EA027835B1 - Антитела против респираторно-синцитиального вируса (рсв) и способы их применения - Google Patents

Abstract

В изобретении предоставлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с белком слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB). Также предоставлены способы предотвращения, лечения и диагностики вирусной инфекции и/или лечения одного или более симптомов опосредуемого PCB заболевания. Также предоставлены способы получения антител, которые иммуноспецифически связывают белок F PCB.

Description

изобретение относится в частности к антителу против респираторно-синцитиального вируса (PCB) или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат

вариабельную область тяжелой цепи, включающую VH CDR1, содержащую последовательность аминокислотных остатков, указанную в SEQ ID NO: 405 или 437, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 405 или 437; V_H CDR2, содержащую последовательность аминокислотных остатков, указанную в SEQ ID NO: 406, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 406; и V_H CDR3, содержащую последовательность аминокислотных остатков, указанную в SEQ ID NO: 407, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 407; и

вариабельную область легкой цепи, включающую VL CDR1, содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 408, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 408; VL CDR2, содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 409, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 409; и V_L CDR3, содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 410, или

- 2 027835

последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 410; и

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с белком слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB) и/или нейтрализуют PCB.

В частности, по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 V_H, указанную в SEQ ID NO: 405 или 437, CDR2 V_H, указанную в SEQ ID NO: 406, CDR3 V_H, указанную в SEQ ID NO: 407, CDR1 V_L, указанную в SEQ ID NO: 408, CDR2 V_L, указанную в SEQ ID NO: 409, и CDR3 V_L, указанную в SEQ ID NO: 410, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 405-410 или 437.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 464 или 483, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 465, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 466, CDR1 VL, указанную в SEQ ID NO: 467, CDR2 VL, указанную в SEQ ID NO: 468, и CDR3 VL, указанную в SEQ ID NO: 469, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 464469 или 483.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 411 или 438, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 412, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 413, CDR1 V_L, указанную в SEQ ID NO: 414, CDR2 V_L, указанную в SEQ ID NO: 415, и CDR3 V_L, указанную в SEQ ID NO: 416, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 411416 или 438.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 417 или 439, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 418, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 419, CDR1 VL, указанную в SEQ ID NO: 420, CDR2 VL, указанную в SEQ ID NO: 421, и CDR3 VL, указанную в SEQ ID NO: 422, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 417422 или 439.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 423 или 440, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 424, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 425, CDR1 V_L, указанную в SEQ ID NO: 426, CDR2 V_L, указанную в SEQ ID NO: 427, и CDR3 V_L, указанную в SEQ ID NO: 428, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 423428 или 440.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 429 или 441, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 430, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 431, CDR1 VL, указанную в SEQ ID NO: 432, CDR2 VL, указанную в SEQ ID NO: 433, и CDR3 VL, указанную в SEQ ID NO: 434, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 429434 или 441.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 458 или 482, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 459, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 460, CDR1 VL, указанную в SEQ ID NO: 461, CDR2 VL, указанную в SEQ ID NO: 462, и CDR3 VL, указанную в SEQ ID NO: 463, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 458463 или 482.

Также по настоящему документу предоставлено антитело, содержащее CDR1 VH, указанную в SEQ ID NO: 470 или 484, CDR2 VH, указанную в SEQ ID NO: 471, CDR3 VH, указанную в SEQ ID NO: 472, CDR1 V_L, указанную в SEQ ID NO: 473, CDR2 V_L, указанную в SEQ ID NO: 474, и CDR3 V_L, указанную в SEQ ID NO: 475, или антитело, содержащее CDR с последовательностями, по меньшей мере или приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичными с любой из SEQ ID NO: 470475 или 484.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 396. В некоторых примерах выделенные антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VH с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-121 SEQ ID NO: 396.

В частности, настоящее изобретение относится к антителу к PCB или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим

домен VH, где аминокислотная последовательность домена VH аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 396 или по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в ами- 3 027835

нокислотах 1-121 SEQ ID NO: 396; и

домен VL, где аминокислотная последовательность домена VL указана в аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395 или по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 395. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-110 SEQ ID NO: 395. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 30D8.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VH), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 396, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 395.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 405 или 437; CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 406; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 407.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 408; CDR2 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 409; и CDR3 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 410.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 398. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен V_H с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-125 SEQ ID NO: 398. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 397. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-107 SEQ ID NO: 397. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 104Е5.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 398, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 397.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 411 или 438; CDR2 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 412; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 413.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 414; CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 415; и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 416.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 400. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен V_H с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-124 SEQ ID NO: 400. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 399. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-108 SEQ ID NO: 399. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 38F10.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие

- 4 027835

фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VH), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 400, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 399.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 417 или 439; CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 418; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 419.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 420; CDR2 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 421; и CDR3 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 422.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 402. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен V_H с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-125 SEQ ID NO: 402. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 401. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-113 SEQ ID NO: 401. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 14G3.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 402, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 401.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 423 или 440; CDR2 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 424; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 425.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 426; CDR2 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 427; и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 428.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 404. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен V_H с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-123 SEQ ID NO: 404. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 403. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-107 SEQ ID NO: 403. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 90D3.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 404, и легкую цепь, указанную в SEQ IID NO:403.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 429 или 441; CDR2 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 430; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 431.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 432; CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 433;

- 5 027835

и CDR3 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 434.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 452. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен V_H с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-124 SEQ ID NO: 452. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 453. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-111 SEQ ID NO: 453. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 56Е11.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же зпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 452, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 453.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 458 или 482; CDR2 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 459; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 460.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 461; CDR2 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 462; и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ IID NO:463.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 454. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен V_H с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-133 SEQ ID NO: 454. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 455. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-107 SEQ ID NO: 455. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 17С9.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 454, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 455.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 464 или 483; CDR2 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 465; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 466.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 467; CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 468; и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 469.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 456. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VH с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-118 SEQ ID NO: 456. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат легкую цепь с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 457. В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат домен VL с аминокислотной последовательностью, указанной как аминокислоты 1-109 SEQ ID NO: 457. В конкретном примере выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой 69F6.

- 6 027835

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 456, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 457.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 470 или 484; CDR2 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 471; и CDR3 VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 472.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 473; CDR2 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474; и CDR3 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 475.

По настоящему документу предоставлены выделенные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_H), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на слитом белке (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB), что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 454 или 456, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 или 457.

В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат определяющую комплементарность область 1 (CDR1) VH с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 или 482-484.

В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 или 471.

В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR3 V_H с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 или 472.

В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 или 473.

В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR2 VL с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 или 474.

В некоторых примерах выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 или 475.

В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 V_H, где аминокислотная последовательность CDR1 VH указана в SEQ ID NO: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 или 482-484; CDR2 VH, где аминокислотная последовательность CDR2 VH указана в SEQ ID NO: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 или 471 и CDR3 VH, где аминокислотная последовательность CDR3 VH указана в SEQ ID NO: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 или 472. В некоторых примерах выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат CDR1 VL, где аминокислотная последовательность CDR1 VL указана в SEQ ID NO: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 или 473; CDR2 VL, где аминокислотная последовательность CDR2 VL указана в SEQ ID NO: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 или 474; и CDR3 V_L, где аминокислотная последовательность CDR3 V_L указана в SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 или 475.

По настоящему документу предоставлены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с частью белка F PCB с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 25.

По настоящему документу предоставлены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие антигенсвязывающий домен, которые представляют собой человеческие или гуманизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых примерах выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, представляют собой химерные антитела. В некоторых примерах выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd или Fd'. В некоторых примерах выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, содержат пептидный линкер. В некоторых примерах пептидный линкер содержит приблизительно от 1

- 7 027835

до 50 аминокислот.

В некоторых примерах выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, конъюгированы с полиэтиленгликолем (ПЭГ). В некоторых примерах выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат терапевтические или диагностические средства. Примеры диагностических средств включают, но не ограничиваются ими, фермент, флуоресцентное соединение, переносящее электроны соединение и радиоактивную метку.

По настоящему документу предоставлены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие домен белковой трансдукции. В некоторых примерах домен белковой трансдукции выбран из пептидов с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 284-355. В некоторых примерах домен белковой трансдукции представляет собой домен белковой трансдукции ТАТ-белка ВИЧ.

Настоящее изобретение относится также к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где EC50 антитела или антигенсвязывающего фрагмента для нейтрализации PCB в анализе подавления бляшкообразования in vitro составляет менее чем 2 нМ или аффинность антитела или антигенсвязывающего фрагмента к выделенному белку F PCB или к вирусу PCB составляет по меньшей мере 10⁸ М^-1.

По настоящему документу предоставлены поливалентные антитела, содержащие первую антигенсвязывающую часть, включающую полипептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, конъюгированные с доменом мультимеризации; и вторую антигенсвязывающую часть, включающую антигенсвязывающий фрагмент противовирусного антитела, конъюгированный со вторым доменом мультимеризации. В таких примерах первый домен мультимеризации и второй домен мультимеризации комплементарны или одинаковы, вследствие чего первая антигенсвязывающая часть и вторая антигенсвязывающая часть формируют поливалентное антитело. В некоторых примерах поливалентные антитела, предоставляемые по настоящему документу, содержат 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенсвязывающих фрагментов. Примеры поливалентных антител включают двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентные, пятивалентные, шестивалентные или семивалентные антитела. Поливалентные антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают гетеробивалентные или гомобивалентные антитела. Поливалентные антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают полиспецифические антитела. В некоторых примерах полиспецифические антитела представляют собой биспецифические, триспецифические или тетраспецифические антитела. В некоторых примерах поливалентные антитела, предоставляемые по настоящему документу, содержат антигенсвязывающие фрагменты, которые представляют собой одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd или Fd'. Первая антигенсвязывающая часть и/или вторая антигенсвязывающая часть поливалентного антитела, предоставляемого по настоящему документу, можно посредством ковалентной или нековалентной связи конъюгировать с доменом мультимеризации. В некоторых примерах антигенсвязывающая часть конъюгирована с доменом мультимеризации посредством линкера, такого как химически синтезированный линкер или полипептидный линкер. В некоторых примерах домен мультимеризации поливалентного антитела, предоставляемого по настоящему документу, выбран из константной области иммуноглобулина (Fc), лейциновой застежки, комплементарных гидрофобных областей, комплементарных гидрофильных областей или совместимых доменов белок-белковых взаимодействий. В некоторых примерах домен Fc представляет собой домен Fc IgG, IgM и IgE.

В некоторых примерах поливалентные антитела, предоставляем по настоящему документу, содержат два или более антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. В конкретном примере поливалентные антитела, предоставляемые по настоящему документу, содержат два или более антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов.

По настоящему документу предоставлены поливалентные антитела, содержащие первую антигенсвязывающую часть, содержащую антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, конъюгированную с доменом мультимеризации; и вторую антигенсвязывающую часть, содержащую антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из паливизумаба, мотавизумаба, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, А12а6, А13С4, A17d4, A4B4, А8с7, 1X493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающих фрагментов, конъюгированную со вторым доменом мультимеризации.

По настоящему документу предоставлены поливалентные антитела, содержащие первую антигенсвязывающую часть, содержащую антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, конъюгированную с доменом мультимеризации; и вторую антигенсвязывающую часть, содержащую противовирусное антитело, которое иммуноспецифически связывает антигены вируса парагриппа (PIV) или метапневмовируса человека (hMPV), конъюгированную со вторым доменом мультимеризации.

Настоящее изобретение относится также к поливалентному антителу против а) PCB, или b) PCB и вируса парагриппа (PIV), или с) PCB и вируса парагриппа (PIV), содержащему

первую антигенсвязывающую часть, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент со- 8 027835

гласно изобретению, конъюгированные с доменом мультимеризации; и вторую антигенсвязывающую часть, содержащую антигенсвязывающий фрагмент противовирусного антитела, выбранного из группы, состоящей из антитела против PCB, PIV или hMPV, конъюгированный со вторым доменом мультимеризации, где

первый домен мультимеризации и второй домен мультимеризации являются комплементарными или одинаковыми, вследствие чего первая антигенсвязывающая часть и вторая антигенсвязывающая часть формируют поливалентное антитело.

По настоящему документу предоставлены фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, любое поливалентное антитело, предоставляемое по настоящему документу, а также фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В некоторых примерах фармацевтические композиции по настоящему документу составляют в виде геля, мази, жидкости, суспензии, аэрозоли, таблетки, пилюли, порошка или назального спрея. В некоторых примерах фармацевтические композиции, предоставляем по настоящему документу, составляют для легочного, интраназального или парентерального введения. В некоторых примерах фармацевтические композиции, предоставляемые по настоящему документу, составляют для введения однократной дозы. В некоторых примерах фармацевтические композиции, предоставляемые по настоящему документу, составляют для замедленного высвобождения.

По настоящему документу предоставлены фармацевтические композиции, содержащие выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу или поливалентное антитело, предоставляемое по настоящему документу, а также одно или более дополнительных противовирусных антител. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат два или более различных антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат два или более различных антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов, выбранных из антител или антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, и антитела, выбранные из паливизумаба, мотавизумаба, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, А12а6, А13С4, A17d4, А4В4, А8с7, 1X493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, и антитела, выбранные из антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антигены вируса парагриппа (PIV) или метапневмовируса человека (hMPV). В некоторых примерах антиген PIV представляет собой антиген PIV человека типа 1, PIV человека типа 2, PIV человека типа 3 и/или PIV человека типа 4. В некоторых примерах антиген PIV выбран из фосфопротеина нуклеокапсида PIV, слитого белка (F) PIV, фосфопротеина PIV, большого белка (L) PIV, белка матрикса (M) PIV, гликопротеина гемагглютинина-нейраминидазы (HN) PIV, РНК-зависимой РНК-полимеразы PIV, белка Y1 PIV, белка D PIV, белка С PIV и их аллельных вариантов. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV типа А или hMPV типа В. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV подтипа A1, hMPV подтипа А2, hMPV подтипа В1 или hMPV подтипа В2. В некоторых примерах антиген hMPV выбран из нуклеопротеина hMPV, фосфопротеина hMPV, белка матрикса hMPV, малого гидрофобного белка hMPV, РНК-зависимой РНК-полимеразы hMPV, белка F hMPV, белка G hMPV и их аллельных вариантов.

По настоящему документу предоставлены фармацевтические композиции, содержащие выделенные полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, или поливалентное антитело, предоставляемое по настоящему документу, и одно или более дополнительных противовирусных антител, где одно или более дополнительных противовирусных антител представляют собой одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd или Fd'.

По настоящему документу предоставлены фармацевтические композиции, содержащие выделенные полипептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, или поливалентное антитело, предоставляемое по настоящему документу, и противовирусное средство. В некоторых примерах, противовирусное средство представляет собой рибавирин.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения или подавления одного или более симптомов инфекции PCB у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению.

По настоящему документу предоставлены способы лечения вирусной инфекции у индивидуума, включающие введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, предоставляемое по настоящему документу. По настоящему документу предоставлены способы лечения или подавления одного или более симптомов вирусной инфекции у индивидуума, включающие введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, предоставляемой по настоящему документу. Также по настоящему документу предоставлены способы пре- 9 027835

дотвращения вирусной инфекции у индивидуума, включающие введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, предоставляемой по настоящему документу. В конкретном примере вирусная инфекция представляет собой инфекцию PCB. В конкретном примере инфекция PCB представляет собой инфекцию верхних дыхательных путей.

Введение можно осуществлять любым подходящим путем, включая, но не ограничиваясь, местным, парентеральным, локальным или системным введением, например, интраназальным, внутримышечным, интрадермальным, внутрибрюшинным, внутривенным, подкожным, пероральным или легочным введением. В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, вводят посредством распылителя или ингалятора. Фармацевтические композиции, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить любому подходящему индивидууму, например, млекопитающему, например, человеку.

В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, вводят младенцу, недоношенному младенцу или младенцу с риском госпитализации вследствие инфекции PCB, пожилому человеку, индивидууму с муковисцидозом, бронхолегочной дисплазией, врожденным пороком сердца, врожденным иммунодефицитом, приобретенным иммунодефицитом, лейкозом или неходжкинской лимфомой или индивидууму, с трансплантатом, например, таким как трансплантат костного мозга или трансплантат печени.

В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, вводят один, два, три, четыре или пять раз в течение сезона PCB (например, с октября по май). В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, вводят один, два, три, четыре или пять раз в течение одного, двух или трех месяцев до сезона PCB.

В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, можно вводить с одним или более противовирусными средствами. В некоторых примерах противовирусное средство представляет собой рибавирин. В некоторых примерах фармацевтическая композиция и противовирусное средство составляют в виде одной композиции или в виде отдельных композиций. В способах, предоставляемых по настоящему документу, фармацевтическую композицию и противовирусное средство можно вводить последовательно, одновременно или периодически.

В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, можно вводить совместно с проведением гормональной терапии, иммунотерапии или с введением противовоспалительного средства. В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, можно вводить с одним или более дополнительными противовирусными антителами и их антигенсвязывающими фрагментами. Фармацевтическую композицию и одно или более дополнительных противовирусных антител составляют в виде одной композиции или в виде отдельных композиций. Фармацевтическую композицию и одно или более дополнительных антител к PCB можно вводить последовательно, одновременно или периодически. В некоторых примерах антигенсвязывающие фрагменты представляют собой одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd или Fd'.

В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, можно вводить с одним или более дополнительными противовирусными антителами, выбранными из антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, например, таких как паливизумаб, мотавизумаб, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, А12а6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу, можно вводить с одним или более дополнительными противовирусными антителами, выбранными из антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антигены вируса парагриппа (PIV) или метапневмовируса человека (hMPV). В некоторых примерах антиген PIV представляет собой антиген PIV человека типа 1, PIV человека типа 2, PIV человека типа 3 и/или PIV человека типа 4. В некоторых примерах антиген PIV выбран из фосфопротеина нуклеокапсида PIV, слитого белка (F) PIV, фосфопротеина PIV, большого белка (L) PIV, белка матрикса (М) PIV, гликопротеина гемагглютинина-нейраминидазы (HN) PIV, РНК-зависимой РНК-полимеразы PIV, белка Y1 PIV, белка D PIV, белка С PIV и их аллельных вариантов. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV типа А или hMPV типа В. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV подтипа А1, hMPV подтипа А2, hMPV подтипа В1 или hMPV подтипа B2. В некоторых примерах антиген hMPV выбран из нуклеопротеина hMPV, фосфопротеина hMPV, белка матрикса hMPV, малого гидрофобного белка hMPV, РНК-зависимой РНК-полимеразы hMPV, белка F hMPV, белка G hMPV и их аллельных вариантов.

По настоящему документу предоставлены способы детекции инфекции PCB, включающие (а) анализ. уровня антигена PCB в образцах жидкостей, клеток или тканей посредством антител или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, (b) сравнение измеряемого уровня антигена PCB с контрольным уровнем, где возрастание измеряемого уровня антигена PCB по сравнению с контрольным уровнем антигена PCB является показателем инфекции PCB. В некоторых

- 10 027835

примерах образец клеток или ткани получают у человека. В некоторых примерах образец клеток или ткани представляет собой образец крови, мочи, слюны, мокроты легких, лаважа или лимфы.

По настоящему документу предоставлены выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу. Также по настоящему документу предоставлено применение антител или антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, для получения лекарственного средства для профилактики вирусной инфекции у индивидуума. Также по настоящему документу предоставлено применение антител или антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, для получения лекарственного средства для лечения вирусной инфекции у индивидуума. Также по настоящему документу предоставлено применение антител или антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, для получения лекарственного средства для лечения или подавления одного или более симптомов вирусной инфекции у индивидуума.

В частности, настоящее изобретение относится к применению антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения или подавления одного или более симптомов инфекции PCB или предотвращения инфекции PCB.

Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения инфекции PCB у индивидуума, включающему введение индивидууму профилактически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой ЗЭ-модсль белка F PCB в конформации перед слиянием. Аминокислотные остатки, идентифицированные в примере 12 как важные для связывания антитела 58С5, указаны черным, пространственные модели. Когда остатки представлены на 3О-модели белка F PCB перед слиянием, они кластеризуются на ограниченной области выступа и иллюстрируют область узнавания антитела у антитела 58С5.

На фиг. 2 представлена рентгеновская структура 3О-модели области D3 белка F PCB, содержащей остатки белка F PCB, важные для связывания антитела 58С5 в конформации до слияния и после слияния. Как показано на фиг. 2, остатки, важные для связывания антитела 58С5, кластеризуются только в модели до слияния. В модели после слияния, остатки рассредоточены по большой области поверхности белка.

Фиг. 3 представляет собой 3D-модель белка F PCB в конформации перед слиянием. Аминокислотные остатки, идентифицированные в примере 12 как важные для связывания антитела 30D8, указаны черным, пространственные модели. Остатки кластеризуются в домене D1 в основании структуры головки на ножке непосредственно ниже области стебля/ножки.

Подробное описание

Содержание.

A. Определения.

B. Обзор.

1. Респираторно-синцитиальный вирус.

C. Антитела к PCB.

1. Общая структура антител и функциональные домены.

a. Структурные и функциональные домены антител.

b. Фрагменты антител.

2. Примеры антител к PCB.

а. Производные антитела.

i. Одноцепочечные антитела.

ii. Антиидиотипические антитела.

iii. Полиспецифические антитела и мультимеризация антител.

D. Дополнительные модификации антител к PCB.

1. Модификации для снижения иммуногенности.

2. Модификации Fc.

3. Пегилирование.

4. Конъюгация с детектируемой молекулой.

5. Конъюгация с терапевтической молекулой.

б. Модификации для улучшения специфичности связывания.

E. Способы выделения антител к PCB.

F. Способы получения антител к PCB, их модифицированных форм или вариантов и нуклеиновых кислот, кодирующих антитела.

1. Нуклеиновые кислоты.

2. Векторы.

3. Клеточные экспрессирующие системы.

a. Экспрессия в прокариотах.

b. Дрожжевые клетки.

c. Клетки насекомых.

- 11 027835

d. Клетки млекопитающих.

e. Растения.

4. Очистка антител.

G. Анализ свойств и активности антител к PCB.

1. Анализы связывания.

4. Модели на животных для анализа эффективности антител к PCB in vivo.

Н. Применение в диагностике.

1. Детекция патогенной инфекции in vitro.

2. Детекция патогенной инфекции in vivo.

3. Мониторинг инфекции.

I. Применение для профилактики и лечения.

1. Индивидуумы, подлежащие лечению.

2. Дозировки.

3. Пути введения.

4. Способы комбинированного лечения.

а. Противовирусные антитела для комбинированного лечения.

i. Антитела к PCB.

ii. Антитела к другим респираторным вирусам.

5. Генотерапия.

J. Фармацевтические композиции, комбинации и промышленные изделия/наборы.

1. Фармацевтические композиции.

2. Промышленные изделия/наборы.

3. Комбинации.

K. Примеры.

А. Определения

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют тот же смысл, как это обычно понимает специалист в области, к которой относится изобретение. Если не определено иначе, все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности GenBank, базы данных, веб-сайты и другие опубликованные материалы, указываемые в настоящем документе, приведены в полном объеме в качестве ссылки. В случае наличия для указываемых в настоящем документе терминов нескольких определений, приоритет имеет приведенное в этом разделе определение. В случае указания URL или другого подобного идентификатора или адреса, следует понимать, что идентификатор может изменяться и информация в сети Интернет может появляться и исчезать, но в сети Интернет можно найти аналогичную информацию. Подобная ссылка указывает на доступность и наличие открытого доступа для такой информации.

Как применяют в настоящем документе, "антитело" относится к иммуноглобулинам и фрагментам иммуноглобулинов, природным или частично или полностью синтетическим, таким как получаемые рекомбинантным способом, включая любые их фрагменты, содержащие по меньшей мере часть вариабельного домена молекулы иммуноглобулина, которые сохраняют специфичность связывания полноразмерного иммуноглобулина. Таким образом, антитела включают любые белки, содержащие связывающий домен, гомологичный или в значительной степени гомологичный антигенсвязывающему домену иммуноглобулина (связывающая область антитела). Антитела включают фрагменты антител, такие как фрагменты антител к PCB. Таким образом, как применяют в настоящем документе, термин антитело включает в себя синтетические антитела, рекомбинантные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела человека и не принадлежащие человеку антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, внутриклеточные антитела и фрагменты антител, включая, но не ограничиваясь, фрагментами Fab, фрагментами Fab' фрагментами F(ab')2, фрагментами Fv, связанными дисульфидными мостами фрагментами Fv (dsFv), фрагментами Fd, фрагментами Fd', одноцепочечными Fv (scFv), одноцепочечными Fab (scFab), диателами, антиидиотилическими (анти-Id) антителами или антигенсвязывающими фрагментами любого из указанного выше. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают представителей иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса (например, IgG2a и IgG2b).

Как применяют в настоящем документе, "фрагмент антитела" или "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к любой части полноразмерного антитела, меньшей полноразмерной молекулы, но содержащей по меньшей мере часть вариабельной области антитела, связывающего антиген (например, одну или более CDR и/или одну или более связывающих областей антитела), и, таким образом, по меньшей мере, частично сохраняющей специфичность связывания полноразмерного антитела. Таким образом, антигенсвязывающий фрагмент относится к фрагменту антитела, содержащему антигенсвязывающую часть, связывающуюся с тем же антигеном, что и антитело, из которого этот фрагмент антитела получен. Фрагменты антител включают производные антител, полученные посредством ферментативной обработки полноразмерных антител, а также синтетически, например, рекомбинантно получаемые про- 12 027835

изводные. Фрагмент антитела включен в понятие антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd и Fd', а также другие фрагменты, включая модифицированные фрагменты (см., например, Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003), Chapter 1; p. 3-25, Kipriyanov). Фрагмент может содержать несколько цепей, связанных друг с другом, например, посредством дисульфидных мостиков и/или пептидных линкеров. Как правило, фрагмент антитела содержит по меньшей мере или приблизительно 50 аминокислот, а, как правило, по меньшей мере или приблизительно 200 аминокислот.

Антигенсвязывающий фрагмент включает любой фрагмент антитела, который при вставке в каркас антитела (например, посредством замены соответствующей области) приводит к антителу, которое иммуноспецифически связывает (т.е. демонстрирует Ka по меньшей мере приблизительно 10⁷-10⁸ М^-1) с антигеном.

Как применяют в настоящем документе, "терапевтическое антитело" относится к любому антителу или антигенсвязывающему фрагменту, которые вводят для лечения животных, включая человека. Такие антитела можно получать любым известным способом получения полипептидов, и, таким образом, они включают, но не ограничиваются рекомбинантно получаемыми антителами, синтетически получаемыми антителами и терапевтическими антителами, выделенными из клеток, тканей и других источников. При выделении из любых источников или при другом способе получения терапевтические антитела могут являться гетерогенными по длине и различаться по посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование (т.е. содержание углеводов). Гетерогенность терапевтических антител также может зависеть от источника терапевтических антител. Таким образом, указание терапевтического антитела относится к гетерогенной популяции антител, как полученных, так и выделенных. Если подразумевают гомогенный препарат, то это указывают отдельно. Указание терапевтических антител в настоящем документе при необходимости относится к их мономерным, димерным или другим олигомерным формам.

В настоящем документе "нейтрализующее антитело" относится к любому антителу или антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с патогеном и препятствуют способности патогена инфицировать клетки и/или вызывать заболевание у индивидуума. Примером нейтрализующих антител являются нейтрализующие антитела, связывающие вирусные, бактериальные и грибковые патогены. Как правило, нейтрализующие антитела, предоставляемые по настоящему документу, связываются с поверхностью патогена. В примерах, где патоген представляет собой вирус, нейтрализующее антитело, связывающееся с вирусом, как правило, связывается с белком на поверхности вируса. В зависимости от класса вируса поверхностный белок может представлять собой белок капсида (например, белок капсида безоболочечного вируса) или белок оболочки вируса (например, белок оболочки оболочечного вируса). В некоторых примерах белок представляет собой гликопротеин. Способность антитела подавлять инфекционность вируса можно измерять, например, посредством анализа нейтрализации in vitro, например, анализа подавления бляшкообразования с использованием клеток-хозяев Vero.

Как применяют в настоящем документе, "оболочечный вирус" представляет собой вирус животного, содержащий наружную мембрану или оболочку, которая представляет собой липидный бислой, содержащий вирусные белки, окружающую капсид вируса. Белки оболочки вируса участвуют в сборке инфекционной частицы, а также участвуют в процессе проникновения вируса, связываясь с рецепторами, присутствующими у клетки-хозяина и вызывая слияние вирусной оболочки и мембраны клетки-хозяина. Оболочечные вирусы могут быть сферическими или нитевидными (палочковидными). Примеры вирусов с оболочкой включают, но не ограничиваются представителями семейств вирусов Herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, Togaviridae, Arenaviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Coronaviridae и Bornaviridae. Респираторно-синцитиальный вирус (PCB) представляет собой оболочечный вирус семейства Paramyxoviridae, подсемейства Pneumovirinae с антисмысловой одноцепочечной РНК.

Как применяют в настоящем документе, "безоболочечный вирус" или "голый вирус" представляет собой вирус, который не имеет оболочки. Для заражения клетки-хозяина безоболочечный вирус для прикрепления к клетке-мишени использует белки вирусного капсида. Примеры безоболочечных вирусов включают, но не ограничиваются семействами вирусов Adenoviridae, Papillomavirinae, Parvoviridae, Polyomavirinae, Circoviridae, Reoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae и Astroviridae.

Как применяют в настоящем документе, "поверхностный белок" патогена представляет собой любой белок, расположенный на внешней поверхности патогена. Поверхностный белок может быть полностью или частично экспонирован во внешнюю среду (например, на внешнюю поверхность). Примерами поверхностных белков являются мембранные белки, например, такие как белок, расположенный на поверхности оболочки вируса или наружной мембране бактерии (например, мембранный гликопротеин). Мембранные белки могут представлять собой трансмембранные белки (т.е. белки, пересекающие липидный бислой) или белки, являющиеся не трансмембранными, ассоциированными с клеточной поверхностью белками (например, заякоренные или ковалентно связанные с поверхностью мембраны, например, связанные с другими белкам на поверхности патогена). Другие примеры поверхностных белков включают белки вирусных капсидов безоболочечных вирусов, которые хотя бы частично экспонированы во

- 13 027835

внешнюю среду.

Как применяют в настоящем документе, "моноклональное антитело" относится к популяции идентичных антител, что означает, что каждая отдельная молекула антитела в популяции моноклональных антител идентична с другими. Это свойство отличается от популяции поликлональных антител, которая содержит антитела с множеством различных последовательностей. Моноклональные антитела можно получать рядом известных способов (Smith et al. (2004), J. Clin. Pathol. 57, 912-917; и Nelson et al., J. Clin Pathol (2000), 53, 111-117). Например, моноклональные антитела можно получать посредством иммортализации B-клеток, например, посредством слияния с миеломной клеткой с получением гибридомной клеточной линии, или посредством инфицирования B-клеток вирусом, таким как EBV. Также можно использовать рекомбинантную технологию для получения антител in vitro из клональных популяций клеток-хозяев посредством трансформации клеток-хозяев плазмидой, несущей искусственную последовательность нуклеотидов, кодирующую антитела.

Как применяют в настоящем документе, "обычное антитело" относится к антителу, содержащему две тяжелых цепи (которые можно обозначать Н и Н'), две легких цепи (которые можно обозначать L и L') и два участка связывания, где каждая тяжелая цепь может представлять собой полноразмерную тяжелую цепь иммуноглобулина или ее любую функциональную область, которая сохраняет антигенсвязывающие свойства (например, тяжелая цепь включает, но не ограничивается цепями V_H, цепи V_H-C_H1 и цепями VH-CH1-CH2-CH3), а каждая легкая цепь может представлять собой полноразмерную легкую цепь или ее любую функциональную область (например, легкие цепи включают, но не ограничиваются цепями V_L и цепями V_L-C_L). Каждая тяжелая цепь (Н и Н') образует пару с одной легкой цепью (L и L', соответственно).

Как применяют в настоящем документе, полноразмерное антитело представляет собой антитело с двумя полноразмерными тяжелыми цепями (например, VH-CH1-CH2-CH3 или VH-CH1-CH2-CH3-CH4) и двумя полноразмерными легкими цепями (VL-CL) и шарнирными областями, например, антитела человека, продуцируемые в естественных условиях секретирующими антитела B-клетками, и антитела с теми же доменами, получаемые синтетически.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент Fv антитела состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) и одного вариабельного домена легкой цепи (V_L), связанных посредством нековалентных взаимодействий.

Как применяют в настоящем документе, dsFv относится к Fv со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью, стабилизирующей пару VH-VL.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент Fd представляет собой фрагмент антитела, содержащий вариабельный домен (VH) и один домен константной области (CH1) тяжелой цепи антитела.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент Fab представляет собой фрагмент антитела, полученный расщеплением полноразмерного иммуноглобулина папаином, или фрагмент с той же структурой, но полученный синтетически, например, рекомбинантными способами. Фрагмент Fab содержит легкую цепь (содержащую VL и CL) и другую цепь, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и один домен константной области тяжелой цепи (C_H1).

Как применяют в настоящем документе, фрагмент F(ab')₂ представляет собой фрагмент антитела, полученный расщеплением иммуноглобулина пепсином при pH 4,0-4,5, или фрагмент с той же структурой, но полученный синтетически, например, рекомбинантными способами. Фрагмент F(ab')₂, по существу, содержит два фрагмента Fab, где каждая часть тяжелой цепи содержит несколько дополнительных аминокислот, включающих остатки цистеина, которые формируют дисульфидные связи, соединяющие два фрагмента.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент Fab' представляет собой фрагмент, содержащий половину (одну тяжелую цепь и одну легкую цепь) фрагмента F(ab')2.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент Fd' представляет собой фрагмент антитела, содержащий часть одной тяжелой цепи фрагмента F(ab')2.

Как применяют в настоящем документе, фрагмент Fv' представляет собой фрагмент, содержащий только домены V_H и V_L молекулы антитела.

Как применяют в настоящем документе, hsFv относится к фрагментам относится антител, в которых константные домены, в норме присутствующие во фрагменте Fab, заменены гетеродимерным суперспиральным доменом (см., например, Arndt et al. (2001), J. Mol. Biol. 7:312:221-228).

Как применяют в настоящем документе, фрагмент scFv относится к фрагменту антитела, который содержит вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH), ковалентно связанные полипептидным линкером в любом порядке. Линкер имеет такую длину, что два вариабельных домена без существенных затруднений соединяются друг с другом. Примерами линкеров являются остатки (Gly-Ser)n с включенными для увеличения растворимости остатками Glu или Lys.

Как применяют в настоящем документе, термин "производное" относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность антитела к PCB или его фрагмента, модифицированную, например, посредством введения замен, делеций или добавления аминокислотных остатков, а также посредством ковалентного присоединения к полипептиду молекул любого типа (например, посредством

- 14 027835

гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточными лигандами или другими белками). Производные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно модифицировать посредством химической модификацией известными специалистам в данной области способами, включая, но не ограничиваясь специфическим химическим расщеплением, ацетилированием, формилированием. Кроме того, производные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать одну или более неклассических аминокислот. Как правило, полипептидное производное обладает схожими или идентичными функциями по сравнению с антителом к PCB или его антигенсвязывающем фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, (например, нейтрализация PCB).

Как применяют в настоящем документе, фраза "полученный из", относящаяся к фрагментам антител, получаемым из другого антитела, такого как моноклональное антитело, относится к конструированию фрагментов антител (например, фрагментов Fab, F(ab'), F(ab')2, одноцепочечных фрагментов Fv (scFv), фрагментов Fv, dsFv, диател, фрагментов Fd и Fd'), которые сохраняют специфичность связывания исходного антитела. Такие фрагменты можно получать рядом известных в данной области способов, включая, но не ограничиваясь ферментативным расщеплением, химическим сшиванием, рекомбинантными способами или их комбинацией. Как правило, получаемый фрагмент антитела обладает идентичными или по существу идентичными вариабельной областью тяжелой цепи (V_H) и вариабельной областью легкой цепи (V_L) с исходным антителом, так что фрагмент антитела и исходное антитело связывают один и тот же эпитоп.

Как применяют в настоящем документе, "исходное антитело" или "антитело-источник" относится к антителу, из которого получают фрагмент антитела (например, фрагменты Fab, F(ab'), F(ab')2, одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd и Fd').

Как применяют в настоящем документе, термин "эпитоп" относится к любой антигенной детерминанте антигена, с которой связывается паратоп антитела. Как правило, эпитопы содержат химически активные поверхностные группировки молекул, такие как боковые цепи аминокислот или сахаров, и, как правило, имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические характеристики заряда.

Как применяют в настоящем документе, химерный полипептид относится к полипептиду, который содержит части по меньшей мере из двух различных полипептидов или из двух несмежных частей одного полипептида. Таким образом, как правило, химерный полипептид содержит последовательность аминокислотных остатков из всего или части одного полипептида и последовательность аминокислот из всего или части другого полипептида. Две части можно связывать непосредственно или опосредовано и их можно связывать пептидными связями, другими ковалентными связями или другими нековалентными взаимодействиями достаточной силы с поддержанием целостности значительной части химерного полипептида в равновесных условиях и в физиологических условиях, таких как в изотоническом буферном растворе с pH 7. Для целей настоящего документа химерные полипептиды включают полипептиды, содержащие все антитело к PCB или его часть, связанные с другим полипептидом, таким как, например, домен мультимеризации, константный домен или каркасная область гетерологичного иммуноглобулина, диагностический или терапевтический полипептид.

Как применяют в настоящем документе, слитый белок представляет собой полипептид, сконструированный так, чтобы содержать последовательность аминокислот, соответствующих двум различным полипептидам, которые связаны вместе, например, посредством экспрессии слитого белка с вектора, содержащего две нуклеиновые кислоты, кодирующие два полипептида, расположенные в непосредственной близости, например, рядом одна с другой по длине вектора. Как правило, слитый белок, предоставляем по настоящему документу, относится к полипептиду, содержащему полипептид с аминокислотной последовательностью антитела или антигенсвязывающего фрагмента, и полипептид или пептид с аминокислотной последовательностью гетерологичного полипептида или пептида, например, такого как диагностический или терапевтический полипептид. Таким образом, слитый белок относится к химерному белку, содержащему два белка или части из двух или более белков или пептидов, которые непосредственно или опосредованно связаны пептидной связью. Две молекулы в конструкции могут примыкать друг к другу или могут быть разделены линкером или спейсерным полипептидом. Спейсер может кодировать полипептид, изменяющий свойства полипептида, такие как растворимость или внутриклеточное перемещение.

Как применяют в настоящем документе, "линкерный" или "спейсерный" пептид относится к коротким последовательностям аминокислот, которая связывают две полипептидные последовательности (или к нуклеиновой кислоте, кодирующей такую аминокислотную последовательность). "Пептидный линкер" относится к короткой последовательности аминокислот, связывающей две полипептидные последовательности. Примеры полипептидных линкеров включают линкеры, связывающие с антителом домен трансдукции белка, или линкеры, связывающие две цепи антитела в синтетическом фрагменте антитела, таком как фрагмент scFv. Линкеры хорошо известны, и в предоставляемых способах можно использовать любой известный линкер. Примеры полипептидных линкеров включают аминокислотные последовательности (Gly-Ser)_n с включенными для увеличения растворимости остатками Glu или Lys. В настоящем

- 15 027835

документе описаны другие примеры линкеров, и в предоставляемых композициях и способах можно использовать любой из этих и других известных линкеров.

Как применяют в настоящем документе, "шарнирная область антитела" или "шарнирная область" относится к области полипептида, которая в природе присутствует в тяжелых цепях антител γ-, δ- и αизотипов между доменами C_H1 и C_H2, и которая не имеет гомологии с другими доменами антител. Эта область богата остатками пролина и придает антителам IgG, IgA и IgD гибкость, позволяя двум "плечам" (каждое из которых содержит один участок связывания антитела) части Fab быть подвижными, принимая при связывании антигена по отношению друг к другу различные углы. Такая гибкость позволяет плечам Fab перемещаться для выравнивания участков связывания антитела для взаимодействия с эпитопами на поверхности клеток или с другими антигенами. Две внутрицепочечные дисульфидные связи в шарнирной области стабилизируют взаимодействия между двумя тяжелыми цепями. В некоторых вариантах осуществления, предоставляемых по настоящему документу, синтетически получаемые фрагменты антител содержат одну или более шарнирных областей, например, для содействия стабилизации посредством взаимодействий двух цепей антитела. Шарнирные области являются примерами доменов димеризации.

Как применяют в настоящем документе, диатела представляет собой димерные scFv; как правило, диатела содержат более короткие пептидные линкеры по сравнению с scFv, что предпочтительно димеризуются.

Как применяют в настоящем документе, гуманизированные антитела относятся к антителам, модифицированным включением "человеческих" последовательностей аминокислот, так что введение человеку не вызывает иммунного ответа. Как правило, гуманизированное антитело содержат определяющие комплементарность области (CDR), получаемые из иммуноглобулинов видов, не являющихся человеком, а остальная часть молекулы антитела, как правило, получена из иммуноглобулина человека. Способы получения таких антител известны. Например, можно изменять ДНК, кодирующую моноклональное антитело, посредством технологии рекомбинантных ДНК с кодированием антитела, в котором состав аминокислот невариабельных областей основан на антителах человека. Способы определения таких фрагментов известны, включая компьютерные программы, разработанные для определения вариабельных и невариабельных областей иммуноглобулинов.

Как применяют в настоящем документе, идиотип относится к набору из одной или более антигенных детерминант, характерных для вариабельной области молекулы иммуноглобулина.

Как применяют в настоящем документе, антиидиотипическое антитело относится к антителу к антигенспецифической части последовательности антитела или T-клеточного рецептора. Антиидиотипическое антитело ингибирует специфический иммунный ответ.

Как применяют в настоящем документе, домен Ig представляет собой домен, признаваемый таким специалистами в данной области, который отличается характерной иммуноглобулиновой (Ig) укладкой, содержащей два β-слоя, каждый из которых содержит антипараллельные β-цепи аминокислот, связанные петлями. Два β-слоя в Ig-укладке удерживаются друг рядом с другом гидрофобными взаимодействиями и консервативными внутрицепочечными дисульфидными связями. Кроме того, отдельные домены иммуноглобулина в цепи антитела можно отличать на основе их функций. Например, легкая цепь содержит один домен вариабельной области (VL) и один домен константной области (CL), тогда как тяжелая цепь содержит один домен вариабельной области (VH) и три или четыре домена константной области (CH). Каждый домен V_L, C_L, V_H и C_H представляет собой пример иммуноглобулинового домена.

Как применяют в настоящем документе, вариабельный домен или вариабельная область представляют собой конкретный домен Ig тяжелой или легкой цепей антитела, содержащий аминокислотную последовательность, варьирующую в различных антителах. Каждая легкая цепь и каждая тяжелая цепь содержат по одному домену вариабельной области, VL и VH соответственно. Вариабельные домены обеспечивают антигенную специфичность, и, таким образом, отвечают за распознавание антигена. Каждая вариабельная область содержит области CDR, которые являются частью домена антигенсвязывающего участка, и каркасные области (FR).

Как применяют в настоящем документе, "антигенсвязывающий домен", "антигенсвязывающий участок", "область связывания антигена" и "связывающий область антитела" используют как синонимы для обозначения домена антитела, который распознает и физически взаимодействует с распознаваемым антигеном. Природная полноразмерная молекула обычного антитела содержит два обычных антигенсвязывающих участка, каждый из которых содержит части вариабельной области тяжелой цепи и части вариабельной области легкой цепи. Обычный антигенсвязывающий участок содержит петли, соединяющие антипараллельные β-цепи в доменах вариабельных областей. Антигенсвязывающие участки могут содержать другие части доменов вариабельных областей. Каждый обычный антигенсвязывающий участок содержит три гипервариабельных области тяжелой цепи и три гипервариабельных области легкой цепи. Гипервариабельные области также называют определяющими комплементарность областями (CDR).

Как применяют в настоящем документе, "гипервариабельная область", "HV", "определяющая комплементарность область", "CDR" и "CDR антитела" используют как синонимы для обозначения одной из

- 16 027835

нескольких частей в каждом вариабельной области, которые вместе формируют антигенсвязывающий участок антитела. Каждый домен вариабельной области содержит три CDR, обозначаемые CDR1, CDR2 и CDR3. Три CDR не являются смежными в линейной аминокислотной последовательности, но сближены в уложенном полипептиде. CDR расположены в петлях, связывающих параллельные тяжи β-листов вариабельного домена. Как описано в настоящем документе, специалист в данной области знает и может определить CDR на основе нумерации Kabat или Chothia (см., например, Kabat, E.A. et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, и Chothia, C. et al. (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917).

Как применяют в настоящем документе, каркасные области (FR) представляют собой домены в доменах вариабельных областей антитела, расположенных в β-слоях; области FR являются сравнительно более консервативными в отношении их аминокислотных последовательностей по сравнению с гипервариабельными областями.

Как применяют в настоящем документе, домен "константной области" представляет собой домен в тяжелой или легкой цепи антитела, который содержит последовательность аминокислот, сравнительно более консервативную, чем последовательность аминокислот домена вариабельной области. В молекулах обычных полноразмерных антител каждая легкая цепь содержит один домен константной области легкой цепи (CL), а каждая тяжелая цепь содержит один или более доменов константных областей тяжелой цепи (CH), которые включают CH1, CH2, CH3 и CH4. Полноразмерные изотипы IgA, IgG и IgD содержат CH1, CH2, CH3 и шарнирную область, тогда как IgE и IgM содержат CH1, CH2, CH3 и CH4. Домены CH1 и C_L продолжают плечо Fab молекулы антитела, таким образом, внося вклад во взаимодействии с антигеном и вращение плеч антитела. Константные области антител может выполнять эффекторные функции, включая, но не ограничиваясь, клиренсом антигенов, патогенов и токсинов, с которыми специфически связывается антитело, например, посредством взаимодействий с различными клетками, биомолекулами и тканями.

Как применяют в настоящем документе, функциональная область антитела представляет собой часть антитела, содержащая, по меньшей мере, домены VH, VL, CH (например, (CH1, CH2 и CH3)), CL или шарнирной области антитела или, по меньшей мере, их функциональные области.

Как применяют в настоящем документе, функциональная область домена VH представляет собой по меньшей мере часть полного домена V_H, которая сохраняет по меньшей мере часть специфичности связывания полного домена V_H (например, посредством сохранения одной или более CDR полного домена V_H), так что функциональная область домена V_H самостоятельно или в комбинации с другим доменом антитела (например, доменом V_L) или его фрагментом, связывает антиген. Примеры функциональных областей доменов VH представляют собой области, содержащие CDR1, CDR2 и/или CDR3 домена VH.

Как применяют в настоящем документе, функциональная область домена V_L представляет собой по меньшей мере часть полного домена VL, которая сохраняет по меньшей мере часть специфичности связывания полного домена VL (например, посредством сохранения одной или более CDR полного домена VL), так что функциональная область домена VL самостоятельно или в комбинации с другим доменом антитела (например, доменом VH) или его фрагментом, связывает антиген. Примеры функциональных областей доменов VL представляют собой области, содержащие CDR1, CDR2 и/или CDR3 домена VL.

Как применяют в настоящем документе, "специфически связывает" или "иммуноспецифически связывает" в отношении антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в настоящем документе используют взаимозаменяемо, и они относятся к способности антитела или антигенсвязывающего фрагмента формировать одну или более нековалентных связей с распознаваемым антигеном посредством нековалентных взаимодействий между участком(ами) связывания антитела и антигена. Антиген может представлять собой выделенный антиген или может быть представлен в вирусе. Как правило, антитело, которое иммуноспецифически связывается (или специфически связывается) с вирусным антигеном или с вирусом представляет собой антитело, которое связывается с вирусным антигеном (или с антигеном в вирусе или с вирусом) с константой аффинности K_a приблизительно 1х10⁷ M^-1 или 1х10⁸ М^-1, или более (или с константой диссоциации (K_d) 1х10^-7 М или 1х10^-8 М, или менее). Константы аффинности можно определять посредством стандартной методологии кинетических тестов для реакций антител, например, иммунологических анализов, поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Rich and Myszka (2000), Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998), Analyst. 123:1599), изотермического калориметрического титрования (ITC) и других известных анализов кинетического взаимодействия известных в данной области (см., например, Paul, Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, с 332-336 (1989), также для описания примеров применения способов SPR и ITC для расчета аффинности связывания антител к PCB см. патент США № 7229619). Оборудование и способы детекции и мониторинга скоростей связывания в реальном времени известны и являются коммерчески доступными (например, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000), Biochem. Soc. Trans. 27:335). Антитело, которое иммуноспецифически связывает вирусный антиген (или вирус) может с равной или меньшей аффинностью связывать другие пептиды, полипептиды или белки или вирусы. Как правило, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу,

- 17 027835

которые иммуноспецифически связывают белок F PCB (или вирус PCB), не реагируют перекрестно с другими антигенами или перекрестно реагируют с такими антигенами с существенно меньшей (по меньшей мере в 10-100 раз) аффинностью. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают определенные вирусные антигены (например, белок F PCB), можно определять, например, посредством иммунологических анализов, таких как радиоиммунный анализ (РИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), поверхностный плазмонный резонанс или другие способы, известные специалистам в данной области. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связывают эпитоп белка F PCB, как правило, представляют собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающие эпитоп (представленный в белке или вирусе) с большей аффинностью, чем любой перекрестно-реактивный эпитоп, как определяют экспериментальными способами, включающими, но не ограничивающимися иммунохимическими анализами, поверхностным плазмонным резонансом или другими способами, известными специалистам в данной области. Иммуноспецифическое связывание выделенного белка PCB (например, рекомбинантно полученного белка), такого как белок F PCB, не обязательно означает, что антитело будет демонстрировать такие же иммуноспецифическое связывание и/или нейтрализацию вируса. Такие измерения и свойства отличаются. Можно определять аффинность антител или антигенсвязывающих фрагментов к вирусу или антигену, представленному в вирусе. Для целей настоящего документа, при описании аффинности или сходных понятий следует определять мишень, такую как выделенный белок или вирус.

Как применяют в настоящем документе, термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать взаимодействия в режиме реального времени посредством детекции изменений концентрации белков на матрице биосенсора, например, с использованием системы Biacore (GE Healthcare, Life Sciences).

Как применяют в настоящем документе, "поливалентное" антитело представляет собой антитело, содержащее два или более антигенсвязывающих участков. Поливалентные антитела включают двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентные, пятивалентные, шестивалентные, семивалентные антитела или антитела большей валентности.

Как применяют в настоящем документе, "моноспецифическое" антитело представляет собой антитело, которое содержит два или более антигенсвязывающих участков, где каждый антигенсвязывающий участок иммуноспецифически связывает один и тот же эпитоп.

Как применяют в настоящем документе, "полиспецифическое" антитело представляет собой антитело, которое содержит два или более антигенсвязывающих участков, где по меньшей мере два антигенсвязывающих участка иммуноспецифически связывают различные эпитопы.

Как применяют в настоящем документе, "биспецифическое" антитело представляет собой полиспецифическое антитело, которое содержит два или более антигенсвязывающих участков и может иммуноспецифически связывать два различных эпитопа.

"Триспецифическое" антитело представляет собой полиспецифическое антитело, которое содержит три или более антигенсвязывающих участков и может иммуноспецифически связывать три различных эпитопа, "тетраспецифическое" антитело представляет собой полиспецифическое антитело, которое одержит четыре или более антигенсвязывающих участков и может иммуноспецифически связывать четыре различных эпитопа, и так далее.

Как применяют в настоящем документе, "гетеробивалентное" антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое содержит два антигенсвязывающих участка, где антигенсвязывающие участки иммуноспецифически связывают различные эпитопы.

Как применяют в настоящем документе, "гомобивалентное" антитело представляет собой моноспецифическое антитело, которое содержит два антигенсвязывающих участка, где антигенсвязывающие участки иммуноспецифически связывают один и тот же эпитоп. Гомобивалентные антитела включают, но не ограничиваются обычными полноразмерными антителами, сконструированными или синтетическими полноразмерными антителами, любыми мультимерами двух одинаковых антигенсвязывающих фрагментов или любыми мультимерами двух антигенсвязывающих фрагментов, содержащих один и тот же антигенсвязывающий домен.

Как применяют в настоящем документе, домен мультимеризации относится к последовательности аминокислот, которая способствует стабильному взаимодействию полипептидной молекулы с одной или более дополнительными полипептидными молекулами, каждая из которых содержит комплементарный домен мультимеризации, который может являться таким же или другим доменом мультимеризации, формирующий стабильный мультимер с первым доменом. Как правило, полипептид связан с доменом мультимеризации непосредственно или опосредовано. Примеры доменов мультимеризации включают последовательности иммуноглобулинов или их частей, лейциновые застежки, гидрофобные области, гидрофильные области и сочетаемые домены белок-белковых взаимодействий. Например, домен мультимеризации может представлять собой константную область или домен иммуноглобулина, например, такие как домен Fc или его части из IgG, включая подтипы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, IgA, IgE, IgD и IgM, и его модифицированные формы.

Как применяют в настоящем документе, домен димеризации представляет собой домен мультиме- 18 027835

ризации, который способствует взаимодействию двух полипептидных последовательностей (таких как, но не ограничиваясь цепями антител). Домен димеризации включает, но не ограничивается аминокислотной последовательностью, содержащей остаток цистеина, который способствует формирование дисульфидной связи между двумя полипептидными последовательностями, такой как вся полноразмерная шарнирная область антитела или ее часть, одна или более последовательностей димеризации, которые представляют собой последовательности аминокислот, известные, как способствующие взаимодействию между полипептидами (например, лейциновые застежки, застежки GCN4).

Как применяют в настоящем документе, "Fc" или "область Fc", или "домен Fc" относятся к полипептиду, содержащему константная область тяжелой цепи антитела за исключением первого домена константной области иммуноглобулина. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgE или к последним трем доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM. Необязательно область Fc может содержать весь гибкий шарнир с N-конца этих доменов или его часть. У IgA и IgM Fc может содержать J-цепь. Для иллюстративного домена Fc из IgG Fc содержит иммуноглобулиновые домены Cy2 и Cy3, и, необязательно, шарнир между Cy1 и Cy2 или его часть. Границы области Fc могут варьировать, но, как правило, включают по меньшей мере часть шарнирной области. Кроме того, Fc также содержит любые аллельные или видовые варианты или любой вариант или модифицированную форму, такие как любые вариант или модифицированную форму, которые изменяют связывание с FcR или изменяют опосредованные Fc эффекторные функции.

Как применяют в настоящем документе, "химерная Fc" относится к химерному полипептиду, в котором с областью Fc или ее производным непосредственно или опосредовано связаны один или более полипептидов. Как правило, химерная Fc комбинирует область Fc иммуноглобулина с другим полипептидом, таким как, например, фрагмент антитела к PCB. Производные полипептида Fc или модифицированные полипептиды Fc известны специалистам в данной области.

Как применяют в настоящем документе, "домены белковой трансдукции" или "PTD" представляет собой пептидные домены, которые можно конъюгировать с белком, таким как антитело, предоставляемое по настоящему документу, для обеспечения связывания белка с клеткой-мишенью и/или захвата его клеткой-мишенью.

Как применяют в настоящем документе, "метка" или "эпитопная метка" относится к последовательности аминокислот, как правило, добавляемой на N- или C-конец полипептида, такого как антитело, предоставляемое по настоящему документу. Включение метки, слитой с полипептидом, может облегчать очистку и/или детекцию полипептида. Как правило, метка или полипептидная метка относятся к полипептиду, который содержит достаточное количество остатков для формирования эпитопа, распознаваемого антителом, или может служить для детекции или очистки, но в то же время является достаточно коротким, чтобы не препятствовать активности химерного полипептида, с которым они связаны. Как правило, полипептидная метка является в достаточной степени уникальной, чтобы антитело, которое ее специфически связывает, не проявляло значительного перекрестного связывания с эпитопами полипептида, к которому она присоединена. Как правило, подходящий полипептидная метка содержит по меньшей мере 5 или 6 аминокислотных остатков, а, как правило, приблизительно 8-50 аминокислотных остатков, как правило, 9-30 остатков. Метки могут быть связаны с одним или более химерными полипептидами в мультимере и обеспечивают детекцию мультимера или его выделение из образца или смеси. Такие метки хорошо известны и их можно легко синтезировать и конструировать. Примеры полипептидных меток включают метки, которые используют для аффинной очистки, и включают метки His, полипептидную метку гемагглютинина (НА) гриппа и антитело 12СА5 к ней (Field et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 5:2159-2165); метку c-myc и антитела 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9Е10 к ней (см., например, Evan et al. (1985), Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616) и метку гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса и антитела к ней (Paborsky et al. (1990), Protein Engineering 5:547-553 (1990). Как правило, антитела, используемые для детекции маркированных эпитопной меткой антител, указывают в настоящем документе как вторичные антитела.

Как применяют в настоящем документе, "полипептид" относится к двум или более ковалентно связанным аминокислотам. Термины "полипептид" и "белок" используются в настоящем документе взаимозаменяемо.

Как применяют в настоящем документе, "пептид" относится к полипептиду, который включает от 2 до приблизительно или 40 аминокислот в длину.

Как применяют в настоящем документе, "аминокислота" представляет собой органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит две или более аминокислоты. Как применяют в настоящем документе, аминокислоты, содержащиеся в антителах, предоставляемых по настоящему документу, включают двадцать природных аминокислот (табл. 1), неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (например, аминокислоты, в которых α-углерод содержит боковую цепь). Как применяют в настоящем документе, аминокислоты, содержащиеся в различных аминокислотных последовательностях полипептидов в настоящем документе, идентифицируют в соответствии с их хорошо известными трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами (см. табл. 1). Нуклеоти- 19 027835

ды, которые содержаться в различных молекулах нуклеиновых кислот и их фрагментах, обозначены стандартными однобуквенными обозначениями, как правило, используемыми в данной области.

Как применяют в настоящем документе, "аминокислотный остаток" относится к аминокислоте, формируемой при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по его пептидным связям. Аминокислотные остатки, описываемые в настоящем документе, как правило, находится в форме 'Ъ"-изомера. Вместо любого L-аминокислотного остатка можно использовать остатки в форме "D''-изомера, при условии что полипептид сохраняется желаемое функциональное свойство. NH2 относится к свободной аминогруппе, находящейся на N-конце полипептида. COOH относится к свободной карбоксильной группе, находящейся на С-конце полипептида. В табл. 1 представлены сокращения остатков аминокислот в соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов, описанной в J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968), принятой на 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822.

Таблица 1

Таблица соответствий

ОБОЗНАЧЕНИЕ
однобуквенное	трехбуквенное	АМИНОКИСЛОТА
Y	Туг	Тирозин
G	Gly	Глицин
F	Phe	Фенилаланин
М	Met	Метионин
А	Ala	Аланин
S	Ser	Серин
I	lie	изолейцин
L	Leu	Лейцин
Т	Thr	Треонин
V	Val	Валин
Р	Pro	Пролин
к	Lys	Лизин
н	His	Гистидин
Q	Gin	Глутамин
Е	Glu	Глутаминовая кислота
Z	Glx	Глутаминовая кислота и/или глутамин
W	Trp	Триптофан
R	Arg	Аргинин
D	Asp	Аспарагиновая кислота
N	Asn	Аспарагин
В	Asx	Аспарагиновая кислота и/или аспарагин
С	Cys	Цистеин
X	Xaa	Неизвестная или другая

Все последовательности аминокислотных остатков, представленные в настоящем документе посредством формулы, ориентированы слева направо в общепринятом направлении от N-конца к С-концу. Кроме того, фраза "аминокислотный остаток" определена для включения аминокислот, перечисленных в таблице соответствий (табл. 1), модифицированных и необычных аминокислот. Кроме того, тире в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков указывает на пептидную связь с дополнительной последовательностью из одного или более аминокислотных остатков или с аминоконцевой группой, такой как NH2, или с карбоксильной группой, такой как COOH.

В пептиде или белке можно проводить подходящие консервативные замены аминокислот, известные специалистам в данной области, без изменения биологической активности получаемой молекулы. Специалистам в данной области очевидно, что, как правило, одна замена аминокислоты в несущественной области полипептида по существу не изменяет биологическую активность (см., например, Watson at al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub., p. 224).

Такие замены можно проводить в соответствии с примерами замен, указанными в табл. 2, следующим образом.

- 20 027835

Таблица 2

Также допустимы другие замены, и их можно определять эмпирически или в соответствии с другими известными консервативными или неконсервативными заменами.

Как применяют в настоящем документе, "природные аминокислоты" относятся к 20 Lаминокислотам, которые встречаются в полипептидах.

Как применяют в настоящем документе, термин "неприродная аминокислота" относится к органическому соединению со структурой, сходной с природной аминокислотой, но структурно модифицированной для имитации структуры и реакционной способности природной аминокислоты. Таким образом, неприродные аминокислоты, включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот, отличные от 20 природных аминокислот, и включают, но не ограничиваются D-изостереомерами аминокислот. Примеры неприродных аминокислот известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются 2-аминоадипиновой кислотой (AaD), 3-аминоадипиновой кислотой (Baad), в-аланином/βаминопропионовой кислотой (Bala), 2-аминомасляной кислотой (Abu), 4-аминомасляной кислотой/пиперидиновой кислотой (4Abu), 6-аминокапроновой кислотой (Аср), 2-аминогептановой кислотой (Ahe), 2-аминоизомасляной кислотой (Aib), 3-аминоизомасляной кислотой (Baib), 2-аминопимелиновой кислотой (Apm), 2,4-диаминомасляной кислотой (Dbu), десмозином (Des), 2,2'-диаминопимелиновой кислотой (Dpm), 2,3-диаминопропионовой кислотой (Dpr), N-этилглицином (EtGly), N-этиласпарагином (EtAsn), гидроксилизином (Hyl), аллогидроксилизином (Ahyl), 3-гидроксипролином (3Hyp), 4гидроксипролином (4Hyp), изодесмозином (Ide), аллоизолейцином (Aile), N-метилглицином, саркозином (MeGly), N-метилизолейцином (MeIle), 6-№метиллизином (MeLys), N-метилвалином (MeVal), норвалином (Nva), норлейцином (Nle) и орнитином (Orn).

Как применяют в настоящем документе, молекула "природного полипептида" или "природной нуклеиновой кислоты" представляет собой молекулу полипептида или нуклеиновой кислоты, соответственно, которые встречаются в природе. Природная молекула полипептида или нуклеиновой кислоты может представлять собой форму полипептида или нуклеиновой кислоты дикого типа. Природная молекула полипептида или нуклеиновой кислоты может представлять собой преобладающую форму полипептида или любой ее аллельный или другой природный вариант. Варианты молекул полипептидов и нуклеиновых кислот, предоставляемые по настоящему документу, могут по сравнению с молекулами природных полипептидов и нуклеиновых кислот содержать модификации.

Как применяют в настоящем документе, форма молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты дикого типа представляет собой форму, кодируемую геном или кодирующей последовательностью, кодируемой геном. Как правило, форма гена дикого типа, кодируемая, таким образом, молекула, не содержит мутации или другие модификации, которые изменяют ее функцию или структуру. Термин дикий тип также включает в себя формы с аллельными вариантами, встречающимися у одного вида и между видами. Как применяют в настоящем документе, преобладающая форма молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты относится к форме молекулы, которая представляет собой основную форму, продуцируемую с гена. "Преобладающая форма" варьирует от источника к источнику. Например, различные типы клеток или тканей может продуцировать различные формы полипептидов, например, за счет альтернативного сплайсинга и/или альтернативного процессинга белка. В каждом типе клеток или тканей "преобладающей формой" могут являться различные полипептиды.

- 21 027835

Как применяют в настоящем документе, "аллельный вариант" или "аллельная вариация" относятся к любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же локус хромосомы. Аллельная вариация в природе возникает в результате мутаций и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Термин "аллельный вариант" также используют в настоящем документе для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена. Как правило, эталонная форма гена кодирует форму дикого типа и/или преобладающую форму полипептида в популяции или у одного эталонного представителя вида. Как правило, аллельные варианты, которые включают варианты между видами и внутри видов, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95% или более аминокислот идентичны форме дикого типа и/или преобладающей форме у того же вида; степень идентичности зависит от гена и от того, является ли сравнение межвидовым или внутривидовым. Как правило, внутривидовые аллельные варианты по меньшей мере приблизительно на 80, 85, 90 или 95% или более идентичны форме дикого типа и/или преобладающей форме, включая идентичность с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида на 96, 97, 98, 99% или более. Как правило, указание аллельного варианта в настоящем документе относится к вариациям в белках у представителей одного и того же вида.

Как применяют в настоящем документе, термин "аллель", который в настоящем документе взаимозаменяемо используют с термином "аллельный вариант", относится к альтернативным формам генов или их частей. Аллели занимают один и тот же локус или положение в гомологичных хромосомах. Когда у индивидуума присутствуют два одинаковых аллеля гена, индивидуум, называют гомозиготой по этому гену или аллелю. Когда у индивидуума присутствуют два различных аллеля гена, индивидуума называют гетерозиготой по гену. Аллели конкретного гена могут отличаться друг от друга одним нуклеотидом или более нуклеотидами и могут включать замены, делеции и вставки нуклеотидов. Аллель гена также может быть формой гена, содержащей мутацию.

Как применяют в настоящем документе, "видовой вариант" относятся к вариантам полипептида у различных видов, включая различные виды млекопитающих, такие как мышь и человек, и видов микроорганизмов, таких как вирусы и бактерии.

Как применяют в настоящем документе, "домен" полипептида представляет собой часть полипептида (последовательность из трех или более, как правило, 5, 10 или более аминокислот), которая является структурно и/или функционально различимой или определимой. Примером полипептидного домена является часть полипептида, которая может самостоятельно формировать уложенную структуру в полипептиде, состоящую из одного или более структурных мотивов (например, комбинаций α-спиралей и/или β-цепей, связанных петлевыми областями), и/или которую распознают по конкретной функциональной активности, такой как ферментативная активность, димеризация или связывание антигена. Полипептид может содержать один или более, как правило, более одного, различных доменов. Например, полипептид может содержать один или более структурных доменов и один или более функциональных доменов. Отдельный полипептидный домен можно различить на основе структуры и функции. Домен может содержать непрерывные линейные последовательности аминокислот.

Альтернативно домен может содержать множество не следующих непрерывно друг за другом участков аминокислот, которые не являются смежными в линейной последовательности аминокислот полипептида. Как правило, полипептид содержит несколько доменов. Например, каждая тяжелая цепь и легкая цепь молекулы антитела содержит несколько иммуноглобулиновых (Ig) доменов, каждый из приблизительно из 110 аминокислот в длину.

Специалистам в данной области очевидно знакомы с полипептидными доменами и могут идентифицировать их на основании их структурной и/или функциональной гомологии с другими такими доменами. Для иллюстрации в настоящем документе приведены определения, но следует понимать, что специалист в данной области может определить конкретные домены по имени. При необходимости для определения доменов можно использовать подходящее программное обеспечение.

Как применяют в настоящем документе, функциональная область полипептида представляет собой область полипептида, которая содержит по меньшей мере один функциональный домен (который обеспечивает конкретную функцию, такую как способность взаимодействовать с биомолекулой, например, посредством связывания антигена, связывания ДНК, связывания лиганда или димеризации или посредством ферментативной активности, например, киназной активности или протеолитической активности); примеры функциональных областей полипептидов представляют собой домены антител, такие как V_H, V_L, C_H, C_L, и их части, например, CDR, включающие CDR1, CDR2 и CDR3, или антигенсвязывающие части, такие как области связывания антител.

Как применяют в настоящем документе, структурная область полипептида представляет собой область полипептида, содержащую по меньшей мере один структурный домен.

Как применяют в настоящем документе, "свойство" полипептида, такого как антитело, относится к любому свойству, демонстрируемому полипептидом, включая, но не ограничиваясь специфичностью связывания, структурной конфигурацией или конформацией, стабильностью белка, устойчивостью к

- 22 027835

протеолизу, конформационной стабильностью, тепловой стабильностью и устойчивостью к условиям pH. Изменения свойств могут изменить "активность" полипептида. Например, изменения специфичности связывания полипептида антитела может изменить способность к связыванию антигена и/или различные видов активности связывания, такие как аффинность или авидность, или активность полипептида in vivo.

Как применяют в настоящем документе, "активность" или "функциональная активность" полипептида, такого как антитело, относится к любой активности, проявляемой полипептидом. Такую активность можно определять эмпирически. Примеры активности включают, но не ограничиваются способностью взаимодействовать с биомолекулой, например, посредством связывания антигена, связывания ДНК, связывания лиганда или димеризации, или ферментативной активностью, например, киназной активностью или протеолитической активностью. Для антител (включая фрагменты антител) активность включает, но не ограничивается способностью специфически связывать конкретный антиген, аффинностью связывания антигена (например, высокой или низкой аффинностью), авидностью связывания антигена (например, высокой или низкой авидностью), скоростью присоединения, скоростью диссоциации, эффекторными функциями, такими как способность обеспечивать нейтрализацию или клиренс антигена, нейтрализацией вируса и активностью in vivo, такой как способность предотвращать инфекцию или инвазию патогена или обеспечивать клиренс или проникновение в определенную ткань, или жидкость, или клетки в организме. Активность можно анализировать in vitro или in vivo с использованием известных анализов, таких как ELISA, проточная цитометрия, поверхностный плазмонный резонанс, или эквивалентных анализов для измерения скорости связывания или скорости диссоциации, иммуногистохимии и иммунофлуоресцентной гистологии и микроскопии, клеточных анализов, проточной цитометрии и анализов связывания (например, анализов пэннинга). Например, для антител активность можно анализировать посредством измерения аффинностей, авидности связывания и/или коэффициентов связывания (например, скоростей связывания/диссоциации) и других видов активности in vitro, или посредством измерения различных видов действия in vivo, таких как иммунное действие, например, клиренс антигена, проникновение или локализация антител в тканях, защита от заболевания, например, инфекции, титр антител в сыворотке или других жидкостях, или другими анализами, хорошо известными в данной области. Результаты таких анализов, которые демонстрируют, что полипептид проявляет активность, могут коррелировать с активностью полипептида in vivo, где активность in vivo можно обозначать как терапевтическую активность или биологическую активность. Активность модифицированного полипептида может представлять собой любой уровень процента активности немодифицированного полипептида, включая, но не ограничиваясь 1% активности, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или большей активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом. Анализы для определения функциональности или активности модифицированных (например, вариантов) антител хорошо известны в данной области.

Как применяют в настоящем документе, термин "терапевтическая активность" относится к активности терапевтического полипептида in vivo. Как правило, терапевтическая активность представляет собой активность, которую используют для лечения заболевания или патологического состояния. Терапевтическая активность модифицированного полипептида может составлять любую величину относительно терапевтической активности немодифицированного полипептида, включая, но не ограничиваясь, 1% активности, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или большей терапевтической активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом.

Как применяют в настоящем документе, фраза "проявляет по меньшей мере один вид активности" или "сохраняет по меньшей мере один вид активности" относится к активности, проявляемой модифицированным полипептидом, таким как вариант полипептида, получаемый предоставляемыми способами, такой как модифицированное антитело, например, вариант антитела, или другой терапевтический полипептид (например, модифицированное антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент), по сравнению с полипептидом-мишенью или немодифицированным полипептидом, который не содержит модификаций. Модифицированный полипептид или вариант полипептида, которые сохраняют активность полипептида-мишени, может проявлять улучшенную активностью или сохранять активность немодифицированного полипептида. В некоторых случаях модифицированный полипептид или вариант полипептида могут сохранять активность, которая возрастает по сравнению с полипептидом-мишенью или немодифицированным полипептидом. В некоторых случаях модифицированный полипептид или вариант полипептида могут сохранять активность, которая снижается по сравнению с немодифицированным полипептидом или полипептидом-мишенью. Активность модифицированного полипептида или варианта полипептида может составлять любой уровень процента активности немодифицированного полипептида или полипептида-мишени, включая, но не ограничиваясь, 1% активности, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или большей активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом или полипептидом-мишенью. В других вариантах осуществления активность по сравнению с немодифицированным полипептидом или полипептидом-мишенью может изменяться по меньшей мере приблизительно в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 раз или более. Анализы для определения сохранения активности зависят от активности, которую необходимо сохранять. Такие анализы можно проводить in

- 23 027835

vitro или in vivo. Активность можно измерять, например, с использованием известных в данной области и описанных в приведенных ниже примерах анализов активности, включая, но не ограничиваясь ELISA и пэннингом. Активность модифицированного полипептида или варианта полипептида по сравнению с немодифицированным или полипептидом-мишенью также можно оценивать как терапевтическую или биологическую активность in vivo или как результат после введения полипептида.

Как применяют в настоящем документе, термин "анализ" относятся к качественному и количественному определению в смысле получения абсолютной величины активности протеазы или ее домена, присутствующих в образце, а также к получению индекса, отношения, процента, визуального показателя или другой величины, указывающей на уровень активности. Анализ может быть прямым или непрямым и химические молекулы, детектируемые фактически, конечно же необязательно должны быть самими продуктами протеолиза, но могут представлять собой, например, их производное или какое-либо дополнительное вещество. Например, детекцию продукта расщепления белка системы комплемента можно проводить посредством SDS-PAGE и окрашивания белков Кумасси синим.

Как применяют в настоящем документе, "нуклеиновая кислота" означает по меньшей мере два связанных нуклеотида или производных нуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК), связанных вместе, как правило, фосфодиэфирными связями. Также в термин "нуклеиновая кислота" включают аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК), тиофосфатную ДНК и другие такие аналоги и производные или их комбинации. Нуклеиновые кислоты также включают производные ДНК и РНК, содержащие, например, аналоги нуклеотидов или "каркасные" связи, отличные от фосфодиэфирной связи, например, фосфотриэфирную связь, фосфорамидатную связь, тиофосфатную связь, тиоэфирную связь или пептидную связь (в пептидной нуклеиновой кислоте). Термин также включает в себя эквиваленты, производные, варианты и аналоги РНК или ДНК, получаемые из аналогов нуклеотидов, одноцепочечные (смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные нуклеиновые кислоты. Дезоксирибонуклеотиды включают дезоксиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин. В РНК урациловое основание представляет собой уридин.

Нуклеиновые кислоты могут содержать аналоги нуклеотидов, включающие, например, нуклеотиды с измененной массой, которые позволяют различать молекулы нуклеиновых кислот по массе; нуклеотиды, содержащие детектируемую метку, такую как флуоресцентная, радиоактивная, люминесцентная или хемилюминесцентная метки, которые позволяют детектировать молекулы нуклеиновых кислот; или нуклеотиды, содержащие реакционноспособную группу, такую как биотиновая или тиольная группа, что облегчает иммобилизацию молекулы нуклеиновой кислоты на твердой подложке. Нуклеиновые кислоты также могут содержать одну или более связей в каркасе, которые являются селективно расщепляемыми, например, химически, ферментативно или фотолитически расщепляемыми. Например, нуклеиновая кислота может содержать один или более дезоксирибонуклеотидов с последующими одним или более рибонуклеотидами, за которыми могут следовать один или более дезоксирибонуклеотидов, такая последовательность является расщепляемой по рибонуклеотидной последовательности посредством основного гидролиза. Нуклеиновая кислота также может содержать одну или более связей, которые относительно устойчивы к расщеплению, например, химерный олигонуклеотидный праймер может содержать нуклеотиды, связанные пептидными связями нуклеиновых кислот, и по меньшей мере один нуклеотид на 3'конце, связанный фосфодиэфирной или другой подходящей связью и способный к элонгации полимеразой. Последовательности пептидных нуклеиновых кислот можно получать хорошо известными способами (см., например, Weiler et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:2792-2799).

Как применяют в настоящем документе, термины "полинуклеотид" и "молекула нуклеиновой кислоты" относятся к олигомеру или полимеру, содержащему по меньшей мере два связанных нуклеотида или производных нуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК), соединенных вместе, как правило, фосфодиэфирной связью. Полинуклеотиды также включают производные ДНК и РНК, содержащие, например, аналоги нуклеотидов, или "каркасные" связи, отличные от фосфодиэфирной связи, например, фосфотриэфирную связь, фосфорамидатную связь, тиофосфатную связь, тиоэфирную связь или пептидную связь (в пептидной нуклеиновой кислоте). Полинуклеотиды (молекулы нуклеиновых кислот) включают одноцепочечные и/или двухцепочечные полинуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), а также аналоги или производные РНК или ДНК. Термин также включает эквиваленты, производные, варианты и аналоги РНК или ДНК, получаемые из аналогов нуклеотидов, одноцепочечные (смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные полинуклеотиды.

Дезоксирибонуклеотиды включают дезоксиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин. В РНК урациловое основание представляет собой уридин. Полинуклеотиды могут содержать аналоги нуклеотидов, включающие, например, нуклеотиды с измененной массой, которые позволяют различать полинуклеотиды по массе; нуклеотиды, содержащие детектируемую метку, такую как флуоресцентная, радиоактивная, люминесцентная или хемилюминесцентная метки, которые позволяют детектировать полинуклеотид; или нуклеотиды, содержащие реакционноспособную группу, такую как биотиновая или тиольная группа, что облегчает иммобилизацию полинуклеотида на твердой подложке. Поли- 24 027835

нуклеотид также могут содержать одну или более связей в каркасе, которые являются селективно расщепляемыми, например, химически, ферментативно или фотолитически расщепляемыми. Например, полинуклеотид может содержать один или более дезоксирибонуклеотидов с последующими одним или более рибонуклеотидами, за которыми могут следовать один или более дезоксирибонуклеотидов, такая последовательность является расщепляемой по рибонуклеотидной последовательности посредством основного гидролиза. Полинуклеотид также может содержать одну или более связей, которые относительно устойчивы к расщеплению, например, химерный олигонуклеотидный праймер может содержать нуклеотиды, связанные пептидными связями нуклеиновых кислот, и по меньшей мере один нуклеотид на 3'-конце, связанный фосфодиэфирной или другой подходящей связью и способный к элонгации полимеразой. Последовательности пептидных нуклеиновых кислот можно получать известными способами (см., например, Weiler et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:2792-2799). Примерами молекул нуклеиновых кислот (полинуклеотидов), предоставляемых по настоящему документу, являются олигонуклеотиды, включающие синтетические олигонуклеотиды, олигонуклеотидные дуплексы, праймеры, включая праймеры заполнения и олигонуклеотидные дуплексные кассеты.

Как применяют в настоящем документе, "конструкция ДНК" представляет собой одноцепочечную или двуцепочечную, линейную или кольцевую молекулу ДНК, содержащую участки ДНК, комбинированные и связанные в порядке, не встречающемся в природе. Конструкции ДНК являются результатом манипуляций человека и включают в себя клоны и другие копии молекул, с которыми проводились манипуляции.

Как применяют в настоящем документе, "участок ДНК" представляет собой часть более длинной молекулы ДНК с указанными свойствами. Например, участок ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть более длинной молекулы ДНК, такой как плазмида или фрагмент плазмиды, который при чтении в направлении от 5' к 3' кодирует последовательность аминокислот указанного полипептида.

Как применяют в настоящем документе, полинуклеотид с положительной цепью относится к "смысловой цепи" полинуклеотидного дуплекса, которая комплементарна отрицательной цепи или "антисмысловой" цепи. В случае полинуклеотидов, кодирующих гены, смысловая цепь представляет собой цепь, которая идентична цепи мРНК, транслируемой в полипептид, тогда как антисмысловая цепь комплементарна этой цепи. Положительная и отрицательные цепи дуплекса комплементарны друг другу.

Как применяют в настоящем документе, генетический элемент относится к гену или любой его области, кодирующим полипептид или белок или их область. В некоторых примерах генетический элемент кодирует слитый белок.

Как применяют в настоящем документе, регуляторная область молекулы нуклеиновой кислоты относится к цис-действующей нуклеотидной последовательности, которая положительно или отрицательно влияет на экспрессию функционально связанного гена. Регуляторные области включают последовательности нуклеотидов, которые обеспечивают индуцируемую (например, требующую вещества или стимула для увеличения транскрипции) экспрессию гена. Когда индуктор присутствует в среде или при повышении его концентрации в среде, экспрессия гена может увеличиваться. Регуляторные области также включают последовательности, которые подавляют экспрессию генов (т.е. вещество или стимул снижают транскрипцию). Когда репрессор присутствует в среде или при повышении его концентрации в среде, экспрессия гена может снижаться. Известно, что регуляторные области влияют, модулируют и контролируют многие виды биологической активности in vivo, включая пролиферацию клеток, рост и гибель клеток, дифференцировку клеток и иммуномодуляцию. Как правило, регуляторные области, связываются с одним или более транс-действующими белками, что приводит к повышению или снижению транскрипции гена.

Конкретные примеры регуляторных областей генов включают промоторы и энхансеры. Промоторы представляют собой последовательности, расположенные рядом с участком старта транскрипции или трансляции, как правило, располагаясь с 5'-конца от участка начала трансляции. Как правило, промоторы расположены в пределах 1 т.п.н. от участка начала трансляции, но могут располагаться далее, например, на расстоянии 2, 3, 4, 5 т.п.н. и более, до и включая 10 т.п.н. Известно, что энхансеры влияют на экспрессию генов, когда расположены с 5'- и 3'-конца от гена или когда расположены в экзоне или интроне или являются их частями. Энхансеры также могут функционировать на значительном расстоянии от гена, например, на расстоянии приблизительно 3, 5, 7, 10, 15 т.п.н. и более.

Регуляторные области в дополнение к промоторным областям, также включают, но не ограничиваются последовательностями, которые облегчают трансляцию, сигналами сплайсинга интронов, поддерживающими правильную рамку считывания гена для обеспечения трансляции мРНК внутри рамки и стоп-кодоны, лидерными последовательностями и последовательностями партнеров по слиянию, элементами внутренних участков связывания рибосом (IRES) для получения полигенных или полицистронных транскриптов, сигналами полиаденилирования, обеспечивающими надлежащее полиаденилирование транскрипта представляющего интерес гена, и стоп-кодонами, и их необязательно можно включать в экспрессирующий вектор.

Как применяют в настоящем документе, "функционально связанный", в отношении последователь- 25 027835

ностей, областей, элементов или доменов нуклеиновых кислот означает, что области нуклеиновой кислоты функционально связаны друг с другом. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая лидерный пептид, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, так что нуклеиновые кислоты могут транскрибироваться и транслироваться с экспрессией функционального слитого белка, в котором лидерный пептид обеспечивает секрецию слитого полипептида. В некоторых случаях нуклеиновая кислота, кодирующая первый полипептид (например, лидерный пептид), функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, и нуклеиновые кислоты транскрибируются, как один транскрипт мРНК, но трансляция транскрипта мРНК может приводить к одному из двух экспрессируемых полипептидов. Например, между нуклеиновой кислотой, кодирующей первый полипептид, и нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, может располагаться амбер стоп-кодон так, что при введении в частично супрессирующие амбер-кодоны клетки полученный единый транскрипт мРНК может транслироваться с получением слитого белка, содержащего первый и второй полипептиды, или может транслироваться с продукцией только первого полипептида. В другом примере промотор может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, в результате чего промотор регулирует или опосредует транскрипцию нуклеиновой кислоты.

