硫键连接的同源二聚体。因此，可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下减少同源二聚体。通常，将具有不同细胞外部分的嵌合单体以等摩尔量混合并氧化以形成同源二聚体和异源二聚体的混合物。通过层析技术分离混合物组分。
或者，可以通过遗传工程化和表达抗RSV抗原结合融合分子，其包含抗RSV抗原结合片段，随后为hIgG的Fc-结构域，随后为c-jun或c-fos亮氨酸拉链，来倾向于形成异源二聚体。因为亮氨酸拉链主要形成异源二聚体，当需要时它们可以用来驱动异源二聚体的形成。包含Fc区的抗RSV嵌合多肽还可以工程化以包括具有金属螯合物或其他表位的标签。标记的结构域可以用于通过金属螯合层析和/或通过抗体快速纯化，允许在生物测定中蛋白印迹、免疫沉淀或活性消耗/阻断检测。
D.抗RSV抗体的额外修饰
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以进一步修饰。抗RSV抗体或抗原结合片段的修饰可以改善所述抗体的一种或多种特性，包括但不限于降低所述抗体或抗原结合片段的免疫原性，改善所述抗体或抗原结合片段的半衰期，例如降低对蛋白水解的敏感性和/或降低对氧化的敏感性，以及改变或改善所述抗体或其抗原结合片段的结合特性。示例性修饰包括但不限于所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的一级氨基酸序列的修饰以及所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰的改变。示例性翻译后修饰包括例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连接至细胞配体或其他蛋白。其他示例性修饰包括将一个或多个异源肽连接至所述抗RSV抗体或抗原结合片段以改变或改善所述抗体或其抗原结合片段的一种或多种特性。
通常，所述修饰不会导致所述抗体或其抗原结合片段的免疫原性增加或者显著负面影响所述抗体或其抗原结合片段与RSV的结合。评价修饰的抗体或其抗原结合片段结合RSV F蛋白的方法如本文所提供，并且是本领域已知的。例如，可以通过例如但不限于ELISA、表面等离子共振(SPR)的方法或者通过体外微量中和测定来测定修饰的抗体或其抗原结合片段与RSV F蛋白的结合。
本文提供改善任何所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的半衰期的方法。增加本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的半衰期可以提高所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的疗效，并且允许较低频率施用所述抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗，例如预防或治疗RSV感染，预防、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症状，或者减少RSV感染的持续时间。
本文所产生的抗RSV抗体或其抗原结合片段的修饰可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，来自从亲本抗体天然突变或人为操纵。修饰诸如抗体的多肽的方法是本领域已知的，并且可以用于修饰本文所提供的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的药物动力学特性可以通过本领域技术人员已知的技术的Fc修饰来增强。本领域技术人员已知的标准技术可以用来将突变引入编码本文所提供的抗体或抗原结合片段的核苷酸分子以便产生具有一个或多个氨基酸取代的多肽。引入突变的示例性技术包括但不限于位点定向诱变和PCR介导的诱变。
本文所提供的抗RSV抗体及其抗原结合片段可以通过连接异源肽以促进纯化来修饰。一般这类肽表达为融合蛋白，其包含在所述抗体或其抗原结合片段的C端或N端融合至所述肽的抗体。常用于纯化的示例性肽包括但不限于6-组氨酸肽、血凝素(HA)肽和flag标签肽(参见例如，Wilson et al.(1984)Cell 37:767;Witzgall et al.(1994)AnalBiochem 223:2,291-8)。融合不必是直接的，而是可以通过接头肽发生。在一些实例中，所述接头肽包含蛋白酶切割位点，其允许纯化之后通过用特异性识别所述蛋白酶切割位点的蛋白酶切割来去除纯化肽。
本文所提供的抗RSV抗体及其抗原结合片段还可以通过连接异源多肽来修饰，所述异源多肽在体外或体内将所述抗体或抗原结合片段靶向至特定细胞类型(例如，呼吸道上皮细胞)。在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过将所述抗体或其抗原结合片段融合或缀合至特定细胞表面受体特异性的抗体或者与特定细胞受体相互作用的其他多肽来靶向至特定细胞类型。
在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过将所述抗体或其抗原结合片段融合或缀合至结合细胞表面糖蛋白的肽，例如蛋白转导结构域(例如，TAT肽)，来靶向至靶细胞表面和/或被靶细胞吸收。示例性蛋白转导结构域包括但不限于来源于诸如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)TAT的蛋白的PTD(Ruben et al.(1989)J.Virol.63:1-8；例如，SEQ ID NO:326-337，例如，GRKKRRQRRR(TAT48-57)SEQ ID NO:330))，疱疹病毒被膜蛋白VP22(Elliott and O’Hare(1997)Cell88:223-233；例如，SEQ ID NO:342)，果蝇(Drosophila melanogaster)触角足(Antp)蛋白的同源异型蛋白(Penetratin PTD；Derossi et al.(1996)J.Biol.Chem.271:18188-18193；例如，SEQ ID NO:311-314)，protegrin1(PG-1)抗菌肽SynB(例如，SynB1、SynB3和Syn B4；Kokryakov et al.(1993)FEBS Lett.327:231-236；例如，分别为SEQ ID NO:323-325)以及碱性成纤维细胞生长因子(Jans(1994)FASEB J.8:841-847；例如，SEQ ID NO:307)。PTD还包括合成PTD，例如但不限于聚精氨酸肽(Futaki et al.(2003)J.Mol.Recognit.16:260-264;Suzuki et al.(2001)J.Biol.Chem.276:5836-5840；例如SEQ ID NO:315-316)，transportan(Pooga et al.(1988)FASEB J.12:67–77;Pooga et al.(2001)FASEB J.15:1451–1453;例如，SEQ ID NO:338-341)，MAP(Oehlke et al.(1998)Biochim.Biophys.Acta.1414:127–139;例如，SEQ IDNO:305)，KALA(Wyman et al.(1997)Biochemistry36:3008–3017;例如，SEQ ID NO:303)以及其他阳离子肽，例如，各种β-阳离子肽(Akkarawongsa et al.(2008)Antimicrob.Agentsand Chemother.52(6):2120-2129)。
本文所提供的抗RSV抗体及其抗原结合片段可以通过将诊断和/或治疗性部分连接至所述抗体或其抗原结合片段来修饰。本文所提供的抗RSV抗体及其抗原结合片段可以通过将任何类型的分子，例如诊断或治疗分子共价连接至所述抗体或其抗原结合片段来修饰，所述共价连接不阻止所述抗体或其抗原结合片段结合其相应表位。例如，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过共价连接分子来进一步修饰，所述共价连接不阻止所述抗体或其抗原结合片段结合RSV。在一些实例中，所述抗体或其抗原结合片段可以在N端或C端重组融合至异源多肽，或者化学缀合至异源多肽或其他组合物，包括共价和非共价缀合。例如，所述异源多肽或组合物可以是诊断多肽或其他诊断部分或者治疗性多肽或其他治疗性部分。示例性诊断和治疗性部分包括但不限于药物、放射性核苷酸、毒素、荧光分子(参见，例如国际PCT公开号WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；以及EP 396,387)。诊断多肽或诊断部分可以用作例如标记用于体内或体外检测。治疗性多肽或治疗性部分可以用于例如病毒感染(如RSV感染)的治疗，或者用于病毒感染的一种或多种症状的治疗。
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的其他融合蛋白可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生。DNA改组可以用来改变本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的活性，例如，产生具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其抗原结合片段(参见，通常，美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，以及Patten et al.(1997)Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33;Harayama(1998)Trends Biotechnol.16(2):76-82;Hansson et al.,(1999)J.Mol.Biol.287:265-76;以及Lorenzo and Blasco(1998)Biotechniques 24(2):308-13)。
所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以连接至固体支持物，这有利于免疫测定或靶抗原的纯化。示例性固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
1.降低免疫原性的修饰
在一些实例中，可以进一步修饰本文所提供的抗体或其抗原结合片段以降低在诸如人对象的对象中的免疫原性。例如，可以修饰所述抗体或其抗原结合片段中的一个或多个氨基酸以改变人T-细胞的潜在表位，以便消除或降低所述抗体或其抗原结合片段暴露于对象的免疫系统时的免疫原性。示例性修饰包括一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入，这消除或降低所述抗体或其抗原结合片段的免疫原性。通常，这类修饰不改变所述抗体或其抗原结合片段对其各个抗原的结合特异性。降低所述抗体或其抗原结合片段的免疫原性可以改善所述抗体或其抗原结合片段的一种或多种特性，例如，提高所述抗体或其抗原结合片段的疗效和/或增加所述抗体或其抗原结合片段在体内的半衰期。
2.Fc修饰
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含野生型或修饰的Fc区。如本文其他地方所述，Fc区可以连接至本文所提供的抗RSV抗原结合片段，例如，58c5、sc5、30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6，或者来源于58c5、sc5、30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗原结合片段。在一些实例中，可以修饰所述Fc区以改变Fc多肽的一种或多种特性。例如，可以修饰所述Fc区以改变(即或多或少)与野生型免疫球蛋白重链的Fc区的效应子功能相比的效应子功能。抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，赋予称为效应子功能的一批重要功能性能力。Fc效应子功能包括例如Fc受体结合、补体结合以及T细胞消除活性(参见例如，美国专利第6,136,310号)。测定T细胞消除活性、Fc效应子功能以及抗体稳定性的方法是本领域已知的。例如，IgG分子的Fc区与FcγR相互作用。这些受体在各种免疫细胞中表达，包括例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞以及γδT细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集至结合抗原的位点，通常导致细胞内的信号事件以及重要的随后的免疫应答，例如释放炎症介质、B细胞活化、胞吞作用、吞噬作用以及细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。表达FcγR的细胞毒性细胞识别和裂解靶细胞上结合的抗体称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。各种抗体同种型的其他Fc受体包括FcεR(IgE)、FcαR(IgA)和FcμR(IgM)。
因此，修饰的Fc结构域可以具有改变的对Fc受体的亲和力，包括但不限于提高的或低的或无亲和力。例如，不同的IgG亚类具有不同的对FcγR的亲和性，IgG1和IgG3通常基本上比IgG2和IgG4更好地结合受体。此外，不同的FcγR介导不同的效应子功能。FcγR1、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发活化的正调节物，其特征在于具有细胞内结构域，所述细胞内结构域具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。然而，FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，并且因此是抑制的。因此，改变Fc区对受体的亲和力可以调节Fc结构域所诱导的效应子功能。
在一实例中，使用Fc区，为了优化结合某些FcγR而修饰所述Fc区以更好地介导效应子功能，例如，抗体依赖性细胞毒性ADCC。这样修饰的Fc区可以包含在一个或多个氨基酸残基(根据Kabat编号方案，Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services)处的修饰，包括但不限于氨基酸位置249、252、259、262、268、271、273、277、280、281、285、287、296、300、317、323、343、345、346、349、351、352、353和424。例如，Fc区中的修饰可以对应于以下任一个或多个进行：SEQ ID NO:356所示的示例性IgG1序列的G119S、G119A、S122D、S122E、S122N、S122Q、S122T、K129H、K129Y、D132Y、R138Y、E141Y、T143H、V147I、S150E、H151D、E155Y、E155I、E155H、K157E、G164D、E166L、E166H、S181A、S181D、S187T、S207G、S307I、K209T、K209E、K209D、A210D、A213Y、A213L、A213I、I215D、I215E、I215N、I215Q、E216Y、E216A、K217T、K217F、K217A和P279L，或者它们的组合。包含这些突变的修饰的Fc可以具有增强的与FcR(例如活化受体FcγIIIa)的结合，和/或可以具有减少的与抑制受体FcγRIIb的结合(参见例如，美国2006/0024298)。修饰以具有增加的与FcR的结合的Fc区可以在促进破坏患者中病毒(例如RSV)感染的细胞中更有效。
在一些实例中，可以进一步修饰本文所提供的抗体或抗原结合片段以改善所述抗体或其抗原结合片段与FcRn受体的相互作用，以便增加所述抗体或其抗原结合片段的体内半衰期和药物动力学(参见，例如，美国专利第7,217,797号，美国专利公开第2006/0198840号和第2008/0287657号)。FcRn为新生儿FcR，其结合将胞吞的抗体或其抗原结合片段从核内体回收至血流。这个过程，加上由于全长分子的大尺寸而不被肾过滤，导致有利抗体的血清半衰期范围为1-3周。Fc结合FcRn还在抗体运输中起作用。
Fc区的示例性修饰包括但不限于美国专利第7,217,797号；美国专利公开号2006/0198840、2006/0024298和2008/0287657，以及国际专利公开第WO 2005/063816号所述的Fc的突变，例如在Fc重链恒定区的CH2结构域中的氨基酸残基(Kabat编号，Kabat et al.(1991))251-256、285-90、308-314和/或CH3结构域中的氨基酸残基385-389和428-436中的一个或多个处的突变，其中相对于未修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰改变Fc受体结合亲和力和/或血清半衰期。在一些实例中，在Fc区中于IgG重链恒定区的CH2结构域中的氨基酸位置250、251、252、254、255、256、263、308、309、311、312和314和/或CH3结构域的氨基酸位置385、386、387、389、428、433、434、436和459中的一个或多个处修饰IgG恒定结构域。这类修饰对应SEQ ID NO:356所示示例性IgG1序列中的CH2结构域中的氨基酸Gly120、Pro121、Ser122、Phe124、Leu125、Phe126、Thr133、Pro174、Arg175、Glu177、Gln178和Asn180以及CH3结构域中的氨基酸Gln245、Val246、Ser247、Thr249、Ser283、Gly285、Ser286、Phe288和Met311。在一些实例中，所述修饰在一个或多个表面暴露的残基，并且所述修饰是用与被取代的残基具有相似电荷、极性或疏水性的残基取代。
在具体实例中，在氨基酸位置251、252、254、255和256(Kabat编号)中的一处或多处修饰Fc重链恒定区，其中位置251用Leu或Arg取代，位置252用Tyr、Phe、Ser、Trp或Thr取代，位置254用Thr或Ser取代，位置255用Leu、Gly、Ile或Arg取代，和/或位置256用Ser、Arg、Gln、Glu、Asp、Ala、Asp或Thr取代。在一些实例中，在氨基酸位置308、309、311、312和314中的一处或多处修饰Fc重链恒定区，其中位置308用Thr或Ile取代，位置309用Pro取代，位置311用丝氨酸或Glu取代，位置312用Asp取代，和/或位置314用Leu取代。在一些实例中，在氨基酸位置428、433、434和436中的一处或多处修饰Fc重链恒定区，其中位置428用Met、Thr、Leu、Phe或Ser取代，位置433用Lys、Arg、Ser、Ile、Pro、Gln或His取代，位置434用Phe、Tyr或His取代，和/或位置436用His、Asn、Asp、Thr、Lys、Met或Thr取代。在一些实例中，在氨基酸位置263和459中的一处或多处修饰Fc重链恒定区，其中位置263用Gln或Glu取代，和/或位置459用Leu或Phe取代。
在一些实例中，可以修饰Fc重链恒定区以增强结合补体蛋白C1q。除了与FcR相互作用，Fc还与补体蛋白C1q相互作用以介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。C1q与丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物以形成C1复合物。C1q能够结合6个抗体，虽然结合2个IgG足以激活补体级联。与Fc与FcR相互作用相似，不同IgG亚类对C1q具有不同亲和力，IgG1和IgG3通常基本上比IgG2和IgG4更好地结合。因此，具有增加的与C1q结合的修饰的Fc可以介导增强的CDC，并且可以增强破坏病毒(例如，RSV)感染的细胞。增加与C1q结合的Fc区中的示例性修饰包括但不限于在位置345和353(Kabat编号)处的氨基酸修饰。示例性修饰包括对应SEQID NO:356所示示例性IgG1序列中的K209W、K209Y和E216S的修饰。
在另一实例中，还已知具有取代以减少或消除与FcγR结合的各种Fc突变体。这类突变蛋白在需要降低或消除Fc介导的效应子功能的情况下是有利的。当期望拮抗作用但不杀死包含靶抗原的细胞时这是常有的事。这样的Fc的实例是美国专利第5,457,035号所述的Fc突变蛋白，其在氨基酸位置248、249和251(Kabat编号)处修饰。在SEQ ID NO:356所示的示例性IgG1序列中，氨基酸117从Leu修饰为Ala，氨基酸118从Leu修饰为Glu，并且氨基酸120从Gly修饰为Ala。相似突变可以在任何Fc序列中进行，例如，示例性Fc序列。该突变蛋白表现出降低的对Fc受体的亲和力。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以工程化以包含修饰的Fc区。例如，将多肽融合或缀合至抗体的恒定区(即制备Fc融合蛋白)的方法是本领域已知的，并且例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公开WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539;Traunecker et al.(1988)Nature 331:84-86;Zheng et al.(1995)J.Immunol.154:5590-5600;以及Vil et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341(1992)所述，并且在本文其他地方描述。在一些实例中，具有增加FcRn结合亲和力和/或改善半衰期的一个或多个修饰的修饰的Fc区可以融合至本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
3.聚乙二醇化
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以缀合至诸如高分子量聚乙二醇(PEG)的聚合物分子以增加半衰期和/或改善它们的药物动力学谱。缀合可以通过本领域技术人员已知的技术来进行。据证实治疗性抗体与PEG的缀合增强药效学而不干扰功能(参见，例如，Deckert et al.,Int.J.Cancer 87:382-390,2000;Knight et al.,Platelets15:409-418,2004;Leong et al.,Cytokine 16:106-119,2001;和Yang et al.,Protein Eng.16:761-770,2003)。PEG可以连接至所述抗体或抗原结合片段(有或无多功能接头)，通过将PEG位点特异性缀合至所述抗体或抗原结合片段的N端或C端，或者通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基。可以使用导致生物学活性的最小损失的线性或支化聚合物衍生化。缀合程度可以通过SDS-PAGE和质谱分析法监测以确保PEG分子适当缀合至所述抗体。未反应的PEG可以通过例如大小排阻层析或离子交换层析从抗体-PEG缀合物分离。可以利用本领域技术人员已知的方法测试PEG衍生的抗体或其抗原结合片段与RSV抗原的结合活性以及体内效力，例如，通过本文所述的免疫测定。
4.可检测部分的缀合
在一些实例中，可以通过缀合至可检测部分来进一步修饰本文所提供的抗RSV抗体和抗体片段。可检测部分可以直接或间接检测。根据所选的可检测部分，可检测部分可以体内和/或体外检测。例如，可检测部分可以用于检测暴露于RSV或RSV的定位的诊断方法或者确定所述抗RSV抗体或其抗原结合片段对RSV的结合亲和力的结合测定。可检测部分还可以用于制备所述抗RSV抗体的方法，例如，所述抗体或其抗原结合片段的纯化。通常，选择可检测部分，从而可检测部分的缀合不干扰所述抗体或其抗原结合片段结合靶表位。通常，可检测部分的选择取决于所需的灵敏度、容易与化合物缀合、稳定性要求、可用仪器以及处理规定。本领域技术人员熟悉标记，并且可以鉴定适合和相容于所采用的测定的可检测的标记。用可检测部分标记抗体的方法是本领域已知的，并且包括例如重组和化学方法。
可检测部分可以是具有可检测的物理或化学特性的任何物质。这类可检测的标记在免疫测定领域已良好开发，并且一般来说，在这类方法中有用的任何标记的大部分可以应用于所提供的方法。因此，标记是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组合物。
有用的标记包括但不限于荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、
罗丹明等)，放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)，特别地，γ和正电子发射放射性同位素(例如，157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe)，金属离子(例如，111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr和201Tl)，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及ELISA中常用的其他酶)，电子转移剂(例如，
包括金属结合蛋白和化合物)，发光和化学发光标记(例如，萤光素和2,3-二氢酞嗪酮(2,3-dihydrophtahlazinediones)，例如，鲁米诺)，磁珠(例如，
DYNABEADSTM)，以及比色标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。可以使用的各种标记或信号产生系统的综述参见例如美国专利第4,391,904号。
5.治疗性部分的缀合
在一些实例中，可以通过缀合至治疗性部分来进一步修饰本文所提供的抗RSV抗体和抗原结合片段。示例性治疗性部分包括但不限于细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如，α-发射体)。示例性细胞毒素或细胞毒剂包括但不限于对细胞有害的任何物质，例如但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二氢蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、
利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同系物。示例性治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C以及顺铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂(cisplatin))，蒽环类(例如，柔红霉素(原来为道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放线菌素D(dactinomycin)(原来为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))，抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)，以及抗病毒药，例如但不限于核苷类似物，如齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷和利巴韦林；膦甲酸(foscamet)、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦和α-干扰素。
在一些实例中，可以通过缀合至为治疗性多肽的治疗性部分来进一步修饰本文所提供的抗RSV抗体和抗原结合片段。示例性治疗性多肽包括但不限于毒素，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；或者免疫刺激剂，如细胞因子，例如但不限于干扰素(例如，IFN-α、β、γ、ω)，淋巴因子，造血生长因子，例如但不限于GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素-14(IL-14)和肿瘤坏死因子(TNF)。
6.修饰以提高结合特异性
所提供的抗RSV抗体和抗体片段的结合特异性可以通过诸如噬菌体展示的技术改变或提高。噬菌体展示的方法一般包括使用丝状噬菌体(噬粒)表面表达载体系统用于克隆和表达抗体种类的文库。其他人已描述产生组合文库的各种噬粒克隆系统。参见，例如Kanget al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:4363-4366;Barbas et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:7978-7982;Zebedee et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3175-3179;Kang et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:11120-11123;Barbas et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:4457-4461;和Gram et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576-3580所述在噬粒上制备组合抗体文库，这些文献援引加入本文。
在具体实例中，从动物cDNA文库(例如，人或小鼠淋巴组织cDNA文库)扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。将编码VH和VL结构域的DNA通过PCR用scFv接头重组在一起并克隆入噬粒载体(例如，p CANTAB 6或pComb 3 HSS)。将所述载体电穿孔入大肠杆菌(E.coli)，并且将所述大肠杆菌用辅助噬菌体感染。用于这些方法的噬菌体典型为丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达结合RSV抗原(例如，RSV F蛋白)的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原选择或鉴定，例如，利用标记的抗原或者结合或捕获至固体表面或珠的抗原。可以用来通过噬菌体展示制备所述抗体的噬菌体展示方法实例包括例如Brinkman et al.(1995)J.Immunol.Methods 182:41-50;Ames etal.(1995)J.Immunol.Methods 184:177-186;Kettleborough et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:952-958;Persic et al.(1997)Gene 187:9-18;Burton et al.(1994)Advances in Immunology 57:191-280;PCT公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108所公开的方法；这些文献每个整体援引加入本文。
如上文参考文献所述，噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以分离并用来产生全抗体，包括人抗体，或者任何其他期望的抗原结合片段，并且在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如本文所述。还可以采用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，利用本领域已知的方法，例如PCT公开第WO 92/22324号；Mullinax et al.(1992)BioTechniques 12(6):864-869;Sawai et al.(1995)AJRI 34:26-34;和Better et al.(1988)Science 240:1041-1043所公开的方法。
可以操纵所得的噬粒文库以增加和/或改变所述抗体或抗原结合片段的免疫特异性以产生和随后鉴定具有改善的特性的额外的抗体，例如增加与靶抗原的结合。例如，可以将重链和轻链编码DNA中的任一或两者在免疫球蛋白多肽可变区的互补性决定区(CDR)中诱变，并且随后筛选可取的免疫反应和中和能力。然后可以在本文所述的确定中和能力的一个或多个测定中筛选所得的抗体。
为了一些用途，包括人中抗体的体内用途以及体外检测测定，使用人或嵌合抗体。完全人抗体对于人对象的治疗是特别可取的。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，包括上文所述的噬菌体展示方法，利用来源于人免疫球蛋白序列或与人免疫球蛋白序列同源的合成序列的抗体文库。参见美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；以及PCT公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；这些文献每个整体援引加入本文。
E.分离抗RSV抗体的方法
抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过本领域公知的各种技术鉴定和分离，包括但不限于小鼠杂交瘤(参见，例如，Olsson and Kaplan(1980)Proc Natl Acad Sci USA77:5429-5431；这类抗体可以如本文其他地方所述人源化用于人)，表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见，例如，Kellerman and Green(2000)Curr.Opin Biotechnol.13:593-597)，噬菌体展示(参见，例如，Mancini(2004)New Microbiol.27:315-28)，以及从诸如B细胞的成熟人免疫细胞分离(参见，例如，Banchereau and Rousset(1992)Adv Immunol.52:125-262,Crotty and Ahmed(2004)Semin Immunol.16:197-203,Carsetti(2004)MethodsMol Biol.271:25-35,McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams(2005)Annu RevImmunol.23:487-513)。在本文所提供的示例性方法中，本文所提供的人抗RSV抗体及其抗原结合片段鉴定和分离自人B细胞。
考虑到从人抗体分泌细胞获得稳定的杂交瘤的困难，已广泛用于产生和分离人抗体分泌细胞的示例性方法是用埃巴病毒(EBV)永生化人B细胞，还已知其诱导多克隆B细胞活化和增殖(参见，例如，Sugimoto et al.(2004)Cancer Res.64:3361-3364;Bishop andBusch(2002)Microbes Infect.4:853-857)。例如，已通过人B细胞的EBV永生化产生抗体分泌细胞，例如来自可能暴露于所述抗原的患者或其他对象或者利用标记的抗原预先选择的健康对象的外周血、淋巴结、脾、扁桃体或胸膜液(参见，例如，Casali et al.(1986)Science234:476-9,Yamaguchi et al.(1987)Proc Natl Acad Sci USA84:2416-2420,Posner et al.(1991)J Immunol.146:4325-4332,Raff et al.(1988)J Exp Med.168:905-917,Steenbakkers et al.(1993)Hum Antibod Hybrid.4:166-173,Steenbakkers etal.(1994)Mol Biol Rep.19:125-134,Evans et al.(1988)J Immunol140:941-943,和Wallis R et al.(1989)J Clin Invest 84:214-219)。