Как применяют в настоящем документе, термин "синтетический", например, в отношении синтетической молекулы нуклеиновой кислоты, или синтетического гена, или синтетического пептида, относится к молекуле нуклеиновой кислоты или молекуле полипептида, которые получают рекомбинантными способами и/или способами химического синтеза.

Как применяют в настоящем документе, получение рекомбинантными способами с использованием способов рекомбинантных ДНК означает применение для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК, известных способов молекулярной биологии.

Как применяют в настоящем документе, "экспрессия" относится к процессу, посредством которого полипептиды получают посредством транскрипции и трансляции полинуклеотидов. Уровень экспрессии полипептида можно оценивать любым способом, известным в данной области, включая, например, способы определения количества полипептида, продуцируемого из клетки-хозяина. Такие способы включают, но не ограничиваются количественным определением полипептида в клеточном лизате посредством ELISA, окрашиванием Кумасси синим после электрофореза в геле, анализом белка по Лоури и анализом белка по Брэдфорду.

Как применяют в настоящем документе, "клетка-хозяин" представляет собой клетку, которую используют для получения, сохранения, репродукции и амплификации вектора. Клетки-хозяева можно использовать для экспрессии полипептида, кодируемого вектором. Нуклеиновая кислота, содержащаяся в векторе, при делении клетки-хозяина реплицируется, таким образом амплифицируя нуклеиновые кислоты. В одном из примеров клетка-хозяин представляет собой генетический контейнер, который можно индуцировать с экспрессией на ее поверхности варианта полипептида. В другом примере клетку-хозяина инфицируют генетическим контейнером. Например, клетка-хозяин может представлять собой клеткухозяина, совместимую с фаговым дисплеем, которую можно трансформировать фаговым или фагмидным вектором, и которая может поддерживать фаговый контейнер, экспрессирующий слитые белки, содержащие варианты полипептидов.

Как применяют в настоящем документе, "вектор" представляет собой реплицируемую нуклеиновую кислоту, с которой посредством которой при трансформации вектора в соответствующую клетку-хозяина можно экспрессировать один или более гетерологичных белков. Указание вектора включает в себя векторы, в которые можно встраивать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид или его фрагмент, как правило, посредством рестрикционного расщепления и лигирования. Указание вектора также включает векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Вектор используют для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в клетку-хозяина для амплификации нуклеиновой кислоты или экспрессии/дисплея полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. Векторы обычно остаются в эписомном состоянии, но могут быть предназначены для интеграции гена или его части в хромосому генома. Также предусмотрены векторы, которые представляют собой искусственные хромосомы, такие как искусственные хромосомы дрожжей и искусственные хромосомы млекопитающих. Выбор и использование таких носителей хорошо известны специалистам в данной области.

Как применяют в настоящем документе, вектор также включает "вирусные векторы". Вирусные векторы представляют собой сконструированные вирусы, которые функционально связаны с экзогенными генами для переноса (как носители или челноки) экзогенных генов в клетки.

Как применяют в настоящем документе, "экспрессирующий вектор" включает векторы, способные экспрессировать ДНК, функционально связанную с регуляторными последовательностями, такими как, промоторные области, способные осуществлять экспрессию таких фрагментов ДНК. Такие дополнительные участки могут включать последовательности промотора и терминатора и, необязательно, могут включать один или более участков начала репликации, один или более селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.п. Как правило, экспрессирующие векторы получают из плазмидной или вирусной ДНК, или они могут содержать элементы обеих. Таким образом, экспрессирующий вектор относится к рекомбинантной конструкции ДНК или РНК, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный ви- 26 027835

рус или другой вектор, которая при введении в подходящую клетку-хозяина приводит к экспрессии клонированной ДНК. Соответствующие экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают векторы, реплицирующиеся в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, векторы, остающиеся в эписомном состоянии, и векторы, интегрирующие в геном клеткихозяина.

Как применяют в настоящем документе, термины "олигонуклеотид" и "олиго" применяют как синонимы. Олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотиды, длину которых составляет ограниченное число нуклеотидов. Специалисту в данной области очевидно, что длина олигонуклеотида составляет, как правило, менее чем приблизительно двести пятьдесят, как правило, менее чем приблизительно двести, как правило, менее чем приблизительно сто нуклеотидов. Как правило, олигонуклеотиды, предоставляемые по настоящему документу, являются синтетическими олигонуклеотидами. Длина синтетических олигонуклеотидов составляет менее чем или приблизительно 250 или 200 нуклеотидов, например, менее 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 нуклеотидов. Как правило, олигонуклеотиды являются одноцепочечными олигонуклеотидами. Для указания длины олигонуклеотида можно использовать окончание "-мер". Например, понятие "100-мер" можно использовать для обозначения олигонуклеотида, длина которого составляет 100 нуклеотидов. Примерами синтетических олигонуклеотидов, предоставляемых по настоящему документу, являются олигонуклеотиды с положительными и отрицательными цепями, случайные олигонуклеотиды, олигонуклеотиды с эталонными последовательностями, матричные олигонуклеотиды и праймеры заполнения.

Как применяют в настоящем документе, синтетические олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды, получаемые посредством химического синтеза. Химические способы синтеза олигонуклеотидов хорошо известны. Для получения олигонуклеотидов, сконструированных и используемых в предоставляемых способах, можно использовать любые из известных способов синтеза. Например, синтетические олигонуклеотиды, как правило, получают химическим присоединением одиночных нуклеотидных мономеров или нуклеотидных тримеров, содержащих защитные группы. Как правило, в реакцию за один раз добавляют по одному фосфорамидиту, нуклеотиду, содержащему защитные группы. Как правило, синтез начинают с 3'-конца олигонуклеотида. Начальный 3'-концевой фосфорамидит связан с твердой поддержкой, и синтез проводят, присоединяя каждый следующий фосфорамидит к 5'-концу предыдущего. После каждого добавления с 5'-фосфатной группы самого последнего добавленного основания удаляют защитную группу, что позволяет присоединять следующий фосфорамидит. Как правило, автоматизированные синтезаторы, могут синтезировать олигонуклеотиды от приблизительно 150 до приблизительно 200 нуклеотидов в длину. Как правило, для синтеза олигонуклеотидов, сконструированных и применяемых в предоставляемых способах, используют стандартную цианоэтильную реакцию фосфорамидитных мономеров. Синтетические олигонуклеотиды, получаемые указанным стандартным способом, можно приобретать в Integrated DNA Technologies (IDT) (Coralville, IA) или TriLink Biotechnologies (San Diego, CA).

Как применяют в настоящем документе, "праймер" относится к молекуле нуклеиновой кислоты (более типично, к совокупности таких молекул с идентичными последовательностями), которая может выступать в качестве точки инициации матричного синтеза нуклеиновых кислот в подходящих условиях (например, в присутствии четырех разных нуклеозидтрифосфатов и полимеризующего средства, такого как ДНК-полимераза, РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в соответствующем буфере и при подходящей температуре. Следует понимать, что определенные молекулы нуклеиновых кислот могут служить в качестве "зонда" и в качестве "праймера". Однако праймер содержит 3'-гидроксильную группу для элонгации. Праймер можно использовать во множестве способов, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), (ОТ)-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой), ПЦР с РНК, ЛЦР, мультиплексную ПЦР, ПЦР с выступающими праймерами, ПЦР с захватом, ПЦР с экспрессией, 3' и 5' RACE, ПЦР in situ, ПЦР с лигированием и другие способы амплификации.

Как применяют в настоящем документе, "пара праймеров" относится к набору праймеров (например, две совокупности праймеров), включающему 5'-праймер (прямой), который гибридизуется с 5'концом амплифицируемой (например, посредством ПЦР) последовательности, и 3'-праймер (обратный), который гибридизуется с 3' концом амплифицируемой последовательности. Так как "праймер" может относиться к совокупности идентичных молекул нуклеиновой кислоты, как правило, пара праймеров представляет собой пару из двух совокупностей праймеров.

Как применяют в настоящем документе, "один праймер" и "одна совокупность праймеров" являются синонимами и относятся к совокупности праймеров, где последовательность каждого праймера в совокупности в определенной степени идентична с другими представителями праймеров, например, к совокупности праймеров, в которой представители на по меньшей мере приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны. Праймеры из одной совокупности праймеров (все с определенной степенью идентичности) выступают в качестве 5' (прямых) праймеров (специфически гибридизуются с 5'-концом амплифицируемой (например, посредством ПЦР) последовательности), а также 3' (обратных) праймеров (специфически гибридизуются с последовательностью, комплементарной 3'концу амплифицируемой последовательности). Таким образом, один праймер можно без других прайме- 27 027835

ров использовать в качестве затравки для синтеза комплементарных нитей и амплификации нуклеиновой кислоты в полимеразной реакции амплификации.

Как применяют в настоящем документе, комплементарность в отношении двух нуклеотидов, относится к способности двух нуклеотидов образовывать пару друг с другом при гибридизации двух молекул нуклеиновых кислот. Две молекулы нуклеиновой кислоты, проявляющие комплементарность, обозначают как комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты; примером комплементарных молекул нуклеиновых кислот являются положительная и отрицательная цепи в полинуклеотидном дуплексе. Как применяют в настоящем документе, когда молекула нуклеиновой кислоты или ее область комплементарны другой молекуле нуклеиновой кислоты или ее области, то молекулы и области специфически гибридизуются друг с другом. Две комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты можно описывать в терминах процентов комплементарности. Например, полагают, что две молекулы нуклеиновой кислоты, по 100 нуклеотидов в длину каждая, которые специфически гибридизуются друг с другом, но содержат 5 несоответствий относительно друг друга, комплементарны на 95%. Для двух молекул нуклеиновых кислот для гибридизации со 100% комплементарностью не обязательно необходимо, чтобы комплементарность существовала по всей длине обеих молекул. Например, молекула нуклеиновой кислоты, составляющая 20 последовательных нуклеотидов в длину, может специфически гибридизоваться с частью из 20 последовательных нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, составляющей 500 последовательных нуклеотидов в длину. Если в пределах этой части из 20 нуклеотидов отсутствуют несоответствия, молекула из 20 нуклеотидов, гибридизуется со 100% комплементарностью. Как правило, комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты выравниваются менее чем с 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1% несоответствий между комплементарными нуклеотидами (другими словами, по меньшей мере или приблизительно с 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% комплементарностью). В другом примере комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты обладают или обладают приблизительно или по меньшей мере или приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% комплементарностью. В одном из примеров комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты содержат менее 5, 4, 3, 2 или 1 не комплементарных нуклеотидов. В одном из примеров комплементарные нуклеотиды комплементарны на 100%. При необходимости можно указывать процент комплементарности. Как правило, две молекулы выбирают так, что они специфически гибридизуются в жестких условиях.

Как применяют в настоящем документе, комплементарная цепь молекулы нуклеиновой кислоты относится к последовательности нуклеотидов, например, молекуле нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с молекулой, так как противоположная цепь с молекулой нуклеиновой кислоты в полинуклеотидном дуплексе. Например, в полинуклеотидном дуплексе комплементарной цепью для олигонуклеотида с положительной цепью является олигонуклеотид с отрицательной цепью, который в дуплексе специфически гибридизуется с олигонуклеотидом с положительной цепью. В одном из примеров предоставляемых способов для синтеза комплементарных цепей полинуклеотидов, формирующих дуплексы, используют полимеразную реакцию, как правило, начинающуюся с гибридизации олигонуклеотидного праймера с полинуклеотидом.

Как применяют в настоящем документе, термин "специфически гибридизуется" относится к отжигу молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида или полинуклеотида) с другой молекулой нуклеиновой кислоты посредством спаривания комплементарных оснований. Специалистам в данной области известны параметры in vitro и in vivo, которые влияют на специфичность гибридизации, такие как длина и состав конкретной молекулы. Параметры, особенно значимые для гибридизации in vitro, также включают температуры отжига и отмывки, состав буфера и концентрации солей. Для специфической гибридизации двух молекул нуклеиновой кислоты не обязательно наличие 100% комплементарности указанных молекул. Например, две комплементарные молекулы нуклеиновых кислот с комплементарностью последовательностей, такой как или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50%, могут специфически гибридизоваться друг с другом. Для варьирования процента комплементарности, необходимого для специфической гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью, можно подбирать строгость параметров, например, компоненты буфера, время и температуру, используемых в способах гибридизации in vitro, предоставляемых по настоящему документу. Специалист в данной области может легко подобрать эти параметры для достижения специфической гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью, подходящей для конкретного применения.

Как применяют в настоящем документе, "первичная последовательность" относится к последовательности аминокислотных остатков в полипептиде или к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты.

Как применяют в настоящем документе, "сходство" между двумя белками или нуклеиновыми кислотами относится к близости аминокислотных последовательностей белков или нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот. Сходство может быть основано на степени идентичности последовательностей остатков и остатков, содержащихся в них. Способы оценки степени сходства белков или нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области. Например, в одном из способов оценки сходства последовательностей две аминокислотные или нуклеотидные последовательности выравнивают та- 28 027835

ким образом, чтобы достичь максимального уровня идентичности последовательностей. "Идентичность" относится к степени, до которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности являются неизменными. При выравнивании аминокислотных последовательностей и, в некоторой степени, последовательностей нуклеотидов, также можно принимать во внимание консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Консервативными различиями являются различия, при которых сохраняются физико-химические свойства участвующих остатков. Выравнивание может быть глобальным (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей и включая все остатки) или локальным (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее близкие область или области).

Как применяют в настоящем документе, когда полипептид или молекула нуклеиновой кислоты или их области "идентичны" или "гомологичны" с другими полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты или их областями, то последовательности двух молекул и/или областей идентичны, в степени большей или равной или приблизительно 40%, как правило, большей или равной или приблизительно 50%, например, по меньшей мере или приблизительно 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%; если необходимо можно указывать точный процент идентичности. Молекула нуклеиновой кислоты или ее область, идентичные или гомологичные второй молекуле нуклеиновой кислоты или ее области, может специфически гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты или областью, которые на 100% комплементарны второй молекуле нуклеиновой кислоты или области. Альтернативно степень идентичности можно определять у двух теоретических нуклеотидов или аминокислотных последовательностей или у молекул нуклеиновой кислоты или полипептида и теоретической последовательности.

Сама "идентичность" последовательностей имеет значение, принятое в данной области, и процент идентичности двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов или областей можно рассчитывать известными из литературы способами. Процент идентичности можно определять для всей длины полипептида или полинуклеотида или для областей молекул (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., ed., M Stockton Press, New York, 1991). Хотя существует множество способов определения идентичности двух полинуклеотидов или полипептидов, термин "идентичность" хорошо известен специалисту в данной области (Carillo, Н. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math 48: 1073 (1988)).

Идентичность последовательностей при сравнении двух полинуклеотидов или полипептидов по всей длине относится к проценту идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков по всей длине молекулы. Например, если полипептид А содержит 100 аминокислот, а полипептид В содержит 95 аминокислот, которые идентичны аминокислотам 1-95 полипептида А, то при определении идентичности последовательности полипептида А по всей длине и последовательности полипептида В по всей длине полипептид В идентичен на 95%. Альтернативно, идентичность последовательностей полипептида А и полипептида В можно определять в области, такой как аналогичная область из 20 аминокислот каждого полипептида. В этом случае, если полипептиды А и В в этой области содержат 20 идентичных аминокислот, идентичность последовательностей для областей составляет 100%. Альтернативно, идентичность последовательностей можно определять по всей длине молекулы в сравнении с областью другой молекулы. Альтернативно, идентичность последовательностей полипептида А и полипептида В можно определять по полипептидам одинаковой длины, но с заменами аминокислот, таких как консервативные замены аминокислот или неконсервативные замены аминокислот. Как описано ниже и как известно специалистам в данной области, доступно множество различных программ и способов оценки идентичности. Высокие уровни идентичности, такие как 90 или 95%, можно легко определить без программного обеспечения.

Обладают ли любые две молекулы нуклеотидными последовательностями или аминокислотными последовательностями, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% "идентичны", можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа FASTA, с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано в Pearson et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (другие программы включают программный пакет GCG (Devereux, J., at al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., at al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990); Guide to HugeCoraputers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), и Carillo et al. SIAM J. Applied Math 48: 1073). Например, для определения идентичности можно использовать функцию BLAST базы данных National Center for Biotechnology Information. Другие коммерческие или общедоступные программы включают программу DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) и программу "Gap" University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison, WI). Процент гомологии или идентичности молекул белков и/или нуклеиновых кислот можно определять, например, посредством сравнения информации о последовательностях с использованием программы GAP (см., например, Needleman at al., J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с редакцией Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). В кратком изложении, программа GAP определяет сходство как количество выровненных символов (т.е. нуклеоти- 29 027835

дов или аминокислот), которые являются идентичными, деленное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov at al., Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), как описано Schwartz and Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф в размере 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске и (3) отсутствие штрафа для концевых пропусков.

В основном для определения процента идентичности последовательностей последовательности выравнивают с достижением наибольшего совпадения (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., и Griffin, H.G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., ed., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988), SIAM J. Applied. Math. 48: 1073). Для определения идентичности последовательностей определяют количество консервативных аминокислот посредством программ со стандартными алгоритмами выравнивания, и их можно использовать со штрафами за пропуски по умолчанию, устанавливаемыми каждым поставщиком. Молекулы нуклеиновых кислот, гомологичные в значительной степени, специфически гибридизуются, как правило, при умеренной жесткости или при высокой жесткости, по всей длине представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие в гибридизуемой молекуле нуклеиновой кислоты вместо кодонов вырожденные кодоны.

Таким образом, термин "идентичность", когда он ассоциирован с конкретным числом, относится к сравнению двух последовательностей первых и вторых полипептидов или полинуклеотидов или их областей и/или двух теоретических последовательностей нуклеотидов или аминокислот. Как применяют в настоящем документе, термин "идентичны по меньшей мере на 90%" относится к идентичности последовательностей от 90 до 99,99% относительно первой последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности полипептида. Идентичность на уровне 90% и более является показателем того факта, что, полагая для иллюстративных целей длину первого и второго полипептидов за 100 аминокислот, в первом полипептиде от второго полипептида отличаются не более 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот. Подобные сравнения можно проводить между первым и вторым полинуклеотидами. Такие различия между первой и второй последовательностями могут быть представлены в виде точечных мутаций, случайно распределенных по всей длине полипептида, или они могут быть сосредоточены в одном или более участках различной длины вплоть до максимально допустимой, например, длины 10/100 различающихся аминокислот (идентичность приблизительно 90%). Различия определяют как замены, вставки, добавления и делеции нуклеотидных или аминокислотных остатков. На уровне гомологии или идентичности выше приблизительно 85-90% результат не зависит от программы и установки штрафов за пропуск; такие высокие уровни идентичности можно легко оценить, часто посредством ручного выравнивания без использования программного обеспечения.

Как применяют в настоящем документе, "выравнивание последовательности" относится к использованию гомологии для выравнивания двух или более последовательностей нуклеотидов или аминокислот. Как правило, две или более последовательности, идентичные на 50% и более, выравниваются. Выровненный набор последовательностей относится к 2 или более последовательностям, которые выровнены по соответствующим положениям, и может включать выравнивание последовательностей, получаемых из РНК, таких как EST и другие кДНК, с последовательностью геномной ДНК.

Сходные полипептиды или молекулы нуклеиновых кислот или варианты полипептидов или молекул нуклеиновых кислот можно выравнивать любым способом, известным специалистам в данной области. Как правило, в таких способах максимизируют совпадения, и они включают такие способы, как выравнивание использование выравнивания вручную и использование многочисленных доступных программ выравнивания (например, BLASTP) и других, известных специалистам в данной области. При выравнивании последовательностей полипептидов или нуклеиновых кислот специалист в данной области может идентифицировать аналогичные части или положения, с использованием в качестве ориентиров консервативных и идентичных аминокислотных остатков. Кроме того, специалист в данной области также может использовать консервативные аминокислотные или нуклеотидные остатки в качестве ориентиров для нахождения соответствующих аминокислотных или нуклеотидных остатков в последовательностях человека и не принадлежащих человеку последовательностях. Соответствующие положения также могут основываться на структурном выравнивании, например, с использованием смоделированного на компьютере выравнивания структур белков. В других случаях можно идентифицировать соответствующие области. Для нахождения соответствующих аминокислотных остатков в последовательностях человека и не принадлежащих человеку последовательностях, специалист в данной области в качестве ориентиров может использовать консервативные аминокислотные остатки.

Как применяют в настоящем документе, "аналогичные" и "соответствующие" части, положения или области представляют собой части, положения или области, которые выравнены друг с другом при вы- 30 027835

равнивании двух или более сходных последовательностей полипептидов или нуклеиновых кислот (включая последовательности молекул, областей молекул и/или теоретические последовательности), с достижением наибольшего соответствия, используя для максимизации соответствий способы выравнивания, известные специалистам в данной области. Другими словами, два аналогичных положения (или части, или области) выравнивают при выравнивании двух или более последовательностей полипептидов или нуклеиновых кислот с наилучшим соответствием. Аналогичные части/положения/области идентифицируют по положению в линейной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислот, когда две или более последовательности выровнены. Аналогичные части не должны иметь идентичные последовательности друг с другом. Например, выравнивание (например, с максимальным соответствием) последовательностей двух гомологичных молекул нуклеиновых кислот, по 100 нуклеотидов в длину каждая, может выявить идентичность 70 из 100 нуклеотидов. Части этих молекул нуклеиновой кислоты, содержащие некоторые из неидентичных 30 аминокислот или все такие аминокислоты, являются аналогичными частями с неидентичными последовательностями. Альтернативно, аналогичные части или могут обладать определенным процентом идентичности последовательностей друг с другом, например, приблизительно идентичностью на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%. В одном из примеров аналогичные части идентичны на 100%.

Как применяют в настоящем документе, "модификация" рассматривается в отношении модификации последовательности аминокислот полипептида или последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и включает делеции, вставки и замены аминокислот и нуклеотидов соответственно. Способы модификации полипептидов являются у специалистов в данной области установившейся практикой, например, с использованием технологии рекомбинантных ДНК.

Как применяют в настоящем документе, "делеция" в отношении последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида относится к делеции одного или более нуклеотидов или аминокислот по сравнению с другой последовательностью, такой как полинуклеотид-мишень, или полипептид-мишень, или природная последовательность, или последовательность дикого типа.

Как применяют в настоящем документе, "вставка" в отношении последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислот относится к включению одного или более дополнительных нуклеотидов или аминокислот, в последовательность-мишень, природную последовательность, последовательность дикого типа или другую сходную последовательность. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты, содержащая по сравнению с последовательностью дикого типа одну или более вставок, содержит в линейной последовательности один или более дополнительных нуклеотидов. Как применяют в настоящем документе, "добавления" в отношении последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот относятся к добавлениям нуклеотидов или аминокислот на любом из концов по сравнению с другой последовательностью.

Как применяют в настоящем документе, "замена" относится к замене одного или более нуклеотидов или аминокислот в природной последовательности, последовательности-мишени или другой последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида на альтернативные нуклеотиды или аминокислоты без изменения длины молекулы (выраженной в количестве остатков). Таким образом, одна или более замен в молекуле не изменяют количество аминокислотных остатков и нуклеотидов в молекуле. Мутации замены по сравнению с конкретным полипептидом можно описывать в виде номера аминокислотного остатка по длине полипептидной последовательности. Например, модифицированный полипептид с модификацией аминокислоты в 19 положении в аминокислотной последовательности, которая представляет собой замену изолейцина (Ile, I) на цистеин (Cys; С), можно описать как I19C, Ile19C или просто С19, для указания того, что аминокислота в модифицированном 19 положении представляет собой цистеин. В этом примере молекула с заменой содержит модификацию в положении Ile19 немодифицированного полипептида.

Как применяют в настоящем документе, свойство связывания представляет собой характеристику молекулы, например, полипептида, относящуюся тому, связывается ли он или нет с одним или более партнерами, и как. Свойства связывания включают способность связываться с партнером(ами), аффинность, с которой происходит связывание партнера (например, высокая аффинность), авидность, с которой происходит связывание партнера, силу связывания с партнером по связыванию и специфичность связывания с партнером по связыванию.

Как применяют в настоящем документе, аффинность описывает силу взаимодействия между двумя или более молекулами, такими как партнеры по связыванию, как правило, силу нековалентного взаимодействия между двумя партнерами по связыванию. Аффинность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к эпитопу антигена представляет собой меру силы всех нековалентных взаимодействий между одним участком связывания антитела и эпитопом. Низкоаффинное взаимодействие антиген-антитело является слабым, и молекулы имеют тенденцию к быстрой диссоциации, тогда как высокоаффинное взаимодействие антиген-антитело является сильным, и молекулы остаются связанными в течение более длительного периода времени. Способы расчета аффинности хорошо известны и включают, например, способ определения констант ассоциации/диссоциации. Аффинность можно оценивать эмпирически или можно определять относительно, например, посредством сравнения аффинностей одного антитела и дру- 31 027835

гого антитела к конкретному антигену.

Как применяют в настоящем документе, авидность антитела относится к силе нескольких взаимодействий между поливалентным антителом и распознаваемым им антигеном, так как антитело, содержащее несколько участков связывания, ассоциирует с антигеном, с повторяющимися эпитопами или с множеством эпитопов. Высокоавидное антитело характеризуется более высокой прочностью таких взаимодействий по сравнению с низкоавидным антителом.

Как применяют в настоящем документе, "связывание" относится к участию любой молекулы в аттрактивном взаимодействии с другой молекулой, приводящем к стабильной ассоциации, при которой две молекулы находятся в непосредственной близости друг к другу. Связывание включает, но не ограничивается нековалентными связями, ковалентными связями (такими как обратимые и необратимые ковалентные связи), и включает в себя взаимодействие между молекулами, такими как, но не ограничиваясь белками, нуклеиновыми кислотами, углеводами, липидами, низкомолекулярными соединениями, такими как химические соединения, включая лекарства. Примеры связей включают взаимодействия антигенантитело и рецептор-лиганд. Когда антитело "связывает" конкретный антиген, связывание относится к специфическому распознаванию антигена антителом посредством специфического взаимодействия антиген-антитело в участках связывания антитела. Связывание также может включать ассоциацию нескольких цепей полипептида, таких как цепи антитела, которые взаимодействуют посредством дисульфидных связей.

Как применяют в настоящем документе, "константа аффинности" относится к константе ассоциации (K_a), используемой для измерения аффинности антител к антигену. Чем больше константа аффинности, тем выше аффинность антитела к антигену.

Константы аффинности выражают в единицах, обратных молярности (например, М^-1), и ее можно рассчитывать из константы скорости реакции ассоциации-диссоциации, измеряемой методологии стандартной кинетики для реакций антител (например, посредством иммунологических анализов, поверхностного плазмонного резонанса или других известных анализов кинетических взаимодействий, известных в данной области).

Как применяют в настоящем документе, "такая же", когда используют в отношении аффинности связывания антител, означает, что константа ассоциации (K_a) находится в пределах приблизительно от 1 до 100 раз или от 1 до 10 раз от эталонного антитела (аффинность в 1-100 раз выше или в 1-100 раз ниже, или в любое число раз или диапазон или значение в пределах таких диапазонов, чем у эталонного антитела).

Как применяют в настоящем документе, "по существу такая же", когда используют в отношении константы ассоциации (Ka), означает, что константа ассоциации приблизительно в 5-5000 раз выше или ниже, чем константа ассоциации, Ka, эталонного антитела (в 5-5000 раз выше или в 5-5000 раз ниже, чем у эталонного антитела). Аффинность связывания антитела также можно выражать в виде константы диссоциации, или Kd. Константа диссоциации обратна константе ассоциации, Kd=1/Ka.

Как применяют в настоящем документе, фраза "с такой же специфичностью связывания", когда ее используют для описания антитела по отношению к другому антителу, означает, что антитело специфически связывается (иммуноспецифически связывается или специфически связывается с вирусом) с тем же антигенным эпитопом, что и эталонное антитело, или с его частью. Таким образом, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент с такой же специфичностью связывания, как и антитело, обозначаемое 58с5 или как 30D8, специфически связывается с тем же эпитопом или с частью того же эпитопа, что и антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, обозначаемые 58с5 или 30D8 соответственно. Эпитоп может находиться в выделенном белке или в белке вируса. Способность двух антител связывать один эпитоп можно определять посредством известных в данной области анализов, например, таких как анализ поверхностного плазмонного резонанса и анализы конкуренции антител. Как правило, антитела, которые иммуноспецифически связываются с одним эпитопом, могут конкурировать за связывание с эпитопом, что можно измерять, например, посредством анализа конкуренции за связывание in vitro (например, конкурентного ELISA) с использованием известных в данной области протоколов. Как правило, первое антитело, которое иммуноспецифически связывается с тем же эпитопом, что и второе антитело, может конкурировать за связывание с эпитопом на или приблизительно на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%, где процент конкуренции представляет собой определяемую способность второго антитела замещать первое антитело при связывании эпитопа. Например, в анализе конкуренции за связывание антиген инкубируют в присутствии предопределенного лимитирующего разведения меченого антитела (например, 50-70% от концентрации насыщения), а также серийных разведений немеченого конкурирующего антитела. Конкуренцию определяют посредством определения связывания меченого антитела с антигеном по любому снижению связывания в присутствии конкурирующего антитела. В данной области известны варианты таких анализов, включая различные способы мечения и детекции, например, включая радиометрическую, флуоресцентную, ферментативную и колориметрическую детекцию. Способность первого антитела связывать тот же эпитоп, что и второе антитело, также можно определять, например, посредством анализов нейтрализации вирусов с применением устойчивых к моноклональным антителам мутантов (MARM). Например, когда первое антитело к PCB нейтрализует

- 32 027835

PCB дикого типа, но не конкретный мутант PCB, тогда второе антитело, которое нейтрализует PCB дикого типа, но не конкретный мутант PCB, как правило, связывает на PCB тот же эпитоп, что и первое антитело. Когда первое антитело к PCB нейтрализует PCB дикого типа, но не конкретный мутант PCB, тогда второе антитело, которое нейтрализует PCB дикого типа и конкретный мутант PCB, как правило, не связывает на PCB тот же эпитоп, что и первое антитело.

Как применяют в настоящем документе, "устойчивый к моноклональному антителу мутант" (MARM) также обозначаемый как "ускользающий от моноклонального антитела мутант" представляет собой мутантный респираторно-синцитиальный вирус (PCB), демонстрирующий устойчивость к нейтрализации моноклональным антителом, нейтрализующим вирус PCB дикого типа. На практике, для MARM, для которого полагают, что он ускользает от антитела, концентрация антитела, необходимая для нейтрализации 50% MARM PCB, должна быть по меньшей мере приблизительно или по меньшей мере в 10 раз выше, чем концентрация, необходимая для нейтрализации эквивалентного количества эталонных инфекционных вирусных частиц дикого типа.

MARM получают посредством культивирования PCB дикого типа в присутствии такого моноклонального антитела при последовательных циклах репликации вируса в присутствии антитела так, что после каждого последующего цикла репликации вируса для получения эффекта нейтрализации вируса необходимо повышать концентрацию антител. Цитопатическое действие (CPE) наблюдается только в присутствии возрастающих концентраций антител до получения мутантного вируса, который уже антителом эффективно не нейтрализуется. Если для возникновения MARM в присутствии первого антитела требуется больше циклов репликации по сравнению со вторым антителом, можно сделать вывод, что первое антитело связывает эпитоп, который отличается от эпитопа, который связывает второе антитело. Если первое антитело может нейтрализовать MARM, устойчивый ко второму антителу, можно сделать вывод, что антитела специфически связываются и взаимодействуют с различными эпитопами. Посредством MARM можно более точно картировать антигенсвязывающие эпитопы антител по сравнению с анализом конкуренции за связывания так, как антитело может конкурировать с другим антителом за связывание с антигеном, но при этом не может нейтрализовать MARM своего конкурента. Для некоторых антител для получения MARM необходимо только несколько циклов отбора; для других антител необходимо больше циклов. Для определенных антител, предоставляемых по настоящему документу, после 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 или более циклов не получают ни одного MARM. В некоторых случаях, получать MARM невозможно.

Как применяют в настоящем документе, EC₅₀ относится к эффективной концентрации, при которой антитело может ингибировать вирусную инфекцию на 50% в анализе нейтрализации in vitro, таком как, например, анализ уменьшения подавления бляшкообразования, описываемый в настоящем документе (например, анализ подавления бляшкообразования с использованием для заражения клеток-хозяев Vero или других клеток-хозяев) или другие известные в данной области анализы нейтрализации вирусов. Как правило, нейтрализующее вирус антитело представляет собой антитело, у которого в анализе нейтрализации in vitro, таком как анализ подавления бляшкообразования, EC50 ингибирования вируса составляет 2 нМ или менее.

Как применяют в настоящем документе, "партнер по связыванию" относится к молекуле (например, полипептиду, липиду, гликолипиду, молекуле нуклеиновой кислоты, углеводу и другой молекуле), с которой специфически взаимодействует другая молекула, например, посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий, таких как взаимодействие антитела с распознаваемым антигеном. Партнер по связыванию может являться продуцируемым в природе или получаемым синтетически. В одном из примеров желаемые варианты полипептидов выбирают с использованием одного или более партнеров по связыванию, например, способами in vitro или in vivo. Примеры способов in vitro включают выделение с использованием партнера по связыванию, связанного с твердой подложкой, такой как бусы, планшет, колонка, матрикс или другая твердая подложка; или партнера по связыванию, связанного с другой селектируемой молекулой, такой как молекула биотина, с последующим отбором посредством связывания селектируемой молекулы с твердой подложкой. Как правило, способы in vitro включают этапы отмывки для удаления несвязанных полипептидов с последующей элюцией отбираемого варианта полипептида(ов). Этот процесс можно повторять один или более раз в повторяющемся процессе с отбором вариантов полипептидов из отбираемых полипептидов.

Как применяют в настоящем документе, дисульфидная связь (также называемая связь S-S или дисульфидный мостик) представляет собой одинарную ковалентную связь, образованную связыванием тиольных групп. Дисульфидные связи в белках формируются между тиольными группами остатков цистеина и стабилизируют взаимодействия между полипептидными доменами, такими как домены антител.

Как применяют в настоящем документе, "связанные" или "конъюгированные" означает связанные посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий.

Как применяют в настоящем документе, фразы "конъюгированные с антителом" или "связанные с антителом" или их грамматические вариации, когда они относятся к присоединению к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту различных молекул, таких как, диагностических или терапевтических молекул, означают, что молекулу присоединяют к антителу или антигенсвязывающему фрагменту лю- 33 027835

бым известным способом связывания пептидов, например, таким как посредством получения рекомбинантными способами слитого белка или посттрансляционно, химическим способом. Для конъюгации можно использовать любое из множества сшивающих средств, включая, но не ограничиваясь, пептидными или составными линкерами или химическими сшивающими средствами.

Как применяют в настоящем документе, "фаговый дисплей" относится к экспрессии полипептидов на поверхности нитевидных бактериофагов.

Как применяют в настоящем документе, "совместимые с фаговым дисплеем клетки" или "совместимые с фаговым дисплеем клетки-хозяева" представляют собой клетки-хозяева, как правило, бактериальные клетки-хозяева, которые можно заражать фагом, и которые, таким образом, могут поддерживать получение фагов, э слитые белки, содержащие полипептиды, например, варианты полипептидов, и которые, таким образом, можно использовать для фагового дисплея. Примерами совместимых с фаговым дисплеем клеток включают, но не ограничиваются клетками XL1-Blue.

Как применяют в настоящем документе, "пэннинг" относится к основанной на аффинности процедуре выделения фагов, несущих молекулы, специфичные к партнеру по связыванию, например, захватывающую молекулу (например, антиген) или последовательности аминокислот или нуклеотидов или к их эпитопы, области, части или локусы.

Как применяют в настоящем документе, "дисплейный белок" или "дисплейный белок в генетическом контейнере" означает любой полипептид в генетическом контейнере, используемый для дисплея полипептида на генетическом контейнере, таком, что, когда дисплейный белок сливают (например, включая как часть слитого белка) с представляющим интерес полипептидом (например, полипептидом, для которого желательно снижение экспрессии), полипептид экспонирован на внешней поверхности или во внешнем компартменте генетического контейнера. Как правило, дисплейный белок представлен на внешней поверхности или в пределах внешней поверхности или внешнего компартмента генетического контейнера (например, мембраны, клеточной стенки, оболочки или другой внешней поверхности или компартмента) генетического контейнера, например вирусного генетического контейнера, такого как фаг, так, что после слияния с представляющим интерес полипептидом полипептид экспонирован на генетическом контейнере.

Как применяют в настоящем документе, белок оболочки представляет собой дисплейный белок по меньшей мере часть которого находится на внешней поверхности генетического контейнера так, что после слияния с представляющим интерес полипептидом полипептид экспонирован на внешней поверхности генетического контейнера. Как правило, белки оболочки представляют собой вирусные белки оболочки, такие как белки оболочки фага. Вирусные белки оболочки, такие как белки оболочки фага, ассоциируют с вирусной частицей во время сборки в клетке-хозяине. В одном из примеров белки оболочки используют по настоящему документу для дисплея полипептидов на генетических контейнерах; белки оболочки экспрессируются как части слитых белков, содержащих последовательность аминокислот белка оболочки и последовательность аминокислот полипептида для дисплея. Белки оболочки могут являться полноразмерными белками оболочки или любыми их частями, способными к дисплею полипептида на поверхности генетического контейнера.

Пример белков оболочки включают белки оболочки фагов, такие как, но не ограничиваясь (I) минорными белками оболочки нитевидных фагов, такими как белок гена III (gIIIp, ср3) и (II) основными белками оболочки (которые присутствуют в оболочке вируса в количестве 10 копий и более, например, десятков, сотен или тысяч копий) нитевидных фагов, такими как белок гена VIII (gVIIIp, cp8); также можно получать слитые белки с другими белками оболочки фагов, такими как белок гена VI, белок гена VII или белок гена IX (см., например, WO 00/71694), и частями (например, доменами или фрагментами) этих белков, такими как, но не ограничиваясь доменами, которые стабильно встроены в фаговую частицу, например, такими как якорный домен gIIIp или gVIIIp. Кроме того, можно использовать мутанты gVIIIp, которые оптимизированы для экспрессии больших пептидов, такие как мутанты с улучшенными свойствами дисплея на поверхности, например, мутант gVIIp (см., например, Sidhu et al. (2000), J. Mol. Biol. 296:487-495).

Как применяют в настоящем документе, "заболевание или нарушение" относится к патологическому состоянию организма, возникающему под действием причины или состояния, включающих, но не ограничивающихся инфекциями, приобретенными состояниями, генетическими состояниями, и характеризующемуся идентифицируемыми симптомами. Заболевания и нарушения по настоящему документу представляют собой заболевания и нарушения, включающие инфекцию PCB или заболевания и нарушения, увеличивающие риск инфекции PCB.

Как применяют в настоящем документе, "инфекция" и "инфекция PCB" относится ко всем стадиям жизненного цикла PCB в хозяине (включая, но не ограничиваясь инвазией и репликацией PCB в клетке или тканях организма), а также к патологическому состоянию, являющемуся результатом инвазии и репликации PCB. Инвазия и репликация PCB включают, но не ограничиваются следующими стадиями: докингом частицы PCB на клетке, слиянием вируса с клеточной мембраной, введением генетической информации вируса в клетку, экспрессией белков PCB, образованием новых частиц PCB и высвобождением частиц PCB из клетки. Инфекция PCB может представлять собой инфекцию PCB верхних дыхатель- 34 027835

ных путей (URI), инфекцию PCB нижних дыхательных путей (LRI) или их комбинацию. В некоторых примерах патологическое состояние, являющееся результатом инвазии и репликации PCB, представляет собой острое заболевание PCB.

Как применяют в настоящем документе, "острое заболевание PCB" относится к клинически значимому заболеванию легких или нижних дыхательных путей в результате инфекции PCB, которое может манифестировать в виде пневмонии и/или бронхиолита, где такие симптомы могут включать, например, гипоксию, апное, дыхательную недостаточность, учащенное дыхание, хрипы, цианоз. Острое заболевание PCB требует получение пораженным индивидуумом медицинской помощи, такой как госпитализация, введение кислорода, интубация и/или искусственное дыхание.

Как применяют в настоящем документе, "лечение" индивидуума с заболеванием или патологическим состоянием означает, что симптомы индивидуума после лечения частично или полностью снижаются или остаются неизменными. Таким образом, лечение включает профилактику, лечение и/или излечение. Профилактика относится к предотвращению возможного заболеваний и/или предотвращению ухудшения симптомов или прогрессирования заболевания. Лечение также включает любое фармацевтическое применение любых предоставляемых антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции, предоставляемой по настоящему документу.

Как применяют в настоящем документе, "профилактика", "предотвращение" и их грамматические эквивалентные формы относятся к способам, при которых снижается риск развития заболевания или патологического состояния.

Как применяют в настоящем документе, "фармацевтически эффективное средство" включает любое терапевтическое средство или биологически активное средство, включающие, но не ограничивающиеся, например, анестетиками, вазоконстрикторами, диспергирующими средствами, общепринятыми терапевтическими лекарственными средствами, включая низкомолекулярные лекарственные средства и терапевтические белки.

Как применяют в настоящем документе, "терапевтический эффект" означает эффект, являющийся результатом лечения индивидуума, заключающийся в изменении, как правило, улучшении или снижении симптомов заболевания или патологического состояния, или лечении заболевания или патологического состояния.

Как применяют в настоящем документе, "терапевтически эффективное количество" или "терапевтически эффективная доза" относятся к количеству средства, соединения, вещества или композиции, содержащей соединение, которого, по меньшей мере, достаточно для получения терапевтического эффекта после введения индивидууму. Таким образом, оно представляет собой количество, необходимое для профилактики, лечения, улучшения состояния, купирования или частичного купирования симптомов заболевания или нарушения.

Как применяют в настоящем документе, "терапевтическая эффективность" относится к способности средства, соединения, вещества или композиции, содержащей соединение, оказывать при введении индивидууму средства, соединения, вещества или композиции, содержащей соединение, терапевтический эффект.

Как применяют в настоящем документе, "профилактически эффективное количество" или "профилактически эффективная доза" относится к количеству средства, соединения, вещества или композиции, содержащей соединение, которое при введении индивидууму оказывает планируемый профилактический эффект, например, предотвращая или задерживая возникновение или повторное возникновение заболевания или симптомов, снижая вероятность возникновения или повторного возникновения заболевания или симптомов или снижая частоту вирусной инфекции. Полный профилактический эффект не обязательно достигается при введении одной дозы и может наступать только после введения ряда доз. Таким образом, профилактически эффективное количество можно вводить посредством одного или более введений.

Как применяют в настоящем документе, термины "иммунотерапевтический" или "иммунотерапия" в комбинации с предоставляемыми антителами обозначают профилактическое или терапевтическое введение. Таким образом, предоставляемые терапевтические антитела можно вводить индивидууму с риском контакта с вирусной инфекцией (например, инфекцией PCB) для уменьшения вероятности и/или тяжести заболевания, или можно вводить индивидууму с уже подверженной активной вирусной инфекцией (например, инфекцией PCB).

Как применяют в настоящем документе, улучшение состояния симптомов конкретных заболевания или нарушения посредством лечения, такого как введение фармацевтической композицией или другого терапевтического средства, относится к любому снижению, постоянному или временному, устойчивому или неустойчивому, симптомов, которые можно отнести или ассоциировать с введением композиции или терапевтического средства.

Как применяют в настоящем документе, термин "диагностически эффективное" количество относится к количеству средства, соединения, вещества или композиции, содержащей детектируемое соединение, которого, по меньшей мере, достаточно для детекции соединения после введения индивидууму. Как правило, диагностически эффективное количество антитела к PCB или его антигенсвязывающего

- 35 027835

фрагмента, такого как детектируемо меченое антитело или антигенсвязывающий фрагмент или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые можно детектировать посредством вторичного средства, вводимое индивидууму для детекции, представляет собой количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которого является достаточным для обеспечение детекции участка, содержащего антиген PCB, к которому специфичны антитело или антигенсвязывающий фрагмент. При использовании антител, предоставляемых по настоящему документу, для детекции антигена in vivo детектируемо меченое антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе, которая является диагностически эффективной.

Как применяют в настоящем документе, метка или детектируемая группа представляет собой детектируемый маркер (например, флуоресцентную молекулу, хемилюминесцентную молекулу, биолюминесцентную молекулу, контрастное средство (например, металл), радионуклид, хромофор, детектируемый пептид или фермент, который катализирует образование детектируемого продукта), который можно непосредственно или опосредовано присоединять или связывать с молекулой (например, антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу,) или ассоциировать с ней и можно детектировать in vivo и/или in vitro. Способ детекции может представлять собой любой известный в данной области способ, включающий известные способы детекции in vivo и/или in vitro (например, визуальное выявление, магнитная резонансная (MP) спектроскопия, ультразвуковой сигнал, рентген, γ-спектроскопия (например, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ)), флуоресцентная спектроскопия или поглощение флуоресценции). Опосредованная детекция относится к измерению физических явлений, таких как энергия или излучение и поглощение частиц атомом, молекулой или композицией, которая непосредственно или опосредована связана с детектируемым фрагментом (например, детекция вторичного меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывает первичное антитело (например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу).

Как применяют в настоящем документе, термин "индивидуум" относится к животным, включая млекопитающих, таких как человек.

Как применяют в настоящем документе, пациент представляет собой человека.

Как применяют в настоящем документе, животное включает любое животное, такое как, но не ограничиваясь приматами, включая людей, горилл и низших приматов, грызунами, такими как мыши и крысы, птицами, такими как куры, жвачными животными, такими как, козы, коровы, олени, овцы; свиньями и другими животными. Не являющиеся человеком животные исключает из предусмотренных животных человека. Полипептиды, по настоящему документу, предоставлены из любого источника, животного, растения, прокариотов и грибов. Большинство полипептидов являются полипептидами животного происхождения, включая млекопитающих.

Как применяют в настоящем документе, термин "пожилой" относится к индивидууму, который в силу возраста имеет сниженный иммунный ответ и сниженную реакцию на вакцинацию. Как правило, пожилой индивидуум является человеком, чей возраст составляет шестьдесят пять лет и более, как правило, 70 лет и более.

Как применяют в настоящем документе, "младенец" относится к человеку, чей возраст составляет менее чем или приблизительно 24 месяца (например, менее чем или приблизительно 16 месяцев, менее чем или приблизительно 12 месяцев, менее чем или приблизительно 6 месяцев, менее чем или приблизительно 3 месяца, менее чем или приблизительно 2 месяца или менее чем или приблизительно 1 месяц). Как правило, младенец рождается с гестационным возрастом более 38 недель.

Как применяют в настоящем документе, "недоношенный новорожденный" относится к человеку, который родился с гестационным возрастом менее чем или приблизительно 40 недель, как правило, менее чем или приблизительно 38 недель.

Как применяют в настоящем документе, "стандартная лекарственная форма" относится к физически дискретным единицам, подходящим для человека и животного, содержащимся в индивидуальном контейнере, как известно в данной области.

Как применяют в настоящем документе, "единичная дозированная композиция" относится к композиции для непосредственного введения.

Как применяют в настоящем документе, "промышленное изделие" представляет собой продукт, который производят и продают. Как применяют на всем протяжении настоящей заявки, термин включает композиции, предоставляемые по настоящему документу, содержащиеся в упаковочных средствах.

Как применяют в настоящем документе, "жидкость" относится к любой композиции, которая может течь. Таким образом, жидкости включают композиции, находящиеся в полутвердой форме, пасты, растворы, водные смеси, гели, лосьоны, кремы и другие такие композиции.

Как применяют в настоящем документе, выделенный или очищенный полипептид или белок (например, выделенные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) или его биологически активная часть (например, выделенный антигенсвязывающий фрагмент) по существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток или тканей, из которых получают белок, или по существу не содержит химических предшественников и других химических веществ, когда его синтезиру- 36 027835

ют химически. Препараты можно определять как по существу чистые, если они не содержат легкодетектируемых примесей, определяемых посредством стандартных способов анализа, таких как тонкослойная хроматография (TLC), электрофорез в геле и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), используемых специалистами в данной области для оценки такой чистоты, или препараты можно определять как в достаточной степени чистые так, что дальнейшая очистка детектируемо не изменяет физических и химических свойств, таких как ферментативная и биологическая активность. Способы очистки соединений для получения по существу химически чистых соединений известны специалистам в данной области. Однако по существу химически чистое соединение, может представлять собой смесь стереоизомеров. В таких случаях дополнительная очистка может увеличить специфическую активность соединения. Как применяют в настоящем документе, "клеточный экстракт" или "лизат" относятся к препарату или фракции, которые состоят из лизированных или разрушенных клеток.

Как применяют в настоящем документе, выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, которые присутствуют в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. "Выделенные" молекулы нуклеиновой кислоты, такие как молекула кДНК, могут, по существу, не содержать другого клеточного материала или среды для культивирования, когда их получают рекомбинантными способами, или могут практически не содержать химических веществ-предшественников и других химических веществ, когда их синтезируют химически. Примеры выделенных молекул нуклеиновых кислот, предоставляемых по настоящему документу, включают выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие предоставляемые антитела или антигенсвязывающие фрагменты.

Как применяют в настоящем документе, "контроль" относится к образцу, который по существу идентичен тестируемому образцу, за исключением того, что у него не подвергают обработке тестируемый параметр, или, если он представляет собой образец плазмы, его можно получать у нормального добровольца, не находящегося в представляющем интерес патологическом состоянии. Контроль также может представлять собой внутренний контроль.

Как применяют в настоящем документе, "композиция" относится к любой смеси. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водную смесь или неводную смесь или любую их комбинацию.

Как применяют в настоящем документе, "комбинация" относится к любой ассоциации двух или более элементов. Комбинация может представлять собой два или более отдельных элемента, таких как две композиции или две совокупности, может представлять собой их смесь, такую как единую смесь двух или более элементов, или любые их вариации. Элементы комбинации, как правило, функционально связаны или сходны.

Как применяют в настоящем документе, комбинированное лечение относится к введению двух или более различных терапевтических средств, например, двух или более различных антител к PCB и/или антител к PCB и их антигенсвязывающих фрагментов. Различные терапевтические средства можно предоставлять и вводить отдельно, последовательно, периодически, или их можно предоставлять в виде единой композиции.

Как применяют в настоящем документе, набор представляет собой упакованный комбинацию, которая необязательно содержит другие элементы, такие как дополнительные реагенты и инструкции по применению комбинации или ее элементов, с целью, включающей, но не ограничивающейся активацией, введением, диагностикой и оценкой биологической активности или свойства.

Как применяют в настоящем документе, формы единственного числа также включают указания на множественное число, если из контекста явно не следует иначе. Таким образом, например, указание полипептида, содержащего "иммуноглобулиновый домен" включает полипептиды с одним или более иммуноглобулиновыми доменами.

Как применяют в настоящем документе, термин "или" используется для обозначения "и/или", если явно не указана ссылка только на альтернативы или если альтернативы не являются взаимоисключающими.

Как применяют в настоящем документе, диапазоны и количества можно выражать в виде "приблизительно" конкретных значений или диапазонов. Приблизительно также включает точное значение. Таким образом, "приблизительно 5 аминокислот" означает "приблизительно 5 аминокислот", а также "5 аминокислот".

Как применяют в настоящем документе, "необязательный" или "необязательно" означают, что описанные позднее события или обстоятельства могут происходить или могут не происходить, и что описание включает случаи, когда указанные события или обстоятельства происходят, и случаи, когда они не происходят. Например, необязательная вариантная часть означает, что часть является вариантной или невариантной.

Как применяют в настоящем документе, аббревиатуры любых защитных групп, аминокислот и других соединений, если не указано иначе, приведены в соответствии с их обычным использованием, являются общепризнанными аббревиатурами, или по номенклатуре IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (см., Biochem. (1972), 11(9):1726-1732).

- 37 027835

В. Обзор

Предоставлены антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, связывающие и нейтрализующие респираторно-синцитиальный вирус. Антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, представляют собой нейтрализующие антитела, распознающие один или более эпитопов на поверхности PCB. В частности, антитела, предоставляемые по настоящему документу, связывают слитый белок (F) PCB. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать для профилактики и лечения. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, также можно использовать в качестве терапевтических средств.

Например, антитела можно использовать для предотвращения возникновения и/или распространения патогенных заболеваний, включая, но не ограничиваясь ингибированием передачи вируса между индивидуумами, ингибированием развития вирусной инфекции у хозяина и снижением вирусной нагрузки у индивидуума. Антитела также можно использовать для профилактики, лечения и/или ослабления одного или более симптомов инфекции PCB или для сокращения продолжительности инфекции PCB. Таким образом, лечение пациентов антителами, предоставляемыми по настоящему документу, может снижать смертность и/или уровень заболеваемости, ассоциированные с инфекцией PCB.

Персистенция PCB ассоциирована с возникновением ускользающих мутантов, которые невозможно нейтрализовать антителами. Таким образом, основной проблемой при разработке терапевтических антител к вирусам является получение или идентификация антител, с эпитоп для нейтрализации, который: 1) является консервативным в различных штаммах или серотипах и 2) сложен для эволюционирования вируса с повторным образованием ускользающих мутантов. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, связываются с различными подгруппами и штаммами PCB. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, также демонстрируют улучшенную по сравнению с существующими на известном уровне техники антителами активность нейтрализации вирусов. Предоставляемые антитела эффективно нейтрализуют вирус в течение последовательных раундов репликации, где PCB, как правило, образовывает ускользающие мутанты, устойчивые к нейтрализации. Способность ограничивать образование MARM означает, что антитела, предоставляемые по настоящему документу, связывают эпитоп, которые менее подвержен вариации в форме образующихся ускользающих мутантов. Таким образом, этот эпитоп отличается от эпитопов других известных антител к PCB. Таким образом, предоставляемые антитела к PCB в дополнение к профилактическому лечению, также пригодны для лечения инфекции PCB. В настоящее время не существует известных одобренных терапевтических антител против инфекции PCB. Таким образом, антитела, предоставляемые по настоящему документу, особенно важны для лечения инфекции PCB у пожилых пациентов, например, пожилых пациентов, находящихся в группах или домах престарелых, где близость индивидуумов увеличивает риск распространения вируса среди пациентов. Лечение антителами, предоставляемыми по настоящему документу, также важно в ситуациях, когда несоблюдение схемы лечения повышает риск ускользания вируса, так как несоблюдение схемы лечения при профилактическом лечении PCB паливизумабом в возрастающей степени вызывает резистентность вируса (см., например, Adams et al. (2010), Clin. Infect. Dis. 51(2): 185-188).

Как правило, антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, с высокой аффинностью связывают белок F PCB. По сравнению с существующими одобренными антителами к PCB (например, паливизумабом, синагисом (Synagis®)) высокоаффинные антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, предусматривают менее частое введение для профилактики и/или лечения инфекции PCB, для профилактики, лечения и/или снижения одного или более симптомов инфекции PCB, или для уменьшения продолжительности инфекции PCB. Таким образом, антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, пригодны в качестве терапевтических антител, т.е. для лечения инфекции PCB. Менее частое введение облегчает соблюдение схемы лечения и, таким образом, снижает вероятность пропуска дозы, что приводят к увеличению резистентности вируса к антителам к PCB. Более низкие дозы антител, которые иммуноспецифически связывают PCB, также могут снижать вероятность неблагоприятных воздействий при лечении иммуноглобулинами.

Как правило, антитела к PCB, предоставляемые по настоящему-документу, способны ингибировать или снижать один или более видов активности вируса, например, таких как ассоциация вируса с мембраной клетки-мишени, слияние вируса с мембраной клетки-мишени и/или проникновение в клетку, образование новых вирусных частиц, включая подавление репликации вируса, или слияние инфицированной клетки с другой клеткой (т.е. формирование синцития). Предоставляемые антитела к PCB также можно использовать для усиления иммунного ответа против инфекции PCB.

1. Респираторно-синцитиальный вирус.

PCB человека является членом подсемейства Pneumovirus семейства Paramyxoviridae. Существует две различные подгруппы PCB человека, группа А и группа В. Кроме того, каждый подтип делится на две штамма: А1 и А2 и В1 и В2. PCB представляет собой оболочечный несегментированный РНК содержащий вирус с минус-цепью с геномом, состоящим приблизительно из 15000 нуклеотидов, который кодирует одиннадцать вирусных белков.

PCB кодирует два основных поверхностных гликопротеина, гликопротеин G и гликопротеин F. Гликопротеин G или белок прикрепления отвечает за связывание вируса с клеточным рецептором, тогда

- 38 027835

как гликопротеин F или белок слияния способствует слиянию вирусной и клеточной мембран, обеспечивая проникновение вирусного рибонуклеопротеина в цитоплазму клетки (Lopez et al. (1998), J. Virology 72:6922-6928). Гликопротеин F также способствует слиянию мембран инфицированных клеток с мембранами соседних клеток, что приводит к формированию синцития. Белок F содержит две связанные

дисульфидным мостиком субъединицы, F₁ и F₂, которые образуются посредством протеолитического

расщепления неактивного N-гликозилированного предшественника. G-белок представляет собой трансмембранный гликопротеин II типа с массой 80-90 кДа, содержащий N- и O-связанные олигосахариды, связанные с белком-предшественником массой 32 кДа.

Показано, что антитела, получаемые к гликопротеинам F или G PCB, с высокой эффективностью нейтрализуют PCB in vitro и имеют профилактический эффект in vivo (см., например, Walsh et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 67:505; Beeler et al. (1989), J. Virol. 63:2941-2950, Garcia-Borreno et al. (1989), J. Virol. 63:925-932, Taylor et al. (1984), Immunology 52:137-142, и патенты США № 5824307 и 6818216). Антитела к белку F PCB также эффективны для ингибирования слияния инфицированных PCB клеток с соседними неинфицированными клетками.

Анализ различных моноклональных антител, которые иммуноспецифически связывают белок F PCB, привел к идентификации трех неперекрывающихся антигенных участков А, В и С и одного участка АВ (Beeler et al. (1989), J. Virol. 63:2941-2950). Каждый из антигенных участков содержит отличающийся эпитоп. В одном из исследований панели из 18 моноклональных антител на основе ускользающих от моноклональных антител мутантов (MARM) идентифицировали пять эпитопов антигенного участка А, четыре эпитопа антигенного участка В и четыре эпитопа антигенного участка С (см., например, Beeler et al. (1989), J. Virol. 63:2941-2950). Моноклональное антитело 1129, связывающее эпитоп 4 антигенного участка A (Beeler et al. (1989), J. Virology 63 (7):2841-2950), представляет собой исходное антитело, из которого получено гуманизированное антитело паливизумаб (синагис (SYNAGIS®)) (см. Johnson et al. (1997), J. Infect. Diseases 176:1215-1224 и патент США № 5824307). Также идентифицированы дополнительные эпитопы белка F PCB. Например, фрагмент Fab к PCB человека Fab19 (см. Barbas et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:10164-10168 и Crowe et al. (1994), Proc. Natl. Acad Sci USA 91:1386-1390) связывает эпитоп в антигенном участке А, который отличается от эпитопов, определенных Beeler et al. (см. Crowe et al. (1998), Virology 252:373-375 и Barbas et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10164-10168).

Белок F PCB демонстрирует более 91% сходства в подгруппах А и В PCB, а белок G PCB в подгруппах А и В PCB демонстрирует только 53% сходства аминокислот (Sullender (2000), Clin. Microbiol. Rev. 13:1-15). Поскольку вирусы подтипов А и В совместно циркулируют при большинстве эпидемий PCB, желательными являются антитела, нейтрализующие PCB подтипов А и В, такие как антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PCB, предоставляемые по настоящему документу.

PCB человека, подобно большинству РНК-содержащих вирусов, обладает способностью претерпевать быстрые мутации под давлением отбора. Отбор ускользающих мутантов PCB (MARM) in vitro с использованием моноклональных антител хорошо документирован (например, Garcia-Barreno et al. (1989), J. Virol. 63:925-932). Например, показано, что одноаминокислотные мутации по аминокислотным остаткам N262, 1266, N268, K272, S275, N276, Р389 или R429, или мутации двух аминокислот по F32 и K272 или А241 и K421 в белке F A2 PCB приводят к ускользанию от известных моноклональных антител к PCB (см., например, Crowe et al. (1998), Virology 252:373-375; Zhao et al. (2004), J. Infectious Disease 190:1941-1946 и Liu et al. (2007), Virology Journal 4:71). Кроме, показано, что паливизумаб (синагис (SYNAGIS®)) отбирает ускользающие мутанты in vitro, a также in vivo, и что некоторые выделенные мутанты полностью устойчивы к профилактике паливизумабом у хлопковых хомяков (см., например, Zhao et al. (2005), J. Virol. 79:3962-3968 и Zhao et al. (2004), J. Infect. Dis. 190:1941-1946). Например, показано, что одноаминокислотная мутация в белке F PCB приводит к ускользанию от паливизумаба (см., Zhao et al. (2004), J. Infectious Disease 190:1941-1946). Таким образом, предпочтительно антитело, которое эффективно нейтрализует вирус PCB в течение последовательных циклов репликации без образования ускользающих мутантов, такое как антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PCB, предоставляемые по настоящему документу.

Инфекция респираторно-синцитиального вируса (PCB) является основной причиной заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и маленьких детей. В Соединенных Штатах Америки инфекция PCB также является наиболее частой причиной бронхиолита или воспаления мелких бронхов в легких и пневмонии у детей в возрасте до 1 года. Кроме того, инфекция PCB также считают основной причой респираторных заболеваний у пожилых людей. Симптомы и патологические состояния, ассоциированные с инфекцией PCB, включают, например, астму, хрипы, реактивные заболевания дыхательных путей (RAD) и хроническое обструктивное заболевание легких (ХНЗЛ). Таким образом, как описано в настоящем документе, антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать для профилактики и лечения инфекции PCB и/или для облегчения одного или более симптомов такого опосредованного PCB заболевания.

- 39 027835

С. Антитела к PCB

По настоящему документу предоставлены антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, которые можно использовать для терапевтического, профилактического и диагностического применения. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать, например, для пассивной иммунизации индивидуума против PCB или для лечения индивидуума с вирусной инфекцией. В одном из примеров антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, используют для профилактики, т.е. для предотвращения инфекции PCB. В другом примере антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, используют в качестве терапевтических антител, т.е. для лечения вирусной инфекции PCB. В еще одном примере антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, используют для пассивной иммунизации индивидуума против PCB. Предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты также можно использовать для детекции инфекции PCB или для мониторинга инфекции PCB in vitro и in vivo.

1. Общая структура антител и функциональные домены.

Антитела в природе вырабатывают B-клетки в мембраносвязанной и секретируемой формах. Антитела специфически распознают и связывают эпитопы антигенов посредством специфических взаимодействий. Связывание антител с распознаваемыми антигенами может инициировать несколько эффекторных функций, которые вызывают нейтрализацию и клиренс токсинов, патогенных микроорганизмов и других возбудителей инфекции.

Разнообразие в специфичности антител в природе возникает вследствие рекомбинации в процессе развития B-клеток. В результате этих событий различные комбинации множества генных сегментов антител V, D и J, кодирующие вариабельные области молекул антител, соединяются с генами константных областей с получением природного репертуара антител с большим количеством разнообразных антител. Репертуар человеческих антител содержит более 10¹⁰ различных антигенных специфичностей и, таким образом, теоретически может специфически распознавать любой чужеродный антиген. Антитела включают такие продуцируемые в природе антитела, а также синтетические, т.е. рекомбинантно продуцируемые антитела, такие как фрагменты антител, включая антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу.

В уложенных полипептидах антител специфичность связывания обусловлена доменами антигенсвязывающих участков, содержащими части доменов вариабельных областей тяжелых и/или легких цепей. Другие домены молекулы антитела выполняют эффекторные функции, например, участвуя в таких событиях, как передача сигнала и взаимодействие с другими клетками, полипептидами и биомолекулами. Указанные эффекторные функции вызывают нейтрализацию и/или клиренс распознаваемого антителом возбудителя инфекции. Для изменения конкретных свойства, домены полипептидов антител можно изменять описанными в настоящем документе способами.

а. Структурные и функциональные домены антител.

Полноразмерные антитела содержат несколько цепей, доменов и областей. Обычные полноразмерные антитела состоят из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, каждая из которых содержит множество иммуноглобулиновых (Ig) доменов. Домен Ig характеризуется структурой, называемой Ig-укладка, содержащей два β-слоя, каждый из которых содержит антипараллельные β-цепи, связанные петлями. Два β-слоя в Ig-укладке удерживаются друг рядом с другом гидрофобными взаимодействиями и консервативными внутрицепочечными дисульфидными связями.

Домены Ig в цепях антитела представляют собой домены вариабельных (V) и константных (С) областей. Каждая тяжелая цепь связана с легкой цепью дисульфидной связью, и две тяжелые цепи связаны друг с другом дисульфидными связями. Связь тяжелых цепей опосредована гибкой областью тяжелой цепи, известной как шарнирная область.

Каждая легкая цепь обычного полноразмерного антитела содержит один домен вариабельной области (VL) и один домен константной области (CL). Каждая обычная полноразмерная тяжелая цепь содержит один домен вариабельной области (VH), три или четыре домена константных областей (CH) и, в некоторых случаях, шарнирную область. Вследствие событий рекомбинации, описываемых выше, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие домены вариабельных областей, в различных молекулах антител отличаются друг от друга и обеспечивают конкретным антителам антигенную специфичность. С другой стороны, константные области кодируют последовательности, которые у антител являются более консервативными. Эти домены обеспечивают функциональные свойства антител, например, способность взаимодействовать с клетками иммунной системы и сывороточными белками, обеспечивая клиренс возбудителей инфекции. Различные классы антител, например, IgM, IgD, IgG, IgA и IgE содержат различные константные области, что позволяет им выполнять различные эффекторные функции.

Каждый домен вариабельной области содержит три части, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) или гипервариабельными (HV) областями, которые кодируют высоковариабельные последовательности нуклеиновых кислот. CDR расположены в петлях, соединяющих β-слои домена вариабельной области Ig. Вместе три CDR тяжелой цепи (CDR1, CDR2 и CDR3) и три CDR лег- 40 027835

кой цепи (CDR1, CDR2 и CDR3) составляют обычный антигенсвязывающий участок антитела (участок связывания антитела), который физически взаимодействует с распознаваемым антигеном и обеспечивает специфичность антитела. Полноразмерное антитело содержит два идентичных участка связывания антитела, каждый из которых образован CDR одной тяжелой и одной легкой цепи. Так как CDR расположены в соединяющих β -цепи петлях, три CDR не следуют друг за другом в линейной последовательности аминокислот вариабельной области. После укладки полипептида антитела петли CDR оказываются в непосредственной близости, образуя участок связывания антигена. β-слои доменов вариабельных областей составляют каркасные области (FR), содержащие более консервативные последовательности, важные для других свойств антител, например, для их стабильности.

b. Фрагменты антител.

Антитела, предоставляемые по настоящему документу, включает фрагменты антител, которые являются производными полноразмерных антител, которые содержат меньше всей последовательности полноразмерного антитела, но которые сохраняют, по меньшей мере частично, способность специфического связывания полноразмерного антитела. Фрагменты антител также могут включать антигенсвязывающие части антител, которые можно вставлять в каркасные антитела (например, химерные антитела) с сохранением аффинности исходного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются фрагментами Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечными фрагментами Fv (scFv), фрагментами Fv, dsFv, диателами, фрагментами Fd и Fd', а также другими фрагментами, включая модифицированные фрагменты (см., например, Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003 г.); Chapter 1; p. 3-25, Kipriyanov). Фрагменты антител могут включать несколько цепей, связанных друг с другом, например, посредством дисульфидных мостиков, и их можно получать рекомбинантно. Фрагменты антител также могут содержать синтетические линкеры, такие как пептидные линкеры, для связывания двух или более доменов. Способы получения антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области, и их можно использовать для модификации любого антитела, предоставляемого по настоящему документу. Фрагменты молекул антител можно получать, например, ферментативным расщеплением. Например, при расщеплении папаином от двух областей Fab отщепляется димер константных областей тяжелых цепей, домен Fc (т.е. части, содержащие вариабельные области).

Одноцепочечные антитела можно конструировать рекомбинантно посредством связывания вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и вариабельной области легкой цепи (V_L) определенного антитела. Конкретные последовательности нуклеиновых кислот вариабельных областей можно клонировать стандартными способами молекулярной биологии, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и других способов рекомбинантных нуклеиновых кислот. Способы получения scFv описаны, например, в Whitlow and Filpula (1991), Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988), Science 242:423-426; Pack et al. (1993), Bio/Technology 11:1271-77; и в патентах США № 4946778, 5840300, 5667988, 5658727, 5258498. Одноцепочечные антитела также можно идентифицировать посредством скрининга библиотек одноцепочечных антител на связывание антигена-мишени. Способы получения и скрининга таких библиотек хорошо известны в данной области.

2. Примеры антител к PCB.

По настоящему документу предоставлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, связывающие и нейтрализующие PCB. В частности, антитела или антигенсвязывающие фрагменты иммуноспецифически связывают белок F PCB. Например, антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, иммуноспецифически связывают выделенный или очищенный или рекомбинантный белок F PCB. В других примерах антитела к PCB, предоставляемы по настоящему документу, иммуноспецифически связывают вирион PCB или вирус PCB, кодирующие поверхностный гликопротеин F (белок F PCB).

Антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, проявляют свойства, превосходящие или отличающиеся от свойств антител к PCB в данной области. Например, антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают антитела к PCB, проявляющие меньшую или улучшенную аффинность связывания к белку F PCB, такую как меньшая или улучшенная аффинность связывания к выделенному или очищенному или рекомбинантному белку F PCB или к вирусу или вириону PCB, экспрессирующим природный белок F. В других примерах, антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают антитела к PCB, проявляющие более высокую или лучшую нейтрализующую активность в отношении PCB. В конкретных примерах антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, включают антитела, связывающие эпитоп на PCB, менее подверженный вариации в форме образующихся ускользающих мутантов (MARM) в сравнении с другими антителами к PCB на известном уровне техники или существующими антителами к PCB. Например, в присутствии антитела к PCB, предоставляемого по настоящему документу, например, антитела 30D8 или его полноразмерной формы или фрагмента антитела другой формы, PCB не способен формировать ускользающего мутанта после более 10 циклов репликации вируса, а как правило, после более 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 циклов.

Антитела к PCB включают антитела sc5 или 58с5, или их полноразмерные формы или другие фор- 41 027835

мы фрагментов антител (см., например, патентную публикацию США № US 2011/0076268 и опубликованную международную заявку РСТ № WO 2011/020079). 58с5 представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую, цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 5. Антитело 58с5 или формы антигенсвязывающих фрагментов 58с5 и которые связывают тот же эпитоп что и 58с5, содержат тяжелую цепь с определяющими комплементарность областями (CDR) CDR1 V_H, указанной как GASINSDNYYWT (SEQ ID NO: 2) или SEQ ID NO: 435, CDR2 VH, указанной как HISYTGNTYYTPSLKS (SEQ ID NO: 3), и CDR3 V_H, указанной как CGAYVLISNCGWFDS (SEQ ID NO: 4; и легкую цепь с CDR CDR1 V_L, указанной как QASQDISTYLN (SEQ ID NO: 6), CDR2 VL, указанной как GASNLET (SEQ ID NO: 7), и CDR3 VL, указанной как QQYQYLPYT (SEQ ID NO: 8). Как правило, форма фрагмента антитела 58с5 содержит домен VH с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 1, и домен VL с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 5. sc5 представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 9, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 13.

Антитело или формы антигенсвязывающих фрагментов sc5 и которые связывают тот же эпитоп, что и sc5, содержат тяжелую цепь с определяющими комплементарность областями (CDR) CDR1 V_H, указанной как GDSISGSNWWN (SEQ ID NO: 10) или SEQ ID NO: 436, CDR2 VH, указанной как EIYYRGTTNYKSSLKG (SEQ ID NO: 11), и CDR3 VH, указанной как GGRSTFGPDYYYYMDV (SEQ ID NO: 12); и легкую цепь с CDR CDR1 V_L, указанной как RASQNIKNYLN (SEQ ID NO: 14), CDR2 V_L, указанной как AASTLQS (SEQ ID NO: 15), и CDR3 VL, указанной как QQSYNNQLT (SEQ ID NO: 16). Как правило, форма фрагмента антитела sc5 содержит домен VH с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 9, и домен VL, с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 13.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, включают моноклональные антитела, полиспецифические антитела, биспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, камелизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, фрагменты Fab, фрагменты

F(ab'), связанные дисульфидными связями Fv (sdFv) и антиидиотипические (анти-Id) антитела, интраантитела или антигенсвязывающие фрагменты указанного выше. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулы, содержащие антигенсвязывающий участок. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать в способах лечения и диагностики в формах, которые включают моноклональные антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, камелизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), связанные дисульфидными связями Fv (sdFv) и антиидиотипические (анти-Id) антитела, интраантитела или антигенсвязывающие фрагменты указанного выше. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулы, содержащие антигенсвязывающий участок. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Примеры антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, которые иммуноспецифически связываются с белком F PCB, включают 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 и 69F6, которые представляют собой фрагменты Fab, подробно описанные в других разделах настоящего документа. Примеры антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, также включают антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (домен V_H) и константный домен 1 тяжелой цепи (C_H1), и/или легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи (домен V_L) и константный домен легкой цепи (C_L) 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. Например, примеры антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, включают антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 454 или 456, и/или легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 или 457. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 396, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 395. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 398, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 397. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 400, и легкую

- 42 027835

цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 399. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 402, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 401. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 404, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 403. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 452, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 453. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 454, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 455. В конкретном примере антитело к PCB представляет собой фрагмент Fab, содержащий тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 456, и легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 457.

Антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают формы полноразмерных антител 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, также включают формы полноразмерных антител, содержащие антигенсвязывающий участок (например, CDR) 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. Полноразмерные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать любые константные области легких цепей и тяжелых цепей, известные в данной области, такие как любая константная область человека, известная в данной области. Например, полноразмерные антитела, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать константную область легкой цепи (CL), которая представляет собой легкую цепь каппа (k) человека, легкую цепь лямбда (λ) человека. Полноразмерные антитела, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать константную область тяжелой цепи (Сн1-линкер-Сн2-Сн3), которая происходит из любого изотипа, а в частности, которая происходит из IgG. Константная область, может представлять собой константную область подкласса IgG1 (SEQ ID NO: 356), константную область IgG2 (SEQ ID NO: 357), константную область IgG3 (SEQ ID NO: 358) или константную область IgG4 (SEQ ID NO: 359). В частности, формы полноразмерных антител любых антител, предоставляемых по настоящему документу, содержат константную область IgG подкласса IgG1.

Антитела, предоставляемые по настоящему документу, включают другие формы фрагментов антител 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 и 69F6, которые иммуноспецифически связывают белок F PCB. Такие фрагменты включают любой его антигенсвязывающий фрагмент или сконструированное антитело, содержащее антигенсвязывающий фрагмент(ы) 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6, сохраняющее способность связывать белок F PCB. Такие антитела включают, например, химерные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), связанные дисульфидными связями Fv (sdFv), антиидиотипические (анти-Id) антитела, интраантитела или антигенсвязывающий фрагменты любого из указанного выше. В конкретных примерах антитело представляет собой Fab 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6.

Примеры антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, включают антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие домен V_H и/или вариабельный домен легкой цепи V_L с последовательностью аминокислот домена V_H и/или домена V_L 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6 соответственно. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать домен V_H с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 398 или 402, аминокислотах 1-121 SEQ ID NO: 396, аминокислотах 1-123 SEQ ID NO: 404, аминокислотах 1-124 SEQ ID NO: 400 или 452, аминокислотах 1-133 SEQ ID NO: 454 или аминокислотах 1-118 SEQ ID NO: 456, и/или домен VL с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 397, 403 или 455, аминокислотах 1-108 SEQ ID NO: 399, аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395, аминокислотах 1-113 SEQ ID NO: 401, аминокислотах 1-111 SEQ ID NO: 453 или аминокислотах 1-109 SEQ ID NO: 457.

Примеры антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, включают антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие домен V_H и/или домен V_L с последовательностью аминокислот, которая на по меньшей мере или приблизительно 80% идентична домену V_H и/или домену V_L 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6 соответственно. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать домен VH с последовательностью аминокислот, которая на 80% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 398 или 402, аминокислотах 1-121 SEQ ID NO: 396, аминокислотах 1-123 SEQ ID NO: 404, аминокислотах 1-124 SEQ ID NO: 400 или 452, аминокислотах 1-133 SEQ ID NO: 454 или аминокислотах 1-118 SEQ ID NO: 456, и/или домен VL с последовательностью аминокислот, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 397, 403 или 455, аминокислотах 1-108 SEQ ID NO: 399, аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395, аминокислотах 1-113 SEQ ID NO: 401, аминокислотах 1-111 SEQ ID NO: 453 или аминокислотах 1-109 SEQ ID NO:

- 43 027835

457.

В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать домен V_H с последовательностью аминокислот, которая на по меньшей мере или приблизительно 81%, по меньшей мере или приблизительно на 82%, по меньшей мере или приблизительно на 83%, по меньшей мере или приблизительно на 84%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 86%, по меньшей мере или приблизительно на 87%, по меньшей мере или приблизительно на 88%, по меньшей мере или приблизительно на 89%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 91%, по меньшей мере или приблизительно на 92%, по меньшей мере или приблизительно на 93%, по меньшей мере или приблизительно на 94%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 96%, по меньшей мере или приблизительно на 97%, по меньшей мере или приблизительно на 98% или по меньшей мере или приблизительно на 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 398 или 402, аминокислотах 1-121 SEQ ID NO: 396, аминокислотах 1-123 SEQ ID NO: 404, аминокислотах 1-124 SEQ ID NO: 400 или 452, аминокислотах 1-133 SEQ ID NO: 454 или аминокислотах 1-118 SEQ ID NO: 456, и/или домен V_L с последовательностью аминокислот, которая на по меньшей мере или приблизительно 81%, по меньшей мере или приблизительно на 82%, по меньшей мере или приблизительно на 83%, по меньшей мере или приблизительно на 84%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 86%, по меньшей мере или приблизительно на 87%, по меньшей мере или приблизительно на 88%, по меньшей мере или приблизительно на 89%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 91%, по меньшей мере или приблизительно на 92%, по меньшей мере или приблизительно на 93%, по меньшей мере или приблизительно на 94%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 96%, по меньшей мере или приблизительно на 97%, по меньшей мере или приблизительно на 98% или по меньшей мере или приблизительно на 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 397, 403 или 455, аминокислотах 1-108 SEQ ID NO: 399, аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395, аминокислотах 1-113 SEQ ID NO: 401, аминокислотах 1-111 SEQ ID NO: 453 или аминокислотах 1-109 SEQ ID NO: 457.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен V_H с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-121 SEQ ID NO: 396, и содержащие домен VL с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен V_H с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 398, и содержащие домен V_L с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 397.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен VH с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-124 SEQ ID NO: 400, и содержащие домен V_L с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-108 SEQ ID NO: 399.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен VH с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-125 SEQ ID NO: 402, и содержащие домен VL с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последова- 44 027835

тельности, указанной в аминокислотах 1-113 SEQ ID NO: 401.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен V_H с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-123 SEQ ID NO: 404, и содержащие домен V_L с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 403.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен VH с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-124 SEQ ID NO: 452, и содержащие домен V_L с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-111 SEQ ID NO: 453.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен VH с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-133 SEQ ID NO: 454, и содержащие домен VL с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-107 SEQ ID NO: 455.

Таким образом, по настоящему документу предоставлены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен V_H с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-118 SEQ ID NO: 456, и содержащие домен VL с последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере или которая приблизительно на 80-99% идентична, например, на 90-99% или по меньшей мере на 95% идентична, например, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-109 SEQ ID NO: 457.

Также предоставлены антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) V_H, выбранных из CDR 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 или 482-484. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR1 VH с последовательностью аминокислот GFTFSGHTIA (SEQ ID NO: 405), GGTFDTYTIS (SEQ ID NO: 411), GFSITDFGIH (SEQ ID NO: 417), GASISSDNHYWS (SEQ ID NO: 423), GFTLKNYEMN (SEQ ID NO: 429), GHTIA (SEQ ID NO: 437), TYTIS (SEQ ID NO: 438), DFGIH (SEQ ID NO: 439), SDNHYWS (SEQ ID NO: 440), NYEMN (SEQ ID NO: 441), GVSINSNNYFWA (SEQ ID NO: 458), GDSFNDYFWT (SEQ ID NO: 464), GYSFTSYWIA (SEQ ID NO: 470), SNNYFWA (SEQ ID NO: 482), DYFWT (SEQ ID NO: 483) или SYWIA (SEQ ID NO: 484).

В другом примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 или 471. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR2 V_H с последовательностью аминокислот WVSTNNGNTEYAQKIQG (SEQ ID NO: 406), RIIPSLGETNYAHKLQG (SEQ ID NO: 412), LISYNEVNIHYGESVRG (SEQ ID NO: 418), SIYYTGGTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 424), YISSSGNWKYVDSVQG (SEQ ID NO: 430), NIYYGGSTHYNASLQS (SEQ ID NO: 459), EISHSGSTNYSPSLKS (SEQ ID NO: 465) или IIFPNDSDATYSPSFQG (SEQ ID NO: 471).

В другом примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 или 472. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR3 VH с последовательностью аминокислот EWLVMGGFAFDH (SEQ ID NO: 407), RITGPVDWVWDYGMDV (SEQ ID NO: 413), DVWEDSWLSLACFQE (SEQ ID NO: 419), GLFFITARPYWYFDL (SEQ ID NO: 425) или GFSIDKYDSSVDEY (SEQ ID NO: 431), SESIFWDYYYGLDV (SEQ ID NO: 460), GVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMDV (SEQ ID NO: 466) или QYYLGSFES (SEQ ID NO: 472).

- 45 027835

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 405, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 406, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 407. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 437, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 406, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 407.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 411, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 412, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 413. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 438, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 412, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 413.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 417, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 418, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 419. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 439, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 418, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 419.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 423, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 424, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 425. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 440, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 424, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 425.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 429, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 430, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO-.431. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 441, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 430, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 431.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 458, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 459, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 460. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 482, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 459, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 460.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 464, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 465, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 466. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 483, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 465, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 466.

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 470, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 471, и CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 472. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 484, CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 471, и CDR3 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 472.

Также предоставлены антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) VL, выбранных из CDR 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR1 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 или 473. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR1 V_L с последовательностью аминокислот GANNIGSQNVH (SEQ ID NO: 408),

- 46 027835

RASQNIKTYLN (SEQ ID NO: 414), RASQSISNWLA (SEQ ID NO: 420), RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 426), RASQSISNFLN (SEQ ID NO: 432), TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 461), RASQNINTWLA (SEQ ID NO: 467) или QASDISNYLN (SEQ ID NO: 473).