由于EBV感染的人B细胞的低可转化性、低可克隆性以及固有的不稳定性和异质性(Chan et al.(1986)J Immunol136:106-112,and James and Bell(1987)J ImmunolMethods.100:5-40)，可以采用已知技术，例如与骨髓瘤细胞系细胞融合(参见，例如，Bronet al.(1984)PNAS81:3214-3217;Yamaguchi et al.(1987)Proc Natl Aacd Sci USA 84:2416-2420;Posner et al.(1991)J Immunol.146:4325-4332,Niedbala and Stott(1998)Hybridoma 17:299-304;Li et al.(2006)Proc Natl Aacd Sci USA 103:3557-62)。提高EBV永生化的其他技术包括例如用致癌病毒永生化，用癌基因转化，小-电融合，以及在单一过程中小鼠-人异源融合(参见，例如，美国专利第4,997,764号；Steenbakkers et al.(1993)Hum Antibod Hybrid.4:166-173;Dessain et al.(2004)J Immunol Methods.291:109-22)。人单克隆抗体可以分离自B细胞，并且如本领域所述通过在细胞培养中结合各种操作来分离，所述B细胞已在抗原存在或不存在的情况下活化和永生化(参见例如，Borrebaeck et al.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:3995-3999,Davenport et al.(1992)FEMS Microbiol Immunol.4:335-343,Laroche-Traineau et al.(1994)Hum AntibHybrid.5:165-177,Morgenthaler et al.(1996)J.Clin Endocrinology.81:3155-3161,Niedbala and Kurpisz(1993)Immunol Lett.35:93-100,Mulder et al.(1993)HumImmunol.36:186-192,Hur et al.(2005)Cell Prolif.38:35-45,Traggiai et al.(2004)Nat Med 10:871-875,Tsuchiyama et al.(1997)Hum Antibodies 8:43-47;以及PCT公开号WO 91109115、WO 041076677、WO 88101642、WO 90102795、WO 96140252和WO 02146233)。
从成熟B细胞分离人抗体的方法一般包括分离成熟B细胞群体以及筛选B细胞表达的针对特定抗原的抗体。抗体分泌细胞的各种不同群体可以分离自具有特定特征的人供体(例如幼稚、免疫接种的、或多或少最近感染和血清反应阳性对象)以及B细胞停留并发挥它们的活性的不同组织(例如血液、扁桃体、脾、淋巴结)(Viau and Zouali(2005)ClinImmunol.114:17-26)。在本文所提供的示例性方法中，本文所提供的抗RSV抗体可以分离自含有B细胞的外周血单核细胞(PBMC)的样品，分离自人供体和/或已经或者具有已暴露于RSV的高概率的健康人供体，例如医护人员。
从生物样品分离PBMC之后，可以利用本领域所述的各种方法中的一种，在它们表面上的细胞表面标记和其他蛋白(如果适当)的表达以及细胞的增殖活性、代谢和/或形态状态的基础上进行抗体分泌细胞的特异性选择。特别地，从人样品纯化抗体分泌细胞的各种技术对于正选择或负选择使用不同方法和条件。这些细胞通过物理分离表达细胞表面标记的细胞更容易和有效选择，所述细胞表面标记是表达和分泌抗体的细胞特异性的(例如人B细胞)。具体方案是已知的，并且可以在文献中找到(参见，例如，Callard andKotowicz″Human B-cell responses to cytokines″in Cytokine Cell Biology:Apractical Approach.Balkwill F.(ed.)Oxford University Press,2000,17-31)。
诸如B细胞的特异性免疫细胞的选择通常利用抗体来进行，所述抗体特异性结合B-细胞特异性细胞表面蛋白并且可以连接至固体支持物(例如微珠或塑料板)或用可以利用荧光激活细胞分选术(FACS)检测的荧光染料标记。例如，在EBV永生化之前，人B细胞已在它们对支持物(例如微珠)结合的CD19、CD27和/或CD22微珠的亲和力基础上选择，或者选择缺少对某些同种型特异性抗体的结合亲和力(参见，例如，Li et al.(1995)BiochemBiophys Res Commun 207:985-993,Bernasconi et al.(2003)Blood 101:4500-4504和Traggiai et al.(2004)Nat Med10:871-875)。用于纯化的细胞标记的选择可以影响永生化过程的效率，例如，由于选择过程所触发的细胞内信号以及可以改变细胞生长和生存力的细胞内信号。例如，控制抗原识别和B细胞活化相关的信号转导通路的B-细胞限制跨膜蛋白CD22是初始B细胞选择的示例性分子。因为CD22阳性群体包含表达具有不同同种型和特异性的抗体的细胞，其他细胞表面标记也可以用于选择细胞，刺激阶段之前或之后。
在一些实例中，抗体分泌细胞的特异性富集可以通过应用除了基于CD22的选择之外的基于CD27的选择来获得。已知CD27是具有体细胞突变的可变区基因的人B细胞的标记(Borst J et al.(2005)Curr Opin Immunol.17:275-281)。诸如CD5、CD24、CD25、CD86、CD38、CD45、CD70或CD69的其他标记也可以用来减少或富集期望的细胞群体。因此，根据因素，例如供体暴露于抗原(例如RSV抗原)的历史和抗体效价，可以选择总CD22富集的B细胞或者进一步富集的B细胞亚群，如CD27阳性B细胞。
细胞选择之后和细胞永生化之前，细胞群体可以暴露于适当的刺激剂。示例性刺激剂包括例如多克隆B细胞激活剂，例如但不限于先天免疫应答的激动剂(例如Toll样受体激动剂，如CpG寡核苷酸(Bernasconi et al.(2003)Blood 101:4500-4504,Bernasconi etal.(2002)Science298:2199-2202,Bourke et al.(2003)Blood 102:956-63)；例如，CpG核苷酸，例如，CpG2006、CpG2395和CpG2395，可获得自Cell Sciences,Canton,MA)和诸如细胞因子的免疫调节分子(例如，已知具有免疫刺激活性的白介素，例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-13(参见Callard and Kotowicz″Human B-cell responses to cytokines″inCytokine Cell Biology:A practical Approach.Balkwill F(ed.)Oxford UniversityPress,2000,17-31)和TNF受体家族的细胞膜受体的激动剂，特别是激活B细胞中的NF-κB通路和增殖的激动剂，例如但不限于APRIL、BAFF、CD40配体(CD40L)(参见，例如，Schneider(2005)Curr Opin Immunol.17:282-289,He et al.(2004)J Immunol.172:3268-3279,Craxton et al.(2003)Blood 101:4464-4471,and Tangye et al.(2003)J Immunol.170:261-269)。利用EBV永生化与一种或多种多克隆激活剂联合或顺序刺激B细胞的示例性方法是本领域已知的(参见，例如，Traggiai et al.(2004)Nat Med 10:871-875,Tsuchiyamaet al.(1997)Hum Antibodies 8:43-47,Imadome et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA100:7836-7840，以及PCT公开号WO 07/068758、WO 04/76677、WO 91/09115和WO 94/24164)。刺激剂的组合可以在永生化阶段之前同时或顺序加入细胞培养基(例如在初始细胞选择之后马上加入第一刺激剂并且在数小时或数天后加入第二刺激剂)。所述刺激剂可以从稀释的储备溶液直接加入细胞培养基，或者在适当配制之后，例如，利用可以提高它们的吸收和免疫刺激活性的脂质体或其他化合物(Gursel et al.(2001)J Immunol.167:3324-3328)。所述刺激剂还可以连接至固体基质(微珠或直接在细胞培养板上)，这可以允许有效去除所述试剂。可以将细胞用新鲜培养基洗涤一次或多次，并且任选维持在普通细胞培养基中(例如，1-6天)以便进一步稀释和消除所述刺激剂的任何剩余影响。所述刺激剂还可以通过将特定化合物加入细胞培养物来抑制。
可以在刺激细胞之后和将所述选择和刺激的细胞暴露于永生化物质之前(即刺激阶段和永生化阶段之间)基于所表达的抗体的同种型进一步选择细胞。基于同种型选择细胞可以通过应用正(允许分离特定细胞)或负(允许消除不需要的细胞)选择的方法来进行。例如，刺激的IgG阳性细胞的群体可以正选择(通过FACS或磁性细胞分离器)，或者通过从细胞群体减少表达IgM的细胞，并且因此富集表达IgG的细胞。利用荧光激活或磁性细胞分离器的抗体分泌细胞的分离技术在文献中已知(参见，例如，Li et al.(1995)BiochemBiophys Res Commun 207:985-993,Traggiai et al.(2004)Nat Med 10:871-875)。根据抗体分泌细胞的来源和它们的最终用途，还可以进行减少(或富集)其他同种型表达细胞，例如IgD或IgA表达细胞。如果期望这样精细的选择，相似的方法可以用来基于特定亚类分离细胞(例如，选择表达IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体的人B细胞)。
各种病毒永生化物质是本领域已知的，并且可以用于抗体分泌细胞以获得永生化的抗体分泌细胞。感染和永生化抗体分泌细胞的病毒通常称为嗜淋巴细胞病毒。这类病毒的实例是包括在疱疹病毒的γ类之内的病毒。这个病毒家族的成员以物种特异性方式感染淋巴细胞，并且与淋巴组织增生性疾病和几种恶性肿瘤的发展有关(Nicholas(2000)J.MolPathol.53:222-237和Rickinson(2001)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.356:595-604)。在所提供的方法中用作永生化物质的示例性病毒包括EBV(埃巴病毒，也称为疱疹病毒4)和HHV-8(人疱疹病毒8，也称为KSHV，卡波西肉瘤相关性疱疹病毒)，其可以感染和永生化人淋巴细胞。用于所述方法的其他示例性病毒包括但不限于MHV-68(小鼠疱疹病毒68)、HVS(疱疹病毒Samiri)、RRV(恒河猴疱疹病毒)、LCV(灵长类淋巴滤泡病毒)、EHV-2(马疱疹病毒2)、HVA(疱疹病毒Ateles)和AHV-1(狷羚疱疹病毒1)，它们是具有一些保守的常见遗传特征并且在不同哺乳动物宿主细胞中具有相似致病作用的其他致癌的嗜淋巴细胞疱疹病毒。
包含来自用于永生化的病毒的特定病毒蛋白的重组DNA构建体也已用来永生化B细胞(参见Damania(2004)Nat Rev Microbiol.2:656-668和Kilger et al.(1998)EMBOJ.17:1700-1709)。在所提供的方法中可以将包含病毒基因的相似载体转导入细胞。制备这类构建体的方法是本领域公知的，并且包括例如使用反转录病毒系统或病毒样颗粒和包装细胞系，这又提供形成这类颗粒的所有必需因素。
永生化阶段可以持续1小时至数小时，多达2-4天。永生化阶段的长度可以根据各种因素调整，例如细胞生存力和永生化的效率。在一些实例中，将细胞用EBV永生化约4-约24小时的时间。在一具体实例中，将细胞用EBV永生化约16小时的时间。
EBV介导的B细胞的永生化需要被认为是主要EBV受体的细胞表面受体CD21的表达。CD21存在于大多数B细胞亚群上，并且通过与CDl9和B细胞抗原受体形成复合物来调控B细胞应答(Fearon and Carroll(2000)Ann Rev Immun.18:393-422)。用EBV转化细胞的能力可以通过添加B细胞刺激剂来增强，但是条件必须确保CD21维持在细胞表面上，允许高效率EBV永生化。
永生化阶段之后，可以将永生化的细胞在饲养细胞层上低密度培养。饲养层可以由辐照的非异源外周血细胞制品、类淋巴母细胞或成纤维细胞细胞系、脐带血淋巴细胞、或者不同类型的胚细胞组成。具有这些特性的细胞系的实例为EL4-B5，有效支持B细胞的生长和增殖的突变EL4胸腺瘤细胞系。其他示例性饲养细胞包括如本文其他地方所述的辐照的去除B-细胞的PMBC饲养细胞。诸如用来刺激B细胞群体的生长促进剂也可以用来在永生化之后维持永生化的B细胞群体。
永生化的细胞群体可以用于一系列应用，特别是与抗体分离、表征和制备相关的应用。在一些实例中，编码细胞表达的抗体或这类抗体的片段的DNA文库可以利用常见重组技术从分离自大量细胞群体的DNA构建。在一些实例中，如本文所述，可以将永生化的细胞进一步培养并划分为抗体分泌细胞的池。例如，可以将细胞池在饲养细胞层上培养。
在一些实例中，将来自细胞池的细胞培养上清液筛选一轮或多轮，鉴定表达具有特定抗原特异性的抗体(例如，免疫特异性地结合RSV F蛋白的抗体)的细胞。筛选抗体和测量结合特异性的示例性方法如本文其他地方所述，并且是本领域已知的。一旦鉴定特定抗体，编码所述抗体或其抗原结合部分的DNA可以利用公知的重组方法从细胞池分离。如本文所述，然后可以将分离自细胞池的DNA表达(例如，在原核或真核宿主细胞中)并重新筛选，鉴定表达期望的抗体或其抗原结合片段的单个克隆。表达和纯化抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且如F节所述。
在一些实例中，如本文所述，永生化的细胞可以是利用标记的抗原利用细胞分选仪(例如，FACS)分选的单一细胞。在一具体实例中，表达抗RSV抗体的细胞可以利用AlexaFluor 647标记以便标记期望细胞的RSV F抗原分离。分选之后，然后可以利用公知的重组方法分离编码所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的DNA。可以表达分离自细胞池的DNA(例如，在原核或真核宿主细胞中)以证实与RSV抗原的结合。
通常，用来鉴定结合特定抗原的各个抗体的筛选方法导致鉴定这类抗体的抗原结合部分。为了从抗原结合片段产生全长或其他衍生抗体，可以分别分离编码VH和/或VL链或其抗原结合部分的核苷酸序列并克隆入表达VH恒定区(例如，人γ1恒定区)、VL恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体。还可以将VH和VL结构域克隆入表达所选恒定区的载体。然后利用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染入细胞系以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
F.制备抗RSV抗体及其修饰或变体形式以及编码抗体的核酸的方法
本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知用于制备抗体的任何合适的方法产生，包括化学合成和重组表达技术。宿主细胞和载体的各种组合可以用于接受、保持、再生和扩增核酸(例如，编码例如提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的抗体的核酸)，以及表达所述核酸编码的多肽。通常，宿主细胞和载体的选择取决于是否期望扩增、多肽表达和/或在诸如噬菌体的遗传包装上展示。转化宿主细胞的方法是公知的。任何已知的转化方法(例如，转化、转染、感染、电穿孔和超声穿孔)可以用于用核酸转化宿主细胞。制备抗体的方法是本领域公知的，所述抗体例如单克隆抗体和抗体片段，例如但不限于Fab片段和单链抗体。
单克隆抗体可以利用大量本领域已知的技术来制备，包括但不限于使用杂交瘤、重组表达、噬菌体展示技术或它们的组合。例如，单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备，包括本领域已知和教导的那些，例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988);Hammerling,MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 5630681(Elsevier N.Y.1981)。
多肽(例如本文所示的任何多肽，包括本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段)可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备，包括体内和体外方法。期望的多肽可以在适合于制备所需量和形式的蛋白的任何生物体中表达，例如用于分析、施用和治疗。表达宿主包括原核和真核生物体，例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物(例如，兔、小鼠、大鼠和家畜，例如但不限于山羊、绵羊和牛)，包括血清、乳和卵中的产生。表达宿主可以在其蛋白产生水平以及存在于表达的蛋白上的翻译后修饰类型有所不同。表达宿主的选择可以基于这些和其他因素，例如调控和安全考虑、生产成本以及纯化的需求和方法。
1.核酸
本文提供分离的核酸分子，其编码本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述分离的核酸分子编码的抗体为30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6。在一些实例中，所述分离的核酸分子编码30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11、17C9或69F6的抗体形式或上述抗体的其他抗原结合片段形式。
在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:396、398、400、402、404、452、454或456所示的氨基酸的重链。在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子包含具有SEQ ID NO:443、445、447、449、451、477、479或481所示的核苷酸序列的核酸。
在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:395、397、399、401、403、453、455或457所示的氨基酸序列的轻链。在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子包含具有SEQ ID NO:442、444、446、448、450、476、478或480所示的核苷酸序列的核酸。
在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:405、411、417、423、429、437-441、458、464、470或482-484所示的氨基酸序列的VH CDR1。在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:406、412、418、424、430、459、465或471所示的氨基酸序列的VH CDR2。在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQID NO:407、413、419、425、431、460、466或472所示的氨基酸序列的VH CDR3。
在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:408、414、420、426、432、461、467或473所示的氨基酸序列的VL CDR1。在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ IDNO:409、415、421、427、433、462、468或474所示的氨基酸序列的VL CDR2。在一些实例中，本文提供的分离的核酸分子编码抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:410、416、422、428、434、463、469或475所示的氨基酸序列的VL CDR3。
编码本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的核酸分子可以利用操作核酸分子的公知重组技术来制备(参见，例如以下文献描述的技术：Sambrook et al.(1990)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.,eds.(1998)Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley & Sons,NY)。在一些实例中，例如但不限于重组DNA技术、定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)的方法可以用于产生修饰的抗体或其抗原结合片段，其具有不同氨基酸序列，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
在一些实例中，本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR利用常规重组DNA技术插入框架区。框架区可以选自天然存在或共有框架区，包括人框架区(参见，例如Chothia et al.(1998)J.Mol.Biol.278:457-479的示例性框架区)。通常，通过框架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段，其保留亲本抗RSV抗体或其抗原结合片段的抗原-结合特异性。可以对多核苷酸进行改变以改进编码的抗体或其抗原结合片段的一种或多种特性，并且在本领域的技术内。在一些实例中，可以进行多核苷酸的一个或多个修饰以产生框架区中的氨基酸取代，其例如改进抗体或其抗原结合片段对其抗原的结合。此外，这样的方法可以用于产生参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。
2.载体
本文提供的载体包含编码所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的核酸或多种核酸(编码重链和轻链)。通常，将编码抗体的重链的核酸克隆入载体，并且将编码抗体的轻链的核酸编码入所述载体。可以将基因克隆入单一载体用于其双表达，或者克隆入不同载体。如果期望，载体还可以包含编码额外的恒定区或铰链区的其他序列以产生其他抗体形式。
许多表达载体是可用的且为本领域技术人员已知，并且可以用于表达多肽。表达载体的选择会受宿主表达系统的选择影响。这样的选择在本领域技术人员的水平之内。通常，表达载体可以包含转录启动子和任选存在的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有可选择标记，其允许选择和保持转化的细胞。在一些情况下，复制起点可以用于扩增细胞中载体的拷贝数。
载体还可以包含额外的核苷酸序列，其可操作地连接至连接的核酸分子，例如用于定位的表位标签，如6-his标签或myc标签，或者用于纯化的标签，例如GST融合物；以及用于指导蛋白分泌和/或膜关联的序列。
所述抗体或其抗原结合片段的表达可以被本领域已知的任何启动子/增强子控制。合适的细菌启动子为本领域公知，并且描述于下文。用于哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的其他合适启动子为本领域公知，并且示例于下文。用于指导异源核苷酸表达的启动子的选择取决于具体应用，并且在本领域技术人员的水平之内。可用的启动子包括但不限于真核表达载体，其包含SV40早期启动子(Bernoist and Chambon,(1981)Nature 290:304-310)；启动子，其包含于劳氏肉瘤病毒的3’长末端重复序列(Yamamoto et al.(1980)Cell 22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445)；金属硫蛋白的调控序列(Brinster et al.,(1982)Nature 296:39-42)；原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)或tac启动子(DeBoer et al.,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)；还参见“Useful Proteins from RecombinantBacteria”:in Scientific American 242:79-94(1980))；植物表达载体，其包含胭脂氨酸合成酶启动子(Herrera-Estrella et al.,(1984)Nature 303:209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et al.,(1981)Nucleic Acids Res.9:2871)和光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.,(1984)Nature 310:115-120)；来自酵母和其他真菌的启动子元件，例如Gal4启动子、乙醇降解酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子以及表现出组织特异性和用于转基因动物的以下动物转录控制区：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中是活跃的(Swift et al.,(1984)Cell 38:639-646;Ornitz et al.,(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald,(1987)Hepatology 7:425-515)；胰岛素基因控制区，其在胰β细胞中是活跃的(Hanahan et al.,(1985)Nature 315:115-122)；免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴样细胞中是活跃的(Grosschedl et al.,(1984)Cell 38:647-658;Adams et al.,(1985)Nature318:533-538;Alexander et al.,(1987)Mol.Cell Biol.7:1436-1444)；小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中是活跃的(Leder et al.,(1986)Cell 45:485-495)；白蛋白基因控制区，其在肝中是活跃的(Pinckert et al.,(1987)Genes andDevel.1:268-276)；甲胎蛋白基因控制区，其在肝中是活跃的(Krumlauf et al.,(1985)Mol.Cell.Biol.5:1639-403);Hammer et al.,(1987)Science235:53-58)；α-1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中是活跃的(Kelsey et al.,(1987)Genes and Devel.1:161-171)；β珠蛋白基因控制区，其在髓样细胞中是活跃的(Magram et al.,(1985)Nature 315:338-340);Kollias et al.,(1986)Cell 46:89-94)；髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中是活跃的(Readhead et al.,(1987)Cell 48:703-712)；肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中是活跃的(Shani(1985)Nature 314:283-286)；以及促性腺释放激素基因控制区，其在下丘脑的促性腺激素细胞中是活跃的(Mason et al.,(1986)Science234:1372-1378)。
除了启动子，表达载体通常包含转录单元或表达盒，其包含在宿主细胞中表达抗体或其部分所需的所有额外的元件。典型的表达盒包含可操作地连接至编码抗体链的核酸序列的启动子以及转录的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和转录终止所需的信号。所述盒的额外元件可以包括增强子。此外，所述盒通常包含结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。终止区可以获得自与启动子序列相同的基因，或者可以获得自不同的基因。
一些表达系统具有提供基因扩增的标记，例如胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。或者，不涉及基因扩增的高收率表达系统也是合适的，例如利用昆虫细胞中的杆状病毒载体，其具有在多面体启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下编码种系抗体链的核酸序列。
为了本文的目的，提供包含编码抗RSV抗体的重链和/或轻链可变区的核苷酸序列的载体。在一些实例中，本文所提供的载体包含编码抗体的恒定区的核苷酸序列，其可操作地连接至编码所述抗体的可变区的核酸序列。载体可以包括CH1、CH2、铰链、CH3或CH4和/或CL中的一个或全部的序列。通常，例如对于Fab的表达，载体包含CH1或CL(κ或λ轻链)的序列。恒定区或铰链区的序列是本领域技术人员已知的(参见例如美国公开申请第20080248028号)，并且在本文中描述。
本领域技术人员已知用于将DNA片段插入载体的任何方法可以用于构建包含编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的核酸的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。插入克隆载体可以，例如通过将DNA片段连接入具有互补粘性末端的克隆载体来完成。如果克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性位点，则可以酶促修饰DNA分子的末端。或者，可以通过将核苷酸序列(接头)连接至DNA末端来产生期望的任何位点；这些连接的接头可以包含特定的化学合成的核酸，其编码限制性内切酶识别序列。
用于产生本文提供的抗体或抗原结合片段的示例性质粒载体包含强启动子，如HCMV立即早期增强子/启动子或MHC I类启动子；增强转录物加工的内含子，如HCMV立即早期基因内含子A；以及多腺苷酸化(polyA)信号，如晚期SV40 polyA信号。质粒可以是多顺反子的以允许表达抗体的全长重链和轻链、单链Fv片段或其他免疫球蛋白片段。
3.细胞表达系统
编码本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的核酸可以在合适的宿主中表达。本文提供包含载体和编码本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞。通常，可以改造以表达异源DNA并具有分泌途径的任何细胞类型是合适的。表达宿主包括原核和真核生物体，例如细菌细胞(如大肠杆菌)、酵母细胞、真菌细胞、古细菌、植物细胞、昆虫细胞以及包括人细胞在内的动物细胞。表达宿主可以在其蛋白产生水平以及存在于表达的蛋白上的翻译后修饰类型有所不同。此外，表达宿主的选择通常涉及所用的载体以及转录和翻译元件的选择。例如，表达宿主的选择通常，但不总是取决于所用的前体序列的选择。例如，许多异源信号序列仅可以在相同物种的宿主细胞中表达(即，昆虫细胞信号序列在昆虫细胞中最优地表达)。相比之下，其他信号序列可以用于异源宿主，例如人血清白蛋白(hHSA)信号序列，其在酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞中很好地发挥作用；以及组织纤溶酶原激活物前/原序列，其证实为在昆虫和哺乳动物细胞中发挥功能(Tan et al.,(2002)ProteinEng.15:337)。表达宿主的选择可以基于这些和其他因素，例如调控和安全考虑、生产成本以及纯化的需求和方法。因此，载体系统必需与所用的宿主细胞相容。
真核宿主中的表达可以包括以下真核宿主中的表达：酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)细胞和鳞翅目(lepidopteran)细胞；植物和植物细胞，如烟草、玉米、稻、藻类和柠檬(lemna)。用于表达的真核细胞还包括哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主还包括转基因动物中的产生，例如包括血清、乳和卵中的产生。
可以将重组分子引入宿主细胞，通过例如转化、转染、感染、电穿孔和超声穿孔，从而产生基因序列的许多拷贝。通常，将标准转染方法用于产生表达大量抗体链的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后将其利用标准技术纯化(参见，例如Colley et al.(1989)J.Biol.Chem.,264:17619-17622;Guide to Protein Purification,in Methods inEnzymology,vol.182(Deutscher,ed.),1990)。真核和原核细胞的转化根据标准技术进行(参见，例如Morrison(1977)J.Bact.132:349-351;Clark-Curtiss and Curtiss(1983)Methods in Enzymology,101,347-362)。例如，可以使用任何公知的将外源核苷酸序列引入宿主细胞的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质融合、电穿孔、轰击(biolistic)、脂质体、微注射、等离子(plasma)载体、病毒载体(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)以及任何其他将克隆的基因组DNA、cDNA、质粒DNA、粘粒DNA、合成DNA或其他外源遗传物质引入宿主细胞的公知方法。
通常，为了本文的目的，用至少编码抗RSV抗体的VH链或重链的第一载体以及至少编码所述抗RSV抗体的VL链或轻链的第二载体转染宿主细胞。还可以用编码轻链和重链或者其部分的单一载体转染宿主细胞。
在一实例中，将编码抗体的重链的核酸连接入第一表达载体，并且将编码抗体的轻链的核酸连接入第二表达载体。所述表达载体可以相同或不同，虽然通常它们足够相容以允许蛋白(重链和轻链)由此相当的表达。所述第一和第二表达载体一般共转染入宿主细胞，典型为1:1比例。载体的实例包括但不限于pγ1HC和pκLC(Tiller et al.(2008)Journal of Immunological Methods,329:112-24)。其他表达载体包括L链表达载体pAG4622和重链表达载体pAH4604(Coloma et al.(1992)J Immunol.Methods,152:89-104)。pAG4622载体包含编码人κL链的C-区结构域和gpt选择标记的基因组序列。pAH4604载体包含hisD选择标记和编码人H链γ1C-区结构域的序列。
在另一实例中，可以将重链和轻链克隆入具有重链和轻链的表达盒的单一载体。在一实例中，可以将编码重链和轻链的基因克隆入哺乳动物表达载体pTT5(NRCBiotechnology Research)。在另一实例中，可以将编码重链和轻链或者其部分的基因克隆入pCALM(SEQ ID NO:102)。
为了表达全长Ig，可以将编码VH-CH1-铰链-CH2-CH3的序列克隆入第一表达载体，并且将编码VL-CL结构域的序列克隆入第二表达载体。为了产生Fab，可以将编码VH-CH1的序列克隆入第一表达载体，并且将编码VL-CL结构域的序列克隆入第二表达载体。对于常规抗体，重链与轻链配对并产生Fab单体。
表达可以在本领域技术人员已知的任何细胞表达系统中。表达的示例性细胞包括但不限于293FS细胞、HEK293-6E细胞或CHO细胞。其他表达载体和宿主细胞如下文所述。当表达时，抗体重链和轻链通过二硫键配对以形成全长抗体或其片段。
a.原核表达
原核细胞，特别是大肠杆菌提供了用于产生大量蛋白的系统，并且可以用于表达本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。通常，大肠杆菌宿主细胞用于扩增和表达本文提供的变体多肽。大肠杆菌的转化是本领域技术人员公知的简单且快速的方法。大肠杆菌的表达载体可以包含诱导型启动子，这类启动子可用于诱导高水平的蛋白表达和用于表达对宿主细胞表现出一些毒性的蛋白。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调控的λPL启动子。
蛋白可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达，例如本文所提供的任何蛋白。对于一些多肽，细胞质环境可以导致含有蛋白团聚体的不溶性包含体的形成。诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇的还原剂以及诸如胍-HCl和尿素的变性剂可以用来重溶解蛋白，随后该可溶性蛋白重折叠。可选的方法是在细菌的周质间隙中表达蛋白，细菌的周质间隙提供氧化环境以及伴侣蛋白样蛋白(chaperonin-like)和二硫键异构酶，并且可以导致可溶性蛋白的产生。例如，为了蛋白的噬菌体展示，可以将蛋白输出至周质，从而它们可以装配入噬菌体。通常，将前导序列融合至待表达的蛋白，其将蛋白引导至周质。然后前导序列被周质中的信号肽酶去除。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酸裂合酶基因的pelB前导序列以及来源于碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况下，周质表达允许所表达的蛋白渗漏至培养基。蛋白的分泌允许从培养上清液快速而简单的纯化。不分泌的蛋白可以通过渗透裂解从周质获得。与细胞质表达相似，在一些情况下蛋白可以变为不溶的，并且变性剂和还原剂可以用来促进溶解和重折叠。诱导和生长的温度也可以影响表达水平和溶解性，通常使用25℃-37℃的温度。通常，细菌产生非糖基化的蛋白。因此，如果蛋白的功能需要糖基化，则可以在从宿主细胞纯化后体外加入糖基化。
b.酵母细胞
酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和毕赤酵母(Pichia pastoris)是众所周知的酵母表达宿主，可以用来表达本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。酵母可以用游离型复制载体转化或者通过同源重组进行稳定染色体整合。通常，诱导型启动子用于调控基因表达。这类启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1，或者其他毕赤酵母(Pichia)或其他酵母启动子。表达载体常包含用于选择和维持转化DNA的选择标记，如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。在酵母中表达的蛋白通常是可溶的。与诸如Bip和蛋白二硫键异构酶的伴侣蛋白共表达可以提高表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白可以被引导分泌，利用诸如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号的分泌信号肽融合以及与诸如Aga2p交配粘附受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的酵母细胞表面蛋白融合。可以工程化诸如Kex-2蛋白酶的蛋白酶切割位点以在表达多肽离开分泌途径时从表达多肽去除融合序列。酵母还能够在Asn-X-Ser/Thr基序处糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞，特别是利用杆状病毒表达可以用来表达本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。昆虫细胞表达高水平的蛋白，并且能够进行高等真核生物所用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有有限的宿主范围，
这提高了安全性并且减少了真核表达的监管问题。典型的表达载体为了高水平表达使用启动子，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒和昆虫细胞系，杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)，昆虫细胞系如来源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。为了高水平表达，将待表达的分子的核苷酸序列直接融合至病毒多角体蛋白起始密码子的下游。为了产生能够表达人抗体的杆状病毒重组体，利用双表达转移，如pAcUW51(PharMingen)。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被准确加工并且可以用来将表达蛋白分泌入培养基。此外，细胞系美洲粘虫(A7S)和黑脉金斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白。
昆虫细胞中的可选表达系统使用稳定转化的细胞。诸如Schnieder2(S2)和Kc细胞(果蝇)以及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))的细胞系可以用于表达。果蝇(Drosophila)金属硫蛋白启动子可以用来在镉或铜的重金属诱导存在的情况下诱导高水平表达。表达载体通常通过使用诸如新霉素和潮霉素的选择标记来保持。
用于表达抗体的杆状病毒载体的实例为双顺反子载体pAc-κ-Fc(Progen,Biotechnik;目录号PR3001)；pAc-λ-Fc(Progen;PR3003)；pAc-κ-CH3(Progen;PR3000)和pAc-λ-CH3(Progen;PR3002)。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可以用来表达本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。表达构建体可以通过病毒感染(例如但不限于腺病毒或痘苗病毒)或者通过直接DNA转移来转移至哺乳动物细胞，所述直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过诸如电穿孔和显微注射的物理方法。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包含mRNA帽位点、TATA框、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多腺苷酸化元件。这类载体常包含用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中活跃。组织和细胞类型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自诸如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳癌病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素基因调控的基因的启动子/增强子区。可选择标记可以用来选择和保持具有表达构建体的细胞。可选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。抗体可以利用NEOR/G418系统、二氢叶酸还原酶(DHFR)系统或谷氨酰胺合成酶(GS)系统产生。GS系统使用联合表达载体如pEE12/pEE6以表达重链和轻链。与诸如TCR-ζ和FcεRI-γ的细胞表面信号分子融合可以引导蛋白在细胞表面上以活性状态表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、BHK、HeLa、MDCK、MT2、小鼠NS0(非分泌)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异种杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、W138、BT483、HS578T、HTB2、BT20、T47D、293S、2B8和HKB细胞。细胞系还可适应促进从细胞培养基纯化分泌的蛋白的无血清培养基。一个这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham etal.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42.)。
用于表达载体的示例性哺乳动物载体包括pTT5(NRC Biotechnology ResearchInstitute)和pCALM(如SEQ ID NO:102所示)。
e.植物
转基因植物细胞和植物可以用来表达如本文所述的任何多肽。通常利用诸如微粒轰击和PEG-介导的转移入原生质体的直接DNA转移以及用农杆菌-介导的转化来将表达构建体转移至植物。表达载体可以包含启动子和增强子序列、转录终止元件以及翻译控制元件。在诸如拟南芥(Arabidopsis)和烟草的双子叶植物宿主以及诸如玉米和水稻的单子叶植物宿主之间通常划分表达载体和转化技术。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及泛素和UBQ3启动子。诸如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶的可选择标记常用来促进转化细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养中保持为细胞、团聚体(愈伤组织)或再生为整个植物。转基因植物细胞还可以包括工程化以产生蛋白酶或修饰的蛋白酶的藻类(参见例如，Mayfield et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100:438-442)。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，所以这可以影响这些宿主中产生的蛋白的选择。
4.抗体的纯化
用于从宿主细胞纯化包括本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段在内的多肽的方法取决于所选的宿主细胞和表达系统。对于分泌分子，蛋白一般在去除细胞后从培养基纯化。对于细胞内表达，可以将细胞裂解并从提取物纯化蛋白。在一实例中，通过离心和细胞裂解(例如通过在干冰/乙醇浴中反复冻融)然后离心并保留含有多肽的上清液来从宿主细胞分离多肽。当诸如转基因植物和动物的转基因有机体用于表达时，组织或器官可以用作起始原料以产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物产品可以包括乳汁或卵中的多肽产品，可以将其收集，并且如有必要可以利用本领域的标准方法提取和进一步纯化蛋白。
蛋白，如本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以利用本领域已知的标准蛋白纯化技术例如从裂解的细胞提取物纯化，所述标准蛋白纯化技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级和大小排阻层析、硫酸铵沉淀以及诸如阴离子交换的离子交换层析。亲和纯化技术也可以用来提高制品的效率和纯度。例如，抗体、受体以及结合蛋白酶的其他分子可以用于亲和纯化。还可以将表达构建体工程化以将诸如myc表位、GST融合或His6的亲和标签加入蛋白，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。可以通过本领域已知的任何方法评价纯度，包括凝胶电泳以及染色和分光光度技术。
通常，通过本领域技术人员已知的任何方法纯化抗体及其部分。可以利用本领域已知的标准蛋白纯化技术将抗体纯化至相当的纯度，所述标准蛋白纯化技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级和大小排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析、离子交换层析或者柱层析。例如，抗体可以通过柱层析来纯化。纯化抗体的方法的实例是通过利用柱层析，其中将固体支持柱材料连接至来自链球菌(Streptococcus)的细胞表面相关蛋白G蛋白，G蛋白以高亲和力结合免疫球蛋白。抗体可以纯化至60%、70%、80%纯度，并且通常至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%纯度。纯度可以通过标准方法来评价，例如通过SDS-PAGE和考马斯染色。
然后可以例如通过在凝胶(例如SDS-Page凝胶)上分离、大小分级(例如在SephacrylTMS-200HiPrepTM16x60大小排阻柱(Amersham from GE Healthcare LifeSciences,Piscataway,NJ)上分离)来分析分离的多肽。还可以在结合测定中分析分离的多肽，通常为利用结合诸如板(例如基于ELISA的结合测定)或珠的固体支持物的结合配对物的结合测定，以测定它们结合期望的结合配对物的能力。结合测定如下文的章节所述，其用来评价沉淀的噬菌体展示的多肽的结合，还可以用来评价直接分离自宿主细胞裂解物的多肽。例如，可以进行结合测定以测定抗体多肽是否结合一种或多种抗原，例如，通过将抗原包被在固体支持物上，如测定板的孔，并且将分离的多肽在所述固体支持物上温育，然后洗涤并用第二试剂检测，例如酶标记的抗体和底物。
G.评价抗RSV抗体性质和活性
本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过本领域技术人员公知的各种方法来表征。例如，可以测定本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合人呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白的能力。这样的测定可以例如在以下物质中进行：在溶液中(如Houghten(1992)Bio/Techniques 13:412-421)、在珠上(Lam(1991)Nature 354:82-84)、在芯片上(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、在细菌上(美国专利第5,223,409号)、在孢子上(美国专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、在质粒上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或在噬菌体上(Scott and Smith(1990)Science249:386-390;Devlin(1990)Science 249:404-406;Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382;和Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)。还可以测定已经鉴定为免疫特异性地结合RSV抗原或其片段的抗体或其抗原结合片段对RSV抗原的特异性和亲和力。可以确定结合特异性或表位，例如通过与其他抗RSV抗体的竞争测定和/或利用抗单克隆抗体突变体(MARM)的病毒中和测定。此外，利用本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，可以使用体外测定和体内动物模型来测量通过抗RSV抗体或其抗原结合片段的接触或施用进行的RSV中和的水平。
1.结合测定
通过本领域技术人员已知的任何方法，可以评价本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段结合所选靶标(如RSV病毒或分离的RSV F蛋白)的能力以及对此类靶标的特异性。示例性测定提供于实施例，以及描述于下文。结合测定可以在溶液、悬浮液中或在固体支持物上进行。例如，可以将靶抗原固定于固体支持物(如碳或塑料表面、组织培养皿或芯片)，并与抗体或其抗原结合片段接触。可以洗去未结合的抗体或靶蛋白，然后可以检测结合的复合物。可以在降低非特异性结合的条件下进行结合测定，例如利用高离子强度缓冲液(如0.3-0.4M NaCl)与非离子去污剂(如0.1%Triton X-100或Tween 20)和/或封闭蛋白(如牛血清白蛋白或明胶)。这样的测定中还可以包括阴性对照作为背景结合的量度。结合亲和力可以利用Scatchard分析(Munson et al.,(1980)Anal.Biochem.,107:220)、表面等离子共振、等温量热法或本领域技术人员已知的其他方法来测定。
可以用于分子免疫特异性地结合和交叉反应性的示例性免疫测定包括但不限于竞争和非竞争性测定系统，其使用例如但不限于以下的技术：蛋白印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、Meso Scale Discovery(MSD,Gaithersburg,Maryland)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、ELISPOT、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定。这样的测定是本领域常规和公知的(参见，例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols inMolecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York，其整体援引加入本文)。其他测定形式包括脂质体免疫测定(LIA)，其使用设计为结合特定分子(如抗体)的脂质体，并释放包封的试剂或标记。然后根据标准技术检测释放的化学物质(参见Monroe et al.,(1986)Amer.Clin.Prod.Rev.5:34-41)。下文简述非限制性的示例性免疫测定。
免疫沉淀方法通常包括将细胞群体在诸如RIPA缓冲液(1%NP-40或Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠，pH7.2、1%抑肽酶)的裂解缓冲液中裂解，所述裂解缓冲液补充了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如EDTA,PMSF,aprotinin,sodium vanadate)；向细胞裂解物加入所关注的抗体或其抗原结合片段；在40℃下温育一定时间(如1-4小时)；向细胞裂解物加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠；在40℃下温育约1小时或更长时间；将珠用裂解缓冲液洗涤并再悬浮于SDS/样品缓冲液中。可以通过例如蛋白印迹分析评价所关注的抗体或其抗原结合片段免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员应当理解，可以改变参数以增加抗体或其抗原结合片段对抗原的结合并降低背景(例如用琼脂糖珠预清理细胞裂解物)。关于免疫沉淀方法的进一步讨论参见，例如Ausubel et al.,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.16.1。
蛋白印迹分析通常包括制备蛋白样品；在聚丙烯酰胺凝胶中蛋白样品的电泳(如8%-20%SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)；将蛋白样品从聚丙酰烯胺凝胶转移至诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙的膜；将膜在封闭液(如包含3%BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭；将膜在洗涤缓冲液(如PBS-Tween 20)中洗涤；将膜用在封闭缓冲液中稀释的一抗或其抗原结合片段(即，所关注的抗体或其抗原结合片段)封闭；将膜在洗涤缓冲液中洗涤；将膜用在封闭缓冲液中稀释的缀合至酶促底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如32P或125I)的二抗(其识别一抗，如抗人抗体)封闭；将膜在洗涤缓冲液中洗涤；以及检测抗原的存在。本领域技术人员应当了解，可以改变参数以增加检测的信号并降低背景噪音。关于蛋白印迹方法的进一步讨论参见，例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols inMolecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.8.1。
ELISA包括制备抗原，用所述抗原包被96孔微量滴定板的孔，将缀合至诸如酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的可检测的化合物的所关注的抗体或其抗原结合片段加入孔并温育一段时间，以及检测所述抗原的存在。在ELISA中，所关注的抗体或其抗原结合片段不必缀合至可检测的化合物；作为替代，可以将缀合至可检测的化合物的二抗(其识别所关注的抗体)加入孔。而且，代替用所述抗原包被孔，可以将所述抗体包被至孔。在这种情况下，将所关注的抗原加入包被的孔之后可以加入缀合至可检测的化合物的二抗。本领域技术人员知道可以修改以增加检测的信号的参数以及本领域已知的ELISA的其他变化。关于ELISA的进一步讨论参见，例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocolsin Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 11.2.1。实施例5和8示例抗RSV抗体结合RSV F蛋白的结合测定。
例如，可以通过竞争性结合测定来测定抗体或其抗原结合片段与抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在增加量的未标记的抗原存在的情况下将标记的抗原(例如，3H或125I)与所关注的抗体或其抗原结合片段温育，并且检测结合标记的抗原的抗体或其抗原结合片段。可以通过Scatchard图分析从该数据确定本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段对RSV抗原的亲和力以及结合解离速率。还可以利用放射免疫测定来测定与二抗的竞争。在这种情况下，在增加量的未标记的二抗存在的情况下将RSV抗原与缀合至标记的化合物(例如，3H或125I)的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段温育。在一些实例中，表面等离子共振(例如，BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)动力学分析可以用来测定抗体或其抗原结合片段与RSV抗原的结合速率和解离速率。表面等离子共振动力学分析包括分析RSV抗原从表面上具有固定的抗体或其片段的芯片结合和解离。
利用本领域技术人员已知的技术，还可以测定本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制RSV对其宿主细胞受体结合的能力。例如，可以使表达RSV的受体的细胞与RSV在存在或不存在抗体或其抗原结合片段的情况下接触，并且所述抗体或其片段抑制RSV的结合的能力可以通过例如流式细胞术或闪烁测定来测量。RSV(例如RSV抗原，如F糖蛋白或G糖蛋白)或者抗体或其抗体片段可以用可检测的化合物如放射性标记(如32P、35S和125I)或荧光标记(如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺)标记以允许检测RSV与其宿主细胞受体之间的相互作用。
抗体或其抗原结合片段抑制RSV结合其受体的能力还可以在无细胞测定中测定。例如，可以使RSV或RSV抗原如F糖蛋白与抗体或其片段接触，并且可以测定所述抗体或抗体片段抑制RSV或RSV抗原结合其宿主细胞受体的能力。在一些实例中，将抗体或抗原结合片段固定于固体支持物上，并且将RSV或RSV抗原用可检测的化合物标记。在一些实例中，将RSV或RSV抗原固定于固体支持物上，并且将抗体或其片段用可检测的化合物标记。RSV或RSV抗原可以是部分或完全纯化的(如部分或完全不含其他多肽)或者是细胞裂解物的一部分。在一些实例中，RSV抗原可以是融合蛋白，其包含RSV抗原和诸如谷胱甘肽-S-转移酶的结构域。在一些实例中，可以将RSV抗原利用本领域技术人员公知的技术生物素化(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals;Rockford,Ill.)。
2.结合特异性
可以通过本领域技术人员已知的任何测定来测定本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的结合特异性或表位，包括但不限于表面等离子共振、竞争测定以及利用抗单克隆抗体突变体(MARM)的病毒中和测定。表位可以在分离的蛋白(即分离的F蛋白)中，或者在病毒中的蛋白中。两种抗体结合相同表位的能力可以通过本领域已知的测定来确定，例如，表面等离子共振测定和抗体竞争测定。通常，免疫特异性地结合相同表位的抗体可以竞争结合所述表位，这可以例如利用本领域已知的技术通过体外结合竞争测定(例如竞争ELISA)来测量。通常，免疫特异性地与第二抗体结合相同的表位的第一抗体可以约或30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%竞争结合所述表位，其中百分比竞争是测量的所述第二抗体置换所述第一抗体结合所述表位的能力。在示例性竞争测定中，在预定的有限稀释的标记的抗体(例如，50-70%包含浓度)和连续稀释的未标记的竞争抗体存在的情况下温育所述抗原。通过在所述竞争抗体存在的情况下测量所述标记的抗体结合所述抗原的结合中的任何减少来测定竞争。这类测定的变化是本领域已知的，包括各种标记技术和检测方法，包括例如辐射、荧光、酶促和比色检测。例如，如下文实施例10所示例，抗体30D8和莫他珠单抗不竞争结合RSV F蛋白，因此表明抗体30D8与莫他珠单抗结合不同的表位。
第一抗体与第二抗体结合相同的表位的能力还可以利用抗单克隆抗体突变体通过病毒中和测定来确定。MARM是不被中和野生型RSV病毒的单克隆抗体中和的突变的呼吸道合胞病毒(RSV)，即MARM是RSV逃逸突变体。通过在单克隆抗体存在的情况下培养野生型RSV来产生MARM，在所述抗体存在的情况下经过连续数轮的病毒复制，从而在连续的每轮病毒复制之后，在增加浓度的抗体存在的情况下观察到致细胞病变效应(CPE)，直至不被所述抗体中和的突变病毒结果。如果第一抗体可以中和针对第二抗体产生的MARM，可以得出结论所述抗体特异性结合不同表位或与不同表位相互作用。例如，当第一抗RSV抗体中和野生型RSV但不中和特定突变的RSV(即，MARM)时，中和所述野生型RSV但不中和所述特定突变的RSV的第二抗体一般与所述第一抗体结合相同的RSV上的表位。当第一抗RSV抗体中和野生型RSV但不中和特定突变的RSV时，中和所述野生型RSV和所述特定突变的RSV的第二抗体一般不与所述第一抗体结合相同的RSV上的表位。
例如，如下文实施例9所示例，本文所提供的58c5能够中和以前产生的针对各种抗RSV抗体的MARM，包括针对帕利珠单抗和莫他珠单抗的亲本抗体MAb 1129产生的MARM1129(参见，Johnson et al.(1997)J.Infect.Diseases 176:1215-1224和美国专利第5,824,307号)、针对Fab 19产生的MARM 19(参见Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10164-10168)以及针对MAb 151产生的MARM 151(参见，Mufson et al.,(1985)J.Gen.Virol,66:2111-2124)。因此，58c5与抗体Fab 19、MAb 151和MAb 1129结合不同的F蛋白上的表位。
如下文实施例11所示例，针对莫他珠单抗和58c5的IgG形式产生MARM。5-7轮选择后产生的莫他珠单抗MARM与野生型RSV F蛋白相比含有单个氨基酸突变(K272E,SEQ IDNO:486)。氨基酸K272处的突变与已知破坏莫他珠单抗的亲本抗体的结合的突变一致(参见，Zhao et al.,(2004)J.Infectious Disease 190:1941-1946)。10轮选择后产生的58c5MARM与野生型RSV F蛋白相比含有3个氨基酸突变(N63K、M115K和E295G，SEQ ID NO:487)。58c5 MARM中影响逃逸的突变以前未被鉴定为免疫特异性地结合RSV F蛋白的各种单克隆抗体的抗原位点(参见，例如，Beeler et al.(1989)J.Virology 63(7):2841-2950,Croweet al.(1998)Virology 252:373-375;Zhao et al.,(2004)J.Infectious Disease 190:1941-1946;Liu et al.,(2007)Virology Journal 4:71)。在30D8的IgG形式的存在下，12轮病毒复制之后RSV病毒不能逃脱中和(参见下文实施例11)。抗体30D8限制MARM的产生的能力意味着30D8结合对逃逸突变体的产生较不敏感的表位，因此，抗体30D可用作治疗性抗体用于治疗RSV感染。
此外，如下文实施例11所示，30D8中和莫他珠单抗MARM和58c5MARM，58c5中和莫他珠单抗MARM，并且莫他珠单抗中和58c5 MARM。因此，30D8与58c5和莫他珠单抗结合RSV F蛋白的不同表位。此外，58c5与30D8和莫他珠单抗结合RSV F蛋白的不同表位。
3.用于分析抗体的病毒中和效应的体外测定
可以通过本领域已知的用于检测病毒中和的任何合适的方法分析本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。用于检测病毒中和的方法包括但不限于空斑测定以及合胞体形成抑制的测定。这类测定可以用来评价例如病毒吸附、病毒进入和病毒的细胞至细胞传播的抑制(参见，例如Burioni et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:355-359;Sanna et al.(2000)Virology 270:386-396l;and De Logu et al.,(1998)J ClinMicrobiol 36:3198-3204)。本领域技术人员可以鉴定能够测量病毒中和的任何测定。
标准空斑测定包括例如空斑减少测定、空斑大小减小测定、中和测定和中和动力学测定。这些测定测量病毒感染靶细胞单层之后病毒空斑(即裂解细胞的区域)的形成。可以用于空斑减少测定的示例性靶细胞系包括但不限于非洲绿猴肾细胞、MRC-5细胞、RC-37细胞、BHK-21/C13细胞和HEp-2细胞。本领域技术人员可以鉴定用于空斑测定的适当靶细胞系。用于空斑测定的适当细胞系的选择可以取决于已知因素，例如，细胞感染性以及病毒在靶细胞中增殖和裂解靶细胞的能力。实施例6和9示例体外中和测定。
空斑减少测定可以用来测量抗RSV抗体或其抗原结合片段在溶液中影响病毒中和的能力。在示例性空斑减少测定中，添加靶细胞之前将抗体或其抗原结合片段与病毒预温育。然后将靶细胞用抗体/病毒混合物感染，并且在预定的感染期之后进行空斑测定。本领域技术人员可以基于本领域已知的实例确定所需的温育时间。靶细胞感染之后产生的病毒空斑数量的减少表明抗体或其抗原结合片段防止病毒结合靶细胞的能力，其不依赖于抗体或其抗原结合片段吸附至靶细胞和/或抗体或其抗原结合片段内化。
空斑大小减小测定可以用来测量抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制病毒的细胞至细胞传播的能力。在示例性空斑大小减小测定中，首先用病毒感染靶细胞预定的感染期，然后将抗体或其抗原结合片段加入感染的细胞。本领域技术人员可以基于本领域已知的实例确定所需的温育时间。病毒空斑大小(即直径)的减小表明抗体或其抗原结合片段能够防止病毒的细胞至细胞传播。
病毒中和测定可以用来测量抗RSV抗体或其抗原结合片段在靶细胞表面通过病毒暴露之前所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞的结合来影响病毒中和的能力。在示例性病毒中和测定中，将抗体或其抗原结合片段与靶细胞预温育预定的一段时间以允许抗体或其抗原结合片段结合靶细胞。预温育期之后，去除未结合的抗体并用病毒感染靶细胞。这个测定中空斑数量的减少表明抗体或其抗原结合片段防止病毒感染的能力，其依赖于吸附至靶细胞和/或抗体或其抗原结合片段的内化。这个测定还可以用于通过改变抗体或抗原结合片段浓度和预温育时间来测量中和动力学。
合胞体形成抑制的示例性测定可以用于通过在使用融合病毒株时阻断合胞体的形成来测量抗体介导的病毒致细胞病变效应的抑制。本领域技术人员可以鉴定用于该测定的适当的融合病毒株。
还可以利用本领域技术人员已知的技术测定本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制或下调RSV复制的能力。例如，可以通过例如Johnson et al.(1997)Journal ofInfectious Diseases 176:1215-1224所述的空斑测定来测定RSV复制。还可以测定本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制或下调RSV多肽表达的能力。本领域技术人员已知的技术可以用来测量RSV多肽的表达，包括但不限于蛋白印迹分析、RNA印迹分析和RT-PCR。
4.用于评价抗RSV抗体的效力的体内动物模型