В другом примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR2 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 или 474. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR2 V_L с последовательностью аминокислот DDRDRPS(SEQ ID NO: 409), AVSNLQS (SEQ ID NO: 415), KASNLED (SEQ ID NO: 421), TLSYRAS (SEQ ID NO: 427), AASSLQG (SEQ ID NO: 433), EVTKRPS (SEQ ID NO: 462), AASFLQS(SEQ ID NO: 468) или DASYLDT (SEQ ID NO: 474).

В другом примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR3 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 или 475. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать CDR3 VL с последовательностью аминокислот QVWDSSRDQAVI (SEQ ID NO: 410), QQSFSIPLT (SEQ ID NO: 416), QQYNSYSGLS (SEQ ID NO: 422), MQRMEFPFT (SEQ ID NO: 428), QQTYISLYT (SEQ ID NO: 434), SSYAGSRHW (SEQ ID NO: 463), QQANSFPRT (SEQ ID NO: 469) или QQYDDLRGGFT (SEQ ID NO: 475).

В одном конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 408, CDR2 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 409, и CDR3 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 410. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 414, CDR2 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 415, и CDR3 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 416. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 420, CDR2 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 421, и CDR3 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 422.

В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 426, CDR2 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 427, и CDR3 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 428. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 432, CDR2 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 433, и CDR3 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 434. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 461, CDR2 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 462, и CDR3 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 463. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 467, CDR2 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 468, и CDR3 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 469. В другом конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 473, CDR2 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 474, и CDR3 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 475.

Для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно выбирать любую комбинацию CDR, предоставляемых по настоящему документу, при условии, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент сохраняют способность к иммуноспецифическому связыванию белок F PCB. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать каркасную область антитела, известную в данной области. Примеры каркасных областей включают выделенные природные или консенсусные каркасные области, включая каркасные области человек (см., например, Chothia et al. (1998), J. Mol. Biol. 278: 457-479). В некоторых примерах каркасная область антитела представляет собой каркасную область антитела человека. В некоторых примерах антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит каркасную область 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6.

Примеры выделенных антител к PCB или их антигенсвязывающие фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, включают любое антитело к PCB или его антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с тем же эпитопом на белке слияния (F) респираторносинцитиального вируса (PCB), что и любое из антител, предоставляемых по настоящему документу. В одном из примеров по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 30D8, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 396, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 395. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 104Е5, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 398, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 397. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 38F10,

- 47 027835

которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 400, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 399. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 14G3, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 402, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 401. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 90D3, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 404, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 403. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 56Е11, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 452, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 453. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 17С9, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 454, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 455. В другом примере по настоящему документу предоставлено антитело, связывающее тот же эпитоп, что и 69F6, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 456, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 457. Как правило, такие антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_H) или их антигенсвязывающие фрагменты.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, демонстрируют константу аффинности связывания (K_a) к эпитопу белка F PCB по меньшей мере или приблизительно 1 х 10⁸ M^-1, по меньшей мере или приблизительно 2,5х10⁸ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10⁸ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10⁹ M^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10⁹ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹⁰ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹⁰ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹¹ M^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹¹ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹² М^-1, по меньшей мере или приблизительно

5х10¹² М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹³ M^-1, по меньшей мере или приблизительно

5х10¹³ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹⁴ М^-1, по меньшей мере или приблизительно

5х10¹⁴ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹⁵ M^-1 или по меньшей мере или приблизительно

5х10¹⁵ М^-1. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, могут демонстрировать аффинность связывания к рекомбинантно очищенному белку F, такому как внеклеточный домен белка F штамма А2 PCB, указанный в SEQ ID NO: 25. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, также могут демонстрировать аффинность связывания к природному белку F PCB, такому как получают посредством инфицирования и экспрессии PCB в клетках. Антитела, предоставляемые по настоящему документу, могут обладать аффинностями связывания, которые для рекомбинантного белка F по сравнению с природным белком F PCB являются такими же или отличающимися. В отличие от этого, sc5 (см., например, патентную публикацию США № US 2011/0076268 и опубликованную международную заявку РСТ № WO 2011/020079) для природного белка F PCB или рекомбинантного белка F демонстрирует сходную аффинность связывания.

В некоторых примерах антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, демонстрируют константу диссоциации (Kd) эпитопа белка F PCB менее чем или приблизительно 1х10^-8 М, менее чем или приблизительно 4х10^-9 М, менее чем или приблизительно 2х10^-9 М, менее чем или приблизительно 1х10^-9 М, менее чем или приблизительно 2х10^-10 М, менее чем или приблизительно 1х10^-10 М, менее чем или приблизительно 2х10^-11 М, менее чем или приблизительно 1х10^-11 М, менее чем или приблизительно 2х10^-12 М, менее чем или приблизительно 1х10^-12 M, менее чем или приблизительно 2х10^-13 М, менее чем или приблизительно 1х10^-13 M, менее чем или приблизительно 2х10^-14 М, менее чем или приблизительно 1х10^-14 М, менее чем или приблизительно 2х10^-15 М, менее чем или приблизительно 1 х 10^-15 M или менее чем или приблизительно 2х 10^-16 М.

В некоторых примерах антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, в микроанализе нейтрализации in vitro при нейтрализации PCB обладают EC50 менее чем или приблизительно 0,005 нМ, менее чем или приблизительно 0,01 нМ, менее чем или приблизительно 0,025 нМ, менее чем или приблизительно 0,05 нМ, менее чем или приблизительно 0,075 нМ, менее чем или приблизительно 0,1 нМ, менее чем или приблизительно 0,5 нМ, менее чем или приблизительно 0,75 нМ, менее чем или приблизительно 1 нМ, менее чем или приблизительно менее чем или приблизительно 1,25 нМ, менее чем или приблизительно 1,5 нМ, менее чем или приблизительно 1,75 нМ или менее чем или приблизительно 2 нМ. В конкретных примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PCB, предоставляемые по настоящему документу, обладают EC₅₀ нейтрализации PCB в анализе подавления бляшкообразования in vitro от менее чем или приблизительно 0,005 нМ до менее чем или приблизительно 2 нМ; от менее чем или приблизительно 0,005 нМ до менее чем или приблизительно 1 нМ; от менее чем или приблизительно 0,005 нМ до менее чем или приблизительно 0,5 нМ; от менее чем или приблизительно 0,01 нМ до менее чем или приблизительно 1 нМ; от менее чем или приблизительно 0,05 нМ до менее чем или приблизительно 1 нМ; от менее чем или приблизительно 0,05 нМ до менее чем или приблизительно 0,5 нМ или от менее чем или приблизительно 0,1 нМ до менее чем или приблизительно 0,5 нМ.

- 48 027835

В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, при нейтрализации PCB в микроанализе нейтрализации in vitro нейтрализуют ускользающие от моноклональных антител мутанты (MARM) для различных антител к PCB. В конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, нейтрализуют MARM с EC₅₀ нейтрализации, которая является или является приблизительно такой же, как EC₅₀ нейтрализации исходного штамма PCB из которого получали MARM. Если первое антитело может нейтрализовать MARM, получаемые для второго антитела, можно сделать вывод, что антитела специфически связываются и взаимодействуют с различными эпитопами.

В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, связывают эпитоп, менее чувствительный к вариациям в форме формируемых ускользающих мутантов (MAR MS) В некоторых примерах PCB не способен формировать ускользающего мутанта после 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более последовательных циклов репликации вируса в присутствии антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу. В конкретном примере PCB не формирует ускользающего мутанта после 11, 12, 13, 14, 15 или более последовательных циклов репликации вируса в присутствии антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу. В другом конкретном примере PCB не способен осуществлять ускользание от антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемого по настоящему документу. Например, в примере 11А показано, что после 12 циклов репликации вируса в присутствии 30D8, PCB был не способен осуществлять ускользание. В отличие от этого, PCB был способен ускользать от мотавизумаба® всего лишь после 7 циклов репликации вируса.

В некоторых примерах антитела к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, по сравнению со связыванием PCB с его рецептором не на клетке-хозяине в отсутствие антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента ингибируют связывание PCB с его рецептором на клетке-хозяине по меньшей мере приблизительно на 99%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 10%. В некоторых примерах антитело или антигенсвязывающий фрагмент к PCB, предоставляемые по настоящему документу, по сравнению с репликацией PCB в отсутствие антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента подавляет репликацию PCB по меньшей мере приблизительно на 99%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 15% или по меньшей мере приблизительно на 10%.

В некоторых примерах антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, имеют время полужизни 15 суток или более, 20 суток или более, 25 суток или более, 30 суток или более, 40 суток или более, 45 суток или более, 50 суток или более, 55 суток или более, 60 суток или более, 3 месяца или более, 4 месяца или более или 5 месяцев или более. Способы увеличения времени полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, известны в данной области. Такие способы включают, например, пегилирование, гликозилирование и аминокислотные замены, например, описанные в настоящем документе.

а. Производные антитела.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать для получения производных антител, таких как химерные антитела или другие антигенсвязывающие фрагменты, такие как, например, фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd и Fd'. Как правило, производные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, полученные из исходного антитела, сохраняют специфичность связывания исходного антитела. Фрагменты антител можно получать любым способом, известным специалистам в данной области. Например, фрагменты Fab и F(ab')2 можно получать посредством протеолитического расщепления молекул иммуноглобулинов с использованием таких ферментов как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')2). Фрагменты F(ab')2 содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен тяжелой цепи CH1. Кроме того, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу,

- 49 027835

также можно получать различными способами фагового дисплея, известными в данной области. В некоторых примерах антигенсвязывающие вариабельные области антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно рекомбинантно сливать с одной или более известными в данной области константными областями с получением химерных полноразмерных антител, фрагментов Fab, Fab', F(ab')₂ или других антигенсвязывающих фрагментов. Примеры способов получения полноразмерных антител из фрагментов антител известны в данной области и предоставлены в настоящем документе. Способы получения химерных антител известны в данной области (см., например, Morrison (1985), Science 229:1202; Oi et al. (1986), BioTechniques 4:214; Gillies et al. (1989), J. Immunol. Methods 125:191-202; и патенты США № 5807715, 4816567 и 4816397).

Химерные антитела, содержащие одну или более CDR антител к PCB, предоставляемых по настоящему документу, и каркасные области из гетерологичных молекул иммуноглобулинов, можно получать различными способами, известными в данной области, включая, например, привитие CDR (ЕР 239400; публикация РСТ № WO 91/09967; и патенты США № 5225539, 5530101 и 5585089), обшивка или изменение поверхности (EP 592106, EP 519596; Padlan (1991), Molecular Immunology 28 (4/5):489-498; Studnicka et al. (1994), Protein Engineering 7(6): 805-814; and Roguska et al. (1994), PNAS 91:969-973) и перестановка цепей (патент США № 5565332).

В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 30D8 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 405-410 и 437) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 104E5 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 411-416 и 438) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 38F10 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 417-422 и 439) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 14G3 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 423-428 и 440) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 90D3 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 429-434 и 441) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 56E11 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 458-463 и 482) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 17C9 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 464-469 и 483) и гетерологичную каркасную область. В некоторых примерах антитела содержат одну или более CDR 69F6 (например, одну или более CDR, указанные в SEQ ID NO: 470-475 и 484) и гетерологичную каркасную область. Каркасные остатки в каркасных областях можно замещать соответствующими остатками из донорного антитела для CDR для изменения, например, улучшения, связывания антигена. Эти замены в каркасе идентифицируют способами, хорошо известными в данной области, например, посредством моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков с идентификацией каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей с идентификацией необычных каркасных остатков в конкретных положениях (см., например, патент США № 5585089; и Riechmann et al. (1988), Nature 332:323).

В некоторых примерах константа аффинности связывания (K_a) к эпитопу белка F PCB производных антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов составляет по меньшей мере или приблизительно 1х 10⁸ M^-1, по меньшей мере или приблизительно 2,5х10⁸ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10⁸ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1 х 10⁹ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10⁹ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹⁰ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹⁰ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 1х10¹¹ M^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹¹ M^-1, по

меньшей мере или приблизительно 1х10¹² М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹² М^-1, по

меньшей мере или приблизительно 1х10¹³ M^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹³ М^-1, по

меньшей мере или приблизительно 1х10¹⁴ М^-1, по меньшей мере или приблизительно 5х10¹⁴ М^-1, по

меньшей мере или приблизительно 1х10¹⁵ M^-1 или по меньшей мере или приблизительно 5х10¹⁵ М^-1.

В некоторых примерах константа диссоциации (Kd) к эпитопу белка F PCB производных антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов составляет менее чем или приблизительно 1 х 10^-8 М, менее чем или приблизительно 4х10^-9 М, менее чем или приблизительно 2х10^-9 М, менее чем или приблизительно 1х10^-9 M, менее чем или приблизительно 2х10^-10 М, менее чем или приблизительно 1х10^-10 М, менее чем или приблизительно 2х10^-11 М, менее чем или приблизительно 1х10^-11 M, менее чем или приблизительно 2х10^-12 М, менее чем или приблизительно 1х10^-12 M, менее чем или приблизительно 2х10^-13 М, менее чем или приблизительно 1х10^-13 M, менее чем или приблизительно 2х10^-14 M, менее чем или приблизительно 1х10^-14 М, менее чем или приблизительно 2х10^-15 М, менее чем или приблизительно 1 х 10^-15 М или менее чем или приблизительно 2х 10^-16 М.

В некоторых примерах производные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты нейтрализуют ускользающие от моноклональных антител мутанты (MARM) для различных антител к PCB при нейтрализации PCB в микроанализе нейтрализации in vitro. В конкретном примере антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, нейтрализуют MARM с EC50 нейтрализации являющейся такой же или приблизительно такой же как EC50 нейтрализа- 50 027835

ции исходного штамма PCB из которого получали MARM.

В некоторых примерах производные антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты связывают эпитоп, менее чувствительный к вариации в форме формируемых ускользающих мутантов. В некоторых примерах PCB не способен формировать ускользающего мутанта после 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более последовательных циклов репликации вируса в присутствии производного антитела к PCB или его антигенсвязывающий фрагмента, предоставляемых по настоящему документу. В другом конкретном примере PCB не способен осуществлять ускользание от производного антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу.

В некоторых примерах EC50 производных антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов при нейтрализации PCB в микроанализе нейтрализации in vitro составляет менее чем или приблизительно 0,005 нМ, менее чем или приблизительно 0,01 нМ, менее чем или приблизительно 0,025 нМ, менее чем или приблизительно 0,05 нМ, менее чем или приблизительно 0,075 нМ, менее чем или приблизительно 0,1 нМ, менее чем или приблизительно 0,5 нМ, менее чем или приблизительно 0,75 нМ, менее чем или приблизительно 1 нМ, менее чем или приблизительно 1,25 нМ, менее чем или приблизительно 1,5 нМ, менее чем или приблизительно 1,75 нМ, или менее чем или приблизительно 2 нМ. В конкретных примерах EC₅₀ нейтрализации PCB в анализе подавления бляшкообразования in vitro производных антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов составляет от менее чем или приблизительно 0,005 нМ до менее чем или приблизительно 2 нМ; от менее чем или приблизительно 0,005 нМ до менее чем или приблизительно 1 нМ; от менее чем или приблизительно 0,005 нМ до менее чем или приблизительно 0,5 нМ; от менее чем или приблизительно 0,01 нМ до менее чем или приблизительно 1 нМ; от менее чем или приблизительно 0,05 нМ до менее чем или приблизительно 1 нМ; от менее чем или приблизительно 0,05 нМ до менее чем или приблизительно 0,5 нМ; или от менее чем или приблизительно 0,1 нМ до менее чем или приблизительно 0,5 нМ.

Любое производное антитела к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать в схемах лечения, профилактическом лечении и/или способах диагностики, так как в предоставляемых способах. Например, производные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для связывания PCB для лечения, предотвращения и/или детекции инфекции PCB или снижения одного или более симптомов инфекции PCB.

i. Одноцепочечные антитела.

В конкретных примерах антитело к PCB представляет собой одноцепочечное антитело. Одноцепочечное антитело можно получать из антигенсвязывающих доменов любых антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу. В данной области известны способы получения одноцепочечных антител рекомбинантными способами, такими как способы, описанные, например, в Marasco et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893, Whitlow and Filpula. (1991), Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988), Science 242:423-426; Pack et al. (1993), Bio/Technology 11:1271-77; и в патентах США № 4946778, 5840300, 5667988, 5658727.

Одноцепочечное антитело может содержать вариабельный домен легкой цепи (домен VL) или ее функциональную область и вариабельный домен тяжелой цепи (домен V_H) или их функциональную область из любого антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу. В некоторых примерах домен V_L или его функциональная область в одноцепочечном антителе содержат определяющую комплементарность область 1 (CDR1), определяющую комплементарность область 2 (CDR2) и/или определяющую комплементарность область 3 (CDR3) любого антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PCB, предоставляемых по настоящему документу. В некоторых примерах домен VH или его функциональная область в одноцепочечном антителе содержат определяющую комплементарность область 1 (CDR1), определяющую комплементарность область 2 (CDR2) и определяющую комплементарность область 3 (CDR3) любого антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PCB, предоставляемых по настоящему документу. В некоторых примерах одноцепочечное антитело дополнительно содержит пептидный линкер. В таких примерах пептидный линкер может располагаться между вариабельным доменом легкой цепи (V_L) и вариабельным доменом тяжелой цепи (V_H).

Одноцепочечные антитела между одним или более доменами антитела могут содержать пептидный спейсер или линкер. Например, вариабельный домен легкой цепи (V_L) антитела может быть связан с вариабельным доменом тяжелой цепи (V_H) посредством гибкого пептидного линкера. Различные пептидные линкеры хорошо известны в данной области и их можно использовать в предоставляемых способах. Пептидный линкер может содержать несколько остатков глицина (Gly) или остатков серина (Ser). Примерами полипептидных линкеров являются пептиды с аминокислотными последовательностями (GlySer)n, (GlymSer)n или (SermGly)n, где m представляет собой от 1 до 6, как правило, от 1 до 4 и, как правило, от 2 до 4, и n представляет собой от 1 до 30 или от 1 до 10, как правило, от 1 до 4, при этом по всей длине линкера для увеличения растворимости расположено несколько остатков глутаминовой кислоты (Glu) и лизина (Lys) (см., например, международную заявку РСТ № WO 96/06641, в которой предоставлены примеры линкеров для использования в конъюгатах). Примеры пептидных линкеров включают, но не ограничиваются пептидами с последовательностями GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 267), GSGRSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 268), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 269), EGKSSGSGSESKSTQ

- 51 027835

(SEQ ID NO: 270), EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 271), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 272), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 273) и ESGSVSSEELAFRSLD (SEQ ID NO: 274). Как правило, длина пептидных линкеров составляют приблизительно 1-50 аминокислот. Также линкеры, используемые по настоящему документу, могут увеличивать внутриклеточную доступность, стабильность в сыворотке, специфичность и растворимость или обеспечивать большую гибкость и снимать стерические препятствия. Линкерные молекулы описаны, например, в Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, Whitlow et al. (1993), Protein Engineering 6:989-995, и Newton et al. (1996), Biochemistry 35:545-553. Другие подходящие пептидные линкеры включают линкеры, описанные в патентах США № 4751180 и 4935233, которые, таким образом, включены в настоящий документ в качестве ссылки.

ii. Антиидиотипические антитела.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать для получения антиидиотипических антител, которые "имитируют" антиген белка F PCB, с которым иммуноспецифически связываются антитела, способами, хорошо известными специалистам в данной области (см., например, Greenspan and Bona (1989), FASEB J. 7 (5):437-444; и Nissinoff (1991), J. Immunol. 147 (8):2429-2438). Например, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, связывающие и конкурентно ингибирующие связывание PCB с его рецептором на клетке-хозяине, как определяют посредством хорошо известных в данной области анализов, можно использовать для получения антиидиотипических антител, которые "имитируют" антиген PCB и связывают рецепторами PCB, т.е. конкурируют с этим вирусом за связывание с клеткой-хозяином, таким образом, снижая скорость инфицирования клеток-хозяев вирусом. В некоторых примерах анти-антиидиотипические антитела можно получать хорошо известными специалистам в данной области способами. Анти-антиидиотипические антитела имитируют связывающий домен антитела к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент и, как следствие, связывают и нейтрализуют PCB.

iii. Полиспецифические антитела и мультимеризация антител.

Два или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно конструировать с формированием поливалентных производных антител или мультимеров, таких как двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентные, пятивалентные, шестивалентные, семивалентные производные антитела или производные антитела большей валентности (например, содержащее 2, 3, 4, 5, 6, 7 и более антигенсвязывающих участков). Такие производные поливалентные антитела могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или большей полиспецифичности. В некоторых примерах поливалентные производные антитела являются моноспецифическими, содержащими два или более антигенсвязывающих доменов, иммуноспецифически связывающих один и тот же эпитоп. В некоторых примерах поливалентные производные антитела являются полиспецифическими, содержащими два или более антигенсвязывающих домена, иммуноспецифически связывающих два или более различных эпитопов. В некоторых конкретных примерах поливалентные производные антитела являются двухвалентными, содержащими два антигенсвязывающих домена. Такие двухвалентные антитела могут быть гомобивалентными или гетеробивалентными антителами, которые иммуноспецифически связывают одинаковые или различные эпитопы соответственно.

В некоторых примерах полиспецифические антитела могут иммуноспецифически связывать два или более различных эпитопов PCB. Способы конструирования полиспецифических антител известны в данной области и включают, например, связывание двух или более антигенсвязывающих фрагментов посредством ковалентной, нековалентной или химической связей. В некоторых случаях поливалентные производные антитела можно формировать посредством димеризации двух или более антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. Мультимеризация двух антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов может быть самопроизвольной или может происходить вследствие вынужденного связывания двух или более полипептидов. В одном из примеров мультимеры антител к PCB могут быть связаны дисульфидными связями, формируемыми между остатками цистеина в различных антителах к PCB. В другом примере поливалентные производные антитела могут включать антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, связанные посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий с пептидными молекулами, слитыми с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. Такие пептиды могут представлять собой пептидные линкеры (спейсеры) или пептиды, которые обладают свойством стимуляции мультимеризации. В некоторых примерах поливалентные производные антитела можно формировать из двух антител посредством химического связывания, например, с использованием гетеробифункциональных линкеров.

Из антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно получать любые полиспецифические и/или поливалентные производные антитела, при условии, что антитело биосовместимо (например, для введения в организм животных, включая человека) и сохраняет свою активность, такую как связывание одного или более эпитопов и/или нейтрализация PCB. Для полиспецифических и поливалентных производных антител, предоставляемых по настоящему документу, производное антитело, по меньшей мере, иммуноспецифично к эпитопу, распознаваемому 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. Полиспецифическое и поливалентное производ- 52 027835

ное антитело, предоставляемое по настоящему документу, также может быть иммуноспецифичным к эпитопу, распознаваемому 58с5 или sc5.

В некоторых примерах полиспецифическое и/или поливалентное антитело содержит CDR1 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 2, 10, 405, 411, 417, 423, 429, 435-441, 458, 464, 470 или 482-484, CDR2 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 3, 11, 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 или 471, CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 4, 12, 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 или 472, CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 6, 14, 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 или 473, CDR2 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 7, 15, 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 или 474, CDR3 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 8, 16, 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 или 475, или любое их сочетание.

В некоторых примерах можно получать полиспецифические антитела, которые иммуноспецифически связывают два или более эпитопов белка F PCB (например, белка F PCB с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 282, 382 или 485). Например, полиспецифические антитела могут иммуноспецифически связывать два или более различных эпитопов в антигенных областях А, В или С белка F PCB. В некоторых примерах можно получать полиспецифические антитела, которые иммуноспецифически связывают эпитоп белка F PCB и другой эпитоп PCB. Например, полиспецифические антитела могут иммуноспецифически связывать эпитоп белка F PCB и эпитоп другого поверхностного гликопротеина PCB. В некоторых примерах полиспецифические антитела могут иммуноспецифически связывать эпитоп белка F PCB и эпитоп белка PCB, выбранного из белка присоединения PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 275), большого структурного белка βсубъединицы РНК-полимеразы PCB (белка L) (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 276), белка нуклеокапсида PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 277), нуклеопротеина PCB (N) (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 278), фосфопротеина Р PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 279), матриксного белка PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 280), малого гидрофобного (SH) белка PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 281), РНК-зависимой полимеразы PCB, белка G PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 282) или аллельного варианта любого из указанного выше. В некоторых примерах полиспецифические антитела могут иммуноспецифически связывать эпитоп белка F PCB и эпитоп белка G PCB.

В некоторых примерах полиспецифическое антитело содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6 и антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из другого антитела к PCB. Например, другое антитело к PCB может представлять собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, получаемые из 58с5 или sc5. В некоторых примерах полиспецифическое антитело содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6, и антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из антитела к PCB, выбранного bp паливизумаба (синагис (SYNAGIS®)) и его производных, в качестве неограничивающих примеров, таких как мотавизумаб (NUMAX®), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, А12а6, А13с4, A17d4, A4B4, А8с7, 1X-493L1, FR H3-3F4, М3И9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7B5, L2-15B10, A13a11, A1h5, А4В4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4F52S (см., например, патенты США № 5824307 и 6818216). В некоторых примерах полиспецифическое антитело содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6, и антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из антитела человека к PCB, в качестве неограничивающих примеров, такого как rsv6, rsv11, rsv13, rsv19 (т.е. Fab19), rsv21, rsv22, rsv23, RF-1 и RF-2 (см., например, патенты США № 6685942 и 5811524). В некоторых примерах полиспецифическое антитело содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6, и антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из моноклонального антитела мыши к PCB, в качестве неограничивающих примеров, такого как MAb 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243 (Beeler et al. (1989), J. Virology 63 (7): 2841-2950), MAb 151 (Mufson et al. (1987), J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539), MAb 43-1 и 13-1 (Fernie et al. (1982), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271), MAb 1436C, 1302A, 1308F и 1331Н (Anderson et al. (1984), J. Clin. Microbiol. 19:934-936), и их гуманизированные производные. Дополнительные примеры антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые можно использовать для получения полиспецифического антитела, содержащего антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, получаемый из 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6 в качестве неограничивающих примеров включают антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные, например, в патентах США № 6413771, 5840298, 5811524, 6656467, 6537809, 7364742, 7070786, 5955364, 7488477, 6818216, 5824307, 7364737, 6685942 и 5762905 и патентных заявках США № 20070082002, 2005-0175986, 2004-0234528, 2006-0198840, 2009-0110684, 2006-0159695, 2006-0013824, 20050288491, 2005-0019758, 2008-0226630, 2009-0137003 и 2009-0092609. В табл. 2А и 2В ниже указаны SEQ

- 53 027835

ID NO тяжелых цепей (табл. 2А) и легких цепей (табл. 2В) антител к PCB. Включены полноразмерные последовательности тяжелых и легких цепей, последовательности вариабельных доменов тяжелых и легких цепей и последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и/или CDRL3, где указано.

Таблица 2А

SEQ ID NO тяжелой цепи антитела к PCB

- 54 027835

Таблица 2В

SEQ ID NO легкой цепи антитела к РСВ

	Легкая цепь	Вариабельный домен	CDR1	CDR2	CDR3
Синагис	108	109	110	111	112
AFFF	117	118	119	120	121
Р1212 P12f4 Plld4 Ale9 А12аб А13С4 A17d4 А4В4 А8с7 IX-493L1FR МЗН9 Y10H6 DG AFFF {1) 6Н8 L1-7E5 L2-15B10 А13а11 Alh5 А4В4 (1) A4B4L1 A4B4-F25S H3-3F4 А3е2 А14а4 А16Ь4	127 134 140 146 152 158 164 169 174 177 180 183 189 191 195 199 202 207 211 216 220 223 228 236 242 248	128 135 141 147 153 159 165 170 175 178 181 184 192 196 200 203 208 212 217 221 224 229 237 243 249	129 142 154 166 213 244 250	130 136 143 148 160 171 231 185 197 204 209 214 218 225 238 245 251	193
А17Ь5	254	255		256
A17f5	260	261		262
A17h4	263	264	265	266
RSV6/11/21/22	370		371	372	373
Rsvl3/19H	378		379	380	381
Rsv23	374		375	376	377

В некоторых примерах полиспецифические антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут иммуноспецифически связывать эпитоп белка F PCB и эпитоп другого гетерологичного полипептида или другого антигенного материала, такого как, например, твердый материал подложки (см., например, международные заявки PCT № WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 и WO 92/05793/ патенты США № 4474893, 4714681, 4925648, 5573920, 5601819, Tutt, et al. (1991), J. Immunol. 147:60-69; и Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148:1547-1553.)

(1) Мультимеризация посредством пептидных линкеров.

Для получения поливалентных антител, например, таких как мультимеры, в которых одним из партнеров по мультимеризации является антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать пептидные линкеры. В одном из примеров пептидные линкеры могут быть слиты с С-концом первого полипептида и N-концом второго полипептида. Эта структура может быть повторена несколько раз так, что по меньшей мере один, например 2, 3, 4 или более растворимых полипептидов связываются друг с другом посредством пептидных линкеров на их соответствующих концах. Например, мультимерный полипептид может иметь последовательность Z1-X-Z2, где каждый из Z₁ и Z₂ представляет собой последовательность антигенсвязывающего фрагмента антитела к PCB (например, одноцепочечное антитело к PCB, см., например, патент США № 6759518,

- 55 027835

описывающий мультимеризацию одноцепочечных антител), где X представляет собой последовательность пептидного линкера. В некоторых случаях Z1 и/или Z2 представляют собой антигенсвязывающие фрагменты антител к PCB, предоставляемые по настоящему документу. В другом примере Z₁ и Z₂ представляет собой различные антигенсвязывающие фрагменты антител к PCB, где, по меньшей мере, Z₁ или Z₂ получены из антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу. В некоторых примерах мультимерный полипептид имеет последовательность Z1-X-Z2-(XZ)_n, где "n" представляет собой любое целое число, т.е., как правило, 1 или 2. Как правило, пептидный линкер имеет достаточную длину, чтобы каждый антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB связывал соответствующий ему эпитоп без изменения специфичности связывания антитела.

(2) Мультимеризация посредством гетеробифункциональных сшивающих средств.

Связь между антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, и другим антителом или антигенсвязывающим фрагментом к PCB, приводящая к поливалентным антителам, может являться прямой или непрямой. Например, связывания двух или более антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов можно достигать посредством химического связывания или посредством гетеробифункциональных линкеров, таких как любые известные в данной области или предоставляемые по настоящему документу.

Специалистам в данной области известно множество гетеробифункциональных сшивающих реагентов, которые используют для формирования ковалентных связей между аминогруппами и тиольными группами и для введения тиольных групп в белки (см., например, PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993, в которых описано получение и применение таких реагентов и предоставлен коммерческий источник таких реагентов; см. также, например, Cumber et al. (1992), Bioconjugate Chem. 3:397-401; Thorpe et al. (1987), Cancer Res. 47:5924-5931; Gordon et al. (1987), Proc. Natl. Acad Sci. 84:308-312; Walden et al. (1986), J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson et al. (1978), Biochem. J. 173: 723-737; Mahan et al. (1987), Anal. Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak et al. (1992), Br. J. Cancer 66:361366; Fattom et al. (1992), Infection & Immun. 60:584-589). Эти реагенты можно использовать для формирования ковалентных связей между двумя антителами или между каждым из антител и линкером. Примеры реагентов в качестве неограничивающих примеров включают:

Ы-сукцинимидил-3-(2-ииридилдитио)ироиионат (SPDP; дисульфидный линкер); сульфосукцинимидил 6-[3-(2-ииридилдитио)ироиионамидо]гексаноат (сульфо-LC-SPDP); сукцинимидилоксикарбонил-а-метилбензилтиосульфат (SMBT, иространственно-затрудненный

дисульфатный линкер);

сукцинимидил-6-[3-(2-ииридилдитио)ироиионамидо]гексаноат (LC-SPDP); сульфосукцинимидил 4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC); сукцинимидил 3-(2-ииридилдитио)бутират (SPDB; линкер с иространственно-затрудненной дисульфидной связью);

сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиоироиионат (SAED); сульфосукцинимидил 7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (SAMCA);

сульфосукцини\1идил-6-|а-\1етил-а-(2-пиридилдитио)толуа\1идо|гексаноат (сульфо-LC-SMPT);

1,4-ди-[3'-(2'-ииридилдитио)ироиионамидо]бутан (DPDPB);

4-сукцинимидилоксикарбонил-а-метил-а-(2-ииридилтио)толуол (SMPT, иространственнозатрудненный дисульфатный линкер);

сульфосукцинимидил-6-[а-метил-а-(2-ииримидилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-SMPT); м-малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимидный сложный эфир (MBS); м-малеимидобензоил-Ы-гидроксисульфосукцинимидный сложный эфир (сульфо-MBS); Ы-сукцинимидил(4-йодоацетил)аминобензоат (SIAB; тиоэфирный линкер); сульфосукцинимидил-(4-йодоацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB); сукцинимидил-4-(и-малеимидофенил)бутират (SMPB);

сульфосукцинимидил-4-(и-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB) и азидобензоилгидразид

(АВН).

В некоторых иримерах линкеры можно исиользовать в комбинации с иеитидными линкерами, такими как линкеры, которые иовышают гибкость и растворимость или которые обесиечивают снятие стерических иреиятствий. Для соединения иолииеитидной молекулы с другой молекулой можно исиользовать любые другие линкеры, известные сиециалистам в данной области.

(3) Полииеитидные домены мультимеризации.

Взаимодействие двух или более антигенсвязывающих фрагментов с формированием иоливалентных и/или иолисиецифических ироизводных антител можно облегчать их связыванием, ирямым или не ирямым, с любой молекулой или другим иолииеитидом, которые сами сиособны взаимодействовать с формированием стабильной структуры. Наиример, иосредством мультимеризации можно связывать отдельно кодируемые иолииеитидные цеии, где мультимеризация иолииеитидов оиосредована доменами мультимеризации. Как иравило, домен мультимеризации обесиечивает формирование стабильных белокбелковых взаимодействий между иервым химерным иолииеитидом и вторым химерным иолииеитидом.

- 56 027835

Химерные полипептиды включают, например, связь (прямую или непрямую) одной цепи (например, вариабельного домена тяжелой цепи или вариабельного домена легкой цепи) антитела или антигенсвязывающего фрагмента с доменом мультимеризации. Как правило, домен мультимеризации связан с доменом тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающим фрагментом. Такие химерные полипептиды можно получать в виде слитых белков рекомбинантными способами слияния нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела, с нуклеиновой кислотой, кодирующей домен мультимеризации.

Для поливалентных и/или полиспецифических производных антител по настоящему документу по меньшей мере один партнер по мультимеризации представляет собой антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, прямо или опосредованно связанные с доменом мультимеризации. При совместной экспрессии отдельных химерных полипептидов можно получать гомо- и гетеромультимерные полипептиды. Первый и второй химерные полипептиды могут быть одинаковыми или различными.

Как правило, домен мультимеризации включает любой полипептид, способный формировать стабильные белок-белковых взаимодействия с другим полипептидом. Домены мультимеризации могут взаимодействовать, например, посредством иммуноглобулиновых последовательностей (например, домен Fc), лейциновых застежек, гидрофобных областей, гидрофильных областей или свободных тиольных групп, которые формируют межмолекулярные дисульфидные связи между химерными молекулами гомо- или гетеромультимера. Кроме того, домены мультимеризации могут включать аминокислотную последовательность, формирующую выступ, комплементарный аминокислотной последовательности, формирующей углубление или карман, как описано, например, в патенте США № 5731168. Можно сконструировать такие домены мультимеризации так, что стерические взаимодействия будут не только способствовать стабильному взаимодействию, но и дополнительно способствовать формированию из смеси химерных мономеров гетеродимеров, а не гомодимеров.

В некоторых примерах поливалентные и/или полиспецифические антитела получают посредством связывания двух антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB посредством доменов мультимеризации. В таких примерах по меньшей мере один из антигенсвязывающих фрагментов получают из антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PCB, предоставляемых по настоящему документу, например, таких как 58с5, sc5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6.

Антигенсвязывающий полипептид, например, антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB, можно конъюгировать с доменом мультимеризации с получением химерного полипептида. Для антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB, состоящих более чем из одной цепи (например, вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи), домен мультимеризации можно конъюгировать с одной из цепей, как правило, с тяжелой цепью. Как правило, антигенсвязывающие фрагменты посредством своих N- или С-концов связаны с N- или С-концами домена мультимеризации. Как правило, домен мультимеризации конъюгирован с С-концом антигенсвязывающего фрагмента (например, с Сконцом одноцепочечного антитела или С-концом одной цепи антигенсвязывающего фрагмента). Связь может быть прямой или опосредованной линкером. Кроме того, химерный полипептид может представлять собой слитый белок или его можно формировать посредством химического связывания, например, посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Например, при получении химерного полипептида, содержащего домен мультимеризации, нуклеиновая кислота, кодирующая весь антигенсвязывающий фрагмент антитела к PCB или его часть, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей последовательность домена мультимеризации, напрямую или опосредовано или необязательно посредством линкерного домена. Как правило, конструкция кодирует химерный белок, где C-конец антигенсвязывающего фрагмента антитела к PCB (или одной цепи антигенсвязывающего фрагмента) связан с N-концом домена мультимеризации.

Поливалентное антитело, предоставляемое по настоящему документу, содержит два химерных белка, получаемых связыванием, прямо или опосредовано, двух одинаковых или различных антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB прямо или опосредовано с доменом мультимеризации. В некоторых примерах, где домен мультимеризации представляет собой полипептид, слитый ген, кодирующий химерный полипептид антигенсвязывающего фрагмента антитела к PCB (или одноцепочечными антигенсвязывающие фрагменты)-домена мультимеризации, вставлен в соответствующий экспрессирующий вектор. Получаемые химерные белки антигенсвязывающего фрагмента антитела к PCB-домена мультимеризации можно экспрессировать в клетках-хозяевах, трансформированных рекомбинантным экспрессирующим вектором, и позволять собираться в мультимеры, где домены мультимеризации взаимодействуют с формированием поливалентных антител. Химическое связывание доменов мультимеризации с антигенсвязывающими фрагментами антител к PCB также можно проводить с использованием гетеробифункциональных линкеров, как описано выше. В некоторых примерах поливалентные антитела представляют собой полиспецифические антитела, которые получают из двух или более антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB, связывающих различные эпитопы.

Получаемые химерные полипептиды и формирующиеся из них поливалентные антитела можно очищать любым подходящим способом, известным в данной области, например, посредством аффинной хроматографии на колонках с белком А или белком G. Когда клетки трансформируют двумя молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими различные химерные полипептиды антигенсвязывающих фрагмен- 57 027835

тов антител к PCB, происходит формирование гомо- и гетеродимеров. Условия для экспрессии можно подбирать таким образом, что формирование гетеродимеров превалирует над формированием гомодимеров.

(а) Иммуноглобулиновый домен.

Домены мультимеризации включают домены, которые содержат свободные тиольные группу, способную реагировать с формированием межмолекулярной дисульфидной связи с доменом мультимеризации дополнительной аминокислотной последовательности. Например, домен мультимеризации может включать в себя часть молекулы иммуноглобулина, например, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE. Как правило, выбранная для применения в качестве домена мультимеризации часть иммуноглобулина представляет собой константную область (Fc). Получение слитых белков, содержащих полипептиды, слитые с различными частями полученных из антител полипептидов, включая домен Fc, описано (см., например, Ashkenazi et al. (1991), PNAS 88: 10535; Bym et al. (1990), Nature, 344:677; Hollenbaugh and Aruffo (1992), "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pp. 10.19.1-10.19.11).

У человека описано пять изотипов антител, классифицируемых на основе их тяжелых цепей, обозначаемых дельта (δ), гамма (γ), мю (μ), альфа (α) и эпсилон (ε), что дает классы антител IgD, IgG, IgM, IgA и IgE соответственно. Классы IgA и IgG включают подклассы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Различия последовательностей тяжелых цепей иммуноглобулинов обуславливает различные изотипы, отличающиеся, например, по количеству константных (С) доменов, наличию шарнирной области, а также количеству и расположению межцепочечных дисульфидных связей. Например, тяжелые цепи IgM и IgE содержат дополнительный домен С (С4), который заменяет шарнирную область. Области Fc IgG, IgD, и IgA спариваются друг с другом посредством своих доменов С<53. Ογ3 и Ca3, в то время как фрагменты Fc IgM и IgE димеризуются посредством доменов Cμ4 и Cε4. IgM и IgA образуют поливалентные структуры с десятью и четырьмя антигенсвязывающими участками соответственно.

Антигенсвязывающие химерные полипептиды, предоставляемые по настоящему документу, включают полноразмерные полипептиды иммуноглобулинов (т.е. включающие все домены полноразмерного иммуноглобулина). В некоторых примерах химерный антигенсвязывающий полипептид меньше полноразмерного (например, химерный полипептид может содержать антигенсвязывающий домен и один или более иммуноглобулиновых доменов для мультимеризации, где химерный полипептид не представляет собой полноразмерный иммуноглобулин). В некоторых примерах химерные полипептиды антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB собирают как моновалентные или гетеро- или гомополивалентные антитела, такие как двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентные, пятивалентные, шестивалентные, семивалентные антитела или антитела большей валентности. Для сборки моновалентного и гетеро- или гомо-поливалентного антитела можно использовать цепи и основные компоненты различных структур (например, еще несколько гетерологичных константных областей или доменов). Химерные полипептиды антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB можно легко получать и секретировать с использованием клеток млекопитающих, трансформированных соответствующей молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах для получения поливалентных антител, где антигенсвязывающие части антител к PCB поливалентного антитела являются одинаковыми или разными, клетки-хозяева можно трансформировать одной или более молекулами гибридной нуклеиновой кислоты. Как правило, по меньшей мере одну часть антигенсвязывающего фрагмента антитела к PCB поливалентного антитела получают из антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, таких как, например, 58с5, sc5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6.

(i) домен Fc.

Примеры доменов мультимеризации, которые можно использовать для получения поливалентных и/или полиспецифическых антител, содержащих антигенсвязывающие фрагменты антител к PCB, предоставляемые по настоящему документу, включают полипептиды, полученные из константной области тяжелой цепи или домена выбранной молекулы иммуноглобулина. Примеры последовательностей константной области тяжелой цепи подтипов IgG человека указаны в SEQ ID NO: 356 (IgG1), SEQ ID NO: 357 (IgG2), SEQ ID NO: 358 (IgG3) и SEQ ID NO: 359 (IgG4). Например, для примера константной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 356, домен CH1 соответствует аминокислотам 1-103, шарнирная область соответствует аминокислотам 104-119, домен CH2 соответствует аминокислотам 120-223 и домен CH3 соответствует аминокислотам 224-330.

В одном из примеров химерный белок с полипептидом иммуноглобулина может содержать область Fc полипептида иммуноглобулина. Как правило, такой слитый белок сохраняет, по меньшей мере, функционально активный шарнир, домены константной области тяжелой цепи иммуноглобулина C_H2 и C_H3. Например, последовательность полноразмерного Fc IgG1 содержит аминокислоты 104-330 последовательности, указанной в SEQ ID NO: 356. Пример последовательности Fc для hIgG1 указан в SEQ ID NO: 360 и содержит последовательность шарнира, соответствующую аминокислотам 104-119 SEQ ID N0:356, и полную последовательность доменов CH2 и CH3, как указано в SEQ ID NO: 356. Другой пример полипептида Fc приведен в заявке PCT WO 93/10151 и представляет собой одноцепочечный полипептид от N- 58 027835

концевой шарнирной области до природного С-конца области Fc IgG1 человека (SEQ ID NO: 1606). Точный участок, где происходит связывание, не является критичным: конкретные участки хорошо известны в данной области и их можно выбирать для оптимизации биологической активности, секреции или характеристик связывания химерного полипептида антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB. Например, другие примеры последовательностей полипептидов Fc начинаются с аминокислот С109 и Р113 последовательности, указанной в SEQ ID NO: 356 (см., например, US 2006/0024298).

В дополнение к Fc hIgG1 в химерные полипептиды антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB, предоставляемые по настоящему документу, также можно включать другие области Fc. Например, слитые белки с Fc могут содержать иммуноглобулиновые последовательности, которые кодируют гены иммуноглобулинов, принадлежащие к любым классам антител, включая, но не ограничиваясь классами антител IgG (включая подклассы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), IgA (включая подклассы IgA1 и IgA2 человека), IgD, IgE и IgM.

В некоторых примерах домен Fc можно выбран на основе функциональных свойств домена, например, таких как эффекторные функции домена Fc при опосредуемом иммунном ответе. Например, если

необходимо минимизировать эффекторные функции, опосредуемые взаимодействиями Fc/FcyR, можно использовать слитые белки с изотипами IgG, которые плохо активируют комплемент или эффекторные клетки, такими как, например, Fc IgG2 или IgG4.

Модифицированные домены Fc также предусмотрены в настоящем документе для применения в химерных белках с антигенсвязывающими фрагментами антител к PCB, см., например, патент США № 7217797 и патентные публикации США № 2006/0198840, 2006/0024298 и 2008/0287657 и международную патентную публикацию № WO 2005/063816 для примеров модификаций. Также примеры модификаций аминокислот доменов Fc предоставлены в других разделах настоящего документа.

Как правило, двухвалентное антитело представляет собой димер двух химерных белков, получаемый посредством прямого или непрямого связывания двух одинаковых или различных антигенсвязывающих фрагментов антител к PCB с полипептидом Fc. В некоторых примерах слитый ген, кодирующий химерный белок, встроен в соответствующий экспрессирующий вектор. Полученные химерные белки можно экспрессировать в клетках-хозяевах, трансформированных рекомбинантным экспрессирующим вектором, с последующей сборкой, где между фрагментами Fc формируются межцепочечные дисульфидные связи с выходом двухвалентных антител к PCB. Как правило, клетки-хозяева и экспрессирующая система представляют собой экспрессирующую систему в млекопитающего для обеспечения гликозилирования химерных белков. Полученные химерные полипептиды, содержащие фрагменты Fc, и формируемые из них поливалентные антитела можно легко очищать посредством аффинной хроматографии на колонках с белком А или белком G. Когда клетки трансформируют двумя нуклеиновыми кислотами, кодирующими различные химерные полипептиды из антител к PCB, формирование гетеродимеров должно достигаться биохимически, так как химерные молекулы из антител к PCB, несущие домен Fc, также будут экспрессироваться в виде связанных дисульфидными связями гомодимеров. Таким образом, в условиях, которые способствуют разрушению межцепочечных дисульфидных связей, но не влияют на внутрицепочечные дисульфидные связи можно снижать количество гомодимеров. Как правило, химерные мономеры с различными внеклеточными частями смешивают в эквимолярных количествах и окисляют с формированием смеси гомо- и гетеродимеров. Компоненты этой смеси разделяют хроматографическими способами.

Альтернативно, формирования гетеродимера можно добиться посредством генетического конструирования и экспрессии слитых молекул, связывающих антиген PCB, содержащих антигенсвязывающие фрагменты антител к PCB с последующим доменом Fc hIgG с последующими лейциновыми застежками с-june или c-fos. Так как лейциновые застежки предпочтительно формируют гетеродимеры, их при желании можно использовать для формирования гетеродимеров. Химерные полипептиды из антител к PCB, содержащие области Fc, также могут конструировать так, чтобы они включали метку с хелатами металлов или другой эпитоп. Домен с меткой можно использовать для быстрой очистки посредством металл-хелатной хроматографии и/или посредством антител, обеспечивая детекцию вестерн-блотингом, иммунопреципитацией или истощением/блокировкой в биоанализах.

D. Дополнительные модификации антител к PCB

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно дополнительно модифицировать. Модификации антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов могут улучшать одно или более свойств антител, включая, но не ограничиваясь снижением иммуногенности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, увеличением времени полужизни антител или антигенсвязывающих фрагментов, например, снижая восприимчивость к протеолизу и/или снижая чувствительность к окислению, и изменением или улучшением свойств связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Примеры модификаций включают, но не ограничиваются модификацией первичной аминокислотной последовательности антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента и изменением посттрансляционных модификации антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента. Примеры посттрансляционных модификаций включают, например, гликозилирование, ацетилирование, пегилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию защит- 59 027835

ной/блокирующей группой, протеолитическое расщепление, связывание с клеточным лигандом или другими белками. Другие примеры модификации включают присоединение к антителам к PCB или их антигенсвязывающим фрагментам одного или более гетерологичных пептидов для изменения или улучшения одного или более свойств антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

Как правило, модификации не приводят к увеличению иммуногенности антитела или его антигенсвязывающих фрагментов и существенно отрицательно не влияют на связывание антител или антигенсвязывающих фрагментов с PCB. Способы анализа связывания модифицированных антител или их антигенсвязывающих фрагментов с белком F PCB предоставлены в настоящем документе и известны в данной области. Например, модифицированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно анализировать на связывание с белком F PCB способами, включающими, но не ограничивающимися, например, ELISA, поверхностным плазмонным резонансом (SPR) или микроанализами нейтрализации in vitro.

По настоящему документу предоставлены способы повышения времени полужизни любого из предоставляемых антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. Увеличение времени полужизни антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, может повысить терапевтическую эффективность антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов и обеспечить менее частое введение антител или их антигенсвязывающих фрагментов для профилактики и/или лечения, например, предотвращения или лечения инфекции PCB, предотвращения, лечения и/или облегчения одного или более симптомов инфекции PCB, или уменьшения продолжительности инфекции PCB.

Модификация антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, может включать одну или более замен, делеций или вставок аминокислот или посредством мутации в природе, или посредством манипуляций человека с исходным антителом. Способы модификации полипептидов, таких как антитела, известны в данной области и их можно использовать для модификации любого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу. В некоторых примерах фармакокинетические свойства антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно улучшать посредством модификаций Fc известными специалистам в данной области способами. Для введения мутаций в молекулу нуклеотида, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, для получения полипептида с одной или более аминокислотными заменами можно использовать стандартные способы, известные специалистам в данной области. Примеры способов введения мутаций включают, но не ограничиваются сайт-специфическим мутагенезом и опосредованным ПЦР мутагенезом.

Антитела к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицированы присоединением гетерологичных пептидов для облегчения очистки. Как правило, такие пептиды экспрессируются в виде слитого белка, содержащего антитело, слитое с пептидом на С- или N-конце антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Примеры пептидов, широко используемых для очистки, включают, но не ограничиваются гексагистидиновыми пептидами, пептидом гемагглютинина (HA) и пептидом метки flag (см., например, Wilson et al. (1984), Cell 37:767; Witzgall et al. (1994), Anal. Biochem. 223:2, 291-8). Слияние не обязательно должно быть прямым, но его можно проводить посредством пептидного линкера. В некоторых примерах линкерный пептид содержит участок расщепления протеазы, который позволяет удалять пептид после очистки посредством расщепления протеазой, которая специфически распознает участок расщепления протеазы.

Антитела к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно модифицировать присоединением гетерологичного полипептида, который направляет антитело или антигенсвязывающий фрагмент к конкретному типу клеток (например, к эпителиальным клеткам дыхательных путей) in vitro или in vivo. В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, можно направлять к конкретному типу клеток посредством слияния или конъюгации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антителом, специфичным к конкретному рецептору клеточной поверхности, или с другим полипептидом, взаимодействующим со специфическим клеточным рецептором.

В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, могут быть направлены на поверхность клетки-мишени и/или захвачены клеткой-мишенью посредством слияния или конъюгации антитела или антигенсвязывающего фрагмента с пептидом, который связывает гликопротеины клеточной поверхности, таким как домен белковой трансдукции (например, ТАТ-пептид). Примеры доменов белковой трансдукции включают, но не ограничиваются PTD, получаемыми из таких белков, как ТАТ вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) (Ruben et al. (1989), J. Virol. 63:1-8; например, SEQ ID NO: 326-337, такие как, например, GRKKRRQRRR (TAT 48-57) SEQ ID NO: 330), белок оболочки вируса герпеса VP22 (Elliott and O'Hare (1997), Cell 88:223-233, например, SEQ ID NO: 342), гомеотический белок Antennapedia (Antp) Drosophila melanogaster (пенетратин PTD; Derossi et al. (1996), J. Biol. Chem. 271:18188-18193, например, SEQ ID NO: 311-314), противомикробный пептид SynB протегрин 1 (PG-1) (например, SynB1, SynB3 и SynB4; Kokryakov et al. (1993),

- 60 027835

FEBS Lett. 327:231-236, например, SEQ ID NO: 323-325, соответственно) и основной фактор роста фибробластов (Jans (1994), FASEB J. 8:841-847, например, SEQ ID NO: 307). PTD также включают синтетические PTD, включая, но не ограничиваясь, полиаргининовыми пептидами (Futaki et al. (2003), J. Mol. Recognit. 16:260-264; Suzuki et al. (2001), J. Biol. Chem. 276:5836-5840, например, SEQ ID NO: 315-316), транспортаном (Pooga et al. (1988), FASEB J. 12:67-77; Pooga et al. (2001), FASEB J. 15:1451-1453, например, SEQ ID NO: 338-341), MAP (Oehlke et al. (1998), Biochim. Biophys. Acta. 1414:127-139; например, SEQ ID NO: 305), KALA (Wyman et al. (1997), Biochemistry 36:3008-3017; например, SEQ ID NO: 303) и другими катионными пептидами, например, такими как различные β-катионные пептиды (Akkarawongsa et al. (2008), Antimicrob. Agents and Chemother. 52(6):2120-2129).

Антитела к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицировать присоединением к антителу или антигенсвязывающему фрагменту диагностической и/или терапевтической молекулы. Антитела к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицировать посредством ковалентного присоединения к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту молекул любого типа, таких как диагностические или терапевтические молекулы так, что ковалентное присоединение не предотвращает связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с соответствующим ему эпитопом. Например, антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, можно дополнительно модифицировать посредством ковалентного присоединения молекулы так, что ковалентное присоединение не предотвращает связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с PCB. В некоторых примерах антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно рекомбинантным способом на N- или C-конце сливать с гетерологичным полипептидом или химически конъюгировать, включая ковалентную и нековалентную конъюгацию, с гетерологичным полипептидом или другим веществом. Например, гетерологичный полипептид или композиция может представлять собой диагностический полипептид или другую диагностическую молекулу или терапевтический полипептид или другую терапевтическую молекулу. Примеры диагностических и терапевтических молекул включают, но не ограничиваются лекарственными средствами, радионуклидами, токсинами, флуоресцентными молекулами (см., например, международные публикации PCT № WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624, патент США № 5314995 и ЕР 396387). Диагностические полипептиды или диагностические молекулы можно использовать, например, в качестве меток для детекции in vivo или in vitro. Терапевтические полипептиды или терапевтические фрагменты можно использовать, например, для лечения вирусной инфекции, такой как инфекция PCB, или для лечения одного или более симптомов вирусной инфекции.

Дополнительные слитые белки антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно получать способами перестановки генов, перестановки мотивов, перестановки экзонов и/или перестановки кодонов (совместно обозначаемых как "перестановка ДНК"). Перестановку ДНК можно использовать для модификации активности антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, например, для получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов с более высокой аффинностью и сниженными скоростями диссоциации (см., например, патенты США № 5605793, 5811238, 5830721, 5834252, 5837458 и Patten et al. (1997), Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama (1998), Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al. (1999), J. Mol. Biol. 287:265-76; и Lorenzo and Blasco (1998), Biotechniques 24(2):308-13).

Предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты также можно прикреплять к твердой подложке, что пригодно иммунологических анализов или очистки антигена-мишени. Примеры твердых подложек включают, но не ограничиваются стеклом, целлюлозой, полиакриламидом, нейлоном, полистиролом, поливинилхлоридом или полипропиленом.

1. Модификации для снижения иммуногенности.

В некоторых примерах антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно дополнительно модифицировать для снижения иммуногенности у индивидуума, такого как человек. Например, для изменения потенциальных эпитопов T-клеток человека с целью устранения или снижения иммуногенности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при контакте с иммунной системой индивидуума можно модифицировать одну или более аминокислот в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте. Примеры модификаций включают замены, делеции и вставки одной или более аминокислот, которые устраняют или снижают иммуногенность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Как правило, такие модификации не изменяют специфичность связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с соответствующими им антигенами. Снижение иммуногенности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может улучшить одно или более свойств антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, повысить терапевтическую эффективность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и/или увеличить время полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента in vivo.

2. Модификации Fc.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать область Fc дикого типа или модифицированную область Fc. Как описано в других разделах настоящего документа, область Fc можно связать с антигенсвязывающим фрагментом анти- 61 027835

тел к PCB, предоставляемых по настоящему документу, например, 58с5, sc5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6, или антигенсвязывающим фрагментом, получаемым из 58с5, sc5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. В некоторых примерах область Fc можно модифицировать для изменения одного или более свойств полипептида Fc. Например, область Fc можно модифицировать для изменения (т.е. усиления или ослабления) эффекторных функций по сравнению с эффекторной функцией области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина дикого типа. Область Fc антитела взаимодействует с рядом рецепторов Fc и лигандов, обеспечивая рад важных функциональных свойств, обозначаемых как эффекторные функции. Эффекторные функции Fc включают, например, связывание Fc с рецепторами, фиксацию комплемента и снижение активности T-клеток (см., например, патент США № 6136310). Способы анализа снижения активности T-клеток, эффекторных функций Fc и стабильности антител известны в данной области. Например, область Fc молекулы IgG взаимодействует с FcyR. Эти рецепторы экспрессированы на множестве иммунных клеток, включая, например, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, B-клетки, большие зернистые лимфоциты, клетки Лангерганса, клетки натуральных киллеров (NK), γδ T-клетки. Формирование комплекса Fc/Fc'/R. привлекает эти клетки-эффекторы в участки связывания антигена, как правило, приводя к передаче сигнала внутри клеток и важным последующим иммунным реакциям, таким как высвобождение медиаторов воспаления, активация B-клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Способность опосредовать цитотоксические и фагоцитарные эффекторные функции является потенциальным механизмом, посредством которого антитела разрушают клетки-мишени. Распознавание и лизис связанных антителами клеток-мишеней цитотоксическими клетками, экспрессирующими FcyR, обозначают как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). Другие рецепторы Fc для различных изотипов антител включают FceR (IgE), FcaR (IgA) и FcpR (IgM).

Таким образом, модифицированный домен Fc может обладать измененной аффинностью, включая, но не ограничиваясь повышением, снижением или утратой аффинности к рецептору Fc. Например, различные подклассы IgG имеют различную аффинность к FcyR, где IgG1 и IgG3 как правило связывают рецептор существенно лучше, чем IgG2 и IgG4. Кроме того, различные FcyR опосредуют различные эффекторные функции. FcyR1, FcYRIIa/c и FcYRIIIa являются положительными регуляторами опосредованной иммунными комплексами активации, характеризуясь наличием внутриклеточного домена с иммунорецепторным активационным тирозиновым мотивом (ITAM). Однако FcYRIIb несет иммунорецепторный ингибирующий тирозиновый мотив (ITIM) и, таким образом, является ингибирующим. Таким образом, изменение аффинности области Fc к рецепторам может модулировать эффекторные функции, индуцированные доменом Fc.

В одном из примеров используют область Fc, модифицированную для оптимизации связывания с определенными FcyR для улучшенной активации эффекторных функций, например, таких как антителозависимая клеточная цитотоксичность, ADCC. Такие модифицированные области Fc могут содержать модификации одной или более аминокислот (в соответствии с нумерацией по схеме Kabat, Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services), включая, но не ограничиваясь, аминокислотами в положениях 249, 252, 259, 262, 268, 271, 273, 277, 280, 281, 285, 287, 296, 300, 317, 323, 343, 345, 346, 349, 351, 352, 353 и 424. Например, можно проводить модификации в области Fc, соответствующие одной или более из G119S, G119A, S122D, S122E, S122N, S122Q, S122T, Н129Н, K129Y, D132Y, R138Y, E141Y, Т143Н, V147I, S150E, H151D, E155Y, E155I, Е155Н, K157E, G164D, E166L, Е166Н, S181A, S181D, S187T, S207G, S307I, K209T, K209B, K209D, A210D, A213Y, A213L, A213I, I215D, I215E, I215N, I215Q, E216Y, Е216А, K217T, K217F, K217A и P279L иллюстративной последовательности IgG1, указанной в SEQ ID NO: 356, или их комбинациям. Модифицированные Fc, содержащие эти мутации, могут характеризоваться повышенным связыванием с FcR, например, таким как активирующий рецептор FcYIIIa и/или могут характеризоваться сниженным связыванием с ингибирующим рецептором FcYRIIb (см., например, US 2006/0024298). Модифицированные для усиления связывания с FcR области Fc могут быть более эффективными в обеспечении разрушения инфицированных вирусом (например, PCB) клеток у пациентов.

В некоторых примерах антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицировать для улучшения взаимодействия антитела или антигенсвязывающего фрагмента с рецептором FcRn для увеличения времени полужизни in vivo и улучшения фармакокинетики антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (см., например, патент США № 7217797, патентные публикации США № 2006/0198840 и 2008/0287657). FcRn представляет собой неонатальный FcR, связывание с которым возвращает эндоцитированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из эндосомы обратно в кровоток. Этот процесс в комбинации с препятствием фильтрации в почках вследствие большого размера полноразмерной молекулы приводит к благоприятным для антител временам полужизни в сыворотке в диапазоне от одной до трех недель. Связывание Fc с FcRn также играет важную роль в транспорте антител.

Примеры модификаций области Fc включают, но не ограничиваются мутациями Fc, описанными в патенте США № 7217797, патентных публикациях США № 2006/0198840, 2006/0024298 и 2008/0287657

- 62 027835

и международной патентной публикации № WO 2005/063816, такими как мутации одного или более аминокислотных остатков (нумерация по Kabat, Kabat et al. (1991)) 251-256, 285-90, 308-314 в домене СН2 и/или аминокислотных остатков 385-389 и 428-436 в домене C_H3 Fc константной области тяжелой цепи, где модификация изменяет аффинность к рецепторам Fc и/или время полувыведения по сравнению с немодифицированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых примерах константный домен IgG изменен в области Fc по одной или более аминокислотам в положениях 250, 251, 252, 254, 255, 256, 263, 308, 309, 311, 312 и 314 домена C_H2 и/или аминокислотам в положениях 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434, 436 и 459 домена C_H3 константной области тяжелой цепи IgG. Такие модификации соответствуют, например, аминокислотам Gly120, Pro121, Ser122, Phe124, Leu125, Phe126, Thr133, Pro174, Arg175, Glu177, Gln178 и Asn180 в домене CH2 и аминокислотам Gln245, Val246, Ser247, Thr249, Ser283, Gly285, Ser286, Phe288 и Met311 в домене CH3 в последовательности IgG1, указанной в SEQ ID NO: 356. В некоторых примерах модификации проводят по одному или более экспонированным на поверхности остаткам, и модификация представляет собой замену на остаток сходных заряда, полярности или гидрофобности по сравнению с заменяемым остатком.

В конкретных примерах константная область Fc тяжелой цепи модифицирована по одной или более аминокислотам в положениях 251, 252, 254, 255 и 256 (нумерация по Kabat), где в положении 251 производят замену на Leu или Arg, в положении 252 производят замену на Tyr, Phe, Ser, Trp или Thr, в положении 254 производят замену на Thr или Ser, в положении 255 производят замену Leu, Gly, Ile или Arg и/или в положении 256 производят замену Ser, Arg, Gln, Glu, Asp, Ala, Asp или Thr. В некоторых примерах константную область Fc тяжелой цепи модифицируют по одной или более аминокислотам в положениях 308, 309, 311, 312 и 314, где в положении 308 производят замену на Thr или Ile, в положении 309 производят замену на Pro, в положении 311 производят замену на Ser или Glu, в положении 312 производят замену на Asp и/или в положении 314 производят замену на Leu. В некоторых примерах константную область Fc тяжелой цепи модифицируют по одной или более аминокислотам в положениях 428, 433, 434 и 436, где в положении 428 производят замену на Met, Thr, Leu, Phe или Ser, в положении 433 производят замену на Lys, Arg, Ser, Ile, Pro, Gln или His, в положении 434 производят замену на Phe, Tyr и His и/или в положении 436 производят замену на His, Asn, Asp, Thr, Lys, Met или Thr. В некоторых примерах константную область Fc тяжелой цепи модифицируют по одной или более аминокислотам в положениях 263 и 459, где в положении 263 производят замену на Gln или Glu и/или в положении 459 производят замену на Leu или Phe.

В некоторых примерах константную область Fc тяжелой цепи можно модифицировать для усиления связывания с белком комплемента C1q. В дополнение к взаимодействию с FcR Fc также взаимодействует с белком C1q комплемента, опосредуя обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC). C1q формирует комплекс с сериновыми протеазами C1r и C1s и с формированием комплекса C1. C1q способен связывать шесть антител, хотя для активации каскада комплемента достаточно связывания с двумя IgG. Подобно взаимодействию Fc с FCR различные подклассы IgG имеют различную аффинность к C1q, при этом IgG1 и IgG3, как правило, связывают белок комплемента существенно лучше, чем IgG2 и IgG4. Таким образом, модифицированный Fc с усиленным связыванием C1q может опосредовать повышенный CDC и может усиливать разрушение инфицированных вирусом (например, PCB) клеток. Примеры модификаций области Fc, которые повышают связывание C1q, включают, но не ограничиваются, модификацией аминокислот в положениях 345 и 353 (нумерация по Kabat). Примеры модификаций включают модификации, соответствующие K209W, K209Y и E216S в иллюстративной последовательности IgG1, указанной в SEQ ID NO: 356.

В другом примере также предоставлены различные мутанты Fc с заменами, уменьшающими или

полностью устраняющими связывание с FcyR. Такие мутанты пригодны в случаях, когда необходимо снизить или устранить эффекторные функции, опосредованные Fc. Часто это предпочтительно, когда желателен антагонизм, но не уничтожение клеток, несущих антиген-мишень. Примеры таких Fc представляют собой мутант Fc, описанный в патенте США № 5457035, который модифицирован по аминокислотам в положениях 248, 249 и 251 (нумерация по Kabat). В иллюстративной последовательности IgG1, указанной в SEQ ID NO: 356, Leu в положении аминокислоты 117 заменен на Ala, Leu в положении аминокислоты 118 заменен на Glu и Gly в положении аминокислоты 120 заменен на Ala. Подобные мутации можно проводить в любой последовательности Fc, такой как, например, последовательность Fc, приведенная в качестве примера. Полученный мутант проявляет сниженную аффинность к рецепторам Fc.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно сконструировать так, чтобы они содержали модифицированные области Fc. Например, способы слияния или конъюгации полипептидов с константными областями антител (т.е. получения слитых белков Fc) в данной области известны и описаны, например, в патентах США № 5336603, 5622929, 5359046,

5349053, 5447851, 5723125, 5783181, 5908626, 5844095 и 5112946; EP 307434, EP 367166, EP 394827, публикациях PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 и WO 99/04813; Ashkenazi et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Traunecker et al. (1988), Nature 331:84-86; Zheng et al. (1995), J. Immunol. 154:5590-5600; и Vil et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992), а

- 63 027835

также описаны в настоящем документе. В некоторых примерах модифицированную область Fc с одной или более модификациями, которые увеличивают аффинность связывания FcRn и/или увеличивают время полужизни, можно сливать с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу.

3. Пегилирование.

Для увеличения времени полужизни и/или улучшения их фармакокинетических профилей антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно конъюгировать с полимерными молекулами, такими как высокомолекулярный полиэтиленгликоль (ПЭГ). Конъюгацию можно проводить способами, известными специалистам в данной области. Показано, что конъюгация терапевтических антител с ПЭГ улучшает их фармакодинамику, не оказывая влияния на функции (см., например, Deckert et al., Int. J. Cancer 87: 382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15: 409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16: 106-119, 2001; и Yang et al., Protein Eng. 16: 761-770, 2003). ПЭГ можно присоединять к антителам или антигенсвязывающим фрагментам посредством многофункционального линкера или без него, либо посредством сайт-специфической конъюгации с N- или C-концом антител или антигенсвязывающих фрагментов или посредством эпсилон-аминогруппы на остатках лизина. можно использовать дериватизацию линейным или разветвленным полимером, приводящую к минимальной потери биологической активности. Для обеспечения надлежащей конъюгации молекулы ПЭГ с антителами степень конъюгации можно контролировать посредством SDS-PAGE и масс-спектрометрии. Непрореагировавший ПЭГ можно отделять от конъюгатов антител с ПЭГ, например, посредством эксклюзионной или ионообменной хроматографии. ПЭГ-производные антител или их антигенсвязывающих фрагментов можно проверять на активность связывания антигенов PCB, а также на эффективность in vivo известными специалистам в данной области способами, например, посредством иммунологических анализов, описанных в настоящем документе.

4. Конъюгация с детектируемой молекулой.

В некоторых примерах антитела к PCB и фрагменты антител, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицировать посредством конъюгации с детектируемой молекулой. Детектируемые молекулы можно детектировать прямо или опосредованно. В зависимости от выбранной детектируемой молекулы ее можно детектировать in vivo и/или in vitro. Детектируемые молекулы можно использовать, например, в способах диагностики для определения наличия PCB или локализации PCB или в анализах связывания для определения аффинности связывания антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента к PCB. Детектируемые молекулы также можно использовать в способах получения антител к PCB, например, таких как очистка антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Как правило, детектируемые молекулы подбирают так, что конъюгация детектируемой молекулы не препятствует связыванию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с эпитопом-мишенью. Как правило, выбор детектируемой молекулы зависит от требуемой чувствительности, простоты конъюгации с соединением, требований стабильности, доступного оборудования и удаляемых положений. Специалисту в данной области известны метки и он может определить детектируемую метку, подходящую и совместимую с применяемым анализом. Способы мечения антител детектируемыми молекулами известны в данной области и включают, например, рекомбинантные и химические способы.

Детектируемая молекула может представлять собой любое вещество с детектируемыми физическими или химическими свойствами. Такие детектируемые молекулы хорошо разработаны в области иммунохимических анализов и, как правило, практически любую пригодную в таких способах метка можно применять в предоставляемых способах. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Пригодные метки включают, но не ограничиваются флуоресцентными красителями (например, флуоресцеинизотиоцианатом, техасским красным,

3 125 35 14 32

родамином и т.п.), радиоактивными метками (например, ³Н, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C или ³²Р), в частности, гамма- и позитронизлучающими изотопами (например, ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe), ионами металлов (например, ^11:LIn, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr и ²⁰¹Tl), ферментами (например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и другими, широко используемыми в ELISA), переносящими электроны средствами (например, связывающими металл белками и соединениями), люминесцентными и хемилюминесцентными метками (например, люциферином и 2,3-дигидрофталазиндионами, например, люминолом), магнитными гранулами (например, DYNABEADS™) и колориметрическими метками, такими как коллоидное золото или цветные стеклянные или пластиковые гранулы (например, из полистирола, полипропилена, латекса и т.п.). Для обзора различных метящих или продуцирующих сигнал систем, которые можно использовать, см., например, патент США № 4391904.

5. Конъюгация с терапевтической молекулой.

В некоторых примерах антитела к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицировать посредством конъюгации с терапевтической молекулой. Примеры терапевтических молекул включают, но не ограничиваются цитотоксинами (например, цитостатическими или цитотоксическими средствами), терапевтическими средствами или радиоактивными ионами металлов (например, альфа-излучателями). Примеры цитотоксинов или цитостатических средств

- 64 027835

включают, но не ограничиваются любыми средствами, которые отрицательно влияют на клетки, включая, но не ограничиваясь паклитаксолом, цитохалазином, грамицидином D, бромистым зтидием, эметином, митомицином, этопозидом, тенопозидом, винкристином, винбластином, колхицином, доксорубицином, даунорубицином, дигидроксиантрациндионом, митоксантроном, митрамицином, актиномицином D, 1-дегидротестостероном, глюкокортикоидами, прокаином, тетракаином, лидокаином, пропранололом, пуромицином и их аналогами или гомологами. Примеры терапевтических средств включают, но не ограничиваются антиметаболитами (например, метотрексатом, 6-меркаптопурином, 6-тиогуанином, цитарабином, 5-фторурацилом, декарбазином), алкилирующими средствами (например, мехлорэтамином, тиотепа, хлорамбуцилом, мелфаланом, кармустином (BSNU) и ломустином (CCNU), циклофосфамидом, бусульфаном, дибромоманнитолом, стрептозотоцином, митомицином С и цис-дихлородиамин платиной (II) (ДЦП), цисплатином), антрациклинами (например, даунорубицином (ранее дауномицин) и доксорубицином), антибиотиками (например, дактиномицином (ранее актиномицин), блеомицином, митрамициномом и антрамицином (АМС)), антимитотическими средствами (например, винкристином и винбластином) и противовирусными средствами, включая, но не ограничиваясь, аналогами нуклеозидов, такими как зидовудин, ацикловир, гангцикловир, видарабин, идоксуридин, трифлуридин и рибавирин; фоскаметом, амантадином, римантадином, саквинавиром, индинавиром, ритонавиром и альфа-интерферонами.

В некоторых примерах антитела к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно модифицировать посредством конъюгации с терапевтической молекулой, которая представляет собой терапевтический полипептид. Примеры терапевтических полипептидов включают, но не ограничиваются токсинами, такими как абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas или токсин дифтерии; или иммуностимулирующими средствами, например, цитокинами, включая, но не ограничиваясь интерфероном (например, IFN-α, β, γ, ω), лимфокинами, гемопоэтическим факторами роста, такими как, например, GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-14 (IL-14) и фактор некроза опухоли (TNF).

6. Модификации для увеличения специфичности связывания.

Специфичность связывания предоставляемых антител к PCB и фрагментов антител можно изменять или улучшать известными в данной области способами, такими как фаговый дисплей. Как правило, способ фагового дисплея включает применение экспрессирующей векторной системы на поверхности нитевидных бактериофагов (фагмид) для клонирования и экспрессии молекул антител библиотеки. В литературе для получения комбинаторных библиотек описаны различные фагмидные системы клонирования. Смотри, например, описание получения комбинаторных библиотек антител в фагмидах Kang et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:4363-4366; Barbas et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:7978-7982; Zebedee et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3175-3179; Kang et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:11120-11123; Barbas et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4457-4461; and Gram et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.

В конкретных примерах последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL, амплифицируют из библиотеки кДНК животного (например, библиотеки кДНК из лимфоидных тканей человека или мыши). ДНК, кодирующую домены V_H и V_L, посредством ПЦР рекомбининируют вместе с линкером для scFv и клонируют в фагмидный вектор (например, pCANTAB 6 или pComb 3 HSS). Вектор электропорацией вводят в E.coli и E.coli заражают фагом-помощником. Используемые в указанных способах фаги, как правило, представляют собой нитевидные бактериофаги, включающие FD и М13, и домены V_H и V_L, как правило, рекомбинантно сливают с геном III или геном VIII фага. Фаги, экспрессирующие антигенсвязывающий домен, который связывает антиген PCB, например, белок F PCB, можно отбирать или идентифицировать посредством антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного или захваченного на твердой подложке или грануле. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител посредством фагового дисплея, описаны, например, в Brinkman et al. (1995), J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995), J. Immunol. Methods 184:177186; Kettleborough et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997), Gene 187:9-18; Burton et al. (1994), Advances in Immunology 57:191-280; публикациях PCT № WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO97/13844; в патентах США

№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108, каждый из которых полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Как описано в приведенных выше ссылках, после отбора фагов из них можно выделять кодирующие антитела области и использовать для получения полноразмерного антитела, включая антитела человека, или любого другого желаемого антигенсвязывающего фрагмента и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, например, как описано в настоящем документе. В способах рекомбинантного получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab')2 можно также использовать другие известные в данной области способы, такие как описано в публикации PCT №WO 92/22324; Mullinax et al. (1992), BioTechniques 12 (6):864-869; Sawai et al. (1995), AJRI 34:26-34; и Better et al. (1988), Science 240: 1041-1043.

- 65 027835

Полученные фагмидные библиотеки можно модифицировать для увеличения и/или изменения иммуноспецифичности получаемых антител или антигенсвязывающих фрагментов, а затем идентифицировать дополнительные антитела с улучшенными свойствами, такими как усиленное связывание антигенамишени. Например, ДНК, кодирующую тяжелую или легкую цепь или обе цепи, можно подвергнуть мутагенезу в определяющей комплементарность области (CDR) вариабельной области полипептида иммуноглобулина, а затем полученные варианты подвергать скринингу на желаемые свойства иммунореактивности и нейтрализации. Полученные антитела можно подвергать скринингу посредством одного или более анализов для определения эффективности нейтрализации, описанных в настоящем документе.

Для некоторых применений, включая применение антител in vivo у человека и в анализах детекции in vitro, используют антитела человека или химерные антитела. Полностью человеческие антитела особенно предпочтительны для лечения индивидуума, являющегося человеком. Антитела человека можно получать различными способами, известными в данной области, включая фаговый дисплей, описанный выше, с использованием библиотеки антител, получаемой из последовательностей иммуноглобулинов человека или синтетических последовательностей, гомологичных последовательностям иммуноглобулинов человека, см. патенты США № 4444887 и 4716111 и публикации PCT № WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741, которые полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

E. Способы выделения антител к PCB

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно идентифицировать и выделять различными способами, хорошо известными в данной области, включая, но не ограничиваясь, гибридомами мышей (см., например, Olsson and Kaplan (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5429-5431); такие антитела можно гуманизировать для применения у человека, в другом разделе настоящего документа), трансгенными мышами, экспрессирующими гены иммуноглобулинов человека (см., например, Kellerman and Green (2000), Curr. Opin Biotechnol. 13:593-597), фаговым дисплеем (см., например, Mancini (2004), New Microbiol. 27:315-28), а также выделением из зрелых человеческих иммунных клеток, таких как B-клетки (см., например, Banchereau and Rousset (1992), Adv. Immunol. 52: 125-262, Crotty and Ahmed (2004), Semin. Immunol. 16: 197-203, Carsetti (2004), Methods Mol. Biol. 271: 25-35., McHeyzer-Williams и McHeyzer-Williams (2005), Annu. Rev. Immunol. 23:487-513). В иллюстративных способах, предоставляемых по настоящему документу, антитела человека к PCB и их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляем по настоящему документу, идентифицируют и выделяют из человеческих клеток.

Учитывая трудности в получении стабильных гибридом из клеток человека, секретирующих антитела, примером способа, который широко используют для получения и выделения секретирующих антитела человека клеток, является иммортализация клеток В-человека вирусом Эпштейна-Барр (EBV), который, как известно, также вызывает активацию и пролиферацию поликлональных B-клеток (см., например, Sugimoto et al. (2004), Cancer Res. 64:3361-3364.; Bishop and Busch (2002), Microbes Infect. 4:853-857). Секретирующие антитела клетки получали, например, иммортализацией EBV клеток человека, например, из периферической крови, лимфоузлов, селезенки, миндалин или плевральной жидкости пациентов или других индивидуумов, которые подвергались воздействию антигена, или здоровых индивидуумов, предварительно отбираемых с применением меченого антигена (см., например, Casali et al. (1986), Science 234:476-9, Yamaguchi et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2416-2420, Posner et al. (1991), J. Immunol. 146:4325-4332, Raff et al. (1988), J. Exp. Med. 168:905-917, Steenbakkers et al. (1993), Hum. Antibod. Hybrid. 4:166-173, Steenbakkers et al. (1994), Mol. Biol. Rep. 19:125-134, Evans et al. (1988), J. Immunol. 140:941-943, и Wallis R et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:214-219).

Вследствие низкой трансформируемости, низкой клонируемостью и свойственной нестабильностью и гетерогенностью инфицированных EBV клеток человека (Chan M et al. (1986), J. Immunol. 136:106-112 и James and Bell (1987), J. Immunol. Methods. 100:5-40) можно использовать другие известные способы, такие как слияние клеток, например, такие как слияние с миеломной клеточной линией (см., например, Bron et al. (1984), PNAS 81:3214-3217; Yamaguchi et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2416-2420; Posner et al. (1991), J. Immunol. 146:4325-4332, Niedbala and Stott (1998), Hybridoma 17:299-304; Li et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62). Дополнительные способы улучшения иммортализации EBV включают, например, иммортализацию онкогенными вирусами, трансформацию онкогенами, миниэлектрослиянием и гетерослиянием клеток мыши и человека в одном процессе (см., например, патент США № 4997764; Steenbakkers et al. (1993), Hum. Antibod. Hybrid. 4:166-173; Dessain et al. (2004), J. Immunol. Methods. 291:109-22). Моноклональные антитела человека можно выделять из В-клеток, активированных и иммортализированных в присутствии или в отсутствие антигена и посредством комбинации различных манипуляций в клеточной культуре, как описано в данной области (см., например, Borrebaeck С et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3995-3999, Davenport et al. (1992), FEMS Microbiol. Immunol. 4:335-343, Laroche-Traineau et al. (1994), Hum. Antib. Hybrid. 5:165-177, Morgenthaler et al. (1996), J. Clin. Endocrinology. 81:3155-3161, Niedbala and Kurpisz (1993), Immunol. Lett. 35:93-100, Mulder et al. (1993), Hum. Immunol. 36:186-192, Hur et al. (2005), Cell Prolif. 38:35-45, Traggiai et al. (2004), Nat. Med. 10:871875, Tsuchiyama et al. (1997), Hum. Antibodies 8:43-47 и публикации PCT № WO 91109115, WO 041076677, WO 88101642, WO 90102795, WO 96140252 и WO 02146233).

- 66 027835

Способы выделения антител человека из зрелых B-клеток, как правило, включают выделение популяции зрелых B-клеток и скрининг антител, экспрессируемых B-клетками, против конкретного антигена. Различные популяции секретирующих антитела клеток можно выделять у донора-человека со специфическим профилем (например, индивидуумы без воздействия, вакцинированные, более или менее недавно инфицированные или серопозитивные индивидуумы) и из различных тканей (например, крови, миндалин, селезенки, лимфатических узлов), где находятся и проявляют свою активность B-клетки (Viau and Zouali (2005), Clin. Immunol. 114:17-26). В примерах предоставляемых по настоящему документу способов антитела к PCB, предоставляемые по настоящему документу, можно выделять из образцов мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), содержащих B-клетки, выделенные у доноров-людей и/или у здоровых доноров-людей, которые подвергались воздействию PCB или у которых существует высокая вероятность воздействия PCB, например, у медицинских работников.

После выделения РВМС из биологических образцов можно проводить специфическую селекцию секретирующих антитела клеток одним из множества способов, описанных в данной области, на основе экспрессии поверхностных клеточных маркеров на их поверхности и, при необходимости, других белков, а также активности пролиферации, обмена веществ, метаболического и/или морфологического статуса клеток. В частности, в различных технологиях очистки секретирующих антитела клеток из образцов, полученных у человека, используют различные средства и условия для положительного или отрицательного отбора. Эти клетки легче и эффективнее отобрать посредством физического отделения клеток, экспрессирующих поверхностные клеточные маркеры, специфичные для клеток, экспрессирующих и секретирующих антитела (например, B-клеток человека). Конкретные протоколы известны и их можно найти в литературе (см., например, Callard and Kotowicz "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31).

Отбор специфических иммунных клеток, таких как B-клетки, как правило, проводят с использованием антител, которые специфически связываются специфическими белками клеточной поверхности Bклеток и которые можно связать с твердой подложкой (например, микрогранулами или пластиковыми планшетами) или метить флуорохромом, который можно детектировать с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS). Например, перед иммортализацией EBV B-клетки человека отбирают на основе их аффинности к подложкам (например, микрогранулам), связывающим CD19, CD27 и/или CD22, или по отсутствию аффинности к антителам, специфичным к антителам определенных изотипов (см., например, Li et al. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 207:985-993, Bemasconi et al. (2003), Blood 101:4500-4504 и Traggiai et al. (2004), Nat. Med. 10:871-875). На эффективность процесса иммортализации может влиять выбор клеточного маркера для очистки, например, вследствие внутриклеточных сигналов, которые запускаются в процессе отбора и которые могут влиять на рост и жизнеспособность клеток. Например, CD22, который представляет собой специфичный B-клеточный трансмембранный белок, который контролирует пути передачи сигналов, связанные с распознаванием антигена и активацией B-клеток, является примером молекулы для начального отбора B-клеток. Так как положительная по CD22 популяция содержит клетки, которые экспрессируют антитела различных изотипов и специфичностей, для отбора клеток до либо после этапа стимуляции также можно использовать другие поверхностные клеточные маркеры.

В некоторых примерах обогащения специфическими секретирующими антитела клетками можно достигать, применяя в дополнение к отбору по CD22 отбор на основе CD27. Известно, что CD27 представляет собой маркер B-клеток человека, в которых произошла соматическая мутация генов вариабельной области (Borst J. et al. (2005), Curr. Opin. Immunol. 17:275-281). Также для удаления или обогащения желаемой популяции клеток можно использовать дополнительные маркеры, такие как CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, CD70 и CD69. Таким образом, в зависимости от таких факторов как история воздействия антигена на донора (например, антигена PCB) и титр антител можно отбирать общую популяцию обогащенных CD22 B-клеток или дополнительно обогащенные субпопуляции B-клеток, такие как положительные по CD27 B-клетки.

После отбора клеток и перед иммортализацией клеток популяцию клеток можно подвергать действию соответствующего стимулирующего средства. Примеры стимулирующих средств включают, например, активаторы поликлональных B-клеток, включая, но не ограничиваясь агонистами врожденного иммунного ответа (например, агонистами Толл-подобных рецепторов, такими как олигонуклеотиды CpG

(Bemasconi et al. (2003), Blood 101:4500-4504, Bemasconi et al. (2002), Science 298:2199-2202, Bourke et al.

(2003), Blood 102:956-63; например, нуклеотиды CpG, такие как, например, CpG2006, CpG2395 и CpG2395, доступные в Cell Sciences, Canton, MA), и иммуномодулирующими молекулами, такими как цитокины (например, интерлейкины с известной иммуностимулирующей активностью, например, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 и IL-13 (см. Callard and Kotowicz "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31), и агонистами рецепторов клеточной мембраны семейства рецепторов TNF, в частности агонистами, активирующими путь NFкВ и пролиферацию B-клеток, включая, но не ограничиваясь APRIL, BAFF, лиганд CD40 (CD40L) (см., например, Schneider (2005), Curr. Opin. Immunol. 17:282-289, He et al. (2004), J. Immunol. 172:3268-3279, Craxton et al. (2003), Blood 101:4464-4471 и Tangye et al. (2003), J. Immunol.170:261-269). Примеры спосо- 67 027835

бов стимуляции B-клеток с использованием иммортализации EBV в комбинации или последовательно с одним или более поликлональными активаторами, известными в данной области (см., например, Traggiai

et al. (2004), Nat. Med. 10:871-875, Tsuchiyama et al. (1997), Hum. Antibodies 8:43-47, Imadome et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7836-7840, публикации PCT № WO 07/068758, WO 04/76677, WO 91/09115 и WO 94/24164). Комбинацию стимулирующих средств можно добавлять в среду для культивирования перед этапом иммортализации, в одно и то же время или последовательно (например, добавление первого стимулирующего средства сразу же после начального отбора клеток, а второго стимулирующего средства спустя несколько часов или суток). Стимулирующие средства можно непосредственно добавлять в среду для культивирования из разбавленных исходных растворов, или после соответствующей подготовки, например, с использованием липосом или других соединений, которые могут улучшить их захват и иммуностимулирующую активность (Gursel et al. (2001), J. Immunol. 167:3324-3328). Стимулирующие средства также можно прикреплять к твердой подложке (к микрогранулам или непосредственно на планшеты для культивирования), что может обеспечить эффективное удаление средств(а). Клетки можно один или более раз промывать свежей средой и, необязательно, культивировать в нормальной среде для культивирования клеток (например, от 1 до 6 суток) для дальнейшего разбавления и устранения любого остаточного влияния стимулирующих средств. Стимулирующее средство(а) также можно ингибировать добавлением в клеточную культуру конкретных веществ.

Кроме того, клетки можно отбирать на основании изотипа экспрессируемых антител после стимуляции клеток и перед иммортализацией указанных отобранных и стимулированных клеток (т.е. между этапом стимуляции и этапом иммортализации). Отбор клеток по изотипу можно проводить применяя способы положительной (обеспечивая выделение специфических клеток) или отрицательной (обеспечивая устранение нежелательных клеток) селекции. Например, популяцию стимулированных положительных по IgG клеток можно отбирать посредством положительной селекции (посредством FACS или магнитного сепаратора клеток) или удаляя клетки, которые экспрессируют IgM, из популяции клеток популяция и, таким образом, обогащая клетками, которые экспрессируют IgG. Способы разделения секретирующих антитела клеток с использованием активируемых флуоресценцией или магнитных сепараторов клеток описаны в литературе (см., например, Li et al. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 207:985-93, Traggiai et al. (2004), Nat. Med. 10:871-875). В зависимости от источника секретирующих антитела клеток и их конечного применения также можно проводить удаление (или обогащение) клеток, экспрессирующих другие изотипы, таких как клетки, экспрессирующие IgD или IgA. Подобный подход можно использовать для выделения клеток на основе конкретного подкласса, если желателен такой точный отбор (например, отбор клеток человека, которые экспрессируют IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 антитела).

В данной области известно множество вирусных иммортализующих средств и их можно использовать для секретирующих антитела клеток с получением иммортализованных клеток, секретирующих антитела. Вирусы, инфицирующие и иммортализующие секретирующие антитела клетки вирусы общеизвестны как лимфотропные вирусы. Примерами таких вирусов являются вирусы, включенные в класс гамма вирусов герпеса. Представители этого семейства вирусов видоспецифично инфицируют лимфоциты и ассоциированы с лимфопролиферативными нарушениями и развитием нескольких злокачественных новообразований (Nicholas (2000), J. Mol. Pathol. 53:222-237 и Rickinson (2001), Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356:595-604). Примеры вирусов, которые можно применять в качестве иммортализующих средств в предоставляемых способах, включают EBV (вирус Эпштейна-Барр, также известный как вирус герпеса 4) и HHV-8 (вирус герпеса человека 8, также известный как KSHV, ассоциированный с саркомой Калоши вирус герпеса), которые могут заражать и иммортализовать лимфоциты человека. Другие примеры вирусов, которые можно использовать в способах, включают, но не ограничиваются MHV-68 (вирус герпеса мыши 68), HVS (вирус герпеса Самири), RRV (радиновирус макаки-резуса), LCV (лимфокриптовирус приматов), EHV-2 (вирус герпеса 2 лошадей), HVA (вирус герпеса Ateles) и AHV-1 (вирус герпеса 1 Alcelaphine), которые являются другими онкогенными лимфотропными вирусами герпеса с некоторыми общими генетическими признаками, консервативными у них, и со сходными патогенными эффектами в различных клетках-хозяевах млекопитающих.

Для иммортализации B-клеток также использовали рекомбинантные конструкции ДНК, содержащие специфические вирусные белки из вирусов, используемых для иммортализации (см. Damania (2004), Nat. Rev. Microbiol. 2:656-668 и Kilger et al. (1998), EMBO J. 17:1700-1709). В предоставляемых способах в клетки можно трансдуцировать сходные векторы, содержащие вирусные гены. Способы получения таких конструкций хорошо известны в данной области и включают, например, использование ретровирусных систем или вирусоподобных частиц и линий пакующих клеток, которые обеспечивают все необходимые факторы для формирования таких частиц.

Этап иммортализации может длиться от одного или более часов до 2-4 суток. Длительность этапа иммортализации можно корректировать в зависимости от различных факторов, таких как жизнеспособность клеток и эффективность иммортализации. В некоторых примерах клетки иммортализируют EBV в течение периода приблизительно от 4 до 24 ч. В конкретном примере клетки иммортализируют EBV в течение периода приблизительно 16 ч.

Опосредованная EBV иммортализация клеток требует экспрессии клеточного поверхностного ре- 68 027835

цептора CD21, который рассматривают в качестве основного рецептора EBV. CD21 присутствует на

большинстве субпопуляций B-клеток и регулирует ответ B-клеток, формируя комплекс с CD 19 и рецептором антигена B-клеток (Fearon and Carroll (2000), Ann. Rev. Immun. 18:393-422). Способность к трансформации клеток EBV можно повышать добавлением стимулирующих B-клетки средств, но условия должны обеспечивать сохранение CD21 на поверхности клеток, что позволяет EBV с высокой эффективностью осуществлять иммортализацию.

После этапа иммортализации иммортализованные клетки можно культивировать с низкой плотностью на слоях фидерных клеток. Фидерный слой можно получать из препаратов облученных неаллогенных клеток периферической крови, клеток лимфобластоидных линий или линий фибробластов, лимфоцитов пуповинной крови или различных типов эмбриональных клеток. Примером клеточной линии с такими свойствами является EL4-B5, мутантные клеточные линии тимомы EL4, которые эффективно поддерживает рост и пролиферацию B-клеток. Другие примеры фидерных клеток включают облученные фидерные клетки РМВС, обедненные B-клетками, как описано в другом разделе настоящего документа. Для поддержания популяции иммортализованных B-клеток также можно использовать способствующие росту средства, такие как средства, используемые для стимуляции популяции B-клеток.

Иммортализованные популяции клеток можно использовать в ряде применений, в частности, связанных с выделением, характеристикой и получением антител. В некоторых примерах из ДНК, выделенной из суммарной популяции клеток, общими рекомбинантными способами, можно получать библиотеки ДНК, кодирующие антитела, экспрессируемые клетками, или фрагменты таких антител. В некоторых примерах, как описано в настоящем документе, иммортализованные клетки можно культивировать далее и разделять на популяции секретирующих антитела клеток. Популяции клеток можно культивировать, например, на слоях фидерных клеток.

В некоторых примерах супернатанты клеточных культур популяций клеток подвергают одному или более циклам скрининга для идентификации клеток, экспрессирующих антитела с конкретной антигенной специфичностью (например, антитела, иммуноспецифически связывающие белок F PCB). Примеры способов скрининга антител и определения специфичности связывания описаны в других разделах настоящего документа и известны в данной области. После идентификации конкретного антитела из популяции клеток хорошо известными рекомбинантными способами можно выделять ДНК, кодирующую антитела или их антигенсвязывающие части. Как описано в настоящем документе, ДНК, выделенную из популяции клеток, затем можно экспрессировать (например, в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах) и подвергать повторному скринингу для идентификации индивидуальных клонов, экспрессирующих желаемое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Способы экспрессии и очистки антител хорошо известны специалисту в данной области и описаны в разделе F.

В некоторых примерах, как описано в настоящем документе, иммортализованные клетки можно сортировать по одной клетке посредством сортировщика клеток (например, FACS) с использованием меченого антигена. В конкретном примере клетки, экспрессирующие антитела к PCB, можно выделять с использованием антигена F PCB, меченого Alexa Fluor 647, для мечения желаемых клеток. Затем после сортировки, ДНК, кодирующую антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, можно выделять известными рекомбинантными способами. ДНК, выделенную из популяции клеток, можно экспрессировать (например, в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах), для подтверждения связывания антигена PCB.

Как правило, способы скрининга, применяемые для идентификации индивидуальных антител, связывающих конкретный антиген, приводят к идентификации антигенсвязывающих частей таких антител. Для получения полноразмерных или других производных антител из антигенсвязывающих фрагментов можно выделять нуклеотидные последовательности, кодирующие цепи VH и/или VL или их антигенсвязывающие части, и клонировать в векторы, экспрессирующие константную область VH (например, константную область гамма-1 человека) и константную область VL (например, константную область каппа или лямбда человека) соответственно. Домены VH и VL также можно клонировать в вектор, экспрессирующий выбранные константные области. Затем известными специалистам в данной области способами в линию клеток можно совместно трансфицировать вектор конверсии тяжелой цепи и вектор конверсии легкой цепи с получением стабильной или транзиторно трансфицированной клеточной линии, которая экспрессирует полноразмерное антитело, например, IgG.

F. Способы получения антител к PCB, их модифицированных форм вариантов и нуклиновых кислот, кодирующих антител

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно получать любым подходящим способом получения антител, известным в данной области, включая способы химического синтеза и рекомбинантной экспрессии. Для получения, поддержания, репродукции и амплификации нуклеиновых кислот (например, нуклеиновых кислоты, кодирующих антитела, такие как предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты) и для экспрессии полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислоты, можно использовать различные комбинации клеток-хозяев и векторов. В основном, выбор клетки-хозяина и вектора зависит от того желательны ли амплификации, экспрессия полипептида и/или дисплей на генетическом контейнере, например, фаге.

- 69 027835

Способы трансформации клеток-хозяев хорошо известны. Для трансформации клетки-хозяина нуклеиновыми кислотами можно использовать любой известный способ трансформации (например, трансформацию, трансфекцию, инфекцию, электропорацию и обработку ультразвуком). Способы получения антител, например, моноклональных антител и фрагментов антител, включая, но не ограничиваясь фрагментами Fab и одноцепочечными антителами, хорошо известны в данной области.

Моноклональные антитела можно получать широким спектром способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь использованием гибридом, рекомбинантной экспрессией, технологией фагового дисплея или их комбинацией. Например, моноклональные антитела можно получать гибридомными способами, включая известные в данной области и описанные, например, в. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 5630681 (Elsevier N.Y. 1981).

Полипептиды, такие как любые указанные в настоящем документе, включая антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно получать любым способом, известным специалистам в данной области, включая способы in vivo и in vitro. Желаемый полипептид можно экспрессировать в любом организме, подходящем для получения требуемого количества и форм белков, например, необходимых для анализа, введения и лечения. Экспрессирующие хозяева включают прокариотические и эукариотические организмы, такие как E.coli, дрожжи, растения, клетки насекомых, клетки млекопитающих, включая клеточные линии человека, и трансгенных животных (например, кроликов, мышей, крыс и скота, включая, но не ограничиваясь козами, овцами и крупным рогатым скотом), включая получение в сыворотке, молоке и яйцах. Экспрессирующие хозяева могут различаться по уровням продукции белка, а также типам посттрансляционных модификаций, которые присутствуют в экспрессируемом белке. Выбор экспрессирующего хозяина можно проводить на основе этих и других факторов, таких как нормативные ограничения и соображения безопасности, себестоимость и необходимость и способы очистки.

1. Нуклеиновые кислоты.

По настоящему документу предоставлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу. В некоторых примерах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело, представляющее собой 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6. В некоторых примерах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует форму антитела или другую форму антигенсвязывающего фрагмента 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11, 17С9 или 69F6.

В некоторых примерах выделенная молекула нуклеиновой кислоты, предоставляемая по настоящему документу, кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 454 или 456. В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислота с последовательность нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 443, 445, 447, 449, 451, 477, 479 или 481.

В некоторых примерах выделенная молекула нуклеиновой кислоты, предоставляемая по настоящему документу, кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие легкую цепь с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 или 457. В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислота с последовательность нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 442, 444, 446, 448, 450, 476, 478 или 480.

В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 или 482-484. В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 или 471. В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 или 472.

В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 или 473. В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR2 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 или 474. В некоторых примерах предоставляемая выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR3 VL с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 или 475.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно получать хорошо известными рекомбинант- 70 027835

ными способами манипуляции молекулами нуклеиновых кислот (см., например, способы, описанные Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. и Ausubel et al. (1998), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY). В некоторых примерах для получения модифицированных антител или их антигенсвязывающих фрагментов с различными аминокислотными последовательностями, например, для введения аминокислотных замен, делеций и/или вставок, можно использовать способы, включающие, но не ограничивающиеся способами рекомбинантных ДНК, сайт-специфическим мутагенезом и полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

В некоторых примерах одну или более CDR антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, встраивают в каркасные области обычными способами рекомбинантных ДНК. Каркасные области можно выбрать из природных или консенсусных каркасных областей, включая каркасные области человека (см., примеры каркасных областей в Chothia et al. (1998), J. Mol. Biol. 278: 457-479). Как правило, полинуклеотид, полученный комбинированием каркасных. областей и CDR, кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность исходного антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента. Для улучшения одного или более свойств кодируемого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента специалист в данной области может проводить в полинуклеотиде модификации. В некоторых примерах в полинуклеотиде можно проводить одну или более модификаций, приводящих к аминокислотным заменам в каркасных областях, которые, например, улучшают связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с их антигеном. Кроме того, такие способы можно использовать для замены или делеций одного или более остатков цистеина вариабельной области, которые участвуют в образовании внутрицепочечных дисульфидных связей, с получением молекулы антител без одной или более внутрицепочечных дисульфидных связей.

2. Векторы.

По настоящему документу предоставлены векторы, содержащие нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты (кодирующие тяжелые и легкие цепи), кодирующие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты. Как правило, в вектор клонируют нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и в вектор клонируют нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела. Гены можно клонировать в один вектор для их совместной экспрессии или в раздельные векторы. При желании, векторы также могут содержать дополнительные последовательности, кодирующие дополнительную константную область(и) или шарнирные области для получения других форм антител.

Доступно и известно специалистам в данной области множество экспрессирующих векторов и их можно использовать для экспрессии полипептидов. Выбор экспрессирующего вектора зависит от выбора экспрессирующего хозяина. Такой выбор находится в компетенции специалиста в данной области. В основном экспрессирующие векторы могут содержать промоторы и, необязательно, энхансеры транскрипции, сигналы трансляции и сигналы терминации транскрипции и трансляции. Экспрессирующие векторы, которые используют для стабильной трансформации, как правило, содержат селектируемый маркер, обеспечивающий отбор и поддержание трансформированных клеток. В некоторых случаях для амплификации количества вектора в клетках можно использовать участок начала репликации.

Векторы также могут содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, функционально связанные с лигируемой молекулой нуклеиновой кислоты, например, такие как эпитопные метки, такие как для локализации белка, например, метка His6, или метка myc, или метка для очистки, например, метка GST, и последовательность для направления секреции белка и/или ассоциации с мембраной.

Экспрессию антител или их антигенсвязывающих фрагментов можно контролировать посредством любого промотора/энхансера, известного в данной области. Подходящие бактериальные промоторы хорошо известны в данной области и описаны в настоящем документе ниже. В данной области хорошо известны другие промоторы для клеток млекопитающих, дрожжевых клеток и клеток насекомых и некоторые из них описаны ниже. Выбор промотора, используемого для контроля экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения и находится в компетенции специалистов в данной области. Промоторы, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ранним промотором SV40, содержащимся в эукариотических экспрессирующих векторах (Bemoist and Chambon, (1981), Nature 290:304-310), промотором, содержащимся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al. (1980), Cell 22:787-797), промотором тимидинкиназы герпеса (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), регуляторными последовательностями гена металлотионеина (Brinster et al. (1982), Nature 296:39-42), промоторами прокариотических экспрессирующих векторов, такими как промотор β-лактамазы (Jay et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) или промотором tac (DeBoer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25), также см. "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980)); экспрессирующие векторы растений включают промотор нопалинсинтетазы (Herrera-Estrella et al. (1984), Nature 303:209-213), промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (Gardner et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:2871) и промотор фермента фотосинтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Herrera-Estrella et al. (1984), Nature 310:115-120); промоторные элементы дрожжей и других грибов включают промотор Gal4, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор

- 71 027835

фосфоглицеролкиназы, промотор щелочной фосфатазы; и приведенные ниже области контроля транскрипции животных, которые проявляют тканеспецифичность и которые использовали у трансгенных животных: контролирующая область гена эластазы I, которая активна в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al. (1984), Cell 38:639-646; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7:425-515); контролирующая область гена инсулина, активная в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan et al. (1985), Nature 315:115-122), контролирующая область гена иммуноглобулина, который активна в лимфоидных клетках (Grosschedl et al. (1984), Cell 38:647-658; Adams et al. (1985), Nature 318:533-538; Alexander et al. (1987), Mol. Cell Biol. 7:1436-1444), контролирующая область вируса опухоли молочной железы мыши, активная в яичках, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al. (1986), Cell 45:485-495), контролирующая область гена альбумина, активная в печени (Pinckert et al. (1987), Genes and Devel. 1:268-276), контролирующая область гена альфа-фетобелка, активная в печени (Krumlauf et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5:1639-403); Hammer et al. (1987), Science 235:53-58), контролирующая область гена α-1-антитрипсина, активная в печени (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1:161-171), контролирующий область гена бета-глобина, активная в миелоидных клетках (Magram et al. (1985), Nature 315:338-340); Kollias et al. (1986), Cell 46:89-94), контролирующая область гена основного белка миелина, активная в олигодендроцитах мозга (Readhead et al. (1987), Cell 48:703-712), контролирующая область гена легких цепей-2 миозина, активная в скелетных мышцах (Shani (1985), Nature 314:283-286) и контролирующая область гена гонадотропного рилизинггормона, активная в гонадотрофоцитах гипоталамуса (Mason et al. (1986), Science 234:1372-1378).

В дополнение к промотору экспрессирующий вектор обычно содержит единицу транскрипции или экспрессирующую кассету, содержащую все дополнительные элементы, необходимые для экспрессии антитела или его части в клетках-хозяевах. Типичная экспрессирующая кассета содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей цепи антитела, и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, участки связывания рибосомы и терминации трансляции. Дополнительные элементы кассеты могут включать энхансеры. Кроме того, для эффективной терминации кассета, как правило, ниже структурных генов содержит область терминации транскрипции. Область терминации можно получать из того же гена, что и промоторная последовательность, или можно получать из других генов.

Некоторые экспрессирующие системы имеют маркеры, которые обеспечивают амплификацию гена, такие как тимидинкиназа и дигидрофолатредуктаза. Кроме того, также подходят экспрессирующие системы с высоким выходом, не связанные с амплификацией гена, например, можно применять бакуловирусный вектор, вводимый в клетки насекомых, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела зародышевой линии под контролем промотора полиэдрина или другого сильного бакуловируснного промотора.

Для целей по настоящему документу предоставлены векторы, содержащие последовательность нуклеотидов, кодирующую вариабельные области тяжелых цепей и/или легких цепей антитела к PCB. В некоторых примерах векторы, предоставляемые по настоящему документу, содержат последовательность нуклеотидов, кодирующую константную область антитела, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область антитела. Вектор может содержать последовательность одного или всех из C_H1, C_H2, шарнира, C_H3 или C_H4 и/или C1. Как правило, например, для экспрессии Fab, вектор содержит последовательность для C_H1 или C_L (легкие цепи каппа или лямбда). Последовательности константных областей или шарнирных областей известны специалисту в данной области (см., например, опубликованную, заявка США № 20080248028) и описаны в настоящем документе.

Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать любые способы вставки фрагментов ДНК в вектор, которые известны специалистам в данной области.

Эти способы могут включать технологии рекомбинантных ДНК in vitro и синтетические способы и рекомбинацию in vivo (генетическую рекомбинацию). Вставку в клонирующий вектор можно проводить, например, посредством лигирования фрагмента ДНК в клонирующий вектор с комплементарными липкими концами. Если в клонирующем векторе не присутствуют комплементарные участки рестрикции, используемые для фрагментации ДНК, концы молекулы ДНК можно модифицировать ферментативно. Альтернативно, посредством лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах ДНК можно получать любой желаемый участок, эти лигированные линкеры могут содержать специфические химически синтезированные нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательности, распознаваемые рестрикционными эндонуклеазами.

Примеры плазмидных векторов, пригодных для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, включают сильный промотор, такой как предранний энхансер/промотор HCMV или промотор МНС I класса, интрон для усиления процессинга транскрипта, такой как интрон предраннего гена HCMV и сигнал полиаденилирования (полиА), такой как поздний сигнал полиаденилирования SV40. Для экспрессии полноразмерных тяжелых и легких цепей

- 72 027835

антитела, фрагмента одноцепочечного Fv или других фрагментов иммуноглобулина плазмида может быть полицистронной.

3. Клеточные экспрессирующие системы.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно экспрессировать в подходящем хозяине. По настоящему документу предоставлены клетки, содержащие векторы и нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу. Как правило, подходят любые типы клеток, которые могут экспрессировать гетерологичную ДНК и имеют секреторный путь. Экспрессирующие хозяева включает прокариотические и эукариотические организмы, такие как бактериальные клетки (например, E.coli), дрожжевые клетки, клетки грибов, архей, растительные клетки, клетки насекомых и клетки животных, включая клетки человека. Экспрессирующие хозяева могут различаться по их уровням экспрессии белка, а также типам посттрансляционных модификаций, которые присутствуют на экспрессируемом белке. Кроме того, выбор экспрессирующего хозяина часто зависит от выбора вектора и используемых элементов транскрипции и трансляции. Например, выбор экспрессирующего хозяина часто зависит от выбора используемой последовательностипредшественника. Например, многие гетерологичные сигнальные последовательности можно экспрессировать только в клетке-хозяине того же вида (т.е. сигнальные последовательности клеток насекомых оптимально экспрессируются в клетках насекомых). В отличие от этого, другие сигнальные последовательности можно использовать в гетерологичных хозяевах, такие как например, сигнальная последовательность сывороточного альбумина человека (hHSA), которая активна в клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих, и пре/про последовательность тканевого активатора плазминогена, для которой показано, что она функциональна в клетках насекомых и млекопитающих (Tan et al. (2002), Protein Eng. 15:337). Выбор экспрессирующего хозяина можно проводить на основе этих и других факторов, таких как нормативные ограничения и соображения безопасности, себестоимость и необходимость и способы очистки. Таким образом, векторная система должна быть совместимой с используемой клеткой-хозяином.

Экспрессия в эукариотических хозяевах может включать в себя экспрессию в дрожжах, таких как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, в клетках насекомых, таких как клетки Drosophila и клетки чешуекрылых, в растениях и клетках растений, таких как табак, кукуруза, рис, водоросли и ряска. Эукариотические клетки для экспрессии также включают линии клеток млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомяка (СНО) или клетки эмбриональной почки хомяка (ВНК). Экспрессия в эукариотических хозяевах также включает получение белка у трансгенных животных, например, включающее получение в сыворотке, молоке и яйцах.

Рекомбинантные молекулы можно вводить в клетки-хозяева, например, посредством трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации и обработки ультразвуком, так что клетки получают несколько копий последовательности гена. Как правило, для получения клеток бактерий, линий клеток млекопитающих, дрожжей или насекомых, которые экспрессируют большое количество цепей антител, которые затем очищают стандартными способами, применяют стандартные способы трансфекции, (см., например, Colley et al. (1989), J. Biol. Chem., 264:17619-17622; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990). Трансформация эукариотических и прокариотических клеток проводят стандартными способами (см., например, Morrison (1977), J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss and Curtiss (1983), Methods in Enzymology, 101, 347-362). Например, можно использовать любые известные способы введения чужеродных нуклеотидных последовательностей в клетки-хозяева. Они включают использование трансфекции фосфатом кальция, полибрена, слияние протопластов, электропорацию, биолистику, липосомы, микроинъекцию, плазматические векторы, вирусные векторы (например, на основе бакуловируса, вируса коровьей оспы, аденовируса и других вирусов), а также любые другие хорошо известные способы введения в клетку-хозяина клонированной геномной ДНК, кДНК, плазмидной ДНК, космидной ДНК, синтетической ДНК или другого чужеродного генетического материала.

Как правило, для целей по настоящему документу, клетки-хозяева трансфицируют первым вектором, кодирующим, по меньшей мере, V_H тяжелой цепи или тяжелую цепь антитела к PCB, и вторым вектором, кодирующим, по меньшей мере, V_L легкой цепи или легкую цепь антитела к PCB. Также клеткихозяева можно трансфицировать одним вектором, кодирующим тяжелую и легкую цепи или их части.

В одном из примеров нуклеиновую кислота, кодирующую тяжелую цепь антитела, лигируют в первый экспрессирующий вектор, а нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, лигируют во второй экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы могут быть одинаковыми или различными, хотя, как правило, они являются в достаточной степени совместимыми, чтобы обеспечить сравнимую экспрессию белков (тяжелой и легкой цепей) с них. Первый и второй экспрессирующие векторы, как правило, совместно трансфицируют в клетки-хозяева, как правило, в соотношении 1:1. Примеры векторов включают, но не ограничиваются pylHC и pkLC (Tiller et al. (2008), Journal of Immunological Methods, 329:112-24)). Другие экспрессирующие векторы включают экспрессирующий легкую цепь вектор pAG4622 и экспрессирующий тяжелую цепь вектор рАН4604 (Coloma et al. (l992), J. Immunol. Methods,

l52:89-l04). Вектор pAG4622 содержит геномную последовательность, кодирующую домен С-области человека легкой цепи к и селектируемый маркер gpt. Вектор рАН4604 содержит селектируемый маркер

- 73 027835

hisD и последовательности, кодирующие домен C-области тяжелой цепи γ1 человека.

В другом примере тяжелые и легкие цепи можно клонировать в один вектор, содержащий экспрессирующие кассеты для тяжелой и легкой цепей. В одном из примеров гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи, можно клонировать в экспрессирующий вектор pTT5 млекопитающих (NRC Biotechnology Research). В другом примере гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи или их части, можно клонировать в pCALM (SEQ ID NO: 102).

Для экспрессии полноразмерного Ig, последовательности, кодирующие У_н-С_н1-шарнир-С_н2-С_н3, можно клонировать в первый экспрессирующий вектор, а последовательности, кодирующие домены V_LC_L, можно клонировать во второй экспрессирующий вектор. Для получения Fab, последовательности, кодирующие V_H-C_H1, можно клонировать в первый экспрессирующий вектор, а последовательности, кодирующие домены VL-CL, можно клонировать во второй экспрессирующий вектор. Для обычного антитела тяжелую цепей спаривают с легкой цепью и получают мономер Fab.

Экспрессию можно проводить в любой клеточной экспрессирующей системе, известной специалисту в данной области. Примеры клеток для экспрессии включают, но не ограничиваются клетки 293FS, клетки HEK293-6B или клетки CHO. Другие экспрессирующие векторы и клетки-хозяева описаны ниже.

После экспрессии тяжелые и легкие цепи антитела спариваются посредством дисульфидной связи с формированием полноразмерного антитела или его фрагментов.

a. Экспрессия в прокариотах.

Прокариоты, особенно E.coli, обеспечивают системы для получения больших количеств белка и их можно использовать для экспрессии предоставляемых антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. Как правило, для амплификации и экспрессии предоставляемых вариантов полипептидов используют клетки-хозяева E.coli. Трансформация E.coli представляет собой простой и быстрый способ, хорошо известный специалистам в данной области. Экспрессирующие векторы E.coli могут содержать индуцибельные промоторы, пригодные для индукции высоких уровней экспрессии белка и для экспрессии белков, которые проявляют определенную степень токсичности для клеток-хозяев. Примеры индуцибельных промоторов включают промотор lac, промотор trp, гибридный промотор tac, промоторы Т7 и SP6 РНК и термочувствительный промотор /-PL.

Белки, такие как любые белки, предоставляемые по настоящему документу, можно экспрессировать в цитоплазматической среде E.coli. Для некоторых полипептидов цитоплазматическая среда может приводить к формированию нерастворимых телец включения, содержащих агрегаты белков. Для повторного растворения белков с последующим рефолдингом растворимых белков можно использовать восстановители, такие как дитиотреитол и β-меркаптоэтанол, и денатурирующие средства, такие как гуанидин-HCl и мочевина. Альтернативный подход состоит в экспрессии белка в периплазматическом пространстве бактерий, которое обеспечивает окислительную среду, шаперонин-подобные изомеразы и дисульфидизомеразы, что приводит к образованию растворимого белка. Например, для фагового дисплея белков, белки экспортируют в периплазму так, что они могут собираться в фаге. Как правило, с экспрессируемым белком сливают лидерную последовательность, которая направляет белок в периплазму. Затем лидерную последовательность удаляют сигнальные пептидазы в периплазме. Примеры лидерных последовательностей, направляющих белки в периплазму, включают лидерную последовательность pelB гена пектатлиазы и лидерную последовательность гена щелочной фосфатазы. В некоторых случаях периплазматическая экспрессия обеспечивает выход экспрессируемого белка в среду для культивирования. Секреция белков позволяет быстро и просто очищать белки от супернатанта культуры. Несекретируемые белки можно получать из периплазмы посредством осмотического лизиса. Как и при цитоплазматической экспрессии, в некоторых случаях белки могут становиться нерастворимыми и для облегчения растворения и рефолдинга белков можно использовать денатурирующие средства и восстановители. Температуры индукции и роста также могут влиять на уровень экспрессии и растворимость белков, как правило, используют температуры от 25 до 37°C. Как правило, бактерии продуцируют негликозилированные белки. Таким образом, если для функционирования белки требуют гликозилирования, то гликозилирование можно добавлять in vitro после очистки из клеток-хозяев.

b. Дрожжевые клетки.

Дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis и Pichia pastoris, являются хорошо известными дрожжевыми экспрессирующими хозяевами, которые можно использовать для экспрессии антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу. Дрожжи можно трансформировать эписомными реплицирующимися векторами или посредством стабильной интеграцией в хромосомы посредством гомологичной рекомбинации. Как правило, для регуляции экспрессии генов используют индуцибельные промоторы. Примеры таких промоторов включают промоторы GAL1, GAL7 и GAL5 и промоторы металлотионеинов, такие как CUP1, АОХ или другие промоторы Picnia или промоторы других дрожжей. Для отбора и поддержания трансформированной ДНК экспрессирующие векторы часто содержат селектируемые маркеры, такие как LEU2, TRP1, HIS3 и URA3. Экспрессируемые в дрожжах белки часто являются растворимыми. Коэкспрессия с шаперонинами, такими как Bip и протеиндисульфидизомераза, может по- 74 027835

вышать уровень экспрессии и растворимость. Кроме того, экспрессируемые в дрожжах белки можно направлять для секреции с использованием слитых белков с сигнальным пептидом секреции, таким как сигнал секреции альфа-фактора типа спаривания дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и слитых белков с сигнальным пептидом дрожжевых поверхностных белков, таких как адгезивный рецептор спаривания Aga2p или глюкоамилаза Arxula adeninivorans. Для удаления из экспрессированных полипептидов после выхода из пути секреции слитых последовательностей можно конструировать участок расщепления протеазой, например, протеазой Kex-2. Дрожжи также способны к гликозилированию мотивов Asn-XSer/Thr.

с. Клетки насекомых.

Для экспрессии антител к PCB и их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно использовать клетки насекомых, особенно при использовании экспрессии бакуловирусов. Клетки насекомых экспрессируют высокие уровни белка и способны осуществлять большинство посттрансляционных модификаций, используемых высшими эукариотами. Бакуловирусы имеют ограниченный диапазон хозяев, что повышает безопасность и снижает нормативные ограничения, присущие системам эукариотической экспрессии. Как правило, в экспрессирующих векторах используют промотор для высокоуровневой экспрессии белка, такой как промотор полиэдрина бакуловируса. Широко используемые бакуловирусные системы включают такие бакуловирусы, как вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) и вирус ядерного полиэдроза Bombyx mori (BmNPV) и линии клеток насекомых, такие как Sf9, полученные из Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) и Danaus plexippus (DpN1). Для достижения высокого уровня экспрессии нуклеотидную последовательность молекулы для экспрессии сливают непосредственно ниже инициирующего кодона полиэдрина вируса. Для получения рекомбинантов бакуловируса, способных к экспрессии антител человека, используют перенос с двойной экспрессией, такой как pAcUW51 (PharMingen). Сигналы секреции млекопитающих безошибочно процессируются в клетках насекомых и их можно использовать для секреции экспрессированного белка в среду для культивирования. Кроме того, клеточные линии Pseudaletia unipuncta (A7S) и Danaus plexippus (DpN1) продуцируют белки, профиль гликозилирования которых сходен с клеточными системами млекопитающих.

Альтернативной экспрессирующей системой в клетках насекомых является использование стабильно трансформированных клеток. Для экспрессии можно использовать такие клеточные линии, как Schnieder 2 (S2) и клетки Kc (Drosophila melanogaster) и клетки С7 (Aedes albopictus). Для индукции высоких уровней экспрессии можно использовать промотор металлотионеина Drosophila с индукцией тяжелыми металлами кадмием и медью. Экспрессирующие векторы, как правило, поддерживают, используя селектируемые маркеры, такие как неомицин и гигромицин.

Примерами бакуловирусных векторов для экспрессии антител являются бицистронные векторы рАс-k-Fc (Progen, Biotechnik; по каталогу № PR3001); pAc-X-Fc (Progen; PR3003); pAc-k-C_H3 (Progen; PR3000) и рАс-Х-С_н3 (Progen; PR3002).

d. Клетки млекопитающих.

Для экспрессии антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу можно использовать экспрессирующие системы млекопитающих.

Экспрессирующие конструкции можно трансфицировать в клетки млекопитающих посредством инфекции вирусом, включающим, но не ограничивающимся, например, аденовирусом или вирусом коровьей оспы, или посредством прямого переноса ДНК, например, посредством липосом, фосфата кальция, DEAE-декстрана, и физическими способами, такими как электропорация и микроинъекция. Экспрессирующие векторы для клеток млекопитающих, как правило, включают участок кэпирования мРНК, ТАТА-бокс, последовательность инициации трансляции (консенсусную последовательность Козака) и элементы полиаденилирования. Такие векторы часто включают промоторы и энхансеры транскрипции для достижения высокоуровневой экспрессии, например, промотор-энхансер SV40, промотор цитомегаловируса человека (CMV) и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса. Эти промоторы-энхансеры активны во многих типах клеток. Также для экспрессии можно использовать тканеспецифичные и специфичные к определенным типам клеток промоторы и энхансерные области. Примеры промоторных/энхансерных областей включают, но не ограничиваются такими областями генов, как контрольная область гена эластазы I, контрольная область гена инсулина, контрольные области генов иммуноглобулинов, контрольные области генов вируса опухоли молочной железы мыши, контрольная область гена альбумина, контрольная область гена альфафетопротеина, контрольная область гена α-1-антитрипсина, контрольная область гена бетаглобина, контрольная область гена основного белка миелина, контрольная область гена легкой цепи миозина 2 и контрольная область гена гонадотропного рилизинг-гормона. Для отбора и поддержания клеток с экспрессирующими конструкциями можно использовать селектируемые маркеры. Примеры селектируемых маркеров включают, но не ограничиваются генами гигромицин-Вфосфотрансферазы, аденозиндезаминазы, ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы, аминогликозидфосфотрансферазы, дигидрофолатредуктазы и тимидинкиназы. Слитые с сигнальными молекулами клеточной поверхности, такими как TCR-ζ и Fc^RI-γ. белки могут непосредственно зкспрессироваться в ак- 75 027835

тивном состоянии на поверхность клеток. Антитела можно получать с использованием системы NEO^R/G418, системы дигидрофолатредуктазы (DHFR) или системы глутаминсинтетазы (GS). В системе GS используют комбинированные экспрессирующие векторы, такие как рЕЕ12/рЕЕ6 с одновременной экспрессией тяжелой цепи и легкой цепи. Слияние с сигнальными молекулами клеточной поверхности, такими как TCR-ζ и Fc_eRI-y может направлять экспрессию белков в активном состоянии на клеточную поверхность.

Для экспрессии у млекопитающих доступно множество клеточных линий, включая клетки мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомяка. Примеры линий клеток включают, но не ограничиваются CHO, Balb/3T3, ВНК, HeLa, MDCK, MT2, NS0 мыши (не секретирующими) и другими миеломными клеточными линиями, гибридомными и гетерогибридомными клеточными линиями, лимфоцитами, фибробластами, клетками Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, W138, ВТ483, HS578T, НТВ2, ВТ20, T47D, 293S, 2В8 и HKB. Также доступны клеточные линии, адаптированные к бессывороточной среде, которые облегчает очистку секретируемых белков из среды для культивирования. Один такой пример представляет собой бессывороточную линию клеток EBNA-I (Pham at al. (2003), Biotechnol Bioeng. 84:332-42).

Примеры векторов млекопитающих для экспрессии антител включают рТТ5 (NRC Biotechnology Research Institute) и pCALM (указанный в SEQ ID NO: 102).

е. Растения.

Для экспрессии полипептиды, таких как любые полипептиды, описываемые в настоящем изобретении белки, можно использовать трансгенные клетки растений и растения. Экспрессирующие конструкции, как правило, переносят в растения с использованием прямого переноса ДНК, такого как бомбардировка микрочастицами и опосредованный ПЭГ перенос в протопласты, или с использованием опосредуемой агробактериями трансформации. Экспрессирующие векторы могут содержать промоторные и энхансерные последовательности, элементы терминации транскрипции и элементы контроля трансляции. Экспрессирующие векторы и способы трансформации, как правило, разделены между двудольными хозяевами, такими как Arabidopsis и табак, и однодольными хозяевами, такими как кукуруза и рис. Примеры промоторов растений, используемых для экспрессии, включают промотор вируса мозаики цветной капусты, промотор нопалинсинтазы, промотор рибозобисфосфаткарбоксилазы и промоторы убиквитина и UBQ3. Для облегчения отбора и поддержания трансформированных клеток часто используют селектируемые маркеры, такие как гигромицин, фосфоманнозоизомераза и неомицинфосфотрансфераза.

Трансформированные клетки растений можно поддерживать в культуре в виде клеток, агрегатов (каллусной ткани) или регенерировать в целые растения. Трансгенные клетки растений также могут включать водоросли, генетически сконструированные для продукции протеаз и модифицированных протеаз (см., например, Mayfield et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:438-442). Поскольку профили гликозилирования у растений отличаются от профилей гликозилирования клеток млекопитающих, это может влиять на выбор белков, продуцируемых в этих хозяевах.

4. Очистка антител.

Способы очистки полипептидов, включая антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, из клеток-хозяев зависят от выбранных клеток-хозяев и экспрессирующих систем. В случае секретируемых молекул, белки, как правило, очищают из среды для культивирования после удаления клеток. Для внутриклеточной экспрессии клетки можно лизировать и очищать белки из экстракта. В одном из примеров, полипептиды выделяют из клеток-хозяев посредством центрифугирования и лизиса клеток (например, посредством повторяющегося замораживанияоттаивания в бане с сухим льдом/этанолом) с последующим центрифугированием и сбором супернатанта, содержащего полипептиды. Когда для экспрессии используют трансгенные организмы, такие как трансгенные растения и животные, в качестве исходного материала для получения экстракта лизированных клеток можно использовать ткани или органы. Кроме того, получение белков у трансгенных животных может включать получение полипептидов в молоке или яйцах, которые можно собирать, и при необходимости дополнительные белки можно выделять и дополнительно очищать стандартными способами, известными в данной области.

Белки, такие как антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно очищать, например, из экстракта лизированных клеток стандартными способами очистки белков, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь SDS-PAGE, хроматографией фракций по размеру и эксклюзионной хроматографией, осаждением сульфатом аммония и ионообменной хроматографией, такой как анионообменная хроматография. Для увеличения эффективности очистки и улучшения чистоты получаемых препаратов можно использовать способы аффинной очистки. Также экспрессирующие конструкции можно конструировать так, чтобы добавлять к белку аффинную метку, такую как эпитоп myc, слияние GST или His6, и аффинную очистку проводить с антителом к myc, смолы с глутатионом и Ni-смолы соответственно. Чистоту можно анализировать любым способом, известным в данной области, включая гель-электрофорез и окрашивание и спектрофотометрические способы.

Как правило, антитела и их части очищают известным специалисту в данной области способом. Антитела можно очищать до значительной чистоты стандартными способами очистки белков, известными в

- 76 027835

данной области включая, но не ограничиваясь SDS-PAGE, хроматографией фракций по размеру и эксклюзионной хроматографией, осаждением сульфатом аммония, хелатной хроматографией, ионообменной хроматографией или хроматографией на колонке. Например, антитела можно очищать посредством хроматографии на колонке. Примером способа очистки антител является использование хроматографии на колонке, где материал твердой подложки колонки связывают с белком G, ассоциированным с клеточной поверхностью белком Streptococcus, которые с высокой аффинностью связывают иммуноглобулины. Антитела можно очищать до 60, 70, 80% чистоты, а как правило, по меньшей мере до 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% чистоты. Чистоту можно анализировать стандартными способами, такими как SDS-PAGE и окрашивание Кумасси.

Затем выделенные полипептиды можно анализировать, например, посредством разделения в геле (например, геле SDS-Page), фракционирования по размеру (например, разделения на эксклюзионных колонках Sephacryl™ S-200 HiPrep™ 16x60 (Amersham из GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Выделенные полипептиды также можно анализировать в анализах связывания, как правило, в анализах связывания с использованием партнера по связыванию, связанного с твердой подложкой, например, с планшетом (например, в анализах связывания способом ELISA) или с гранулой для определения их способности связывать желаемых партнеров по связыванию. Анализы связывания, описанные в разделах ниже, которые используют для анализа связывания осажденных полипептидов из фагового дисплея, также можно использовать для анализа полипептидов, выделенных непосредственно из лизатов клеток-хозяев. Например, анализы связывания можно проводить для определения наличия связывания полипептидов антител с одним или более антигенами, например, посредством нанесения антигена на твердую подложку, например, в лунку планшета для анализа, и инкубации выделенных полипептидов с твердой подложкой с последующей отмывкой и детекцией вторичными реагентами, например, меченным ферментом антителами и субстратами.

G. Анализ свойств и активности антител к PCB

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно характеризовать различными способами, хорошо известными специалисту в данной области. Например, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно анализировать на способность иммуноспецифически связывать белок F респираторносинцитиального вируса (PCB) человека. Такие анализы можно проводить, например, в растворе (например, Houghten (1992), Bio/Techniques 13:412-421), на поверхности гранул (Lam (1991), Nature 354:82-84), на чипах (Fodor (1993), Nature 364:555-556), на бактериях (патент США № 5223409), на спорах (патенты США № 5571698, 5403484 и 5223409), на плазмидах (Cull et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:18651869) или на фагах (Scott and Smith (1990), Science 249:386-390; Devlin (1990), Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; и Felici (1991), J. Mol. Biol. 222:301-310). Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые идентифицированы как иммуноспецифически связывающие антиген PCB или его фрагмент, также можно анализировать на их специфичность и аффинность к антигену PCB. Специфичность связывания или эпитоп можно определять, например, в анализах конкуренции с другими антителами к PCB и/или в анализах нейтрализации вируса с использованием устойчивых к моноклональным антителам мутантов (MARM). Кроме того, для измерения уровня нейтрализации PCB, осуществляемого посредством контакта или введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, можно использовать анализы in vitro и модели на животных in vivo с использованием антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу.

1. Анализы связывания.

У антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, любыми способами, известными специалистам в данной области, можно анализировать их способность связывать выбранную мишень (например, вирус PCB или выделенный белок F PCB) и специфичность к такой мишени. Примеры анализов приведены в примерах и описаны в настоящем документе ниже. Анализы связывания можно проводить в растворе, суспензии или на твердом носителе. Например, антигены-мишени можно иммобилизовать на твердой подложке (например, угле или пластиковой поверхности, чашке для тканевых культур или чипе) и приводить в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. Несвязанные антитела или белок-мишень можно отмывать, а затем можно детектировать связанные комплексы. Анализы связывания можно проводить в условиях, уменьшающих неспецифическое связывание, например, с использованием буфера с высокой ионной силой (например, 0,30,4 М NaCl) с неионными детергентами (например, 0,1% Triton X-100, Твин-20) и/или блокирования белком (например, бычьим сывороточным альбумином или желатином). Для оценки фонового связывания в такие анализы также можно включать отрицательный контроль. Аффинность можно определять посредством анализа Скэтчарда (Munson et al. (1980), Anal. Biochem., 107:220), поверхностного плазмонного резонанса, изотермической калориметрии или другими способами, известными специалистам в данной области.

Примеры иммунологических анализов, которые можно использовать для анализа иммуноспецифического связывания и перекрестной реактивности, включают, но не ограничиваются конкурентными и

неконкурентными системами анализа с использованием способов, в качестве неограничивающих приме- 77 027835

ров, таких как вестерн-блотинг, радиоиммунологические анализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland, иммунологические анализы типа "сэндвич", анализы иммунопреципитации, ELISPOT, реакции преципитации, реакции преципитации с диффузией в геле, иммунодиффузионные анализы, анализы агглютинации, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммунологические анализы с белком А. Такие анализы являются стандартными и хорошо известны в данной области (см., например, Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, которое в полном объеме включено в настоящий документ в качестве ссылки). Другие форматы анализа включают иммунологические анализы с липосомами (LIA), в котором используют липосомы, сконструированные для связывания специфических молекул (например, антител) и высвобождения инкапсулированных реагент или маркеров. Затем высвобожденные химические вещества детектируют стандартными способами (см. Monroe et al. (1986), Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41). Ниже в кратком изложении описаны примеры иммунологических анализов, не предназначенные для ограничения.

Протоколы иммунопреципитации, как правило, включают лизис популяции клеток в буфере для лизиса, таком как буфер RIPA (1% NP-40 или Тритон Х-100, 1% раствор дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 0,15 М NaCl, 0,01 М фосфат натрия при pH 7,2, 1% трасилол) с добавлением ингибиторов фосфатаз и/или протеаз белков (например, ЭДТА, PMSF, апротинина, ванадата натрия), добавление к клеточному лизату представляющего интерес антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, инкубацию в течение определенного периода времени (например, от 1 до 4 ч) при 40°C, добавление к клеточному лизату сефарозных гранул с белком А и/или белком G, инкубацию приблизительно в течение часа или более при температуре 40°C, отмывку гранул в буфере для лизиса и ресуспендирование гранул в SD S/буфере для образцов. Способность представляющих интерес антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к иммунопреципитации конкретного антигена можно анализировать, например, посредством вестернблоттинга. Специалисту в данной области хорошо известны параметры, которые можно модифицировать для увеличения связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном и уменьшения фона (например, предварительная очистка клеточного лизата с сефарозными гранулами). Для дополнительного описания протоколов иммунопреципитации см., например, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1.

Анализ вестерн-блоттингом, как правило, включает в себя получение образцов белков, электрофорез образцов белков в полиакриламидном геле (например, 8-20% SDS-PAGE в зависимости от молекулярной массы антигена), перенос образцов белков из полиакриламидного геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза, PVDF или нейлон, блокировку мембраны в растворе для блокировки (например, PBS с 3% BSA или обезжиренным молоком), отмывку мембраны в отмывочном буфере (например, PBS-Твин 20), блокировку мембраны первичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (т.е. представляющими интерес антителом или его антигенсвязывающим фрагментом), разведенными в блокирующем буфере, отмывку мембраны в отмывочном буфере, блокировку мембраны вторичным антителом (распознающим первичное антитело, например, антителом к антителам человека), конъюгированным с ферментом (например, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой) или радиоактивной молекулой (например, ³²P или ¹²⁵I), разведенными в блокирующем буфере, отмывку мембраны в отмывочном буфере и детекцию присутствия антигена. Специалисту в данной области хорошо известны параметры, которые можно модифицировать для увеличения детектируемого сигнала и уменьшения фонового шума. Для дополнительного описания протоколов вестерн-блоттинга см., например, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1.

ELISA включает получение антигена, покрытие 96-луночного планшета для микротитрования антигеном, добавление представляющего интерес антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конъюгированного с детектируемым соединением, таким как фермент (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), в лунки и инкубацию в течение определенного периода времени с последующей детекцией присутствия антигена. В ELISA представляющее интерес антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не обязательно конъюгированы с детектируемым соединением, вместо этого в лунку можно добавлять второе антитело (которое распознает представляющее интерес антитело), конъюгированное с детектируемым соединением. Кроме того, вместо покрытия лунок антигеном, их можно покрывать антителами. В этом случае второе антитело, конъюгированное с детектируемым соединением, можно добавлять в покрытую первичным антителом лунку после внесения представляющего интерес антигена. Специалисту в данной области хорошо известны параметры, которые можно модифицировать для увеличения детектируемого сигнала, а также другие известные в данной области варианты ELISA. Для дополнительного описания протоколов ELISA см., например, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1. Примеры 5 и 8 иллюстрируют анализ связывание антител к PCB с белком F PCB.

Аффинность связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с антигеном и скорость диссоциации при взаимодействии антитела-антигена можно определять, например, посредством анализа конкурентного связывания. Одним из примеров анализа конкурентного связывания является радиоиммунологический анализ, включающий инкубацию меченого антигена (например, ³Н или ¹²⁵I) с представ- 78 027835

ляющими интерес антителами или антигенсвязывающими фрагментами в присутствии возрастающих количеств немеченого антигена и детекцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связанных с меченым антигеном. Аффинность антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, к антигену PCB и скорости диссоциации можно определять по полученным данным посредством анализа по графику Скэтчарда. Конкуренцию со вторым антителом также можно определять посредством радиоиммунологического анализа. В этом случае антиген PCB инкубируют с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, конъюгированными с меткой (например, ³Н или ¹²⁵I), в присутствии увеличивающихся количеств немеченого второго антитела. В некоторых примерах для определения связывания и скоростей диссоциации антител или их антигенсвязывающих фрагментов с антигеном PCB можно использовать кинетический анализ посредством поверхностного плазмонного резонанса (BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmgvist (2000), Biochem. Soc. Trans. 27:335). Кинетический анализ способом поверхностного плазмонного резонанса включает анализ связывания и диссоциации антигена PCB с чипов с иммобилизованными на их поверхности антителами или их фрагментами.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно анализировать на их способность ингибировать связывание PCB с его рецептором на клетке-хозяине способами, которые известны специалистам в данной области. Например, клетки, экспрессирующие рецептор PCB, можно приводить в контакт с PCB в присутствии или отсутствии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и способность антитела или его фрагмента ингибировать связывание PCB можно измерять, например, посредством проточной цитометрии или сцинтилляционного анализа. Для обеспечения детекции взаимодействия PCB и его рецептора на клетке-хозяине PCB (например, антиген PCB, такой как гликопротеин F или гликопротеин G) или антитело, или фрагмент антитела

32 35 125

можно метить детектируемым соединением, таким как радиоактивная метка (например, ³²Р, ³⁵S и ¹²⁵I) или флуоресцентная метка (например, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, o-фталевый альдегид и флуорескамин).

Способность антител или их антигенсвязывающих фрагментов ингибировать связывание PCB с его рецептором также можно определять в анализах в бесклеточных системах. Например, PCB или антиген PCB, такой как гликопротеин F, можно приводить в контакт с антителом или его фрагментом и можно определять способность антитела или фрагмента антитела ингибировать связывание PCB или антигена PCB с его рецептором клетки-хозяина. В некоторых примерах антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммобилизованы на твердой подложке, а PCB или антиген PCB помечены детектируемым соединением. В некоторых примерах PCB или антиген PCB иммобилизован на твердой подложке и антитело или его фрагмент помечен детектируемым соединением. PCB или антиген PCB можно частично или полностью очищать (например, частично или полностью очищать от других полипептидов) или они могут составлять часть клеточного лизата. В некоторых примерах антиген PCB может представлять собой слитый белок, содержащий антиген PCB и другой домен, такой как глутатионЫ-трансферазу. В некоторых примерах антиген PCB можно биотинилировать способами, хорошо известными специалистам в данной области (например, посредством набора для биотинилирования, Pierce Chemicals; Rockford, 111).

2. Специфичность связывания.

Специфичность связывания или эпитоп антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно определять любым способом, известным специалисту в данной области, включая, но не ограничиваясь поверхностным плазмонным резонансом, анализами конкурентного связывания и анализами нейтрализации вирусов с применением устойчивых к моноклональным антителам мутантов (MARM). Эпитоп может присутствовать в выделенном белке, т.е. на выделенном белке F, или в белке в вирусе. Способность двух антител связывать один и тот же эпитоп можно определять известными в данной области анализами, например, такими как поверхностный плазмонный резонанс и анализы конкуренции антител. Как правило, антитела, которые иммуноспецифически связывают один и тот же эпитоп, могут конкурировать за связывание с эпитопом, которое можно измерять, например, в анализе конкуренции связывания in vitro (например, в конкурентном ELISA) известными в данной области способами. Как правило, первое антитело, которое иммуноспецифически связывает тот же эпитоп, что и второе антитело, может конкурировать за связывание с эпитопом приблизительно на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%, где процент конкуренции измеряется способностью второго антитела замещать первое связанное антитело в эпитопе. В примере анализа конкуренции антиген инкубируют в присутствии предварительно лимитирующих разведений меченого антитела (например, при 50-70% от насыщенной концентрации) и серийных разведений немеченого конкурирующего антитела. Конкуренцию определяют посредством измерения связывания меченого антитела с антигеном по любому уменьшению связывания в присутствии конкурирующего антитела. Варианты таких анализов, включая различные способы мечения и способы детекции, включая, например, радиометрическую, люминесцентную, ферментативную и колориметрическую детекцию, известны в данной области. Например, как описано в примере 10 ниже, антитело 30D8 и мотавизумаб не конкурируют за связывание с белком F PCB, что свидетельствует о том, что антитело 30D8 и мотавизумаб связывают различные эпи- 79 027835

топы.

Способность первого антитела связывать тот же эпитоп, что и второе антитело, также можно определять, например, посредством анализов нейтрализации вируса с применением устойчивых к моноклональным антителам мутантов. MARM представляют собой мутанты респираторно-синцитиального вируса (PCB), которые не нейтрализуются моноклональным антителом, которое нейтрализует вирус PCB дикого типа, т.е. MARM представляют собой ускользающие мутанты PCB. MARM получают посредством культивирования PCB дикого типа в присутствии моноклональных антител в течение последовательных циклов репликации вируса в присутствии антитела так, что после каждого последующего цикла репликации вируса в присутствии возрастающих концентраций антител наблюдается цитопатический эффект (CPE), в результате чего получается мутант вируса, который не нейтрализуется антителом. Если первое антитело может нейтрализовать MARM против второго антитела, можно заключить, что антитела специфически связываются и взаимодействуют с различными эпитопами. Например, если первое антитело к PCB нейтрализует PCB дикого типа, но не конкретный мутант PCB (например, MARM), второе антитело, которое нейтрализует PCB дикого типа, но не конкретный мутант PCB, как правило, связывает тот же эпитоп на PCB, что и первое антитело. Если первое антитело к PCB нейтрализует PCB дикого типа, но не конкретный мутант PCB, а второе антитело нейтрализует PCB дикого типа и конкретный мутант PCB, то второе антитело, как правило, не связывает тот эпитоп PCB, который связывает первое антитело.

Например, как проиллюстрировано в примере 9 ниже, предоставляемое по настоящему документу 58с5 способно нейтрализовать MARM, полученный ранее для различных антител к PCB, включая MARM 1129, полученный для MAb 1129, исходного антитела для паливизумаба и мотавизумаба (см., Johnson et al. (1997), J. Infect. Diseases 176:1215-1224 и патент США № 5824307), MARM 19, полученный для Fab19 (см. Barbas et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10164-10168) и MARM 151, полученный для MAb 151 (см. Mufson et al. (1985), J. Gen. Virol, 66:2111-2124). Таким образом, 58с5 на белке F связывает эпитопы, отличные от эпитопов антител Fab 19, MAb 151 и MAb 1129.

Как проиллюстрировано в примере 11 ниже, получали MARM, устойчивые к мотавизумабу и форме IgG 58c5. MARM мотавизумаба, полученный после 5-7 циклов отбора, содержит одну аминокислотную мутацию (К272Е, SEQ ID NO: 486) по сравнению с белком F PCB дикого типа. Аминокислотная мутация K272 согласуется с известной мутацией, которая нарушает связывание исходного антитела мотавизумаба (см., Zhao et al. (2004), J. Infectious Disease 190:1941-1946). MARM 58c5, полученный после 10 циклов отбора, содержит 3 аминокислотные мутации (N63K, М115K и E295G, SEQ ID NO: 487) по сравнению с белком F PCB дикого типа. Мутации, опосредующие ускользание MARM от 58с5, ранее не были идентифицированы как антигенные участки различных моноклональных антител, которые иммуноспецифически связывают белок F PCB (см., например, Beeler et al. (1989), J. Virology 63 (7):2841-2950, Crowe et al. (1998), Virology 252:373-375; Zhao et al. (2004), J. Infectious Disease 190:1941-1946; Liu et al. (2007), Virology Journal 4:71). После 12 циклов репликации вируса в присутствии формы IgG 30D8, вирус PCB был неспособен ускользать от нейтрализации (см. пример 11 ниже). Способность антитела 30D8 ограничивать образование MARM означает, что 30D8 связывается с эпитопом, которые менее чувствителен к образованию ускользающих мутантов и в результате антитело 30D8 пригодно в качестве терапевтического антитела для лечения инфекции PCB.

Кроме того, как представлено в примере 11 ниже, 30D8 нейтрализует MARM мотавизумаба и MARM 58с5, 58с5 нейтрализует MARM мотавизумаб, и мотавизумаб нейтрализует MARM 58c5. Таким образом, 30D8 связывает эпитоп белка F PCB, отличный от эпитопа 58с5 и мотавизумаба. Кроме того, 58с5 связывает эпитоп белка F PCB, отличный от эпитопа 30D8 и мотавизумаба.

3. Анализы нейтрализации вирусов антителами in vitro.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно анализировать любым подходящим способом детекции нейтрализации вируса, известным в данной области. Способы детекции нейтрализации вирусов включают, но не ограничиваются анализами бляшкообразования и анализами ингибирования образования синцития. Такие анализы можно использовать для оценки, например, подавления прикрепления вируса, проникновения вируса в клетку и распространения вируса от клетки к клетке (см., например, Burioni et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:355-359; Sanna et al. (2000), Virology 270:386-3961; и De Logu et al. (1998), J. Clin. Microbiol. 36:3198-3204). Специалист в данной области может выбирать любой анализ, способный измерять нейтрализацию вируса.

Стандартные анализы бляшкообразования включают, например, анализ подавления бляшкообразования, анализ уменьшение размера бляшек, анализы нейтрализации и кинетические анализы нейтрализации. В указанных анализах определяют формирование вирусных бляшек (т.е. областей лизированных клеток) после заражения монослоя клеток-мишеней вирусом. Примеры линий клеток-мишеней, которые можно использовать в анализах подавления бляшкообразования, включают, но не ограничиваются клетками Vero, клетками MRC-5, клетками RC-37, клетками ВНК-21/С13 и клетками НЕр-2. Специалист в данной области может выбирать подходящие линии клеток-мишеней для применения в анализах бляшкообразования. Выбор подходящей линии клеток для анализа бляшкообразования может зависеть от известных факторов, например, таких как инфекционность вируса и способность вируса размножаться в

- 80 027835

клетках-мишенях и лизировать их. Примеры 6 и 9 иллюстрируют анализы нейтрализации in vitro.

Анализы подавления бляшкообразования можно использовать для определения способности антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента нейтрализовать вирус в растворе. В примере анализа подавления бляшкообразования антитело или антигенсвязывающий фрагмент и вирус перед добавлениям к клеткам-мишеням предварительно инкубируют. Затем клетки-мишени инфицируют смесью антитело/вирус и после предопределенного периода инфекции проводят анализ бляшкообразования. Специалист в данной области может определить необходимое время инкубации на основе известных примеров в данной области. Уменьшение количества вирусных бляшек, образующихся после инфицирования клеток-мишеней, свидетельствует о способности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента предотвращать связывание вируса с клетками-мишенями независимо от связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с клетками-мишенями и/или интернализации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Анализы уменьшения размеров бляшек можно использовать для измерения способности антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента ингибировать распространение вируса от клетки к клетке. В примере анализа уменьшения размеров бляшек клетки-мишени сначала инфицируют вирусом в течение предопределенного периода инфекции, а затем к инфицированным клеткам добавляют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Специалист в данной области может определить необходимое время инкубации на основе известных примеров в данной области. Уменьшение размеров (например, диаметра) бляшек вируса указывает на то, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны предотвращать распространение вируса от клетки к клетке.

Анализы нейтрализации вируса можно использовать для измерения способности антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента нейтрализовать вирус на поверхности клетки-мишени посредством связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с клеткой-мишенью до воздействия вируса. В примере анализа нейтрализации вирусов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и клетки-мишени предварительно инкубировали в течение предопределенного периода времени для обеспечения связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с клеткой-мишенью. После предварительной инкубации несвязанное антитело удаляют, а клетки-мишени инфицируют вирусом. Уменьшение количества бляшек в этом анализе указывает на способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента предотвращать вирусную инфекцию в зависимости от прикрепления к клетке-мишени и/или интернализации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Этот анализ также можно использовать для измерения кинетики нейтрализации посредством варьирования концентраций антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и времени предварительной инкубации.

Примеры анализов ингибирования формирования синцития можно использовать для измерения опосредованного антителами ингибирования цитопатического действия вируса посредством блокирования формирования синцития при использовании фузогенного штамма вируса. Специалист в данной области можно определить подходящие фузогенные штаммы вируса для применения в анализе.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно анализировать на их способность ингибировать или подавлять репликацию PCB хорошо известными специалистам в данной области способами. Например, репликацию PCB можно анализировать посредством анализа бляшкообразования, как описано, например, в Johnson et al. (1997), Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно анализировать на их способность ингибировать или подавлять экспрессию полипептидов PCB. Для измерения экспрессии полипептидов PCB можно использовать известные специалистам в данной области способы, включая, но не ограничиваясь вестернблоттингом, нозерн-блоттингом и ОТ-ПЦР.

4. Модели на животных для анализа эффективности антител к PCB in vivo.

Для оценки эффективности антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно проводить исследования in vivo с применением моделей на животных. Исследования in vivo с применением моделей на животных можно также проводить для оценки токсичности при введении таких антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Для оценки способности антител к PCB подавлять или лечить вирусную инфекцию PCB и анализа любого вида токсичности, специалистам в данной области известен ряд анализов, таких как применение моделей на животных in vivo. Терапевтический эффект антител к PCB можно анализировать с применением моделей патогенных инфекций на животных, включая модели вирусной инфекции на животных. Такие модели на животных известны в данной области и включают, но не ограничиваются моделями инфекции PCB на животных, например, таких как хлопковый хомяк, инбредные мыши, телята, хорьки, хомяки, морские свинки, шимпанзе, трехполосные дурукули, макак-резус, африканская зеленая мартышка, обезьяна цебус, беличья обезьяна, индийский макак, павиан, (см., например, Prince et al. (1978), Am. J. Pathol. 93:771-791; Prince et al. (1979), Infect. Immunol. 26:764-766; Byrd и Prince (1997), Clinical Infectious Diseases 25:13631368, включая приведенные в указанных статьях ссылки на примеры моделей инфекции PCB). Для тестирования антитела или антигенсвязывающего фрагмента или токсичности композиции in vivo можно использовать любую известную в данной области модель на животном, включая, но не ограничиваясь

- 81 027835

моделями на крысах, мышах, коровах, обезьянах и кроликах.

5. Анализы in vitro и in vivo для определения эффективности антител.

Эффективность лечения или профилактики вирусной инфекции можно демонстрировать посредством детекции способности антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, ингибировать репликацию вируса, ингибировать перенос или предотвращать адаптацию вируса у его хозяина, снижать уровень заболеваемости PCB или предотвращать, улучшать состояние или облегчать один или более симптомов, ассоциированных с инфекцией PCB. Лечение считают терапевтическим, например, если возникает снижение вирусной нагрузки, улучшение одного или более симптомов, уменьшение продолжительности инфекции PCB или снижение смертности и/или заболеваемости после введения антитела или композиций, предоставляемых по настоящему документу. Кроме того, лечение считают терапевтическим, если после введения одного или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связывают один или более антигенов PCB, наблюдают возрастание иммунного ответа.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно тестировать на способность индуцировать экспрессию цитокинов, таких как IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 и IL-15 in vitro и in vivo. Для измерения уровня экспрессии цитокинов можно использовать известные специалистам в данной области способы. Например, уровень экспрессии цитокинов можно измерять посредством анализа уровня РНК цитокинов, например, посредством ОТ-ПЦР и нозерн-блоттинга или посредством анализа уровня цитокинов, например, посредством иммунопреципитации с последующим анализом вестерн-блоттингом или ELISA.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно тестировать in vitro и in vivo на их способность модулировать биологическую активность иммунных клеток, включая иммунные клетки человека (например, T-клетки, B-клетки и клетки натуральных киллеров).

Способность антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов модулировать биологическую активность иммунных клеток можно оценивать посредством детекции экспрессии антигенов, детекции пролиферации клеток иммунной системы, детекции активации сигнальных молекул, детекции эффекторных функций иммунных клеток или детекции дифференцировки иммунных клеток. Для измерения этих видов активности можно использовать известные специалистам в данной области способы. Например, клеточную пролиферацию можно анализировать посредством анализов включения ³Н-тимидина и подсчета клеток с окрашиванием трипановым синим. Экспрессию антигена можно анализировать, например, посредством иммунологических анализов, включая, но не ограничиваясь системами конкурентного и неконкурентного анализа с применением таких способов, как вестерн-блоттинг, иммуногистохимический, радиоиммунологический анализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунологический анализ типа "сэндвич", анализы иммунопреципитации, реакции преципитации, реакции преципитации с диффузией в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализ фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммунологические анализы с белком А и анализ FACS. Активацию сигнальных молекул можно анализировать, например, посредством анализов на киназную активность и анализов электрофоретического сдвига (EMSA).

Также антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно тестировать на их способность ингибировать репликацию вируса или снижать вирусную нагрузку в анализах in vitro, ex vivo или in vivo. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты также можно анализировать на их способность уменьшать период инфекции PCB. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты также можно анализировать на их способность увеличивать период выживаемости людей, страдающих инфекцией PCB по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 95% или по меньшей мере или приблизительно на 99%. Кроме того, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно анализировать на их способность уменьшать период госпитализации людей, страдающих инфекцией PCB на по меньшей мере или приблизительно 60%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 95% или по меньшей мере или приблизительно на 99%. Для анализа функций антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно использовать известные специалистам в данной области способы in vivo.

Для демонстрации профилактической и/или терапевтической эффективность антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, в соответствии со способами и применениями по настоящему документу нет необходимости проведения клинических испытаний с участием людей. Исследования in vitro и. модели на животных с применением антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, можно экстраполировать на людей и их достаточно для демонстрации профилактической и/или терапевтической ценности антител

- 82 027835

к PCB или антигенсвязывающих фрагментов.

Н. Применение в диагностике

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать в диагностических анализах для детекции, очистки и/или нейтрализации PCB. Примеры диагностических анализов включают детекцию PCB in vitro и in vivo. Например, предоставлены анализы с использованием антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, для качественного и количественного анализа уровней PCB в выделенном биологическом образце (например, мокроте) или in vivo.

Как описано в настоящем документе, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно конъюгировать с детектируемой молекулой для детекции in vitro или in vivo.

Такие антитела можно использовать, например, для оценки локализации и/или персистенции антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента in vivo, например, в слизистой оболочке. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, связанные с детектируемой молекулой, можно детектировать in vivo любым подходящим способом, известным в данной области. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, связанные с детектируемой молекулой, также можно детектировать в выделенных биологических образцах, таких как образцы тканей или жидкостей, полученные у индивидуума после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

1. Детекция патогенной инфекции in vitro.

В основном, PCB можно детектировать у индивидуума или пациента по присутствию одного или более белков PCB и/или полинуклеотидов, кодирующих такие белки, в биологическом образце (например, в крови, сыворотке, моче, мокроты и/или других подходящих клетках или тканях), полученном у индивидуума или пациента. Такие белки можно использовать в качестве маркеров, указывающих на наличие или отсутствие PCB у индивидуума или пациента. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать для детекция уровня антигена и/или эпитопа, который связывается со средством в биологическом образце.

Специалистам в данной области известно множество различных форматов анализа для применения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов для детекции полипептидных маркеров в образце (см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). В основном, наличие или отсутствие PCB у индивидуума или пациента можно определять посредством приведения полученного у индивидуума или пациента биологического образца в контакт с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, и измерение уровня полипептида, который связывается с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых примерах анализ включает применение антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, иммобилизованных на твердой подложке, со связыванием и выделением полипептидов-мишеней из остальной части образца. Связанные полипептиды можно детектировать посредством детектирующего реагента, содержащего репортерную группу и специфически связывающегося с комплексом антитело/полипептид. Такие детектирующие реагенты могут содержать, например, связывающее средство, которое специфически связывается с полипептидом, или антитело или другое средство, которое специфически связывается со связывающим средством.

В некоторых примерах можно использовать конкурентный анализ, в котором полипептид метят репортерной группой и обеспечивают его связывание с иммобилизованным антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом после инкубации антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента с образцом. Степень ингибирования компонентами образца связывания меченого полипептида с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом является показателем способности образца реагировать с иммобилизованными антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами. Подходящие для применения в таких анализах полипептиды включают полноразмерный белок F PCB и его части, включая внеклеточный домен белка F PCB, с которым связываются антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано выше.

Твердая подложка может представлять собой любой материал, известный специалистам в данной области, к которому можно присоединять белок. Например, твердая подложка может представлять собой поверхность лунки планшета для микротитрования или нитроцеллюлозу или другие подходящие мембраны. Подложка также может представлять собой гранулу или диск из такого материала как стекло, стекловолокно, латекс или пластик, такой как полистирол или поливинилхлорид. Подложка также может представлять собой магнитные частицы или волоконно-оптический датчик, как описано, например, в патенте США № 5359681. Антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент можно иммобилизовать на твердом носителе различными способами, известными специалистам в данной области. Антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент также можно иммобилизовать посредством адсорбции к лунке в планшете или к мембране. В таких случаях адсорбции можно достигать посредством контакта антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента с твердой подложкой в подходящем буфере в течение подходящего времени. Время контакта зависит от температуры, но, как правило, составляет от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 суток. Как правило, для иммобилизации необходимого количе- 83 027835

ства антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PCB достаточно контакта с лункой пластикового планшета для микротитрования антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента в диапазоне от приблизительно 10 нг до приблизительно 10 мкг, как правило, от приблизительно 100 нг до приблизительно 1 мкг.

Как правило, ковалентное присоединение антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов к твердой подложке можно проводить посредством первой реакции подложки с бифункциональным реагентом, который реагирует с подложкой и функциональной группой, такой как гидроксильная группа или аминогруппа, на антителе к PCB или его антигенсвязывающем фрагменте. Например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент к PCB можно ковалентно связывать с подложкой с подходящим полимерным покрытием с использованием бензохинона или посредством конденсации альдегидной группы на подложке с аминогруппой или активным водородом на партнере по связыванию (см., например, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13).

В некоторых примерах анализ проводят в проточном варианте или в формате тест-полосок, где антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты иммобилизованы на мембране, такой как нитроцеллюлозная мембрана. В проточном варианте анализа полипептиды в образце связываются иммобилизованными антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами при прохождении образца через мембрану. Затем с комплексом антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента с полипептидом при прохождении через мембрану раствора, содержащего второе средство, связывается второе меченое связывающее средство.

В данной области описаны дополнительные протоколы анализа, которые пригодны для использования с белками PCB или предоставляемыми антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами. Приведенное выше описание предназначено только для иллюстративных целей. Например, специалисту в данной области очевидно, что приведенные выше протоколы можно легко модифицировать для использования полипептидов PCB для детекции антител, связывающихся с такими полипептидами в биологическом образце. Детекция таких специфичных к белку антител может позволять выявлять инфекцию PCB.

Для повышения чувствительности в получаемом образце можно анализировать несколько белковмаркеров PCB. Очевидно, что в одном анализе можно применять антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, специфичные к различным полипептидам PCB. Кроме того одновременно можно использовать несколько праймеров или зондов. Выбор белков-маркеров PCB может быть основан на стандартных экспериментах для определения комбинаций, приводящих к оптимальной чувствительности. Кроме того или альтернативно, анализы на белки PCB, предоставляемые по настоящему документу, можно объединять с анализами на другие известные антигены PCB.

2. Детекция патогенной инфекции in vivo.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно применять в качестве диагностического средства in vivo. Например, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты могут обеспечивать визуализацию инфицированных тканей (например, инфекции PCB в легких) с применением способов детекции, например, таких как магнитно-резонансная томография, рентгенография, компьютерная эмиссионная томографии и другие технологии визуализации. Например, для визуализации инфицированных PCB тканей, часть антитела к PC, как правило, связывается с PCB (например, связывается с эпитопом белка F PCB) и визуализирующее средство представляет собой средство, детектируемое при визуализации, такое как парамагнитное, радиоактивное или флуоресцентное средство, связанное с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом. Как правило, для применения в качестве диагностического средства антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты связывают с визуализирующим средством прямо или опосредованно.

В данной области известно множество подходящих визуализирующих средств, а также способов их присоединения к антителам или антигенсвязывающим фрагментам к PCB известны (см., например, патенты США № 5021236 и 4472509). Примеры способов присоединения включают использование металлхелатных комплексов, например, с применением органических хелатирующих средств, таких как DTPA, связанных с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (патент США № 4472509). Антитела также могут реагировать с ферментом в присутствии связывающего средства, такого как глутаральдегид или периодат. Конъюгаты с флуоресцентными маркерами получают в присутствии таких сшивающих средств или посредством реакции с изотиоцианатом.

Для диагностической визуализации in vivo при выборе конкретного изотопа учитывают тип доступного устройства для визуализации. Выбранный радиоактивный изотоп должен иметь тип распада, детектируемый устройством данного типа. Другим фактором при выборе радиоизотопа для диагностики in vivo является период полураспада радиоактивного изотопа, который должен быть достаточно длительным для возможности его детекции в момент максимального поглощения мишенью, но достаточно коротким для минимизации вредной для пациента радиации. Как правило, используемые для визуализации in vivo радиоизотопы не испускают частиц, но продуцируют большое количество фотонов с энергией в диапазоне 140-250 кэВ, которые можно легко детектировать общепринятыми гамма-камерами.

Для диагностики in vivo радиоактивные изотопы можно связывать с антителами или их антигенсвя- 84 027835

зывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, прямо или опосредованно посредством промежуточных функциональных групп. Примеры промежуточных функциональных групп, которые можно использовать для связывания радиоизотопов, существующих в виде ионов металлов, с антителами, включают бифункциональные хелатирующие средства, такие как диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и подобные молекулы. Примеры ионов металлов, которые можно связать с предоставляемыми антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, включают, но не ограничиваются ⁷²мышьяком, ²¹астатом, ¹⁴углеродом, ⁵¹хромом,

³⁶хлором, ⁵⁷кобальтом, ⁵⁸кобальтом, ⁶⁷медью, ¹⁵²европием, ⁵⁷галлием, ⁶⁸галлием, ³водородом, ¹²³йодом,

1 qc 101 111 oQ Q'? i oz" i oo 0*7 1 c

¹²⁵йодом, ¹³¹йодом, ¹¹¹индием, ⁵⁹железом, ³²фосфором, ¹⁸⁶рением, ¹⁸⁸рением, ⁹⁷рутением, ⁷⁵селеном,

35 99 201 90 89

серой, технецием, талием, иттрием и цирконием.

Для диагностики in vivo, например, способом магнитно-резонансной томографии (МРТ) или электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно метить парамагнитными изотопами. В основном можно использовать любой общепринятый способ диагностической визуализации. Как правило, для визуализации на камеру используют излучающие гамма-кванты и позитроны радиоактивные изотопы, а для МРТ используют парамагнитные изотопы. Элементы, которые особенно пригодны для таких способов, включают, но не ограничиваются ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe.

Примеры парамагнитных ионов включают, но не ограничиваются хромом (III), марганцем (II), железом (III), железом (II), кобальтом (II), никелем (II), медью (II), неодимом (III), самарием (III), иттербием (III), гадолинием (III), ванадием (II), тербием (III), диспрозием (III), гольмием (III) и эрбием (III). Ионы, пригодные, например, для рентгеновской визуализации, включают, но не ограничиваются лантаном (III), золотом (III), свинцом (II) и висмутом (III).

Концентрация вводимых меченных детектируемой меткой антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов должна быть достаточной для детекции связывания с PCB по сравнению с фоном. Кроме того, для получения наилучшего соотношения сигнала мишень-фон желательно быстрое выведение меченных детектируемой меткой антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов из кровеносной системы.

Доза детектируемо меченных антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов для диагностики in vivo варьирует в зависимости от таких факторов как возраст, пол и тяжесть заболевания индивидуума. Доза моноклональных антител человека может варьировать, например, от приблизительно 0,01 мг/м² до приблизительно 500 мг/м², от приблизительно 0,1 мг/м² до приблизительно 200 мг/м², от приблизительно 0,1 мг/м² до приблизительно 10 мг/м². Такие дозы могут варьировать, например, в зависимости от количества инъекций, ткани и других факторов, которые известных специалистам в данной области.

3. Мониторинг инфекции.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно использовать in vitro и in vivo для мониторинга курса лечения заболевания. Таким образом, например, можно измерять увеличение или уменьшение количества клеток, инфицированных PCB, или изменения концентрации вирусных частиц PCB в организме или в различных жидкостях организма. С применением таких способов антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для определения того, является ли конкретная схема лечения, направленная на лечение состояния заболевания, эффективной.

I. Применение для профилактики и лечения

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, и фармацевтические композиции, содержащие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить индивидууму для профилактики и лечения. Например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить для лечения заболевания или состояния, такого как инфекция PCB. В некоторых примерах антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить индивидууму в профилактических целях, таких как предотвращение возникновения и/или распространения инфекции PCB, включая, но не ограничиваясь ингибированием развития инфекции PCB у индивидуума или ингибированием передачи PCB между индивидуумами. В некоторых примерах антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить индивидууму для снижения вирусной нагрузки PCB у данного индивидуума. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты также можно вводить индивидууму для профилактики, лечения и/или облегчения одного или более симптомов инфекции PCB или уменьшения продолжительности инфекции PCB.

В некоторых примерах введение антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, снижают заболеваемость PCB относительно заболеваемости PCB в отсутствие антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов на по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере при- 85 027835

близительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 15% или по меньшей мере приблизительно на 10%. В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, снижают тяжесть одного или более симптомов инфекции PCB по сравнению с тяжестью одного или более симптомов инфекции PCB в отсутствие антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов на по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 15% или по меньшей мере приблизительно на 10%.

1. Индивидуумы, подлежащие лечению.

Индивидуумы или кандидаты для терапии антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, включают, но не ограничиваются индивидуумом, таким как пациент-человек, подвергавшийся воздействию вируса PCB, индивидуумом, таким как пациент-человек, который проявляет один или более симптомов инфекции PCB, и индивидуумом, таким как пациент-человек, у которого существует риск инфекции PCB. Примеры вирусных инфекций PCB включают вызываемые вирусом PCB инфекции, включающие, но не ограничивающиеся острым заболеванием PCB, вызванной PCB инфекцией верхних дыхательных путей (URI) и/или вызванной PCB инфекцией нижних дыхательных путей (LRI), включая, например, бронхиолит и пневмонию.