可以进行使用动物模型的体内研究以评价本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的效力。可以进行使用动物模型的体内研究以评价施用这类抗体或其抗原结合片段的任何毒性。各种测定(例如采用体内动物模型的测定)对于本领域技术人员是可用的，其用于评价抗RSV抗体抑制或治疗RSV病毒感染的能力以及用于评价任何毒性。可以利用包括病毒感染动物模型在内的病原感染动物模型评价抗RSV抗体的疗效。这类动物模型是本领域已知的，并且包括但不限于RSV感染的动物模型，例如但不限于棉鼠、近交系小鼠、小牛、雪貂、仓鼠、豚鼠、黑猩猩、枭猴、猕猴、非洲绿猴、卷尾猴、松鼠猴、帽猴、狒狒(参见，例如，Prince et al.(1978)Am.J.Pathol.93:771-791;Prince et al.(1979)Infect.Immunol.26:764-766;Byrd and Prince(1997)Clinical Infectious Diseases25:1363-1368，包括其中所引用的RSV感染的示例性模型的参考文献)。为了体内测试抗体或抗原结合片段或者组合物的毒性，可以使用本领域已知的任何动物模型系统，包括但不限于大鼠、小鼠、牛、猴和兔。
5.用于测量抗体效力的体外和体内测定
治疗或防止病毒感染的效力可以通过检测本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制病毒的复制、抑制传播或防止病毒在其宿主中建立本身、降低RSV感染的发病率或者防止、改善或减轻与RSV感染相关的一种或多种症状的能力来证实。例如，如果施用本文所提供的抗体或组合物之后有病毒载量的减少、一种或多种症状的改善、RSV感染持续时间的减少或者死亡率和/或发病率的降低，那么认为治疗是治疗性的。而且，如果施用一种或多种免疫特异性地结合一种或多种RSV抗原的抗体或其抗原结合片段之后免疫应答有增加，那么认为治疗是治疗性的。
可以体外和体内测试本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段诱导细胞因子表达的能力，如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12和IL-15。本领域技术人员已知的技术可以用来测量细胞因子的表达水平。例如，细胞因子的表达水平可以通过例如RT-PCR和RNA印迹分析分析细胞因子的RNA水平来测量，以及通过例如免疫沉淀然后蛋白印迹分析或ELISA分析细胞因子的水平来测量。
可以体外和体内测试本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段调节包括人免疫细胞在内的免疫细胞(例如，T-细胞、B-细胞和自然杀伤细胞)的生物学活性的能力。抗RSV抗体或抗原结合片段调节免疫细胞的生物学活性的能力可以通过检测抗原的表达、检测免疫细胞的增殖、检测信号分子的活化、检测免疫细胞的效应子功能或者检测免疫细胞的分化来评价。本领域技术人员已知的技术可以用于测量这些活性。例如，细胞增殖可以通过3H-胸苷掺入测定和台盼蓝细胞计数来测定。抗原表达可以例如通过免疫测定来测定，所述免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，使用诸如蛋白印迹、免疫组织化学放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、A蛋白免疫测定以及FACS分析的技术。信号分子的活化可以例如通过激酶测定和电泳迁移测定(EMSA)来测定。
还可以在体外、离体和体内测定中测试本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制病毒复制或减少病毒载量的能力。还可以测定所述抗RSV抗体或其抗原结合片段减短RSV感染的时间进程的能力。还可以测定所述抗RSV抗体或其抗原结合片段增加患有RSV感染的人的生存期至少或约25%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约75%、至少或约85%、至少或约95%或者至少或约99%的能力。而且，可以测定抗RSV抗体或其抗原结合片段减少患有RSV感染的人的住院期至少或约60%、至少或约75%、至少或约85%、至少或约95%或者至少或约99%的能力。本领域技术人员已知的技术可以用来分析本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段在体内的功能。
按照本文所提供的方法和用途，不必进行人体临床试验以证实本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的预防和/或治疗效力。使用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的体外和动物模型研究可以外推至人，并且足以证实所述抗RSV抗体或抗原结合片段的预防和/或治疗效用。
H.诊断用途
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用于诊断测定，用于RSV的检测、纯化和/或中和。示例性诊断测定包括RSV的体外和体内检测。例如，提供使用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段定性和定量测量分离的生物样品(例如，痰)中或体内RSV水平的测定。
如本文所述，可以将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段缀合至可检测部分用于体外或体内检测。例如，这类抗体可以用来评价所述抗RSV抗体或其抗原结合片段在体内部位(例如，粘膜部位)的定位和/或持久性。偶联至可检测部分的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的任何合适的方法在体内检测。偶联至可检测部分的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以在分离的生物学样品中检测，例如获得自施用所述抗体或其抗原结合片段之后的对象的组织或流体样品。
1.病原感染的体外检测
一般来说，可以基于获得自对象或患者的生物学样品(例如，血液、血清、痰尿和/或其他适当的细胞或组织)中一种或多种RSV蛋白和/或编码这类蛋白的多核苷酸的存在来在对象或患者中检测RSV。这类蛋白可以用作标记物以显示对象或患者中RSV存在或不存在。本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用于检测结合生物学样品中的物质的抗原和/或表位的水平。
本领域技术人员已知各种测定形式，其用于使用抗RSV抗体或其抗原结合片段检测样品中的多肽标记物(参见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。一般来说，对象或患者中RSV的存在或不存在可以通过使获得自对象或患者的生物学样品与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段接触并检测样品中结合所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的多肽的水平来测定。
在一些实例中，所述测定包括使用固定在固体支持物上的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段以结合靶多肽并从样品的剩余物去除靶多肽。然后可以利用含有报告基团并特异性结合抗体/多肽复合物的检测试剂检测结合的多肽。这类检测试剂可以含有例如特异性结合所述多肽的结合剂或者抗体或者特异性结合所述结合剂的其他物质。
在一些实例中，可以利用竞争测定，其中将多肽用报告基团标记，并且允许其在抗RSV抗体或其抗原结合片段与样品温育之后结合固定的抗RSV抗体或其抗原结合片段。样品的组分抑制标记的多肽结合抗RSV抗体或其抗原结合片段的程度指示样品与固定的抗RSV抗体或其抗原结合片段的反应性。用于这类测定的合适的多肽包括如上文所述抗RSV抗体或其抗原结合片段结合的全长RSV F蛋白及其部分，包括RSV F蛋白的细胞外结构域。
所述固体支持物可以是本领域技术人员已知的可以吸附蛋白的任何物质。例如，所述固体支持物可以是微量滴定板中的测试孔或者硝化纤维素或其他合适的膜。所述支持物还可以是珠或盘，例如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物还可以是磁性颗粒或光纤传感器，例如美国专利第5,359,681号所公开的物质。可以利用本领域技术人员已知的各种技术将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段固定在所述固体支持物上。可以通过吸附至微量滴定板中的孔或膜来固定所述抗RSV抗体或其抗原结合片段。在这类情况下，可以通过使合适的缓冲液中的抗RSV抗体或其抗原结合片段与固体支持物接触适量的时间来实现吸附。接触时间随温度变化，但是通常在约1小时和约1天之间。一般来说，使塑料微量滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与约10ng-约10μg，典型约100ng-约1μg的抗RSV抗体或其抗原结合片段接触足以固定适量的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
抗RSV抗体或其抗原结合片段共价连接至固体支持物一般可以通过首先使所述支持物与双功能试剂反应来实现，所述双功能试剂会与所述支持物以及所述抗RSV抗体或其抗原结合片段上的官能团(例如羟基或氨基)反应。例如，可以利用苯醌或者通过支持物上的醛基与结合配对物上的胺和活性氢缩合来将所述RSV抗体或其抗原结合片段共价连接至具有适当聚合物包被的支持物(参见，例如，Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook,1991,at A12-A13)。
在一些实例中，在流穿测试或带测试形式中进行该测定，其中将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段固定在膜上，例如硝化纤维素。在流穿测试中，当样品通过膜时，样品内的多肽结合固定的抗RSV抗体或其抗原结合片段。然后当含有第二结合剂的溶液通过膜时，第二标记的结合剂结合抗RSV抗体或其抗原结合片段-多肽复合物。
适合用于RSV蛋白或者所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的其他测定方案存在于本领域中。以上描述仅为了示例。例如，本领域技术人员会清楚可以很容易修改上述方案以使用RSV多肽检测结合生物学样品中的这类多肽的抗体。检测这类蛋白特异性抗体可以允许鉴定RSV感染。
为了提高灵敏度，可以测定给定样品内的多种RSV蛋白标记。很明显在单一测定内可以组合不同RSV多肽特异性的抗RSV抗体或其抗原结合片段。而且，可以同时使用多种引物或探针。RSV蛋白标记的选择可以基于常规实验以确定导致最佳灵敏度的组合。此外或可选地，本文所提供的RSV蛋白的测定可以与其他已知的RSV抗原的测定联合。
2.病原感染的体内检测
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用作体内诊断剂。例如，利用诸如磁共振成像、X-射线成像、计算机发射断层成像和其他成像技术的检测方法，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以提供感染组织的图像(例如，肺中的RSV感染)。为了RSV感染组织的成像，例如，抗RSV抗体的抗体部分一般会结合RSV(例如，结合RSV F蛋白表位)，并且显像剂是成像时可检测的物质，例如偶联至所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的顺磁剂、放射性物质或荧光剂。通常，为了用作诊断剂，将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段直接或间接偶联至显像剂。
许多适当的显像剂是本领域已知的，将它们连接至所述抗RSV抗体或抗原结合片段的方法也是如此(参见，例如，美国专利第5,021,236号和第4,472,509号)。示例性连接方法包括使用金属螯合复合物，采用例如连接至所述抗体或其抗原结合片段的有机螯合剂，如DTPA(美国专利第4,472,509号)。还可以在诸如戊二醛或高碘酸盐的偶联剂存在的情况下使所述抗体与酶反应。在这类偶联剂存在的情况下或者通过与异硫氰酸盐反应来制备具有荧光标记的缀合物。
对于体内诊断成像，当选择给定放射性同位素时考虑可用的检测仪器的类型。所选的放射性同位素具有给定类型的仪器可检测的衰变类型。选择用于体内诊断的放射性同位素另一因素是所述放射性同位素的半衰期足够长，从而在靶最大吸收时仍可检测；但是足够短，从而最小化对宿主的有害辐射。通常，用于体内成像的放射性同位素缺少颗粒发射，但是产生大量140-250keV范围中的光子，这可以通过常规γ相机容易地检测。
为了体内诊断，可以直接或者通过使用中间官能团间接使放射性同位素结合本文所提供的抗体或其抗原结合片段。可以用来将作为金属离子存在的放射性同位素结合抗体的示例性中间官能团包括双功能螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)以及相似分子。可以结合所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的金属离子的实例包括但不限于72砷、211砹、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、67铜、152铕、67镓、68镓、3氢、123碘、125碘、131碘、111铟、59铁、32磷、186铼、188铼、97钌、75硒、35硫、99m锝、201铊、90钇以及89锆。
为了体内诊断的目的，在磁共振成像(MRI)或电子自旋共振(ESR)中可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用顺磁同位素标记。一般来说，可以利用可视化诊断成像的任何常规方法。通常，γ和正电子发射放射性同位素用于相机成像和MRI的顺磁同位素。在这类技术中特别有用的元素包括但不限于157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
示例性顺磁离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)以及铒(III)。例如在X-射线成像中可用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)以及铋(III)。
施用的可检测标记的抗RSV抗体或其抗原结合片段的浓度是足够的，从而与背景相比，与RSV的结合是可检测的。而且，可检测标记的抗RSV抗体或其抗原结合片段从循环系统迅速清除是可取的，以便给出最好的靶标比背景信号比。
用于体内诊断的可检测标记的抗RSV抗体或其抗原结合片段的剂量根据诸如年龄、性别以及对象的疾病程度的因素变化。人单克隆抗体的剂量可以变化，例如，约0.01mg/m2-约500mg/m2、0.1mg/m2-约200mg/m2或者约0.1mg/m2-约10mg/m2。此类剂量可以例如根据是否施用多次注射、组织以及本领域技术人员已知的其他因素变化。
3.监测感染
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以在体外和体内用来监测致病性疾病的治疗过程。因此，例如，可以测量感染RSV的细胞数量的增加或减少或者存在于体内或各种体液中的RSV病毒颗粒浓度的变化。使用这类方法，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用来测定旨在改善致病性疾病的特定治疗方案是否有效。
I.预防和治疗用途
可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段以及含有本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的药物组合物给对象施用而用于预防和治疗。例如，可以施用所提供的抗体或其抗原结合片段用于治疗疾病或疾病状况，例如RSV感染。在一些实例中，可以将所提供的抗体或其抗原结合片段给对象施用用于预防用途，例如RSV感染的防止和/或传播，包括但不限于抑制宿主中RSV感染的建立或者抑制对象间的RSV传播。在一些实例中，可以将所提供的抗体或其抗原结合片段给对象施用，用于减少所述对象中的RSV病毒载量。还可以将所述抗体或其抗原结合片段给对象施用，用于防止、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症状，或者减少RSV感染的持续时间。
在一些实例中，相对于抗RSV抗体或抗原结合片段不存在的情况下RSV感染的发病率，施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制RSV感染的发病率至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中，相对于抗RSV抗体或抗原结合片段不存在的情况下RSV感染的一种或多种症状的严重程度，施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段降低RSV感染的一种或多种症状的严重程度至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
1.治疗对象
用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段治疗的对象或候选包括但不限于已暴露于RSV病毒的对象，如人类患者；表现出RSV感染的一种或多种症状的对象，如人类患者；以及有RSV感染风险的对象，如人类患者。示例性RSV病毒感染包括RSV病毒引起的感染，例如但不限于急性RSV疾病、RSV上呼吸道感染(URI)和/或RSV下呼吸道感染(LRI)，包括例如细支气管炎和肺炎。
在一些实例中，用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段治疗的对象为哺乳动物。在一些实例中，用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段治疗的对象为灵长类。在具体实例中，用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段治疗的对象为人。
可以将所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段给对象施用，如人类患者，用于治疗任何RSV介导的疾病。例如，可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段给对象施用以缓解与RSV病毒感染相关的一种或多种症状或疾病状况，包括但不限于哮喘、喘息、反应性气道疾病(RAD)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。这类疾病和疾病状况是公知的，并且很容易被医生或技术人员诊断。
可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于患有RSV病毒感染的对象，如人类患者，用于复发的RSV病毒介导的疾病的维持或抑制治疗。
可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于有RSV病毒感染风险的对象，如人类对象，包括但不限于早产(prematurely born)(早产(pre-term))婴儿(例如，少于38周胎龄出生的人类婴儿，例如29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周或37周胎龄)；婴儿(例如，超过37周胎龄出生的人类婴儿)，患有囊性纤维化、支气管肺发育不良、先天性心脏病、先天性免疫缺陷或获得性免疫缺陷(例如，AIDS患者)、白血病、非霍奇金淋巴瘤的对象，免疫抑制的患者，例如，移植(例如骨髓移植或肾移植)受体，或者老年对象，包括养老院或康复中心中的对象。在一些实例中，可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于对象，例如早产婴儿或婴儿，其暴露于一种或多种环境风险因素，例如但不限于参加日托、有学龄的兄弟姐妹、暴露于环境空气污染物、先天性气道异常和/或严重神经肌肉疾病。在一些实例中，可以将所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于对象，例如婴儿或小于2岁的儿童，其患有慢性肺疾病或先天性心脏病，包括充血性心力衰竭、肺动脉高压和发绀性心脏病。
各种病原体和病原感染的测试是本领域已知的，并且可以用于评价对象是否是本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段治疗的候选。例如，RSV病毒感染的测试是已知的，并且包括例如病毒培养空斑测定、抗原检测测试、聚合酶链式反应(PCR)测试以及各种抗体血清学测试。病毒感染的测试可以在获得自组织或流体样品(例如脊髓液、血液或尿)的样品上进行。其他测试包括但不限于可以显示肺炎征兆的胸透，其他血液测试，例如化学筛选、全血细胞计数或动脉血气(ABG)分析，以及血氧定量法，以测量血液中氧的量。
可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于在一年的特定时间有增加的RSV感染风险的对象。RSV季节通常从十月延伸至五月。可以向在这段时间表现出增加的对病毒感染的敏感性的对象(例如婴儿、老年人或免疫低下患者)施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，用于在RSV季节之前和/或期间预防和/或治疗RSV感染。在一些实例中，在RSV季节期间施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、2次、3次、4次或5次。在一些实例中，在RSV季节前1个月、2个月或3个月之内施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、2次、3次、4次或5次。
2.剂量
以足以在不期望的对治疗患者的副作用不存在的情况下发挥治疗有用效果的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。可以通过在已知的体外和体内系统中测试多肽来凭经验确定抗RSV抗体或其抗原结合片段的治疗有效浓度，例如通过利用本文所提供或本领域已知的测定。
例如，待治疗性施用的抗体或其抗原结合片段的有效量取决于治疗目标、施用途径以及患者的疾病状况。此外，主治医师考虑已知改变药物作用的各种因素，包括疾病的严重程度和类型，患者的健康、体重、性别、饮食，施用时间和途径，其他药物以及其他相关临床因素。因此，临床医学家必须按照需要滴定所述抗体或其抗原结合片段的剂量并修改施用途径以获得最佳疗效。通常，临床医生会施用所述抗体或其抗原结合片段，直至达到实现期望效果的剂量。这种治疗的进展通过常规测定很容易监测。用于监测病毒感染的治疗的示例性测定是本领域已知的，并且包括例如病毒滴度测定。
通常，施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的剂量范围是足够大以产生期望的效果的剂量范围，其中病原体介导的疾病(例如病毒疾病)的症状改善，或者病毒感染的可能性降低。在一些实例中，以有效诱导对象中的免疫应答的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。剂量不是那么大，不会引起有害副作用，例如高粘滞综合征、肺水肿或充血性心力衰竭。通常，剂量会随年龄、疾病状况、性别以及患者中的疾病程度变化，并且可以由本领域技术人员确定。在出现任何有害副作用的情况下，个体医生可以调整剂量。用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状的示例性剂量包括但不限于约或0.01mg/kg至约或300mg/kg，例如，约或0.01mg/kg、约或0.1mg/kg、约或0.5mg/kg、约或1mg/kg、约或5mg/kg、约或10mg/kg、约或15mg/kg、约或20mg/kg、约或25mg/kg、约或30mg/kg、约或35mg/kg、约或40mg/kg、约或45mg/kg、约或50mg/kg、约或100mg/kg、约或150mg/kg、约或200mg/kg、约或250mg/kg或者约或300mg/kg。
在一些实例中，以有效实现期望的血清滴度的剂量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在具体实例中，以在施用第一剂量的所述抗体或其抗原结合片段后或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现至少或约1μg/ml、至少或约2μg/ml、至少或约3μg/ml、至少或约4μg/ml、至少或约5μg/ml、至少或约6μg/ml、至少或约7μg/ml、至少或约8μg/ml、至少或约9μg/ml、至少或约10μg/ml、至少或约15μg/ml、至少或约20μg/ml、至少或约25μg/ml、至少或约30μg/ml、至少或约40μg/ml、至少或约50μg/ml、至少或约60μg/ml、至少或约70μg/ml、至少或约80μg/ml、至少或约90μg/ml、至少或约100μg/ml的血清滴度的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状。
在一些实例中，以有效实现插管样品、痰或来自肺的灌洗液中期望的滴度的剂量将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段通过肺部递送给对象施用。在具体实例中，以在施用第一剂量的所述抗体或其抗原结合片段后或约10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现插管样品或来自肺的灌洗液中10ng/mg(ng抗RSV抗体或其抗原结合片段/mg肺蛋白)或约10ng/mg、15ng/mg或约15ng/mg、20ng/mg或约20ng/mg、25ng/mg或约25ng/mg、30ng/mg或约30ng/mg、40ng/mg或约40ng/mg、50ng/mg或约50ng/mg、60ng/mg或约60ng/mg、70ng/mg或约70ng/mg、80ng/mg或约80ng/mg、90ng/mg或约90ng/mg、100ng/mg或约100ng/mg、110ng/mg或约110ng/mg、120ng/mg或约120ng/mg、130ng/mg或约130ng/mg、140ng/mg或约140ng/mg或者150ng/mg或约150ng/mg的滴度的剂量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状。
为了治疗病毒感染，所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的剂量可以根据疾病的类型和严重程度变化。可以单剂量、多次单独施用或通过连续输液施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段。对于根据疾病状况在几天或更长的时间中重复施用，可以重复治疗直至期望的疾病症状抑制发生或者实现期望的患者疾病状况的改善。重复施用可以包括根据治疗的进展增加或减少的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的量。还考虑其他剂量方案。
在一些实例中，每天或在几天中施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在具体实例中，以在施用第一剂量、第二剂量、第三剂量、第四剂量、第五剂量、第六剂量、第七剂量、第八剂量、第九剂量、第十剂量的所述抗体或其抗原结合片段后或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现至少或约1μg/ml、至少或约2μg/ml、至少或约3μg/ml、至少或约4μg/ml、至少或约5μg/ml、至少或约6μg/ml、至少或约7μg/ml、至少或约8μg/ml、至少或约9μg/ml、至少或约10μg/ml、至少或约15μg/ml、至少或约20μg/ml、至少或约25μg/ml、至少或约30μg/ml、至少或约40μg/ml、至少或约50μg/ml、至少或约60μg/ml、至少或约70μg/ml、至少或约80μg/ml、至少或约90μg/ml、至少或约100μg/ml的血清滴度的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次，用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状。在一具体实例中，以在施用第四剂量的所述抗体或其抗原结合片段后或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现至少或约72μg/ml的血清滴度的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段4次，用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状。
在一些实例中，以两次或更多次施用的顺序施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述施用间隔选定的时间。在一些实例中，选定的时间为至少或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或者3个月。
在一些实例中，正好在RSV季节之前施用预防有效量的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段一次或多次。在一些实例中，正好在RSV季节之前施用预防有效量的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段一次或多次，和/或在RSV季节期间施用预防有效量的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段一次或多次。
还可以例如通过测量施用一个或多个剂量的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段之前和之后对象中的病毒滴度来评价特定剂量或剂量方案的疗效。剂量和/或施用频率可以根据期望的对象中的病毒清除速率来修改。
本领域技术人员会理解，最佳治疗方案会变化，并且在一个或多个治疗周期之前和之后评价治疗的疾病的状态和患者的一般健康以确定最佳最佳治疗剂量和施用频率在治疗方法的范围之内。应当进一步理解，对于任何特定对象，具体剂量方案可以根据对象需要以及管理或监督药物制剂的施用的人的专业判断随时间调整，并且本文所示的剂量仅为示例，并不是为了限制其范围。为了治疗诸如病毒感染(例如RSV病毒感染)的疾病或疾病状况施用的抗RSV抗体或其抗原结合片段的量可以通过标准临床技术(例如病毒滴度或抗原检测测定)来确定。此外，体外测定和动物模型可以用来帮助鉴定最佳剂量范围。这类测定可以提供剂量范围，所述剂量范围可以外推至给对象如人的施用。基于动物模型的鉴定最佳剂量范围的方法是本领域技术人员公知的。
3.施用途径
可以通过本领域已知的施用多肽的任何方法将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段给对象施用，包括例如全身或局部施用。可以通过诸如肠胃外(例如，皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下或腔内)、体表、硬膜外、或粘膜(例如鼻内或口服)的途径施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段。可以在疾病部位将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段给对象外部施用，用于发挥局部或透皮作用。可以通过任何方便的途径施用含有抗RSV抗体或其抗原结合片段的组合物，例如通过输液或团注射、通过上皮粘膜或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收。可以与其他生物活性剂一起施用含有抗RSV抗体或抗原结合片段的组合物。施用模式可以包括体表或者其他在身体区域上、中或周围施用组合物，其可以接触感染、污染诸如RSV病毒的病毒或与诸如RSV病毒的病毒有关的流体、细胞或组织。为了直接递送至靶器官，例如肺，可以通过体表或气雾剂途径(例如，通过肺气雾剂)施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以作为控释制剂例如通过泵(参见，例如，Langer(1990)Science 249:1527-1533;Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20;Buchwald et al.(1980)Surgery 88:507;和Saudek et al.(1989)N.Engl.J.Med.321:574)或者通过使用本领域已知和本文其他地方所述的各种聚合物施用。在一些实例中，可以将控释或缓释系统放置于接近治疗靶标，例如，肺，因此仅需要全身剂量的部分(参见，例如，Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。
在具体实例中，通过肺部递送施用所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段(参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903)。肺部递送的示例性方法是本领域已知的，并且包括但不限于气雾剂法，例如吸入器(例如，压力定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、雾化吸入器(例如，喷射或超声雾化吸入器)以及其他一次呼吸液体系统)、气管内灌输和吹入。在一些实例中，可以通过共施用或施用含有本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段和渗透促进剂的共制剂来促进肺部递送，所述渗透促进剂例如表面活性剂、脂肪酸、糖、螯合剂和酶抑制剂，如蛋白酶抑制剂。
本领域技术人员可以基于抗RSV抗体或其抗原结合片段或者含有所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物的剂量的特性选择递送的适当方法，例如肺部递送。这类特性包括但不限于溶解性、吸湿性、结晶特性、熔点、密度、粘度、流动、稳定性以及降解谱。
在一些实例中，本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段增加针对病毒的有效粘膜免疫。因此，在具体实例中，将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于粘膜表面。例如，可以通过诸如口服(例如，口腔、舌下)、眼部(例如，角膜、结膜、玻璃体内、水内注射)、鼻内、生殖器(例如，阴道)、直肠、肺部、胃或肠的途径递送所述抗RSV抗体或其抗原结合片段。可以全身性施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，例如肠胃外，如通过注射或通过随时间逐步输液，或者通过肠(即，消化道)。还可以体表施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，例如，通过体表安装或施用(例如，利用支气管镜或其他人工气道气管内灌输和吹入)液体溶液、凝胶剂、软膏剂、散剂，或者通过吸入(例如，鼻腔喷雾剂、吸入器(压力定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、雾化吸入器(例如，喷射或超声雾化吸入器)以及其他一次呼吸液体系统))。施用可以在暴露于病毒之前或暴露于病毒之后进行。
4.联合治疗
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以单独或者与一种或多种治疗剂或治疗联合施用，用于预防和/或治疗疾病或疾病状况。例如，所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种抗病毒剂联合施用，用于预防。在另一实例中，所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种抗病毒剂联合使用，用于治疗病毒感染，如呼吸道病毒感染。在一些实例中，所述呼吸道病毒感染为RSV感染。抗病毒剂可以包括减少和/或消除病原感染的物质或者缓解病原感染的一种或多种症状的物质。在一些实例中，还可以联合施用多种抗体或其抗原结合片段(例如，一种或多种抗病毒抗体)，其中所述抗体中的至少一种为本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，可以联合施用多种抗体用于预防，其中所述抗体中的至少一种为本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在其他实例中，可以联合施用多种抗体用于治疗RSV感染或多种病毒感染，其中所述抗体中的至少一种为本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所提供的抗RSV抗体可以与结合并中和诸如RSV的病毒的一种或多种抗病毒抗体联合施用。在一些实例中，所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以与可以抑制或缓解诸如RSV感染的病毒感染的一种或多种症状的一种或多种抗体联合施用。在一些实例中，联合施用两种或更多种本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
一种或多种额外的物质可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段同时、顺序或间歇施用。所述物质可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段共施用，例如，作为相同药物组合物或相同递送方法的部分。在一些实例中，所述物质可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段同时共施用，但是通过不同的递送方式。还可以在与施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段不同的时间施用所述物质，但是在时间上与施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段足够接近以具有联合预防或治疗效果。在一些实例中，在施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段之后或之前施用一种或多种额外的物质，间隔选定的时间。在一些实例中，所述时间为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实例中，多次施用一种或多种额外的物质和/或多次施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
在一些实例中，相对于组合不存在的情况下RSV感染的发病率，施用组合抑制RSV感染的发病率至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中，相对于组合不存在的情况下RSV感染的一种或多种症状的严重程度，施用组合降低RSV感染的一种或多种症状的严重程度至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
在一些实例中，相对于组合不存在的情况下RSV与其宿主细胞受体的结合，组合抑制RSV与其宿主细胞受体的结合至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中，相对于组合不存在的情况下的RSV复制，组合抑制RSV复制至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
已知有用，或者用于或已用于防止、管理、治疗或改善RSV感染或者其一种或多种症状的任何治疗可以与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联用(参见，例如，Gilman et al.,Goodman and Gilman′s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,2001;The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,Berkow,M.D.et al.(eds.),17th Ed.,Merck Sharp & Dohme Research Laboratories,Rahway,N.J.,1999;Cecil Textbook of Medicine,20th Ed.,Bennett and Plum(eds.),W.B.Saunders,Philadelphia,1996,关于已用于或用于防止、治疗、管理或改善RSV感染或者其一种或多种症状的治疗(例如，预防剂或治疗剂)的信息)。这类物质的实例包括但不限于免疫调节剂，抗炎剂(例如，肾上腺类皮质激素、皮质类固醇(例如，倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、曲安西龙、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松)、糖皮质激素、类固醇、非类固醇抗炎药(例如，阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸和COX-2抑制剂))，止痛药，白三烯拮抗药(例如，孟鲁司特、甲基黄嘌呤、扎鲁司特和齐留通)，支气管扩张药，例如β2-激动剂(例如，班布特罗、比托特罗、克仑特罗、非诺特罗、福莫特罗、茚达特罗、异他林、奥西那林、吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、利米特罗、沙丁胺醇(salbutamol)(沙丁胺醇(Albuterol)、万托林)、左沙丁胺醇、沙美特罗、妥洛特罗和特布他林)和抗胆碱能剂(例如，异丙托溴铵和奥封溴铵)，柳氮磺吡啶(sulphasalazine)，青霉胺，氨苯砜，抗组胺药，抗疟剂(例如，羟氯喹)以及抗病毒剂。本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以与治疗RSV感染的一种或多种治疗联合施用，所述治疗包括但不限于静脉内输液的免疫球蛋白的施用，补充氧和液体或辅助呼吸的施用。本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以与调节肺成熟和表面活性蛋白表达的一种或多种物质联合施用，所述物质例如但不限于糖皮质激素、PPARγ配体和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
可以选择与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的示例性抗病毒剂包括但不限于抗病毒化合物、抗病毒蛋白、抗病毒肽、抗病毒蛋白缀合物以及抗病毒肽缀合物，包括但不限于核苷类似物、核苷酸类似物、免疫调节剂(例如干扰素)和免疫刺激剂。使用本文所提供的抗体和/或抗RSV抗体和抗原结合片段的联合治疗预期作为本文所提供的抗体和/或抗RSV抗体和抗原结合片段与其他抗RSV抗体以及抗RSV抗体和抗原结合片段的组合。
可以与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合施用的用于治疗病毒感染的示例性抗病毒剂包括但不限于阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、碘苷、曲氟尿苷、溴夫定、西多福韦、二十二烷醇、福米韦生、膦甲酸、曲金刚胺、咪喹莫德、鬼臼毒素、恩替卡韦、拉米夫定、替比夫定、克来夫定、阿德福韦、替诺福韦、boceprevir、替拉瑞韦、普来可那立、阿比多尔、金刚烷胺、金刚乙胺、奥塞米韦、扎那米韦、培拉米韦、肌苷、干扰素(例如，干扰素α-2b、PEG干扰素α-2a)、利巴韦林/taribavirin、阿巴卡韦、恩曲他滨、拉米夫定、去羟肌苷、齐多夫定、阿立他滨(apricitabine)、stampidine、艾夫西他滨、racivir、氨多索韦、司他夫定、扎西他滨、替诺福韦、依法韦仑、奈韦拉平、依曲韦林、利匹韦林、洛韦胺、地位韦啶、阿扎那韦、呋山那韦、洛匹那韦、达芦那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦、氨普那韦、茚地那韦、恩夫韦肽、马拉韦罗、维立韦罗、PRO 140、ibalizumab、raltegravir、elvitegravir、bevirimat、vivecon，包括它们的互变异构形式、类似物、异构体、多晶型物、溶剂化物、衍生物或盐。
可以与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合施用的用于预防和/或治疗RSV感染的示例性抗病毒剂包括但不限于利巴韦林、NIH-351(Gemini Technologies)、重组RSV疫苗(Aviron)、RSVf-2(Intracel)、F-50042(Pierre Fabre)、T-786(Trimeris)、VP-36676(ViroPharma)、RFI-641(American Home Products)、VP-14637(ViroPharma)、PFP-1和PFP-2(American Home Products)、RSV疫苗(Avant Immunotherapeutics)、F-50077(Pierre Fabre)以及其他抗RSV抗体或他们的抗原结合片段。
本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以与能够刺激诸如细胞粘膜免疫的细胞免疫的一种或多种物质联合施用。可以使用任何能够刺激细胞免疫的物质。示例性免疫刺激剂包括细胞因子，例如但不限于干扰素(例如，IFN-α、β、γ、ω)；淋巴因子和造血生长因子，例如GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素-14(IL-14)和肿瘤坏死因子(TNF)。
对于与抗病原剂联合治疗，施用这类化合物的剂量是本领域已知的，或者可以由本领域技术人员根据已知的临床因素(例如，对象的物种、大小、体表面积、年龄、性别、免疫活性和一般健康，施用的持续时间和途径，疾病的种类和阶段，以及是否同时施用诸如其他抗病原剂的其他治疗)来决定。
a.用于联合治疗的抗病毒抗体
本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以联合一种或多种其他抗体或其抗原结合片段施用。在一些实例中，所述一种或多种其他抗体为抗病毒抗体。在一些实例中，所述一种或多种其他抗体结合病毒抗原。在一些实例中，所述一种或多种其他抗体结合病毒抗原，其为表面蛋白，例如病毒衣壳蛋白或病毒包膜蛋白。在一些实例中，所述一种或多种其他抗体结合病毒抗原，其表达于感染的细胞的表面。在一些实例中，所述一种或多种其他抗体结合病毒抗原，其是细胞内表达的(即在感染的细胞内)。在一些实例中，所述一种或多种其他抗体结合病毒，其导致呼吸道疾病，例如但不限于RSV、副流感病毒(PIV)或人偏肺病毒(hMPV)。本文还提供包含抗体混合物的组合物。
与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如本文提供的抗体的抗-Id抗体)以及它们的任何表位结合片段。与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物(如人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。通常，与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体为人或人源化抗体。与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更高的多特异性的。
与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体可以包括修饰的衍生抗体，例如通过共价连接将任何类型的分子连接至所述抗体或其抗原结合片段。示例性抗体或其抗原结合片段衍生物包括修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连接至细胞配体或其他蛋白或者包含对FcRN受体具有更高亲和力的异源Fc结构域(参见，例如美国专利第7,083,784号)。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化或者衣霉素存在下的合成。此外，衍生物可以包含一个或多个非经典氨基酸。
与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的一种或多种额外的抗体可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段同时、顺序或间歇施用。所述一种或多种额外的抗体可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段共施用，例如作为相同的药物组合物或相同的递送方法的一部分。在一些实例中，所述一种或多种额外的抗体可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段在相同的时间共施用，但是通过不同的递送方式。所述一种或多种额外的抗体可以与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段在不同的时间施用，但是时间上与施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段足够接近以具有联合的预防或治疗效果。在一些实例中，所述一种或多种额外的抗体在施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段之后或之前施用，被选定的时间段分隔。在一些实例中，所述时间段为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实例中，所述一种或多种额外的抗体多次施用和/或本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段多次施用。
i.抗RSV抗体
在一些实例中，所述一种或多种额外的抗病毒抗体为抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，联合一种或多种额外的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段以预防和/或治疗RSV感染。用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段包括免疫特异性地结合并中和RSV的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述一种或多种额外的抗RSV抗体或其抗原结合片段包括免疫特异性地结合RSV A亚型和/或RSV B亚型的抗体或其抗原结合片段。
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗RSV抗体，其结合RSV附着蛋白(例如，具有SEQ ID NO:276所示的氨基酸序列)、RSV RNA聚合酶β亚基大结构蛋白)(L蛋白)(例如，具有SEQ ID NO:276所示的氨基酸序列)、RSV核壳体蛋白(例如，具有SEQ ID NO:277所示的氨基酸序列)、RSV核蛋白(N)(例如，具有SEQ ID NO:278所示的氨基酸序列)、RSV磷蛋白P(例如，具有SEQ ID NO:279所示的氨基酸序列)、RSV基质蛋白(例如，具有SEQ ID NO:280所示的氨基酸序列)、RSV小疏水(SH)蛋白(例如，具有SEQ ID NO:281所示的氨基酸序列)、RSV RNA-依赖性聚合酶、RSV F蛋白(例如，具有SEQ ID NO:282所示的氨基酸序列)、RSV G蛋白(例如，具有SEQ IDNO:283氨基酸序列)，或者它们的任何等位变体。在具体实例中，所述一种或多种额外的抗病毒抗体包括结合RSV F蛋白的抗RSV抗体。在具体实例中，结合RSV F蛋白的一种或多种额外的抗病毒抗体结合RSV F糖蛋白的A、B、C、I、II、IV、V或VI抗原位点(参见，例如Lopez etal.(1998)J.Virol.72:6922-6928)。
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括但不限于帕利珠单抗(SYNAGIS)、莫他珠单抗(NUMAX)、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、(参见美国专利第5,824,307号和第6,818,216号)、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23(参见美国专利第6,685,942号)、RF-1、RF-2(参见美国专利第5,811,524号)，或它们的抗原结合片段。在一些实例中，用于联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下抗体的VH链和/或VL链的氨基酸序列的VH链和/或VL链：帕利珠单抗(SYNAGIS)、莫他珠单抗(NUMAX)、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1或RF-2。在一些实例中，用于联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含以下抗体的一个或多个CDR：帕利珠单抗(Synagis)、莫他珠单抗(Numax)、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1或RF-2。在一些实例中，用于联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含来自例如但不限于以下的抗RSV小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR：MAb1153、1142、1200、1214、1237、1129、1121、1107、1112、1269、1269、1243(Beeler et al.(1989)J.Virology63(7):2841-2950)、MAb151(Mufson et al.(1987)J.Clin.Microbiol.25:1635-1539)、MAb 43-1和13-1(Fernie et al.(1982)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171:266-271)、MAb 1436C、1302A、1308F和1331H(Anderson etal.(1984)J.Clin.Microbiol.19:934-936)。可以用于与本文提供的抗RSV抗体或抗原结合片段联合治疗的额外的示例性抗体或其抗原结合片段包括但不限于例如以下文献描述的抗RSV抗体或其抗原结合片段：美国专利号6,413,771、5,840,298、5,811,524、6,656,467、6,537,809、7,364,742、7,070,786、5,955,364、7,488,477、6,818,216、5,824,307、7,364,737、6,685,942和5,762,905以及美国专利公开号2007-0082002、2005-0175986、2004-0234528、2006-0198840、2009-0110684、2006-0159695、2006-0013824、2005-0288491、2005-0019758、2008-0226630、2009-0137003和2009-0092609。
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VH链：SEQ ID NO:103、113、122、131、137、144、149、155、161、167、172、176、179、182、186、190、194、198、201、205、210、215、222、226、233、239、246、252、257、362和366。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VH结构域：SEQ ID NO:104、114、123、132、138、145、150、156、162、168、173、187、206、227、232、234、240、247、253和258。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:105、115、124、363和367。在具体实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列TSGMSVG(SEQ ID NO:105)、TAGMSVG(SEQID NO:115)、AYAMS(SEQ ID NO:363)或GYTMH(SEQ ID NO:367)的VH CDR1。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VH CDR2：SEQID NO:106、125、133、157、236、259、364和368。在一具体实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:106)或DIWWDDKKHYNPSLKD(SEQID NO:125)、GISGSGDSTDYADSVKG(SEQ ID NO:364)或SITGGSNFINYSDSVKG(SEQ ID NO:368)的VH CDR2。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO:107、116、126、139、188、241、365和369。在一具体实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列SMITNWYFDV(SEQ ID NO:107)、DMIFNFYFDV(SEQ ID NO:126)、HLPDYWNLDYTRFFYYMDV(SEQ ID NO:365)或APIAPPYFDH(SEQID NO:369)的VH CDR3。
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VL链：SEQ ID NO:108、117、127、134、140、146、152、158、164、169、174、177、180、183、189、191、195、199、202、207、211、216、220、223、228、236、242、248、254、260、263、370、374和378。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VL结构域：SEQ ID NO:109、118、128、135、141、147、153、159、165、170、175、178、181、184、192、196、200、203、208、212、217、221、224、229、237、243、249、255、261和264。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VLCDR1：SEQ ID NO:110、119、129、142、154、166、244、250、265、371、375和379。在一具体实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:110)、SASSRVGYMH(SEQ ID NO:154)、RATQSISSNYLA(SEQ ID NO:371)、KASQNINDNLA(SEQ ID NO:375)或RATQSVSNFLN(SEQ ID NO:379)的VL CDR1。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:111、120、136、143、160、171、185、218、225、230、238、245、251、256、262、266、372、376和380。在一具体实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:111)、DTLLLDS(SEQ ID NO:218)、GASNRAT(SEQ ID NO:372)、GASSRAT(SEQ ID NO:376)或DASTSQS(SEQ ID NO:380)的VL CDR2。在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO:112、121、193、373、377和381。在一具体实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列FQGSGYPFT(SEQ ID NO:112)、QQYDISPYT(SEQ ID NO:373)、QQYGGSPYT(SEQ ID NO:377)或QASINTPL(SEQ ID NO:381)的VL CDR3。
在一些实例中，本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以联合富集抗RSV抗体的超免疫血清或免疫球蛋白施用，例如RSV超免疫球蛋白(RSV IVIG;RespiGamMedImmuneInc,Gaithersburg,MD;参见，例如Groothius et al.(1993)New Eng.J.Med 329:1524-1530)。
ii.针对其他呼吸道病毒的抗体
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括针对除了RSV以外的呼吸道病毒的抗体或其抗原结合片段，例如选自抗人偏肺病毒(hMPV)抗体、抗副流感病毒(PIV)抗体、抗禽肺病毒(APV)抗体或者本领域已知的其他抗病毒抗体。
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体为抗PIV抗体，即免疫特异性地结合PIV抗原的抗体，所述PIV抗原例如PIV核衣壳磷蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋白、PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA-依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D蛋白、PIVC蛋白或它们的任何等位变体。在具体实例中，所述PIV抗原为PIV F蛋白。在一些实例中，所述抗PIV抗体为免疫特异性地结合1型人PIV、2型人PIV、3型人PIV和/或4型人PIV的抗原的抗体。
在一些实例中，用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体为抗hMPV抗体，即免疫特异性地结合hMPV抗原的抗体，所述hMPV抗原例如hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水蛋白、hMPV RNA-依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPVG蛋白或它们的任何等位变体。在具体的实例中，所述hMPV抗原为PIV F蛋白。在一些实例中，所述抗hMPV抗体为免疫特异性地结合A型hMPV或B型hMPV的抗原的抗体。在一些实例中，所述抗hMPV抗体为免疫特异性地结合A1和/或A2亚型hMPV和/或B1和/或B2亚型hMPV的抗原的抗体。
联合本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用的抗体可以是本领域已知的任何类型的抗体或抗原结合片段。例如，联合本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用的抗体或其抗原结合片段可以包括但不限于单克隆抗体、人抗体、非人抗体、重组产生的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、胞内抗体和抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗-Id)抗体或者它们的任何抗原结合片段。联合本文提供的抗RSV抗体施用的抗体可以包括任何免疫球蛋白类型(如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何种类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(如IgG2a和IgG2b)的成员。
在一些实例中，相对于缺少所述抗RSV抗体或抗原结合片段的情况下RSV感染的发生率，施用抗病毒抗体或抗原结合片段的组合抑制RSV感染的发生率至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中，相对于缺少抗病毒抗体或抗原结合片段的组合的情况下RSV感染的一种或多种症状的严重性，施用抗病毒抗体或抗原结合片段的组合降低RSV感染的一种或多种症状的严重性至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
在一些实例中，相对于缺少抗病毒抗体或抗原结合片段的组合的情况下RSV对其宿主细胞受体的结合，抗病毒抗体或抗原结合片段的组合抑制RSV对其宿主细胞受体的结合至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中，相对于缺少抗病毒抗体或抗原结合片段的组合的情况下的RSV复制，抗病毒抗体或抗原结合片段的组合抑制RSV复制至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
5.基因治疗
在一些实例中，施用包含编码抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的序列的核酸以通过基因治疗来治疗、预防或缓解与RSV感染有关的一种或多种症状。基因治疗指通过向对象施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。在这个实例中，核酸产生它们所编码的介导预防或治疗效果的抗体或其抗原结合片段。
本领域中可用的任何基因治疗的方法可以用于施用编码抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸。示例性方法如下。
对于基因治疗方法的综述，参见例如Goldspiel et al.(1993)ClinicalPharmacy 12:488-505;Wu and Wu(1991)Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan(1993)Science 260:926-932;Morganand Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62:191-217;and TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel et al.(eds.),Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993)和Kriegler,Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)。
在一些实例中，本文提供的组合物包含编码抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸，其中所述核酸为在合适的宿主中表达抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的表达载体的一部分。具体地，这样的核酸具有可操作地连接至抗体编码区的启动子，例如异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型，以及任选地组织特异性的。在另一具体实施方案中，使用核酸分子，其中抗体编码序列和任何其他期望的序列的侧翼是促进基因组中期望位点处的同源重组的区域，因而提供编码抗体的核酸的染色体内表达(Koller andSmithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935;Zijlstra et al.(1989)Nature342:435-438)。在一些实例中，表达的抗体分子为单链抗体。在一些实例中，核酸序列包含编码抗体的重链和轻链或它们的片段的序列。在一具体实例中，核酸序列包含编码抗RSVFab片段的序列。在一具体实例中，核酸序列包含编码全长抗RSV抗体的序列。在一些实例中，编码的抗RSV抗体为嵌合抗体。
核酸递送至对象可以是直接的，在这种情况下所述对象直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体；或者是间接的，在这种情况下首先用所述核酸体外转化细胞，然后移植入所述对象。这两种方法分别已知为体内或离体基因治疗。
在一些实例中，体内直接施用核酸序列，其中所述核酸序列被表达以产生编码的产物。这可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来实现，例如通过将所述核酸序列构建为合适的核酸表达载体的一部分，并施用所述载体，从而其变为细胞内的，例如通过利用缺陷或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体的感染(参见美国专利第4,980,286号)，或者通过裸DNA的直接注射，或者通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic,Dupont)，或者用脂质或细胞表面受体或转染剂包衣，封装于脂质体、微粒或微胶囊中，或者通过连接至已知进入细胞核的肽而施用，通过连接至进行受体介导的内吞作用的配体(参见，例如Wu and Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可以用于，例如靶向特异性表达所述受体的细胞类型)。在一些实例中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含膜融合的病毒肽以破坏核内体，从而允许所述核酸避免溶酶体降解。在一些实例中，可以通过靶向特异性受体来体内靶向所述核酸以用于细胞特异性摄取和表达(参见，例如PCT公开WO 92/06180；WO 92/22635；WO92/20316；WO93/14188和WO 93/20221)。或者，可以细胞内引入所述核酸并通过同源重组并入宿主细胞DNA以用于表达(Koller and Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935和Zijlstra et al.(1989)Nature 342:435-438)。