В некоторых примерах индивидуум для терапии предоставляемыми по настоящему документу антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами представляет собой млекопитающее. В некоторых примерах индивидуум для терапии предоставляемыми по настоящему документу антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами представляет собой примата. В конкретных примерах индивидуум для терапии антителами или антигенсвязывающими фрагментами к PCB, предоставляемыми по настоящему документу, представляет собой человека.

Предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить индивидууму, такому как пациент, для лечения любого опосредованного PCB заболевания. Например, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить индивидууму для облегчения одного или более симптомов или состояний, ассоциированных с инфекцией вирусом PCB, включая, но не ограничиваясь астмой, затрудненным дыханием, реактивным заболеванием дыхательных путей (RAD) и хроническим обструктивным заболеванием легких (ХНЗЛ). Такие заболевания и состояния хорошо известны в данной области и легко диагностируются врачами или специалистами.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить индивидууму, такому как пациент с инфекцией вирусом PCB, в качестве поддерживающей терапии или для подавления рецидива опосредованного вирусом PCB заболевания.

Предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить индивидууму, такому как пациент-человек с риском инфекции вирусом PCB, включая, но не ограничиваясь недоношенным (досрочно родившимся) младенцем (например, младенцем, родившимся с гестационным возрастом менее 38 недель, например, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37 недель), младенцем (например, младенцем, родившимся с гестационным возрастом более 37 недель), индивидуумом с кистозным фиброзом, бронхолегочной дисплазией, врожденным пороком сердца, врожденным иммунодефицитом или приобретенным иммунодефицитом (например, больного СПИДом), лейкозом, неходжкинской лимфомой, пациентом с иммуносупрессией, например, реципиенту трансплантата (например, трансплантата костного мозга или трансплантата почки), или пожилыми индивидуумами, включая индивидуумов в домах престарелых или реабилитационных центрах. В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить таким индивидуумам как недоношенный младенец или младенец, подверженный воздействию одного или более факторов риска окружающей среды, в качестве неограничивающих примеров, таких как получение ежедневной помощи, наличие братьев и сестер школьного возраста, воздействие загрязнителей воздуха в окружающей среде, наличие врожденных аномалий дыхательных путей и/или тяжелых нервно-мышечных заболеваний. В некоторых примерах предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить таким индивидуумам как младенец или ребенок младше двух лет с хроническими заболеваниями легких или врожденным пороком сердца, включая застойную сердечную недостаточность, легочную гипертензию и врожденный порок сердца с первичным цианозом.

Для оценки того, является ли индивидуум кандидатом для терапии антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, в данной области из- 86 027835

вестны тесты на различные патогены и патогенные инфекции. Например, известны тесты на инфекцию вирусом PCB, и они включают, например, анализы бляшкообразования в вирусной культуре, анализ детекции антигена, анализы полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а также различные серологические тесты на антитела. Тесты на вирусную инфекцию можно проводить на образцах, полученных из образцов тканей или жидкостей, таких как спинномозговая жидкость, кровь или моча. Дополнительные тесты включают, но не ограничиваются рентгеном грудной клетки, который может выявить признаки пневмонии, другими анализами крови, такими как химический скрининг, общим анализом крови или анализом газов артериальной крови (ABG), оксиметрией для измерения количества кислорода в крови.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить индивидууму, с повышенным риском инфекции PCB в определенные периоды года. Сезон PCB, как правило, длится с октября по май. Индивидуумам с повышенной восприимчивостью к вирусной инфекции, таким как младенцы, пожилые или пациенты с иммунной недостаточностью, непосредственно перед сезоном и/или во время сезона PCB можно вводить антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, для профилактики и/или лечения инфекции PCB. В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят один, два, три, четыре или пять раз в течение сезона PCB. В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят один, два, три, четыре или пять раз в течение одного месяца, двух месяцев или трех месяцев перед сезоном PCB.

2. Дозировки.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят в количестве, достаточном для оказания терапевтически полезного эффекта при отсутствии нежелательных побочных эффектов у подвергаемого лечению пациента. Терапевтически эффективную концентрацию антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов можно определять эмпирически посредством тестирования полипептидов в известных системах in vitro и in vivo, например, посредством анализов, предоставляемых по настоящему документу или известных в данной области.

Эффективное для терапевтического введения количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента зависит, например, от терапевтической задачи, пути введения и состояния пациента. Кроме того, лечащий врач принимает во внимание различные факторы, модифицирующие действие лекарственных средств, включающие тяжесть и тип заболевания, состояние здоровья пациента, массу тела, пол, диету, время и путь введения, применение других лекарственных средств и другие значимые клинические факторы. Таким образом, для получения оптимального терапевтического эффекта терапевту необходимо титровать дозу антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и модифицировать пути введения, как необходимо для получения оптимального терапевтического эффекта. Как правило, клинический врач вводит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, до достижения дозы, позволяющей достигать желаемого эффекта. Прогресс такого лечения легко контролировать посредством общепринятых анализов. Примеры анализов для мониторинга лечения вирусных инфекций известны в данной области и включают, например, анализы титра вируса.

Как правило, диапазоны доз для введения предоставляемых по настоящему документу антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов являются достаточно большими для получения желаемого эффекта, при котором облегчается симптом(ы) опосредованного возбудителем заболевания (например, вирусного заболевания) или снижается вероятность вирусной инфекции. В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят в количестве, эффективном для индукции у индивидуума иммунного ответа. Доза не должна быть настолько большой, чтобы вызывать побочные эффекты, такие как синдром повышенной вязкости, отек легких или застойная сердечная недостаточность. Как правило, доза варьируется в зависимости от возраста, состояния, пола и тяжести заболевания у пациента, и ее может определять специалист в данной области. В случае появления каких-либо неблагоприятных побочных эффектов лечащий врач может регулировать дозу. Примеры доз для предотвращения или лечения инфекции PCB и/или улучшения одного или более симптомов инфекции PCB в качестве неограничивающих примеров включают от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 300 мг/кг, например, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 100 мг/кг, приблизительно 150 мг/кг, приблизительно 200 мг/кг, приблизительно 250 мг/кг, приблизительно 300 мг/кг.

В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят индивидууму в дозах, эффективных для достижения желаемого титра в сыворотке. В конкретных примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят для предотвращения или лечения инфекции PCB и/или улучшения одного или более симптомов инфекции PCB в количестве, достаточном для достижения титра в сыворотке по меньшей мере приблизительно 1 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 2 мкг/мл, по

- 87 027835

меньшей мере приблизительно 3 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 4 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 6 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 7 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 8 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 9 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 15 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 20 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 30 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 40 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 60 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 70 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 80 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 90 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 сутки после введения первой дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и до введения последующей дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят индивидууму посредством легочной доставки в дозах, эффективных для достижения желаемого титра в образце, полученном при интубации, мокроте или легочном лаваже. В конкретных примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят для предотвращения или лечения инфекции PCB и/или улучшения состояния одного или более симптомов инфекции PCB в количестве, достаточном для достижения титра 10 нг/мг (нг белка антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента на мг ткани легких) или приблизительно 10, 15 нг/мг, или приблизительно 15, 20 нг/мг, или приблизительно 20, 25 нг/мг, или приблизительно 25, 30 мг/мг, или приблизительно 30, 40 нг/мг, или приблизительно 40, 50 нг/мг, или приблизительно 50, 60 нг/мг, или приблизительно 60, 70 нг/мг, или приблизительно 70, 80 нг/мг, или приблизительно 80, 90 нг/мг, или приблизительно 90, 100 нг/мг, или приблизительно 100, 110 нг/мг, или

приблизительно 110, 120 нг/мг, или приблизительно 120, 130 нг/мг, или приблизительно 130, 140 нг/мг, или приблизительно 140, 150 нг/мг, или приблизительно 150 нг/мг в образце, получаемом при интубации или образце легочного лаважа на 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 сутки после введения первой дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и до введения последующей дозы антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

Для лечения вирусной инфекции доза антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента может варьировать в зависимости от типа и тяжести заболевания. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить однократной дозой, несколькими отдельными введениями или посредством непрерывной инфузии. При повторных введениях в течение несколько суток или более в зависимости от состояния лечение можно повторять до желаемого подавления симптомов заболевания или достижения желаемого улучшения состояния пациента. Повторные введения могут включать увеличенное или уменьшенное количества антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов в зависимости от хода лечения. Также предусмотрены другие режимы дозирования.

В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводятся один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять раз и более в течение суток или в течение нескольких суток. В конкретных примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, для предотвращения и лечения инфекции PCB и/или улучшения одного или более симптомов инфекции PCB вводят один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять раз и более в количестве, достаточном для достижения титра в сыворотке по меньшей мере или приблизительно 1 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 2 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 3 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 4 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 5 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 6 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 7 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 8 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 9 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 10 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 15 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 20 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 25 мкг/мл, в как минимум, приблизительно 30 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 40 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 50 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 60 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 70 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 80 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 90 мкг/мл, по меньшей мере или приблизительно 100 мкг/мл на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 сутки после введения первой, второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятой дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и до введения последующих доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном примере антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, для предотвращения или лечения инфекции PCB и/или улучшение одного или более симптомов инфекции PCB вводят четыре раза в количестве, эффективном для достижения титра в сыворотке по меньшей мере приблизительно 72 мкг/мл на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 сутки после введения четвертой дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и до введения последующей дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В конкретном примере антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые

- 88 027835

по настоящему документу, вводят четыре раза для предотвращения или лечения инфекции PCB и/или улучшения состояния одного или более симптомов инфекции PCB в количестве, эффективном для достижения титра в сыворотке по меньшей мере или приблизительно 72 мкг/мл на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 сутки после введение четвертой дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и до введения последующей дозы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты вводят в последовательности из двух или более введений, где введения разделены выбранным периодом времени. В некоторых примерах выбранный период времени составляет по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 суток, 1, 2, 3 недели, 1, 2 или 3 месяца.

В некоторых примерах профилактически эффективное количество антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, вводят один или более раз непосредственно перед сезоном PCB. В некоторых примерах профилактически эффективное количество антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставляемых по настоящему документу, вводят один или более раз непосредственно перед сезоном PCB и/или один или более раз в течение сезона PCB.

Также можно оценивать терапевтическую эффективность конкретной дозы или режима дозирования, например, посредством измерения вирусного титра у индивидуума до и после введения одной или более доз антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента. Величины доз и/или частоты введения можно модифицировать в зависимости от желаемой скорости выведения вируса у индивидуума.

Как понятно специалисту в данной области, оптимальная схема лечения может варьировать и в рамках способов лечения находится оценка статуса заболевания после лечения и общего состояния здоровья пациента до и после одного или более циклов лечения для определения оптимальной терапевтической дозы и частоты введения. Также следует дополнительно понимать, что для любого конкретного индивидуума, конкретные режимы дозирования с течением времени можно корректировать в зависимости от индивидуальных потребностей и профессионального решения врача, осуществляющего контроль за введением фармацевтических составов, и что дозы, указанные в настоящем документе являются только примерами и не предназначены для ограничения объема изобретения Количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PCB, вводимого для лечения заболевания или патологического состояния, например, вирусной инфекции (например, инфекции PCB), можно определять стандартными клиническими способами (например, анализами титра вируса или детекции антигена). Кроме того, для помощи в определении оптимального диапазона доз можно использовать анализы in vitro и модели на животных. Такие анализы могут определить диапазоны доз, которые можно экстраполировать для введения такому индивидууму как человек. Способы определения оптимальных диапазонов доз, на основе моделей на животных, хорошо известны специалистам в данной области.

3. Пути введения.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить индивидууму любыми способами введения полипептидов, известными в данной области, включая, например, системное или местное введение. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить, например, парентерально (например, интрадермально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно или посредством внутриполостного введения), местно, эпидурально или в слизистые оболочки (например, интраназально или перорально). Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить индивидууму наружно в участке заболевания для проявления местного или трансдермального действия. Композиции, содержащие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, можно вводить любым, удобным способом, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, абсорбцией через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и слизистую оболочку кишечника). Композиции, содержащие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Способ введения может включать местное или другое введение композиции на область тела, в область или вокруг области тела, которые могут контактировать с жидкостью, клетками или тканями, которые инфицированы, заражены или вместе с этим ассоциированы с вирусом, таким как вирус PCB. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить местно или посредством аэрозоля с непосредственной доставкой в органы-мишени, такие как легкие (например, посредством легочных аэрозолей). В некоторых примерах предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить в виде состава с контролируемым высвобождением, например, посредством насоса (см., например, Langer (1990), Science 249:1527-1533; Sefton (1987), CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al. (1980), Surgery 88:507; и Saudek et al. (1989), N. Engl, J. Med. 321:574), или применяя различные полимеры, известные в данной области и описанные в других разделах настоящего документа. В некоторых примерах в непосредственной близости от терапевтической мишени, например, легких, можно размещать системы с контролируемым или замедленным высвобождением, что, таким образом, потребует введения лишь части от системной дозы (см., например, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2,

- 89 027835

pp. 115-138 (1984)).

В конкретных примерах предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты вводят посредством легочной доставки (см., например, патенты США № 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540, 4880078 и публикации PCT № WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903). Примеры способов легочной доставки известны в данной области и включают, но не ограничиваются способами с применением аэрозолей, таких как ингаляторов (например, дозирующих ингаляторов под давлением (MDI), ингаляторов с сухим порошком (DPI), распылителей (например, струйных или ультразвуковых распылителей) и других жидкостных систем для вдыхания лекарственных средств), интратрахеальным вливанием и инсуффляцией. В некоторых примерах легочную доставку можно улучшать посредством одновременного введения или введения совместного состава, содержащего антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, и усилитель проницаемости, такой как, например, поверхностно-активное вещество, жирные кислоты, сахариды, хелатирующие средства и ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеаз.

Подходящие способы доставки, такие как легочная доставка, может выбирать специалист в данной области на основе свойств антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Такие свойства включают, но не ограничиваются растворимостью, гигроскопичностью, кристаллизационными свойствами, температурой плавления, плотностью, вязкостью, текучестью, стабильностью и профилем разрушения.

В некоторых примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, повышают эффективность иммунизации против вируса через слизистую оболочку. Таким образом, в конкретных примерах антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты вводят на поверхность слизистой оболочки. Например, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно доставлять, например, орально (например, буккально, сублингвально), окулярно (например, через роговицу, конъюнктиву, инъекцией внутрь стекловидного тела, внутрь глазной камеры), интраназально, генитально (например, вагинально), ректально, через легкие, желудок или кишечник. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить системно, например, парентерально, например, посредством инъекции или постепенной инфузии в течение определенного времени, или энтерально (например, через желудочно-кишечный тракт). Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно применять местно, например, посредством местного вливания или нанесения (например, интратрахеальное вливание или инсуффляция с использованием бронхоскопа или другого искусственного воздуховода) жидких растворов, гелей, мазей, порошков или посредством ингаляции (например, назальных спреев, ингаляторов (например, дозированных ингаляторов под давлением, ингаляторов с сухим порошком, распылителей (например, струйных или ультразвуковых распылителей) и посредством других жидкостных систем для посредством одного вдоха)). Введение можно проводить до контакта с вирусом или после контакта с вирусом.

4. Способы комбинированного лечения.

Для профилактики и/или лечения заболевания или патологического состояния антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить отдельно или в комбинации с одним или более терапевтическими средствами или лекарственными средствами. Например, предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить в комбинации с одним или более противовирусными средствами для профилактики. В другом примере предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить в комбинации с одним или более противовирусными средствами для лечения вирусной инфекции, такой как респираторная вирусная инфекция. В некоторых примерах респираторная вирусная инфекция представляет собой инфекцию PCB. Противовирусные средства могут включать средства, для уменьшения и/или устранения патогенной инфекции или возбудителей для облегчения одного или более симптомов патогенной инфекции. В некоторых примерах в комбинации также можно вводить множество антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, одно или более противовирусных антител), где по меньшей мере одно из антител представляет собой антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу. В некоторых примерах множество антител можно вводить в комбинации для профилактики, где по меньшей мере одно из антител представляет собой антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу. В других примерах, множество антител можно вводить в комбинации для лечения инфекции PCB или множественной вирусной инфекции, где по меньшей мере одно из антител представляет собой антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу. В некоторых примерах предоставляемые антитела к PCB можно вводить в комбинации с одним или более противовирусными антителами, связывающими и нейтрализующими вирус, такой как PCB. В некоторых примерах предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить в комбинации с одним или более антителами, которые могут подавлять или облегчать один или более симптомов вирусной инфекции, такой как инфекция PCB. В некоторых примерах в комбинации вводят два или более

- 90 027835

антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу.

Один или более дополнительных средств можно вводить с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами одновременно, последовательно или периодически. Средства можно совместно вводить с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, например, как часть одной и той же фармацевтической композиции или тем же способом доставки. В некоторых примерах средства можно вводить совместно и одновременно с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, но посредством других средств доставки. Средства также можно вводить в различные моменты времени с введением антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, но достаточно близко по времени к введению антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов для обеспечения комбинированного профилактического или терапевтического эффекта. В некоторых примерах одно или более дополнительных средств вводят последовательно после или до введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов разделенными выбранным промежутком времени. В некоторых примерах этот промежуток времени составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6 суток, 1, 2, 3 недели, 1, 2 или 3 месяца. В некоторых примерах одно или более дополнительных средств вводят несколько раз и/или антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят несколько раз.

В некоторых примерах введение комбинации снижает заболеваемость PCB относительно заболеваемости PCB в отсутствие комбинации на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%. В некоторых примерах введение комбинации снижает тяжесть одного или более симптомов инфекции PCB по сравнению с тяжестью одного или более симптомов инфекции PCB в отсутствие комбинации на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%.

В некоторых примерах комбинация ингибирует связывание PCB с его рецептором на клеткехозяине по сравнению со связыванием PCB с его рецептором на клетке-хозяине в отсутствие комбинации на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%. В некоторых примерах комбинация ингибирует репликацию PCB по сравнению с репликацией PCB в отсутствие комбинации на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%.

Любое лечение, для которой известно, что она является подходящей, или которую применяют для предотвращения, регулирования, лечения или улучшения состояния при инфекции PCB или одного или более ее симптомов, можно использовать в комбинации с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, (для получения информации о лекарственных средствах (например, профилактических или терапевтических средствах, которые использова- 91 027835

ли или используют для предотвращения, лечения, регулирования и улучшения состояния при инфекции PCB или одного или более ее симптомов, см., например, Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M. D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, N.J., 1999; Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996). Примеры таких средств включают, но не ограничиваются иммуномодулирующими средствами, противовоспалительными средствами (например, адренокортикоидами, кортикостероидами (например, беклометазоном, будесонидом, флунизолидом, флутиказоном, триамцинолоном, метилпреднизолоном, преднизолоном, преднизоном, гидрокортизоном), глюкокортикоидами, стероидовами, нестероидными противовоспалительными препаратами (например, аспирином, ибупрофеном, диклофенаком и ингибиторами ЦОГ-2)), обезболивающими, антагонистами лейкотриенов (например, монтелукастом, метилксантином, зафирлукастом и зилеутоном), бронходилататорами, такими как в2-агонисты (например, бамбутеролом, битолтеролом, кленбутеролом, фенотеролом, формотеролом, индакатеролом, изоэтарином, метапротеренолом, пирбутеролом, прокатеролом, репротеролом, римитеролом, сальбутамолом (альбутеролом, вентолином), левозалбутамолом, сальметеролом, тулобутеролом и тербуталином) и антихолинергическими средствами (например, ипратропия бромидом и окситропия бромидом), сульфасалазином, пеницилламином, дапсоном, антигистаминными средствами, противомалярийными средствами (например, гидроксихлорохином) и противовирусными средствами. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно вводить в комбинации с одним или более способами лечения для лечения инфекции PCB, включающими, но не ограничивающимися внутривенным введением иммуноглобулина, введением дополнительного кислорода и жидкостей или искусственным дыханием. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно вводить в комбинации с одним или более средствами, которые регулируют созревание легких и экспрессию белков сурфактанта, в качестве неограничивающих примеров, такими как глюкокортикоиды, лиганды PPARy и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).

Примеры противовирусных средств, которые можно выбирать для комбинированного лечения с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, включают, но не ограничиваются противовирусными соединениями, противовирусными белками, противовирусными пептидами, конъюгатами противовирусных белков и конъюгатами противовирусных пептидов, включая, но не ограничиваясь аналогами нуклеотидов, иммуномодуляторами (например, интерфероном) и иммуностимуляторами. Комбинированное лечение с применением антител и/или антител к PCB и антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, предусмотрено как комбинация антител и/или антител к PCB и антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, с другими антителами и антигенсвязывающими фрагментами к PCB.

Примеры противовирусных средств для лечения вирусных инфекций, которые можно вводить в комбинации с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, включают, но не ограничиваются ацикловиром, фамцикловиром, ганцикловиром, пенцикловиром, валацикловиром, валганцикловиром, идоксуридином, трифлуридином, бривудином, цидофовиром, докозанолом, фомивирсеном, фоскарнетом, тромантадином, имиквимодом, подофиллотоксином, энтекавиром, ламивудином, телбивудином, клевудином, адефовиром, тенофовиром, боцепревиром, телапревиром, плеконарилом, арбидолом, амантадином, римантадином, осельтамивиром, занамивиром, перамивиром, инозином, интерфероном (например, интерфероном a-2b, пегинтерфероном а-2а), рибавирин/тарибавирином, абакавиром, эмтрицитабином, ламивудином, диданозином, зидовудином, априцитабином, стампидином, элвуцитабином, рацивиром, амдоксовиром, ставудином, зальцитабином, тенофовиром, эфавирензом, невирапином, этравирином, рилпивирином, ловиридом, делавирдином, атазанавиром, фосампренавиром, лопинавиром, дарунавиром, нелфинавиром, ритонавиром, саквинавиром, типранавиром, ампренавиром, индинавиром, энфувиртидом, маравироком, викривироком, PRO 140, ибализумабом, ралтегравиром, элвитегравиром, бевириматом, вивеконом, включая их таутомерные формы, аналоги, изомеры, полиморфные формы, сольваты, производные или соли.

Примеры противовирусных средств для профилактики и/или лечения инфекций PCB, которые можно вводить в комбинацией с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, включают, но не ограничиваются рибавирином, NIH-351 (Gemini Technologies), рекомбинантной вакциной PCB (Aviron), PCBf-2 (Intracel), F-50042 (Pierre Fabre), T-786 (Trimeris), VP-36676 (ViroPharma), RFI-641 (American Home Products), VP-14637 (ViroPharma), PFP-1 и PFP-2 (American Home Products), вакциной PCB (Avant Immunotherapeutics), F-50077 (Pierre Fabre) и другими антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, также можно вводить в комбинации с одним или более средствами, способными стимулировать клеточный иммунитет, такой как клеточный иммунитет слизистых оболочек. Можно использовать любое средство, способное стимулировать клеточный иммунитет. Примеры иммуностимулирующих средств включают цитокины, например, такие как интерфероны (например, интерферон-α, β, γ, ω), лимфокины и

- 92 027835

гемопоэтические факторы роста, например, такие как GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-14 (IL-14) и фактор некроза опухоли (TNF).

Для способов комбинированного лечения с противопатогенными средствами дозировки для введения таких соединений известны в данной области или их может определить специалист в данной области в соответствии с известными клиническими факторами (например, видом индивидуума, размером, площадью поверхности тела, возрастом, полом, иммунокомпетентностью и общим состоянием здоровья, продолжительностью и путем введения, видом и стадией заболевания, наличия других способов лечения, таких как другие противопатогенные средства, вводимые одновременно).

а. Противовирусные антитела для комбинированного лечения.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить в комбинации с одним или более дополнительными антителами или их антигенсвязывающими фрагментами. В некоторых примерах одно или более дополнительных антител представляют собой противовирусные антитела. В некоторых примерах один или более дополнительных антител связывают вирусный антиген. В некоторых примерах один или более дополнительных антител связывают вирусный антиген, который представляет собой поверхностный белок, такой как белок вирусного капсида или белок оболочки вируса. В некоторых примерах один или более дополнительных антител связывают вирусный антиген, который экспрессируется на поверхности инфицированной клетки. В некоторых примерах один или более дополнительных антител связывают вирусный антиген, который экспрессируется внутриклеточно (например, в инфицированной клетке). В некоторых примерах один или более дополнительных антител связывают вирус, который вызывает заболевания дыхательных путей, включая, но не ограничиваясь PCB, вирусом парагриппа (PIV) или метапневмовирусом человека (hMPV). Также в настоящем документе предоставлены композиции, содержащие смеси антител.

Антитела для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, включают, но не ограничиваются моноклональными антителами, полиспецифическими антителами, синтетическими антителами, антителами человека, гуманизированными антителами, химерными антителами, внутриклеточными антителами, одноцепочечными Fv (scFv), одноцепочечными антителами, фрагментами Fab, F(ab') фрагментами, связанными дисульфидными связями Fv (sdFv) и антиидиотипическими (анти-Id) антителами (включая, например, антиId антитела к антителам, предоставляемым по настоящему документу) и связывающими эпитопы фрагментами любых из указанных выше антител. Антитела для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, могут представлять собой молекулы иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Антитела для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, могут представлять собой антитела, происходящие от любого животного, включая птиц и млекопитающих (например, антитела человека, мыши, осла, овцы, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или кур). Как правило, антитела для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, представляют собой антитела человека и гуманизированные антитела. Антитела для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или обладать большей полиспецифичностью.

Антитела для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, могут включать производные антитела, модифицированные, например, присоединением, например, ковалентным присоединением к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту молекулы любого типа. Примеры производных антител или их антигенсвязывающих фрагментов включают антитела, модифицированные, например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с клеточными лигандами или другими белками, или содержащие гетерологичный домен Fc с более высокой аффинностью к рецептору FcRn (см., например, патент США № 7083784). Любую из многочисленных химических модификаций можно проводить известными способами, включая, но не ограничиваясь специфическим химическим расщеплением, ацетилированием, формилированием или синтезом в присутствии туникамицина. Кроме того, производное может содержать одну или более неклассических аминокислот.

Одно или более дополнительных антител для применения в комбинациях с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, можно вводить одновременно, последовательно или периодически с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами. Одно или более дополнительных антител можно вводить совместно с антителами к PCB или антигенсвязывающими фрагментами, например, как часть той же фармацевтической композиции или посредством одного и того же способа доставки. В некоторых примерах одно или более дополнительных

- 93 027835

антител можно вводить одновременно совместно с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, но различными способами доставки. Одно или более дополнительных антител также можно вводить в различные моменты времени с антителами к PCB. или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, но достаточно близко по времени к введению антител к PCB или антигенсвязывающих фрагментов для обеспечения комбинированного профилактического или терапевтического эффекта. В некоторых примерах одно или более дополнительных антител вводят последовательно после или до введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов разделенными выбранным промежутком времени. В некоторых примерах указанный промежуток времени составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6 суток, 1, 2, 3 недели, 1, 2 или 3 месяца. В некоторых примерах одно или более дополнительных антител вводят несколько раз и/или антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, вводят несколько раз.

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител представляют собой антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, вводят в комбинации с одним или более дополнительными антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами для профилактики и/или лечения инфекции PCB. Примеры антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов для комбинированного лечения антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают и нейтрализуют PCB. В некоторых примерах одно или более дополнительных антител к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывается с подтипом А PCB и/или подтипом В PCB.

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения антителами или антигенсвязывающими фрагментами к PCB, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело к PCB, связывающее белок присоединения PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 276), большой структурный белок бетасубъединицы РНК-полимеразы PCB (L белок) (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 276), белок нуклеокапсида PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 277), нуклеопротеин (N) PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 278), фосфопротеин Р PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 279), матриксный белок PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 280), малый гидрофобный (SH) белок PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 281), РНК-зависимую полимеразу PCB, белок F PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 282), белок G PCB (например, с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 283) или аллельный вариант любого из указанного выше. В конкретных примерах одно или более дополнительных противовирусных антител включает антитело к PCB, связывающее белок F PCB. В конкретных примерах одно или более дополнительных противовирусных антител, связывающее белок F PCB, связывает антигенные участки А, В, С, I, II, IV, V или VI гликопротеина F PCB (см., например, Lopez et al. (1998), J. Virol. 72:6922-6928).

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, в качестве неограничивающих примеров включает, паливизумаб (синагис (Synagis®)), мотавизумаб (нумакс (NUMAX®)), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, А8с7, 1X-493L1, FR H3-3F4, М3И9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, А4В4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, (см. патенты США № 5824307 и 6818216), rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23 (см. патент США № 6685942), RF-1, RF-2 (см. патент США № 5811524) или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие цепь VH и/или цепь VL с последовательностями аминокислот цепи VH и/или цепи VL паливизумаба (синагис (Synagis®)), мотавизумаб (нумакс (NUMAX®)), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, А12а6, А13с4, A17d4, A4B4, А8с7, 1X-493L1, FR H3-3F4, М3Ж, Y10H6, DG, AFFF(1), 6Н8, L1-7E5, L215B10, A13a11, A1h5, А4В4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1 или RF-2. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более CDR из паливизумаба (синагис (Synagis®)), мотавизумаб (нумакс (NUMAX®)), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1 или RF-2. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более CDR из формы моноклонального антитела мыши к PCB, в качестве неограничивающих примеров, такой как, MAb 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107,

- 94 027835

1112, 1269, 1269, 1243 (Beeler et al. (1989), J. Virology 63(7):2841-2950), MAb151 (Mufson et al. (1987), J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539), MAb 43-1 и 13-1 (Fernie et al. (1982), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266271), MAb 1436C, 1302A, 1308F и 1331Н (Anderson et al. (1984), J. Clin. Microbiol. 19:934-936). Дополнительные примеры антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые можно использовать для комбинированного лечения с антителами или антигенсвязывающими фрагментами к PCB, предоставляемыми по настоящему документу, в качестве неограничивающих примеров включают, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные, например, в патентах США № 6413771, 5840298, 5811524, 6656467, 6537809, 7364742, 7070786, 5955364, 7488477, 6818216, 5824307, 7364737, 6685942 и 5762905 и патентных публикациях США № 2007-0082002, 2005-0175986, 2004-0234528, 2006-0198840, 2009-0110684, 2006-0159695, 2006-0013824, 2005-0288491, 2005-0019758, 2008-0226630, 2009-0137003 и 2009-0092609.

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемым по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие цепь VH с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 103, 113, 122, 131, 137, 144, 149, 155, 161, 167, 172, 176, 179, 182, 186, 190, 194, 198, 201, 205, 210, 215, 222, 226, 233, 239, 246, 252, 257, 362 и 366. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемым по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен V_H с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 104, 114, 123, 132, 138, 145, 150, 156, 162, 168, 173, 187, 206, 227, 232, 234, 240, 247, 253 и 258. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 VH с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 105, 115, 124, 363 и 367. В конкретных примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 V_H с последовательностью аминокислот TSGMSVG (SEQ ID NO: 105), TAGMSVG (SEQ ID NO: 115), AYAMS (SEQ ID NO: 363) или GYTMH (SEQ ID NO: 367). В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR2 VH с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 106, 125, 133, 157, 236, 259, 364 и 368. В конкретном примере одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR2 VH с последовательностью аминокислот DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO: 106) или DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID NO: 125), GISGSGDSTDYADSVKG (SEQ ID NO: 364) или SITGGSNFINYSDSVKG (SEQ ID NO: 368). В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR3 V_H с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 107, 116, 126, 139, 188, 241, 365 и 369. В конкретном примере одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR3 VH с последовательностью аминокислот SMITNWYFDV (SEQ ID NO: 107), DMIFNFYFDV (SEQ ID NO: 126), HLPDYWNLDYTRFFYYMDV (SEQ ID NO: 365) или APIAPPYFDH (SEQ ID NO: 369).

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие цепь V_L с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 108, 117, 127, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 169, 174, 177, 180, 183, 189, 191, 195, 199, 202, 207, 211, 216, 220, 223, 228, 236, 242, 248, 254, 260, 263, 370, 374 и 378. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие домен VL с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 109, 118, 128, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 170, 175, 178, 181, 184, 192, 196, 200, 203, 208, 212, 217, 221, 224, 229, 237, 243, 249, 255, 261 и 264. В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO:

- 95 027835

110, 119, 129, 142, 154, 166, 244, 250, 265, 371, 375 и 379. В конкретном примере одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1 V_L с последовательностью аминокислот KCQLSVGYMH (SEQ ID NO: 110), SASSRVGYMH (SEQ ID NO: 154), RATQSISSNYLA (SEQ ID NO: 371), KASQNINDNLA (SEQ ID NO: 375) или RATQSVSNFLN (SEQ ID NO: 379). В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR2 VL с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 111, 120, 136, 143, 160, 171, 185, 218, 225, 230, 238, 245, 251, 256, 262, 266, 372, 376 и 380. В конкретном примере одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR2 VL с последовательностью аминокислот DTSKLAS (SEQ ID NO: 111), DTLLLDS (SEQ ID NO: 218), GASNRAT (SEQ ID NO: 372), GASSRAT (SEQ ID NO: 376) или DASTSQS (SEQ ID NO: 380). В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR3 V_L с последовательностью аминокислот, указанной в любой из SEQ ID NO: 112, 121, 193, 373, 377 и 381. В конкретном примере одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR3 VL с последовательностью аминокислот FQGSGYPFT (SEQ ID NO: 112), QQYDISPYT (SEQ ID NO: 373), QQYGGSPYT (SEQ ID NO: 377) или QASINTPL (SEQ ID NO: 381).

В некоторых примерах антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, можно вводить в комбинации с гипериммунной сывороткой или иммунноглобулинами, обогащенными антителами к PCB, например, такими как гипериммунный глобулин PCB (PCB IVIG; RespiGam®; MedImmune Inc, Gaithersburg, MD; см., например, Groothius et al. (1993), New Eng. J. Med 329:1524-1530).

ii. Антитела к другим респираторным вирусам.

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент к респираторному

вирусу, отличному от PCB, например, выбранному из антитела к метапневмовирусу человека (hMPV), антитела к вирусу парагриппа (PIV), антитела к пневмовирусу обезьян (APV) или других противовирусных антител, известных в данной области.

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, представляют собой антитела к PIV, антитела, которые иммуноспецифически связывают антиген PIV, например, такие как фосфопротеин нуклеокапсида PIV, слитый белок (F) PIV, фосфопротеин PIV, большой белок (L) PIV, матриксный белок (М) PIV, гликопротеин гемагглютининнейраминидазы PIV (HN), РНК-зависимую РНК-полимеразу PIV, белок Y1 PIV, белок D PIV, белок С PIV или аллельные варианты любого из указанного выше. В конкретных примерах антиген PIV представляет собой белок F PIV. В некоторых примерах антитела к PIV представляют собой антитела, которые иммуноспецифически связывают антиген PIV человека 1 типа, PIV человека 2 типа, PIV человека 3 типа и/или PIV человека 4 типа.

В некоторых примерах одно или более дополнительных противовирусных антител для комбинированного лечения с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, представляют собой антитела к hMPV, которые иммуноспецифически связывают антиген hMPV, например, такой как нуклеопротеин hMPV, фосфопротеин hMPV, матриксный белок hMPV, малый гидрофобный белок hMPV, РНК-зависимую РНК-полимеразу hMPV, белок F hMPV, белок G hMPV или аллельные варианты любого из указанного выше. В конкретных примерах антиген hMPV представляет собой белок F hMPV. В некоторых примерах антитела к hMPV представляют собой антитела, которые иммуноспецифически связывают антиген hMPV типа А и/или антиген hMPV типа В. В некоторых примерах антитела к hMPV представляют собой антитела, которые иммуноспецифически связывают антиген hMPV подтипа А1 и/или А2 и/или hMPV подтипа В1 и/или В2.

Антитела, вводимые в комбинации с антителом к PCB или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставляемыми по настоящему документу, могут представлять собой антитела или антигенсвязывающие фрагменты любого типа, известные в данной области. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, вводимые в комбинации с антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, предоставляемыми по настоящему документу, в качестве неограничивающих примеров могут включать, моноклональные антитела, антитела человека, антитела, не принадлежащие человеку, реком- 96 027835

бинантно получаемые антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), интраантитела и фрагменты антител, в качестве неограничивающих примеров, такие как фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2, фрагменты Fv, связанные дисульфидными связями Fv (dsFv), фрагменты Fd, фрагменты Fd', одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные Fab (scFab), диатела, антиидиотипические (антитела к Id) или антигенсвязывающие фрагменты любого из указанного выше. Антитела, вводимые в комбинации с антителами к PCB, предоставляемыми по настоящему документу, могут включать представителей иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2 ) или подкласса (например, IgG2a и IgG2b).

В некоторых примерах введение комбинации противовирусных антител или антигенсвязывающих фрагментов снижает заболеваемость PCB относительно заболеваемости PCB в отсутствие антител или антигенсвязывающих фрагментов к PCB на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%. В некоторых примерах введение комбинации противовирусных антител или антигенсвязывающих фрагментов уменьшает тяжесть одного или более симптомов инфекции PCB по сравнению с тяжестью одного или более симптомов инфекции PCB в отсутствие комбинации противовирусных антител или антигенсвязывающих фрагментов на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%.

В некоторых примерах комбинации противовирусных антител и антигенсвязывающих фрагментов ингибирует связывание PCB с его рецептором на клетке-хозяине по сравнению со связыванием PCB с его рецептором на клетке-хозяине в отсутствие комбинации противовирусных антител или антигенсвязывающих фрагментов на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%. В некоторых примерах комбинация противовирусных антител и антигенсвязывающих фрагментов подавляет репликацию PCB по сравнению с репликацией PCB в отсутствие комбинации противовирусных антител или антигенсвязывающих фрагментов на по меньшей мере или приблизительно 99%, по меньшей мере или приблизительно на 95%, по меньшей мере или приблизительно на 90%, по меньшей мере или приблизительно на 85%, по меньшей мере или приблизительно на 80%, по меньшей мере или приблизительно на 75%, по меньшей мере или приблизительно на 70%, по меньшей мере или приблизительно на 65%, по меньшей мере или приблизительно на 60%, по меньшей мере или приблизительно на 55%, по меньшей мере или приблизительно на 50%, по меньшей мере или приблизительно на 45%, по меньшей мере или приблизительно на 40%, по меньшей мере или приблизительно на 35%, по меньшей мере или приблизительно на 30%, по меньшей мере или приблизительно на 25%, по меньшей мере или приблизительно на 20%, по меньшей мере или приблизительно на 15% или по меньшей мере или приблизительно на 10%.

5. Генотерапия.

В некоторых примерах для лечения, предотвращения или смягчения одного или более симптомов, связанных с инфекцией PCB, в качестве генотерапии вводят нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, кодирующие антитела к PCB, антигенсвязывающие фрагменты и/или их производные. Генотерапия относится к терапии, проводимой посредством введения индивидууму экспрессирующей или способной к экспрессии нуклеиновой кислоты. В этом примере нуклеиновые кислоты опосредуют продукцию кодируемых ими антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые опосредуют

- 97 027835

профилактический или терапевтический эффект.

Для введения нуклеиновых кислот, кодирующих антитела к PCB, их антигенсвязывающие фрагменты и/или производные можно использовать любой из способов генотерапии, доступных в данной области. Примеры способов описаны ниже.

Для общего обзора способов генотерапии, см., например, Goldspiel et al. (1993), Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991), Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993), Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993), Science 260:926-932; Morgan and Anderson (1993), Ann. Rev. Biochem. 62:191217; и TIBTECH 11(5):155-215. Способы, широко известные в данной области технологии рекомбинантных ДНК, описаны в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, ed. John Wiley & Sons, NY (1993); и Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

В некоторых примерах композиция, предоставляемая по настоящему документу, содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело к PCB, его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, где нуклеиновые кислоты являются частью экспрессирующего вектора, экспрессирующего антитело к PCB, его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное в подходящем хозяине. В частности, такие нуклеиновые кислоты содержат промоторы, такие как гетерологичные промоторы, функционально связанные с кодирующей антитело областью, где промотор может быть индуцибельным или конститутивным и, необязательно, тканеспецифическим. В другом конкретном варианте осуществления используют молекулы нуклеиновой кислоты, в которых последовательности, кодирующие антитело, и любые другие желаемые последовательности фланкированы областями, которые способствуют гомологичной рекомбинации по желаемому участку в геноме, таким образом, обеспечивая внутрихромосомную экспрессию кодирующей антитело нуклеиновой кислоты (Roller and Smithies (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al. (1989), Nature 342:435-438). В некоторых примерах молекула экспрессируемого антитела представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых примерах последовательности нуклеиновых кислот содержат последовательности, кодирующие тяжелые и легкие цепи антител или их фрагменты. В конкретном примере последовательности нуклеиновых кислот содержат последовательности, кодирующие фрагмент Fab антитела к PCB. В конкретном примере последовательности нуклеиновых кислот содержат последовательности, кодирующие полноразмерное антитело к PCB. В некоторых примерах кодируемые антитела к PCB представляют собой химерные антитела.

Доставка нуклеиновых кислот индивидууму может быть прямой, в случае чего индивидуум непосредственно подвергается воздействию нуклеиновой кислоты или несущих нуклеиновую кислоту векторов, или непрямой, в этом случае клетки сначала трансформируют нуклеиновыми кислотами in vitro, затем трансплантируют индивидууму. Два этих указанных подхода, известны, соответственно, как генотерапия in vivo или ex vivo.

В некоторых примерах последовательности нуклеиновых кислот непосредственно вводят in vivo, где они экспрессируются с получением кодируемого продукта. Это можно проводить любым из многочисленных способов, известных в данной области, например, посредством конструирования их как часть соответствующих экспрессирующих векторов и введения их так, что они становятся внутриклеточными, например, посредством инфекции с использованием дефектных или ослабленных ретровирусных или других вирусных векторов (см. патент США № 4980286), или посредством прямой инъекции голой ДНК с применением бомбардировки микрочастицами (например, посредством генной пушки, Biolistic, Dupont) или покрытия липидами или рецепторами клеточной поверхности или средствами для трансфекции, инкапсуляции в липосомы, микрочастицы или микрокапсулы, или посредством введения их в связи с пептидом, для которого известно, что он проникает в ядро, посредством введения их в связи с лигандом, опосредующим опосредуемый рецептором эндоцитоз (см., например, Wu and Wu (1987), J. Biol. Chem. 262:4429-4432), который можно использовать, например, для направления клетки-мишени определенного типа, специфически экспрессирующие рецепторы. В некоторых примерах можно получать комплексы нуклеиновых кислот с лигандами, в которых лиганд содержит фузогенный вирусный пептид, разрушающий эндосомы, позволяющий нуклеиновой кислоте избежать разрушения в лизосомах. В некоторых примерах нуклеиновые кислоты можно предоставлять для клеточно-специфичного захвата и экспрессии in vivo посредством направления к специфическим рецепторам (см., например, публикации PCT WO 92/06180, WO 92/22635, WO92/20316; WO93/14188 и WO 93/20221). Альтернативно, нуклеиновые кислоты можно вводить внутриклеточно и включать в ДНК клетки-хозяина для экспрессии посредством гомологичной рекомбинации (Roller and Smithies (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; и Zijlstra et al. (1989), Nature 342:435-438). В некоторых примерах используют вирусные векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к PCB, их антигенсвязывающие фрагменты и/или производные. Например, можно использовать ретровирусный вектор (см., например, Miller et al. (1993), Meth. Enzymol. 217:581-599). Ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, для применения в генотерапии, клонируют в один или более векторов, что облегчает доставку гена индивидууму. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al. (1994), Biotherapy 6:291-302. Другие ссылки, иллюстрирующие применение ретровирусных векторов в генотерапии,

- 98 027835

включают, например, Clowes et al. (1994), J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al. (1994), Blood 83:14671473; Salmons and Gunzberg (1993), Human Gene Therapy 4:129-141; и Grossman and Wilson (1993), Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.

Аденовирусы также представляют собой вирусные векторы, которые можно использовать в генотерапии. Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями для доставки генов в дыхательный эпителий. Аденовирусы в природе заражают дыхательный эпителий, вызывая легко протекающее заболевание. Другие мишени для системы доставки на основе аденовирусов включают печень, центральную нервную систему, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы имеют преимущество, обладая способностью инфицировать неделящиеся клетки. Обзор применения аденовирусов в генотерапии предоставлен в Kozarsky and Wilson (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503. В Bout et al. (1994), Human Gene Therapy 5:3-10 продемонстрировано применение аденовирусных векторов для переноса генов в дыхательный эпителий макак-резус. Другие примеры применения аденовирусов в генотерапии можно найти, например, в Rosenfeld et al. (1991), Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993), J. Clin. Invest. 91:225-234; публикации PCT WO 94/12649; и Wang et al. (1995), Gene Therapy 2:775-783. В конкретном примере аденовирусные векторы используют для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих антитела к PCB, их антигенсвязывающие фрагменты и/или производные, предоставляемые по настоящему документу.

Также в генотерапии можно использовать аденоассоциированный вирус (AAV) (Walsh et al. (1993), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300, и патент США № 5436146). В конкретных примерах векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) используют для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих антитела к PCB, антигенсвязывающие фрагменты и/или их производных, предоставленные по настоящему документу.

Другой подход к генотерапии включает перенос генов в клетки в тканевой культуре такими способами как электропорация, липофекция, опосредованная фосфатом кальция трансфекция или вирусная инфекция. Как правило, способ переноса включает перенос в клетки селектируемого маркера. Затем клетки помещают под отбор для выделения клеток, захвативших и экспрессирующих перенесенный ген. Затем экспрессирующие ген клетки доставляют индивидууму.

В некоторых примерах нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела к PCB, их антигенсвязывающие фрагменты и/или производные, предоставляемые по настоящему документу, вводят в клетки до введения полученных рекомбинантных клеток: in vivo. Такое введение может проводить любым способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, инфекцией вирусным или бактериофаговым вектором, содержащими последовательности нуклеиновых кислот, слиянием клеток, опосредованным хромосомами переносом генов, опосредованным микроклетками переносом генов и слиянием сферопластов. Для введения чужеродных генов в клетки в данной области известно множество способов (см., например, Loeffler and Behr (1993), Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al. (1993), Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline (1985), Pharmacol. Ther. 29:69-92), которые можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих антитела к PCB, их антигенсвязывающие фрагменты и/или производные, предоставляемые по настоящему документу, при условии, что не нарушаются обязательные процессы развития и физиологические функции клеток-реципиентов. Способ обеспечивает стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку так, что нуклеиновая кислота экспрессируются в клетке и, как правило, наследуются и экспрессируются в клетках-потомках.

Полученные рекомбинантные клетки можно доставлять индивидууму различными способами, известными в данной области. Рекомбинантные клетки крови (например, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники) можно вводить внутривенно. Количество клеток для введения зависит от многих факторов, включая, например, желаемый профилактический и/или терапевтический эффект и состояние пациента, и его может определить специалист в данной области.

Клетки, в которые с целью генотерапии можно вводить нуклеиновые кислоты, включают любой желаемый доступный тип клеток, включая, но не ограничиваясь эпителиальными клетками, эндотелиальными клетками, кератиноцитами, фибробластами, мышечными клетками, гепатоцитами, клетками крови, такими как Т-лимфоциты, B-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты, различными стволовыми клетками или клетками-предшественниками, в частности гемопоэтическими стволовыми клетками или клетками-предшественниками, например, полученными из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови и печени плода. В конкретных примерах используемые для генотерапии клетки аутологичны для индивидуума.

В некоторых примерах в которых в генотерапии используют рекомбинантные клетки, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к PCB, их антигенсвязывающие фрагменты и/или производные, предоставляемые по настоящему документу, вводят в клетки так, что они экспрессируются в клетках или их потомках, и затем для достижения терапевтического эффекта рекомбинантные клетки вводят in vivo. В конкретном примере используют стволовые клетки или клетки-предшественники. Можно использовать любые стволовые клетки и/или клетки-предшественники, которые можно выделять и культивировать in vitro (см., например, публикацию PCT WO 94/08598; Stemple and Anderson (1992), Cell 71:973-985; Rheinwald (1980), Meth. Cell Bio. 21A:229; и Pittelkow and Scott (1986), Mayo Clinic Proc.

- 99 027835

61:771).

В конкретном примере нуклеиновые кислоты для введения с целью генотерапии, содержат индуцибельный промотор, функционально связанный с кодирующей областью так, что экспрессия нуклеиновой кислоты контролируется наличием или отсутствием соответствующего индуктора транскрипции.

J. Фармацевтические композиции, комбинации и промышленные изделия/наборы

1. Фармацевтические композиции.

По настоящему документу предоставлены фармацевтические композиции, содержащие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу.

Фармацевтическую композиция можно использовать для терапевтического, профилактического и/или диагностического применения. Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно составлять с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Как правило, в таких фармацевтических композициях используют компоненты, которые не ухудшают в значительной степени биологические свойства антител и их антигенсвязывающих фрагментов, такие как связывание с их специфическими эпитопами (например, связывание с эпитопом белка F PCB). Каждый компонент является фармацевтически и физиологически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами и отсутствия вреда для пациента. Составы можно представлять в стандартной лекарственной форме и можно получать способами, хорошо известными в области фармацевтики, включая, но не ограничиваясь формой таблеток, пилюль, порошков, жидких растворов или суспензий (например, включая композиции для инъекций, приема внутрь и местного применения (например, глазные капли, гели или мази), аэрозолями (например, назальными спреями), липосомами, суппозиториями, растворами для инъекций и формами с замедленным высвобождением. Смотрите, Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; and Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. При системном введении терапевтическая композиция является стерильной, апирогенной, как правило, не содержит твердых частиц и содержится в приемлемом для парентерального введения растворе с учетом pH, изотоничности и стабильности. Эти условия известны специалистам в данной области. Способы получения композиций для парентерального введения хорошо известны или очевидны для специалистов в данной области и более подробно описаны, например, в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Formely Remington's Pharmaceutical Sciences)", 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995).

Фармацевтические композиции, предоставляемые по настоящему документу, могут находиться в различных формах, например, в твердой, полутвердой, жидкой, порошковой, водной или лиофилизированной формах. Примеры подходящих фармацевтических носителей известны в данной области и наряду с другими включают, но не ограничиваются водой, буферами, солевыми растворами, растворы фосфатно-солевых буферов, различными типами средств для смачивания, стерильными растворами, спиртами, гуммиарабиком, растительными маслами, бензиловыми спиртами, желатином, глицерином, углеводами, такими как лактоза, сахароза, амилоза или крахмал, стеаратом магния, тальком, кремниевой кислотой, вязким парафином, ароматическими маслами, жирными кислотами, моноглицеридами и диглицеридами, эфирами пентаэритрита и жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозой, порошками. Фармацевтические композиции, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать другие добавки, включая наряду с другими, например, антиоксиданты, консерванты, противомикробные средства, анальгетики, связующие средства, дезинтегранты, красители, разбавители, эксципиенты, наполнители, способствующие скольжению средства, разбавители, растворители, средства придания тоничности, носители, регулирующие вязкость средства, ароматизаторы, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, эмульгаторы и суспендирующие средства, такие как гуммиарабик, агар, альгиновая кислота, альгинат натрия, бентонит, карбомер, каррагенан, карбоксиметилцеллюлоза, целлюлоза, холестерин, желатин, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, октоксинол 9, олеиловый спирт, повидон, пропиленгликольмоностеарат, лаурилсульфат натрия, сложные сорбитановые эфиры, стеариловый спирт, трагакант, ксантановая камедь и их производные, растворители и прочие ингредиенты, такие как кристаллическая целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, лимонная кислота, декстрин, декстроза, жидкая глюкоза, молочная кислота, лактоза, хлорид магния, метафосфат калия, крахмал (см., Alfonso R. Gennaro (2000), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins). Такие носители и/или добавки можно составлять общепринятыми способами и можно вводить индивидууму в подходящей дозе. Стабилизаторы, такие как липиды, ингибиторы нуклеаз, полимеры и хелатирующие средства могут сохранять композиции от разрушения в организме.

Пригодные для применения фармацевтические композиции включают композиции, где одно или более антител к PCB содержатся в количестве, достаточном для достижения назначенной цели. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалиста в данной области. Терапевтически эффективные дозы можно определять способами in vitro и in vivo, как описано в настоящем документе. Таким образом, антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляе- 100 027835

мые по настоящему документу, в составе фармацевтического препарата могут находиться в стандартной лекарственной форме для введения.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно лиофилизировать для хранения и восстановливать в подходящем носителе перед применением. Показано, что такой способ является эффективным для обычных иммуноглобулинов и препаратов белков и можно использовать известные в данной области способы лиофилизации и восстановления.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, можно предоставлять в виде композиций с контролируемым высвобождением или с замедленным высвобождением. В данной области известны полимерные материалы для получения таблеток и капсул с контролируемым или замедленным высвобождением антител или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer и Wise (ed.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen и Ball (ed.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas (1983), J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy et al. (1985), Science 228:190; During et al. (1989), Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989), J. Neurosurg. 71:105; патенты США № 5679377, 5916597, 5912015, 5989463, 5128326, публикации PCT № WO 99/15154 и WO 99/20253). Примеры полимеров, используемых в композициях с замедленным высвобождением, включают, но не ограничиваются поли(2гидроксиэтилметакрилатом), поли(метилметакрилатом), поли(акриловой кислотой), сополимером этилена с винилацетатом, поли(метакриловой кислотой), полигликолидами (PLG), полиангидридами, поли(Ывинилпирролидоном), поли(виниловым спиртом), полиакриламидом, поли(этиленгликолем), полилактидами (PLA), сополимерами молочной и гликолевой кислот и полиортоэфирами. Как правило, полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, является инертным, не содержащим выщелачиваемых примесей, стабильным при хранении, стерильным и биологически разлагаемым. Для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов к PCB, предоставляемых по настоящему документу, можно использовать любой способ получения составов с замедленным высвобождением, известный в данной области.

В некоторых примерах фармацевтическая композиция содержит антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, и одно или более дополнительных антител. В некоторых примерах одно или более дополнительных антител в качестве неограничивающих примеров включают паливизумаб (синагис (SYNAGIS®)) и его производные, например, такие как мотавизумаб (нумакс (NUMAX®)), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R и A4B4-F52S (см. патенты США № 5824307 и 6818216), rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23 (например, см. патенты США № 5824307, 6685942 и 6818216), антитела человека к PCB, в качестве неограничивающих примеров такие как rsv6, rsv11, rsv13, rsv19 (т.е. Fab 19), rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 (см., например, патенты США № 6685942 и 5811524), гуманизированные антитела, получаемые из моноклональных антител мыши к PCB, в качестве неограничивающих примеров, такие как MAb 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243 (Beeler et al. (1989), J. Virology 63 (7):2841-2950), MAb151 (Mufson et al. (1987), J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539), MAb 43-1 и 13-1 (Fernie et al. (1982), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271), MAb 1436C, 1302A, 1308F и 1331Н (Anderson et al. (1984), J. Clin. Microbiol. 19:934-936) или их антигенсвязывающие фрагменты. Дополнительные примеры антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые можно использовать в фармацевтической композиции, содержащей антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, включают, но не ограничиваются антителами к PCB или их антигенсвязывающими фрагментами, описанными, например, в патентах США № 6413771, 5840298, 5811524, 6656467, 6537809, 7364742, 7070786, 5955364, 7488477, 6818216, 5824307, 7364737, 6685942 и 5762905 и патентных публикациях США № 2007-0082002, 2005-0175986, 2004-0234528, 2006-0198840, 2009-0110684, 2006-0159695, 2006-0013824, 2005-0288491, 2005-0019758, 2008-0226630, 2009-0137003 и 2009-0092609.

2. Промышленные изделия/наборы.

Фармацевтические композиции антител к PCB или нуклеиновых кислот, кодирующих антитела к PCB или их производные или биологически активные части, можно упаковать в виде промышленных изделий, содержащих упаковочный материал, фармацевтическую композиция, которая эффективна для профилактики (т.е. вакцинации, пассивной иммунизации) и/или лечения опосредованного PCB заболевания или нарушения, а также этикетку, которая указывает, что антитела или молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для вакцинации и/или лечения заболевания или нарушения. Фармацевтические композиции можно упаковать в стандартные лекарственные формы, содержащие количество фармацевтической композиции для одной дозы или более доз. Упакованные композиции могут содержать лиофилизированный порошок фармацевтической композиции, содержащей предоставляемые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, который можно восстанавливать (например, водой или физиологическим раствором) перед введением.

Промышленные изделия, предоставляемые по настоящему документу, содержат упаковочный ма- 101 027835

териал. Упаковочные материалы, применяемые для упаковки фармацевтических препаратов, хорошо известны специалистам в данной области. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются блистерной упаковкой, бутылками, пробирками, ингаляторами (например, дозированными ингаляторами под давлением (MDI), ингаляторами сухих порошков (DPI), распылителями (например, струйными или ультразвуковыми распылителями) и другими системами доставки жидкой композиции одним вдохом), насосами, пакетами, флаконами, контейнерами, шприцами, бутылками и любым упаковочным материалом, подходящим для выбранной композиции и назначенного способа введения и лечения. Фармацевтическую композицию также можно включать или наносить на барьер или другое защитное устройство, которое используют для защиты от инфекции.

Антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие их антитела, фармацевтические композиции или комбинации, предоставляемые по настоящему документу, также можно предоставлять в виде наборов. Наборы необязательно могут включать один или более компонентов, таких как инструкции по применению, устройства и дополнительные реагенты (например, стерилизованную воду и солевые растворы для разведения композиции и/или восстановления лиофилизированного белка) и такие компоненты, как пробирки, контейнеры и шприцы для практического осуществления способов. Примеры наборов могут включать антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу, инструкции по применению, устройство для введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов индивидууму, устройство для детекции антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов у индивидуума, устройство для детекции антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов в образцах, полученных у индивидуума, и устройство для введения индивидууму дополнительных терапевтических средств.

Набор необязательно может содержать инструкции. Как правило, инструкции содержат ясное указание о предписании антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, и, необязательно, другие компоненты, включенные в набор, и способы для введения, включающие способы для определения надлежащего состояния индивидуума, правильной величины дозы, режимы дозирования и правильный способ введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. Инструкция также может содержать руководство по наблюдению за индивидуумом в течение срока лечения.

Наборы также могут содержать фармацевтическую композицию, описываемую в настоящем документе, и устройство для установления диагноза. Например, такие наборы могут содержать устройство для определения концентрации, количества и активности выбранного антитела к PCB или его антигенсвязывающего фрагмента у индивидуума.

В некоторых примерах антитела к PCB или антигенсвязывающие фрагменты предоставлены в виде диагностического набора для детекция PCB в выделенном биологической образце (например, образце жидкости, такой как кровь, мокрота, лаваж, образец, отобранный при интубации легких, слюна, моча или лимфа, полученном у индивидуума). В некоторых примерах диагностический набор содержит панель из одного или более антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов и/или одного или более контрольных антител (т.е. антител, не связывающих PCB), где одно или более антител в панели представляют собой антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставляемые по настоящему документу.

Наборы, предоставляем по настоящему документу, также могут содержать устройство для введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов индивидууму. Наборы, предоставляемые по настоящему документу, могут содержать любое из множества известных в данной области устройств для введения лекарственных средств индивидууму. Примеры устройств включают, но не ограничиваются ингаляторами (например, дозированными ингаляторами под давлением, ингаляторами с сухим порошком, распылителями (например, струйными или ультразвуковыми распылителями) и другими системами доставки жидкой композиции одним вдохом), игла для подкожных инъекций, иглами для внутривенного введения, катетерами и дозаторами жидкости, такими как пипетки. Как правило, устройство для введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов из набора хорошо совместимо с желаемым способом введения антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов. Например, антитела к PCB или антигенсвязывающие фрагменты для доставки посредством легочного введения, могут быть включены в набор с ингалятором или распылителем или содержаться в ингаляторе или распылителе.

3. Комбинации.

Предоставлены комбинации антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов, предоставляемых по настоящему документу, и второго средства, такого как второе антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, или другого терапевтического или диагностического средства. Комбинации могут включать любые антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты или реагент для проведения лечения ими в соответствии со способами, предоставляемыми по настоящему документу. Например, комбинация может включать любое антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент и противовирусное средство. Комбинации также могут включать антитело к PCB или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставляемые по настоящему документу, с одним или более дополнительными терапевтическими антителами. Комбинации предоставляемых антител к PCB или их антигенсвязывающих фрагментов также могут содержать фармацевтические композиции, содержащие антитела к PCB или их

- 102 027835

антигенсвязывающие фрагменты или клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела к PCB или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем документе. Комбинации, предоставляемые по настоящему документу, можно составлять как одну композицию или в отдельных композициях.

K. Примеры

Приведенные ниже примеры включены исключительно с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объем изобретения.

Пример 1.

Экспрессия белка F PCB.

В этом примере экспрессировали и очищали белок слияния (белок F) PCB штамма А2 респираторно-синцитиального вируса посредством захвата на планшеты ELISA с использованием клона 2F7 моноклонального антитело к PCB, распознающего субъединицы F0 и F1 на гликопротеине слияния. В первом примере рекомбинантный белок F PCB клонировали и экспрессировали в клетках 293F. Во втором примере зкспрессировали природный белок F PCB посредством инфекции клеток НЕр-2 штаммом А2 PCB.

А. Рекомбинантный белок F PCB.

В этом примере клонировали и экспрессировали ген, кодирующий белок F PCB из штамма А2 PCB. Ген F A2 PCB (SEQ ID NO: 21), содержащий только внеклеточный домен синтезировали по стандартному протоколу синтеза ДНК посредством GeneArt (Burlingame, CA). Ген F A2 PCB конструировали так, чтобы он содержал последовательность Козака (нуклеотиды 7-16 SEQ ID NO: 21), последовательность стус (нуклеотиды 1600-1629 SEQ ID NO: 21) и метку 6X-His (нуклеотиды 1645-417 SEQ ID NO: 21). Кроме того, на 5'- и 3'-концах конструировали участки рестрикции NheI (SEQ ID NO: 22) и HindIII (SEQ ID NO: 23), соответственно, для обеспечения клонирования в экспрессирующий вектор. ДНК расщепляли стандартными способами молекулярной биологии и лигировали в расщепленный подобным образом эксдрессирующий вектор млекопитающих pcDNA™3.1/myc-His(-) С (SEQ ID NO: 24, Invitrogen). Вектор, содержащий ген F A2 PCB, трансформировали в электрокомпетентные клетки XL1-Blue (Strategene). Отбирали отдельные колонии и выращивали, и выделяли плазмидную ДНК. Присутствие вставки гена F A2 PCB в выделенном векторе подтверждали секвенированием ДНК, и один клон, содержащий вставку, использовали для получения крупномасштабных препаратов ДНК (набор Megaprep, Qiagen).

Белок F А2 PCB экспрессировали в клетках млекопитающих с применением экспрессирующей системы Freestyle™ 293 (Invitrogen) по инструкциям производителя. В кратком изложении, 3х10⁷ клеток котрансфицировали 30 мкг плазмидной ДНК F А2 F/pcDNA3.1/myc-His(-) С и 5 мкг pAdVAntage (Promega) и инкубировали при 37°C в течение 72 ч. Клетки осаждали центрифугированием и к каждым 3х10⁷ F трансфицированных PCB клеток 293-F добавляли 3 мл холодного буфера для лизиса (300 мМ NaCl, 50 мМ NaH₂PO₄, 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз Complete™ (по каталогу № sc29131, Santa Cruz), pH 8). Смесь перемешивали при 4°C в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 14000 оборотов в минуту в течение 30 мин при 4°C. Очищенный супернатант переносили в новую пробирку и замораживали при -80°C до использования. Перед захватом на. планшетах для ELISA супернатант размораживали, быстро центрифугировали и разбавляли 1:1 об./об. в PBS, содержащем 0,8% обезжиренного сухого молока (конечная концентрация обезжиренного сухого молока 0,4%).

B. Природный белок F PCB.

В этом примере природный белок F PCB из штамма А2 PCB (SEQ ID NO: 382) очищали из инфицированных PCB клеток НЕр-2. Клетки НЕр-2 высевали в десятислойный штатив для культивирования клеток (Coming 3270) с использованием полной ЕМЕМ (ATCC 30-2003, содержащей 10% FBS, 1% Lглутамина и 1% пенициллина-стрептомицина) и инкубировали при 37°C и 5% CO₂. При достижении 80% конфлуэнтности, монослой НЕр-2 заражали вирусом А2 PCB (ATCC VR-1540) при множественности заражения (MOI) 0,01-0,1. Инфицированные клетки культивировали в течение 3-5 суток до образования хорошо наблюдаемого клеточного синцития. Инфицированные клетки однократно промывали PBS и собирали добавлением в культуральный штатив 500 мл PBS с 5 мМ ЭДТА и инкубацией при температуре 37°C в течение 1 ч. Клетки собирали в 50 мл конические пробирки (5х 10⁷ клеток на пробирку) и осаждали посредством центрифугирования. Клеточный осадок промывали 2 раза PBS и центрифугировали при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин. Клеточный осадок хранили при -20°C до дальнейшего использования. Замороженные клетки размораживали и к каждому клеточному осадку добавляли 3 мл холодного буфера для лизиса (300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 1% Тритон Х-100, смесь ингибиторов протеаз Complete™ (по каталогу № sc-29131, Santa Cruz), pH 8). Клетки перемешивали при 4°C в течение 30 мин с последующей обработкой ультразвуком (3 импульса в течение 10 секунд каждый при 10% мощности) и, в заключение, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 30 мин при 4°C. Очищенный супернатант переносили в новую пробирку и замораживали при -80°C до использования. Перед захватом на планшете для ELISA супернатант размораживали, быстро центрифугировали и разбавляли 1:2000.

C. Захват с применением mAb к PCB.

Планшеты ELISA покрывали с использованием 50 мкл/лунку разведения 1:400 mAb к PCB (по каталогу № NB110-37246, клон 2F7, Novus Biologicals) в PBS. Несвязавшиеся антитела, удаляли и планше- 103 027835

ты использовали непосредственно для ELISA (см. примеры 2 и 4). Альтернативно, планшеты замораживали на срок до 2 недель при -20°C. Непосредственно перед использованием планшеты блокировали 4%

нежирным сухим молоком в 1xPBS в течение 2 ч при 37°C. Планшеты перед добавлением лизата дважды отмывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (отмывочный буфер). Захват белка F PCB (рекомбинантного или нативного) проводили, добавляя 50 мкл любого из полученных выше лизатов в каждую лунку планшета ELISA с mAb к PCB и инкубируя при 37°C в течение 2 ч.

Пример 2.

Выделение Fab антител K PCB из трансформированных EBV В-клеток.

В этом примере антитела к PCB выделяли из стимулированных вирусом Эпштейн-Барр трансформированных B-клетки памяти донора, которые подвергали скринингу на связывание белка F PCB с последующим получением антител in vitro. В разделах А и В описаны два немного отличающихся способа получения и клонирования трансформированных EBV B-клеток и скрининга на связывания белка F PCB. Различия заключаются в следующем: (1) источник РМВС на этапе 1; (2) выделение IgG+ B-клеток на этапе 2 (обедненные по IgM, IgD и IgA экспрессирующие клетки в разделе А и клетки, дополнительно обедненные по CD3-положительным клеткам, в разделе В); и (3) получение облученных фидерных клеток с обедненными B-клетками на этапе 3.а.

А. Получение и клонирование трансформированных EBV В-клеток и скрининг на связывание белка F PCB (способ А).

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были получены у работника, ухаживающего за детьми, который мог быть подвержен PCB при контакте с детьми. РВМС выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-гипака по инструкциям производителя.

1. Выделение CD22+ и активация CD22+ B-клеток.

У донора РВМС выделяли 3,2х10⁶ CD22+ B-клеток с использованием магнитных гранул с антителами к CD22 (Miltenyi, по каталогу № 130-046-401) и колонок LS (Miltenyi, по каталогу № 130-042-401). Выделенные CD22+ B-клетки культивировали при 1х10⁶ клеток на лунку в 48-луночном планшете в RPMI (Hyclone, по каталогу № SH30096.01), содержащем 10% инактивированную нагреванием эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG (FBS, Invitrogen, по каталогу № 16250-078), 1% антибиотики (Hyclone, по каталогу № SV30010), 1% пируват натрия (Hyclone, по каталогу № SH30239.01) и 1% L-глутамин (Hyclone, по каталогу № SH30034.01). Выделенные B-клетки активировали с выбором для индукции пролиферации и продукции антител средств, стимулирующих поликлональные B-клетки.

2. Опосредованная EBV иммортализация IgG+ B-клеток.

4,5х10⁶ активированных CD22+ B-клеток отмывали и в течение 15 мин при 4°C инкубировали с 40 мкл конъюгированных с FITC антител к IgM (BD Biosciences, по каталогу № 555782), 40 мкл конъюгированных с FITC антител к IgD (BD Biosciences, по каталогу № 555778) и 4 мкл конъюгированных с FITC антител к IgA (Jacksons Imraunoresearch, по каталогу № 309-096-043). Клетки однократно отмывали в PBS (содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) и ресуспендировали в 90 мкл того же буфера.. Содержание IgG+ В-клеток обогащали посредством отрицательной селекции экспрессирующих IgM, IgD, IgA клеток с использованием 10 мкл магнитных гранул с антителами к FITC (Miltenyi, по каталогу № 130-048-701) и колонок LS (Miltenyi, по каталогу № 130-042-401) по инструкциям производителя.

Тотальную иммортализацию B-клеток проводили посредством инкубации 1,87х10⁶ B-клеток, обогащенных IgG+ CD22+ клетками, с 0,5 мл супернатанта EBV (50% об./об. в RMPI-1640 с 10% ЭТС, по каталогу № ATCC VR-1492 из клеток В95-8) в течение 16 ч. После инфекции клетки отмывали и в течение дополнительных 9 суток культивировали (10⁶/мл в каждой из двух лунок в RPMI (Hyclone, по каталогу № SH30096.01), содержащей 10% инактивированную нагреванием эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG (Invitrogen, по каталогу № 16250-078), 1% антибиотики (Hyclone, по каталогу № SV30010), 1% пируват натрия (Hyclone, по каталогу № SH30239.01) и 1% L-глутамин (Hyclone, по каталогу № SH30034.01), 200 МЕ/мл rhIL-2 (R&D Systems #202-IL-50) с 0,5х10⁶ облученных фидерных клеток на лунку 24-луночного планшета.

3. Клонирование B-клеток.

а. Получение облученных, обедненных, B-клетками фидерных клеток для клонирования B-клеток.

Облученные, обедненные B-клетками фидерные клетки использовали для помощи в поддержании роста трансформированных EBV B-клеток. Из смеси, полученной у 3 здоровых доноров, облученной 3250 рад (в UCSD Moore's Cancer Center) и обедненной B-клетками с использованием магнитных гранул с антителами к CD19 (Miltenyi Biotec, по каталогу № 130-050-301) и колонок LD (Miltenyi Biotec, по каталогу № 130-091-509) посредством разделения на фиколле получали РВМС. В кратком изложении, замороженные и облученные РМВС, полученные посредством разделения на фиколле, размораживали, дважды отмывали и подсчитывали. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и отбирали супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в 80 мкл буфера MACS (PBS с 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) на каждые 10⁷ клеток и добавляли 20 мкл CD19 MicroBeads (на каждые 10⁷ клеток). После тщательного смешивания клетки инкубировали при 4°C в течение 15 мин. Затем клетки отмывали, добавляя

- 104 027835

1-2 мл буфера (на каждые 10⁷ клеток) с последующим центрифугированием при 300 g в течение 10 мин и отбирали супернатант. Затем ресуспендировали до 10⁸ клеток в 500 мкл буфера. Проводили магнитное разделение, помещая колонку LD (заполненную ферромагнитными сферами, покрытыми пластиковой оболочкой, обеспечивающими быстрое и осторожное разделение клеток) в магнитном поле сепаратора MACS. Колонку LD промывали 2 мл буфера и сверху колонки наносили клеточную суспензию. После добавления 2x1 мл буфера собирали клетки, не являющиеся B-клетками, по мере их прохождения через колонку.

b. Клонирование B-клеток.

Приблизительно 20 трансформированных EBV B-клеток в 96-луночном планшете в течение 13 суток культивировали совместно со средством, стимулирующим поликлональные B-клетки, и 50000 облученных, обедненных B-клетками фидерных клеток на лунку. Всего получали 120 96-луночных планшетов.

5. Скрининг супернатанта B-клеток на связывание белка F PCB.

Супернатанты из каждой лунки переносили в новый 96-луный планшет и клетки однократно отмывали в PBS и замораживали при -80°C в 100 мкл буфера RLT (Qiagen, по каталогу № 79216), содержащего 10 мкл/мл 2-меркаптоэтанола. Для определения того, в каких лунках происходит продукция антител, способных к связыванию с белком F PCB, супернатант использовали в ELISA. В кратком изложении, ELISA проводили следующим образом: (1) планшеты ELISA с белком F PCB получали, как описано в примере 1 с использованием половины лунки 96-луночных планшетов со следующими модификациями: в качестве антитела для захвата белка F PCB использовали mAb к PCB (клон 2F7, асцитная жидкость мыши, по каталогу № ab43812, Abeam) и белок F PCB инкубировали с захватывающим антителом в течение ночи при 4°C. (2) 10 мкл супернатанта B-клеток из каждой из 2 лунок (всего объединяли 20 мкл) добавляли в половину лунок 96-луночного планшета для ELISA и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C. В качестве положительного контроля использовали плазму доноров из банка крови (собранную и замороженную после разделения B-клеток в фиколле-гиппаке, разбавленную 1:1000). (3) Планшеты четырежды отмывали, как описано выше, и в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгированных с HRP антител козы к Fc IgG человека (разбавленных 1:1000 в PBS с 0,05% Твин-20) и планшет инкубировали при 37°C в течение 1 ч. (4) Планшеты 6 раз отмывали, как описано выше, и проявляли с использованием 50 мкл 1:1 об./об. раствора субстрата ТМВ:пероксид водорода (Pierce, по каталогу № 34021) и позволяли развиваться окрашиванию в течение 7 минут. Реакцию немедленно останавливали добавлением 50 мкл 2н. H₂SO₄ и посредством планшетного спектрофотометра для ELISA измеряли оптическую плотность при 450 нМ. Положительным связыванием считали OD₄₅₀ более 0,5 (0,5-0,9 - умеренное связывание, больше 1 - сильное связывание) и ответ выше фона в 3 раза.

Для определения того, какой супернатант из двух объединенных лунок содержит антитела к PCB, 20 мкл супернатанта B-клеток (разбавленного PBS/0,05% Твин-20 1:2 об./об.) из каждой лунки повторно тестировали отдельно с захваченным на планшетах белком F PCB.

Всего на связывание с лизатом F PCB (очищаемым в примере 1) скринингу подвергали 18 планшетов (или 1080 лунок). Шесть лунок идентифицировали как связывающие лизат F PCB. Пять из шести лунок повторно подтверждали посредством дополнительного ELISA и использовали для получения антител к PCB посредством ПЦР (описано ниже).

В. Получение и клонирование трансформированных EBV В-клеток и скрининг на связывание белка F PCB (способ В).

Мононуклеарные клетки периферической крови (РМВС) получали из банка крови доноров СанДиего. РВМС выделяли по плотности центрифугированиемна фиколле-гиппаке по инструкциям производителя.

1. Выделение CD22+ и активация CD22+ B-клеток.

Из РВМС доноров с использованием магнитных гранул с антителами к CD22 выделяли 10,5x10⁶ CD22+ B-клеток и выделенные CD22+ B-клетки культивировали и активировали в 24-луночных планшетах, как описано в разделе А.1. выше.

2. Опосредованная EBV иммортализация IgG+ B-клеток. а. Выделение IgG+ B-клеток.

11,3 x10⁶ активированных CD22+ B-клеток отмывали и инкубировали со 110 мкл конъюгированных с биотином антител к IgM (BD Biosciences, по каталогу № 555781), 22 мкл конъюгированных с биотином антител к IgD (BD Biosciences, по каталогу № 555777) и 22 мкл конъюгированных с биотином антител к IgA (Invitrogen, по каталогу № 62-7440) и 220 мкл конъюгирован с биотином антител к CD3 (BD Bioscience, по каталогу № 555331) в течение 15 мин при 4°C. Клетки однократно отмывали в PBS (содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) и ресуспендировали в 1,045 мл того же буфера. Обогащение IgG+ B-клетками проводили посредством отрицательной селекции экспрессирующих IgM, IgD, IgA и CD3 клеток с использованием 55 мкл магнитных гранул с антителами к биотину (Miltenyi, по каталогу № 130-090-485) и колонок LD (Miltenyi, по каталогу № 130-042-901) по инструкциям производителя.

а. Получение облученных фидерных клеток для культивирования трансформированных EBV кле- 105 027835

ток.

Облученные фидерные клетки использовали для помощи в поддержании роста трансформированных EBV B-клеток. РВМС из смеси от 2-3 здоровых доноров получали и выделяли посредством разделения на фиколле, облучения 3300 рад (в UCSD Moore's Cancer Center) и замораживали при 5х 10⁶ клеток на флакон в FBS, содержащей 10% диметилсульфоксида (Sigma по каталогу № D2650-100). Перед использованием один флакон клеток размораживали и трехкратно отмывали RPMI (Hyclone, по каталогу № SH30096.01), содержащей 10% инактивированную нагреванием эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG (Invitrogen, по каталогу № 16250-078), 1% антибиотики (Hyclone, по каталогу № SV30010), 1% пируват натрия (Hyclone, по каталогу № SH30239.01) и 1% L-глутамин (Hyclone, по каталогу № SH30034.01). Клетки подсчитывали, ресуспендировали при 1х10⁶ клетки/мл и высевали при 0,25х10⁶ клеток на лунку 48-луночного планшета.

с. Опосредуемая EBV иммортализация.

Тотальную иммортализацию B-клеток проводили посредством инкубации 0,58х10⁶ B-клеток, обогащенных IgG+ CD22 + клетками, с 0,5 мл супернатанта EBV (50% об./об. в RMPI-1640 с 10% ЭТС, по каталогу № ATCC VR-1492 из клеток В95-8) в течение 16 ч. После инфекции клетки отмывали и культивировали (0,58х10⁶/0,5 мл в одной лунке в RPMI (Hyclone, по каталогу № SH30096.01), содержащей 10% инактивированную нагреванием эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG (Invitrogen, по каталогу № 16250-078), 1% антибиотиками (Hyclone, по каталогу № SV30010), 1% пируватом натрия (Hyclone, по каталогу № SH30239.01) и 1% L-глутамином (Hyclone, по каталогу № SH30034.01) с 0,5х10⁶ облученных фидерных клеток на лунку 48-луночного планшета. Через 48 ч, добавляли 200 МЕ/мл rhIL-2 (R&D Systems, по каталогу № 202-IL-50) и клетки культивировали в течение дополнительных 7 суток.

3. Клонирование B-клеток.

a. Получение облученных, обедненных B-клетками фидерных клеток для клонирования B-клеток.

Для клонирования B-клеток получали облученные, обедненные B-клетками фидерные клетки. Получали лейкоцитарный слой от 5-6 здоровых доноров и хранили в течение ночи при температуре окружающей среды. РВМС выделяли посредством разделения на фиколле и обедняли B-клетками с использованием магнитных гранул с антителами к CD19 (Miltenyi Biotec, по каталогу № 130-050-301) и колонок LD (Miltenyi Biotec, по каталогу № 130-042-901).

В кратком изложении, замороженные РМВС, полученные посредством разделения на фиколле, размораживали, дважды отмывали и подсчитывали. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и отбирали супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в 80 мкл буфера MACS (PBS с 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) на каждые 10⁷ клеток и добавляли 20 мкл MicroBeads к CD19 (на каждые 10⁷ клеток). После тщательного смешивания клетки инкубировали при 4°C в течение 15 мин. Затем клетки отмывали посредством добавления 1-2 мл буфера (на каждые 10⁷ клеток) с последующим центрифугированием при 300 g в течение 10 мин и отбирали супернатант. Затем до 10⁸ клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера. Магнитное разделение проводили, помещая колонку LD (заполненную ферромагнитными сферами, покрытыми пластиковой оболочкой, обеспечивающими быстрое и осторожное разделение клеток) в магнитное поле сепаратора MACS. Колонку LD отмывали 2 мл буфера и сверху колонки наносили клеточную суспензию. После добавления 2х 1 мл буфера собирали клетки, не являющиеся В-клетками, по мере их прохождения через колонку. Клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и ресуспендировали при 5х10⁶ клеток/мл в PBS, содержащем 2% эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG. Клетки облучали 4000 рад (в UCSD Moore's Cancer Center), центрифугировали при 300 g в течение 6 минут, ресуспендировали в 90% FBS с низким содержанием IgG и 10% диметилсульфоксиде (ДМСО, 25х10⁶ клетки/мл) и хранили замороженными в жидком азоте.

Перед использованием клетки размораживали и трехкратно отмывали модифицированной Исков средой Дульбекко (IMDM, Hyclone № SH30228.01), содержащей 10% инактивированную нагреванием эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG (Invitrogen, по каталогу № 16250-078), 1% антибиотики (Hyclone, по каталогу № SV30010), 1% не являющиеся незаменимыми аминокислоты (Hyclone, по каталогу № SH30238.01) и 1% L-глутамин (Hyclone, по каталогу № SH30034.01).

b. Клонирование B-клеток.

Приблизительно 100 трансформированных EBV B-клеток совместно культивировали со стимулирующими поликлональные В-клетки средствами и 50000 облученных, обедненных B-клетками фидерных клеток на лунку в 96-луночном планшет и выращивали в течение 13 суток в IMDM (Hyclone, по каталогу № SH30228.01), содержащей 10% инактивированную нагреванием эмбриональную телячью сыворотку с низким содержанием IgG (Invitrogen, по каталогу № 16250-078), 1% антибиотики (Hyclone, по каталогу № SV30010), 1% не являющиеся незаменимыми аминокислоты (Hyclone, по каталогу №SH30238.01) и 1% L-глутамин (Hyclone, по каталогу № SH30034.01). Всего получали 120 96-луночных планшетов.

5. Скрининг супернатанта B-клеток на связывание белка F PCB.

Супернатант из каждой лунки подвергали скринингу посредством ELISA для определения того, в каких лунках продуцируемые антитела способны к связыванию белка F PCB. ELISA проводили, как опи- 106 027835

сано в разделе А.5. выше в половине лунок 96-луночных планшетов для ELISA, покрытых белком F PCB (как описано в примере 1). Как описано выше, для определения того, какая из двух объединенных лунок

содержит антитела к PCB, 20 мкл супернатанта B-клеток (разведенного 1:2 об./об. PBS/0,05% Tween 20) из каждой лунки повторно тестировали отдельно с захваченным на планшетах белком F PCB.