在一些实例中，使用病毒载体，其包含编码抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸序列。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见，例如Miller et al.(1993)Meth.Enzymol.217:581-599)。逆转录病毒载体包含病毒基因组的正确包装及整合入宿主细胞DNA所需的组分。将待用于基因治疗的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列克隆入一种或多种促进基因递送入对象的载体。关于逆转录病毒载体的更多细节可见，例如Boesen et al.(1994)Biotherapy 6:291-302。示例逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其他参考文献包括例如Clowes et al.(1994)J.Clin.Invest.93:644-651;Klein etal.(1994)Blood 83:1467-1473；Salmons and Gunzberg(1993)Human Gene Therapy 4:129-141；和Grossman and Wilson(1993)Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114。
腺病毒也是可用于基因治疗的病毒载体。腺病毒对于将基因递送至呼吸上皮细胞是特别有吸引力的媒介物。腺病毒天然感染呼吸上皮细胞，其中它们导致轻度疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶包括肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。Kozarsky and Wilson(1993)Current Opinion in Genetics andDevelopment 3:499-503提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.(1994)HumanGene Therapy 5:3-10证实了腺病毒载体将基因转移至猕猴的呼吸上皮细胞的用途。腺病毒在基因治疗中的用途的其他实例可见，例如Rosenfeld et al.(1991)Science 252:431-434;Rosenfeld et al.(1992)Cell 68:143-155;Mastrangeli et al.(1993)J.Clin.Invest.91:225-234;PCT公开WO94/12649;和Wang et al.(1995)Gene Therapy 2:775-783。在一具体实例中，腺病毒载体用于递送编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸。
腺相关病毒(AAV)也可以用于基因治疗(Walsh et al.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300;和美国专利第5,436,146号)。在一具体实例中，腺相关病毒(AAV)载体用于递送编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸。
基因治疗的另一方法涉及通过下述方法将基因转移至组织培养中的细胞，例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染。通常，转移方法包括可选择标记转移至细胞。然后将该细胞至于选择下以分离吸收并表达转移的基因的细胞。然后将表达所述基因的细胞递送至对象。
在一些实例中，将编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸引入细胞，然后体内施用所得的重组细胞。这样的引入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微室介导的基因转移以及原生质球融合。本领域已知许多用于将外源基因引入细胞的技术(参见，例如Loeffler and Behr(1993)Meth.Enzymol.217:599-618;Cohen et al.(1993)Meth.Enzymol.217:618-644;Cline(1985)Pharmacol.Ther.29:69-92)，并且可以用于施用编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸，条件是接受细胞的必需的发育和生理功能不被破坏。所述技术提供核酸稳定转移至细胞，从而所述核酸可被所述细胞表达，并且通常是可遗传的并可被其后代细胞表达。
可以通过本领域已知的各种方法将所得的重组细胞递送至对象。可以静脉内递送重组血液细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。施用的细胞的量取决于各种因素，包括例如期望的预防和/或治疗效果以及患者状态，并且可以由本领域技术人员确定。
为了基因治疗目的可以引入核酸的细胞包括任何期望的可得细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞、血液细胞(如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞)、各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如获得自骨髓、脐带血、外周血和胎肝。在具体的实例中，用于基因治疗的细胞对于对象是自体的。
在重组细胞用于基因治疗的一些实例中，将编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸序列引入细胞，从而它们可被所述细胞或其后代表达，然后体内施用重组细胞以用于治疗效果。在一具体实例中，使用干细胞或祖细胞。可以使用能够体外分离并维持的任何干细胞和/或祖细胞(参见，例如PCT公开WO94/08598;Stemple andAnderson(1992)Cell 71:973-985;Rheinwald(1980)Meth.Cell Bio.21A:229;和Pittelkow and Scott(1986)Mayo Clinic Proc.61:771)。
在一具体实例中，为了基因治疗目的而引入的核酸包含诱导型启动子，其可操作地连接至编码区，从而所述核酸的表达可以通过控制转录的合适诱导物的存在或不存在而进行控制。
J.药物组合物、组合和制成品/试剂盒
1.药物组合物
本文提供药物组合物，其包含本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。所述药物组合物可以用于治疗、预防和/或诊断应用。本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以与药物可接受的载体或稀释剂配制。通常，这样的药物组合物使用不会明显破坏所述抗体或其抗原结合片段的生物学性质的组分，所述生物学性质例如结合其特异性表位(例如，结合RSV F蛋白上的表位)。每种组分在与其他成分相容并且不伤害患者的意义上是药学和生理学可接受的。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的方法制备，包括但不限于片剂、丸剂、散剂、液体溶液剂或混悬剂(例如，包括可注射、可吸收和体表制剂(例如，滴眼液、凝胶剂或软膏剂)、气雾剂(例如，鼻腔喷雾剂)、脂质体、栓剂、可注射和可灌注的溶液以及缓释形式。参见，例如Gilman,et al.(eds.1990)Goodman and Gilman′s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press;andRemington′s Pharmaceutical Sciences,17th ed.(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.;Avis,et al.(eds.1993)Pharmaceutical Dosage Forms:ParenteralMedications,Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Dekker,NY;and Lieberman,et al.(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Dekker,NY。当全身施用时，治疗组合物是无菌、无热原的，通常不含颗粒物，并且在具有应有的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的溶液中。这些条件是本领域技术人员已知的。制备可肠胃外施用的组合物的方法是本领域技术人员公知的或者显而易见，并且更详细地描述于，例如″Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Formerly Remington′s Pharmaceutical Sciences)″,19th ed.,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.(1995)。
本文提供的药物组合物可以为各种形式，例如，固体、半固体、液体、粉末、水溶液或冷冻干燥形式。本领域已知合适的药物载体的实例，并且包括但不限于水、缓冲剂、盐水溶液、磷酸缓冲盐溶液、各种类型的湿润剂、无菌溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、明胶、甘油、碳水化合物(如乳糖、蔗糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、粉末等。本文提供的药物组合物可以包含其他添加剂，包括例如抗氧化剂、防腐剂、抗微生物剂、镇痛剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、稀释剂、赋形剂、增量剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、张力剂、媒介物、增稠剂、调味剂、乳剂(如油/水乳剂)、乳化和悬浮剂(如阿拉伯胶、琼脂、藻酸、藻酸钠、膨润土、卡波姆、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛基酚聚醚-9(octoxynol9)、油醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、山梨聚糖酯、硬脂醇、黄蓍胶、黄原胶及其衍生物)、溶剂以及各种成分，例如晶体纤维素、微晶纤维素、柠檬酸、糊精、葡萄糖、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等(通常，参见Alfonso R.Gennaro(2000)Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th Edition.Baltimore,MD:Lippincott Williams &Wilkins)。这样的载体和/或添加剂可以通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量给对象施用。稳定剂如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止组合物在体内降解。
适合使用的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效地实现其预期目的的量的一种或多种抗RSV抗体。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力内。治疗有效剂量可以利用本文所述的体外和体内方法确定。因此，当在药物制剂中时，本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以存在于用于施用的单位剂型中。
可以将本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段冷冻干燥以用于保存，并在使用前在合适的载体中重建。这种技术据证实对于常规免疫球蛋白和蛋白制剂是有效的，并且可以使用本领域已知的冷冻干燥和重建技术。
本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以提供为控释或缓释组合物。本领域已知用于可以实现本文提供的抗体或其抗原结合片段的控释或缓释的丸剂和胶囊的聚合材料(参见，例如Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,DrugProduct Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Ranger and Peppas(1983)J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61;还参见Levy etal.(1985)Science 228:190;During et al.(1989)Ann.Neurol.25:351;Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71:105;美国专利号5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463、5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。通常，用于缓释制剂中的聚合物为惰性的、无可滤去的杂质、存储上稳定、无菌并且生物可降解的。本领域已知用于制备缓释制剂的任何技术可以用于制备包含本文提供的一种或多种抗RSV抗体或抗原结合片段的缓释制剂。
在一些实例中，所述药物组合物包含本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段以及一种或多种额外的抗体。在一些实例中，所述一种或多种额外的抗体包括但不限于帕利珠单抗(SYNAGIS于莫他珠单抗(NUMAX)、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R和A4B4-F52S(参见美国专利第5,824,307号和第6,818,216号)、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23(参见，例如美国专利号5,824,307、6,685,942和6,818,216)；人抗RSV抗体，例如但不限于rsv6、rsv11、rsv13、rsv19(即Fab19)、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2(参见，例如美国专利第6,685,942号和第5,811,524号)；源自抗RSV小鼠单克隆抗体的人源化抗体，例如但不限于MAb 1153、1142、1200、1214、1237、1129、1121、1107、1112、1269、1269、1243(Beeler et al.(1989)J.Virology 63(7):2841-2950)、MAb151(Mufson et al.(1987)J.Clin.Microbiol.25:1635-1539)、MAbs43-1和13-1(Fernie et al.(1982)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171:266-271)、MAb 1436C、1302A、1308F和1331H(Anderson et al.(1984)J.Clin.Microbiol.19:934-936)，或它们的抗原结合片段。可以用于包含本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的药物组合物中的其他示例性抗体或其抗原结合片段包括但不限于例如以下文献中描述的抗RSV抗体或其抗原结合片段：美国专利号6,413,771、5,840,298、5,811,524、6,656,467、6,537,809、7,364,742、7,070,786、5,955,364、7,488,477、6,818,216、5,824,307、7,364,737、6,685,942和5,762,905以及美国专利公开号2007-0082002、2005-0175986、2004-0234528、2006-0198840、2009-0110684、2006-0159695、2006-0013824、2005-0288491、2005-0019758、2008-0226630、2009-0137003和2009-0092609。
2.制成品/试剂盒
抗RSV抗体或者编码抗RSV抗体或其衍生物或生物学活性部分的核酸的药物组合物可以包装为制成品，其包含包装材料、有效地预防(即，疫苗接种、被动免疫)和/或治疗RSV介导的疾病或病症的药物组合物以及指示所述抗体或核酸分子用于疫苗接种和/或治疗所述疾病或病症的标签。所述药物组合物可以包装于单位剂型中，其包含用于单剂量或多剂量的量的药物组合物。包装的组合物可以包含药物组合物的冻干粉末，所述药物组合物包含提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，可以在施用前重建(例如，用水或盐水)。
本文提供的制成品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员公知。药物包装材料的实例包括但不限于水泡眼包装、瓶、管、吸入器、吸入器(如定量加压施用吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、雾化吸入器(如喷雾或超声雾化吸入器)和其他单呼吸液体系统)、泵、袋、瓶、容器、注射器、瓶以及适合于所选制剂和预期的施用和治疗模式的任何包装材料。所述药物组合物还可以加入、应用于或涂覆在用于避免感染的屏障或保护性装置。
本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段、编码其抗体的核酸分子、药物组合物或组合还可以提供为试剂盒。试剂盒可以任选地包含一种或多种组分，例如使用说明、装置和其他试剂(例如，用于稀释所述组合物和/或重建冷冻干燥的蛋白的无菌水或盐溶液)和组分，例如用于实施所述方法的管、容器和注射器。示例性试剂盒可以包含本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段，并且可以任选地包含使用说明、用于向对象施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置、用于检测对象中的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置、用于检测获得自对象的样品中的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置、以及用于向对象施用其他治疗剂的装置。
所述试剂盒可以任选地包含说明。说明通常包括真实的表述，其描述所述抗RSV抗体或其抗原结合片段和任选的包含于所述试剂盒中的其他组分，以及施用方法，包括确定对象的适当状态的方法、适当的剂量、剂量方案以及用于施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的适当施用方法。说明还可以包括在治疗持续时间监测所述对象的指导。
试剂盒还可以包含本文所述的药物组合物以及用于诊断的物品。例如，这样的试剂盒可以包含用于测量对象的所选抗RSV抗体或其抗原结合片段的浓度、量或活性的物品。
在一些实例中，在诊断试剂盒中提供所述抗RSV抗体或其抗原结合片段以用于检测分离的生物学样品(例如，获得自对象的流体样品，如血液、痰、灌洗、肺插管样品、唾液、尿或淋巴)中的RSV。在一些实例中，所述诊断试剂盒包含一种或多种抗RSV抗体或其抗原结合片段和/或一种或多种对照抗体(即，非RSV结合抗体)的组(panel)，其中所述组中的一种或多种抗体为本文提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。
本文提供的试剂盒还可以包含用于向对象施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置。本领域已知用于向对象施用药物的各种装置中的任一种可以包含于本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于吸入器(如定量加压施用吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、雾化吸入器(如喷雾或超声雾化吸入器)和其他单呼吸液体系统)、皮下针、静脉内针、导管和液体分配器，如滴眼药器。通常，试剂盒的用于施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置与施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的期望方法是相容的。例如，通过肺施用递送的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含于具有或包含于吸入器或雾化吸入器的试剂盒中。
3.组合
提供本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段与第二物质的组合，例如第二抗RSV抗体或其抗原结合片段或其他诊断或治疗剂。组合可以包括任何抗RSV抗体或其抗原结合片段或者根据本文提供的方法进行其治疗的试剂。例如，组合可以包括任何抗RSV抗体或其抗原结合片段和抗病毒剂。组合还可以包括本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段与一种或多种其他治疗性抗体。如本文所述，提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的组合还可以包含药物组合物，所述药物组合物包含所述抗RSV抗体或其抗原结合片段或者包含编码所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的核酸的宿主细胞。本文提供的组合可以配制为单一组合物或分离的组合物。
K.实施例
以下的实施例仅用于示例目的而不意图限制本发明的范围。
实施例1RSV F蛋白的表达
在该实施例中，表达来自呼吸道合胞病毒株A2的RSV融合蛋白(F蛋白)，并利用抗RSV单克隆抗体克隆2F7(其识别融合糖蛋白的F0和F1亚基)捕获在ELISA板上来进行纯化。在第一实例中，克隆重组RSV F蛋白，并在293F细胞中表达。在第二实例中，通过用RSV A2病毒株感染HEp-2细胞来表达天然RSV F蛋白。
A.重组RSV F蛋白
在该实施例中，克隆编码来自A2RSV病毒株的RSV F蛋白的基因，并表达。根据GeneArt(Burlingame,CA)的标准DNA合成方法，合成仅包含胞外结构域的RSV A2F基因(SEQID NO:21)。改造RSV A2F基因以包含Kozak序列(SEQ ID NO:21的核苷酸7-16)、c-myc序列(SEQ ID NO:21的核苷酸1600-1629)和6X-His标签(SEQ ID NO:21的核苷酸1645-417)。此外，分别在5’和3’端改造NheI(SEQ ID NO:22)和HindIII(SEQ ID NO:23)限制性位点以允许克隆入表达载体。利用标准分子生物学技术消化DNA，并连接入类似地消化的哺乳动物表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)C(SEQ ID NO:24,Invitrogen)。将包含RSV A2 F基因的载体转化入电转感受态(electrocompetent)XL1-Blue细胞(Strategene)。选择单菌落并使其生长，并纯化质粒DNA。通过DNA测序来证实在分离载体中RSV A2 F基因插入的存在，并将含有所述插入的一个克隆用于产生DNA的大规模制备物(Megaprep kit,Qiagen)。
根据生产商的说明书，利用FreeStyleTM293表达系统(Invitrogen)在哺乳动物细胞中表达RSV A2 F蛋白。简言之，将3x107个细胞用30μg的RSV A2 F/pcDNA3.1/myc-His(-)C质粒DNA和5μg的pAdVAntage(Promega)共转染，并在37℃下温育72hr。将细胞通过离心沉淀，并且每3x107个RSV F-转染的-293-F细胞加入3mL冷裂解缓冲液(300mM NaCl、50mMNaH2PO4、1%Triton X-100、CompleteTM Protease Inhibitor cocktail(Cat.No.sc-29131,Santa Cruz),pH8)。将混合物在4℃下摇动30min，然后以14,000rpm在4℃下离心30min。将澄清上清液转移至新管中，并冷冻于-80℃直至使用。在于ELISA板上捕获之前，将上清液解冻，短暂离心，并用1:1 v/v的包含0.8%脱脂奶粉的PBS稀释(终浓度为0.4%脱脂奶粉)。
B.天然RSV F蛋白
在该实施例中，如下从RSV感染的HEp-2细胞纯化来自RSV A2病毒株的天然RSV F蛋白(氨基酸示于SEQ ID NO:382)。简言之，利用完全EMEM(ATCC 30-2003；包含10%FBS、1%L-谷氨酰胺和1%pen-Strep)，将HEp-2细胞接种于10层细胞培养架(Corning 3270)中，并在37℃和5%CO2中温育。一旦细胞达到80%汇合，将HEp-2单层用RSV A2病毒(ATCC VR-1540)以0.01-0.1的感染复数(MOI)感染。将感染的细胞培养3-5天，直至观察到明显的细胞合胞体。将感染的细胞用PBS洗涤一次，并通过向培养架加入500mL PBS和5mM EDTA并在37℃下温育1hr来收获细胞。将细胞收集入50mL锥形管(5x107个细胞/管)，并通过离心沉淀。将细胞沉淀用PBS洗涤2X，并以1200rpm离心5分钟。将细胞沉淀保存在-20℃下，直至进一步加工。将冷冻的细胞解冻，并向每个细胞沉淀加入3mL冷裂解缓冲液(300mM NaCl,50mM NaH2PO4,1%Triton X-100,CompleteTM Protease Inhibitor cocktail(Cat.No.sc-29131,SantaCruz),pH8)。将细胞在4℃下摇动30min，然后超声处理(每次10%功率下3次脉冲10秒)，最后于4℃下以14,000rpm离心30min。将澄清上清液转移至新管中，并冷冻于-80℃下直至使用。在捕获于ELISA板上之前，将上清液解冻，短暂离心并1:2000稀释。
C.用抗RSV mAb捕获
将ELISA板利用50μL/孔的在PBS中1:400稀释的抗RSV mAb(Cat.No.NB110-37246,clone 2F7,Novus Biologicals)涂覆。除去未结合的抗体，并将平板立即用于ELISA(见实施例2和4)。或者，将平板在-20℃下冷冻最多2周。在使用前，立即用1x PBS中的4%脱脂奶粉于37℃下封闭2小时。加入裂解物之前，将平板用包含0.05%Tween-20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤。通过向抗RSV mAb ELISA平板每孔加入50μL任何上文制备的裂解物并在37℃下温育2小时来进行RSV F蛋白(重组或天然)的捕获。
实施例2从EBV-转化的B细胞分离抗RSV Fab抗体
在该实施例中，从刺激的埃巴病毒转化的供体记忆B细胞分离抗RSV抗体，筛选所述细胞与RSV F蛋白的结合，然后进行体外抗体产生。A和B节描述用于产生和克隆EBV转化的B细胞以及筛选结合RSV F蛋白的两种略微不同的方法。差异如下：(1)步骤1中PMBC的来源；(2)步骤2中IgG+B细胞的分离(在A节中去除IgM、IgD和IgA表达细胞，另外在B节中去除CD3阳性细胞)；以及(3)步骤3.a中辐照的去除B-细胞的饲养细胞的制备。
A.EBV-转化的B细胞的产生和克隆以及筛选结合RSV F蛋白(方法A)
外周血单核细胞(PMBC)获得自儿童护理工作人员，其通过接触儿童而暴露于RSV。根据生厂商的说明书，通过在Ficoll Hypaque上的密度离心来分离PBMC。
1.CD22+ B细胞的CD22+分离和活化
利用CD22磁珠(Miltenyi,cat.#130-046-401)和LS柱(Miltenyi,cat.# 130-042-401)从供体PBMC分离3.2x106个CD22+B细胞。在48孔板中，将分离的CD22+ B细胞以1x106个细胞/孔在RPMI(Hyclone,cat.# SH30096.01)中培养，所述RPMI包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(FBS,Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.# SV30010)、1%丙酮酸钠(Hyclone,cat.# SH30239.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.# SH30034.01)。选择多克隆B细胞刺激剂激活分离的B细胞以诱导增殖和抗体产生。
2.IgG+ B细胞的EBV-介导的永生化
于4℃下，将4.5x106个活化的CD22+ B细胞洗涤，并用40μL的缀合FITC的抗IgM(BDBiosciences,cat.# 555782)、40μL的缀合FITC的抗IgD(BD Biosciences,cat.# 555778)和4μL的缀合FITC的抗IgA(Jacksons Immunoresearch,cat.309-096-043)抗体温育15分钟。将细胞在PBS(包含0.5%BSA和2mM EDTA)洗涤1X，并再悬浮于90uL的相同缓冲液中。根据生厂商的说明书，利用10μL抗FITC磁珠(Miltenyi,cat.# 130-048-701)和LS柱(Miltenyi,cat.#130-042-401)，通过负选择表达IgM、IgD、IgA的细胞来富集IgG+ B细胞。
通过用0.5ml EBV上清(RMPI-1640中50%v/v，包含10%FCS,ATCC Cat.No.VR-1492，来自B95-8细胞)将1.87x106个IgG+、CD22+富集的B细胞温育16小时来进行B细胞的大量(bulk)永生化。感染后，将细胞洗涤，并在RPMI(Hyclone,cat.# SH30096.01)中和0.5x106个辐照的饲养细胞/24孔板的孔进一步培养9天(两孔中每个106/mL)，所述RPMI包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.#SV30010)、1%丙酮酸钠(Hyclone,cat.# SH30239.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.#SH30034.01)、200IU/ml rhIL-2(R&D Systems #202-IL-50)。3.B细胞克隆
a.用于克隆B细胞的辐照的去除B-细胞的饲养细胞的制备
将辐照的去除B细胞的饲养细胞用于帮助维持EBV-转化的B细胞的生长。来自3个健康供体的混合物的PBMC通过Ficoll分离获得，用3250拉德辐照(在UCSD Moore’s CancerCenter)，并利用抗CD19磁珠(Miltenyi Biotec,Cat.No.130-050-301)和LD柱(MiltenyiBiotec,cat.# 130-091-509)去除B细胞。简言之，将获得自Ficoll分离的冷冻和辐照的PMBC解冻，洗涤两次并计数。然后将细胞以300g离心10分钟，并吸出上清液。将细胞沉淀以每107个细胞重悬浮于80μl MACS缓冲液(包含0.5%BSA和2mM EDTA的PBS)中，并加入20μlCD19微珠(每107个细胞)。完全混合后，将细胞在4℃下温育15分钟。然后通过加入1-2mL缓冲液(每107个细胞)洗涤细胞，然后以300g离心10分钟，并吸出上清液。然后将至多108个细胞重悬浮于500μl缓冲液中。磁分离通过将LD柱(由磁铁球组成，其覆盖有塑料涂层以允许快速和温和地分离细胞)置于MACS分离器的磁场中来进行。将LD柱用2mL缓冲液洗涤，并将细胞悬浮液应用于柱的顶端。在添加2x1mL缓冲液后，当非B细胞通过柱时进行收集。
b.B细胞克隆
将约20个EBV转化的B细胞与多克隆B细胞刺激剂以及96孔板中每孔50,000个辐照的去除B细胞的饲养细胞共培养，并生长13天。产生总共120个96孔板。
5.通过与RSV F蛋白的结合筛选B细胞上清液
将来自每孔的上清液转移至新的96孔板，将细胞用PBS洗涤1X，并冷冻于-80℃的包含10μL/mL2-巯基乙醇的100μL的RLT缓冲液中(Qiagen,cat.# 79216)。将上清液用于ELISA以确定哪些细胞产生能够结合RSV F蛋白的抗体。简言之，如下进行ELISA：(1)如实施例1所述，利用96孔半面积板制备RSV F蛋白ELISA板，并且进行以下改变：将抗RSV mAb(克隆2F7，小鼠腹水，Cat.No.ab43812,Abcam)用作捕获抗体，并且将RSV F蛋白和所述捕获抗体在4℃下温育过夜。(2)将来自2孔的每一个的10μL B细胞上清液(总共20μL混合)加入96半孔ELISA板，并在37℃下温育2h。将来自血库供体的血浆(Ficoll Hypaque分离后收集并冷冻，1:1000稀释)用作阳性对照。(3)如上文所述将平板洗涤4X，并向每孔加入50μL山羊抗人Fc IgG HRP-缀合的抗体(在包含0.05%Tween20的PBS中1:1000稀释)，并将平板在37℃下温育1小时。(4)如上文所述将平板洗涤6X，并利用50μL的:1v/v TMB：过氧化物溶液(Pierce,Cat No.34021)底物显影，并且使得显影7分钟。通过加入50μL2N H2SO4立即停止反应，并利用ELISA酶标仪测量450nm的吸光度。阳性结合由大于0.5的OD450(0.5-0.9为中等结合，>1为强结合)和比背景高3倍的应答指示。
为了确定两个混合孔中哪个包含抗RSV抗体，将来自每孔的20μL B细胞上清液(用PBS/0.05%Tween 20稀释1:2v/v)分别针对捕获的RSV F蛋白再测试。
筛选总共18个平板(或1080孔)的与RSV F裂解物(如实施例1中纯化)的结合。6个孔鉴定为RSV F裂解物的结合物(binder)。这6个孔中的5个通过额外的ELISA再证实，并用于通过PCR产生抗RSV抗体(下文描述)。
B.EBV-转化的B细胞的产生和克隆以及筛选结合RSV F蛋白(方法B)
外周血单核细胞(PMBC)获得自San Diego血库供体。根据生厂商的说明书，通过在Ficoll Hypaque上的密度离心来分离PBMC。
1.CD22+ B细胞的CD22+分离和活化
如上文A.1节所述，利用CD22磁珠从供体PBMC分离10.5x106个CD22+ B细胞，并且在24孔板中培养和活化分离的CD22+ B细胞。
2.IgG+ B细胞的EBV-介导的永生化
a.IgG+ B细胞的分离
于4℃下，将11.3x106个活化的CD22+ B细胞洗涤，并用110μL的缀合生物素的抗IgM(BD Biosciences,cat.# 555781)、22μL的缀合生物素的抗IgD(BD Biosciences,cat.#555777)和22μL的缀合生物素的抗IgA(Invitrogen,cat.# 62-7440)和220μL的缀合生物素的抗CD3(BD Bioscience,cat.# 555331)抗体温育15分钟。将细胞在PBS(包含0.5%BSA和2mM EDTA)洗涤1X，并再悬浮于1.045mL的相同缓冲液中。根据生厂商的说明书，利用55μL抗生物素磁珠(Miltenyi,cat.# 130-090-485)和LD柱(Miltenyi,cat.# 130-042-901)，通过负选择表达IgM、IgD、IgA和CD3的细胞来富集IgG+ B细胞。
b.用于培养EBV转化的细胞的辐照的饲养细胞的制备
将辐照的饲养细胞用于帮助维持EBV-转化的B细胞的生长。获得来自2-3个健康供体的PBMC并通过Ficoll分离来分离，用3300拉德辐照(在UCSD Moore’s Cancer Center)并以5x106个细胞/瓶冷冻于包含10%二甲基亚砜(Sigma cat.# D2650-100)的FBS中。使用之前，将一瓶细胞用RPMI(Hyclone,cat.# SH30096.01)洗涤3x，所述RPMI包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.# SV30010)、1%丙酮酸钠(Hyclone,cat.# SH30239.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.# SH30034.01)。将细胞计数，以1x106个细胞/ml重悬，并且以0.25x106个细胞/48孔板的孔平板接种。
c.EBV介导的永生化
通过用0.5ml EBV上清(RMPI-1640中50%v/v，包含10%FCS,ATCC Cat.No.VR-1492，来自B95-8细胞)将0.58x106个IgG+、CD22+富集的B细胞温育16小时来进行B细胞的大量永生化。感染后，将细胞洗涤并在RPMI(Hyclone,cat.# SH30096.01)中和0.5x106个辐照的饲养细胞/48孔板的孔培养(一孔中0.58x106/0.5mL)，所述RPMI包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.# SV30010)、1%丙酮酸钠(Hyclone,cat.# SH30239.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.# SH30034.01)。48小时后，加入200IU/ml的rhIL-2(R&D Systems,cat.#202-IL-50)，并且将细胞进一步培养7天。
3.B细胞克隆
a.用于克隆B细胞的辐照的去除B-细胞的饲养细胞的制备
制备辐照的去除B-细胞的饲养细胞用于B细胞的克隆。获得来自5-6个健康供体的暗黄覆盖层，并且在环境温度下储存过夜。通过Ficoll分离来分离PBMC，并且利用抗CD19磁珠(Miltenyi Biotec,Cat.No.130-050-301)和LD柱(Miltenyi Biotec,cat.# 130-042-901)去除B细胞。
简言之，将获得自Ficoll分离的冷冻的PMBC解冻，洗涤两次并计数。然后将细胞以300g离心10分钟，并吸出上清液。将细胞沉淀以每107个细胞重悬浮于80μl MACS缓冲液(包含0.5%BSA和2mM EDTA的PBS)中，并加入20μl CD19微珠(每107个细胞)。完全混合后，将细胞在4℃下温育15分钟。然后通过加入1-2mL缓冲液(每107个细胞)洗涤细胞，然后以300g离心10分钟，并吸出上清液。然后将至多108个细胞重悬浮于500μl缓冲液中。磁分离通过将LD柱(由磁铁球组成，其覆盖有塑料涂层以允许快速和温和地分离细胞)置于MACS分离器的磁场中来进行。将LD柱用2mL缓冲液洗涤，并将细胞悬浮液应用于柱的顶端。在添加2x1mL缓冲液后，当非B细胞通过柱时进行收集。将细胞以300g离心10分钟并以5x106个细胞/mL重悬于包含2%低IgG胎牛血清的PBS中。将细胞用4000拉德辐照(在UCSD Moore’s CancerCenter)，以300g离心6分钟，重悬于90%低IgG FBS和10%二甲基亚砜(DMSO,25x106个细胞/mL)中，并且冷冻储存于液氮中。
使用之前，将细胞解冻并用Iscove’s Modified Dulbeccos Medium(IMDM,Hyclone #SH30228.01)洗涤3次，所述Iscove’s Modified Dulbeccos Medium包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.#SV30010)、1%非必需氨基酸(Hyclone,cat.# SH30238.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.#SH30034.01)。
b.B细胞克隆
将约100个EBV转化的B细胞与多克隆B细胞刺激剂以及96孔板中每孔50,000个辐照的去除B细胞的饲养细胞在IMDM(Hyclone,cat.# SH30228.01)中共培养并生长13天，所述IMDM包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.# SV30010)、1%非必需氨基酸(Hyclone,cat.#SH30238.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.# SH30034.01)。产生总共120个96孔板。
4.通过与RSV F蛋白的结合筛选B细胞上清液
通过ELISA筛选来自每个孔的上清液以确定哪些孔产生能够结合RSV F蛋白的抗体。如上文A.5节所述在用RSV F蛋白包被的96-孔半面积ELISA板中进行ELISA(如实施例1所述)。如上文所述，为了确定两个混合孔中哪个包含抗RSV抗体，将来自每个孔的20μL B细胞上清液(用PBS/0.05%Tween 20稀释1:2v/v)分别针对捕获的RSV F蛋白再测试。
筛选总共120个平板(或7200孔)的与RSV F裂解物(如实施例1中纯化)的结合。29个孔鉴定为RSV F裂解物的结合物。这29个孔中的10个通过额外的ELISA再证实，并用于通过PCR产生抗RSV抗体(下文描述)。
C.通过PCR产生抗RSV抗体
初始筛选EBV-转化的B细胞产生结合RSV F蛋白的抗体后，通过PCR从B细胞RNA扩增编码单个抗体的基因。将A节中鉴定为命中的5个孔选为用于克隆。将B节中鉴定为命中的10个孔选为用于克隆。
1.RNA提取
根据生产商的说明书，利用RNeasy Micro Kit(Qiagen,Cat.No.1402-2408)，从B细胞提取RNA(每个孔对应于RSV F蛋白的阳性结合物)，并且进行以下改变：1)将B细胞冷冻于包含β-巯基乙醇(10μL/mL缓冲液)的100μL RLT缓冲液中；2)细胞未匀浆；3)将RNA用70%乙醇(无RNase水中)沉淀；以及4)DNase处理根据生产商的补充说明书“柱中(in-column)”进行。RNA洗脱为最终体积26μL。
2.第一链cDNA合成
RNA提取后，根据Superscript III(Invitrogen;Cat No.19090-051)第一链合成方法产生cDNA。简言之，将8μl RNA(如上文所述分离)、1μl oligo dT引物和1μl dNTP在0.2mL无菌管中合并，在65℃下温育5分钟，然后在冰上温育1分钟。随后，将2μl 0.1mM DTT、4μl 25mM MgCl2、2μl RT缓冲液、1μl RNaseOut和1μl SuperScript III RT加入该管中，并将反应混合物在50℃下温育50分钟，然后在85℃下温育15分钟。cDNA立即使用或冷冻于-80℃下长期保存。
3.通过PCR扩增分离IgG重链以及κ和λ轻链基因
通过PCR扩增，从B细胞第一链cDNA合成反应产生IgG重链以及κ和λ轻链(见上文)。κ轻链基因通过一步PCR扩增，而重链基因和λ轻链基因则利用两步、巢式PCR方法扩增。然后，利用“重叠PCR”将扩增的重链和轻链基因连接至单盒。
步骤I.扩增IgG重链基因和λ轻链基因
在步骤I、重链A中，将2μL通过第一链合成(见上文)产生的cDNA用作模板来通过PCR单独扩增IgG重链。在这一步骤中，使用步骤I引物池(见下文表3A)。反应条件如下：
PCR步骤I：重链A：
或者，在步骤I、重链B中，将2.5μL通过第一链合成(见上文)产生的cDNA用作模板来通过PCR单独扩增IgG重链。在这一步骤中，将步骤I引物的相同池用作正向引物，并将VHγ-1(a/b)反向用作反向引物(见下文表3A)。反应条件如下：
PCR步骤I：重链B：
在步骤I、λ轻链中，将2.5μL通过第一链合成(见上文)产生的cDNA用作模板以通过PCR单独扩增IgG重链。在这一步骤中，将步骤I引物池用作正向引物，并将pCALCL(T)-R用作反向引物(见下文表3B)。反应条件如下：
PCR步骤I：λ轻链：
对于PCR反应，使用降落(touchdown)方法以增加反应扩增的特异性。在每个降落步骤中，退火温度每个循环降低1℃。PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)10个循环：
94℃，15秒；62℃，20秒(降落)；68℃，1分钟
3)25个循环：
94℃，15秒；52℃，20秒；68℃，1分钟
4)68℃，3分钟
5)4℃，保持
将所得的反应混合物用作步骤II(见下文)的模板DNA，而无需任何进一步纯化。
步骤II.扩增重链和轻链基因
在步骤II中，将来自步骤I的重链和λ轻链反应混合物用作第二轮PCR反应的模板，该反应使用扩增每条链的框架1区至恒定区(重链的CH1，轻链的CL)末尾的正向和反向引物的混合物。
重链正向引物(见表4)设计为引入SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。反应条件如下：
PCR II：重链
λ轻链正向引物(见表6)设计为引入SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。
反应条件如下：
PCR II：λ轻链
步骤II反应的PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)30个循环：
94℃，15秒；52℃，20秒；68℃，1分钟
3)68℃，3分钟
4)4℃，保持
对于κ轻链基因的扩增，将2μL通过第一链合成(见上文)产生的cDNA用作模板以通过PCR单独扩增IgGκ轻链。将轻链κ正向引物(见表5)用作引物池，并设计为引入SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。
反应条件如下：
PCR II：κ轻链
步骤II反应的PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)35个循环：
94℃，15秒；54℃，20秒；68℃，1分钟
3)68℃，3分钟
4)4℃，保持
扩增后，将PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上分离，并且通过凝胶抽提(Qiagen GelExtraction Kit;Cat.No.28706)纯化对应于重链(675bp)和轻链(650bp)的条带。将PCR产物洗脱为30μl。
步骤III.重叠PCR
在步骤III中，将步骤II中产生的重链和轻链DNA片段1)在重叠反应中用Fab接头连接(见下文表7)，所述接头退火至轻链的3’端和重链的5’端；以及2)用Sfi正向和反向引物(见下文表7)扩增，从而允许扩增包含轻链-接头-重链的1200碱基对(bp)的抗体片段。
利用FabLinker-Rev或FabLinker-Rev-IT*引物(见下文表7)从2g12/pCAL载体(SEQ ID NO:81)扩增Fabκ接头。形成Fabκ接头的PCR反应条件如下：
Fabκ接头
Fabλ接头扩增自28d11/pCAL载体(SEQ ID NO:1636)。形成Fabκ接头的PCR反应条件如下：
Fabλ接头
形成Fab接头的PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)30个循环：
94℃，15秒；54℃，20秒；68℃，1分钟
3)68℃，3分钟
4)4℃，保持
PCR反应在1%琼脂糖凝胶上进行，并根据Qiagen Gel Extraction方法凝胶抽提120bp接头。将2μl纯化的接头用于每个重叠反应。
重叠反应的PCR条件如下(最初15个循环后，向PCR反应中加入SfiF/R引物)：
PCR III：重叠
PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)15个循环：
94℃，15秒；68℃，1分钟；
加入Sfi F/R引物(1μL)，然后：
3)94℃，2分钟
4)30个循环：
94℃，15秒；60℃，20秒；68℃，2分钟
5)68℃，3分钟
6)4℃，保持
扩增后，将总共50μl PCR重叠反应产物轻链-接头-重链中的10μl在1%琼脂糖凝胶上分离以测定大小，并且将剩余的40μl PCR产物通过Qiagen PCR Purification Kit(Qiagen;Cat.No.28106)纯化为30μl总体积。简言之，将5倍PCR反应体积的PBI缓冲液加入PCR产物。混合物结合QIA Spin柱，并用PE缓冲液洗涤两次。将样品洗脱为30μl，并高速离心1.5分钟以洗脱全部30μl。约1μg的重叠产物为每50μl重叠反应的典型收率。
步骤IV.用Sfi消化并克隆入pCAL表达载体或pCAL IT*表达载体
重叠PCR反应和纯化PCR产物后，将反应产物用SfiI消化。向30μl洗脱物(见上文)加入以下物质用于消化：
将反应在37℃下温育1小时。消化后，将消化的重叠产物在1%琼脂糖凝胶上分离，并通过凝胶抽提(Qiagen Gel Extraction Purification Kit Cat.No.28706)纯化对应于抗体(～1.45kB)的条带。简言之，将凝胶片用500μl缓冲液QC(Qiagen)消化。向消化物加入150μl异丙醇，并将样品应用于QiaSpin柱。将柱用缓冲液PE(Qiagen)洗涤两次，并将样品洗脱于30μl的EB缓冲液(Qiagen)。从约1μg的PCR重叠产物回收约15ng/μl消化的样品。
最后，将消化的重叠产物连接至pCAL(SEQ ID NO:86)或pCAL IT*(SEQ ID NO:394)细菌表达载体。连接反应条件如下：
将样品在室温下连接1小时。进行转化前，将1μl连接物用4μl的H2O稀释。
步骤V.转化入大肠杆菌
连接后，将连接产物转化入DH5αMax Efficiency细胞(Invitrogen;CatNo.18258;基因型：Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-,mk+)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1)。简言之，将1μl连接产物(1/5稀释)加入50μlDH5α，并在冰上温育30分钟。转化通过在42℃下热休克45秒，然后在冰上2分钟来进行。加入0.9mL SOC培养基，并使细胞在37℃下恢复1小时，同时摇动。将细胞平板接种于补充了羧苄青霉素(100μg/mL)和20mM葡萄糖的LB平板上。将平板在37℃下温育过夜。
步骤VI.单菌落的选择
对于每种抗体扩增，选择总共88个单菌落，并在96孔板中的补充了羧苄青霉素(100μg/mL)的1mL超级肉汤(SB)中于37℃下生长2小时。通过将500μl的每种培养物转移至包含补充了40mM葡萄糖(最终20mM)和100ug/ml的羧苄青霉素的500μl SB的另一96孔形式的细菌平板来产生子平板。向原始或母平板提供补充了100ug/ml羧苄青霉素的500μl SB。使原始平板在30℃下生长过夜，并使子平板(包含葡萄糖)在37℃下生长过夜。将来自30℃平板的细胞裂解物用于细菌ELISA(见下文实施例4)，并将37℃平板用于mini-prep DNA制备(Qiagen)。
总结
利用κ轻链引物扩增上文A节中鉴定为命中的5个孔，并克隆入pCAL表达载体。用κ轻链引物扩增上文B节中鉴定为命中的10个孔，并克隆入pCAL IT*表达载体。另外用λ轻链引物扩增一个孔，并克隆入pCAL IT*表达载体。
实施例3通过单细胞分选分离抗RSV Fab抗体
在该实施例中，从CD19/CD27/IgG阳性细胞分离抗RSV抗体。CD19/CD27/IgG阳性细胞通过1)B细胞分离；和2)FACS单细胞分选获得。然后将分选的细胞用于分离充当体外制备Fab抗体的模板的RNA。
B细胞分离
B细胞利用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Cat.No.130-091-151)分离自PBMC(收获自匿名血库供体)。所述试剂盒用于通过磁性标记和去除表达CD2、CD14、CD16、CD36、CD43和CD235a的细胞(活化的B细胞、浆细胞和CD5+B-1a细胞)以及非B细胞(如T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞、粒细胞和类红细胞)来分离高纯的B细胞。根据生产商的方法，通过利用作为一级标记试剂的生物素缀合的单克隆抗体(生物素-抗体混合物)和缀合至微珠的抗生物素单克隆抗体作为二级标记试剂(抗生物素微球)的混合物来间接磁性标记非B细胞。然后通过磁性分离从纯的静息B细胞除去非B细胞。
简言之，将获得自Ficoll分离的冷冻的PMBC解冻，洗涤两次并计数。然后将细胞以300g离心10分钟，并吸出上清液。将细胞沉淀重悬于40μlMACS缓冲液(每107个细胞)，并加入10μl生物素-抗体混合物(每107个细胞)。完全混合后，将细胞在4℃下温育10分钟。温育时间段后，加入30μl缓冲液(每107个细胞)和20μl抗生物素微珠(每107个细胞)。完全混合后，将细胞在4℃下温育15分钟。然后通过加入1-2mL缓冲液(每107个细胞)洗涤细胞，然后以300g离心10分钟，并吸出上清液。然后将至多108个细胞重悬浮于500μl缓冲液中。
磁分离通过将LS柱(由磁铁球组成，其覆盖有塑料涂层以允许快速和温和地分离细胞)置于MACS分离器的磁场中来进行。将LS柱用3mL缓冲液洗涤，并将细胞悬浮液应用于柱的顶端。在添加3x3mL缓冲液后，当未标记的B细胞通过柱时进行收集。
单细胞分选
在该实施例中，利用FACSAria流式细胞仪(BD Biosciences)通过抗原特异性来分选分离的B细胞。所选的细胞为CD19/CD27/IgG阳性。按照生产商的说明书(MolecularProbes,A-20186)，用Alexa Fluor647标记RSV-F抗原。
简言之，将分离的B细胞等分为16个分离的管。14个管接受1x105个细胞并用于确定FACSAria的光电倍增器设定和分选参数。将剩余的1.8x106个细胞用Alexa Fluor 647/RSV-F标记，终浓度为20nM。加入抗体前15分钟，向样品加入标记的蛋白。CD19和CD27抗体以1:20的稀释使用，而IgG抗体以1:50的稀释使用。加入Alexa Fluor 647/RSV-F蛋白和抗体后，将管在冰上温育30分钟，随后洗涤两次。单细胞分选利用FACSAria流式细胞仪(BDBiosciences)进行。标记包括PE-Cy5(抗人CD19)、PE-Cy7(抗人CD27)、PE(山羊抗人IgGFcg)、Pacific Blue(小鼠抗人CD3)、FITC(小鼠抗人IgD、小鼠抗人IgM、小鼠抗人IgA和小鼠抗人CD14)、碘化丙啶和Alexa Fluor 647(标记的RSV-F蛋白)。
细胞分选通过首先排除死细胞然后排除CD3阳性细胞来进行。进一步鉴定CD19和CD27阳性细胞，并且在这一群体中，对IgG Fcγ表达进行细胞的设门。从剩余的细胞排除表达IgD、IgM和IgA的细胞。最后，对RSV-F结合进行CD19/CD27/IgG Fcγ阳性细胞分选，并将每种阳性B细胞沉积入96孔板的单独孔中，其包含2μl cDNA反应缓冲液(Superscript III10X缓冲液，Invitrogen;Cat No.19090-051)、0.5μl RNaseOUT和7.5μl无菌水。将平板保存于-80℃直至进一步使用。
第一链cDNA合成
分选后，根据Invitrogen第一链合成方法，在每个孔中单独地产生cDNA。简言之，向每孔加入0.5μl10%NP-40、1μl oligo dT引物和1μldNTP，并将平板在65℃下温育5分钟，然后在冰上温育1分钟。随后加入2μl DTT、4μl MgCl2和1μl SuperScript III RT，并将反应混合物在50℃下温育1小时，然后在85℃下温育5分钟。立即使用cDNA或冷冻于-80℃下长期保存。
IgG重链和κ轻链扩增
然后，通过4个顺序步骤的PCR来产生IgG重链和κ轻链。
步骤1.扩增
在步骤I中，将2.5μL通过第一链合成(见上文)产生的cDNA用作模板来通过PCR单独地扩增κ轻链和IgG重链。在这一步骤中，使用步骤I引物池(见下文表8和9)。反应条件如下：
PCR步骤I：
PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2:00
2)10个循环：
94℃，0:15；62℃，0:20(降落)；68℃ for1:00
3)40个循环：
94℃，0:15；52℃0:20；68℃，1:00
4)68℃，3:00
5)4℃，保持
将反应混合物用作步骤II(见下文)的模板DNA，无需任何进一步纯化。
步骤II.扩增
在步骤II中，将来自步骤I的反应混合物用作第二PCR反应的模板，并分别对于轻链或重链使用正向和反向引物的混合物。这些反应从每条链的框架1区扩增DNA。轻链正向引物(见表10)设计为引入SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。反应条件如下：
PCR II：轻链
重链正向引物(见表11)设计为引入SalI限制性位点(SEQ ID NO:96)。反应条件如下：
PCR II：重链
PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)50个循环：
94℃，15秒；54℃，20秒；68℃，1分钟
3)68℃，3分钟
4)4℃，保持
扩增后，将PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上分离，并通过凝胶抽提(Qiagen)纯化对应于重链(400bp)和轻链(650bp)的条带。
步骤III.重叠PCR
在步骤III中，将步骤II中产生的重链和轻链DNA片段1)在重叠反应中用Fab接头连接(见下文表12)，所述接头退火至轻链的3’端和重链的5’端；以及2)用Sfi正向引物(其退火至轻链的5’端，见下文表12)和JH反向引物(其退火至重链的3’端，见下文表11)扩增，从而允许扩增包含轻链-接头-重链的1200碱基对(bp)的抗体片段。反应条件如下(接头如上文实施例2所述产生)：
PCR循环变温器条件如下：
用接头重叠
1)94℃，2分钟
2)15个循环：
94℃，15秒；68℃，1分钟
加入引物
3)94℃，2分钟
4)30个循环：
94℃，5秒；60℃，20秒；68℃，1分钟
5)68℃，3分钟
6)4℃，保持
扩增后，将PCR反应产物轻链-接头-重链在1%琼脂糖凝胶上分离，并通过凝胶抽提(Qiagen)纯化。
步骤IV.引入CH1区
重叠后，将扩增的轻链-接头-重链用Sal I消化，并连接至Sal1消化的重链恒定区1(CHγ1区)，从而在重链恒定区的3’端引入SfiI限制性位点。连接反应条件如下：
2μl的连接反应缓冲液
2μl的CH1
5μl的来自步骤III的1.2kB凝胶纯化产物
10μl的水
1μl T4连接酶
将连接反应混合物在室温下温育30分钟。
连接后，将全长Fab通过PCR用SfiI正向和反向引物扩增(见下文表12)，从而获得1.45kb片段。反应条件如下：
PCR循环变温器条件如下：
1)94℃，2分钟
2)30个循环：
94℃，15秒；60℃，20秒；68℃，1分钟
3)68℃，3分钟
4)4℃，保持
反应产物为连接在单个盒中的轻链和重链的1.45kB片段。
步骤V.用Sfi消化并克隆入pCAL表达载体
重叠PCR反应和纯化PCR产物后，将反应产物用SfiI消化。向30μl洗脱物(见上文)加入以下物质用于消化：
将反应在37℃下温育1小时。消化后，将消化的重叠产物在1%琼脂糖凝胶上分离，并通过凝胶抽提(Qiagen Gel Extraction Purification Kit Cat.No.28706)纯化对应于抗体(～1.45kB)的条带。简言之，将凝胶片用500μl缓冲液QC(Qiagen)消化。向消化物加入150μl异丙醇，并将样品应用于QiaSpin柱。将柱用缓冲液PE(Qiagen)洗涤两次，并将样品洗脱于30μl的EB缓冲液(Qiagen)。从约1μg的PCR重叠产物回收约15ng/μl消化的样品。
最后，将消化的重叠产物连接至pCAL细菌表达载体(SEQ ID NO:86)。连接反应条件如下：
将样品在室温下连接1小时。进行转化前，将1μl连接物用4μl的H2O稀释。
步骤VI.转化入大肠杆菌
连接后，将连接产物转化入DH5α Max Efficiency细胞(Invitrogen;CatNo.18258;基因型：Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1hsdR17(rk-,mk+)phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1)。简言之，将1μl连接产物(1/5稀释)加入50μlDH5α，并在冰上温育30分钟。转化通过在42℃下热休克45秒，然后在冰上2分钟来进行。加入0.9mL SOC培养基，并使细胞在37℃下恢复1小时，同时摇动。将细胞平板接种于补充了羧苄青霉素(100μg/mL)和20mM葡萄糖的LB平板上。将平板在37℃下温育过夜。
步骤VII.单菌落的选择
选择总共88个单菌落，并在96孔板中的补充了羧苄青霉素(100μg/mL)的1mL超级肉汤(SB)中于37℃下生长2小时。通过将500μl的每种培养物转移至包含补充了40mM葡萄糖(最终20mM)和100μg/ml的羧苄青霉素的500μl SB的另一96孔形式的细菌平板来产生子平板。向原始或母平板提供补充了100ug/ml羧苄青霉素的500μl SB。使原始平板在30℃下生长过夜，并使子平板(包含葡萄糖)在37℃下生长过夜。将来自30℃平板的细胞裂解物用于细菌ELISA(见下文实施例4)，并将37℃平板用于mini-prep DNA制备(Qiagen)。
实施例4 结合RSV F蛋白的抗体
在该实施例中，通过ELISA测试实施例2和3中产生的Fab抗体结合纯化的RSV F1裂解物的能力。简言之，将50μL用PBS/3% BSA/0.01%Tween20从1体积稀释至总共3体积的细菌细胞裂解物加入预先涂覆RSV F1裂解物(见上文实施例1)的96孔ELISA板。将平板在37℃下温育2小时，或者在4℃下温育过夜，然后用洗涤缓冲液(PBS/0.05% Tween20)洗涤。加入50μL在PBS/3% BSA/0.01% Tween20中1:1000稀释的山羊抗人IgG F(ab)-HRP抗体(JacksonLabs Cat.No.109-036-097)，并将平板在37℃下温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤6x后，加入50μL 1:1v/v TMB：过氧化物溶液(Pierce,Cat No.34021)，并且允许显影7分钟。通过加入50μL 2N H2SO4立即停止反应，并利用ELISA酶标仪测量450nm的吸光度。阳性结合由大于0.5的OD450(0.5-0.9为中等结合，>1为强结合)和比背景高3倍的应答指示。
除了结合RSV F1裂解物，还使用几种阳性和阴性对照抗原。将来自血库供体(Ficoll Hypaque分离后收集并冷冻，1:1000稀释)的混合物用作RSVF1裂解物结合的阳性对照。作为确定每种细菌细胞裂解物包含完整Fab的阳性对照，将Affinipure山羊抗人F(ab)2抗体(1μg/ml Jackson Immunoresearch Cat.No.109-006-097)用于涂覆96孔ELISA板以捕获完整的Fab。这种抗体仅结合IgG抗体的F(ab)部分。然后，利用抗HA过氧化物酶(Roche,Cat.# 12013819001；细菌表达的Fab具有HA标签)检测Fab表达。将肌动蛋白(1μg/ml,Sigma Cat.No.A3653)用作Fab结合任何蛋白的阴性对照，并且作为ELISA反应的阳性对照使用小鼠抗肌动蛋白抗体(1.25μg/ml,Sigma Cat.No.A3853)和山羊抗小鼠IgG F(ab)-HRP抗体(Santa Cruz Biotech Cat.No.SC3697)。还包括小鼠抗RSV mAb(克隆2F7，小鼠腹水，Cat.No.ab43812,Abcam)作为结合RSV F蛋白的特异性的阴性对照，因为使用这种抗体来使RSV F蛋白结合至ELISA板，并因此在人抗RSV抗体的筛选期间存在于ELISA板上。
A.细胞裂解物对EBV转化的B细胞产生的Fab的结合(见实施例2，A和C节，κ轻链，克隆入pCAL载体)
通过ELISA测试上文的实施例2中产生的88种细胞裂解物1)结合抗Fab抗体的能力；和2)结合RSV F1裂解物的能力。ELISA证实，88种细胞裂解物中的76种对Fab产生为阳性，而88种细胞裂解物中的59种结合RSV F裂解物。证实ELISA表明，76种细胞裂解物中的72种的确产生Fab，并且初始59种阳性命中中的46种再证实为RSV F裂解物的结合物。
通过相应DNA制备物(prep)的DNA测序鉴定三种阳性结合物。测序表明，它们均具有相同的序列，鉴定为Fab 58c5，其具有以下轻链和重链：
Fab 58c5
轻链
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)
重链
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO:1)
B.细胞裂解物对从单细胞分选产生的Fab的结合(见实施例3)
结果表明，实施例3中产生的88种细胞裂解物中的64种结合RSV F1蛋白。通过相应DNA制备物的DNA测序鉴定24种阳性结合物。
阳性结合物中的一种鉴定为Fab sc5，其具有以下轻链和重链：
Fab sc5
轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIKNYLNWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCQQSYNNQLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:13)
重链
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCTVSGDSISGSNWWNWVRQPPGKGLEWIGEIYYRGTTNYKSSLKGRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGGRSTFGPDYYYYMDVWGRGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO:9)
C.细胞裂解物对EBV转化的B细胞产生的Fab的结合(见实施例2，B和C节，κ或λ轻链，克隆入pCAL IT*载体)
对于以下实验，如上文所述进行ELISA测定，并且进行以下改变：在包含3%BSA和0.01%Tween20的PBS中1:3稀释的表达58c5和sc5Fab的细菌上清液分别用作结合RSV F1裂解物(重组来源)和HEp2裂解物(天然RSV F来源)的阳性对照。
Fab30D8
对于30D8，通过ELISA测试上文的实施例2中产生的77种细胞裂解物1)结合抗Fab抗体的能力；和2)结合RSV F1裂解物的能力。ELISA证实，70种细胞裂解物对Fab产生为阳性，而77种细胞裂解物中的63种结合RSV F裂解物。8个克隆的证实ELISA表明，8种细胞裂解物中的8种的确产生Fab，并且测试的8种命中中的6种再证实为RSV F裂解物的结合物。将阳性结合物中的3种测序，并且全部包含相同抗体，其具有以下轻链和重链(30D8)：
轻链
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS(SEQ ID NO:395)
重链
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ IDNO:396)
Fab 104E5
对于104E5，通过ELISA测试上文的实施例2中产生的88种细胞裂解物1)结合抗Fab抗体的能力；和2)结合RSV F1裂解物的能力。ELISA证实，15种细胞裂解物对Fab产生为阳性，而88种细胞裂解物中的4种结合RSV F裂解物。24个克隆的证实ELISA表明，24种细胞裂解物中的10种的确产生Fab，并且测试的24种命中中的7种再证实为RSV F裂解物的结合物。将阳性结合物中的2种测序，并且包含相同抗体，其具有以下轻链和重链(104E5)：
轻链
DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASQNIKTYLNWYQQKPGRAPKLLISAVSNLQSGVPSRFSGTGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSIPLTFGGGAKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:397)
重链
QVQLEQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGGTFDTYTISWVRQAPGQRLEWLGRIIPSLGETNYAHKLQGRVTITADKATSVVYMDLSDLTSEDAAVYYCAFRITGPVDWVWDYGMDVWGQGTTVSVSSASSKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO:398)
Fab 38F10
对于38F10，通过ELISA测试上文的实施例2中产生的88种细胞裂解物1)结合抗Fab抗体的能力；和2)结合RSV F1裂解物的能力。ELISA证实，65种细胞裂解物对Fab产生为阳性，而88种细胞裂解物中的40种结合RSV F裂解物。16个克隆的证实ELISA表明，16种细胞裂解物中的13种的确产生Fab，并且测试的16种阳性命中中的13种再证实为RSV F裂解物的结合物。将阳性结合物中的5种测序，并且全部包含相同抗体，其具有以下轻链和重链(38F10)：
轻链
DIQLTQSPPTLSASVGDRVSMTCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIQKASNLEDGVPSRFTASGFGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSGLSFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:399)
重链
EVQLLESGGDVVQPGKSLRLSCTASGFSITDFGIHWVRQAPGKGLEWVALISYNEVNIHYGESVRGRFTISRDIAKNTVYLQMNGLRPEDTGVYFCARDVWEDSWLSLACFQEWGQGSLVVVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQID NO:400)
Fab 14G3
对于14G3，通过ELISA测试上文的实施例2中产生的88种细胞裂解物1)结合抗Fab抗体的能力；和2)结合RSV F1裂解物的能力。ELISA证实，71种细胞裂解物对Fab产生为阳性，而88种细胞裂解物中的13种结合RSV F裂解物。16个克隆的证实ELISA表明，16种细胞裂解物中的14种的确产生Fab，并且测试的16种阳性命中中的5种再证实为RSV F裂解物的结合物。将阳性结合物中的4种测序，并且全部包含相同抗体，其具有以下轻链和重链(14G3)：