Всего на связывание с лизатом F PCB (очищаемым в примере 1) скринингу подвергали 120 планшетов (или 7200 лунок). Двадцать девять лунок идентифицировали как связывающие лизат F PCB. Десять из двадцати пяти лунок повторно подтверждали посредством дополнительного ELISA и использовали для получения антител к PCB посредством ПЦР (описано ниже).

С. Получение антител к PCB посредством ПЦР.

После начального скрининга трансформированных EBV B-клеток для получения антител, связывающих белок F PCB, с B-клеточной РНК посредством ПЦР амплифицировали гены, кодирующие индивидуальные антитела. Для клонирования выбирали пять лунок, идентифицированных как успешные в разделе А выше. Для клонирования выбирали десять лунок, идентифицированных как успешные в разделе В выше.

1. Выделение РНК.

РНК выделяли из B-клеток (для каждой лунки, хорошо соответствующей положительному связыванию с белком F PCB) с использованием набора RNeasy Micro (Qiagen, по каталогу № 1402-2408) по инструкциям производителя со следующими модификациями: 1) B-клетки замораживали в 100 мкл буфера RLT с β-меркаптоэтанолом (10 мкл на мл буфера); 2) клетки не гомогенизировали; 3) РНК осаждали в 70% этаноле (в воде без РНКаз); и 4) обработку ДНКазой проводили "на колонке" по дополнительному протоколу производителя. РНК злюировали в конечном объеме 26 мкл.

2. Синтез первой цепи кДНК.

После выделения РНК получали кДНК по протоколу синтеза первой цепи Superscript III (Invitrogen; по каталогу № 19090-051). В кратком изложении, 8 мкл РНК (выделенной, как описано выше), 1 мкл праймера олиго-dT и 1 мкл dNTP помещали в стерильную 0,2 мл пробирку и инкубировали при 65°C в течение 5 мин с последующей инкубацией на льду в течение 1 мин. Затем, в пробирку добавляли 2 мкл 0,1 мМ DTT, 4 мкл 25 мМ MgCl2 2 мкл буфера RT, 1 мкл RNAaseOut и 1 мкл Superscript III RT и реакционную смесь инкубировали при 50°C в течение 50 мин с последующей инкубацией при 85°C в течение 15 мин. кДНК применяли сразу же или замораживали при -80°C для длительного хранения.

3. Выделение генов тяжелой цепи и легких цепей каппа и лямбда Легк IgG посредством амплификации ПЦР.

После реакции синтеза кДНК первой цепи B-клеток (см. выше) посредством амплификация ПЦР получали тяжелую цепь и легкие цепи каппа и лямбда IgG. гены легкой цепи каппа амплифицировали посредством одноэтапной ПЦР, тогда как гены тяжелой цепи и гены легкой цепи лямбда амплифицировали с использованием подхода двухэтапной вложенной ПЦР. Затем амплифицированные гены тяжелой и легких цепей связывали в одну кассету с использованием "ПЦР с перекрыванием".

Этап I. Амплификация генов тяжелой цепи и генов легкой цепи лямбда IgG.

На этапе I 2 мкл кДНК тяжелой цепи А, полученных посредством синтеза первой цепи (см. выше) применяли в качестве матрицы для индивидуальной амплификации тяжелой цепи IgG посредством ПЦР. На этом этапе, использовали набор праймеров этапа I (см. табл. 3А ниже). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР этап I: тяжелая цепь А.

Реагент мкл

Н₂О

10х буфер

10х буфер Enhancer

dNTP (10 мМ каждого)

кДНК

Набор прямых праймеров V_H (9 мкМ каждого) Набор обратных праймеров V_H (20 мкМ)

Pfx50

16

2,5

2,5

0,75

2,0

0,5

0,25

0,5

25

Альтернативно, на этапе I, 2,5 мкл кДНК тяжелой цепи В, полученных посредством синтеза первой цепи (см. выше) применяли в качестве матрицы для индивидуальной амплификации тяжелой цепи IgG посредством ПЦР. На этом этапе в качестве прямых праймеров использовали тот же набор праймеров этапа I, a в качестве обратного праймера использовали обратный праймер VH gamma-1(a/b) (см. табл. 3A ниже). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР этап I: тяжелая цепь В.

- 107 027835

Реагент	мкл
Н2О	15,5
10х буфер	2,5
10х буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
кДНК	2,5
Набор прямых праймеров VH (9 мкМ каждого)	0,5
VH-gl(a/b)-REV (20 мкМ)	0,25
Pfx50	0,5

25

На этапе I 2,5 мкл кДНК легкой цепи лямбда, полученных посредством синтеза первой цепи (см. выше) применяли в качестве матрицы для индивидуальной амплификации тяжелой цепи IgG посредством ПЦР. На этом этапе использовали набор праймеров этапа I в качестве прямых праймеров, а в качестве обратного праймера использовали pCALCL(T)-R (см. табл. 3B ниже). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР этап I: легкая цепь лямбда.

Реагент	мкл
Н2О	16
10х буфер	2,5
10х буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
кДНК	2,0
Набор νλ (14,2 мкМ каждого)	0,5
pCALCL(T)-R (20 мкМ)	0,25
Pfx50	0,5

25

В реакции ПЦР для увеличения специфичности реакции амплификация использовали подход ступенчатой ПЦР. На каждом этапе ступенчатой ПЦР температуру снижали на 1°C каждый цикл. Условия в термоциклере для ПЦР являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 10 циклов по: 94°C в течение 15 с; 62°C в течение 20 с (этап снижения температуры); 68°C в течение 1 мин;

3) 25 циклов по: 94°C в течение 15 с; 52°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

4) 68°C в течение 3 мин;

5) 4°C хранение.

Полученные реакционные смеси использовали как матричную ДНК для этапа II (см. ниже) без какой-либо дополнительной очистки.

Таблица 3A

Праймеры этапа I для амплификации геном тяжелой цепи IgG

Набор прямых праймеров Vh:	SEQ ID NO
VHla	GGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG	26
VHlb	GCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAC	27
VHlc	GGGTCTTCTGCTTGCTGGCTGTAG	28
VHld	GGATCCTCTTCTTGGTGGGAGCAG	29
VH2a	CTGACCATCCCTTCATGGCTCTTG	30

- 108 027835

VH2b	CTGACCACCCCTTCCTGGGTCTTG	31
VH3a	GCTATTTTARAAGGTGTCCAGTGT	32
VH3b	GCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT	33
VH3c	GCTATTTAAAAAGGTGTCCAATGT	34
VH4a	CTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTC	35
VH5a	CTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTC	36
Набор обратных праймеров VH:	SEQ ID NO
VH-gl-REV	ACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCC	37
VH-g2-REV	TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTG	38
VH-g3-REV	TTTGAGCTCAACTCTCTTGTCCACCTTG	39
VH-g4-REV	ATATTTGGACTCAACTCTCTTGTCCACC	40
Обратный праймер:	SEQ ID NO
VH-gl(a/b)-REV	ACAAGATTTGGGCTCAACTYTCTTGTCC	383

Таблица 3B

Праймеры этапа I для амплификации генов легкой цепи лямбда

Набор прямых праймеров:	SEQ ID NO
5’ L VA 1	GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	384
5' L νλ 2	GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG	385
5' L VA 3	GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG	386
5’ L VA 4/5	GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG	387
5' L νλ б	GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG	388
5’ L νλ 7	GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG	389
5' L νλ 8	GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG	390
Обратный праймер:	SEQ ID NO
pCALCL(T)-R	CTCCTTATTAATTAATTATGAGCATTCTGYAKGGGCM AYTGTC	80

Этап II. Амплификация генов тяжелой и легкой цепей.

На этапе II в качестве матриц для реакций второго раунда ПЦР использовали реакционные смеси

тяжелой цепи и легкой цепи лямбда после этапа I с совокупностями прямых и обратных праймеров, которые обуславливают амплификацию, начиная с области 1 каркаса каждой цепи до конца константной области (CH1 для тяжелой цепи, CL для легкой цепи).

Прямые праймеры для тяжелой цепи (см. табл. 4) конструировали, внося участок рестрикции SfiI (SEQ ID NO: 41). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР II: тяжелая цепь.

Реагент	мкл
H2O	12,75
Юх буфер	2,5
Юх буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
Этап реакции I	2,5
Набор pCAL24VH-F (2 мкМ)	2,5
Набор-Sfi CH1-R (20 мкМ)	1
Pf х50	0,5

25

Прямые праймеры для легкой цепи лямбда (см. табл. 6) конструировали, внося участок рестрикции SfiI (SEQ ID NO: 41). Условия реакции являлись следующими.

- 109 027835

ПЦР II: легкая цепь лямбда.

Реагент	мкл
Н20	15,5
10х буфер	2,5
10х буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
Этап реакции I	2,5
Набор праймеров VA (2 мкМ)	2,5
pCALCL(T)R (20 мкМ)	1
Pfx50	0,5

25

Условия в термоциклере для ПЦР для реакций этапа II являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 30 циклов по: 94°C в течение 15 с; 52°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

3) 68°C в течение 3 мин;

4) 4°C хранение.

Для амплификации генов легкой цепи каппа в качестве матрицы для индивидуальной амплификации легкой цепи каппа IgG посредством ПЦР использовали 2 мкл кДНК, полученные посредством синтеза первой цепи (см. выше). В качестве наборов праймеров использовали прямые праймеры для легкой цепи каппа (см. табл. 5) и их конструировали, внося участок рестрикции SfiI (SEQ ID NO: 41).

Условия реакции являлись следующими.

ПЦР II: легкая цепь каппа.

Реагент	мкл
Н2О	16
10х буфер	2,5
10х буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
Первая цепь кДНК	2
Набор праймеров Vk (9,1 мкМ)	0,5
pCALCK(G)L (20 мкМ)	0,25
Pfx50	0,50

25

Условия в термоциклере для ПЦР для реакций этапа II являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 35 циклов по: 94°C в течение 15 с; 54°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

3) 68°C в течение 3 мин;

4) 4°C хранение.

После амплификации продукты реакции ПЦР разделяли на 1% агарозном геле и полосы, соответствующие тяжелой цепи (675 п.н.) и легкой цепи (650 п.н.) очищали посредством выделения из геля (Qiagen Gel Extraction Kit; по каталогу № 28706). Продукты ПЦР элюировали в 30 мкл.

- 110 027835

Праймеры для амплификации генов тяжелой цепи IgG

Таблица 4

Набор прямых праймеров	SEQ ID NO
рСа130 VHla	ggc 111gc taccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTKCAGC TGGTGCAG	42
рСа130 VHlb	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTCCAGC TTGTGCAG	43
рСа130 VHlc	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCASAGGTCCAGC TGGTACAG	44
рСа130 VHld	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACARATGCAGC TGGTGCAG	45
рСа130 VH2a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGATCACCT TGAAGGAG	46
рСа130 VH3a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCAGARGTGCAGC TGGTGGAG	47
рСа130 VH4a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGSTGCAGC TGCAGGAG	48
рСа130 VH4b	ggc 111gc taccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTGCAGC TACAGCAG	49
рСа130 VH5a	ggc 111gc tac egtagcgCAGGCGGCCGCAGARGTGCAGC TGGTGCAG	50
рСа130 VH6	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTACAGC TGCAGCAG	51
рСа130 VH7	ggc 111 gc t ас c gt age gCAGGCGGCCGCACAGGTS CAGC TGGTGCAA	52
Набор обратных праймеров	SEQ ID NO
VHII-glRev	TGCGGCCGGCCTGGCCGACCACAAGATTTGGGCTCAACTT TC	53
VHII-g2Rev	TGCGGCCGGCCTGGCCGACCTTTGCGCTCAACTGTCTTGT CC	54
VHII-g3Rev	TGCGGCCGGCCTGGCCGACCTTTGAGCTCAACTCTCTTGT CC	55
VHII-g4Rev	TGCGGCCGGCCTGGCCGACCATATTTGGACTCAACTCTCT TG	56

- 111 027835

Таблица 5

Праймеры для амплификации генов легкой цепи каппа

Набор прямых праймеров	SEQ ID NO
VKia	AAggcccagccggccatggccgccggtGACATCCAGATGACC CAG	57
VKlb	AAggcccagccggccatggccgccggtGACATCCAGTTGACC CAG	58
VKlc	AAggcccagccggccatggccgccggtGCCATCCGGTTGACC CAG	59
VK2a	AAggcccagccggccatggccgccggtGATATTGTGATGACY CAG	60
VK3a	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATTGTGTTGACG CAG	61
VK3b	AAggcсcagecggсcatggсcgсcggtGAAATTGTGTTGACA CAG	62
VK3C	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATAGTGATGACG CAG	63
VK4a	AAggcccagccggccatggccgccggtGACATCGTGATGACC CAG	64
VK5a	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAACGACACTCACG CAG	65
VK6a	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATTGTGCTGACT CAG	66
VK6b	AAggcccagccggccatggccgccggtGATGTTGTGATGACA CAG	67
Обратный праймер	SEQ ID NO
pCALCK (G) L	CTCCTTATTAATTAATTAGCACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT TG	68

Таблица 6

Праймеры для амплификации гена легкой цепи лямбда

Этап III. ПЦР с перекрыванием.

На этапе III ДНК участков тяжелой цепи и легкой цепи, полученные на этапе II 1) связывали в реакции с перекрытием с линкером Fab (см. табл. 7, ниже), который отжигался к 3'-концу легкой цепи и 5'концу тяжелой цепи и 2) амплифицировали с прямым и обратным праймерами Sfi (см. табл. 7, ниже), таким образом, обеспечивая амплификацию ДНК фрагмента антитела, содержащего легкую цепь-линкертяжелую цепь, размером 1200 пар оснований (п.н.).

- 112 027835

Линкер Fab каппа амплифицировали с вектора 2g12/pCAL (SEQ ID NO: 81) с использованием праймеров FabLinker-Rev или FabLinker-Rev-IT* (см. табл. 7 ниже). Условия реакции ПЦР для формирования линкера Fab каппа являлись следующими:

Линкер Fab каппа.

Реагент		мкл
Н2О		19,75
10х буфер		2,5
dNTP (10 мМ каждого)		0,75
Вектор 2gl2/pCAL (10	нг)	1
FabLinkerCK-Fwd (20	мкМ)	0,25
Обратный праймер (20	мкМ)	0,25
Pfx50		0,5

25

Линкер Fab лямбда амплифицировали с вектора 28d11/pCAL (SEQ ID NO: 1636). Условия реакции ПЦР для формирования линкера Fab каппа являлись следующими:

Линкер Fab лямбда.

Реагент

Н₂0

10х буфер

10х буфер Enhancer dNTP (10 мМ каждого)

Вектор 28dll/pCAL (10 нг) FabLinkerCA-Fwd (20 мкМ) FabLinker-Rev IT* (20 мкМ) Pfx50

мкл

35.5

5

5

1.5

1

0,5

0,5

0,5

25

Условия в термоциклере для ПЦР для формирования линкеров Fab являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 30 циклов по: 94°C в течение 15 с; 54°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

3) 68°C в течение 3 мин;

4) 4°C хранение.

Реакционную смесь после ПЦР пропускали через 1% агарозный гель и линкер 120 п.н. выделяли из геля в соответствии с протоколом Qiagen Gel Extraction. 2 мкл очищенного линкера использовали для каждой из реакций с перекрыванием.

Условия реакции ПЦР с перекрыванием являлись следующими (праймеры F/R Sfi добавляют в реакцию ПЦР после первых 15 циклов).

ПЦР III: перекрывание.

Реагент

Н₂О

10х буфер

10х буфер Enhancer dNTP (10 мМ каждого) Продукт легкой цепи Продукт тяжелой цепи Линкер

Праймеры F/R Sfi (20 мкМ) Pfx50

мкл

24.5

5

5

1.5

5

5

2

1

1

50

Условия в термоциклере для ПЦР являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 15 циклов по: 94°C в течение 15 с; 68°C в течение 1 мин; Добавление праймеров F/R Sfi (1 мкл), затем:;

3) 94°C в течение 2 мин;

- 113 027835

4) 30 циклов по: 94°C в течение 15 с; 60°C в течение 20 с; 68°C в течение 2 мин;

5) 68°C в течение 3 мин;

6) 4°C хранение.

После амплификация 10 мкл всего 50 мкл продукта реакции ПЦР с перекрыванием легкой цепилинкера-тяжелой цепи разделяли на 1% агарозном геле для определения размера, а оставшиеся 40 мкл продукта ПЦР очищали посредством набора Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen; по каталогу № 28106) в общий объем 30 мкл. В кратком изложении, в 5 объемов реакционной смеси ПЦР буфера PBI добавляют продукт ПЦР. Смесь наносили на центрифужную колонка QIA Spin и дважды отмывали буфером РЕ. Образец элюировали 30 мкл и центрифугировали в течение 1,5 мин при максимальной скорости с элюцией всех 30 мкл. типичным выходом на 50 мкл реакции с перекрыванием являлось приблизительно 1 мкг продукта перекрывания.

Таблица 7

Олигонуклеотиды для этапа III

Олигонуклеотид	SEQ ID NO
FabLinkerCKFwd	GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAATTAATTAATAA GGAG	82
FabLinkerRev	TGCGGCCGCCTGCGCTACGGTAGCAAAGCCAGCCAG TGCCAC	83
FabLinkerCXFwd	GACARTKGCCCMTRCAGAATGCTCATAATTAATTAA TAAGGAGGATATAATTATGAAAAAG	392
FabLinkerRev-IT*	TGCGGCCGCCTACGCTACGGTAGCAAAGCCAGCCAG TGCCAC	393
Прямой Sfi	TCGCggcccagccggccatggc	84
Обратный Sfi	TGCGGCCGGCCTGGCCGA	85

Этап IV. Расщепление Sfi и клонирование в экспрессирующие вектор pCAL или pCAL IT*.

После реакции ПЦР с перекрыванием и очистки продукта ПЦР, продукт реакции расщепляли SfiI. К

30 мкл элюата (см. выше) для расщепления добавляли следующее:

4 мкл буфера для реакции 2 (New England Biolabs)

0,4 мкл BSA

1,6 мкл фермента Sfil (New England Biolabs)

4 мкл H₂O

40 мкл общий объем

Реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°C. После расщепления расщепленный продукт перекрывания разделяли на 1% агарозном геле и полосу, соответствующую антителу (приблизительно 1,45 т.н.), очищали посредством выделения из геля (Qiagen, Gel Extraction Purification Kit, по каталогу № 28706). В кратком изложении, полосу геля гидролизовали 500 мкл буфера QC (Qiagen). К гидролизату добавляли 150 мкл к изопропанола и образец наносили на центрифужную колонку QiaSpin. Колонку дважды отмывали буфером РЕ (Qiagen) и образец элюировали в 30 мкл буфера ЕВ (Qiagen). Приблизительно из 1 мкг продукта ПЦР с перекрыванием получали приблизительно 15 нг/мкл гидролизованного образца.

В заключении, расщепленный продукт перекрывания лигировали в бактериальные экспрессирующие векторы pCAL (SEQ ID NO: 86) или pCAL IT* (SEQ ID NO: 394). Условия реакции лигирования являлись следующими:

расщепленные Sfil векторы pCAL или pCAL IT*

25 нг 25 нг

2 мкл

1 мкл

расщепленный продукт перекрывания

реакционный буфер для лигазы Т4

лигаза Т4 (NEB по каталогу № MC202L, 400000 Ед/мл)

доводили Н₂О до общего объема 20 мкл

Образец лигировали в течение 1 ч при комнатной температуре. 1 мкл смеси после лигирования перед проведением трансформации разбавляли в 4 мкл H2O.

Этап V. Трансформация в E.coli.

После лигирования продукт лигирования трансформировали в клетки DH5a Max Efficiency (Invitrogen; по каталогу № 18258; генотип: F-980lacZAM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 Z-thi-1 gyrA96 relA1). Кратко, 1 мкл продукта лигирования (разведение 1/5) в 50 мкл DH5a и инкубировали на льду в течение 30 мин. Трансформацию проводили посредством теплового шока при 42°C в течение 45 с с последующими 2 мин на льду. Добавляли 0,9 мл среды SOC и клеткам позволяли

- 114 027835

восстанавливаться при 37°C в течение 1 ч без перемешивания. Клетки высевали на планшеты LB с добавленным карбенициллином (100 мкг/мл) и 20 мМ глюкозой. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C.

Этап VI. Отбор отдельных колоний.

Для каждой амплификации антитела отбирали всего 88 отдельных колоний и выращивали в 1 мл Super Broth (SB), дополненной 1 карбенициллином (100 мкг/мл), в 96-луночном планшете в течение 2 ч при 37°C. Получали дочерний планшет посредством переноса 500 мкл каждой культуры в другой бактериальный планшет 96-луночного формата с 500 мкл SB, дополненных 40 мМ глюкозой (конечная концентрация 20 мМ) и 100 мкг/мл карбенициллина. Исходный или материнский планшет дополняли 500 мкл SB, дополненной 100 мкг/мл карбенициллином. Исходный планшет выращивали при 30°C в течение ночи, а дочерний планшет (содержащий глюкозу) выращивали при 37°C в течение ночи. Клеточный лизат из планшета при 30°C использовали для ELISA бактерий (см. пример 4 ниже), а культуру при 37°C на твердой среде использовали для получения мини-препаратов ДНК (Qiagen).

Заключение.

Пять лунок идентифицированных как успешные в разделе А выше, амплифицировали с использованием праймеров для легкой цепи каппа и клонировали в экспрессирующий вектор pCAL. Десять лунок, идентифицированных как успешные в разделе В выше, амплифицировали с использованием праймеров для легкой цепи каппа и клонировали в экспрессирующий вектор pCAL IT*. Одну лунку дополнительно амплифицировали с праймерами для легкой цепи лямбда и клонировали в экспрессирующий вектор pCAL IT*.

Пример 3.

Выделение фрагментов Fab антител к PCB посредством сортировки клеток.

В этом примере антитела к PCB выделяли из положительных по CD19/CD27/IgG клеток. Положительные по CD19/CD27/IgG клетки получали посредством 1) выделения B-клеток; и 2) поклеточной сортировки клеток FACS. Затем отсортированные клетки использовали для выделения РНК, служившей в качестве матрицы для получения фрагментов Fab антител in vitro.

Выделение B-клеток.

B-клетки выделяли из РВМС (полученных в банке крови анонимных доноров) с использованием набора В Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, по каталогу № 130-091-151). Набор применяют для выделения высокочистых B-клеток посредством магнитного мечения и обеднения экспрессирующими CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 и CD235a клетками (активированные B-клетки, плазматические клетки и CD5+ В-1а клетки) и клетками, не являющимися В-клетками (например, T-клетки, NK клетки, дендритные клетки, макрофаги, гранулоциты и эритроидные клетки). По протоколу производителя клетки, не являющиеся Bклетками, подвергали опосредованному магнитному мечению с использованием смеси конъюгированных с биотином моноклональных антител в качестве первичного метящего реагента (смесь биотинантитела) и моноклонального антитела к биотину, конъюгированного с микрогранулами в качестве вторичного метящего реагента (микрогранулы с антителами к биотину). Затем клетки, не являющиеся Bклетками, удаляли из истинных покоящихся B-клеток посредством магнитного разделения.

В кратком изложении, замороженные РМВС, полученные посредством разделения на фиколле, размораживали, дважды отмывали и подсчитывали. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и отбирали супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в 40 мкл буфера MACS (на каждые 10⁷ клеток) и добавляли 10 мкл смеси биотин-антитела (на каждые 10⁷ клеток). После тщательного смешивания клетки инкубировали при 4°C в течение 10 мин. После определенного периода инкубации добавляли 30 мкл буфера (на каждые 10⁷ клеток) и 20 мкл микрогранул с антителами к биотину (на каждые 10⁷ клеток). После тщательного смешивания клетки инкубировали при 4°C в течение 15 мин. Затем клетки отмывали посредством добавления 1-2 мл буфера (на каждые 10⁷ клеток) с последующим центрифугированием при 300 g в течение 10 мин и отбирали супернатант. Затем до 10⁸ клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера.

Магнитное разделение проводили, помещая колонку LS (заполненную ферромагнитными сферами, покрытыми пластиковой оболочкой для обеспечения быстрого и осторожного разделения клеток) в магнитное поле сепаратора MACS. Колонку LS отмывали 3 мл буфера и сверху колонки наносили клеточную суспензию. Немеченные B-клетки собирали по мере их прохождения через колонку после добавления 3x3 мл буфера.

Одноклеточная сортировка клеток.

В этом примере выделенные B-клетки сортировали по антигенной специфичности с использованием проточного цитометра FACSAria (BD Biosciences). Выделенные клетки являлись положительными по CD19/CD27/IgG. Антиген PCB-F метили красителем Alexa Fluor 647 по инструкциям производителя (Molecular Probes, A-20186).

В кратком изложении, аликвоты выделенных B-клеток добавляли в 16 отдельных пробирок. В четырнадцать пробирок добавляли 1x10⁵ клеток и использовали для определения параметров фотоумножителя и параметров сортировки на FACSAria. Оставшиеся 1,8x10⁶ клеток метили Alexa Fluor 647/PCB-F в

- 115 027835

конечной концентрации 20 нМ. Меченый белок добавляли в образец за 15 мин перед добавлением антител. Антитела к CD19 и CD27 использовали при разведении 1:20, тогда как антитело к IgG использовали при разведении 1:50. После добавления Alexa Fluor 647/F белка PCB и антител пробирки инкубировали на льду в течение 30 мин и затем дважды отмывали. Одноклеточную сортировку проводили с использованием проточного цитометра FACSAria (BD Biosciences). Метки включали PE-Cy5 (антитело к CD19 человека), PE-Cy7 (антитело к CD27 человека), PE (Fcg козы к IgG человека), Pacific Blue (антитело мыши к CD3 человека), FITC (антитело мыши к IgD человека, антитело мыши к IgM человека, антитело мыши к IgA человека и антитело мыши к CD14 человека), йодид пропидия и Alexa Fluor 647 (меченый белок F PCB).

Сортировку клеток проводили исключая сначала мертвые клетки, затем исключали положительные по CD3 клетки. Затем идентифицировали положительные по CD19 и CD27 клетки и в этой популяции

отбирали клетки, экспрессирующие Fey IgG. Из оставшихся клеток исключали клетки, экспрессирующие IgD, IgM и IgA. В заключение, отсортировывали положительные по CD19/CD27/IgG Fcy клетки по связыванию PCB-F и каждую положительную клетку помещали в отдельную лунку 96-луночного планшета, содержащую 2 мкл буфера для синтеза кДНК (10х буфер Superscript III, Invitrogen; 19090-051), 0,5 мкл RNaseOUT и 7,5 мкл стерильной воды. Планшеты хранили при температуре -80°C до дальнейшего использования.

Синтез первой цепи кДНК.

После сортировки кДНК получали индивидуально в каждой лунке по протоколу синтеза первой цепи Invitrogen. В кратком изложении, в каждую лунку планшета добавляли 0,5 мкл 10% NP-40, 1 мкл праймера олиго-dT и 1 мкл dNTP добавляли и планшет инкубировали при 65°C в течение 5 мин с последующей инкубацией на льду в течение 1 мин. Затем добавляли 2 мкл DTT, 4 мкл MgCl2 и 1 мкл RT Superscript III и реакционную смесь инкубировали при 50°C в течение 1 ч с последующей инкубацией при 85°C в течение 5 мин. кДНК использовали сразу или замораживали при -80°C для длительного хранения.

Амплификация тяжелой цепи и легкой каппа цепи IgG.

Затем получали тяжелую цепь и каппа легкую цепь IgG посредством четырех последовательных этапов ПЦР.

Этап 1. Амплификация.

На этапе I для индивидуальной амплификации легких цепей каппа и тяжелых цепей IgG посредством ПЦР в качестве матрицы использовали 2,5 мкл кДНК, полученной посредством синтеза первой цепи (см. выше). На этом этапе использовали набор праймеров этапа I (см. табл. 8 и 9 ниже). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР этап I.

н2о	16
10х буфер	2,5
10х буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
кДНК	2,5
Набор этапа I (20 мкМ каждого)	0,25
Обратный праймер (20 мкМ)	0,25
Pfx50	0,25

2 5 мкл

Условия в термоциклере для ПЦР являлись следующими:

1) 94°C в течение 2:00;

2) 10 циклов по: 94°C в течение 0:15; 62°C в течение 0:20 (TOUCHDOWN); 68°C в течение 1:00;

3) 40 циклов по: 94°C в течение 0:15; 52°C в течение 0:20; 68°C в течение 1:00;

4) 68°C в течение 3:00;

5) 4°C хранение.

Реакционные смеси применяли в качестве матричной ДНК для этапа II (см. ниже) без какой либо дополнительной очистки.

Таблица 8

Праймеры этапа I для амплификации легких цепей каппа

Набор прямых праймеров	SEQ ID NO
5' LVkI/2	ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	87
5' LVk3	CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	88
5' LVk4	ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG	89

- 116 027835

Обратный праймер	SEQ ID NO
VK-Rev	GCACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTG	90

Таблица 9

Праймеры этапа I для амплификации тяжелых цепей IgG

Набор прямых праймеров	SEQ ID NO
5' L-VH1	ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	91
5' L-VH3	AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG	92
5' L-VH4/6	CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG	93
5' L-VH5	CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG	94
Обратный праймер	SEQ ID NO
3' CyCHl	GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC	95

Этап II. Амплификация.

На этапе II реакционные смеси из этапа I применяли в качестве матриц для вторых реакций ПЦР с набором прямых и обратных праймеров для каждой легкой цепи или тяжелой цепи соответственно. В этих реакциях амплифицировали ДНК из области 1 каркаса каждой цепи. Прямые праймеры для легких цепей (см. табл. 10) конструировали, внося участок рестрикции SfiI (SEQ ID NO: 41). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР II: легкая цепь.

H2O	15,75
Юх буфер	2,5
10x буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
Реакционная смесь этапа I	2,5
Набор праймеров Vk (9,1 мкМ)	0,5
pCALCK(G)L (20 мкМ)	0,25
Pfx50	0,25

25 мкл

Прямые праймеры тяжелой цепи (см. табл. 11) конструировали, внося участок рестрикции SalI (SEQ ID NO: 96). Условия реакции являлись следующими.

ПЦР II: тяжелая цепь.

Н2О	14,25
Юх буфер	2,5
Юх буфер Enhancer	2,5
dNTP (10 мМ каждого)	0,75
Этап реакции I	2,5
Набор pCAL24VH-F	2
Набор Sail JH-Rev (20 мкМ)	0,25
Pfx50	0,25

2 5 мкл

Условия в термоциклере для ПЦР являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 50 циклов по: 94°C в течение 15 с; 54°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

3) 68°C в течение 3 мин;

4) 4°C хранение.

После амплификации продукты реакции ПЦР разделяли на 1% агарозном геле и полосы, соответствующую тяжелой цепи (400 п.н.) и легкой цепи (650 п.н.) очищали посредством выделения из геля (Qiagen).

- 117 027835

Таблица 10

Праймеры для амплификации легкой цепи каппа

Набор прямых праймеров	SEQ ID NO
VKla	AAggcccagccggccatggccgccggtGACATCCAGAT GACCCAG	57
VKlb	AAggcccagccggccatggccgccggtGACATCCAGTT GACCCAG	58
VKlc	AAggcccagccggccatggccgccggtGCCATCCGGTT GACCCAG	59
VK2a	AAggcccagccggccatggccgccggtGATATTGTGAT GACYCAG	60
VK3a	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATTGTGTT GACGCAG	61
VK3b	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATTGTGTT GACACAG	62
VK3c	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATAGTGAT GACGCAG	63
VK4a	AAggcccagccggccatggccgccggtGACATCGTGAT GACCCAG	64
VK5a	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAACGACACT CACGCAG	65
VK6a	AAggcccagccggccatggccgccggtGAAATTGTGCT GACTCAG	66
VK6b	AAggcccagccggccatggccgccggtGATGTTGTGAT GACACAG	67
Обратный праймер	SEQ ID NO
pCALCK (G) L	CTCCTTATTAATTAATTAGCACTCTCCCCTGTTGAAGC TCTTTG	68

Таблица 11

Праймеры для амплификации тяжелых цепей IgG

Набор прямых праймеров	SEQ ID NO
pCal30 VHla	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTKCAG CTGGTGCAG	42
pCal30 VHlb	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTCCAG CTTGTGCAG	43
pCal30 VHlc	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCASAGGTCCAG CTGGTACAG	44
pCal30 VHld	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACARATGCAG CTGGTGCAG	45
pCal30 VH2a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGATCACC TTGAAGGAG	46
pCal30 VH3a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCAGARGTGCAG CTGGTGGAG	47
pCal30 VH4a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGSTGCAG CTGCAGGAG	48
pCal30 VH4b	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTGCAG CTACAGCAG	49
pCal30 VH5a	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCAGARGTGCAG CTGGTGCAG	50
pCal30 VH6	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTACAG CTGCAGCAG	51
pCal30 VH7	ggctttgctaccgtagcgCAGGCGGCCGCACAGGTSCAG CTGGTGCAA	52
Набор обратных праймеров	SEQ ID NO
3’ SallJH 1/2/4/5	TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG	97
3' SalIJH3	TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG	98
3' SalIJH6	TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG	99

Этап III. ПЦР с перекрыванием.

На этапе III ДНК участков тяжелой цепи и легкой цепи, полученные на этапе II 1) связывали в реакции с перекрытием с линкером Fab (см. табл. 12, ниже), который отжигался к 3'-концу легкой цепи и 5'- 118 027835

концу тяжелой цепи и 2) амплифицировали с прямым праймером Sfi (см. табл. 12, ниже), который отжигался к 5'-концу легкой цепи и обратные праймеры JH (см. табл. 11, выше), который отжигался к 3'-концу тяжелой цепи, таким образом, обеспечивая амплификацию ДНК фрагмента антитела, содержащего легкую цепь-линкер-тяжелую цепь, размером 1200 пар оснований (п.н.). Условия реакции являлись следующими (линкер получали, как описано в примере 2 выше):

н₂о

10х буфер

10х буфер Enhancer dNTP (10 мМ каждого) Легкая цепь

Тяжелая цепь Линкер

Праймеры Sfi F/JH-R Pf х50

24.5

5

5

1.5 5

5

2

1

1

(2 0 мкМ)

50 мкл

Условия в термоциклере для ПЦР являлись следующими.

Перекрывание с линкером:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 15 циклов по: 94°C в течение 15 с; 68°C в течение 1 мин.

Добавление праймеров:

3) 94°C в течение 2 мин;

4) 30 циклов по: 94°C в течение 15 с; 60°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

5) 68°C в течение 3 мин;

6) 4°C хранение.

После амплификации продукт реакции ПЦР легкой цепи-линкера -тяжелой цепи разделяли на 1% агарозном геле и очищали посредством выделения из геля (Qiagen).

Этап IV. Введение области CH1.

После перекрывания амплифицированный фрагмент легкая цепь-линкер-тяжелая цепь расщепляли

Sail и лигировали в расщепленную Sail константную область тяжелой цепи 1 (область CHy1), вводя участок рестрикции SfiI на 3'-конец константной области тяжелой цепи. Условия реакции лигирования являлись следующими:

реакционного буфера для лигирования

С_Н1

2 мкл

2 мкл

5 мкл

10 мкл

1 мкл

1,2 т.н. продукт очистки из геля этапа III воды

лигазы Т4

Реакционную смесь для лигирования инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.

После лигирования полноразмерный Fab амплифицировали посредством ПЦР с прямыми и обратными праймерами SfiI (см. табл. 12, ниже), получая фрагмент 1,45 т.п.н. Условия реакции являлись следующими.

Н₂О

10х буфер

10х буфер Enhancer

dNTP (10 мМ каждого)

Реакционная смесь для лигирования Праймеры Sfi F/R (20 мкМ)

Pfx50

31.5 5

5

1.5 5

1

1

50 мкл

Условия в термоциклере для ПЦР являлись следующими:

1) 94°C в течение 2 мин;

2) 30 циклов по: 94°C в течение 15 с; 60°C в течение 20 с; 68°C в течение 1 мин;

3) 68°C в течение 3 мин;

4) 4°C хранение.

Продукт реакции представлял собой фрагмент легкой цепи и тяжелой цепи, связанных вместе в од- 119 027835

ну кассету, длиной 1,45 т.н.

Таблица 12

Олигонуклеотиды этапа III и этапа IV

Олигонуклеотид	SEQ ID NO
Линкер Fab	GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAATTAATTAATAAGG AGGatataattatgaaaaagacagctatcgcgattgca GTGGCACTGGCTGGCTTTGCTACCGTAGCGCAGGCGGC CGCA	100
Прямой праймер Sfi	TCGCggcccagccggccatggc	84
Обратный праймер Sfi	TGCGGCCGGCCTGGCCGA	85
Фрагмент Сн1	gtcgaccaaaggtccgtctgttttcccgctggctccgt cttctaaatctacctctggtggtaccgctgctctgggt tgcctggttaaagactacttcccggaaccggttaccgt ttcttggaactctggtgctctgacctctggtgttcaca ccttcccggctgttctgcagtcttctggtctgtactct ctgtcttctgttgttaccgttccgtcttcttctctggg tacccagacctacatctgcaacgttaaccacaaaccgt ctaacaccaaagttgacaagaaagttgaaccgaaatct tgcctgcgatcgcggccaggccggccgcaccatcaeca tcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacg cttctactagt	101

Этап V. Расщепление Sfi и клонирование в экспрессирующий вектор pCAL.

После реакции ПЦР с перекрыванием и очистки продукта ПЦР продукт реакции расщепляли SfiI. К

30 мкл элюата (см. выше) для расщепления добавляли следующее:

4 мкл буфера для реакции 2 (New England Biolabs)

0,4 мкл BSA

1,6 мкл фермента Sfil (New England Biolabs) 4 мкл НгО

40 мкл общий объем

Реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°C. После расщепления расщепленный продукт перекрывания разделяли на 1% агарозном геле и полосу, соответствующую антителу (приблизительно 1,45 т.н.) очищали посредством выделения из геля (Qiagen, Gel Extraction Purification Kit, по каталогу № 28706). В кратком изложении, полосу геля гидролизовали 500 мкл буфера QC (Qiagen). К гидролизату добавляли 150 мкл изопропанола и образец наносили на центрифужную колонку QiaSpin. Колонку дважды отмывали буфером PE (Qiagen) и образец элюировали в 30 мкл буфера ЕВ (Qiagen). Приблизительно из 1 мкг продукта ПЦР с перекрыванием восстанавливали приблизительно 15 нг/мкл расщепленного образца.

В заключении, расщепленный продукт перекрывания лигировали в бактериальный экспрессирующий вектор pCAL (SEQ ID NO: 86). Условия реакции лигирования являлись следующими:

25 нг расщепленного Sfil вектора pCAL

25 нг расщепленного продукта перекрывания

1 мкл лигазы Т4 (NEB по каталогу № MC202L, 400000 Ед/мл)

20 мкл общий объем

Образец лигировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Перед проведением трансформации

1 мкл смеси после лигирования разбавляли в 4 мкл H2O.

Этап VI. Трансформация в E.coli.

После лигирования продукт лигирования трансформировали в клетки DH5a Max Efficiency (Invitrogen; по каталогу № 18258; генотип: F-980lacZAM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 A-thi-1 gyrA96 relA1). В кратком изложении, 1 мкл продукта лигирования (разведение 1/5) добавляли в 50 мкл DH5a и инкубировали на льду в течение 30 мин. Трансформацию проводили посредством теплового шока при 42°C в течение 45 с с последующими 2 мин на льду. Добавляли 0,9 мл среды SOC и клеткам позволяли восстанавливаться при 37°C в течение 1 ч с перемешиванием. Клетки высевали на планшеты LB, дополненные карбенициллином (100 мкг/мл) и 20 мМ глюкозой. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C.

Этап VII. Отбор отдельных колоний.

Для каждой амплификации антитела отбирали всего 88 отдельных колоний и выращивали в 1 мл Super Broth (SB), дополненной 1 карбенициллином (100 мкг/мл), в 96-луночном планшете в течение 2 часов при 37°C. Получали дочерний планшет посредством переноса 500 мкл каждой культуры в другой

- 120 027835

бактериальный планшет 96-луночного формата с 500 мкл SB, дополненных 40 мМ глюкозой (конечная концентрация 20 мМ) и 100 мкг/мл карбенициллина. Исходный или материнский планшет дополняли 500 мкл SB, дополненной 100 мкг/мл карбенициллином. Исходный планшет выращивали при 30°C в течение ночи, а дочерний планшет (содержащий глюкозу) выращивали при 37°C в течение ночи. Клеточный лизат из планшета при 30°C использовали для ELISA бактерий (см. пример 4 ниже), а культуру при 37°C на твердой среде использовали для получения мини-препаратов ДНК (Qiagen).

Пример 4.

Связывание антитела с белком F PCB.

В этом примере фрагменты Fab антитела, полученные в примерах 2 и 3, тестировали на их способность связывать очищенный лизат F1 PCB посредством ELISA. 50 мкл лизата бактериальных клеток, 1 объем которого разбавляли в 3 объемах PBS/3% BSA/0,01% Твин-20, добавляли в лунки 96-луночного планшета для ELISA, предварительно покрытого лизатом F1 PCB (см. пример 1 выше). Планшеты инкубировали при 37°C в течение 2 ч или при 4°C в течение ночи с последующей четырехкратной отмывкой отмывочным буфером (PBS/0,05% Твин-20). В лунки добавляли 50 мкл F(ab)-HRP козы к IgG человека (Jackson Labs, по каталогу № 109-036-097), разбавленных 1:1000 в PBS/3% BSA/0,01% Твин-20, и планшеты инкубировали при 37°C в течение 1 ч. После шестикратной отмывки отмывочным буфером в лунки добавляли 50 мкл раствора ТМВ:перекись водорода 1:1 об./об. (Pierce, 34021) и позволяли развиваться окраске в течение 7 мин. Реакцию немедленно останавливали добавлением 50 мкл 2н. H₂SO₄ и с использованием планшетного спектрофотометра для ELISA измеряли оптическую плотность при 450 нМ. Положительным связыванием считали OD₄₅₀ более 0,5 (0,5-0,9 - умеренное связывание, больше 1 - сильное связывание) и ответ выше фона в 3 раза.

В дополнение к связыванию лизата F1 PCB также использовали несколько антигенов положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля связывания лизата F1 PCB использовали плазму доноров из банка крови (собранную и замороженную после разделения в фиколлегиппаке, разбавленную 1:1000). В качестве положительного контроля, для определения того, что каждый образец лизата бактериальных клеток содержит интактный Fab, для захвата интактных Fab для покрытия 96-луночного планшета для ELISA использовали антитела козы к F(ab)2 человека Affinipure (1 мкг/мл Jackson Immunoresearch 109-006-097). Эти антитела связывают только F(ab) часть антитела IgG. Экспрессию Fab детектировали с использованием антитела к НА с пероксидазой (Roche, по каталогу № 12013819001; экспрессируемые в бактериях Fab несли метку НА). В качестве отрицательного контроля связывания Fab с любым белком и в качестве положительного контроля для реакции ELISA с использованием антител мыши к актину (1,25 мкг/мл, Sigma A3853) и F(ab)-HRP козы к IgG мыши (Santa Cruz Biotech SC3697) использовали актин (1 мкг/мл, Sigma A3653). В качестве отрицательного контроля специфичности связывания с белком F PCB также включали mAb мыши к PCB (клон 2F7, из асцитной жидкости мыши, по каталогу № Ab43812, Abeam), так как это антитело использовали для связывания белка F PCB с планшетом для ELISA и, таким образом, оно присутствовало на планшете для ELISA при скрининге антител человека к PCB.

А. Связывание клеточных лизатов с Fab, полученными из трансформированных EBV B-клеток (см. пример 2, разделы А и С, легкие цепи каппа, клонированные в вектор pCAL).

Восемьдесят восемь (88) клеточных лизатов, полученных в примере 2, тестировали посредством ELISA на их способность 1) связываться с антителом к Fab и 2) связывать лизат F1 PCB. ELISA подтвердил, что 76 из 88 лизатов клеток являлись положительными на продукцию Fab, при этом 59 из 88 клеточных лизатов связывали лизат F PCB. Подтверждающий ELISA позволил выявить, что 72 из 76 лизатов клеток действительно продуцировали Fab, a 46 из исходных 59 положительных лизатов переподтверждали, как связывающие связывали лизат F PCB.

Посредством секвенирования соответствующих препаратов ДНК идентифицированы три положительных связывающих антитела. Секвенирование выявило, что они все обладают одной последовательностью, идентифицированной как Fab 58c5, которая имеет следующие легкие и тяжелые цепи:

Fab 58c5.

Легкая цепь

EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGV PSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:5)

Тяжелая цепь

QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGN TYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID N0:1)

- 121 027835

В. Связывание клеточных лизатов с Fab, полученными после одноклеточной сортировки клеток (см. пример 3).

Результаты продемонстрировали, что 64 из 88 клеточных лизатов, полученных в примере 3, связывают белок F1 PCB. Секвенированием соответствующих препаратов ДНК идентифицированы двадцать четыре положительных связывающий антитела.

Одно из положительных связывающих антител определили как Fab sc5, которое содержит следующие легкие и тяжелые цепи:

Fab sc5.

Легкая цепь

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIKNYLNWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCQQSYNNQLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS

DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:13)

Тяжелая цепь

QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCTVSGDSISGSNWWNWVRQPPGKGLEWIGEIYYRGTT

NYKSSLKGRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGGRSTFGPDYYYYMDVWGRGTTV

TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID N0:9)

С. Связывание клеточных лизатов с Fab, полученными из трансформированных EBV B-клеток (см.

пример 2, разделы В и С, легкие цепи каппа или лямбда, клонированные в вектор pCAL IT*).

Для приведенных ниже экспериментов, анализы ELISA проводили, как описано выше, со следующими модификациями: в качестве положительных контролей связывания лизата F1 PCB (рекомбинантный источник) и лизата НЕр2 (природный источник F PCB) использовали супернатант бактерий, экспрессирующих 58с5 и sc5 Fab применяли, соответственно, в разведении 1:3 в PBS, содержащем 3% BSA и 0,01% Tween20.

Fab 30D8.

Для 30D8 77 клеточных лизатов, полученных в примере 2 выше, тестировали посредством ELISA на их способность 1) связывать антитело к Fab и 2) связывать лизата F1 PCB. ELISA подтвердил, что 70 клеточных лизатов клеток являлись положительными на продукцию Fab, при этом 63 из 77 клеточных лизатов связывали лизат F PCB. Подтверждающий ELISA на 8 клонах позволил выявить, что 8 из 8 клеточных лизатов действительно продуцировали Fab, и 6 из 8 тестируемых положительных результатов переподтверждали как связывающие лизат F PCB. Три из положительных связывающих антител секвенировали, и они все содержали одно и то же антитело со следующими легкой и тяжелой цепью (30D8):

Легкая цепь

QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIP

DRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLF

PPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLT

PEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS (SEQ ID N0:395)

Тяжелая цепь

EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNT EYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID N0:396)

Fab 104E5.

Для 104Е5 88 клеточных лизатов, полученных в примере 2 выше, тестировали посредством ELISA на их способность 1) связывать антитело к Fab и 2) связывать лизата F1 PCB. ELISA подтвердил, что 15 клеточных лизатов клеток являлись положительными на продукцию Fab, при этом 4 из 88 клеточных лизатов связывали лизат F PCB. Подтверждающий ELISA на 24 клонах позволил выявить, что 10 из 24 клеточных лизатов действительно продуцировали Fab, и 7 из 24 тестируемых положительных результатов переподтверждали как связывающие лизат F PCB. Два из положительных связывающих антител секвенировали, и они содержали одно и то же антитело со следующими легкой и тяжелой цепями (104Е5):

Легкая цепь

DIQMTQS Р S S LPASVGDRVTITCRASQNIКТYLNWYQQKPGRAPKLLISAVSNLQSGV PSRFSGTGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSIPLTFGGGAKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:397)

- 122 027835

Тяжелая цепь

QVQLEQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGGTFDTYTISWVRQAPGQRLEWLGRIIPSLGET NYAHKLQGRVTITADKATSWYMDLSDLTSEDAAVYYCAFRITGPVDWVWDYGMDVWGQGTTV SVSSASSKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID N0:398)

Fab 38F10.

Для 38F10 88 клеточных лизатов, полученных в примере 2 выше, тестировали посредством ELISA на их способность 1) связывать антитело к Fab и 2) связывать лизата F1 PCB. ELISA подтвердил, что 65 клеточных лизатов клеток являлись положительными на продукцию Fab, при этом 40 из 88 клеточных лизатов связывали лизат F PCB. Подтверждающий ELISA на 16 клонах позволил выявить, что 13 из 16 клеточных лизатов действительно продуцировали Fab, и 13 из 16 тестируемых положительных результатов переподтверждали как связывающие лизат F PCB. Пять из положительных связывающих антител секвенировали, и они содержали одно и то же антитело со следующими легкой и тяжелой цепями (38F10):

Легкая цепь

DIQLTQSPPTLSASVGDRVSMTCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIQKASNLEDGV PSRFTASGFGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSGLSFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:399)

Тяжелая цепь

EVQLLESGGDWQPGKSLRLSCTASGFSITDFGIHWVRQAPGKGLEWVALISYNEVNI HYGESVRGRFTISRDIAKNTVYLQMNGLRPEDTGVYFCARDVWEDSWLSLACFQEWGQGSLW VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID N0:400)

Fab 14G3.

Для 14G3 88 клеточных лизатов, полученных в примере 2 выше, тестировали посредством ELISA на их способность 1) связывать антитело к Fab и 2) связывать лизата F1 PCB. ELISA подтвердил, что 71 клеточных лизатов клеток являлись положительными на продукцию Fab, при этом 13 из 88 клеточных лизатов связывали лизат F PCB. Подтверждающий ELISA на 16 клонах позволил выявить, что 14 из 16 клеточных лизатов действительно продуцировали Fab, и 5 из 16 тестируемых положительных результатов переподтверждали как связывающие лизат F PCB. Четыре из положительных связывающих антител секвенировали, и они содержали одно и то же антитело со следующими легкой и тяжелой цепями (14G3):

Легкая цепь

DWMTQTPLSLSVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLS YRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCMQRMEFPFTFGQGTRLDIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:401)

Тяжелая цепь

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGASISSDNHYWSWIRQPPGKGLEWIASIYYTGG TNYNPSLKSRLALSIDTSGDQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRGLFFITARPYWYFDLWGRGTLV AVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID N0:402)

Fab 90D3.

Для 90D3 88 клеточных лизатов, полученных в примере 2 выше, тестировали посредством ELISA на их способность 1) связывать антитело к Fab и 2) связывать лизата F1 PCB. ELISA подтвердил, что 80 клеточных лизатов клеток являлись положительными на продукцию Fab, при этом 2 из 88 клеточных лизатов связывали лизат F PCB. Подтверждающий ELISA на 8 клонах позволил выявить, что 7 из 16 клеточных лизатов действительно продуцировали Fab, и 3 из 8 тестируемых положительных результатов переподтверждали как связывающие лизат F PCB. Два из положительных связывающих антител секвенировали, и они содержали одно и то же антитело со следующими легкой и тяжелой цепями (90D3):

- 123 027835

Легкая цепь

AIRLTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQSISNFLNWYQQKPGRAPKLLISAASSLQGGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYISLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS

DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA

DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:403)

Тяжелая цепь

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVGSGFTLKNYEMNWVRQAPGQGLQYISYISSSGNW KYVDSVQGRFTISRDNAGNSLYLQMNNLRAEDTATYYCVRGFSIDKYDSSVDEYWGQGIAVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID N0:404)

D. Дополнительные антитела к PCB.

Выделяли три дополнительных антитела, Fab 56E11, 17С9 и 69F6, как описано в пример 2, разделов В и С выше, амплифицировали с использованием праймеров для легких цепей каппа или лямбда. Последовательности тяжелых и легких цепей приведены ниже.

Fab 56E11.

Легкая цепь

QAVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPRLIISEVTKRPS

GVPGRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSRHWFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL

FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSL

TPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPAECS (SEQ ID N0:453)

Тяжелая цепь

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGVSINSNNYFWAWIRQPPGKGLEWIGNIYYGGS THYNASLQSRVTISVDTSKSQFSLKLNSVTSADTAVYYCAASESIFWDYYYGLDVWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID N0:452)

Fab 17C9.

Легкая цепь

EIVLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQNINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYFCQQANSFPRTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:455)

Тяжелая цепь

QVQLQQWGAGLVRPSETLSLTCAVYGDSFNDYFWTWIRQTPGKGLEWIGEISHSGSTN YSPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSAVTAADTTVYFCARGVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMD VWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID N0:454)

Fab 69F6.

Легкая цепь

EIVLTQS PSSLSASVGDRVTIS CQASQDISNYLNWYQQKPGKAPRLLIYDASYLDTGV PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYDDLRGGFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:457)

Тяжелая цепь

QMQLVQSGAEVRKPGESLKIACKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEWLGIIFPNDSDA TYSPSFQGQVTMSVDKSISTAYLQWNSLKASDTAVYFCARQYYLGSFESWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID N0:456)

Домены антител и области CDR выделенных Fab предоставлены в табл. 13A-13C ниже.

- 124 027835

Таблица 13A

Домены антител и области CDR V_H выделенных Fab

АЬ	Тяжелая цепь	CDR1 домена Vh	VH	CDR2 VH	CDR3 VH
58с5	SEQ ID N0:1	Аминокислоты 1125 SEQ ID N0:1	GASINSDNYYWT (SEQ ID N0:2}	HISYTGNTYYTPSLKS (SEQ ID N0:3)	CGAYVLISNCGWFDS (SEQ ID N0:4)
SC5	SEQ ID N0:9	Аминокислоты 1125 SEQ ID N0:9	GDSISGSNWWN (SEQ ID N0:10)	EIYYRGTTNYKSSLKG (SEQ ID N0:11)	GGRSTFGPDYYYYMDV (SEQ ID N0:12)
3 0D8	SEQ ID N0:396	Аминокислоты 1121 SEQ ID N0:396	GFTFSGHTIA (SEQ ID N0:405)	WVSTNNGNTEYAQKIQG (SEQ ID N0:406)	EWLVMGGFAFDH (SEQ ID N0:407)
104Е5	SEQ ID N0:398	Аминокислоты 1125 SEQ ID N0:398	GGTFDTYTIS (SEQ ID N0:411)	RIIPSLGETNYAHKLQG (SEQ ID N0:412)	RITGPVDWVWDYGMDV (SEQ ID N0:413)
38F10	SEQ ID N0:400	Аминокислоты 1124 SEQ ID N0:400	GFSITDFGIH (SEQ ID N0:417)	LISYNEVNIHYGESVRG (SEQ ID N0:418)	DVWEDSWLSLACFQE (SEQ ID N0:419)
14G3	SEQ ID N0:402	Аминокислоты 1125 SEQ ID N0:402	GASISSDNHYWS (SEQ ID N0:423)	SIYYTGGTNYNPSLKS (SEQ ID N0:424)	GLFFITARPYWYFDL (SEQ ID N0:425)
90D3	SEQ ID N0:404	Аминокислоты 1123 SEQ ID N0:404	GFTLKNYEMN (SEQ ID N0:429)	YIS S SGNWKYVDSVQG (SEQ ID N0:430)	GFSIDKYDSSVDEY (SEQ ID N0:431)
56Е11	SEQ ID N0:452	Аминокислоты 1124 SEQ ID N0:452	GVSINSNNYFWA (SEQ ID N0:458)	NIYYGGSTHYNASLQS (SEQ ID N0:459)	SESIFWDYYYGLDV (SEQ ID N0:460)
17С9	SEQ ID N0:454	Аминокислоты 1133 SEQ ID N0:454	GDSFNDYFWT (SEQ ID N0:464)	EISHSGSTNYSPSLKS (SEQ ID N0:465)	GVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGM DV (SEQ ID N0:466)
69F6	SEQ ID N0:456	/Аминокислоты 1118 SEQ ID N0:456	GYSFTSYWIA (SEQ ID N0:470)	IIFPNDSDATYSPSFQG (SEQ ID N0:471)	QYYLGSFES (SEQ ID N0:472)

Таблица 13B

Домены антител и области V_L CDR выделенных Fab

Ab	Легкая цепь	CDR1 домена VL	vL	CDR2 VL	CDR3 VL
58c5	SEQ ID N0:5	Аминокислоты 1107 SEQ ID N0:5	QASQDISTYLN (SEQ ID N0:6)	GASNLET (SEQ ID N0:7)	QQYQYLPYT (SEQ ID N0:8)
sc5	SEQ ID N0:13	Аминокислоты 1107 SEQ ID N0:13	RASQNIKNYLN (SEQ ID N0:14)	AASTLQS (SEQ ID N0:15)	QQSYNNQLT (SEQ ID N0:16)
30D8	SEQ ID N0:395	Аминокислоты 1110 SEQ ID N0:395	GANNIGSQNVH (SEQ ID N0:408)	DDRDRPS (SEQ ID N0:409)	QVWDSSRDQAVI (SEQ ID N0:410)
104E5	SEQ ID N0:397	Аминокислоты 1107 SEQ ID N0:397	RASQNIKTYLN (SEQ ID N0:414)	AVSNLQS (SEQ ID N0:415)	QQSFSIPLT (SEQ ID N0:416)
38F10	SEQ ID N0:399	/Аминокислоты 1 108 SEQ ID N0:399	RASQSISNWLA (SEQ ID N0:420)	KASNLED (SEQ ID N0:421)	QQYNSYSGLS (SEQ ID N0:422)
14G3	SEQ ID N0:401	/Аминокислоты 1113 SEQ ID N0:401	RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID N0:426)	TLSYRAS (SEQ ID N0:427)	MQRMEFPFT (SEQ ID N0:428)
90D3	SEQ ID N0:403	Аминокислоты 1107 SEQ ID N0:403	RASQSISNFLN (SEQ ID N0:432)	AASSLQG (SEQ ID N0:433)	QQTYISLYT (SEQ ID N0:434)
56E11	SEQ ID N0:453	Аминокислоты 1111 SEQ ID N0:453	TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID N0:461)	EVTKRPS (SEQ ID N0:462)	SSYAGSRHW (SEQ ID N0:463)
17C9	SEQ ID N0:455	Аминокислоты 1107 SEQ ID N0:455	RASQNINTWLA (SEQ ID N0:467)	AASFLQS (SEQ ID N0:468)	QQANSFPRT (SEQ ID N0:469)
69F6	SEQ ID N0:457	/Аминокислоты 1109 SEQ ID N0:457	QASDISNYLN (SEQ ID N0:473)	DASYLDT (SEQ ID N0:474)	QQYDDLRGGFT (SEQ ID N0:475)

Таблица 13C

Тяжелая цепь CDR1 (нумерация по Rabat)

Ab	CDR1 Vh	Ab	CDR1 VH
58C5	SDNYYWT (SEQ ID N0:435}	14G3	SDNHYWS (SEQ ID N0:440)
SC5	GSNWWN (SEQ ID N0:436)	90D3	NYEMN (SEQ ID N0:441)
3 0D8	GHTIA (SEQ ID N0:437)	56E11	SNNYFWA (SEQ ID N0:482)
104E5	TYTIS (SEQ ID N0:438)	17C9	DYFWT (SEQ ID N0:483)
38F10	DFGIH (SEQ ID N0:439)	69F6	SYWIA (SEQ ID N0:484)

Пример 5.

Экспрессия и очистка выделенных Fab.

В этом примере отдельные фрагменты антител Fab, которые определяли как связывающие лизат F PCB посредством ELISA с использованием клеточного лизата, экспрессировали и очищали из бактериальных клеток с использованием колоночной хроматографии.

ДНК, кодирующую каждый фрагмент антитела Fab, трансформировали в клетки Top10 (Invitrogen) для экспрессии. Бактерии, экспрессирующие каждое антитело Fab, выращивали в 2 л SB при 37°C до

- 125 027835

OD600 0,8. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и позволяли ей проводить в течение ночи при 30°C. После экспрессии бактериальную культуру центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с ингибиторами протеаз (полная смесь ингибиторов протеаз, Santa Cruz Biotech, по каталогу № SC-29131). К ресуспендированным клеткам добавляли лизоцим (0,2 мг) и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Клетки лизировали посредством двух циклов замораживания/размораживания. В кратком изложении, ресуспендированные бактериальные клетки замораживали в бане этанол/сухой лед с последующим размораживанием при 37°C в водяной бане. После лизиса бактериальный лизат центрифугировали при 18000 об/мин и супернатант фильтровали и стерилизовали, пропуская через фильтр с порами 0,4 мкм.

Затем каждый отдельный фрагмент антитела Fab очищали посредством аффинной хроматографии на колонке. В кратком изложении, фильтрованный супернатант медленно пропускали через колонку с антителами к Fab/белком А, позволяя связываться белку Fab. После отмывки 50 мл PBS связанный Fab элюировали 9 мл 0,2 М глицина, pH 2,2 и собирали в конические пробирки, содержащие 1 мл 2М Трис, таким образом, нейтрализуя элюируемый белок. Затем элюированный Fab диализовали с использованием диализных кассет с MWCO 10 кДа (Pierce) против 4 л PBS. Белок хранили при 4°C в течение ночи, а затем концентрировали до объема 1 мл с использованием фильтров 10 кДа Amicon Ultra Filter (Millipore). Связывание каждого очищенного фрагмента антитела Fab с лизатом F PCB (рекомбинантный источник, пример 1А) и лизатом НЕр2 (природный источник, пример 1В) переподтверждали посредством ELISA (см. пример 4). Кроме того, каждый очищенный фрагмент Fab с использованием анализа, описанного в примере 6, тестировали на способность нейтрализовать PCB.

Связывание Fab 58с5 и sc5 с лизатом F PCB и очищенным белком F PCB.

Посредством ELISA измеряли связывание антител 58С5 и sc5 с захваченным белком F PCB из трансфицированных клеток 293 (рекомбинантным) или очищенным белком F PCB из инфицированных А2 PCB клеток Нер2 (природным). Результаты демонстрируют, что Fab 58c5 и Fab sc5 зависимо от дозы связывают белок F PCB (рекомбинантный), но только sc5 распознает очищенный белок F (природный) (см. табл. 14-15 ниже).

Таблица 14

Связывание Fab sc5 и 58с5 с захваченным лизатом F РСВ (рекомбинантным)

Fab [мкг/мл]	sc5	58с5
2	2,963	2,9165
0,4	2,827	2,9705
0,08	2,151	2,518
0,016	0,651	1,433
0,0032	0,3205	0,5905
0,00064	0,284	0,415
0,000128	0,337	0,3785
0,0000256	0,22	0,2485

Таблица 15

Связывание Fab sc5 и 58с5 с очищенным белком F РСВ (природным)

Fab [мкг/мл]	sc5	58с5
2	2,623	0,417
0,4	2,704	0,2665
0,08	2,744	0,1505
0,016	2,66	0,098
0,0032	1,7685	0,0805
0,00064	0,6035	0,087
0,000128	0,2325	0,1065
0,0000256	0,1445	0,13

Связывание Fab 30D8, 104Е5, 38F10, 90D3 и 14G3 с лизатом F PCB и очищенным белком F PCB. Рассчитанные EC₅₀ для связывания Fab 30D8, 104Е5, 38F10, 90D3 и 14G3 указаны в табл. 16 ниже.

Fab 30D8 и 14G3 связывают лизат F1 PCB (рекомбинантный) при EC50 приблизительно 5 нМ (3,8 и 8,2 нМ соответственно). Fab 104E5 и 90D3 связывают природный белок F штамма А2 PCB при EC50 приблизительно 80 пМ при Fab 38F10, связывающем природный белок F штамма А2 PCB при EC50 177 пМ.

- 126 027835

Таблица 16a

Рассчитанные ЕС₅₀ для Fab 30D8, 104Е5, 38F10, 90D3 и 14G3

Очищенный Fab	ЕС50	Источник антигена
30D8	3,8 нМ	Лизат FI РСВ (рекомбинантный)
104Е5	80 пМ	Лизат НЕр2 (природный)
38F10	177 пМ	Лизат НЕр2 (природный)
90D3	72 пМ	Лизат НЕр2 (природный)
14G3	8,2 нМ	Лизат F1 РСВ (рекомбинантный)

Связывание Fab 56E11, 17С9 и 69F6 с очищенным белком F PCB.

Рассчитанные EC₅₀ для связывания Fab 56E11, 17С9 и 69F6 приведены в табл. 16 ниже. Fab 56E11

связывает лизат F1 PCB (рекомбинантный) с EC₅₀ 545 пМ. Fab 17C9 и 69F6 связывают лизат F1 PCB (рекомбинантный) с EC50 136 и 135 пМ соответственно.

Таблица 16b

Рассчитанные ЕС₅₀ для Fab 30D8, 104Е5, 38F10, 90D3 и 14G3

Очищенный Fab	ЕС50	Источник антиген
56Е11	54 5 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
17С9	136 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
69F6	135 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)

Пример 6.

Анализ нейтрализации PCB.

В этом примере антитела к PCB анализировали на их способность связывать и нейтрализовать вирус PCB в растворе, оцениваемую посредством анализа подавления бляшкообразования. В этом эксперименте в отсутствие клеток-мишеней предварительно инкубировали вирус PCB и антитела. Затем смесь добавляли в клетки и вирусную инфекцию определяли посредством анализа бляшкообразования, описанного в настоящем документе. Антитела к PCB анализировали на их способность нейтрализовать несколько штаммов вируса PCB, включая А2 PCB (ATCC VR-1540), B-wash PCB (ATCC VR-1580, штамм 18537) и В-1 PCB (по каталогу № ATCC 1400).

В качестве клеток-хозяев для инфекции использовали клетки Vero (ATCC, CCL-81; Manassas, VA). Клетки Vero выращивали в DMEM (Hyclone, SH30285.01) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой

(FBS) (Hyclone, SH30070.03) с добавлением 1% L-глутамина (Hyclone, SH30034.01) и 1% пенициллинастрептомицина (Hyclone, SV30010). Клетки Vero культивировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO2 и пересевали два раза в неделю.

На сутки 1 эксперимента клетки Vero культивировали в 24-луночных планшетах для клеточных культур. Клетки высевали при плотности (приблизительно 1х10⁶ клеток на лунку), позволяющей на 2 сутки формировать монослой клеток (больше 90% конфлуэнтности). На сутки 2 каждое антитела серийно разводили в простой минимальной среде Игла (ЕМЕМ, ATCC, по каталогу № 30-2003) (конечная концентрация антител: 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032 и 0,006 мкг/мл). Вирус PCB также разводили в простой ЕМЕМ с концентрацией 2х10³ БОЕ/мл (100 БОЕ/50 мкл) и к 110 мкл каждого разведенного раствора антител добавляли 110 мкл разбавленного вируса PCB и перемешивали посредством пипетирования. Для контрольного образца вируса к 110 мкл простой ЕМЕМ добавляли 110 мкл разбавленного вируса PCB. Смесь антитело-вируса или смесь контроля вируса инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После инкубации из 24луночных планшетов для клеточных культур, содержащих клетки-хозяева Vero проводили декантирование и в каждую лунку переносили 100 мкл преинкубированной смеси вирус-антитело или контроля вируса. Каждый тестовый и контрольный образцы получали в трех повторениях. Затем клетки инкубировали при 37°C в течение одного часа, перемешивая каждые 15 мин.

После инкубационного периода питательную среду, содержащую смесь вирус-антитело или контроля вируса, отбирали и в каждую лунку добавляли 1 мл покровной среды (покровная среда содержала ЕМЕМ, 2% FBS, 1% L-глутамин, 0,75% метилцеллюлозу). Затем 24-луночные планшеты для клеточных культур инкубировали при 37°C (с 5% CO2) в течение приблизительно 72 ч. Планшеты для клеток фиксировали в 10% формалином в течение 1 ч при комнатной температуре, отмывали 10 раз бидистиллированной H2O и блокировали 5% сухим обезжиренным молоком (NFDM) в PBS с 0,05% Твин-20 при 37°C в течение 1 ч.

После инкубации блокирующий раствор декантировали и в каждую лунку добавляли 200 мкл антитела мыши к PCB (ab10018, Abcam, разведения 1:1000 в 5% NFDM). Планшеты инкубировали при 37°C в течение 2 ч, 10 раз отмывали бидистиллированной H2O и в каждую лунку добавляли 200 мкл IgG козы к антителам мыши, конъюгированного с HRP (Pierce, по каталогу № 31432, разведение 1:1000 в 5% NFDM). Планшеты инкубировали при 37°C в течение 2 ч. Планшеты 10 раз отмывали бидистиллированной H₂O и в каждую лунку добавляли 200 мкл субстрата пероксидазы TrueBlue™ (KPL, по каталогу №

- 127 027835

50-78-02). В планшетах позволяли развиваться окраске в течение 10 мин при комнатной температуре. Планшеты дважды отмывали бидистиллированной H2O и сушили на бумажной салфетке и подсчитывали количество синих бляшек. ED50 (эффективное разведение для 50% нейтрализации) рассчитывали с использованием Prism (GraphPad). Степень подавления бляшкообразования рассчитывали по следующей формуле:

Степень подавления бляшкообразования (в процентах)=(1-среднее количество бляшек в каждом

разведении антитела/среднее количество бляшек в контрольных лунках с вирусом)х 100

Данные приведены в табл. 17-19 ниже. В табл. 17 приведены ED50 для каждого Fab для различных

штаммов PCB. В Таблице 18 приведены количества бляшек для различных штаммов PCB и различных концентраций Fab 58c5. В табл. 19 приведена степень подавления бляшкообразования для Fab 58c5. В табл. 20 приведена степень подавления бляшкообразования для Fab 56E11, 17С9, 69F6 и 30D8 для А2 PCB. Результаты демонстрируют, что Fab 58с5 и 30D8 способны к нейтрализации всех 3 штаммов PCB, тогда как Fab sc5 нейтрализует только А2 PCB и В-1 PCB, хотя и при гораздо более высокой концентрации антител. На основании данных, полученных в анализе нейтрализации, и молекулярной массы фрагмента Fab (приблизительно 50 кДа), EC50 для Fab58c5 для нейтрализации А2 PCB in vitro приблизительно составляет 320 пМ, тогда как ED₅₀ Fab 30D8 для нейтрализации А2 PCB in vitro приблизительно в 3 раза ниже (107 пМ). Fab 30D8 является более эффективным против В-1 PCB и B/wash PCB, чем Fab 58c5.

Таблица 17

Данные ЕР₅₀ Нейтрализации Fab

Антиген	А2 РСВ	В-1 РСВ	B/wash РСВ
58с5	320 пМ (0,016 мкг/мл)	840 пМ (0,042 мкг/мл)	500 пМ (0,025 мкг/мл)
SC5	0,016 мкМ (0,8 мкг/мл)	0,042 мкМ (2,1 мкг/мл)	>0,2 мкМ (>10 мкг/мл)
3 0D8	107 пМ (5,35 нг/мл)	51 пМ (2,55 нг/мл)	112 пМ (5,6 нг/мл)
104Е5	580 пМ (29 нг/мл)	н. о.	н. о.
38F10	800 пМ (40 нг/мл)	н. о.	Н. О.
14G3	3400 пМ (172 нг/мл)	н. о.	н. о.
90D3	800 пМ (40 нг/мл)	560 пМ (28 мг/мл)	660 пМ (33 нг/мл)
56Е11	930 пМ (46,5 нг/мл)	н. о.	н. о.
17С9	352 пМ (17,6 нг/мл)	н. о.	н. о.
69F6	260 пМ (13 нг/мл)	н. о.	н. о.

н.о. не определяли.

Таблица 18

Среднее количество бляшек для нейтрализации Fab 58с5

Антиген	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0 мкг/мл
А2 РСВ	0	0	0	5,7	28,7	52,3	57,7
B/wash РСВ	1,3	0,7	0	5	16,3	23,3	26,3
В-1 РСВ	0,3	0	0	4,7	8,7	11,7	12,3

Таблица 19

Степень подавления бляшкообразования (%) для нейтрализации Fab 58с5

Антиген	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0 мкг/мл
А2 РСВ	100	100	100	90	50	9,4	0
B/wash РСВ	95	97	100	81	38	11	0
В-1 РСВ	97,6	100	100	62	29	5	0

- 128 027835

Таблица 20

Степень подавления бляшкообразования (%) для нейтрализации Fab 56Е11, 17С9 и 69F6 для А2 РСВ

Антитело	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,0032 мкг/мл	0,00064 мкг/мл
56Е11	100	100	98,5	65,98	20,8	0	—
17С9	100	100	99,9	91,2	46,7	3,4	...
69F6	99,7	99,8	99,6	97,5	63,0	2,3	...
30D8	100	100	100	96,1	60,7	31,5	0,8

* 30D8 применяли в качестве положительного контроля.

Пример 7.

Клонирование и экспрессия IgG.

В этом примере фрагменты Fab антител, продемонстрировавшие потенциал к нейтрализации PCB, преобразовывали в IgG посредством клонирования в экспрессирующий вектор млекопитающих pCALM (SEQ ID NO: 102). Получали праймеры, специфичные для каждого антитела и тяжелую и легкую цепи каждого Fab, как исходно клонировано в векторе pCAL (см. пример 2) амплифицировали посредством ПЦР. Амплификация легких цепей приводила к фрагменту 650 п.н., а амплификация тяжелой цепи приводила к фрагменту 400 п.н. Кроме того, получали линкер, обеспечивающий перекрытие тяжелой цепи и легкой цепи. Линкер также включали в стандартную константную область тяжелой цепи. Перекрытие тяжелой и легкой цепей приводило к кассете 2,1 т.н. для каждого антитела с участками рестрикции SfiI (SEQ ID NO: 41) на обоих концах. Каждую кассету расщепляли SfiI и клонировали в вектор pCALM. После подтверждения правильной последовательности в бактериях, ДНК для трансфекции млекопитающим выделяли с использованием набора Maxi Prep (Qiagen).

Для экспрессии каждого IgG каждый вектор pCALM использовали для инфицирования приблизительно 200 миллионов клеток 293F, что давало приблизительно 200 микрограмм IgG. Клетки 293F трансфицировали 293fectin (Invitrogen, по каталогу № 51-0031) и позволяли им продуцировать IgG в течение 72 ч. Через 72 ч после трансфекции собирали клеточную среду, центрифугировали для удаления клеток и стерилизовали через фильтр с фильтрующим элементом с диаметром 0,4 мкм. Очистку проводили посредством хроматограаии на колонке с использованием колонки с белком А. Фильтрованную среду, содержащую экспрессированный IgG, дважды пропускали через колонку с белком А. После отмывки 50 мл PBS IgG элюировали 9 мл 0,2 М глицина при pH 2,2 и собирали в 2 М Tris для проведения нейтрализации. Элюат подвергали диализу против 4 л PBS с использованием диализной кассеты 10 кДа (Pierce). Образец концентрировали до 1 мл с использованием 10 кДа Amicon Ultra (Millipore).

Пример 8.

Анализы связывания IgG.

В этом примере формы IgG 58c5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 56Е11, 17С9 и 69F6, полученные в примере 7 выше и антитело к PCB мотавизумаб (Wu et al. (2007), J. Mol. Biol. 368 (3):652-665) тестировали на их способность связывать лизат с белком F PCB (рекомбинантным) или с белком F PCB (природным) посредством ELISA (см. пример 4 выше). Рассчитанные EC50 для связывания (определенные посредством титрования каждого IgG) приведены в табл. 21 ниже. Форма IgG 30D8 обладала наибольшей аффинностью по сравнению с формами IgG 58с5, 104Е, 38F10, 56Е11, 17С9 и 69F6 обладая приблизительно в 10 раз меньшей аффинностью. Кроме того, форма IgG 30D8 обладала аффинностью к белку F штамма А2 PCB в приблизительно 10 раз большей, чем мотавизумаб.

Таблица 21

Связывание IgG с белком F РСВ

Антиген	IgG ЕС50 (рассчитанная)	Источник антигена
Форма IgG 58с5	24 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
Форма IgG 30D8	2,5 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
Форма IgG 104Е5	14,5 пМ	Лизат НЕр2 (природный)
Форма IgG 38F10	35 пМ	Лизат НЕр2 (природный)
Форма IgG 14G3	251 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
Форма IgG 56Е11	7 3 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
Форма IgG 17С9	59 пМ	Лизат НЕр2 (природный)
Форма IgG 69F6	63 пМ	Лизат РСВ F1 (рекомбинантный)
Мотавизумаб	27 пМ	Лизат НЕр2 (природный)

- 129 027835

Пример 9.

Анализы нейтрализации IgG PCB.

В этом примере формы IgG 58c5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 56Е11, 17С9 и 69F6, полученную в примере 7 выше и антитело к PCB мотавизумаб (Wu et al. (2007), J. Mol. Biol. 368 (3):652-665) тестировали на их способность к нейтрализации различных штаммов PCB. Кроме того, форму IgG 58c5 анализировали на ее способность нейтрализовать устойчивые к различным моноклональным антителам ускользающие мутанты PCB (MARM). MARM представляет собой мутантный штамм PCB, который уже не способны нейтрализовать антитела, которые получали против них. Таким образом, способность 58с5 нейтрализовать специфические MARM указывает, что эпитоп связывания 58с5 отличается от эпитопа связывания антитела, к которому получали MARM.

А. Нейтрализация PCB.

Формы IgG 58с5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 56Е11, 17С9 и 69F6 тестировали на их способность к нейтрализации PCB (как описано в пример 6 выше). Данные представлены в табл. 22-24 ниже. В табл. 22 приведено ED50 (эффективное разведение для 50% нейтрализации) для каждого штамма PCB. В табл. 23 приведено количество бляшек для различных штаммов PCB и при различных концентрациях антитела 58с5 в форме IgG. В табл. 24 приведен степень подавления бляшкообразования для различных штаммов PCB и при различных концентрациях антитела IgG 58c5. Результаты демонстрируют, что формы IgG 58c5, 30D8, 104Е5, 38F10, 14G3, 90D3, 56Е11 и 17С9 способны к нейтрализации всех 3 штаммов PCB, хотя и при различных концентрациях. Форма IgG 69F6 является селективной для штамма А2 PCB. На основе данных, полученных в анализе нейтрализации и молекулярной массы фрагмента IgG (приблизительно 150 кДа) ED50 формы IgG 58c5 для нейтрализации А2 PCB in vitro приблизительно составляет 133 пМ. ED50 для форм IgG 30D8 и 14G3 для нейтрализации А2 PCB in vitro составляют 89 и 106 пМ соответственно.

Сравнение нейтрализующей активности формы IgG 30D8 и антитела к PCB мотавизумаба (Wu et al. (2007), J. Mol. Biol. 368 (3): 652-665) для трех штаммов PCB показывает, что IgG 30D8 является более эффективным нейтрализующим антителом. Для штамма А2 PCB, форма IgG 30D8 демонстрирует улучшение нейтрализации (89 пМ versus 360 пМ) в 4 раза. Форма IgG 30D8 в 15 раз лучше для нейтрализации штамма В-1 PCB, чем мотавизумаб. Для штамма B/wash PCB форма IgG 30D8 демонстрирует увеличение нейтрализации в 25 раз (115 пМ в отличие от 2,9 нМ). Дополнительно показано, что форма IgG 30D8 нейтрализует штаммы Long и В/9320 PCB.

Таблица 22

Данные нейтрализации IgG (ED₅₀)

Антиген	А2 РСВ	В-1 РСВ	В/wash РСВ	Long РСВ	В/9320 РСВ
Форма IgG 58с5	133 пМ (0,02 мкг/мл)	280 пМ (0,042 мкг/мл)	193 пМ (0,029 мкг/мл)	н. о.	н. о.
Форма IgG 3 0D8	8 9 пМ (13,3 нг/мл)	55 пМ (8,3 нг/мл)	115 пМ (17,2 нг/мл)	95 пМ	85 пМ
Форма IgG 104Е5	800 пМ (122 нг/мл)	1,7 нМ (253 нг/мл)	8 нМ (1,2 мкг/мл)	н. 0.	н.о.
Форма IgG 38F10	553 пМ (83 нг/мл)	1,4 нМ (212 нг/мл)	5,3 нМ (78 9 нг/мл)	н. о.	н. о.
Форма IgG 14G3	106 пМ (16 нг/мл)	10,7 нМ (1,6 мкг/мл)	4,5 нМ (683 нг/мл)	н. о.	; Н.О.
Форма IgG 90D3	1,8 нМ (263 нг/мл)	1,4 нМ (211 нг/мл)	1,4 нМ (207 нг/мл)	н. о.	Н.О.
Форма IgG 56Е11	853 пМ	2 95 пМ	282 пМ	н. о.	Н.О.
Форма IgG 17С9	363 пМ	32 9 пМ	8 60 пМ	н. о.	н.о.
Форма IgG 69F6	225 пМ	>67 нМ	>67 нМ	н. о.	н.о.
Мотавизумаб	360 пМ	833 пМ	2,9 нМ	н. о..	н.о.

- 130 027835

Таблица 23

Среднее количество бляшек для нейтрализации формой IgG 58с5

Антиген	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0 мкг/мл
А2 РСВ	0,3	0	0,7	16,3	31	40,3	57,7
B/wash РСВ	0	0	1,3	7,7	16,3	20,7	26,3
В-1 РСВ	0	0	0,3	4	9,3	11,7	12,3

Таблица 24

Степень подавления бляшкообразования (%) для нейтрализации формой IgG 58с5

Антиген	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0 мкг/мл
А2 РСВ	99,5	100	99	72	46	30	0
B/wash РСВ	100	100	95	71	38	21	0
В-1 РСВ	100	100	97,6	67,5	24	5	0

В. Нейтрализация PCB устойчивых к моноклональным антителам ускользающих мутантов PCB.

Форму IgG 58c5 также тестировали на ее способность нейтрализовать различные устойчивые к моноклональным антителам ускользающие мутанты PCB (предоставленные Dr. James Crowe, Vanderbilt University), как описано в пример 6 выше. MARMS, перечисленные в табл. 23 ниже, получали из штамма А2 PCB дикого типа. MARM 19, полученные с Fab 19 человека (см., например, Crowe et al., Virology, 252:373-375 (1998)), содержит мутацию аминокислоты изолейцина 266 на метионин. MARM 151, полученный с mAb 151 мыши, содержит мутацию аминокислоты лизин 272 на аспарагин. MARM 1129, полученный к mAb 1129 мыши, являющийся родительским антителом для паливизумаба (синагис (SYNAGIS™)), содержит мутацию аминокислоты серина 275 на фенилаланин.

Форму IgG 58c5 также тестировали на ее способность нейтрализовать несколько устойчивых к моноклональным антителам мутантов (MARM). Данные представлены в табл. 25-26 ниже. В табл. 25 приведено количество бляшек для нейтрализации различных MARM при различных концентрациях антитела. В табл. 26 приведена степень подавления бляшкообразования для нейтрализации для различных MARM при различных концентрациях антитела. Результаты указывают, что форма IgG 58c5 способна к нейтрализации всех 3 MARM PCB. Таким образом, форма IgG 58c5 связывает эпитоп штамма А2 PCB, отличный от эпитопов Fab 19, мыши mAb 1129 и мыши mAb 151.

Таблица 25

Среднее количество бляшек для нейтрализации формой IgG 58с5 MARM РСВ

MARM	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0 мкг/мл
MARM 19	0,7	16,7	72	89,3	135	143	156
MARM 151	0	15,3	64,7	112	128	151	151
MARM 1129	0	0	2,3	5,7	11,7	17,7	22,3

Таблица 26

Степень подавления бляшкообразования для нейтрализации формой IgG 58с5 РСВ MARM

MARM	10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0 мкг/мл
MARM 19	100	89	53,8	42,7	14	8	0
MARM 151	100	90	57	26	15	0	0
MARM 1129	100	100	90	74	47	21	0

Пример 10.

Анализы конкуренции.

В этом примере проводили анализы конкуренции, в которых тестировали способность Fab 58c5, 30D8, 56Е11, 17С9 и 69F6 конкурировать с IgG мотавизумабом (Wu et al. (2007), J. Mol. Biol. 368 (3):652665) за связывание с белком F PCB. Fab 58c5 и 30D8 дополнительно тестировали на их способность конкурировать с формами IgG 17C9 и 69F6 за связывание с рекомбинантным белком F PCB. Fab 56E11, 17С9 и 69F6 дополнительно тестировали на их способность to конкурировать с формами IgG 58c5 и 30D8 за

- 131 027835

связывание с рекомбинантным белком F PCB. В качестве положительных контролей для конкуренции, формы IgG различных антител тестировали на их способность конкурировать с соответствующими формами Fab тех же антител.

Планшеты для ELISA получали, как описано выше в примере 1, с использованием рекомбинантного или природного белка F штамма А2 PCB. Планшеты блокировали 4% обезжиренным сухим молоком в

1xPBS в течение 2 ч при 37°C с последующей четырехкратной отмывкой отмывочным буфером (PBS/0,05% Твин-20). Fab титровали в PBS/3% BSA/0,01% Твин-20 от 9 мкг/мл до 0,0001 мг/мл (фактические исследованные концентрации: 9, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0003, 0,0001 мкг/мл). Добавляли формы IgG тестируемых антител и мотавизумаба в фиксированных концентрациях 0,5, 0,1, 0,05 и 0,01 мкг/мл (как указано в табл. 25 ниже). В каждую лунку планшета в двух повторениях одновременно добавляли 50 мкл каждого разбавленного Fab и фиксированные концентрации IgG, как указано в табл. 27 ниже, и планшеты инкубировали при 37°C в течение 2 ч с последующей четырехкратной отмывкой отмывочным буфером. В лунки добавляли Fc-γ козы с HRP к антителам IgG человека (Jackson ImmunoResearch, 109-035-098, разбавленные 1:1000) и планшеты инкубировали при 37°C в течение 1 ч. После шестикратной отмывки отмывочным буфером добавляли 50 мкл раствора ТМВ:перекись водорода 1:1 об./об. (Pierce, 34021) и позволяли развиваться окраске в течение 7 мин. Реакцию немедленно останавливали добавлением 50 мкл 2н. H2SO4 и измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов для ELISA.

Таблица 27

Анализы конкуренции

	Антиген
	Рекомбинант белок F	Природный белок F
Fab 30D8 (от 9 до 0,0001 мкг/мл)	0,05 мкг/мл формы IgG 30D8	0,5 мкг/мл формы IgG 30D8
0,05 мкг/мл формы IgG 58с5	0,05 мкг/мл формы IgG 58с5
0,1 мкг/мл мотавизумаб IgG	0,01 мкг/мл мотавизумаб IgG
Fab 58с5 (от 9 до 0,0001 мкг/мл)	0,5 мкг/мл формы IgG 30D8	0,5 мкг/мл формы IgG 3 0D8
0,05 мкг/мл формы IgG 58с5	0,05 мкг/мл формы IgG 58с5
0,1 мкг/мл мотавизумаб IgG	0,01 мкг/мл мотавизумаб IgG

Результаты обобщены в табл. 28 ниже. Fab 58C5, 30D3, 56Е11, 17С9 и 69F6 не конкурируют за связывание с белком F штамма А2 PCB с мотавизумабом. Fab 30D8 не конкурирует за связывание ни с одним из тестируемых антител. Fab 58C5 конкурирует за связывание с белком F PCB с формой IgG 69F6. Fab 56Е11 и 69F6 конкурируют за связывание с белком F с формой IgG 58с5. Антитела 58С5, 69F6 и 56Е11 обладают общими участками связывания эпитопа на слитом белке PCB.

Таблица 28

Обобщение анализов конкуренции

	58С5 Fab	3 0D8 Fab	56Е11 Fab	17С9 Fab	69F6 Fab
Мотавизумаб IgG	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет
Форма IgG 58С5	ДА	Нет	ДА	Нет	ДА
Форма IgG 30D8	Нет	ДА	Нет	Нет	Нет
Форма IgG 56Е11	ДА	Нет	н.о.	н.о.	н.о.
Форма IgG 17С9	Нет	Нет	н.о.	ДА	н.о.
Форма IgG 69F6	ДА	Нет	н.о.	н.о.	ДА

н.о.: не определяли.

Пример 11.

Получение MARM PCB и анализы нейтрализации.

В этом примере получали устойчивые к моноклональным антителам ускользающие мутанты PCB (MARMs) для мотавизумаба и формы IgG 58C5. Для формы IgG 30D8, проводили 12 циклов отбора и ускользающих мутантов не идентифицировали. Дополнительно анализировали способность мотавизумаба, форм IgG 58C5 и 30D8 и Fab 56E11, 17С9 и 69F6 к нейтрализации вновь получаемых MARM.

А. Получение MARM.

1. Мотавизумаб.

Предварительно определяли, что концентрация IgG мотавизумаба, которая снижает титр вируса

- 132 027835

PCB на 3 порядка (соответствующая ингибированию 99,9% вируса А2 PCB в анализе нейтрализации),

составляла 3,2 мкг/мл. Вирусные частицы PCB А2 (2х10⁶) предварительно инкубировали с разведениями IgG мотавизумаба и эту смесь использовали для инфицирования монослоев клеток Vero (как описано в примере 6 выше). Лунки с наибольшей концентрацией антител, все еще демонстрирующие цитотоксический эффект, выбирали для дополнительных циклов отбора. После 10 циклов отбора получали бляшки вируса, растущего в присутствии 8 мкг/мл мотавизумаба. Вирусные частицы из этих бляшек тестировали в анализах нейтрализации (как описано в примере 6 выше) и из положительных частиц с использованием набора RNeasy (Qiagen) выделяли РНК. Отбирали шесть ускользающих мутантов и посредством ПЦР амплифицировали ген F. Секвенировали ДНК и все шесть клонов кодировали одну аминокислотную замену глутаминовой кислоты на лизин в положения 272 (К272Е, SEQ ID NO: 486) по сравнению с исходным штаммом А2 PCB (приведенным в SEQ ID NO: 485).

В табл. 29 ниже приведены наибольшие концентрации антител, демонстрирующие цитопатическое действие (CPE) для каждого цикла отбора. Как показано в табл. 29 ниже, ускользающие от мотавизумаба мутанты идентифицировали через 7 циклов отбора, что идентифицировали по концентрациям антител, демонстрирующим больший CPE, чем концентрация мотавизумаба, соответствующая 99,9% ингибированию вируса PCB А2, как определено в анализе нейтрализации (например, >3,2 мкг/мл).

Таблица 29

Отбор MARM мотавизумаба

Цикл отбора	Концентрация антитела (мкг/мл)
1	0,5
2	0,5
3	0,75
4	1
5	2
6	3
7	4
8	8
9	8
10	8

2. 58С5.

Определяли, что концентрация формы IgG 58С5, которая снижает титр вируса PCB на 3 порядка (соответствующая ингибированию 99,9% вируса А2 PCB в анализе нейтрализации), составляла 0,8 мкг/мл. Вирусные частицы PCB А2 (2х10⁶) предварительно инкубировали с разведениями формы IgG 58C5 и эту смесь использовали для инфицирования монослоев клеток Vero (как описано в примере 6 выше). Лунки с наибольшей концентрацией антител, все еще демонстрирующие цитотоксический эффект, выбирали для дополнительных циклов отбора. После 12 циклов отбора получали бляшки вируса, растущего в присутствии 2 мкг/мл формы IgG 58C5. Вирусные частицы из этих бляшек тестировали в анализах нейтрализации (как описано в примере 6 выше) и из положительных частиц с использованием набора RNeasy (Qiagen) выделяли РНК. Отбирали пять ускользающих мутантов и посредством ПЦР амплифицировали ген F. Секвенировали ДНК и все пять клонов кодировали три аминокислотных замены (N63K, M115K и E295G; SEQ ID NO: 487) по сравнению с исходным штаммом А2 PCB (приведенным в SEQ ID NO: 485).

В табл. 30 ниже приведены наибольшие концентрации антител, демонстрирующие цитопатическое действие (CPE) для каждого цикла отбора. Как показано в табл. 30 ниже, ускользающие от 58С5 мутанты идентифицировали через 10 циклов отбора, что идентифицировали по концентрациям антител, демонстрирующим больший CPE, чем концентрация формы IgG 58C5, соответствующая 99,9% ингибированию вируса PCB А2, как определено в анализе нейтрализации (например, >0,8 мкг/мл).

- 133 027835

Таблица 30

Отбор MARM 58С5

Цикл отбора	Концентрация антитела (мкг/мл)
1	0,2
2	0,2
3	0,3
4	0,4
5	0,6
б	0,6
7	0,6
8	0,6
9	0,6
10	1,2
11	1,6
12	2

3. 30D8.

Определяли, что концентрация формы IgG 30D8, снижающая титры вируса PCB на 3 порядка, составляла 1 мкг/мл. Вирусные частицы А2 PCB (2х10⁶) предварительно инкубировали с разведениями формы IgG 30D8 и эту смесь использовали для инфицирования монослоев клеток Vero (полученных, как описано в примере 6 выше). Лунки с наибольшей концентрацией антител, все еще демонстрирующие цитотоксический эффект, выбирали для дополнительных циклов отбора. После 12 циклов отбора ускользающих мутантов для 30D8 не идентифицировано, как представлено в табл. 31.

Таблица 31

Отбор MARM 30D8

В. Анализы нейтрализации.

Мотавизумаб, формы IgG of 58C5 и 30D8 и Fab 56E11, 17С9 и 69F6 тестировали на их способность нейтрализовать исходный штамм А2 вируса PCB, MARM мотавизумаба и MARM 58C5. Последовательность анализа нейтрализации описана в пример 6 выше. Данные представлены в табл. 32-35 ниже. В табл. 32 приведена степень подавления бляшкообразования для нейтрализации исходного вируса А2 PCB. В табл. 33 приведена степень подавления бляшкообразования для нейтрализации MARM мотавизумаба. В табл. 34 приведена степень подавления бляшкообразования для нейтрализации MARM 58c5. В табл. 35 приведено обобщение данных нейтрализации (значения ED50).

Результаты указывают, что все антитела способны к нейтрализации исходного штамма А2 PCB, где формы IgG 58c5 и 30D8 демонстрируют наибольшую активность (см. табл. 32 и 35). Все тестируемые антитела в значительной степени нейтрализуют MARM мотавизумаба без различий в сравнении с исходным штаммом (см. табл. 33 и 35). Как и ожидалось, мотавизумаб не может нейтрализовать MARM мотавизумаба при любой из тестируемых концентраций. Мотавизумаб, форма IgG 30D8 и Fab 17С9 в значительной степени нейтрализуют MARM 58C5 без различий в активности нейтрализации (см. табл. 34 и 35). Как и ожидалось, форма IgG 58c5 не может нейтрализовать MARM 58C5 при любой из тестируемых концентраций. Результаты демонстрируют, что все формы IgG 58c5 и 30D8 и Fab 56E11, 17С9 и 69F6 нейтрализуют MARM мотавизумаба, не демонстрируя конкуренции. Таким образом, эпитопы 58с5, 30D8, 56Е11, 17С9 и 69F6 не перекрываются с эпитопом мотавизумаба, так как не наблюдали конкуренции (см. табл. 28 выше) и все антитела нейтрализуют MARM мотавизумаба.

- 134 027835

Fab 69F6 конкурирует с формой IgG 58c5 за связывание с белком F PCB (см. табл. 28 выше), но все еще нейтрализует MARM 58C5, хотя и немного с большим ED50, чем ED50 для нейтрализации исходного штамма А2 (353 пМ в отличие от 256 пМ). В отличие от этого, Fab 56E11 конкурирует за связывание с белком F PCB с формой IgG 58c5 (см. табл. 28 выше), но не нейтрализует MARM 58C5 при любой из тестируемых концентраций. Таким образом, эпитоп 56Е11 перекрывается с 58с5, так как между двумя антитела наблюдают конкуренцию и Fab 56E11 не может нейтрализовать MARM 58C5. Антитела 69F6 и 17С9 нейтрализуют MARM 58C5, что указывает на то, что их эпитопы не перекрываются с эпитопом антитела 58с5. Однако между 58с5 и 69F6 наблюдали конкуренцию (см. табл. 28), но так как 69F6 нейтрализует MARM 58C5, наблюдаемая конкуренция с наибольшей вероятностью является следствием стерических препятствий.

Таблица 32

Степень подавления бляшкообразования для нейтрализации исходного вируса А2 РСВ

Антитело	10000 нг/мл	2000 нг/мл	400 нг/мл	80 нг/мл	16 нг/мл	3,2 нг/мл
Мотавизумаб	100,0	98,87	82,27	50,40	19,25	0,40
Форма IgG 58С5	100,0	100,0	99,6	87,0	49,2	6,1
Форма IgG 30D8	100,0	100,0	96,2	81,0	58,2	11,9

Таблица 33

Степень подавления бляшкообразования для нейтрализации MARM мотавизумаба

Антитело	10000 нг/мл	2000 нг/мл	400 нг/мл	80 кг/мл	16 кг/мл	3,2 нг/мл
Мотавизумаб	13,3	1,7	0,0	0,2	3,3	0,0
Форма IgG 58С5	97,6	95,8	92,0	74,6	43,0	1,5
Форма IgG 30D8	98,7	98,6	98,2	91,8	55,7	8,7

Таблица 34

Степень подавления бляшкообразования для нейтрализации MARM 58С5

Антитело	10000 нг/мл	2000 нг/мл	400 нг/мл	30 нг/мл	16 нг/мл	3,2 нг/мл
Мотавизумаб	94,8	92,9	83,9	47,1	6,5	0,0
Форма IgG 58С5	3,3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Форма IgG 3 0D8	93,6	87,7	83,9	80,0	58,1	‘ 8,4

Таблица 35

Обобщение значений нейтрализации (ED₅₀)

	Исходный А2 РСВ (ED50)	MARM мотавизумаба (ED50)	MARM 58С5 (EDso)
IgG мотавизумаб	519 пМ	>66,7 нМ	641 пМ
Форма IgG 58С5	115 пМ	17 3 пМ	>66,7 нМ
Форма IgG 30D8	96 пМ	93 пМ	113 пМ
56Е11	1 нМ	1,6 нМ	>200 нМ
17С9	4 36 пМ	356 лМ	353 пМ
69F6	256 пМ	266 пМ	353 пМ

Пример 12.

Картирование связываемых эпитопов 58С5 и 30D8.

В этом примере определяли остатки белка F PCB, вовлеченные в связывание антител 58С5 и 30D8, посредством скрининга библиотеки единичных мутантов белка F PCB на связывание с антителами 58С5 или 30D8.

Библиотеку мутантов белка F PCB получали с использованием технологии картирования Shotgun Mutagenesis Mapping Technology из Integral Molecular (Philadelphia, PA). В кратком изложении, эта технология позволяет экспрессировать и анализировать большие библиотеки мутантных белков-мишеней в эукариотических клетках. Каждый остаток в белке-мишени отдельно подвергают мутагенезу, как прави- 135 027835

ло, в несколько других аминокислот, для анализа изменений связывания и функции моноклонального антитела (MAb). Белки зкспрессируют в клеточных линиях млекопитающих так, что даже сложные белки, которым необходима эукариотические трансляция или посстрансляционный процессинг, можно картировать эпитопами.

В качестве исходной плазмиды для белка F PCB использовали F штамма А2 PCB человека (NCBI,

№ доступа FJ614814). Включали C-концевую метку V5 для обеспечения скрининга. Белки F экспрессировали в клетках HEK 293, а связывание определяли с использованием иммунолюминесценции. С использованием стратегии случайных мутаций получали библиотека белков F PCB, содержащую 1029 мутантных клонов. Мутациям подвергали все 549 аминокислот белка F, со средним 1,34 мутации на клоны и средним 2,46 мутации на аминокислотный остаток. Каждую аминокислоту подвергали мутации по меньшей мере однократно (100%), и по меньшей мере 457 аминокислоты (83,2%) подвергали мутациям дважды. Мотавизумаб и поликлональную сыворотку, связывающие белок F, использовали в качестве положительных контролей для определения плохой укладки белка F. Известно, что мотавизумаб связывает и конформацию белка F PCB до слияния и конформацию белка F PCB после слияния. Кроме того, 58С5 и 30D8 чувствительны к конформационным изменениям, таким образом, 58С5 также использовали как контроль для 30D8, a 30D8 применяли как контроль для 58С5. Как показано в примере 10 выше, 58С5 и 30D8 связывают два независимых участка белка F PCB и, кроме того, чувствительны к конформационным изменениям.

Скрининг проводили более раз с двумя независимыми мини-препаратами трансфектантов. Критерии отбора для оценки остатков, вносящих вклад в связывание антитела, являлись следующими:

результаты для мутантного остатка в сигнале для связывания с 58С5, которые в 2 раза ниже, чем сигнал для связывания с 30D8;

результаты для мутантного остатка в сигнале для связывания с 30D8, которые в 2 раза ниже, чем сигнал для связывания с 58С5;

положительный контроль (поликлональная сыворотка или мотавизумаб) больше 20% люминесценции; и

предпочтительно также другая замена в этом участке.

У каждого идентифицированного клона также подтверждали поверхностную экспрессию с использованием поликлонального антитела. Образцы тестировали по меньшей мере 3 раза.

1. Связывание с антителом 58С5.

Результаты представлены в табл. 36-37 ниже, в которой приведены результаты иммунолюминесценции по меньшей мере для 3 образцов (S1, S2 и S3) для связывания 58С5 и 30D8 с каждым мутантом белка F, связывания мотавизумаба и/или поликлональной сыворотки, среднее значений для 58С5 и 30D8, отношение связывания 30D8/58C5 и мутации в белке F. Как представлено В табл. 36-37 ниже, мутация остатков N63, Е82, Y86, K168, V207, N371, S405 и/или Е463 в белке F приводило к снижению связывания антитела 58С5. Остаток Е82 идентифицирован при обоих скринингах мини-препаратов. Остаток N63 ранее идентифицирован в ускользающем мутанте или MARM 58С5. Эту мутацию также подтверждали анализом FACS. Когда объединенные идентифицированные остатки демонстрируют на SD-модели PCBF перед слиянием, они кластеризуются в ограниченной области выступа в той же области, что и ускользающие мутанты на вершине выступа и иллюстрируют область узнавания антитела Mab 58C5 (см. фиг. 1). Таким образом, 58С5 связывает конформационный эпитоп.

Когда эти остатки демонстрируют на рентгеновской структуре тримерного выступа белка F PCB после слияния, остатки распределены по большой области поверхности белка, что не может являться частью области узнавания антитела (см. фиг. 2 и Morton et al. (2003), Virology 311:275-288; McLellan et al. (2010), J. Virology 84 (23):12236-12244; и McLellan et al. (2011), J. Mol. Biol. 409:853-866). Эпитоп 58С5 расположен в домене, которые претерпевает наиболее значительное конформационное изменение белка F, когда он переходит от состояния до слияния в состояние после слияния. Только кластеризованная область на выступе перед слиянием сочетается с областью узнавания антитела. Таким образом, расположение эпитопа сочетается с данными о том, что 58С5 специфичен для конформации перед слиянием и это также подтверждает отсутствие конкуренции с мотавизумабом, F101 и 30D8. Таким образом, 58С5 не связывает тот же эпитоп, что и мотавизумаб или 30D8.

Таблица 36

Скрининг 58С5 в библиотеке, включающей первый мини-препарат

58С5	30D8	Поликлональные	58С5	30D8
S1	S2	S3	S1	S2	S3	S1	Среднее	Среднее	Мутация	Отношение 30D8/58C5
7,6	4,8	4,8		50,7	55,7	64,7	5,8	53,2	К168Е	9,2
13,2	4,8	4,6	22,6	20,8	27,1	68,0	7,5	23,5	N63H	3,1
22,4	10,0	11,0	17,5	27,9	36,6	60,5	14,5	27,3	V207D	1,9
50,7	30,7	33,9	59,8	87,9	80,0	82,3	38,4	75,9	S405A	2,0
5,4	1,6	3,6	9,7	20,7	12,5	18,9	3,6	14,3	E82G	4,0

- 136 027835

Таблица 37

Скрининг 58С5 в библиотеке, включающей второй мини-препарат

Антитело
58С5	S1	8,6	55,6	13,1	11,1
S2	8,9	16,1	10,2	7,2
S3	7,9	25,3	10,2	6,3
S4	2,1	54,5	1,2	2,4
30D8	S1	35,7	74,9	9,3	17,2
S2	12	111,1	42,1	12,1
S3	12	52,3	36,6	12,1
S4	15,2	80	2,4	19,7
Мотавизумаб	Среднее	42,1	100,9	26,9	24,8
Поликлональные	S1	37,1	137,1	14,4	7,7
58С5	Среднее	6,9	37,9	8,7	6,8
3 0D8	Среднее	18,7	79,6	22,6	15,3
Мутация	E82G	Е4 63А	N371D	Y86C
Отношение 30D8/58C5	2,7	2,1	2,6	2,3

2. Связывание с антителом 30D8.

Результаты представлены в табл. 38, 39 ниже, в которой приведены результаты иммунолюминесценции по меньшей мере для 3 образцов (S1, S2 и S3) для связывания 58С5 и 30D8 с каждым мутантом белка F, связывания мотавизумаба и/или поликлональной сыворотки, среднее значений для 58С5 и 30D8, отношение связывания 58C5/30D8 и мутации в белке F. Как представлено В табл. 38-39 ниже, мутация остатков V278, R339, F351, Р353, М370, N371, С382, D392, М396 и/или S403 в белке F приводит к сниженному связыванию антитела 30D8. Остаток R339 идентифицирован в обоих скринингах минипрепаратов. Две различных мутации М370 и С382 приводили к сниженному связыванию антитела 30D8 с белком F PCB. Как представлено выше для 58С5, идентифицированные остатки ограничивались одним доменом белка F PCB. Когда все идентифицированные остатки для связывания комбинируют, они кластеризуются в домене D1 в основании структуры головки на ножке выше области стебля/ножки. Некоторые остатки по SD-модели являются внутренними, тогда как остальные остатки представляют собой экспонированный кластер на границе в борозде между доменами D1 различных протомеров в трехмерной модели (см. фиг. 3). Когда остатки представлены в тримере после слияния, все идентифицированные остатки являются внутренними. Хотя ожидается, что конформационное изменение области D1 между конформациями до и после слияния будет очень ограниченным, протомерные субъединицы между состояниями до и после слияния претерпевают перестановку, что приводит к структуре после слияния, которая является более компактной и менее открытой. Картирование Mab 30D8 в области D1 согласуется с результатами авторов, что оно зависит от структурной конформации белка F PCB. Кроме того, также как для 58С5, эпитоп не конкурирует с 58С5, мотавизумабом или антителом 101F. Это согласуется с расположением на SD-модели. Таким образом, 30D8 не связывает тот же эпитоп, что и мотавизумаб или 58С5.

Таблица 38

Скрининг 30D8 в библиотеке включающей первый мини-препарат

Антитело
58С5	S1	28,3	10	32,4	18,1	13,8	2,9
S2
S3	28,7	23,5	31,5	43,2	26,4	6,1
S4	44,1	13,9	32,7	26,3	13,2	14,7
3 0D8	S1	16,8	7,3	20,1	14,1	9,3	1,4
S2	6,6	4,9	3,3	10,7	3,1	-1,4
S3	1,9	1,1	2,3	7,2	1,5	-1,3
S4	12,2	11,3	23,7	17,2	19,4	5
Мотавизумаб	Среднее			28
Поликлональные	S1	24,8	76,3	3	75,9	13,1	3,8
58С5	Среднее	32,4	17,7	33,8	32,7	19,9	7,4
30D8	Среднее	9,4	6,2	12,4	12,3	8,3	0,9
Мутации	C382R	R339W	S403A	P353S	C382S	F351S
Отношение 58C5/30D8	3,5	2,9	2,7	2,7	2,4	8,2

- 137 027835

Скрининг 30D8 в библиотеке включающей второй мини-препарат

Таблица 39

58С5	30D8	Поликлональные	58С5	30D8
S1	S2	S3	S1	S2	S3	S1	Среднее	Среднее	Мутации	Отношение 58C5/30D8
27,1	29,0	41,7	10,3	9,0	3,6	118,7	32,6	7,6	R339Q	4,3
26,0	37,6	43,5	16,8	3,1	9,0	61,2	35,7	9,7	М3 7 0R	3,7
93,0	47,6	46,1	38,8	10,1	6,7	35,2	62,2	18,5	М370Т	3,4
45,2	66,4	133,6	46,6	11,8	16,6	69,1	81,7	25,0	N371Y	3,3
13,0	39,4	43,9	15,3	8,3	6,4	73,5	32,1	10,0	M396V	3,2
86,1	51,2	63,6	44,0	11,2	10,3	66,8	67,0	21,9	D392N	3,1
122,1	97,6	79,6	63,6	21,0	11,6	57,5	99,8	32,1	V278M	3,1

Так как специалистам в данной области очевидны модификации, следует понимать, что это изобретение ограничено только объемом приложенной формулы изобретения.

- 138 027835

Список последовательностей

<110> Calmune Corporation

Williamson, Robert Anthony Wadia, Jehangir

Pascual, Gabriel Keogh, Elissa

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА (РСВ) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 33335.01161.WO11/1161PC

<150> 61/399310

<151> 2010-07-09

<150> 61/456454

<151> 2010-11-05

<160> 487

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 228

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 58c5

<400> 1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Ser 15

Gin

Thr

Leu

Ala

Leu

Thr

Cys

Asn

Val

Ser

Gly

Ala

Ser

lie

Asn

Ser

Asp

20

25

30

Asn

Tyr

Tyr

Trp

Thr

Trp

lie

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Gly

Gly

Leu

Glu

35

40

45

Trp

lie

Gly

His

lie

Ser

Tyr

Thr

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Thr

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Ser

Met

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Gin

Ser

Gin

Phe

65

70

75

80

Ser

Leu

Arg

Leu

Thr

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

85

90

95

Cys

Ala

Ala

Cys

Gly

Ala

Tyr

Val

Leu

lie

Ser

Asn

Cys

Gly

Trp

Phe

100

105

110

Asp

Ser

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

130

135

140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145

150

155

160

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165

170

175

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

180

185

190

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

195

200

205

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

210

215

220

Pro

Lys

Ser

Cys

139 027835

225

<210> 2

<211> 12

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR1 VH 58c5

<400> 2

Gly Ala Ser lie Asn Ser Asp Asn Tyr Tyr Trp Thr 15 10

<210> 3

<211> 16

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR2 VH 58c5

<400> 3

His lie Ser Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR3 VH 58c5

<400> 4

Cys Gly Ala Tyr Val Leu lie Ser Asn Cys Gly Trp Phe Asp Ser 15 10 15

<210> 5

<211> 214

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Легкая цепь 58c5

<400> 5

Glu 1

lie

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

lie 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Gin

Ala

Ser

Gin

Asp

lie

Ser

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

lie

35

40

45

Tyr

Gly

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Thr

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Tyr

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser

Val

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

lie

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gin

Tyr

Leu

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Ala

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

- 140 027835

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 6

<211> 11

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR1 VL 58c5

<400> 6

Gin Ala	Ser Gin Asp lie	Ser Thr Tyr Leu Asn
1	5	10

<210>	7
<211>	7
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	CDR2 VL 58c5
<400>	7
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1	5

<210>	8
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	CDR3 VL 58c5
<400>	8
Gin Gin Tyr Gin Tyr Leu Pro Tyr Thr
1	5

<210>	9
<211>	228
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	Тяжелая цепь

- 141 027835

<400> 9

Gin Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gly

1

5

10

15

Thr Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Asp

Ser

lie

Ser

Gly

Ser

20

25

30

Asn Trp

Trp

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

lie Gly

Glu

lie

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Thr

Thr

Asn

Tyr

Lys

Ser

Ser

Leu

50

55

60

Lys Gly

Arg

Val

Thr

Met

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

65

70

75

80

Leu Lys

Leu

Thr

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Gly

Arg

Ser

Thr

Phe

Gly

Pro

Asp

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Met

100

105

110

Asp Val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

115

120

125

Lys Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

130

135

140

Gly Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145

150

155

160

Pro Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165

170

175

Thr Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

180

185

190

Val Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

195

200

205

Asn Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

210

215

220

Pro Lys

Ser

Cys

225

<210> 10

<211> 11

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR1 VH sc5

<400> 10

Gly Asp Ser lie Ser Gly Ser Asn Trp Trp Asn 15 10

<210> 11

<211> 16

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR2 VH sc5

<400> 11

Glu lie Tyr Tyr Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Gly

10

15

<210> 12

<211> 16

<212> Белок <213> Homo sapiens

- 142 027835

<220>

<223> CDR3 VH sc5

<400> 12

Gly Gly Arg Ser Thr Phe Gly Pro Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 15 10 15

<210> 13

<211> 214

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Легкая цепь sc5

<400> 13

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

lie

Lys

Asn

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Ser

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Asn

Asn

Gin

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 14

<211> 11

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR1 VL sc5

<400> 14

Arg Ala Ser Gin Asn lie Lys Asn Tyr Leu Asn 15 10

<210> 15

<211> 7

<212> Белок <213> Homo sapiens

- 143 027835

<220>

<223> CDR2 VL sc5

<400> 15

Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser 1 5

<210> 16

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CDR3 VL sc5

<400> 16

Gin Gin Ser Tyr Asn Asn Gin Leu Thr 1 5

<210> 17

<211> 702

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Тяжелая цепь 58c5

<400> 17

caggtccagc ttgtgcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctggccctc 60

acctgcaatg tctctggtgc ctccatcaat agtgataatt actactggac gtggatccgt 120

cagcgcccag gggggggcct ggagtggatt ggccacatct cttacactgg gaacacctac 180

tacaccccgt cactcaagag ccgactttcc atgtcactag agacatctca gagccaattc 240

tccctgaggc tgacctctgt gactgccgcg gactcggccg tctatttctg tgcggcctgc 300

ggggcatatg ttttaatatc aaactgtggc tggttcgact cctggggcca gggaacccag 360

gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420

aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600

ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagaaagttg agcccaaatc ttgtggtcgg ccaggccggc eg 702

<210> 18

<211> 645

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Легкая цепь 58c5

<400> 18

gaaatagtga tgacgcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggegagtea ggacattagc acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggcaagccc ctaggctcct gatetaegga gcgtccaatt tggagacagg ggtcccatca 180

aggttcactg gaagtggata tgggacagac ttctctgtca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatatta ctgtcaacag taccaatatc tcccgtacac ttttgccccg 300

gggaccaagg tcgagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tetgatgage agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt getaa 645

- 144 027835

<210> 19

<211> 687

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Тяжелая цепь sc5

<400> 19

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60

acttgcactg tctctggtga ctccatcagc ggctctaact ggtggaattg ggtccgccag 120

cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatt atcgtgggac taccaattat 180

aagtcgtccc tcaagggtcg agtcaccatg tcagttgaca cgtccaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga cctctgtgac cgccgcggac acggccgtat attattgtgc gagagggggg 300

aggtccacct ttggtccgga ctactactac tacatggacg tctggggcag agggaccacg 360

gtcaccgtct cctcagcgtc gaccaaaggt ccgtctgttt tcccgctggc tccgtcttct 420

aaatctacct ctggtggtac cgctgctctg ggttgcctgg ttaaagacta cttcccggaa 480

ccggttaccg tttcttggaa ctctggtgct ctgacctctg gtgttcacac cttcccggct 540

gttctgcagt cttctggtct gtactctctg tcttctgttg ttaccgttcc gtcttcttct 600

ctgggtaccc agacctacat ctgcaacgtt aaccacaaac cgtctaacac caaagttgac 660

aagaaagttg aaccgaaatc ttgcctg 687

<210> 20

<211> 642

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Легкая цепь sc5

<400> 20

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctgtaggtga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gaacattaag aactatttaa attggtatca acaaaaacca 120

gggaaagtcc cgaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcagagtgg ggtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttactc ctgtcaacag agttacaata accagctcac tttcggcggt 300

gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

<210> 21

<211> 1665

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок F A2 RSV

<400> 21

gctagcggta ccatgggcga gctcctcatc ctgaaggcca acgccatcac caccatcctg 60

accgctgtga ccttctgctt cgccagcggc cagaacatca ccgaggaatt ctaccagagc 120

acctgcagcg ccgtgagcaa gggctacctg agcgccctgc ggaccggctg gtacaccagc 180

gtgatcacca tcgagctgtc caacatcaaa gaaaacaagt gcaacggcac cgacgccaaa 240

gtgaagctga tcaagcagga actggacaag tacaagaacg ccgtgaccga gctgcagctg 300

ctgatgcaga gcaccccccc caccaacaac cgggccagaa gagaactgcc ccggttcatg 360

aactacaccc tgaacaacgc caagaaaacc aacgtgaccc tgagcaagaa gcggaagcgg 420

cggttcctgg gcttcctgct gggcgtgggc agcgccattg ccagcggcgt ggccgtgtcc 480

aaagtgctgc acctggaagg cgaagtgaac aagatcaagt ccgccctgct gtccaccaac 540

aaggccgtgg tgtccctgag caacggcgtg agcgtgctga ccagcaaggt gctggatctg 600

aagaactaca tcgacaagca gctgctgccc atcgtgaaca agcagagctg cagcatcagc 660

- 145 027835

aacatcgaga cagtgatcga gttccagcag aagaacaacc ggctgctgga aatcacccgg 720

gagttcagcg tgaacgctgg cgtgaccacc cccgtgtcca cctacatgct gaccaactcc 780

gagctgctct ccctgatcaa tgacatgccc atcaccaacg accagaaaaa gctgatgagc 840

aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagagc tactccatca tgagcatcat caaagaagag 900

gtgctggcct acgtggtgca gctgcccctg tacggcgtga tcgacacccc ctgctggaag 960

ctgcacacca gccccctgtg caccaccaac accaaagagg gcagcaacat ctgcctgacc 1020

cggaccgacc ggggctggta ctgcgacaac gccggcagcg tgtcattctt cccacaagcc 1080

gagacatgca aggtgcagag caaccgggtg ttctgcgaca ccatgaacag cctgaccctg 1140

cccagcgaga tcaacctgtg caacgtggac atcttcaacc ccaagtacga ctgcaagatc 1200

atgacctcca agaccgacgt gtccagctcc gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc 1260

tgctacggca agaccaagtg caccgccagc aacaagaacc ggggcatcat caagaccttc 1320

agcaacggct gcgactacgt gtccaacaag ggcatggaca ccgtgtccgt gggcaacaca 1380

ctgtactacg tgaataagca ggaaggcaag agcctgtacg tgaagggcga gcccatcatc 1440

aacttctacg accccctggt gttccccagc gacgagttcg acgccagcat cagccaggtg 1500

aacgagaaga tcaaccagag cctggccttc atcagaaaga gcgacgagct gctgcacaat 1560

gtgaatgccg gcaagtccac caccaaccaa gcttacgtag aacaaaaact catctcagaa 1620

gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attga 1665

<210> 22

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Участок рестрикции Nhel

<400> 22

gctagc 6

<210> 23

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Участок рестрикции Hindlll

<400> 23

aagctt 6

<210> 24

<211> 5521

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вектор pcDNA 3.1/myc-His(-) C

<400> 24

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

- 146 027835

gtttaaacgg gccctctaga ctcgagcggc cgccactgtg ctggatatct gcagaattcc 960

accacactgg actagtggat ccgagctcgg taccaagctt acgtagaaca aaaactcatc 1020

tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg agtttaaacg 1080

gtctccagct taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 1140

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 1200

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 1260

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 1320

ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg 1380

tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 1440

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 1500

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 1560

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 1620

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 1680

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 1740

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 1800

aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag 1860

gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg 1920

gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 1980

caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 2040

attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg 2100

cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 2160

agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt 2220

ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 2280

tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc 2340

tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 2400

aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 2460

ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 2520

ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 2580

caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac 2640

atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg 2700

acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc 2760

ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg 2820

aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc 2880

aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc 2940

gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc 3000

ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc 3060

caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg 3120

aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt 3180

cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 3240

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 3300

catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc 3360

atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 3420

agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 3480

tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 3540

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 3600

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 3660

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 3720

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 3780

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 3840

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 3900

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 3960

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 4020

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 4080

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 4140

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 4200

tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 4260

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 4320

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 4380

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 4440

aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 4500

atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 4560

gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 4620

acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 4680

ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 4740

- 147 027835

tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 4800 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 4860 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 4920 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 4980 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 5040 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 5100 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 5160 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 5220 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 5280 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 5340 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 5400 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 5460 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 5520 c 5521

<210> 25

<211> 550

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок F A2 RSV

<400> 25

Met 1

Gly

Glu

Leu

Leu 5

lie

Leu

Lys

Ala

Asn 10

Ala

lie

Thr

Thr

lie 15

Leu

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

Cys

Phe

Ala

Ser

Gly

Gin

Asn

lie

Thr

Glu

Glu

20

25

30

Phe

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ser

Ala

35

40

45

Leu

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

lie

Thr

lie

Glu

Leu

Ser

Asn

50

55

60

lie

Lys

Glu

Asn

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ala

Lys

Val

Lys

Leu

lie

65

70

75

80

Lys

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

85

90

95

Leu

Met

Gin

Ser

Thr

Pro

Pro

Thr

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Leu

100

105

110

Pro

Arg

Phe

Met

Asn

Tyr

Thr

Leu

Asn

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Asn

Val

115

120

125

Thr

Leu

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

130

135

140

Val

Gly

Ser

Ala

lie

Ala

Ser

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

145

150

155

160

Leu

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

lie

Lys

Ser

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

165

170

175

Lys

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Asn

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

180

185

190

Val

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

lie

Asp

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

lie

Val

195

200

205

Asn

Lys

Gin

Ser

Cys

Ser

lie

Ser

Asn

lie

Glu

Thr

Val

lie

Glu

Phe

210

215

220

Gin

Gin

Lys

Asn

Asn

Arg

Leu

Leu

Glu

lie

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Val

225

230

235

240

Asn

Ala

Gly

Val

Thr

Thr

Pro

Val

Ser

Thr

Tyr

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

245

250

255

Glu

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Asn

Asp

Met

Pro

lie

Thr

Asn

Asp

Gin

Lys

260

265

270

Lys

Leu

Met

Ser

Asn

Asn

Val

Gin

lie

Val

Arg

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

275

280

285

lie

Met

Ser

lie

lie

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Val

Gin

Leu

290

295

300

- 148 027835

Pro

Leu

Tyr

Gly

Val

lie

Asp

Thr

Pro

Cys

Trp

Lys

Leu

His

Thr

Ser

305

310

315

320

Pro

Leu

Cys

Thr

Thr

Asn

Thr

Lys

Glu

Gly

Ser

Asn

He

Cys

Leu

Thr

325

330

335

Arg

Thr

Asp

Arg

Gly

Trp

Tyr

Cys

Asp

Asn

Ala

Gly

Ser

Val

Ser

Phe

340

345

350

Phe

Pro

Gin

Ala

Glu

Thr

Cys

Lys

Val

Gin

Ser

Asn

Arg

Val

Phe

Cys

355

360

365

Asp

Thr

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

He

Asn

Leu

Cys

Asn

370

375

380

Val

Asp

lie

Phe

Asn

Pro

Lys

Tyr

Asp

Cys

Lys

He

Met

Thr

Ser

Lys

385

390

395

400

Thr

Asp

Val

Ser

Ser

Ser

Val

lie

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

He

Val

Ser

405

410

415

Cys

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

He

420

425

430

lie

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Met

435

440

445

Asp

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

450

455

460

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

He

He

Asn

Phe

Tyr

Asp

465

470

475

480

Pro

Leu

Val

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

He

Ser

Gin

Val

485

490

495

Asn

Glu

Lys

lie

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

lie

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

500

505

510

Leu

Leu

His

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

Gin

Ala

Tyr

515

520

525

Val

Glu

Gin

Lys

Leu

lie

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

Ser

Ala

Val

Asp

530

535

540

His

His

His

His

His

His

545

550

<210> 26

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VHla

<400> 26

ggatcctctt cttggtggca gcag 24

<210> 27

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VHlb

<400> 27

gcatcctttt cttggtggca gcac 24

<210> 28

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VHlc

- 149 027835

<400> 28

gggtcttctg cttgctggct gtag 24

<210> 29

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VHld

<400> 29

ggatcctctt cttggtggga gcag 24

<210> 30

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VH2a

<400> 30

ctgaccatcc cttcatggct cttg 24

<210> 31

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VH2b

<400> 31

ctgaccaccc cttcctgggt cttg 24

<210> 32

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VH3a

<400> 32

gctattttar aaggtgtcca gtgt 24

<210> 33

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VH3b

<400> 33

gctcttttaa gaggtgtcca gtgt 24

<210> 34

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 150 027835

<223> Прямой праймер VH3c

<400> 34

gctatttaaa aaggtgtcca atgt 24

<210> 35

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VH4a

<400> 35

ctggtggcag ctcccagatg ggtc 24

<210> 36

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VH5a

<400> 36

ctcctggctg ttctccaagg agtc 24

<210> 37

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VH-g 1-REV

<400> 37

acaagatttg ggctcaactt tcttgtcc 28

<210> 38

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VH-g 2-REV

<400> 38

tttgcgctca actgtcttgt ccaccttg 28

<210> 39

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VH-g 3-REV

<400> 39

tttgagctca actctcttgt ccaccttg 28

<210> 40

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

- 151 027835

<220>

<223> Обратный праймер VH-g 4-REV

<400> 40

atatttggac tcaactctct tgtccacc 28

<210> 41

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Участок рестрикции Sfil

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)...(9)

<223> N = а или g, или с, или t

<400> 41

ggccnnnnng gcc 13

<210> 42

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VHla

<400> 42

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca caggtkcagc tggtgcag 48

<210> 43

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VHlb

<400> 43

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca caggtccagc ttgtgcag 48

<210> 44

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VHlc

<400> 44

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca saggtccagc tggtacag 48

<210> 45

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VHld

- 152 027835

<400> 45

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca caratgcagc tggtgcag 48

<210> 46

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VH2a

<400> 46

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca cagatcacct tgaaggag 48

<210> 47

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VH3a

<400> 47

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca gargtgcagc tggtggag 48

<210> 48

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VH4a

<400> 48

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca cagstgcagc tgcaggag 48

<210> 49

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VH4b

<400> 49

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca caggtgcagc tacagcag 48

<210> 50

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VH5a

<400> 50

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca gargtgcagc tggtgcag 48

<210> 51

<211> 48

<212> ДПК

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 153 027835

<223> Прямой праймер рСа130 VH6

<400> 51

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca caggtacagc tgcagcag 48

<210> 52

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер pCal30 VH7

<400> 52

ggctttgcta ccgtagcgca ggcggccgca caggtscagc tggtgcaa 48

<210> 53

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VHII-gl-Rev

<400> 53

tgcggccggc ctggccgacc acaagatttg ggctcaactt tc 42

<210> 54

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VHII-g2-Rev

<400> 54

tgcggccggc ctggccgacc tttgegetea actgtcttgt cc 42

<210> 55

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VHII-g3-Rev

<400> 55

tgcggccggc ctggccgacc tttgagetea actctcttgt cc 42

<210> 56

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VHII-g4-Rev

<400> 56

tgcggccggc ctggccgacc atatttggac tcaactctct tg 42

<210> 57

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

- 154 027835

45

<220>

<223> Прямой праймер VK la

<400> 57

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgac atccagatga cccag

<210> 58

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK lb

<400> 58

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgac atccagttga cccag

<210> 59

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK lc

<400> 59

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgcc atccggttga cccag

<210> 60

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 2a

<400> 60

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgat attgtgatga cycag

<210> 61

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK За

<400> 61

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgaa attgtgttga cgcag

<210> 62

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 3b

<400> 62

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgaa attgtgttga cacag

<210> 63

<211> 45

45

45

45

45

45

- 155 027835

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 4а

<400> 63

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgaa atagtgatga cgcag 45

<210> 64

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 4a

<400> 64

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgac atcgtgatga cccag 45

<210> 65

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 5a

<400> 65

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgaa acgacactca cgcag 45

<210> 66

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 6a

< 4 0 0 > 66

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgaa attgtgctga ctcag 45

<210> 67

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VK 6b

<400> 67

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgat gttgtgatga cacag 45

<210> 68

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер pCALCK(G)L

<400> 68

ctccttatta attaattagc actctcccct gttgaagctc tttg 44

- 156 027835

<210> 69

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL1-F

< 4 0 0 > 6 9

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt cagtctgtgc tgackcagcc 50

<210> 70

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL2-F

<400> 70

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt cagtctgccc tgactcagcc 50

<210> 71

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL3A-F

<400> 71

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt tcctatgagc tgacwcagcy 50

<210> 72

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL3B-F

<400> 72

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt tcttctgagc tgactcagga c 51

<210> 73

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL3C-F

<400> 73

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt tcctatgwgc tgactcagcc 50

<210> 74

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL4A-F

<400> 74

- 157 027835

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt ctgcctgtgc tgactcagcc c 51

<210> 75

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL4B-F

<400> 75

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt cagcytgtgc tgactcaatc r 51

<210> 76

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL5/9-F

<400> 76

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt cagsctgtgc tgactcagcc r 51

<210> 77

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL6-F

<400> 77

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt aattttatgc tgactcagcc c 51

<210> 78

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL7/8-F

<400> 78

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt cagrctgtgg tgactcagga g 51

<210> 79

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер VL10-F

<400> 79

aaggcccagc cggccatggc cgccggtgtt caggcagggc tgactcagcc a 51

<210> 80

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер pCALCL(T)-R

- 158 027835

<400> 80

ctccttatta attaattatg agcattctgy akgggcmayt gtc 43

<210> 81

<211> 4765

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вектор 2gl2/pCal

<400> 81

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaattga attaaggagg atataattat gaaatacctg 2160

ctgccgaccg cagccgctgg tctgctgctg ctcgcggccc agccggccat ggccgccggt 2220

gttgttatga cccagtctcc gtctaccctg tctgcttctg ttggtgacac catcaccatc 2280

acctgccgtg cttctcagtc tatcgaaacc tggctggctt ggtaccagca gaaaccgggt 2340

aaagctccga aactgctgat ctacaaggct tctaccctga aaaccggtgt tccgtctcgt 2400

ttctctggtt ctggttctgg taccgagttc accctgacca tctctggtct gcagttcgac 2460

gacttcgcta cctaccactg ccagcactac gctggttact ctgctacctt cggtcagggt 2520

acccgtgttg aaatcaaacg taccgttgct gctccgtctg ttttcatctt cccgccgtct 2580

gacgaacagc tgaaatctgg taccgcttct gttgtttgcc tgctgaacaa cttctacccg 2640

cgtgaagcta aagttcagtg gaaagttgac aacgctctgc agtctggtaa ctctcaggaa 2700

tctgttaccg aacaggactc taaagactct acctactctc tgtcttctac cctgaccctg 2760

tctaaagctg actacgaaaa gcacaaagtt tacgcttgcg aagttaccca ccagggtctg 2820

tcttctccgg ttaccaaatc tttcaaccgt ggtgaatgct aattaattaa taaggaggat 2880

ataattatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac tggctggttt cgctaccgta 2940

gcccaggcgg ccgcagaagt tcagctggtt gaatctggtg gtggtctggt taaagctggt 3000

ggttctctga tcctgtcttg cggtgtttct aacttccgta tctctgctca caccatgaac 3060

- 159 027835

tgggttcgtc

acctaccgtg

gaagacttcg

tgcgctcgta

ggtaccgttg

ccgtcttcta

ttcccggaac

ttcccggctg

tcttcttctc

aaagttgaca

catcaccatc

aagggtggtg

ggtggtggct

gctatgaccg

tctgtcgcta

gctaatggta

ggtgacggtg

caatcggttg

gattgtgaca

tttatgtatg

taacgatcgc

cggcgcatta

cgccctagcg

tccccgtcaa

cctcgacccc

gacggttttt

aactggaaca

gatttcggcc

caaaatatta

gtgttccggg

actacgctga

tttacctgca

aaggttctga

ttaccgtttc

aatctacctc

cggttaccgt

ttctgcagtc

tgggtaccca

agaaagttga

accatggcgc

gctctgaggg

ctggttccgg

aaaatgccga

ctgattacgg

atggtgctac

ataattcacc

aatgtcgccc

aaataaactt

tattttctac

ccttcccaac

agcgcggcgg

cccgctcctt

gctctaaatc

aaaaaacttg

cgccctttga

acactcaacc

tattggttaa

acgcttacaa

tggtggtctg

cgctgttaaa

gatgcataaa

ccgtctgtct

tccggcgtcg

tggtggtacc

ttcttggaac

ttctggtctg

gacctacatc

accgaaatct

atacccgtac

tggcggttct

tgattttgat

tgaaaacgcg

tgctgctatc

tggtgatttt

tttaatgaat

ttttgtcttt

attccgtggt

gtttgctaac

agttgcgcag

gtgtggtggt

tcgctttctt

gggggctccc

attagggtga

cgttggagtc

ctatctcggt

aaaatgagct

tttag

gaatgggttg

ggtcgtttca

atgcgtgttg

gacaacgacc

accaaaggtc

gctgctctgg

tctggtgctc

tactctctgt

tgcaacgtta

tgcctgcgat

gacgttccgg

gagggtggcg

tatgaaaaga

ctacagtctg

gatggtttca

gctggctcta

aatttccgtc

ggcgctggta

gtctttgcgt

atactgcgta

cctgaatggc

tacgcgcagc

cccttccttt

tttagggttc

tggttcacgt

cacgttcttt

ctattctttt

gatttaacaa

cttctatctc

ccgtttctcg

aagacaccgc

cgttcgacgc

cgtctgtttt

gttgcctggt

tgacctctgg

cttctgttgt

accacaaacc

cgcggccagg

actacgcttc

gctctgaggg

tggcaaacgc

acgctaaagg

ttggtgacgt

attcccaaat

aatatttacc

aaccatatga

ttcttttata

ataaggagtc

gaatgggacg

gtgaccgcta

ctcgccacgt

cgatttagtg

agtgggccat

aatagtggac

gatttataag

aaatttaacg

tacctcttct

tgacgacctg

tatctactac

ttggggtccg

cccgctggct

taaagactac

tgttcacacc

taccgttccg

gtctaacacc

ccggccgcac

tactagttag

aggcggttcc

taataagggg

caaacttgat

ttccggcctt

ggctcaagtc

ttccctccct

attttctatt

tgttgccacc

ttaagctagc

cgccctgtag

cacttgccag

tcgccggctt

ctttacggca

cgccctgata

tcttgttcca

ggattttgcc

cgaattttaa

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4680

4740

4765

<210> 82

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FabLinkerCK-Fwd

<400> 82

gagcttcaac aggggagagt gctaattaat taataaggag

40

<210> 83

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FabLinker-Rev

<400> 83

tgcggccgcc tgcgctacgg tagcaaagcc agccagtgcc ac

42

<210> 84

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер Sfi

<400> 84

tcgcggccca gccggccatg gc

22

<210> 85

- 160 027835

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер Sfi

<400> 85

tgcggccggc ctggccga 18

<210> 86

<211> 4779

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вектор pCAL 4E10

<400> 86

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaattga attaaggagg atataattat gaaatacctg 2160

ctgccgaccg cagccgctgg tctgctgctg ctcgcggccc agccggccat ggccgccggt 2220

gaaattgtct tgacgcaaag cccggggacc cagtcgctgt ccccgggaga gcgcgcgacc 2280

ctgtcatgtc gtgcgagtca aagtgtcggt aacaataaac tggcttggta ccagcaacgt 2340

cctgggcagg caccgcgctt actcatttac ggagcctctt cacgtcccag cggggtagcg 2400

gatcgtttct ccggttctgg cagcggcact gatttcacct taacaatctc gcgtctggaa 2460

ccggaagatt ttgccgtcta ttactgtcag caatacggcc agtccttgtc tacatttggc 2520

cagggaacga aagtggaggt aaaacgtacc gttgctgccc ccagtgtttt catctttcca 2580

ccgtcagacg agcagctgaa gtctggtacc gcaagtgtgg tttgcctcct gaataacttt 2640

tatcctcgcg aagcgaaagt tcagtggaag gtggataatg ccctgcagtc gggtaatagc 2700

- 161 027835

caggaaagcg tgaccgaaca agattcaaaa gactccacat attctctgag ttcgactctt 2760

acgttaagca aagctgacta tgaaaagcac aaagtttatg catgcgaggt gacgcatcag 2820

ggtctttcca gcccagtaac taaatcattc aaccgcggcg aatgttaatt aataaggagg 2880

atataattat gaaaaagaca gctatcgcga ttgcagtggc actggctggt ttcgctaccg 2940

tagcccaggc ggccgcacag gtgcaactgg tgcagagtgg ggccgaagtt aaacgcccag 3000

gttcgtccgt aaccgtctca tgcaaggcca gcggtggctc tttctctacg tacgcgctgt 3060

cctgggttcg tcaggccccg ggtcgtggac ttgaatggat gggcggcgta ataccgctgc 3120

tcaccatcac taattacgca ccgcgtttcc agggccgcat tacaatcacc gcggaccgtt 3180

cgacctcaac ggcatatctc gagttaaact cactgcgtcc tgaagatacc gcagtgtatt 3240

actgcgctcg tgaaggtacc actggctggg gctggttggg taaaccgatt ggtgcgttcg 3300

cacattgggg gcaaggcaca cttgttactg tcagctctgc ctctacgaaa ggaccgagcg 3360

tctttccctt ggctccaagt agcaaatcaa cgagcggagg gacagccgcg ttaggatgtc 3420

tggtgaagga ctattttccg gaaccagtta ccgtcagttg gaactcgggc gcgttaactt 3480

ccggtgttca cacatttccc gctgttctgc aaagtagcgg tctgtattcc ctgtcctcag 3540

tagtgacagt tccttcgagt tctctgggca ctcagaccta tatttgcaat gtgaaccata 3600

aacctagcaa tacgaaagtg gataagaaag tagagccgaa atcttgtctg cgatcgcggc 3660

caggccggcc gcaccatcac catcaccatg gcgcataccc gtacgacgtt ccggactacg 3720

cttctactag ttagaagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt ggcggctctg 3780

agggaggcgg ttccggtggt ggctctggtt ccggtgattt tgattatgaa aagatggcaa 3840

acgctaataa gggggctatg accgaaaatg ccgatgaaaa cgcgctacag tctgacgcta 3900

aaggcaaact tgattctgtc gctactgatt acggtgctgc tatcgatggt ttcattggtg 3960

acgtttccgg ccttgctaat ggtaatggtg ctactggtga ttttgctggc tctaattccc 4020

aaatggctca agtcggtgac ggtgataatt cacctttaat gaataatttc cgtcaatatt 4080

taccttccct ccctcaatcg gttgaatgtc gcccttttgt ctttggcgct ggtaaaccat 4140

atgaattttc tattgattgt gacaaaataa acttattccg tggtgtcttt gcgtttcttt 4200

tatatgttgc cacctttatg tatgtatttt ctacgtttgc taacatactg cgtaataagg 4260

agtcttaagc tagctaacga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 4320

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 4380

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 4440

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 4500

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 4560

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 4620

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 4680

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 4740

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttag 4779

<210> 87

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 5' LVKappal/2

<400> 87

atgaggstcc cygctcagct gctgg 25

<210> 88

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 5' LVKappa3

<400> ctcttc	88
:ctcc tgctactctg gctcccag	28
<210> <211> <212> <213>	89 25 ДНК Искусственная последовательность
<220>

- 162 027835

<223> Прямой праймер 5' LVKappa4

<400> 89

atttctctgt tgctctggat ctctg 25

<210> 90

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер VK-rev

<400> 90

gcactctccc ctgttgaagc tctttg 26

<210> 91

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 5' L-VHl

<400> 91

acaggtgccc actcccaggt gcag 24

<210> 92

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 5' L-VH3

<400> 92

aaggtgtcca gtgtgargtg cag 23

<210> 93

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 5' L-VH4/6

<400> 93

cccagatggg tcctgtccca ggtgcag 27

<210> 94

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 5' L-VH5

<400> 94

caaggagtct gttccgaggt gcag 24

<210> 95

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

- 163 027835

<220>

<223> Обратный праймер 3' CgammaCHl

<400> 95

ggaaggtgtg cacgccgctg gtc 23

<210> 96

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Участок рестрикции Sail

< 4 0 0 > 96

gtcgac 6

<210> 97

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 3' SallJH 1/2/4/5

<400> 97

tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc ag 32

<210> 98

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 3' SalIJH3

<400> 98

tgcgaagtcg acgctgaaga gacggtgacc attg 34

<210> 99

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 3' SalIJH6

<400> 99

tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc gtg 33

<210> 100

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер Fab

<400> 100

gagcttcaac aggggagagt gctaattaat taataaggag gatataatta tgaaaaagac 60 agctatcgcg attgcagtgg cactggctgg ctttgctacc gtagcgcagg cggccgca 118

<210> 101

- 164 027835

<211> 391

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Фрагмент CHI

<400> 101

gtcgaccaaa ggtccgtctg ttttcccgct ggctccgtct tctaaatcta cctctggtgg 60

taccgctgct ctgggttgcc tggttaaaga ctacttcccg gaaccggtta ccgtttcttg 120

gaactctggt gctctgacct ctggtgttca caccttcccg gctgttctgc agtcttctgg 180

tctgtactct ctgtcttctg ttgttaccgt tccgtcttct tctctgggta cccagaccta 240

catctgcaac gttaaccaca aaccgtctaa caccaaagtt gacaagaaag ttgaaccgaa 300

atcttgcctg cgatcgcggc caggccggcc gcaccatcac catcaccatg gcgcataccc 360

gtacgacgtt ccggactacg cttctactag t 391

<210> 102

<211> 5432

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pCALM

<400> 102

atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360

tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420

acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480

tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540

gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600

gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccacc 660

gcggtggcgg ccgcccacca tggactggac ctggcggatc ctgttcctgg tggccgcggc 720

caccggggcc cacagcaaag ggaaagggaa aggggctagc accaagggcc ccagcgtgtt 780

ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc gccgccctgg gctgcctggt 840

gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac agcggcgccc tgaccagcgg 900

cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg tacagcctga gcagcgtggt 960

gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc 1020

cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc tgcgacaaaa ctcacacatg 1080

cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa 1140

acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 1200

gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1260

tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct 1320

caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 1380

agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 1440

acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac 1500

ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1560

gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1620

ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 1680

cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 1740

taaacgggcc aagcgggcac ccgtgaagca gaccctgaac ttcgacctgc tgaagctggc 1800

cggcgacgtg gagagcaacc ccggccccat gaggctccct gctcagctcc tggggctgct 1860

aatgctctgg gtccctggct cgagtgagaa agggaaaggg aaataaggta ccaggtaagt 1920

gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tcgatcgccc ttcccaacag 1980

ttgcgcagcc tgaatggcga atggagatcc aatttttaag tgtataatgt gttaaactac 2040

tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc acagtcccaa ggctcatttc aggcccctca 2100

gtcctcacag tctgttcatg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg 2160

ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 2220

ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 2280

tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 2340

- 165 027835

tatcttaacg cgtaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 2400 taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa 2460 gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag 2520 aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt 2580 gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac 2640 cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 2700 gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg 2760 cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact 2820 tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 2880 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagaat 2940 cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag 3000 gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg 3060 gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 3120 caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 3180 attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 3240 cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaag 3300 atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 3360 ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 3420 ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 3480 aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg 3540 ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 3600 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 3660 gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 3720 acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 3780 gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagaacatc aggggctcgc gccagccgaa 3840 ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 3900 gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 3960 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 4020 gaagaacttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 4080 gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg 4140 ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg 4200 ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc 4260 tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc tagggggagg ctaactgaaa 4320 cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata 4380 aaacgcacgg tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact 4440 ctgtcgatac cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc 4500 caccccaccc cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcag 4560 gccctgccat agcctcaggt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 4620 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 4680 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 4740 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 4800 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 4860 gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 4920 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 4980 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 5040 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 5100 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 5160 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 5220 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 5280 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 5340 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 5400 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cc 5432

<210> 103

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH синагиса

<400> 103

- 166 027835

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

<210> 104

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 167 027835

<220>

<223> Домен VH синагиса

<400> 104

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 105

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH синагиса

<400> 105

Thr Ser Gly Met Ser Val Gly 1 5

<210> 106

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH синагиса

<400> 106

Asp lie Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 107

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH синагиса

<400> 107

Ser Met lie Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 15 10

<210> 108 <211> 213

- 168 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL синагиса

<400> 108

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Lys

Cys

Gin

Leu

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Ser

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 109 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VL синагиса
<400> 109
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Lys Cys Gin Leu Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Ser Lys Leu	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Leu Glu lie Lys

100 105

<210> 110 <211> 10

- 169 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL синагиса

<400> 110

Lys Cys Gin Leu Ser Val Gly Tyr Met His 15 10

<210> 111

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL синагиса

<400> 111

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5

<210> 112

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL синагиса

<400> 112

Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 113

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH AFFF

<400> 113

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

- 170 027835

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 114 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH AFFF
<400> 114
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Ser Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Ser Met	lie Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

- 171 027835

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 115

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH AFFF

<400> 115

Thr Ala Gly Met Ser Val Gly 1 5

<210> 116

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH AFFF

<400> 116

Ser Met lie Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Val 15 10

<210> 117

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL AFFF

<400> 117

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Phe

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

- 172 027835

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195

Asn Arg Gly Glu Cys 210

200

205

<210> 118

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL AFFF

<400> 118

Asp

lie

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Phe

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 119

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL AFFF

<400> 119

Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His 15 10

<210> 120

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL AFFF

<400> 120

Asp Thr Phe Lys Leu Ala Ser 1 5

<210>	121
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	CDR3 VL AFFF

- 173 027835

<400> 121

Phe Gin Phe Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 122

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH P1212

<400> 122

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Pro

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

- 174 027835

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

<210> 123

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH P1212

<400> 123

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Pro

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

He

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

He

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 124

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH P1212

<400> 124

Thr Pro Gly Met Ser Val Gly 1 5

<210> 125

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH P1212

<400> 125

Asp lie Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15

- 175 027835

<210> 126

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH P1212

<400> 126

Asp Met lie Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val 15 10

<210> 127

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL P1212

<400> 127

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Tyr

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 128

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL P1212

<400> 128

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

- 176 027835

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Tyr

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 129

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL P1212

<400> 129

Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 15 10

<210> 130

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL P1212

<400> 130

Asp Thr Phe Tyr Leu Ser Ser 1 5

<210> 131

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH Р12Б4

<400> 131

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Pro

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

- 177 027835

Phe

Pro 130

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser 135

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly 140

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 132 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH Р12Д4
<400> 132
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Gly Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

- 178 027835

				85					90		95
Cys	Ala	Arg	Asp	Met	lie	Phe	Asn	Phe	Tyr Phe Asp Val	Trp	Gly Gin
			100					105		110
Gly	Thr	Thr	Val	Thr	Val	Ser	Ser

115 120

<210> 133

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH Р12Б4

<400> 133

Asp lie Trp Trp Asp Gly Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15

<210> 134

<211> 208

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL Р12Б4

<400> 134

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Arg

Gly

Leu

Pro

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

<210> 135

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL Р12Б4

- 179 027835

<400> 135

Asp

lie

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Arg

Gly

Leu

Pro

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> <211> <212> <213>	136 7 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	CDR2 VL Р12Б4
<400>	136
Asp Thr Arg Gly Leu	Pro Ser
1	5

<210> 137 <211> 450 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VH Plld4
<400> 137
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Gly Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115	120 125
Phe Pro Leu Ala Pro	Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130	135 140
Leu Gly Cys Leu Val	Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145	150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala	Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165	170 175
Leu Gin Ser Ser Gly	Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180	185 190

- 180 027835

Ser

Ser

Ser 195

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr 200

Tyr

lie

Cys

Asn

Val 205

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 138 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH Plld4
<400> 138
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Gly Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 139

- 181 027835

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH Plld4

<400> 139

Asp Met lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val 15 10

<210> 140

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL Plld4

<400> 140

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Pro

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Met

Arg

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 141

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL Plld4

<400> 141

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Pro

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

- 182 027835

His

Trp

Tyr 35

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 40

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu 45

Leu

lie

Tyr

Asp

Thr

Met

Arg

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 142

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL Plld4

<400> 142

Ser Pro Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 15 10

<210> 143

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL Plld4

<400> 143

Asp Thr Met Arg Leu Ala Ser 1 5

<210> 144

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH Ale9

<400> 144

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

He

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

- 183 027835

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

330

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 145 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH Ale9
<400> 145
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Gly Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95

- 184 027835

Cys Ala Arg Asp Met	lie	Phe	Asn	Trp Tyr Phe Asp Val 105	Trp Gly Gin 110
	100
Gly	Thr	Thr	Val	Thr	Val	Ser	Ser
		115					120

<210> 146 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL Ale9
<400> 146
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Lys Leu	Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> <211> <212> <213>	147 106 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Домен VL Ale9
<400>	147
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1	5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
	20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
	35	40 45
Asp Thr Phe Lys Leu	Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50		55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65		70 75 80

- 185 027835

Asp	Phe	Ala	Thr	Tyr 85	Tyr	Cys	Phe	Gin	Gly Ser 90	Gly Tyr Pro Phe Thr 95
Phe	Gly	Gly	Gly	Thr	Lys	Val	Glu	lie	Lys
			100					105

<210> 148

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL Ale9

<400> 148

Asp Thr Phe Lys Leu Ser Ser 1 5

<210> 149

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A12a6

<400> 149

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

- 186 027835

Asn

Ala 290

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg 295

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn 300

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 150 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH A12a6
<400> 150
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Gly Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser
115	120

<210> <211> <212> <213>	151 16 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	CDR2 VH A12a6
<400>	151
Asp lie Trp Trp Asp	Gly Lys Lys Asp Tyr Asn Pro	Ser Leu Lys Asp
1	5	10	15

- 187 027835

<210> 152

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL A12a6

<400> 152

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

5 0

5 5

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 153 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VL A12a6
<400> 153
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Lys Leu	Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105

- 188 027835

<210> 154

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL A12a6

<400> 154

Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 15 10

<210> 155

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A13c4

<400> 155

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

- 189 027835

Lys

Thr

lie

Ser 340

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin 345

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin 350

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 156 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH A13c4
<400> 156
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Gly Lys Lys Ser Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser
115	120

<210> <211> <212> <213>	157 16 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	CDR2 VH A13c4
<400>	157
Asp lie Trp Trp Asp	Gly Lys Lys Ser Tyr Asn Pro	Ser Leu Lys Asp
1	5	10	15

<210> 158

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 190 027835

<223> Цепь VL A13c4

<400> 158

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Met

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 159 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VL A13c4
<400> 159
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Met Tyr Gin	Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105

<210> 160

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 191 027835

<223> CDR2 VL A13c4

<400> 160

Asp Thr Met Tyr Gin Ser Ser 1 5

<210> 161

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A17d4

<400> 161

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Ghr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Grp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Grp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Ghr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Ghr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

- 192 027835

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

<210> 162

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH A17d4

<400> 162

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 163

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH A17d4

<400> 163

Asp lie Trp Trp Asp Asp Lys Lys Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15

<210> 164

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL A17d4

<400> 164

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Leu

Pro

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

- 193 027835

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Met

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 165

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A17d4

<400> 165

Asp

lie

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Leu

Pro

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Met

Tyr

Gin

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Phe

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 166

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL A17d4

< 4 0 0 > 166

Leu Pro Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 15 10

- 194 027835

<210> 167

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A4B4

<400> 167

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

- 195 027835

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys 450

<210> 168 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH A4B4
<400> 168
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser
115	120

<210> 169 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A4B4
<400> 169
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Phe Leu	Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175

- 196 027835

Thr

Leu

Thr

Leu 180

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 170

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A4B4

<400> 170

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Phe

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 171

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A4B4

<400> 171

Asp Thr Phe Phe Leu Asp Ser 1 5

<210> 172

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A8c7

<400> 172

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

- 197 027835

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435 440 445

Gly Lys 450

<210> 173

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH A8c7

<400> 173

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

- 198 027835

Gly

Met

Ser 35

Val

Gly

Trp

lie

Arg 40

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys 45

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120

<210> 174

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL A8c7

<400> 174

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Pro

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Arg

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 175

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A8c7

<400> 175

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

- 199 027835

Asp

Arg

Val

Thr 20

lie

Thr

Cys

Ser

Ala 25

Ser

Ser

Arg

Val

Gly 30

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Arg

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100 105

<210> 176

<211> 451

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH IX-493L1FR

<400> 176

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Tyr

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

35

40

45

Glu

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

50

55

60

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

65

70

75

80

Val

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

85

90

95

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

115

120

125

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

130

135

140

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

145

150

155

160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

165

170

175

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

180

185

190

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

195

200

205

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

210

215

220

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

225

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

245

250

255

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

260

265

270

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

275

280

285

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

290

295

300

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

305

310

315

320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

- 200 027835

325

330

335

Glu

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

340

345

350

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

355

360

365

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

370

375

380

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

385

390

395

400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

405

410

415

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

420

425

430

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

435

440

445

Pro

Gly

Lys

450

<210> 177 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL IX-493L1FR
<400> 177
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Ser Lys Leu	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 178

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 201 027835

<223> Домен VL IX-493L1FR

<400> 178

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Ser

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100 105

<210> 179

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH M3H9

<400> 179

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

- 202 027835

Asn

Ala 290

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg 295

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn 300

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 180 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL M3H9
<400> 180
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Tyr Lys Gin	Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 181

- 203 027835

<211> 106 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VL M3H9
<400> 181
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Tyr Lys Gin	Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Leu Glu lie Lys
100	105

<210> 182 <211> 450 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VH Y10H6
<400> 182
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Ser Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115	120 125
Phe Pro Leu Ala Pro	Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130	135 140
Leu Gly Cys Leu Val	Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145	150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala	Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165	170 175
Leu Gin Ser Ser Gly	Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180	185 190
Ser Ser Ser Leu Gly	Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys
195	200 205
Pro Ser Asn Thr Lys	Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210	215 220
Lys Thr His Thr Cys	Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225	230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu	Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie

- 204 027835

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 183 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL Y10H6
<400> 183
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Arg Tyr Leu	Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205

- 205 027835

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 184

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL Y10H6

<400> 184

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Arg

Tyr

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 185

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL Y10H6

<400> 185

Asp Thr Arg Tyr Leu Ser Ser 1 5

<210> 186

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH DG

<400> 186

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Thr

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

- 206 027835

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> <211> <212> <213>	187 120 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Домен VH DG
<400>	187
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1	5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
	20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
	35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50		55 60

- 207 027835

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Thr

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120

<210> 188

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH DG

<400> 188

Asp Met lie Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Val 15 10

<210> 189

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL DG

<400> 189

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 190 <211> 450

- 208 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH AFFF(l)

<400> 190

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

- 209 027835

450

<210> 191

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL AFFF(l)

<400> 191

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Phe

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 192

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL AFFF(l)

<400> 192

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Phe

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

- 210 027835

100 105

<210> 193

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL AFFF(l)

<400> 193

Phe Gin Gly Ser Phe Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 194

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH 6H8

<400> 194

Gin 1	Val	Thr	Leu	Arg 5	Glu	Ser	Gly
Thr	Leu	Thr	Leu 20	Thr	Cys	Thr	Phe
Gly	Met	Ser 35	Val	Gly	Trp	lie	Arg 40
Trp	Leu 50	Ala	Asp	lie	Trp	Trp 55	Asp
Leu 65	Lys	Ser	Arg	Leu	Thr 70	lie	Ser
Val	Leu	Lys	Val	Thr 85	Asn	Met	Asp
Cys	Ala	Arg	Asp 100	Met	lie	Thr	Asn
Gly	Thr	Thr 115	Val	Thr	Val	Ser	Ser 120
Phe	Pro 130	Leu	Ala	Pro	Ser	Ser 135	Lys
Leu 145	Gly	Cys	Leu	Val	Lys 150	Asp	Tyr
Trp	Asn	Ser	Gly	Ala 165	Leu	Thr	Ser
Leu	Gin	Ser	Ser 180	Gly	Leu	Tyr	Ser
Ser	Ser	Ser 195	Leu	Gly	Thr	Gin	Thr 200
Pro	Ser 210	Asn	Thr	Lys	Val	Asp 215	Lys
Lys 225	Thr	His	Thr	Cys	Pro 230	Pro	Cys
Pro	Ser	Val	Phe	Leu 245	Phe	Pro	Pro
Ser	Arg	Thr	Pro 260	Glu	Val	Thr	Cys
Asp	Pro	Glu 275	Val	Lys	Phe	Asn	Trp 280
Asn	Ala 290	Lys	Thr	Lys	Pro	Arg 295	Glu
Val	Val	Ser	Val	Leu	Thr	Val	Leu

Pro	Ala 10	Leu	Val	Lys	Pro	Thr 15	Gin
Ser 25	Gly	Phe	Ser	Leu	Ser 30	Thr	Ala
Gin	Pro	Pro	Gly	Lys 45	Ala	Leu	Glu
Asp	Lys	Lys	Asp 60	Tyr	Asn	Pro	Ser
Lys	Asp	Thr 75	Ser	Lys	Asn	Gin	Val 80
Pro	Ala 90	Asp	Thr	Ala	Thr	Tyr 95	Tyr
Phe 105	Tyr	Phe	Asp	Val	Trp 110	Gly	Gin
Ala	Ser	Thr	Lys	Gly 125	Pro	Ser	Val
Ser	Thr	Ser	Gly 140	Gly	Thr	Ala	Ala
Phe	Pro	Glu 155	Pro	Val	Thr	Val	Ser 160
Gly	Val 170	His	Thr	Phe	Pro	Ala 175	Val
Leu 185	Ser	Ser	Val	Val	Thr 190	Val	Pro
Tyr	lie	Cys	Asn	Val 205	Asn	His	Lys
Arg	Val	Glu	Pro 220	Lys	Ser	Cys	Asp
Pro	Ala	Pro 235	Glu	Leu	Leu	Gly	Gly 240
Lys	Pro 250	Lys	Asp	Thr	Leu	Met 255	lie
Val 265	Val	Val	Asp	Val	Ser 270	His	Glu
Tyr	Val	Asp	Gly	Val 285	Glu	Val	His
Glu	Gin	Tyr	Asn 300	Ser	Thr	Tyr	Arg
His	Gin	Asp	Trp	Leu	Asn	Gly	Lys

- 211 027835

305 Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

310 Val

Ser

Asn

Lys

Ala

315 Leu

Pro

Ala

Pro

lie

320 Glu

Lys

Thr

lie

Ser

325 Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

330 Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

335 Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

340 Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

345 Met

Thr

Lys

Asn

Gin

350 Val

Ser

Leu

Thr

Cys

355 Leu

Val

Lys

Gly

Phe

360 Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

365 Ala

Val

Glu

Trp

Glu

370 Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

375 Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

380 Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385 Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

390 Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

395 Ser

Lys

Leu

Thr

Val

400 Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

405 Gin

Gin

Gly

Asn

Val

410 Phe

Ser

Cys

Ser

Val

415 Met

His

Glu

Ala

Leu

420 His

Asn

His

Tyr

Thr

425 Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

430 Leu

Ser

Pro

Gly

Lys 450

435

440

445

<210> 195 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL 6H8
<400> 195
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Lys Leu	Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 196

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 212 027835

<220>

<223> Домен VL 6H8

<400> 196

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100 105

<210> 197

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL 6H8

<400> 197

Asp Thr Phe Lys Leu Thr Ser 1 5

<210> 198

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH L1-7E5

<400> 198

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Thr

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

- 213 027835

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 199 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL L1-7E5
<400> 199
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Lys Leu	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125

- 214 027835

Ala

Ser 130

Val

Val

Cys

Leu

Leu 135

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 140

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 200

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL L1-7E5

<400> 200

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Arg

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 201

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH L2-15B10

<400> 201

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Thr

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

- 215 027835

Phe

Pro 130

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser 135

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly 140

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 202 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL L2-15B10
<400> 202
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Arg Leu	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr

- 216 027835

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 203 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VL L2-15B10
<400> 203
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Arg Leu	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Leu Glu lie Lys
100	105

<210> 204

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL L2-15B10

<400> 204

Asp Thr Phe Arg Leu Ala Ser 1 5

<210> 205

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A13all

- 217 027835

<400> 205

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

<210> 206 <211> 120

- 218 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH А13а11

<400> 206

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 207 <211> 214 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A13all
<400> 207
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Pro Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Tyr Arg His	Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50	55 60
Ser Gly Ser Gly Thr	Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65	70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr	Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe
85	90 95
Thr Phe Gly Gly Gly	Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala
100	105 110
Pro Ser Val Phe lie	Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115	120 125
Thr Ala Ser Val Val	Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130	135 140
Lys Val Gin Trp Lys	Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145	150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu	Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165	170 175
Ser Thr Leu Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180	185 190
Ala Cys Glu Val Thr	His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195	200 205
Phe Asn Arg Gly Glu	Cys
210

- 219 027835

<210> 208

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A13all

<400> 208

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Tyr

Arg

His

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 209

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A13all

<400> 209

Asp Thr Tyr Arg His Ser Ser 1 5

<210> 210

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH Alh5

<400> 210

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

- 220 027835

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

He

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

He

Glu

325

330

335

Lys

Thr

He

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

He

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 211 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL Alh5
<400> 211
Asp He Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr He	Thr Cys Ser Leu Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Phe His	Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95

- 221 027835

Phe

Gly

Gly

Gly 100

Thr

Lys

Val

Glu

lie 105

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 110

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 212 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VL Alh5
<400> 212
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Leu Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Phe Phe His	Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 213

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL Alh5

<400> 213

Ser Leu Ser Ser Ser Val	Gly Tyr Met His
1	5	10

<210>	214
<211>	7
<212>	Белок
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	CDR2 VL Alh5

- 222 027835

<400> 214

Asp Thr Phe Phe His Arg Ser 1 5

<210> 215

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A4B4(1)

<400> 215

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

- 223 027835

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly 405

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr 410

Ser

Lys

Leu

Thr

Val 415

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435 440 445

Gly Lys 450

<210> 216

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL A4B4(1)

<400> 216

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Leu

Leu

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 217

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A4B4(1)

<400> 217

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

- 224 027835

Asp

Thr 50

Leu

Leu

Leu

Asp

Ser 55

Gly

Val

Pro

Ser

Arg 60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100 105

<210> 218

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A4B4(1)

<400> 218

Asp Thr Leu Leu Leu Asp Ser 1 5

<210> 219

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A4B4L1

<400> 219

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

- 225 027835

Ser

Arg

Thr

Pro 260

Glu

Val

Thr

Cys

Val 265

Val

Val

Asp

Val

Ser 270

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 220 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A4B4L1
<400> 220
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Ser Lys Leu	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205
Asn Arg Gly Glu Cys

- 226 210

027835

<210> 221

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A4B4L1

<400> 221

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Ser

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 222

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A4B4-F25S

<400> 222

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

- 227 027835

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> 223 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A4B4-F25S
<400> 223
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Ser Phe Leu	Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175

- 228 027835

Thr

Leu

Thr

Leu 180

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 224

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A4B4-F25S

<400> 224

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Ser

Phe

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 225

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A4B4-F25S

<400> 225

Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser 1 5

<210> 226

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH H3-3F4

<400> 226

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

- 229 027835

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Ar g

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435 440 445

Gly Lys 450

<210> 227

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH H3-3F4

<400> 227

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu 20

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser 25

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser 30

Thr

Ala

- 230 027835

Gly

Met

Ser 35

Val

Gly

Trp

lie

Arg 40

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys 45

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120

<210> 228

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL H3-3F4

<400> 228

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 229

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL H3-3F4

<400> 229

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

- 231 027835

Asp

Arg

Val

Thr 20

lie

Thr

Cys

Ser

Ala 25

Ser

Ser

Ser

Val

Gly 30

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 230

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL

<400> 230

Asp Thr Arg Tyr Gin Ser Ser 1 5

<210> 231

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL M3H9

<400> 231

Asp Thr Tyr Lys Gin Thr Ser 1 5

<210> 232

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH IX-493L1FR

<400> 232

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Asp

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Ser

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

- 232 027835

115 120

<210> 233

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A3e2

<400> 233

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Gly

Asp

Lys

Gly

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

- 233 027835

Lys

Ser

Arg

Trp 420

Gin

Gin

Gly

Asn

Val 425

Phe

Ser

Cys

Ser

Val 430

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

<210> 234

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH A3e2

<400> 234

Gin 1

Val

Thr

Leu

Arg 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala 10

Leu

Val

Lys

Pro

Thr 15

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Gly

Asp

Lys

Gly

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 235

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH A3e2

<400> 235

Asp lie Trp Trp Gly Asp Lys Gly His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15

<210> 236

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL A3e2

<400> 236

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Tyr

Leu

His

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

- 234 027835

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 237

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A3e2

<400> 237

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Tyr

Leu

His

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100 105

<210> 238

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A3e2

<400> 238

Asp Thr Phe Tyr Leu His Ser
1	5
<210>	239
<211>	450
<212>	Белок

- 235 027835

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH А14а4

<400> 239

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

- 236 027835

<210> 240

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH A14a4

<400> 240

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Thr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> <211> <212> <213>	241 10 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	CDR3 VH A14a4
<400>	241
Asp Met lie Thr Asn	Trp Tyr Phe Asp Val
1	5	10

<210> 242 <211> 197 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A14a4
<400> 242
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Leu Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
1 5	10 15
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
20	25 30
Asp Thr Tyr Tyr Gin	Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
35	40 45
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
50	55 60
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
65	70 75 80
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
85	90 95
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

- 237 027835

100

105

110

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

115

120

125

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

130

135

140

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

145

150

155

160

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

165

170

175

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

180

185

190

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

195

<210> 243

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A14a4

<400> 243

Asp

lie

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Leu

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Tyr

Tyr

Gin

Thr

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 244

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL A14a4

<400> 244

Leu Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 15 10

<210> 245

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A14a4

<400> 245

Asp Thr Tyr Tyr Gin Thr Ser 1 5

- 238 027835

<210> 246

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VH A16b4

<400> 246

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

lie

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

- 239 027835

			420		425		430
Glu	Ala	Leu	His Asn His	Tyr Thr	Gin Lys	Ser Leu Ser	Leu Ser Pro
		435		440		445
Gly	Lys
	450

<210> 247 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH A16b4
<400> 247
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser
115	120

<210> 248 <211> 197 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A16b4
<400> 248
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Leu Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
1 5	10 15
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
20	25 30
Asp Thr Met Tyr Gin	Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
35	40 45
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
50	55 60
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
65	70 75 80
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
85	90 95
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
100	105 110
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
115	120 125
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
130	135 140
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
145	150 155 160
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

- 240 027835

165

170

175

Cys Glu Val 1'hr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 1'hr Hys Ser Phe