轻链
DVVMTQTPLSLSVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCMQRMEFPFTFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:401)
重链
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGASISSDNHYWSWIRQPPGKGLEWIASIYYTGGTNYNPSLKSRLALSIDTSGDQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRGLFFITARPYWYFDLWGRGTLVAVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO:402)
Fab 90D3
对于90D3，通过ELISA测试上文的实施例2中产生的88种细胞裂解物1)结合抗Fab抗体的能力；和2)结合RSV F1裂解物的能力。ELISA证实，80种细胞裂解物对Fab产生为阳性，而88种细胞裂解物中的2种结合RSV F裂解物。8个克隆的证实ELISA表明，8种细胞裂解物中的7种的确产生Fab，并且测试的8种阳性命中中的3种再证实为RSV F裂解物的结合物。将阳性结合物中的2种测序，并且每种包含相同抗体，其具有以下轻链和重链(90D3)：
轻链
AIRLTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQSISNFLNWYQQKPGRAPKLLISAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYISLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:403)
重链
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVGSGFTLKNYEMNWVRQAPGQGLQYISYISSSGNVVKYVDSVQGRFTISRDNAGNSLYLQMNNLRAEDTATYYCVRGFSIDKYDSSVDEYWGQGIAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQID NO:404)
D.其他抗RSV抗体
如上文的实施例2、B和C节所述，分离3种其他抗体Fab 56E11、17C9和69F6，利用κ或λ轻链的引物扩增。重链和轻链的序列如下文所示。
Fab 56E11
轻链
QAVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPRLIISEVTKRPSGVPGRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSRHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPAECS(SEQ ID NO:453)
重链
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGVSINSNNYFWAWIRQPPGKGLEWIGNIYYGGSTHYNASLQSRVTISVDTSKSQFSLKLNSVTSADTAVYYCAASESIFWDYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQID NO:452)
Fab 17C9
轻链
EIVLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQNINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYFCQQANSFPRTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:455)
重链
QVQLQQWGAGLVRPSETLSLTCAVYGDSFNDYFWTWIRQTPGKGLEWIGEISHSGSTNYSPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSAVTAADTTVYFCARGVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO:454)
Fab 69F6
轻链
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTISCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPRLLIYDASYLDTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYDDLRGGFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:457)
重链
QMQLVQSGAEVRKPGESLKIACKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEWLGIIFPNDSDATYSPSFQGQVTMSVDKSISTAYLQWNSLKASDTAVYFCARQYYLGSFESWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ IDNO:456)
分离的Fab的抗体结构域和CDR区提供于下文的表13A-13C。
实施例5 分离的Fab的表达和纯化
在该实施例中，随后表达通过利用细胞裂解物的ELISA来确定结合RSV F裂解物的单独Fab抗体，并利用柱层析从细菌细胞纯化。
将编码单独Fab抗体的DNA转化入Top10细胞(Invitrogen)用于表达。使每种Fab抗体在2L SB中于37℃下生长至0.8的OD600。蛋白表达通过加入1mM IPTG诱导，并允许在30℃下过夜。表达后，将细菌培养物离心并将细胞沉淀重悬于10mL包含蛋白酶抑制剂(CompleteProtease Inhibitor Cocktail,Santa Cruz Biotech,Cat.# sc-29131)的磷酸缓冲盐水(PBS)。向重悬的细胞加入溶菌酶(0.2mg)，并将混合物在室温下温育15分钟。将细胞通过两个冷冻/解冻循环裂解。简言之，将重悬的细菌细胞冷冻于乙醇/干冰浴中，然后在37℃水浴中解冻。一旦裂解，将细菌裂解物以18000rpm离心，并将上清液通过0.4微米过滤器过滤和灭菌。
然后通过亲和柱层析将每种单独的Fab抗体纯化。简言之，使过滤的上清液缓慢通过抗Fab/A蛋白柱，以允许Fab结合。用50mL PBS洗涤后，将结合的Fab用9mL的0.2M甘氨酸，pH2.2洗脱，并收集于包含1mL的2M Tris的锥形管中，从而中和洗脱的蛋白。然后，将洗脱的Fab利用10K MWCO透析盒(Pierce)对4L PBS进行透析。将蛋白在4℃下保存过夜，然后利用10kDa Amicon Ultra Filter(Millipore)浓缩至1mL的体积。然后，通过ELISA再证实每种纯化的Fab抗体对RSV F裂解物(重组来源，实施例1A)和HEp2裂解物(天然来源，实施例1B)的结合(见上文的实施例4)。另外，利用实施例6所述的测定，测试每种纯化的Fab抗体中和RSV的能力。
Fab 58c5和sc5对RSV F裂解物和纯化的RSV F蛋白的结合
通过ELISA测量抗体58C5和sc5对从转染的293细胞(重组)捕获的RSV F蛋白或对从RSV A2感染的Hep2细胞(天然)纯化的RSV F蛋白的结合。结果表明，Fab 58c5和Fab sc5以剂量依赖性方式结合RSV F蛋白(重组)，但仅sc5能够识别纯化的F蛋白(天然)(见下文表14-15)。
Fab 30D8、104E5、38F10、90D3和14G3对RSV F裂解物和纯化的RSV F蛋白的结合
估计的Fab 30D8、104E5、38F10、90D3和14G3的结合的EC50如下文表16所示。Fab30D8和14G3均以约5nM(分别为3.8nM和8.2nM)的EC50结合RSV F1裂解物(重组)。Fab 104E5和90D3以约80pM的EC50结合天然RSV病毒株A2F蛋白，而Fab 38F10以177pM的EC50结合天然RSV病毒株A2F蛋白
Fab 56E11、17C9和69F6对纯化的RSV F蛋白的结合
估计的Fab 56E11、17C9和69F6的结合的EC50如下文表16所示。Fab 56E11以545pM的EC50结合RSV F1裂解物(重组)。Fab 17C9和69F6分别以136pM和135pM的EC50结合RSV F1裂解物(重组)。
实施例6 RSV中和测定
在该实施例中，如通过空斑减少测定所评价的，分析抗RSV抗体结合和中和溶液中的RSV病毒的能力。在该实验中，将RSV病毒和抗体在不存在靶细胞的情况下预温育。然后将混合物加入细胞，并通过本文所述的标准空斑减少测定测量病毒感染。分析抗RSV抗体中和几种RSV病毒株的能力，包括RSV A2(ATCC Cat.No.VR-1540)、RSV B-wash(ATCCCat.No.VR-1580，病毒株18537)和RSV B-1(ATCC Cat.No.1400)。
将非洲绿猴肾细胞(ATCC,cat no:CCL-81;Manassas,VA)用于宿主细胞感染。使非洲绿猴肾细胞生长于包含10%胎牛血清(FBS)(HyClone,cat no:SH30070.03)的DMEM(HyClone,cat no:SH 30285.01)中，所述DMEM补充了1%L-谷氨酰胺(HyClone,cat no:SH30034.01)和1%青霉素-链霉素溶液(HyClone,cat no:SV30010)。将非洲绿猴肾细胞维持在5%CO2的37℃培养箱中，并且每周传代两次。
在实验的第1天，将非洲绿猴肾细胞培养于24孔细胞培养板中。将细胞以允许到第2天形成细胞单层(>90%汇合)的密度(约1x106个细胞/孔)平板接种。在第2天，将每种抗体在简单伊格尔氏基本成分培养基(Eagle’s minimal essential medium,EMEM,ATCC,catno:30-2003)中系列稀释(测试的最终抗体浓度：20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml和0.006μg/ml)。还将RSV病毒在简单EMEM中稀释至浓度为2x103pfu/ml(100pfu/50ul)。并且，将110μl稀释的RSV病毒加入110μl每种稀释的抗体溶液，并通过吹吸混合。对于病毒对照样品，将110μl稀释的RSV病毒加入110μl简单EMEM。将抗体-病毒或病毒对照混合物在37℃下温育2小时。温育后，将培养基从包含非洲绿猴肾细胞宿主细胞的24孔培养板倒出，然后将100μl预温育的病毒-抗体或病毒对照混合物转移至每孔。每个测试和对照样品一式三份制备。然后将细胞在37℃下温育1小时，并每15min进行混合。
温育时间段后，吸出包含病毒-抗体或病毒对照混合物的培养基，并将1ml覆盖培养基加入每孔(覆盖培养基包含EMEM、2%FBS、1%L-谷氨酰胺、0.75%甲基纤维素)。然后将24孔细胞培养板在37℃(包含5%CO2)下温育约72小时。将细胞板用10%福尔马林在室温下固定1小时，用ddH2O洗涤10次，并用包含0.05% Tween 20的PBS中的5%脱脂奶粉(NFDM)在37℃下封闭1小时。
温育后，将封闭溶液倒出，并向每孔加入200μL的小鼠抗RSV抗体(ab10018,Abcam，5%NFDM中1:1000稀释)。将平板在37℃下温育2hr，用ddH2O洗涤10次，并向每孔加入200μL山羊抗小鼠HRP-缀合的IgG(Pierce,Cat.No.31432，5%NFDM中1:1000稀释)。将平板在37℃下温育2hr。将平板用ddH2O洗涤10次，并向每孔加入200μL TrueBlueTM过氧化物酶底物(KPLCat.No.50-78-02)。使平板在室温下显影10min。将平板用ddH2O洗涤2次，在纸巾上干燥，并计数蓝色空斑的数目。利用Prism(GraphPad)计算ED50(50%中和的有效稀释)。空斑减少率根据下式计算：
空斑减少率(百分位数)=(1–每种抗体稀释中的平均空斑数/病毒对照孔中的平均空斑数)*100
数据示于下文的表17-19。表17列出各种RSV病毒株的每种Fab的ED50。表18列出各种RSV病毒株和变化浓度的Fab 58c5的空斑计数。表19列出Fab58c5的空斑减少率。表20列出RSV A2的Fab 56E11、17C9、69F6和30D8的空斑减少率。结果表明，Fab 58c5和30D8能够中和RSV的所有3种病毒株，而Fab sc5仅中和RSV A2和RSV B-1，虽然以高得多的抗体浓度。基于中和测定中获得的数据和Fab片段的分子量(约50kDa)，Fab 58c5体外中和RSV A2的ED50为约320pM，而Fab30D8体外中和RSV A2的ED50低约3倍(107pM)。Fab 30D8比Fab 58c5更有效针对RSV B-1和RSV B/wash。
ND 未测定
*30D8 用作阳性对照
实施例7 IgG的克隆和表达
在该实施例中，通过克隆入pCALM哺乳动物表达载体(SEQ ID NO:102)，将表现出中和RSV潜力的Fab抗体转化为IgG。产生对每种抗体特异性的引物，并且通过PCR扩增最初克隆入pCAL载体(见实施例2)的每种Fab的重链和轻链。轻链扩增获得650bp片段，重链扩增获得400bp片段。另外，产生接头，其允许重链和轻链的重叠。接头还包括标准重链恒定区。重链和轻链的重叠获得每种抗体的2.1kB盒，其在两端均具有SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。将每种盒用SfiI消化，并克隆入pCALM载体。证实细菌中的正确序列后，利用Maxi PrepKit(Qiagen)分离用于哺乳动物转染的DNA。
为了表达每种IgG，将每种pCALM载体用于感染约2亿个293F细胞，从而获得约200微克的IgG。将293F细胞用293fectin(Invitrogen,Cat.No.51-0031)转染，并允许产生IgG达72小时。转染后72小时，收获细胞培养基，离心除去细胞，并通过0.4微米过滤器单元过滤灭菌。利用A蛋白柱，通过柱层析进行纯化。使包含表达的IgG的过滤的培养基通过A蛋白柱两次。用50mL的PBS洗涤后，将IgG用9mL的pH2.2的0.2M甘氨酸洗脱，并收集在2M Tris中以进行中和。将洗脱物利用10kDa透析盒(Pierce)对4升PBS进行透析。将样品用10kDa AmiconUltra(Millipore)浓缩至1mL。
实施例8 IgG结合测定
在该实施例中，通过ELISA(见上文实施例4)，测试上文实施例7中产生的58c5、30D8、104E5、38F10、14G3、56E11、17C9和69F6的IgG形式以及抗RSV抗体莫他珠单抗(Wu etal.(2007)J.Mol.Biol.368(3):652-665)的结合RSV F蛋白(重组)或RSV F蛋白(天然)裂解物的能力。估计的结合EC50(通过滴定每种IgG来测定)列于下文的表21。30D8的IgG形式具有最高的亲和力，而58c5、104E、38F10、56E11、17C9和69F6的IgG形式具有低约10倍的亲和力。此外，30D8的IgG形式具有比莫他珠单抗大约10倍的对RSV病毒株A2F蛋白的亲和力。
实施例9 IgG RSV中和测定
在该实施例中，测试上文实施例7中产生的58c5、30D8、104E5、38F10、14G3、56E11、17C9和69F6的IgG形式以及抗RSV抗体莫他珠单抗(Wu et al.(2007)J.Mol.Biol.368(3):652-665)中和RSV的各种病毒株的能力。另外，分析58c5的IgG形式中和各种抗单克隆抗体RSV逃逸突变体(MARM)的能力。MARM是不再被针对其所产生的抗体中和的突变体RSV病毒株。因此，58c5中和特定MARM的能力表示58c5的结合表位不同于产生MARM所针对的抗体的结合表位。
A.RSV的中和
测试58c5、30D8、104E5、38F10、14G3、56E11、17C9和69F6的IgG形式中和RSV的能力(如上文实施例6所述)。数据示于下文的表22-24。表22列出每种RSV病毒株的ED50(50%中和的有效稀释)。表23列出各种RSV病毒株和变化抗体浓度的58c5的IgG形式的空斑计数。表24列出各种RSV病毒株和变化抗体浓度的IgG58c5的空斑减少率。结果表明，58c5、30D8、104E5、38F10、14G3、90D3、56E11和17C9的IgG形式能够中和RSV的所有3种病毒株，虽然以变化的浓度。69F6的IgG形式是RSV病毒株A2选择性的。基于中和测定中获得的数据和IgG片段的分子量(约150kDa)，58c5的IgG形式的体外中和RSV A2的ED50为约133pM。30D8和14G3的IgG形式体外中和RSV A2的ED50分别为89pM和106pM。
30D8的IgG形式与抗RSV抗体莫他珠单抗(Wu et al.(2007)J.Mol.Biol.368(3):652-665)对RSV的三种病毒株的中和活性的比较表明IgG30D8是更有效的中和抗体。对RSV病毒株A2，30D8的IgG形式的中和表现出4倍提高(89pM对360pM)。在中和RSV病毒株B-1中，30D8的IgG形式比莫他珠单抗好15倍。对RSV病毒株B/wash，30D8的IgG形式的中和表现出25倍增加(115pM对2.9nM)。还显示30D8的IgG形式中和RSV的Long和B/9320病毒株。
B.中和抗RSV单克隆抗体的RSV逃逸突变体
如上文的实施例6所述，还测试58c5的IgG形式的中和几种抗单克隆抗体RSV逃逸突变体(Dr.James Crowe,Vanderbilt University提供)的能力。
下文的表23所列的MARM源自RSV野生型病毒株A2。针对人Fab 19(参见，例如Croweet al.,Virology,252:373-375(1998))产生的MARM 19包含异亮氨酸266至甲硫氨酸的氨基酸突变。针对小鼠mAb 151产生的MARM 151包含赖氨酸272至天冬酰胺的氨基酸突变。针对小鼠mAb 1129(其为帕利珠单抗(SYNAGIS)的亲本抗体)产生的MARM 1129包含丝氨酸275至苯丙氨酸的氨基酸突变。
还测试58c5的IgG形式中和几种RSV抗单克隆抗体突变体(MARM)的能力。数据示于下文的表25-26。表25列出变化的抗体浓度的针对各种MARM的中和的空斑计数。表26列出变化的抗体浓度的针对各种MARM的中和的空斑减少率。结果表明，58c5的IgG形式能够中和所有3种RSV MARM。因此，58c5的IgG形式结合的RSV病毒株A2的表位不同于Fab 19、小鼠mAb1129和小鼠mAb 151。
实施例10 竞争测定
在该实施例中，进行竞争测定，其中测试Fab 58c5、30D8、56E11、17C9和69F6与莫他珠单抗IgG(Wu et al.(2007)J.Mol.Biol.368(3):652-665)竞争结合RSV F蛋白的能力。还测试Fab 58c5和30D8与17C9和69F6的IgG形式竞争结合重组RSV F蛋白的能力。还测试Fab 56E11、17C9和69F6与58c5和30D8的IgG形式竞争结合重组RSV F蛋白的能力。作为竞争的阳性对照，测试各种抗体的IgG形式与相同抗体各自的Fab形式竞争的能力。
简言之，如上文实施例1所述制备ELISA板，其包含重组或天然RSV病毒株A2 F蛋白。将平板用1x PBS中的4%脱脂奶粉在37℃下封闭2小时，然后用洗涤缓冲液(PBS/0.05%Tween20)洗涤4x。在PBS/3%BSA/0.01%Tween20中从9μg/mL至0.0001μg/mL滴定Fab(测试的实际浓度：9、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003、0.0001μg/mL)。以0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL的固定浓度加入测试抗体的IgG形式和莫他珠单抗(如下文的表27所示)。如下文的表27所示，同时向平板的每孔加入50μL每种稀释的Fab和固定浓度的IgG，一式两份，并且将平板在37℃下温育2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤4x。加入山羊抗人IgG Fc-γHRP(Jackson ImmunoResearch,Cat.No.109-035-098，1:1000稀释)，并将平板在37℃下温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤6x后，加入50μL1:1v/v TMB：过氧化物溶液(Pierce,Cat No.34021)，并且允许显影7分钟。通过加入50μL2N H2SO4立即停止反应，并利用ELISA酶标仪测量450nm的吸光度。
结果总结于下文的表28。Fab58C5、30D3、56E11、17C9和69F6不与莫他珠单抗竞争结合RSV病毒株A2F蛋白。Fab 30D8不与任何测试的抗体竞争结合。Fab 58C5与69F6的IgG形式竞争结合RSV F蛋白。Fab 56E11和69F6均与58c5的IgG形式竞争结合RSV F蛋白。抗体58C5、69F6和56E11享有共同的RSV融合蛋白上的表位结合位点。
ND：未测定
实施例11 RSV MARM产生和中和测定
在该实施例中，对莫他珠单抗和58c5的IgG形式产生抗单克隆抗体RSV逃逸突变体(MARM)。对30D8的IgG形式，进行12轮选择，并且未鉴定到逃逸突变体。进一步分析莫他珠单抗、58c5和30D8的IgG形式以及Fab 56E11、17C9和69F6中和新产生的MARM的能力。
A.MARM产生
1.莫他珠单抗
减少RSV病毒滴度3log(对应于中和测定的RSV A2病毒的99.9%抑制)的莫他珠单抗IgG的浓度之前测定为3.2μg/mL。将RSV A2病毒颗粒(2x106)用莫他珠单抗IgG稀释物预温育，并将这种混合物用于感染非洲绿猴肾细胞单层(如上文实施例6所述)。选择具有仍然证实细胞毒性效果的最高抗体浓度的孔进行额外轮的选择。10轮选择后，获得在8μg/mL的莫他珠单抗的存在下生长的病毒的空斑。在中和测定中测试来自这些空斑的病毒颗粒(如上文的实施例6所述)，并且利用RNeasy提取试剂盒(Qiagen)制备来自阳性颗粒的RNA。选择6个逃逸突变体，并通过PCR扩增F基因。将DNA测序，并且与亲本RSV A2病毒株(示于SEQ IDNO:485)相比，所有6个克隆均编码位置272处的谷氨酸对赖氨酸的单氨基酸取代(K272E,SEQ ID NO:486)。
下文的表29示出每轮选择的证实致细胞病变效应(CPE)的最高抗体浓度。如下文的表29所示，如通过证实大于对应于中和测定所测定的99.9%RSV A2病毒抑制的莫他珠单抗浓度的CPE的抗体浓度所鉴定的(即>3.2μg/mL)，7轮选择后鉴定了莫他珠单抗逃逸突变体。
2.58C5
减少RSV病毒滴度3log(对应于中和测定的RSV A2病毒的99.9%抑制)的58c5的IgG形式的浓度测定为0.8μg/mL。将RSV A2病毒颗粒(2x106)用58C5的IgG形式的稀释物预温育，并将这种混合物用于感染非洲绿猴肾细胞单层(如上文实施例6所述)。选择具有仍然证实细胞毒性效果的最高抗体浓度的孔进行额外轮的选择。12轮选择后，获得在2μg/mL的58c5的IgG形式的存在下生长的病毒的空斑。在中和测定中测试来自这些空斑的病毒颗粒(如上文的实施例6所述)，并且利用RNeasy提取试剂盒(Qiagen)制备来自阳性颗粒的RNA。选择5个逃逸突变体，并通过PCR扩增F基因。将DNA测序，并且与亲本RSV A2病毒株(示于SEQID NO:485)相比，所有5个克隆均编码3个氨基酸取代(N63K、M115K和E295G；SEQ ID NO:487)。
下文的表30示出每轮选择的证实致细胞病变效应(CPE)的最高抗体浓度。如下文的表30所示，如通过证实大于对应于中和测定所测定的99.9%RSV A2病毒抑制的58C5的IgG形式浓度的CPE的抗体浓度所鉴定的(即>0.8μg/mL)，10轮选择后鉴定了58C5逃逸突变体。
3.30D8
减少RSV病毒滴度3log的30D8的IgG形式的浓度测定为1μg/mL。将RSV A2病毒颗粒(2x106)用30D8的IgG形式的稀释物预温育，并将这种混合物用于感染非洲绿猴肾细胞单层(如上文实施例6所述产生)。选择具有仍然证实细胞毒性效果的最高抗体浓度的孔进行额外轮的选择。12轮选择后，如下文表31所示，未鉴定到30D8逃逸突变体。
B.中和测定
测试莫他珠单抗、58C5和30D8的IgG形式以及Fab56E11、17C9和69F6中和RSV A2亲代病毒株、莫他珠单抗MARM和58C5 MARM的能力。中和测定方法如上文实施例6所述。数据示于下文的表32-35。表32列出针对RSV A2亲代病毒的中和的空斑减少率。表33列出针对莫他珠单抗MARM的中和的空斑减少率。表34列出针对58c5 MARM的中和的空斑减少率。表35为中和数据(ED50值)的总结。
结果表明，所有抗体均能够中和亲代RSV A2病毒株，而58c5和30D8的IgG形式表现出最强的活性(见表32和35)。所有测试的抗体均强烈地中和莫他珠单抗MARM，与亲代病毒株相比没有不同(见表33和35)。如所预期的，在任何测试浓度下，莫他珠单抗不能中和莫他珠单抗MARM。莫他珠单抗、30D8的IgG形式和Fab 17C9强烈地中和58C5 MARM，在中和效力上没有不同(见表34和35)。如所预期的，在任何测试浓度下，58c5的IgG形式不能中和58c5MARM。结果表明，58c5和30D8的IgG形式以及Fab 56E11、17C9和69F6全部中和莫他珠单抗MARM，表明没有竞争。因此，58c5、30D8、56E11、17C9和69F6的表位与莫他珠单抗的表位不重叠，因为未观察到竞争(见下文表28)，并且所有抗体均中和莫他珠单抗MARM。
Fab 69F6与58c5的IgG形式竞争结合RSV F蛋白(见下文表28)但仍然中和58c5MARM，虽然具有比中和亲代A2病毒株略高的ED50(353pM对256pM)。相比之下，Fab 56E11与58c5的IgG形式竞争结合RSV F蛋白(见下文表28)，但是在任何测试浓度下均不中和58c5MARM。因此，56E11表位与58c5重叠，因为观察到这两种抗体之间的竞争，并且56E11 Fab不能中和58C5 MARM。抗体69F6和17C9中和58c5 MARM，表明它们的表位与抗体58c5的表位不重叠。然而，在58c5和69F6之间观察到竞争(见表28)，但是因为69F6中和58c5 MARM，所以观察到的竞争更可能是由于空间位阻。
实施例12 58C5和30D8结合表位的作图
在该实施例中，通过筛选RSV F蛋白的单突变体文库结合抗体58C5或30D8来确定参与抗体58C5和30D8的结合的RSV F蛋白的残基。
利用来自Integral Molecular(Philadelphia,PA)的鸟枪诱变作图技术产生RSVF蛋白突变体文库。简言之，该技术允许在真核细胞内表达和分析突变的靶蛋白的大文库。将靶蛋白中的每个残基单独突变，通常突变为多种其他氨基酸，以便测定单克隆抗体(MAb)结合或功能的变化。在哺乳动物细胞系内表达蛋白，这样甚至可以将需要真核翻译或翻译后加工的复杂蛋白表位作图。
人RSV F A2株(NCBI Ref# FJ614814)用作RSV F蛋白的亲本质粒。包括C端V5标签以允许筛选。在HEK 293细胞中表达F蛋白，并且利用免疫发光确定结合。利用随机突变策略，产生包含1029个突变克隆的RSV F蛋白文库。将F蛋白的全部549个氨基酸突变，平均每个克隆1.34个突变，并且平均每个氨基酸残基2.46个突变。每个氨基酸突变至少一次(100%)，并且至少457个氨基酸(83.2%)突变两次。结合F蛋白的莫他珠单抗和多克隆血清用作阳性对照以确定表达的F蛋白正确折叠。已知莫他珠单抗结合RSV F蛋白的预融和融后构象。此外，58C5和30D8均对构象变化敏感，因此，58C5还用作30D8的对照，而30D8用作58C5的对照。如上文实施例10所示，58C5和30D8结合RSV F蛋白的两个独立位点，此外，均对构象变化敏感。
用转染子的两个独立小量制备进行几次筛选。评价有助于抗体结合的残基的选择标准如下：
突变残基导致比结合30D8的信号少2x的结合58C5的信号；
突变残基导致比结合58C5的信号少2x的结合30D8的信号；
阳性对照(多克隆血清或莫他珠单抗)>20%发光；以及
优选在相同位点还有另一取代。
还利用多克隆抗体证实每个鉴定的克隆的表面表达。样品测试至少3次。
1.结合抗体58C5
结果示出于下文的表36-37，其示出58C5和30D8结合每种F蛋白突变体、莫他珠单抗和/或多克隆血清的结合的至少3个样品(S1、S2和S3)的免疫发光，58C5和30D8的平均值，结合30D8/58C5的比例以及F蛋白中的突变。如下文的表36-37所示，F蛋白中的残基N63、E82、Y86、K168、V207、N371、S405和/或E463的突变导致抗体58C5的结合减少。残基E82在两个小量制备筛选中均鉴定。残基N63以前在58C5的逃逸突变体或MARM中鉴定。这种突变还通过FACS分析证实。当组合的鉴定的残基展示在预融RSV-F的3D模型上时，它们聚集在尖刺的受限区域，在尖刺的顶部与逃逸突变体相同的区域中，并且说明Mab58C5的抗体足迹(见图1)。因此，58C5结合构象表位。
当这些残基展示在融后RSV-F蛋白三聚刺的X-射线结构上时，所述残基分布在大面积的蛋白表面中，这不可能是抗体足迹的一部分(参见，图2，以及Morton et al.,(2003)Virology311:275-288;McLellan et al.,(2010)J Virology 84(23):12236-12244;和McLellan et al.,(2011)J Mol Biol 409:853-866)。58C5的表位位于这样的结构域中，当F蛋白从预融状态移动至融后状态时，所述结构域经过F蛋白的最剧烈的构象变化。仅预融刺上的聚集区与抗体的足迹一致。因此，表位的定位与58C5对预融构象特异性的数据一致，并且其还证实缺少与莫他珠单抗、F101和30D8的竞争。因此，58C5不与莫他珠单抗或30D8结合相同表位。
2.结合抗体30D8
结果示出于下文的表38-39，其示出58C5和30D8结合每种F蛋白突变体、莫他珠单抗和/或多克隆血清的结合的至少3个样品(S1、S2和S3)的免疫发光，58C5和30D8的平均值，结合58C5/30D8的比例以及F蛋白中的突变。如下文的表38-39所示，F蛋白中的残基V278、R339、F351、P353、M370、N371、C382、D392、M396和/或S403的突变导致抗体30D8的结合减少。残基R339在两个小量制备筛选中均鉴定。M370和C382的两种不同突变均导致抗体30D8结合RSV F蛋白的减少。如上文对58C5所示，鉴定的残基限制于RSV F蛋白的一个结构域。当将所有鉴定的结合的残基组合时，它们全部聚集在茎/梗区上的棒棒糖的基部的D1结构域中。根据3D模型，一些残基是内部的，而暴露的其他残基聚集在预融三体模型中不同原体的D1结构域之间的裂隙中的界面中(见图3)。当所述残基展示于融后三体中时，所有鉴定的残基是内部的。虽然预期D1区的构象变化在预融构象和融后构象之间非常有限，但是原体亚基在预融和融后之间的确重排，导致更凝聚和较少开放的融后结构。30D8 Mab作图至D1区与其依赖于RSV F蛋白结构构象的结果一致。此外，正如58C5，该表位不与58C5、莫他珠单抗或抗体101F竞争。这与3D模型上的位置一致。因此，30D8不与莫他珠单抗或58C5结合相同表位。
因为改变对本领域技术人员是显而易见的，所以本发明仅受所附权利要求书的范围的限制。

Claims (9)

1.一种抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中：
在所述抗体或其抗原结合片段的存在下，RSV在超过10轮或更多轮病毒复制后不产生逃脱所述抗体或其抗原结合片段中和的病毒，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
可变重链结构域，其包含：VH CDR1，所述VH CDR1由SEQ ID NO:405或437所示的氨基酸残基序列组成；VH CDR2，所述VH CDR2由SEQ ID NO:406所示的氨基酸残基序列组成；以及VH CDR3，所述VH CDR3由SEQ ID NO:407所示的氨基酸残基序列组成；以及
可变轻链结构域，其包含：VLCDR1，所述VLCDR1由SEQ ID NO:408所示的氨基酸序列组成；VLCDR2，所述VLCDR2由SEQ ID NO:409所示的氨基酸序列组成；以及VLCDR3，所述VLCDR3由SEQ ID NO:410所示的氨基酸序列组成；以及
其中所述抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白并中和RSV。
2.权利要求1的抗RSV抗体或抗原结合片段，其包含：
VH结构域，其中所述VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:396的氨基酸1-121所示；以及
VL结构域，其中所述VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:395的氨基酸1-110所示。
3.权利要求1或2的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在体外空斑减少测定中中和RSV的EC50为少于2nM，或者所述抗体或抗原结合片段具有至少108M-1的对分离的RSV F蛋白或对RSV病毒的亲和力。
4.一种多价抗体，其包含：
第一抗原结合部分，其包含缀合至第一多聚化结构域的权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段；以及
第二抗原结合部分，其包含缀合至第二多聚化结构域的抗病毒抗体的抗原结合片段，其中：
所述第一多聚化结构域与所述第二多聚化结构域是互补的或相同的，从而所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分形成多价抗体。
5.一种药物组合物，其包含：
权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求4的多价抗体，以及药学可接受的载体或赋形剂。
6.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其用于治疗或抑制RSV感染的一种或多种症状，或者用于预防RSV感染。
7.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段用于配制治疗或抑制RSV感染的一种或多种症状或者预防RSV感染的药物的用途。
8.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于通过以下方法检测RSV感染的试剂盒中的用途，所述方法包括：
(a)利用权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段测定流体、细胞或组织样品中的RSV抗原水平；
(b)将所测定的RSV抗原水平与对照水平比较，由此与RSV抗原的对照水平相比，所测定的RSV抗原水平的提高代表RSV感染。
9.一种分离的核酸，其编码权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段。
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