180

Asn Arg Gly Glu Cys 195

185

190

<210> 249

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A16b4

<400> 249

Asp

lie

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Leu

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Met

Tyr

Gin

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 250

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL A16b4

<400> 250

Leu Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met His 1 5 10

<210> 251

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A16b4

<400> 251

Asp Thr Met Tyr Gin Ala Ser 1 5

<210>	252
<211>	450
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>

- 241 027835

<223> Цепь VH A17b5

<400> 252

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Pro

Thr

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Gly

Met

Ser

Val

Gly

Trp

He

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

lie

Trp

Trp

Asp

Asp

Lys

Lys

His

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Asp

Arg

Leu

Thr

He

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Val

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Asp

Met

He

Phe

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

115

120

125

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

130

135

140

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

He

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

He

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

He

Glu

325

330

335

Lys

Thr

He

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

He

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly Lys 450

<210> 253

- 242 027835

<211> 120 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Домен VH A17b5
<400> 253
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser
115	120

<210> 254 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VL A17b5
<400> 254
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20	25 30
His Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr
35	40 45
Asp Thr Tyr Tyr Leu	Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50	55 60
Gly Ser Gly Thr Glu	Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp
65	70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr	Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85	90 95
Phe Gly Gly Gly Thr	Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100	105 110
Ser Val Phe lie Phe	Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115	120 125
Ala Ser Val Val Cys	Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130	135 140
Val Gin Trp Lys Val	Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145	150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165	170 175
Thr Leu Thr Leu Ser	Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180	185 190
Cys Glu Val Thr His	Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195	200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

- 243 027835

<210> 255

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A17b5

<400> 255

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Tyr

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> <211> <212> <213>	256 7 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	CDR2 VL A17b5
<400>	256
Asp Thr Tyr Tyr Leu	Pro Ser
1	5

<210> 257 <211> 450 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Цепь VH А17Б5
<400> 257
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50	55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65	70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85	90 95
Cys Ala Arg Asp Met	lie Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
100	105 110
Gly Thr Thr Val Thr	Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115	120 125

- 244 027835

Phe

Pro 130

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser 135

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly 140

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

145

150

155

160

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165

170

175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

195

200

205

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

210

215

220

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

225

230

235

240

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

245

250

255

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

275

280

285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

290

295

300

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

325

330

335

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

340

345

350

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

370

375

380

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

385

390

395

400

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

405

410

415

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Gly

Lys

450

<210> <211> <212> <213>	258 120 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Домен VH А17Д5
<400>	258
Gin Val Thr Leu Arg	Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin
1	5	10 15
Thr Leu Thr Leu Thr	Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
	20	25 30
Gly Met Ser Val Gly	Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
	35	40 45
Trp Leu Ala Asp lie	Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50		55 60
Leu Lys Asp Arg Leu	Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val
65		70 75 80
Val Leu Lys Val Thr	Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

- 245 027835

	85	90	95
Cys	Ala	Arg	Asp	Met	lie	Phe	Asn	Trp	Tyr Phe Asp Val	Trp	Gly Gin
			100					105		110
Gly	Thr	Thr	Val	Thr	Val	Ser	Ser

115 120

<210> 259

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH А17Б5

<400> 259

Asp lie Trp Trp Asp Asp Lys	Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp
1	5	10	15

<210> 260

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL А17Б5

<400> 260

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Arg

His

Thr

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 261

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 246 027835

<220>

<223> Домен VL А17Б5

<400> 261

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Arg

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Phe

Arg

His

Thr

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100 105

<210> 262

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL А17Б5

<400> 262

Asp Thr Phe Arg His Thr Ser 1 5

<210> 263

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Цепь VL A17h4

<400> 263

Asp 1

lie

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Pro

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Tyr

Tyr

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

- 247 027835

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 264

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL A17h4

<400> 264

Asp

lie

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Ser

Pro

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

35

40

45

Asp

Thr

Tyr

Tyr

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

Gly

Tyr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lie

Lys

100

105

<210> 265

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL A17h4

<400> 265

Ser Pro Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His

10

<210> 266

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL A17h4

<400> 266

Asp Thr Tyr Tyr Leu Ala Ser 1 5

<210> 267

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 248 027835

<220>

<223> Линкер

<400> 267

Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 15 10 15

Gly Gly

<210> 268

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 268

Gly Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

10

15

<210> 269

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 269

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

10

<210> 270

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 270

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gin

10

15

<210> 271

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 271

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp 15 10

<210> 272 <211> 14

- 249 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 272

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 15 10

<210> 273

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 273

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gin Leu Ala Gin Phe Arg Ser 15 10 15

Leu Asp

<210> 274

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 274

Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp 15 10 15

<210> 275

<211> 298

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 275

Met

Ser

Lys

Thr

Lys

Asp

Gin

Arg

Thr

Ala

Lys

Thr

Leu

Glu

Arg

Thr

1

5

10

15

Trp

Asp

Thr

Leu

Asn

His

Leu

Leu

Phe

lie

Ser

Ser

Cys

Leu

Tyr

Lys

20

25

30

Leu

Asn

Leu

Lys

Ser

lie

Ala

Gin

lie

Thr

Leu

Ser

lie

Leu

Ala

Met

35

40

45

lie

lie

Ser

Thr

Ser

Leu

lie

lie

Ala

Ala

lie

lie

Phe

lie

Ala

Ser

50

55

60

Ala

Asn

His

Lys

Val

Thr

Leu

Thr

Thr

Ala

lie

lie

Gin

Asp

Ala

Thr

65

70

75

80

Asn

Gin

lie

Lys

Asn

Thr

Thr

Pro

Thr

Tyr

Leu

Thr

Gin

Asn

Pro

Gin

85

90

95

Leu

Gly

lie

Ser

Phe

Ser

Asn

Leu

Ser

Glu

Thr

Thr

Ser

Gin

Pro

lie

100

105

110

Thr

lie

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Pro

Ser

Ala

Glu

Ser

Thr

Pro

Gin

Ser

115

120

125

Thr

Thr

Val

Lys

Thr

Lys

Asn

Thr

Thr

Thr

Thr

Gin

lie

Gin

Pro

Ser

130

135

140

Lys

Ser

Thr

Thr

Lys

Gin

Arg

Gin

Asn

Lys

Pro

Gin

Asn

Lys

Pro

Asn

- 250 027835

145

150

155

160

Asn

Asp

Phe

His

Phe

Glu

Val

Phe

Asn

Phe

Val

Pro

Cys

Ser

lie

Cys

165

170

175

Ser

Asn

Asn

Pro

Thr

Cys

Trp

Ala

lie

Cys

Lys

Arg

lie

Pro

Asn

Lys

180

185

190

Lys

Pro

Gly

Lys

Lys

Thr

Thr

Thr

Lys

Pro

Thr

Lys

Lys

Pro

Thr

lie

195

200

205

Lys

Thr

Thr

Lys

Lys

Asp

Leu

Lys

Pro

Gin

Thr

Thr

Lys

Ser

Lys

Glu

210

215

220

Val

Leu

Thr

Thr

Lys

Pro

Thr

Glu

Lys

Pro

Thr

lie

Asn

Thr

Thr

Lys

225

230

235

240

Thr

Asn

lie

Arg

Thr

Thr

Leu

Leu

lie

Ser

Asn

Thr

Thr

Gly

Asn

Pro

245

250

255

Glu

His

Thr

Ser

Gin

Lys

Glu

Thr

Leu

His

Ser

Thr

Thr

Ser

Glu

Gly

260

265

270

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Val

Tyr

Thr

Thr

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ser

Gin

275

280

285

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Asn

Thr

Thr

Tyr

Tyr

290 295

<210> 276

<211> 2165

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 276

Met

Asp

Pro

lie

lie

Asn

Gly

Asn

Ser

Ala

Asn

Val

Tyr

Leu

Thr

Asp

1

5

10

15

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Val

lie

Ser

Phe

Ser

Glu

Cys

Asn

Ala

Leu

Gly

20

25

30

Ser

Tyr

lie

Phe

Asn

Gly

Pro

Tyr

Leu

Lys

Asn

Asp

Tyr

Thr

Asn

Leu

35

40

45

lie

Ser

Arg

Gin

Asn

Pro

Leu

lie

Glu

His

Met

Asn

Leu

Lys

Lys

Leu

50

55

60

Asn

lie

Thr

Gin

Ser

Leu

lie

Ser

Lys

Tyr

His

Lys

Gly

Glu

lie

Lys

65

70

75

80

Leu

Glu

Glu

Pro

Thr

Tyr

Phe

Gin

Ser

Leu

Leu

Met

Thr

Tyr

Lys

Ser

85

90

95

Met

Thr

Ser

Ser

Glu

Gin

lie

Ala

Thr

Thr

Asn

Leu

Leu

Lys

Lys

lie

100

105

110

lie

Arg

Arg

Ala

lie

Glu

lie

Ser

Asp

Val

Lys

Val

Tyr

Ala

lie

Leu

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Lys

Glu

Lys

Asp

Lys

lie

Lys

Ser

Asn

Asn

Gly

130

135

140

Gin

Asp

Glu

Asp

Asn

Ser

Val

lie

Thr

Thr

lie

lie

Lys

Asp

Asp

lie

145

150

155

160

Leu

Ser

Ala

Val

Lys

Asp

Asn

Gin

Ser

His

Leu

Lys

Ala

Asp

Lys

Asn

165

170

175

His

Ser

Thr

Lys

Gin

Lys

Asp

Thr

lie

Lys

Thr

Thr

Leu

Leu

Lys

Lys

180

185

190

Leu

Met

Cys

Ser

Met

Gin

His

Pro

Pro

Ser

Trp

Leu

lie

His

Trp

Phe

195

200

205

Asn

Leu

Tyr

Thr

Lys

Leu

Asn

Asn

lie

Leu

Thr

Gin

Tyr

Arg

Ser

Asn

210

215

220

Glu

Val

Lys

Asn

His

Gly

Phe

Thr

Leu

lie

Asp

Asn

Gin

Thr

Leu

Ser

225

230

235

240

Gly

Phe

Gin

Phe

lie

Leu

Asn

Gin

Tyr

Gly

Cys

lie

Val

Tyr

His

Lys

245

250

255

Glu

Leu

Lys

Arg

lie

Thr

Val

Thr

Thr

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Thr

Trp

260

265

270

Lys

Asp

lie

Ser

Leu

Ser

Arg

Leu

Asn

Val

Cys

Leu

lie

Thr

Trp

lie

275

280

285

Ser

Asn

Cys

Leu

Asn

Thr

Leu

Asn

Lys

Ser

Leu

Gly

Leu

Arg

Cys

Gly

- 251 027835

290

295

300

Phe

Asn

Asn

Val

lie

Leu

Thr

Gin

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Asp

Cys

He

305

310

315

320

Leu

Lys

Leu

Phe

His

Asn

Glu

Gly

Phe

Tyr

He

He

Lys

Glu

Val

Glu

325

330

335

Gly

Phe

lie

Met

Ser

Leu

lie

Leu

Asn

He

Thr

Glu

Glu

Asp

Gin

Phe

340

345

350

Arg

Lys

Arg

Phe

Tyr

Asn

Ser

Met

Leu

Asn

Asn

He

Thr

Asp

Ala

Ala

355

360

365

Asn

Lys

Ala

Gin

Lys

Asn

Leu

Leu

Ser

Arg

Val

Cys

His

Thr

Leu

Leu

370

375

380

Asp

Lys

Thr

Val

Ser

Asp

Asn

lie

lie

Asn

Gly

Arg

Trp

He

He

Leu

385

390

395

400

Leu

Ser

Lys

Phe

Leu

Lys

Leu

lie

Lys

Leu

Ala

Gly

Asp

Asn

Asn

Leu

405

410

415

Asn

Asn

Leu

Ser

Glu

Leu

Tyr

Phe

Leu

Phe

Arg

He

Phe

Gly

His

Pro

420

425

430

Met

Val

Asp

Glu

Arg

Gin

Ala

Met

Asp

Ala

Val

Lys

He

Asn

Cys

Asn

435

440

445

Glu

Thr

Lys

Phe

Tyr

Leu

Leu

Ser

Ser

Leu

Ser

Met

Leu

Arg

Gly

Ala

450

455

460

Phe

lie

Tyr

Arg

lie

lie

Lys

Gly

Phe

Val

Asn

Asn

Tyr

Asn

Arg

Trp

465

470

475

480

Pro

Thr

Leu

Arg

Asn

Ala

lie

Val

Leu

Pro

Leu

Arg

Trp

Leu

Thr

Tyr

485

490

495

Tyr

Lys

Leu

Asn

Thr

Tyr

Pro

Ser

Leu

Leu

Glu

Leu

Thr

Glu

Arg

Asp

500

505

510

Leu

lie

Val

Leu

Ser

Gly

Leu

Arg

Phe

Tyr

Arg

Glu

Phe

Arg

Leu

Pro

515

520

525

Lys

Lys

Val

Asp

Leu

Glu

Met

lie

He

Asn

Asp

Lys

Ala

He

Ser

Pro

530

535

540

Pro

Lys

Asn

Leu

lie

Trp

Thr

Ser

Phe

Pro

Arg

Asn

Tyr

Met

Pro

Ser

545

550

555

560

His

lie

Gin

Asn

Tyr

lie

Glu

His

Glu

Lys

Leu

Lys

Phe

Ser

Glu

Ser

565

570

575

Asp

Lys

Ser

Arg

Arg

Val

Leu

Glu

Tyr

Tyr

Leu

Arg

Asp

Asn

Lys

Phe

580

585

590

Asn

Glu

Cys

Asp

Leu

Tyr

Asn

Cys

Val

Val

Asn

Gin

Ser

Tyr

Leu

Asn

595

600

605

Asn

Pro

Asn

His

Val

Val

Ser

Leu

Thr

Gly

Lys

Glu

Arg

Glu

Leu

Ser

610

615

620

Val

Gly

Arg

Met

Phe

Ala

Met

Gin

Pro

Gly

Met

Phe

Arg

Gin

Val

Gin

625

630

635

640

lie

Leu

Ala

Glu

Lys

Met

lie

Ala

Glu

Asn

He

Leu

Gin

Phe

Phe

Pro

645

650

655

Glu

Ser

Leu

Thr

Arg

Tyr

Gly

Asp

Leu

Glu

Leu

Gin

Lys

He

Leu

Glu

660

665

670

Leu

Lys

Ala

Gly

lie

Ser

Asn

Lys

Ser

Asn

Arg

Tyr

Asn

Asp

Asn

Tyr

675

680

685

Asn

Asn

Tyr

lie

Ser

Lys

Cys

Ser

lie

He

Thr

Asp

Leu

Ser

Lys

Phe

690

695

700

Asn

Gin

Ala

Phe

Arg

Tyr

Glu

Thr

Ser

Cys

He

Cys

Ser

Asp

Val

Leu

705

710

715

720

Asp

Glu

Leu

His

Gly

Val

Gin

Ser

Leu

Phe

Ser

Trp

Leu

His

Leu

Thr

725

730

735

lie

Pro

His

Val

Thr

lie

lie

Cys

Thr

Tyr

Arg

His

Ala

Pro

Pro

Tyr

740

745

750

lie

Gly

Asp

His

lie

Val

Asp

Leu

Asn

Asn

Val

Asp

Glu

Gin

Ser

Gly

755

760

765

Leu

Tyr

Arg

Tyr

His

Met

Gly

Gly

He

Glu

Gly

Trp

Cys

Gin

Lys

Leu

770

775

780

Trp

Thr

lie

Glu

Ala

lie

Ser

Leu

Leu

Asp

Leu

He

Ser

Leu

Lys

Gly

785

790

795

800

Lys

Phe

Ser

lie

Thr

Ala

Leu

lie

Asn

Gly

Asp

Asn

Gin

Ser

He

Asp

- 252 027835

lie

Ser

Lys

Pro

805 He

Arg

Leu

Met

Glu

810 Gly

Gin

Thr

His

Ala

815 Gin Ala

Asp

Tyr

Leu

820 Leu

Ala

Leu

Asn

Ser

825 Leu

Lys

Leu

Leu

Tyr

830 Lys

Glu Tyr

Ala

Gly

835 He

Gly

His

Lys

Leu

840 Lys

Gly

Thr

Glu

Thr

845 Tyr

He

Ser Arg

Asp

850 Met

Gin

Phe

Met

Ser

855 Lys

Thr

He

Gin

His

860 Asn

Gly

Val

Tyr Tyr

865 Pro

Ala

Ser

He

Lys

870 Lys

Val

Leu

Arg

Val

875 Gly

Pro

Trp

He

880 Asn Thr

lie

Leu

Asp

Asp

885 Phe

Lys

Val

Ser

Leu

890 Glu

Ser

He

Gly

Ser

895 Leu Thr

Gin

Glu

Leu

900 Glu

Tyr

Arg

Gly

Glu

905 Ser

Leu

Leu

Cys

Ser

910 Leu

He Phe

Arg

Asn

915 Val

Trp

Leu

Tyr

Asn

920 Gin

He

Ala

Leu

Gin

925 Leu

Lys

Asn His

Ala

930 Leu

Cys

Asn

Asn

Lys

935 Leu

Tyr

Leu

Asp

He

940 Leu

Lys

Val

Leu Lys

945 His

Leu

Lys

Thr

Phe

950 Phe

Asn

Leu

Asp

Asn

955 He

Asp

Thr

Ala

960 Leu Thr

Leu

Tyr

Met

Asn

965 Leu

Pro

Met

Leu

Phe

970 Gly

Gly

Gly

Asp

Pro

975 Asn Leu

Leu

Tyr

Arg

980 Ser

Phe

Tyr

Arg

Arg

985 Thr

Pro

Asp

Phe

Leu

990 Thr

Glu Ala

lie

Val

995 His

Ser

Val

Phe

He

1000 Leu

1 Ser

Tyr

Tyr

Thr

1005 Asn

) His

Asp Leu

Lys

1010 Asp

1 Lys

Leu

Gin

Asp

1015 Leu

Ser

Asp

Asp

Arg

1020 Leu

1 Asn

Lys

Phe Leu

1025 Thr

) Cys

He

He

Thr

103C Phe

1 Asp

Lys

Asn

Pro

1035 Asn

Ala

Glu

Phe

1040 Val Thr

Leu

Met

Arg

Asp

1045 Pro

) Gin

Ala

Leu

Gly

1050 Ser

1 Glu

Arg

Gin

Ala

1055 Lys He

Thr

Ser

Glu

1060 He

1 Asn

Arg

Leu

Ala

1065 Val

) Thr

Glu

Val

Leu

1070 Ser

1 Thr Ala

Pro

Asn

1075 Lys

He

Phe

Ser

Lys

1080 Ser

1 Ala

Gin

His

Tyr

1085 Thr

) Thr

Thr Glu

lie

1090 Asp

1 Leu

Asn

Asp

He

1095 Met

Gin

Asn

He

Glu

HOC Pro

1 Thr

Tyr

Pro His

1105 Gly

) Leu

Arg

Val

Val

111C Tyr

1 Glu

Ser

Leu

Pro

1115 Phe

Tyr

Lys

Ala

1120 Glu Lys

He

Val

Asn

Leu

1125 He

) Ser

Gly

Thr

Lys

1130 Ser

1 He

Thr

Asn

He

1135 Leu Glu

Lys

Thr

Ser

1140 Ala

1 He

Asp

Leu

Thr

1145 Asp

1 He

Asp

Arg

Ala

1150 Thr

1 Glu Met

Met

Arg

1155 Lys

Asn

He

Thr

Leu

1160 Leu

1 He

Arg

He

Leu

1165 Pro

) Leu

Asp Cys

Asn

1170 Arg

1 Asp

Lys

Arg

Glu

1175 He

Leu

Ser

Met

Glu

1180 Asn

1 Leu

Ser

He Thr

1185 Glu

) Leu

Ser

Lys

Tyr

119C Val

1 Arg

Glu

Arg

Ser

1195 Trp

Ser

Leu

Ser

1200 Asn He

Val

Gly

Val

Thr

1205 Ser

) Pro

Ser

He

Met

1210 Tyr

1 Thr

Met

Asp

He

1215 Lys Tyr

Thr

Thr

Ser

1220 Thr

1 He

Ser

Ser

Gly

1225 He

1 He

He

Glu

Lys

1230 Tyr

1 Asn Val

Asn

Ser

1235 Leu

Thr

Arg

Gly

Glu

1240 Arg

1 Gly

Pro

Thr

Lys

1245 Pro

) Trp

Val Gly

Ser

1250 Ser

1 Thr

Gin

Glu

Lys

1255 Lys

Thr

Met

Pro

Val

1260 Tyr

1 Asn

Arg

Gin Val

1265 Leu

) Thr

Lys

Lys

Gin

127C Arg

1 Asp

Gin

He

Asp

1275 Leu

Leu

Ala

Lys

1280 Leu Asp

Trp

Val

Tyr

Ala

1285 Ser

) lie

Asp

Asn

Lys

1290 Asp

1 Glu

Phe

Met

Glu

1295 Glu Leu

Ser

lie

Gly

1300 Thr

1 Leu

Gly

Leu

Thr

1305 Tyr

) Glu

Lys

Ala

Lys

1310 Lys

1 Leu Phe

- 253 027835

	1315	1320	1325
Pro Gin	Tyr Leu Ser Val Asn	Tyr	Leu His Arg Leu Thr Val Ser Ser
1330	1335		1340
Arg Pro	Cys Glu Phe Pro Ala	Ser	lie Pro Ala Tyr Arg Thr Thr Asn
1345	1350		1355 1360
Tyr His	Phe Asp Thr Ser Pro 1365	lie	Asn Arg lie Leu Thr Glu Lys Tyr 1370 1375
Gly Asp	Glu Asp lie Asp lie 1380	Val	Phe Gin Asn Cys lie Ser Phe Gly 1385 1390
Leu Ser	Leu Met Ser Val Val	Glu	Gin Phe Thr Asn Val Cys Pro Asn
	1395	1400	1405
Arg lie	lie Leu lie Pro Lys	Leu	Asn Glu lie His Leu Met Lys Pro
1410	1415		1420
Pro lie	Phe Thr Gly Asp Val	Asp	lie His Lys Leu Lys Gin Val lie
1425	1430		1435 1440
Gin Lys	Gin His Met Phe Leu 1445	Pro	Asp Lys lie Ser Leu Thr Gin Tyr 1450 1455
Val Glu	Leu Phe Leu Ser Asn 1460	Lys	Thr Leu Lys Ser Gly Ser His Val 1465 1470
Asn Ser	Asn Leu lie Leu Ala	His	Lys lie Ser Asp Tyr Phe His Asn
	1475	1480	1485
Thr Tyr	lie Leu Ser Thr Asn	Leu	Ala Gly His Trp lie Leu lie lie
1490	1495		1500
Gin Leu	Met Lys Asp Ser Lys	Gly	lie Phe Glu Lys Asp Trp Gly Glu
1505	1510		1515 1520
Gly Tyr	lie Thr Asp His Met 1525	Phe	lie Asn Leu Lys Val Phe Phe Asn 1530 1535
Ala Tyr	Lys Thr Tyr Leu Leu 1540	Cys	Phe His Lys Gly Tyr Gly Lys Ala 1545 1550
Lys Leu	Glu Cys Asp Met Asn	Thr	Ser Asp Leu Leu Cys Val Leu Glu
	1555	1560	1565
Leu lie	Asp Ser Ser Tyr Trp	Lys	Ser Met Ser Lys Val Phe Leu Glu
1570	1575		1580
Gin Lys	Val lie Lys Tyr lie	Leu	Ser Gin Asp Ala Ser Leu His Arg
1585	1590		1595 1600
Val Lys	Gly Cys His Ser Phe 1605	Lys	Leu Trp Phe Leu Lys Arg Leu Asn 1610 1615
Val Ala	Glu Phe Thr Val Cys 1620	Pro	Trp Val Val Asn lie Asp Tyr His 1625 1630
Pro Thr	His Met Lys Ala lie	Leu	Thr Tyr lie Asp Leu Val Arg Met
	1635	1640	1645
Gly Leu	lie Asn lie Asp Arg	lie	His lie Lys Asn Lys His Lys Phe
1650	1655		1660
Asn Asp	Glu Phe Tyr Thr Ser	Asn	Leu Phe Tyr lie Asn Tyr Asn Phe
1665	1670		1675 1680
Ser Asp	Asn Thr His Leu Leu 1685	Thr	Lys His lie Arg lie Ala Asn Ser 1690 1695
Glu Leu	Glu Asn Asn Tyr Asn 1700	Lys	Leu Tyr His Pro Thr Pro Glu Thr 1705 1710
Leu Glu	Asn lie Leu Ala Asn	Pro	lie Lys Ser Asn Asp Lys Lys Thr
	1715	1720	1725
Leu Asn	Asp Tyr Cys lie Gly	Lys	Asn Val Asp Ser lie Met Leu Pro
1730	1735		1740
Leu Leu	Ser Asn Lys Lys Leu	lie	Lys Ser Ser Ala Met lie Arg Thr
1745	1750		1755 1760
Asn Tyr	Ser Lys Gin Asp Leu 1765	Tyr	Asn Leu Phe Pro Met Val Val lie 1770 1775
Asp Arg	lie lie Asp His Ser 1780	Gly	Asn Thr Ala Lys Ser Asn Gin Leu 1785 1790
Tyr Thr	Thr Thr Ser His Gin	lie	Ser Leu Val His Asn Ser Thr Ser
	1795	1800	1805
Leu Tyr	Cys Met Leu Pro Trp	His	His lie Asn Arg Phe Asn Phe Val
1810	1815		1820
Phe Ser	Ser Thr Gly Cys Lys	lie	Ser lie Glu Tyr lie Leu Lys Asp

- 254 027835

1825	1830	1835	1840
Leu Lys lie Lys Asp	Pro	Asn Cys lie Ala Phe	lie Gly Glu Gly Ala
1845	1850	1855
Gly Asn Leu Leu Leu	Arg	Thr Val Val Glu Leu	His Pro Asp lie Arg
1860		1865	1870
Tyr lie Tyr Arg Ser	Leu	Lys Asp Cys Asn Asp	His Ser Leu Pro lie
1875		1880	1885
Glu Phe Leu Arg Leu	Tyr	Asn Gly His lie Asn	lie Asp Tyr Gly Glu
1890		1895	1900
Asn Leu Thr lie Pro	Ala	Thr Asp Ala Thr Asn	Asn lie His Trp Ser
1905	1910	1915	1920
Tyr Leu His lie Lys	Phe	Ala Glu Pro lie Ser	Leu Phe Val Cys Asp
1925	1930	1935
Ala Glu Leu Ser Val	Thr	Val Asn Trp Ser Lys	lie lie lie Glu Trp
1940		1945	1950
Ser Lys His Val Arg	Lys	Cys Lys Tyr Cys Ser	Ser Val Asn Lys Cys
1955		1960	1965
Met Leu lie Val Lys	Tyr	His Ala Gin Asp Asp	lie Asp Phe Lys Leu
1970		1975	1980
Asp Asn lie Thr lie	Leu	Lys Thr Tyr Val Cys	Leu Gly Ser Lys Leu
1985	1990	1995	2000
Lys Gly Ser Glu Val	Tyr	Leu Val Leu Thr lie	Gly Pro Ala Asn lie
2005	2010	2015
Phe Pro Val Phe Asn	Val	Val Gin Asn Ala Lys	Leu lie Leu Ser Arg
2020		2025	2030
Thr Lys Asn Phe lie	Met	Pro Lys Lys Ala Asp	Lys Glu Ser lie Asp
2035		2040	2045
Ala Asn lie Lys Ser	Leu	lie Pro Phe Leu Cys	Tyr Pro lie Thr Lys
2050		2055	2060
Lys Gly lie Asn Thr	Ala	Leu Ser Lys Leu Lys	Ser Val Val Ser Gly
2065	2070	2075	2080
Asp lie Leu Ser Tyr	Ser	lie Ala Gly Arg Asn	Glu Val Phe Ser Asn
2085	2090	2095
Lys Leu lie Asn His	Lys	His Met Asn lie Leu	Lys Trp Phe Asn His
2100		2105	2110
Val Leu Asn Phe Arg	Ser	Thr Glu Leu Asn Tyr	Asn His Leu Tyr Met
2115		2120	2125
Val Glu Ser Thr Tyr	Pro	Tyr Leu Ser Glu Leu	Leu Asn Ser Leu Thr
2130		2135	2140
Thr Asn Glu Leu Lys	Lys	Leu lie Lys lie Thr	Gly Ser Leu Leu Tyr
2145	2150	2155	2160
Asn Phe His Asn Glu

2165

<210> 277

<211> 391

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 277

Met

Ala

Leu

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Asn

Asp

Thr

Leu

Asn

Lys

Asp

Gin

1

5

10

15

Leu

Leu

Ser

Ser

Ser

Lys

Tyr

Thr

lie

Gin

Arg

Ser

Thr

Gly

Asp

Asn

20

25

30

lie

Asp

Thr

Pro

Asn

Tyr

Asp

Val

Gin

Lys

His

Leu

Asn

Lys

Leu

Cys

35

40

45

Gly

Met

Leu

Leu

lie

Thr

Glu

Asp

Ala

Asn

His

Lys

Phe

Thr

Gly

Leu

50

55

60

lie

Gly

Met

Leu

Tyr

Ala

Met

Ser

Arg

Leu

Gly

Arg

Glu

Asp

Thr

lie

65

70

75

80

Lys

lie

Leu

Lys

Asp

Ala

Gly

Tyr

His

Val

Lys

Ala

Asn

Gly

Val

Asp

85

90

95

lie

Thr

Thr

Tyr

Arg

Gin

Asp

lie

Asn

Gly

Lys

Glu

Met

Lys

Phe

Glu

- 255 027835

100

105

110

Val

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

lie

Gin

Val

Asn

lie

Glu

115

120

125

lie

Glu

Ser

Arg

Lys

Ser

Tyr

Lys

Lys

Leu

Leu

Lys

Glu

Met

Gly

Glu

130

135

140

Val

Ala

Pro

Glu

Tyr

Arg

His

Asp

Ser

Pro

Asp

Cys

Gly

Met

lie

lie

145

150

155

160

Leu

Cys

lie

Ala

Ala

Leu

Val

lie

Thr

Lys

Leu

Ala

Ala

Gly

Asp

Arg

165

170

175

Ser

Gly

Leu

Thr

Ala

Val

lie

Arg

Arg

Ala

Asn

Asn

Val

Leu

Lys

Asn

180

185

190

Glu

lie

Lys

Arg

Tyr

Lys

Gly

Leu

lie

Pro

Lys

Asp

lie

Ala

Asn

Ser

195

200

205

Phe

Tyr

Glu

Val

Phe

Glu

Lys

His

Pro

His

Leu

lie

Asp

Val

Phe

Val

210

215

220

His

Phe

Gly

lie

Ala

Gin

Ser

Ser

Thr

Arg

Gly

Gly

Ser

Arg

Val

Glu

225

230

235

240

Gly

lie

Phe

Ala

Gly

Leu

Phe

Met

Asn

Ala

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gin

Val

245

250

255

Met

Leu

Arg

Trp

Gly

Val

Leu

Ala

Lys

Ser

Val

Lys

Asn

lie

Met

Leu

260

265

270

Gly

His

Ala

Ser

Val

Gin

Ala

Glu

Met

Glu

Gin

Val

Val

Glu

Val

Tyr

275

280

285

Glu

Tyr

Ala

Gin

Lys

Leu

Gly

Gly

Glu

Ala

Gly

Phe

Tyr

His

lie

Leu

290

295

300

Asn

Asn

Pro

Lys

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Gin

Phe

Pro

Asn

Phe

305

310

315

320

Ser

Ser

Val

Val

Leu

Gly

Asn

Ala

Ala

Gly

Leu

Gly

lie

Met

Gly

Glu

325

330

335

Tyr

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Asn

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

340

345

350

Tyr

Ala

Glu

Gin

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Val

lie

Asn

Tyr

Ser

Val

Leu

355

360

365

Asp

Leu

Thr

Ala

Glu

Glu

Leu

Glu

Ala

lie

Lys

His

Gin

Leu

Asn

Pro

370

375

380

Lys

Glu

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

385 390

<210> 278

<211> 391

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 278

Met

Ala

Leu

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Asn

Asp

Thr

Leu

Asn

Lys

Asp

Gin

1

5

10

15

Leu

Leu

Ser

Ser

Ser

Lys

Tyr

Thr

lie

Gin

Arg

Ser

Thr

Gly

Asp

Ser

20

25

30

lie

Asp

Thr

Pro

Asn

Tyr

Asp

Val

Gin

Lys

His

lie

Asn

Lys

Leu

Cys

35

40

45

Gly

Met

Leu

Leu

lie

Thr

Glu

Asp

Ala

Asn

His

Lys

Phe

Thr

Gly

Leu

50

55

60

lie

Gly

Met

Leu

Tyr

Ala

Met

Ser

Arg

Leu

Gly

Arg

Glu

Asp

Thr

lie

65

70

75

80

Lys

lie

Leu

Arg

Asp

Ala

Gly

Tyr

His

Val

Lys

Ala

Asn

Gly

Val

Asp

85

90

95

Val

Thr

Thr

His

Arg

Gin

Asp

lie

Asn

Gly

Lys

Glu

Met

Lys

Phe

Glu

100

105

110

Val

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Thr

Glu

lie

Gin

lie

Asn

lie

Glu

115

120

125

lie

Glu

Ser

Arg

Lys

Ser

Tyr

Lys

Lys

Met

Leu

Lys

Glu

Met

Gly

Glu

130

135

140

Val

Ala

Pro

Glu

Tyr

Arg

His

Asp

Ser

Pro

Asp

Cys

Gly

Met

lie

lie

- 256 027835

145

150

155

160

Leu

Cys

lie

Ala

Ala

Leu

Val

lie

Thr

Lys

Leu

Ala

Ala

Gly

Asp

Arg

165

170

175

Ser

Gly

Leu

Thr

Ala

Val

lie

Arg

Arg

Ala

Asn

Asn

Val

Leu

Lys

Asn

180

185

190

Glu

Met

Lys

Arg

Tyr

Lys

Gly

Leu

Leu

Pro

Lys

Asp

lie

Ala

Asn

Ser

195

200

205

Phe

Tyr

Glu

Val

Phe

Glu

Lys

Tyr

Pro

His

Phe

lie

Asp

Val

Phe

Val

210

215

220

His

Phe

Gly

lie

Ala

Gin

Ser

Ser

Thr

Arg

Gly

Gly

Ser

Arg

Val

Glu

225

230

235

240

Gly

lie

Phe

Ala

Gly

Leu

Phe

Met

Asn

Ala

Tyr

Gly

Ala

Gly

Gin

Val

245

250

255

Met

Leu

Arg

Trp

Gly

Val

Leu

Ala

Lys

Ser

Val

Lys

Asn

lie

Met

Leu

260

265

270

Gly

His

Ala

Ser

Val

Gin

Ala

Glu

Met

Glu

Gin

Val

Val

Glu

Val

Tyr

275

280

285

Glu

Tyr

Ala

Gin

Lys

Leu

Gly

Gly

Glu

Ala

Gly

Phe

Tyr

His

lie

Leu

290

295

300

Asn

Asn

Pro

Lys

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Gin

Phe

Pro

His

Phe

305

310

315

320

Ser

Ser

Val

Val

Leu

Gly

Asn

Ala

Ala

Gly

Leu

Gly

lie

Met

Gly

Glu

325

330

335

Tyr

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Asn

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

340

345

350

Tyr

Ala

Glu

Gin

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Val

lie

Asn

Tyr

Ser

Val

Leu

355

360

365

Asp

Leu

Thr

Ala

Glu

Glu

Leu

Glu

Ala

lie

Lys

His

Gin

Leu

Asn

Pro

370

375

380

Lys

Asp

Asn

Asp

Val

Glu

Leu

385 390

<210> 279

<211> 241

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 279

Met 1

Glu

Lys

Phe

Ala 5

Pro

Glu

Phe

His

Gly 10

Glu

Asp

Ala

Asn

Asn 15

Arg

Ala

Thr

Lys

Phe

Leu

Glu

Ser

lie

Lys

Gly

Lys

Phe

Thr

Ser

Pro

Lys

20

25

30

Asp

Pro

Lys

Lys

Lys

Asp

Ser

lie

lie

Ser

Val

Asn

Ser

lie

Asp

lie

35

40

45

Glu

Val

Thr

Lys

Glu

Ser

Pro

lie

Thr

Ser

Asn

Ser

Thr

lie

Met

Asn

50

55

60

Pro

Thr

Asn

Glu

Thr

Asp

Asp

Thr

Val

Gly

Asn

Lys

Pro

Asn

Tyr

Gin

65

70

75

80

Arg

Lys

Pro

Leu

Val

Ser

Phe

Lys

Glu

Asp

Pro

Met

Leu

Ser

Asp

Asn

85

90

95

Pro

Phe

Ser

Lys

Leu

Tyr

Lys

Glu

Thr

lie

Glu

Thr

Phe

Asp

Asn

Asn

100

105

110

Glu

Glu

Glu

Ser

Ser

Tyr

Ser

Tyr

Glu

Glu

lie

Asn

Asp

Gin

Thr

Asn

115

120

125

Asp

Asn

lie

Thr

Ala

Arg

Leu

Asp

Arg

lie

Asp

Glu

Lys

Leu

Ser

Glu

130

135

140

lie

Leu

Gly

Met

Leu

His

Thr

Leu

Val

Val

Ala

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

145

150

155

160

Ser

Ala

Arg

Asp

Gly

lie

Arg

Asp

Ala

Met

Val

Gly

Leu

Arg

Glu

Glu

165

170

175

Met

lie

Glu

Lys

lie

Arg

Thr

Glu

Ala

Leu

Met

Thr

Asn

Asn

Arg

Leu

180

185

190

Glu

Ala

Met

Ala

Arg

Leu

Arg

Asn

Glu

Glu

Ser

Glu

Lys

Met

Ala

Lys

- 257 027835

Asp Asn 225 Phe

Thr 210 Leu

195 Ser Leu

Asp Glu

Glu Gly

Val Asn 230

Ser 215 Asp

200 Leu Ser

Asn Asp

Pro Asp

Thr Asp 235

Ser 220 Leu

205 Glu Ser

Lys Leu

Leu Glu

Asn Asp 240

<210> 280

<211> 256

<212> Белок

<213> Респираторно-

синцитиальный вирус 1

человека

<400> 280

Met

Glu

Thr

Tyr

Val

Asn

Lys

Leu

His

Glu

Gly

Ser

Thr

Tyr

Thr

Ala

1

5

10

15

Ala

Val

Gin

Tyr

Asn

Val

Leu

Glu

Lys

Asp

Asp

Asp

Pro

Ala

Ser

Leu

20

25

30

Thr

lie

Trp

Val

Pro

Met

Phe

Gin

Ser

Ser

Met

Pro

Ala

Asp

Leu

Leu

35

40

45

lie

Lys

Glu

Leu

Ala

Asn

Val

Asn

lie

Leu

Val

Lys

Gin

lie

Ser

Thr

50

55

60

Pro

Lys

Gly

Pro

Ser

Leu

Arg

Val

Met

lie

Asn

Ser

Arg

Ser

Ala

Val

65

70

75

80

Leu

Ala

Gin

Met

Pro

Ser

Lys

Phe

Thr

lie

Cys

Ala

Asn

Val

Ser

Leu

85

90

95

Asp

Glu

Arg

Ser

Lys

Leu

Ala

Tyr

Asp

Val

Thr

Thr

Pro

Cys

Glu

lie

100

105

110

Lys

Ala

Cys

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Lys

Ser

Lys

Asn

Met

Leu

Thr

Thr

115

120

125

Val

Lys

Asp

Leu

Thr

Met

Lys

Thr

Leu

Asn

Pro

Thr

His

Asp

lie

lie

130

135

140

Ala

Leu

Cys

Glu

Phe

Glu

Asn

lie

Val

Thr

Ser

Lys

Lys

Val

lie

lie

145

150

155

160

Pro

Thr

Tyr

Leu

Arg

Ser

lie

Ser

Val

Arg

Asn

Lys

Asp

Leu

Asn

Thr

165

170

175

Leu

Glu

Asn

lie

Thr

Thr

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

Ala

lie

Thr

Asn

Ala

180

185

190

Lys

lie

lie

Pro

Tyr

Ser

Gly

Leu

Leu

Leu

Val

lie

Thr

Val

Thr

Asp

195

200

205

Asn

Lys

Gly

Ala

Phe

Lys

Tyr

lie

Lys

Pro

Gin

Ser

Gin

Phe

lie

Val

210

215

220

Asp

Leu

Gly

Ala

Tyr

Leu

Glu

Lys

Glu

Ser

lie

Tyr

Tyr

Val

Thr

Thr

225

230

235

240

Asn

Trp

Lys

His

Thr

Ala

Thr

Arg

Phe

Ala

lie

Lys

Pro

Met

Glu

Asp

245

250

255

<210> 281

<211> 64

<212> Белок

<213> Респираторно-

синцитиальный вирус 1

человека

<400> 281

Met

Glu

Asn

Thr

Ser

lie

Thr

lie

Glu

Phe

Ser

Ser

Lys

Phe

Trp

Pro

1

5

10

15

Tyr

Phe

Thr

Leu

lie

His

Met

lie

Thr

Thr

lie

lie

Ser

Leu

Leu

lie

20

25

30

lie

lie

Ser

lie

Met

lie

Ala

lie

Leu

Asn

Lys

Leu

Cys

Glu

Tyr

Asn

35

40

45

Ala

Phe

His

Asn

Lys

Thr

Phe

Glu

Leu

Pro

Arg

Ala

Arg

lie

Asn

Thr

50

55

60

- 258 027835

<210> 282

<211> 574

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<220>

<400> 282

Met 1

Glu

Leu

Pro

lie 5

Leu

Lys

Ala

Asn

Ala 10

lie

Thr

Thr

lie

Leu 15

Ala

Ala

Val

Thr

Leu

Cys

Phe

Val

Ser

Ser

Gin

Asn

lie

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

lie

Thr

lie

Glu

Leu

Ser

Asn

lie

50

55

60

Lys

Glu

Asn

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ala

Lys

Val

Lys

Leu

lie

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Ser

Thr

Pro

Ala

Ala

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Leu

Pro

100

105

110

Arg

Phe

Met

Asn

Tyr

Thr

Leu

Asn

Asn

Thr

Lys

Asn

Thr

Asn

Val

Thr

115

120

125

Leu

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

Gly

Ser

Ala

lie

Ala

Ser

Gly

lie

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

Leu

145

150

155

160

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

lie

Lys

Ser

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

165

170

175

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Asn

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Val

180

185

190

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

lie

Asp

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

lie

Val

Asn

195

200

205

Lys

Gin

Ser

Cys

Ser

lie

Ser

Asn

lie

Glu

Thr

Val

lie

Glu

Phe

Gin

210

215

220

Gin

Lys

Asn

Asn

Arg

Leu

Leu

Glu

lie

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Val

Asn

225

230

235

240

Ala

Gly

Val

Thr

Thr

Pro

Val

Ser

Thr

Tyr

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

Glu

245

250

255

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Asn

Asp

Met

Pro

lie

Thr

Asn

Asp

Gin

Lys

Lys

260

265

270

Leu

Met

Ser

Asn

Asn

Val

Gin

lie

Val

Arg

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

lie

275

280

285

Met

Ser

lie

lie

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Val

Gin

Leu

Pro

290

295

300

Leu

Tyr

Gly

Val

lie

Asp

Thr

Pro

Cys

Trp

Lys

Leu

His

Thr

Ser

Pro

305

310

315

320

Leu

Cys

Thr

Thr

Asn

Thr

Lys

Glu

Gly

Ser

Asn

lie

Cys

Leu

Thr

Arg

325

330

335

Thr

Asp

Arg

Gly

Trp

Tyr

Cys

Asp

Asn

Ala

Gly

Ser

Val

Ser

Phe

Phe

340

345

350

Pro

Gin

Ala

Glu

Thr

Cys

Lys

Val

Gin

Ser

Asn

Arg

Val

Phe

Cys

Asp

355

360

365

Thr

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

Val

Asn

Leu

Cys

Asn

Val

370

375

380

Asp

lie

Phe

Asn

Pro

Lys

Tyr

Asp

Cys

Lys

lie

Met

Thr

Ser

Lys

Thr

385

390

395

400

Asp

Val

Ser

Ser

Ser

Val

lie

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

lie

Val

Ser

Cys

405

410

415

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

lie

lie

420

425

430

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Val

Asp

- 259 027835

435

440

445

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

Gly

450

455

460

Lys

Asn

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

lie

lie

Asn

Phe

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

Leu

Val

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

lie

Ser

Gin

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

lie

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

lie

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

lie

Met

lie

Thr

515

520

525

Thr

lie

lie

lie

Val

lie

lie

Val

lie

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Ala

Val

530

535

540

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Arg

Ser

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser

Gly

lie

Asn

Asn

lie

Ala

Phe

Ser

Ser

565

570

<210> 283

<211> 83

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 283

Lys

Arg

Asp

Pro

Lys

Thr

Pro

Ala

Lys

Met

Leu

Asn

Lys

Glu

Thr

Thr

1

5

10

15

Thr

Asn

Pro

Thr

Lys

Asn

Leu

Thr

Leu

Lys

Thr

Thr

Glu

Arg

Asp

Thr

20

25

30

Ser

Thr

Ser

Gin

Ser

Thr

Val

Leu

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Lys

His

lie

35

40

45

lie

Leu

Gin

Gin

Ser

Leu

His

Ser

Thr

Thr

Pro

Glu

Asn

Thr

Pro

Asn

50

55

60

Phe

Thr

Gin

Thr

Pro

Thr

Ala

Ser

Glu

Pro

Ser

Thr

Ser

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Gin

Lys

Thr

<210>	284
<211>	21
<212>	Белок
<213>	Buf о	gargarizans
<220>
<223>	Asian	toad Buforin II
<400>	284
Thr Arg Ser	Ser Arg Ala Gly Leu	Gin Phe	Pro Val Gly Arg Val His
1		5	10	15
Arg Leu Leu	Arg Lys

20

<210> 285

<211> 16

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DPV3

<400> 285

Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser

- 260 027835

1	5 10	15
<210>	286
<211>	17
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	DPV6
<400>	286
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg	Lys Arg Lys Arg Leu Lys
1	5 10	15
Pro

<210>	287
<211>	15
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	DPV7
<400>	287
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys	Leu Gly Lys	Lys Arg Asp Pro
1	5	10	15

<210>	288
<211>	17
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	DPV7b
<400>	288
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys	Leu Gly Lys	Lys Arg Pro Arg Ser
1	5	10	15
Arg

<210> <211> <212> <213>	289 18 Белок Искусственная	последовательность
<220> <223>	DPV3/10
<400>	289
Arg Lys Lys Arg Arg	Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg	Ser Pro Arg
1	5	10	15

His Leu

<210> 290 <211> 19 <212> Белок

- 261 027835

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DPV10/6

<400> 290

Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys 15 10 15

Arg Lys Arg

<210> 291

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DPV1047

<400> 291

Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg 15 10 15

Met Asp Val

<210> 292

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DPV1048

<400> 292

Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg 15 10 15

Asp Val

<210> 293

<211> 14

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DPV10

<400> 293

Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly 15 10

<210> <211> <212> <213>	294 16 Белок Homo sapiens
<220>
<223>	DPV15
<400>	294

- 262 027835

Leu Arg Arg Glu Arg Gin Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gin Ser Arg 15 10 15

<210> 295

<211> 22

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> DPV15b

<400> 295

Gly 1	Ala	Tyr	Asp	Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gin	Ser Arg Leu Arg Arg 15
5	10
Arg	Glu	Arg	Gin	Ser Arg
			20

<210> 296

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GALA

<400> 296 Trp Glu Ala

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu His

1

5

10

15

Leu Ala Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Ala

Ala

20

25

30

<210>	297
<211>	21
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	Цепь фибриногена бета	человека
<400>	297
Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met	Arg Lys Met	Ser Met Lys lie Arg Pro
1	5	10	15
Phe Phe Pro Gin Gin
	20

<210>	298
<211>	20
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	Цепь предшественника	фибриногена гамма человека
<400>	298
Lys Thr Arg Tyr Tyr Ser Met	Lys Lys Thr Thr Met Lys lie	lie Pro
1	5	10	15
Phe Asn Arg Leu

20

- 263 027835

<210> <211> <212> <213>	299 20 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Цепь фибриногена альфа человека
<400>	299
Arg Gly Ala Asp Tyr	Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys	lie Arg Pro
1	5	10	15
Leu Val Thr Gin
	20

<210>	300
<211>	24
<212>	Белок
<213>	Homo sapiens
<220>
<223>	hCT человека	(9-32)
<400>	300
Leu Gly Thr Tyr Thr	Gin Asp	Phe Asn	Lys Phe His	Thr Phe Pro Gin
1	5			10	15
Thr Ala lie Gly Val	Gly Ala	Pro
	20

<210> 301

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HN-1

<400> 301

Thr Ser Pro Leu Asn lie His Asn Gly Gin Lys Leu 15 10

<210> 302

<211> 12

<212> Белок

<213> Вирус гриппа

<220>

<223> Нуклеопротеин (NLS) вируса гриппа

<400> 302

Asn Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser

10

<210>	303
<211>	30
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	KALA

- 264 027835

<400> 303

Trp

Glu

Ala

Lys

Leu

Ala

Lys

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Leu

Ala

Lys His

1

5

10

15

Leu

Ala

Lys

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Leu

Lys

Ala

Cys

Glu

Ala

20

25

30

<210> 304

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ku70

<400> 304

Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu 15 10

<210> 305

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> MAP

<400> 305

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 15 10 15

Leu Ala

<210> <211> <212> <213>	306 27 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	MPG
<400>	306
Gly Ala Leu Phe Leu	Gly Phe Leu Gly Ala	Ala Gly Ser	Thr Met Gly
1	5	10		15
Ala Trp Ser Gin Pro	Lys Lys Lys Arg Lys	Val
	20	25

<210> 307

<211> 16

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Фактор роста фибробластов человека 4

<400> 307

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15

<210> 308

- 265 027835

<211> 9

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> N50 человека (NLS NF-kB P50)

<400> 308

Val Gin Arg Lys Arg Gin Lys Leu Met

<210>	309
<211>	21
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Pep-1
<400>	309
Lys Glu Thr	Trp	Trp
1			5
Lys Lys Arg	Lys	Val
		20

10

15

<210> 310

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Pep-7

<400> 310

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gin Tyr

10

15

<210> 311

<211> 16

<212> Белок

<213> Drosophila antennapedia

<220>

<223> Пенетратин плодовой мушки

<400> 311

Arg Gin lie Lys lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15

<210> 312

<211> 17

<212> Белок

<213> Drosophila antennapedia

<220>

<223> Вариант пенетратина плодовой мушки

<400> 312

Gly Arg Gin lie Lys lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 15 10 15

- 266 027835

Lys

<210> 313

<211> 7

<212> Белок

<213> Drosophila antennapedia

<220>

<223> Короткий пенетратин плодовой мушки

<400> 313

Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5

<210> 314

<211> 17

<212> Белок

<213> Drosophila antennapedia

<220>

<223> Пенетратин плодовой мушки 42-58

<400> 314

Glu Arg Gin lie Lys lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 15 10 15

Lys

<210> 315

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полиаргинин R7

<400> 315

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

<210> 316

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полиаргинин R9

<400> 316

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1		5
<210>	317
<211>	16
<212>	Белок
<213>	Rattus	norvegicus
<220>

- 267 027835

<223> pISL крысы

<400> 317

Arg Val lie Arg Val Trp Phe Gin Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 15 10 15

<210> 318

<211> 28

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<223> Прионный PrPcl-28 мыши

<400> 318

Met	Ala	Asn	Leu	Gly	Tyr	Trp	Leu	Leu	Ala	Leu	Phe Val Thr Met Trp
1				5					10		15
Thr	Asp	Val	Gly	Leu	Cys	Lys	Lys	Arg	Pro	Lys	Pro
			20					25

<210> 319

<211> 18

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<223> pVEC мыши

<400> 319

Leu Leu lie lie Leu Arg Arg Arg lie Arg Lys Gin Ala His Ala His 15 10 15

Ser Lys

<210> 320

<211> 16

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<223> Вариант pVEC мыши

<400> 320

Leu Leu lie lie Leu Arg Arg Arg lie Arg Lys Gin Ala His Ala His 15 10 15

<210> 321

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SAP

<400> 321

Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro 15 10 15

Pro Pro

- 268 027835

<210> 322

<211> 7

<212> Белок

<213> Вирус обезьяны

<220>

<223> SV-40 (NLS)

<400> 322

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5

<210> <211> <212> <213>	323 18 Белок Sus scrofa
<220>
<223>	SynBl свиньи
<400>	323
Arg Gly Gly Arg Leu	Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe	Ser Thr Ser Thr
1	5	10	15
Gly Arg

<210> 324 <211> 10 <212> Белок <213> Sus scrofa

<220>

<223> SynB3 свиньи

<400> 324

Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 15 10

<210>	325
<211>	17
<212>	Белок
<213>	Sus s>
<220>
<223>	SynB4
<400>	325
Ala Trp Ser
1
Arg

10

15

<210> 326

<211> 14

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 47-60

- 269 027835

<400> 326

Туг Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 15 10

<210> 327

<211> 11

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 47-57

<400> 327

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10

<210> 328

<211> 10

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 47-56

<400> 328

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 15 10

<210> 329

<211> 9

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 48-56

<400> 329

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 1 5

<210> 330

<211> 10

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 48-57

<400> 330

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10

<210>	331
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Вирус
<220>

- 270 027835

<223> Tat ВИЧ типа I 49-57

<400> 331

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5

<210> 332

<211> 8

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 49-56

<400> 332

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 1 5

<210> 333

<211> 13

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 48-60

<400> 333

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 15 10

<210> 334

<211> 5

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 48-52

<400> 334

Gly Arg Lys Lys Arg 1 5

<210> 335

<211> 36

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 37-72

<400> 335

Cys

Phe

lie

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

lie

Ser

Tyr

Gly

Arg

Lys

Lys

Arg

1

5

10

15

Arg

Gin

Arg

Arg

Arg

Pro

Pro

Gin

Phe

Ser

Gin

Thr

His

Gin

Val

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Lys

Gin

35

<210> 336

- 271 027835

<211> 35

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 38-72

<400> 336

Phe

lie

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

lie

Ser

Tyr

Gly

Arg

Lys

Lys

Arg

Arg

1 Gin

Arg

Arg

Arg

5 Pro

Pro

Gin

Phe

Ser

10 Gin

Thr

His

Gin

Val

15 Ser

Leu

Ser

Lys

Gin 35

20

25

30

<210> 337

<211> 13

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита человека

<220>

<223> Tat ВИЧ типа I 47-59

<400> 337

Туг Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro 15 10

<210> <211> <212> <213>	338 27 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Транспортан
<400>	338
Gly Trp Thr Leu Asn	Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys lie Asn Leu
1	5	10 15
Lys Ala Leu Ala Ala	Leu Ala Lys Lys lie Leu
	20	25

<210>	339
<211>	21
<212>	Белок
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Транспортан 10
<400>	339
Ala Gly Tyr	Leu Leu	Gly Lys lie Asn Leu	Lys Ala	Leu Ala Ala Leu
1		5	10		15
Ala Lys Lys	lie Leu
		20

<210> 340

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 272 027835

<220>

<223> Производное транспортана

<400> 340

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly 15 10

<210> 341

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Производное транспортана

<400> 341

lie Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys lie Leu 15 10

<210> 342

<211> 34

<212> Белок

<213> Вирус простого герпеса

<220>

<223> Вирус простого герпеса 1 VP22

<400> 342

Asp

Ala

Ala

Thr

Ala

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Ala

Ala

Ser

Arg

Pro

Thr

1

5

10

15

Glu

Arg

Pro

Arg

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Ala

Ser

Arg

Pro

Arg

Arg

Pro

20

25

30

Val Asp

<210>	343
<211>	26
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	VT5
<400>	343
Asp Pro Lys	Gly	Asp
1			5
Val Thr Gly	Lys	Gly
		20

10

15

25

<210> 344

<211> 27

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Пептид на основе сигнальной последовательности

<400> 344

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 15 10 15

- 273 027835

Ala Trp Ser Gin Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25

<210> 345

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Амфифильный модельный пептид

<400> 345

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 15 10 15

Leu Ala

<210> 346

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Проникновение через бактериальную стенку

<400> 346

Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys 15 10

<210> 347

<211> 37

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> LL-37 человека

<400> 347

Leu

Leu

Gly

Asp

Phe

Phe

Arg

Lys

Ser

Lys

Glu

Lys

lie

Gly

Lys

Glu

1

5

10

15

Phe

Lys

Arg

lie

Val

Gin

Arg

lie

Lys

Asp

Phe

Leu

Arg

Asn

Leu

Val

20

25

30

Pro

Arg

Thr

Glu

Ser

35

<210> 348 <211> 31 <212> Белок <213> Sus scrofa

<220>

<223> Цекропин свиньи Pl

<400> 348

Ser

Trp

Leu

Ser

Lys

Thr

Ala

Lys

Lys

Leu

Glu

Asn

Ser

Ala

Lys

1

5

10

15

Arg

lie

Ser

Glu

Gly

lie

Ala

lie

Ala

lie

Gin

Gly

Gly

Pro

Arg

20

25

30

- 274 027835

<210> 349

<211> 30

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> Дефензин альфа человека

<400> 349

Ala

Cys

Tyr

Cys

Arg

lie

Pro

Ala

Cys

lie

Ala

Gly

Glu

Arg

Arg Tyr

1

5

10

15

Gly

Thr

Cys

lie

Tyr

Gin

Gly

Arg

Leu

Trp

Ala

Phe

Cys

Cys

20

25

30

<210> 350

<211> 36

<212> Белок <213> Homo sapiens

<220>

<223> Дефензин бета человека

<400> 350

Asp

His

Tyr

Asn

Cys

Val

Ser

Ser

Gly

Gly

Gin

Cys

Leu

Tyr

Ser

Ala

1

5

10

15

Cys

Pro

lie

Phe

Thr

Lys

lie

Gin

Gly

Thr

Cys

Tyr

Arg

Gly

Lys

Ala

20

25

30

Lys

Cys

Cys

Lys

35

<210> 351

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Бактенецин

<400> 351

Arg Lys Cys Arg lie Trp lie Arg Val Cys Arg

10

<210> 352 <211> 42 <212> Белок <213> Sus scrofa

<220>

<223> PR-39 свиньи

<400> 352

Arg

Arg

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Tyr

Leu

Pro

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Pro

1

5

10

15

Phe

Phe

Pro

Pro

Arg

Leu

Pro

Pro

Arg

lie

Pro

Pro

Gly

Phe

Pro

Pro

20

25

30

Arg

Phe

Pro

Pro

Arg

Phe

Pro

Gly

Lys

Arg

35

40

<210> 353 <211> 13

- 275 027835

<212> Белок

<213> Bos taurus

<220>

<223> Бычий индолицидин

<400> 353

lie Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 15 10

<210> 354

<211> 27

<212> Белок

<213> Вирус иммунодефицита обезьян

<220>

<223> MPS SIV

<400> 354

Gly	Ala	Leu	Phe	Leu	Gly	Trp	Leu	Gly	Ala	Ala Gly Ser Thr Met Gly
1				5					10	15
Ala	Trp	Ser	Gin	Pro	Lys	Lys	Lys	Arg	Lys	Val
			20					25

<210> 355

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> plsl

<400> 355

Pro Val lie Arg Arg Val Trp Phe Gin Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys 15 10 15

Lys

<210> 356

<211> 330

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи hlgGl

<400> 356

Ala 1

Ser

Thr

Lys

Gly 5

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 10

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser 15

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

65

70

75

80

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

100

105

110

- 276 027835

Pro

Ala

Pro 115

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly 120

Pro

Ser

Val

Phe

Leu 125

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

130

135

140

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

145

150

155

160

Туг

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

165

170

175

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

180

185

190

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

195

200

205

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

210

215

220

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

225

230

235

240

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

245

250

255

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

260

265

270

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

275

280

285

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

290

295

300

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

305

310

315

320

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

325 330

<210> 357

<211> 326

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи h!gG2

<400> 357

Ala 1

Ser

Thr

Lys

Gly 5

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 10

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 15

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

65

70

75

80

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

115

120

125

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

130

135

140

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

145

150

155

160

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

165

170

175

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Val

His

Gin

Asp

Trp

180

185

190

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

- 277 027835

195

200

205

Ala

Pro

lie

Glu

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

210

215

220

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

225

230

235

240

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

245

250

255

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

260

265

270

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

275

280

285

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

290

295

300

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

305

310

315

320

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

325

<210> 358

<211> 377

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи h!gG3

<400> 358

Ala 1

Ser

Thr

Lys

Gly 5

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 10

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 15

Arg

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

65

70

75

80

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Arg

Val

Glu

Leu

Lys

Thr

Pro

Leu

Gly

Asp

Thr

Thr

His

Thr

Cys

Pro

100

105

110

Arg

Cys

Pro

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Thr

Pro

Pro

Pro

Cys

Pro

Arg

115

120

125

Cys

Pro

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Thr

Pro

Pro

Pro

Cys

Pro

Arg

Cys

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Thr

Pro

Pro

Pro

Cys

Pro

Arg

Cys

Pro

145

150

155

160

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

165

170

175

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

180

185

190

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Lys

Trp

Tyr

195

200

205

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

210

215

220

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

225

230

235

240

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

245

250

255

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

lie

Glu

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

260

265

270

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

275

280

285

- 278 027835

Thr

Lys 290

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 295

Thr

Cys

Leu

Val

Lys 300

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Ser

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

305

310

315

320

Туг

Asn

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

325

330

335

Туг

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

lie

340

345

350

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

Arg

Phe

Thr

Gin

355

360

365

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

<210> 359

<211> 327

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи hIgG4

<400> 359

Ala 1

Ser

Thr

Lys

Gly 5

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 10

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 15

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

65

70

75

80

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Arg

Val

Glu

Ser

Lys

Tyr

Gly

Pro

Pro

Cys

Pro

Ser

Cys

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Glu

Phe

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

115

120

125

Asp

Thr

Leu

Met

lie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

130

135

140

Asp

Val

Ser

Gin

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

145

150

155

160

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

165

170

175

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

180

185

190

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

195

200

205

Pro

Ser

Ser

lie

Glu

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

210

215

220

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Gin

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

225

230

235

240

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

245

250

255

lie

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

260

265

270

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

275

280

285

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

290

295

300

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

305

310

315

320

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

Lys

- 279 027835

325

<210> 360 <211> 231 <212> Белок <213> Искусственная	последовательное	:ть
<220>
<223> Fc hlgGl
<400> 360
Pro Lys Ser Cys Asp	Lys Thr His Thr	Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5		10 15
Glu Leu Leu Gly Gly	Pro Ser Val Phe	Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20	25	30
Asp Thr Leu Met lie	Ser Arg Thr Pro	Glu Val Thr Cys Val Val Val
35	40	45
Asp Val Ser His Glu	Asp Pro Glu Val	Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50	55	60
Gly Val Glu Val His	Asn Ala Lys Thr	Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr
65	70	75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg	Val Val Ser Val	Leu Thr Val Leu His Gin Asp
85		90 95
Trp Leu Asn Gly Lys	Glu Tyr Lys Cys	Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100	105	110
Pro Ala Pro lie Glu	Lys Thr lie Ser	Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
115	120	125
Glu Pro Gin Val Tyr	Thr Leu Pro Pro	Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130	135	140
Asn Gin Val Ser Leu	Thr Cys Leu Val	Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145	150	155 160
lie Ala Val Glu Trp	Glu Ser Asn Gly	Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165		170 175
Thr Thr Pro Pro Val	Leu Asp Ser Asp	Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180	185	190
Lys Leu Thr Val Asp	Lys Ser Arg Trp	Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser
195	200	205
Cys Ser Val Met His	Glu Ala Leu His	Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
210	215	220
Leu Ser Leu Ser Pro	Gly Lys
225	230

<210> 361 <211> 232 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Fc hlgGl
<400> 361
Glu Pro Arg Ser Cys	Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5	10 15
Pro Glu Leu Leu Gly	Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20	25 30
Lys Asp Thr Leu Met	lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35	40 45
Val Asp Val Ser His	Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50	55 60
Asp Gly Val Glu Val	His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
65	70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr	Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin

- 280 027835

	85	90	95
Asp	Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys	Cys Lys	Val Ser Asn Lys Ala
	100 105		110
Leu	Pro Ala Pro Met Gin Lys Thr lie	Ser Lys	Ala Lys Gly Gin Pro
	115 120		125
Arg	Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro	Pro Ser	Arg Asp Glu Leu Thr
	130 135		140
Lys	Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu	Val Lys	Gly Phe Tyr Pro Arg
145	150	155	160
His	lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn	Gly Gin	Pro Glu Asn Asn Tyr
	165	170	175
Lys	Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser	Asp Gly	Ser Phe Phe Leu Tyr
	180 185		190
Ser	Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg	Trp Gin	Gin Gly Asn Val Phe
	195 200		205
Ser	Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu	His Asn	His Tyr Thr Gin Lys
	210 215		220
Ser	Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225	230
<210> 362
<211> 129
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь Rsv6/11/21/22/23
<400> 362
Gin	Val Lys Leu Leu Glu Gin Ser Gly	Gly Gly	Leu Val Gin Pro Gly
1	5	10	15
Gly	Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val	Ser Gly	Val Thr Phe Ser Ala
	20 25		30
Tyr	Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala	Pro Gly	Lys Gly Leu Glu Trp
	35 40		45
Val	Ser Gly lie Ser Gly Ser Gly Asp	Ser Thr	Asp Tyr Ala Asp Ser
	50 55		60
Val	Lys Gly Arg Leu Thr lie Ser Arg	Asp Asn	Ser Lys Asn Thr Leu
65	70	75	80
Tyr	Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala	Glu Asp	Thr Ala lie Tyr Tyr
	85	90	95
Cys	Ala Ser His Leu Pro Asp Tyr Trp	Asn Leu	Asp Tyr Thr Arg Phe
	100 105		110
Phe	Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys	Gly Thr	Thr Val Thr Val Ser
	115 120		125
Ser
<210> 363
<211> 5
<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи Rsv6/11/21/22/23

<400> 363

Ala Туг Ala Met Ser 1 5

<210> 364

- 281 027835

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи Rsv6/11/21/22/23

<400> 364

Gly lie Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 365

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи Rsv6/11/21/22/23

<400> 365

His Leu Pro Asp Tyr Trp Asn Leu Asp Tyr Thr Arg Phe Phe Tyr Tyr 15 10 15

Met Asp Val

<210> 366

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Rsvl3/19H

<400> 366

Gin

Val

Lys

Leu

Leu

Glu

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Arg

Leu

Ala

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Thr

Thr

Leu

Ser

Gly

20

25

30

Tyr

Thr

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

Val

Ser

Ser

lie

Thr

Gly

Gly

Ser

Asn

Phe

lie

Asn

Tyr

Ser

Asp

Ser

50

55

60

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

lie

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Thr

Ala

Pro

lie

Ala

Pro

Pro

Tyr

Phe

Asp

His

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	367
<211>	5
<212>	Белок
<213>	Искусственная последовательность
<220> <223>	CDR1 тяжелой цепи Rsvl3/19H

- 282 027835

<400> 367

Gly Туг Thr Met His 1 5

<210> 368

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи Rsvl3/19H

<400> 368

Ser lie Thr Gly Gly Ser Asn Phe lie Asn Tyr Ser Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 369

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи Rsvl3/19H

<400> 369

Ala Pro lie Ala Pro Pro Tyr Phe Asp His 15 10

<210> 370

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь Rsv 6/11/21/22

<400> 370

Met 1

Ala

Glu

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Thr

Gin

Ser

lie

Ser

Ser

Asn

20

25

30

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

35

40

45

lie

Tyr

Gly

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Asp

lie

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asp

lie

Ser

Pro

85

90

95

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

Arg

100

105

<210> 371

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 283 027835

<223> CDR1 легкой цепи Rsv 6/11/21/22

<400> 371

Arg Ala Thr Gin Ser lie Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 15 10

<210> 372

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 легкой цепи Rsv 6/11/21/22

<400> 372

Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5

<210> 373

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 легкой цепи Rsv 6/11/21/22

<400> 373

Gin Gin Tyr Asp lie Ser Pro Tyr Thr 1 5

<210> 374

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь Rsv23

<400> 374

Met 1

Ala

Glu

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Val

Thr 10

Leu

Ser

Val

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asn

lie

Asn

Asp

Asn

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

lie

35

40

45

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

lie

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Thr

Arg

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Gly

Ser

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

100

105

<210> 375

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 284 027835

<223> CDR1 легкой цепи Rsv23

<400> 375

Lys Ala Ser Gin Asn lie Asn Asp Asn Leu Ala 15 10

<210> 376

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 легкой цепи Rsv23

<400> 376

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5

<210> 377

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 легкой цепи Rsv23

<400> 377

Gin Gin Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Thr 1 5

<210> 378

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь Rsvl3/19

<400> 378

Met 1

Ala

Glu

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Thr

Cys

Arg

Ala

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Asn

Phe

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Glu

Ala

Pro

Thr

Leu

Leu

lie

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Thr

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Met

Asp

Phe

Ser

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Leu

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Ala

Ser

lie

Asn

Thr

Pro

Leu

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Arg

lie

Asp

Met

Arg

Arg

Thr

100

105

<210> 379

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 285 027835

<223> CDR1 легкой цепи Rsvl3/19

<400> 379

Arg Ala Thr Gin Ser Val Ser Asn Phe Leu Asn 15 10

<210> 380

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 легкой цепи Rsvl3/19

<400> 380

Asp Ala Ser Thr Ser Gin Ser 1 5

<210> 381

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 легкой цепи Rsvl3/19

<400> 381

Gin Ala Ser lie Asn Thr Pro Leu 1 5

<210> 382

<211> 574

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок F штамма A2 респираторно-синцитиального вируса

<400> 382

Met 1

Glu

Leu

Leu

lie 5

Leu

Lys

Ala

Asn

Ala 10

lie

Thr

Thr

lie

Leu 15

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

Cys

Phe

Ala

Ser

Gly

Gin

Asn

lie

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

lie

Thr

lie

Glu

Leu

Ser

Asn

lie

50

55

60

Lys

Glu

Asn

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ala

Lys

Val

Lys

Leu

lie

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Ser

Thr

Pro

Pro

Thr

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Leu

Pro

100

105

110

Arg

Phe

Met

Asn

Tyr

Thr

Leu

Asn

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Asn

Val

Thr

115

120

125

Leu

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

Gly

Ser

Ala

lie

Ala

Ser

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

Leu

145

150

155

160

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

lie

Lys

Ser

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

165

170

175

- 286 027835

Ala

Val

Val

Ser 180

Leu

Ser

Asn

Gly

Val 185

Ser

Val

Leu

Thr

Ser 190

Lys

Val

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

lie

Asp

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

lie

Val

Asn

195

200

205

Lys

Gin

Ser

Cys

Ser

lie

Ser

Asn

lie

Glu

Thr

Val

lie

Glu

Phe

Gin

210

215

220

Gin

Lys

Asn

Asn

Arg

Leu

Leu

Glu

lie

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Val

Asn

225

230

235

240

Ala

Gly

Val

Thr

Thr

Pro

Val

Ser

Thr

Tyr

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

Glu

245

250

255

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Asn

Asp

Met

Pro

lie

Thr

Asn

Asp

Gin

Lys

Lys

260

265

270

Leu

Met

Ser

Asn

Asn

Val

Gin

lie

Val

Arg

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

lie

275

280

285

Met

Ser

lie

lie

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Val

Gin

Leu

Pro

290

295

300

Leu

Tyr

Gly

Val

lie

Asp

Thr

Pro

Cys

Trp

Lys

Leu

His

Thr

Ser

Pro

305

310

315

320

Leu

Cys

Thr

Thr

Asn

Thr

Lys

Glu

Gly

Ser

Asn

lie

Cys

Leu

Thr

Arg

325

330

335

Thr

Asp

Arg

Gly

Trp

Tyr

Cys

Asp

Asn

Ala

Gly

Ser

Val

Ser

Phe

Phe

340

345

350

Pro

Gin

Ala

Glu

Thr

Cys

Lys

Val

Gin

Ser

Asn

Arg

Val

Phe

Cys

Asp

355

360

365

Thr

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

lie

Asn

Leu

Cys

Asn

Val

370

375

380

Asp

lie

Phe

Asn

Pro

Lys

Tyr

Asp

Cys

Lys

lie

Met

Thr

Ser

Lys

Thr

385

390

395

400

Asp

Val

Ser

Ser

Ser

Val

lie

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

lie

Val

Ser

Cys

405

410

415

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

lie

lie

420

425

430

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Met

Asp

435

440

445

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

Gly

450

455

460

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

lie

lie

Asn

Phe

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

Leu

Val

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

lie

Ser

Gin

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

lie

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

lie

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

lie

Met

lie

Thr

515

520

525

Thr

lie

lie

lie

Val

lie

lie

Val

lie

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Ala

Val

530

535

540

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Arg

Ser

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser

Gly

lie

Asn

Asn

lie

Ala

Phe

Ser

Asn

565

570

<210> 383

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер VH-gl(a/b)-REV

<400> 383

acaagatttg ggctcaacty tcttgtcc 28

<210> 384

- 287 027835

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 1

<400> 384

ggtcctgggc ccagtctgtg ctg 23

<210> 385

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 2

<400> 385

ggtcctgggc ccagtctgcc ctg 23

<210> 386

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 3

<400> 386

gctctgtgac ctcctatgag ctg 23

<210> 387

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 4/5

<400> 387

ggtctctctc scagcytgtg ctg 23

<210> 388

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 6

<400> 388

gttcttgggc caattttatg ctg 23

<210> 389

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 7

<400> 389

ggtccaattc ycaggctgtg gtg 23

- 288 027835

<210> 390

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5'L VLambda 8

<400> 390

gagtggattc tcagactgtg gtg 23

<210> 391

<211> 6822

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вектор 28dll/pCAL

<400> 391

atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360

tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420

acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480

tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540

gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600

gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccacc 660

gcggtggcgg ccgcccacca tggactggac ctggcggatc ctgttcctgg tggccgcggc 720

caccggggcc cacagccagc tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaaggtttc 780

ggacaccctg tccctcagct gcactgtctc tggtgactcc atcaatagtt attcctggag 840

ttggatccgg cagcccccag ggaagggact tgagtggatt ggatatctct attacagtgg 900

gagctccaat tatagtccct ccctcaaggg ccgagtcacc atgtcgctag acacgtccaa 960

gaaccagttt tccctgaagc ttcactctct gaccgctgcg gacacggccg tctattactg 1020

tgcgagagga tcttgtggta gaaccacctg ctactgggaa aaccactact acatggacgt 1080

ctggggcaaa gggaccgcgg tcaccgtctc ctcacagctg cagctgcagg agtcgggccc 1140

aggactggtg aaggtttcgg acaccctgtc cctcagctgc actgtctctg gtgactccat 1200

caatagttat tcctggagtt ggatccggca gcccccaggg aagggacttg agtggattgg 1260

atatctctat tacagtggga gctccaatta tagtccctcc ctcaagggcc gagtcaccat 1320

gtcgctagac acgtccaaga accagttttc cctgaagctt cactctctga ccgctgcgga 1380

cacggccgtc tattactgtg cgagaggatc ttgtggtaga accacctgct actgggaaaa 1440

ccactactac atggacgtct ggggcaaagg gaccgcggtc accgtctcct cagctagcac 1500

caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag agcaccagcg gcggcaccgc 1560

cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtga gctggaacag 1620

cggcgccctg accagcggcg tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagca gcggcctgta 1680

cagcctgagc agcgtggtga ccgtgcccag cagcagcctg ggcacccaga cctacatctg 1740

caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggagc ccaagagctg 1800

cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1860

cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac 1920

atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga 1980

cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta 2040

ccgggtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa 2100

gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 2160

agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa 2220

gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga 2280

gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc 2340

cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg 2400

gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 2460

cctctccctg tctccgggta aacgggccaa gcgggcaccc gtgaagcaga ccctgaactt 2520

cgacctgctg aagctggccg gcgacgtgga gagcaacccc ggccccatga ggctccctgc 2580

- 289 027835

tcagctcctg gggctgctaa tgctctgggt ccctggctcg agtgaggttc tgcctgtgct 2640 gactcagcca ccctcagcgt ctgcgacccc cgggcagagg gtcaccatct cttgttctgg 2700 aagcagctcc aacatcgggc gtaatactgt aaactggtac cagcgtctcc caggaacggc 2760 ccccaaactc ctcatctata atactaatca gcggccctca ggggtccctg accgattctc 2820 tggctccaag tctggcacct cagccgccct ggccatcagt ggactccagt ctgaggatga 2880 ggctgagtat tactgtgcag cctgggatga cagcctgaat ggcctttctt gggtgttcgg 2940 cggagggacc aagctgaccg tcctaagtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt 3000 cccgccctcc tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga 3060 cttctacccg ggagccgtga cagcctggaa ggcagatagc agccacgtca aggcgggagt 3120 ggagaccacc acaccctcca aacaaagcaa caacaagtac gcggccagca gctacctgag 3180 cctgacgcct gagcagtgga agtcccacaa aagctacagc tgccaggtca cgcatgaagg 3240 gagcaccgtg gagaagacaa ttgcccctac agaatgctca taaggccggg acggccggta 3300 ccaggtaagt gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tcgatcgccc 3360 ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggagatcc aatttttaag tgtataatgt 3420 gttaaactac tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc acagtcccaa ggctcatttc 3480 aggcccctca gtcctcacag tctgttcatg atcataatca gccataccac atttgtagag 3540 gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 3600 gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 3660 atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 3720 ctcatcaatg tatcttaacg cgtaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt 3780 aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 3840 taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 3900 actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 3960 cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 4020 aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 4080 ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 4140 ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc 4200 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 4260 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 4320 aaggaagaat cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 4380 aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 4440 accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 4500 aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 4560 agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 4620 gccgcctccg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 4680 ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 4740 attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 4800 acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 4860 tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg 4920 gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 4980 agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 5040 ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 5100 tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 5160 tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagaacatc aggggctcgc 5220 gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 5280 gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 5340 catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 5400 tgatattgct gaagaacttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 5460 cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 5520 gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 5580 gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 5640 tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc tagggggagg 5700 ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa 5760 agacagaata aaacgcacgg tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag 5820 ggctggcact ctgtcgatac cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct 5880 tccttttccc caccccaccc cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc 5940 ggggcggcag gccctgccat agcctcaggt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 6000 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 6060 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 6120 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 6180 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 6240 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 6300 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 6360 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 6420

- 290 027835

gataaggcgc

acgacctaca

agggagcttc

tgacttgagc

agcaacgcgg

cctgcgttat

agcggtcggg

ccgaactgag

aggcggacag

cagggggaaa

gtcgattttt

cctttttacg

cccctgattc

ctgaacgggg

atacctacag

gtatccggta

cgcctggtat

gtgatgctcg

gttcctggcc

tgtggataac

ggttcgtgca

cgtgagctat

agcggcaggg

ctttatagtc

tcaggggggc

ttttgctggc

cgtattaccg

cacagcccag

gagaaagcgc

tcggaacagg

ctgtcgggtt

ggagcctatg

cttttgctca

cc

cttggagcga 6480 cacgcttccc 6540 agagcgcacg 6600 tcgccacctc 6660 gaaaaacgcc 6720 catgttcttt 6780

6822

<210> 392

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FabLinkerCLambda-Fwd

<400> 392

gacartkgcc cmtrcagaat gctcataatt aattaataag gaggatataa ttatgaaaaa 60 g 61

<210> 393

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FabLinker-Rev-IT*

<400> 393

tgcggccgcc tacgctacgg tagcaaagcc agccagtgcc ac

42

<210> 394

<211> 5882

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вектор 2G12 pCAL IT*

<400> 394

gtggcacttt

caaatatgta

ggaagagtat

gccttcctgt

tgggtgcacg

ttcgccccga

tattatcccg

atgacttggt

gagaattatg

caacgatcgg

ctcgccttga

ccacgatgcc

ctctagcttc

ttctgcgctc

gtgggtctcg

ttatctacac

taggtgcctc

agattgattt

atctcatgac

aaaagatcaa

caaaaaaacc

ttccgaaggt

tcggggaaat

tccgctcatg

gagtattcaa

ttttgctcac

agtgggttac

agaacgtttt

tattgacgcc

tgagtactca

cagtgctgcc

aggaccgaag

tcgttgggaa

tgtagcaatg

ccggcaacaa

ggcccttccg

cggtatcatt

gacggggagt

actgattaag

aaaacttcat

caaaatccct

aggatcttct

accgctacca

aactggcttc

gtgcgcggaa

agacaataac

catttccgtg

ccagaaacgc

atcgaactgg

ccaatgatga

gggcaagagc

ccagtcacag

ataaccatga

gagctaaccg

ccggagctga

gcaacaacgt

ttaatagact

gctggctggt

gcagcactgg

caggcaacta

cattggtaac

ttttaattta

taacgtgagt

tgagatcctt

gcggtggttt

agcagagcgc

cccctatttg

cctgataaat

tcgcccttat

tggtgaaagt

atctcaacag

gcacttttaa

aactcggtcg

aaaagcatct

gtgataacac

cttttttgca

atgaagccat

tgcgcaaact

ggatggaggc

ttattgctga

ggccagatgg

tggatgaacg

tgtcagacca

aaaggatcta

tttcgttcca

tttttctgcg

gtttgccgga

agataccaaa

tttatttttc

gcttcaataa

tccctttttt

aaaagatgct

cggtaagatc

agttctgcta

ccgcatacac

tacggatggc

tgcggccaac

caacatgggg

accaaacgac

attaactggc

ggataaagtt

taaatctgga

taagccctcc

aaatagacag

agtttactca

ggtgaagatc

ctgagcgtca

cgtaatctgc

tcaagagcta

tactgtcctt

taaatacatt

tattgaaaaa

gcggcatttt

gaagatcagt

cttgagagtt

tgtggcgcgg

tattctcaga

atgacagtaa

ttacttctga

gatcatgtaa

gagcgtgaca

gaactactta

gcaggaccac

gccggtgagc

cgtatcgtag

atcgctgaga

tatatacttt

ctttttgata

gaccccgtag

tgcttgcaaa

ccaactcttt

ctagtgtagc

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

- 291 027835

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920 aagcgacacc atcgaatggc gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 1980 gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 2040 cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 2100 aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 2160 acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 2220 gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 2280 cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 2340 tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 2400 cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 2460 gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca 2520 tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 2580 ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 2640 agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 2700 gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 2760 aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata 2820 cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt 2880 tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 2940 gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 3000 tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 3060 ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcggt acccgataaa agcggcttcc tgacaggagg 3120 ccgttttgtt ttgcagccca cctcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 3180 ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 3240 caattgaatt aaggaggata taattatgaa atacctgctg ccgaccgcag ccgctggtct 3300 gctgctgctc gcggcctagc cggccatggc cgccggtgtt gttatgaccc agtctccgtc 3360 taccctgtct gcttctgttg gtgacaccat caccatcacc tgccgtgctt ctcagtctat 3420 cgaaacctgg ctggcttggt accagcagaa accgggtaaa gctccgaaac tgctgatcta 3480 caaggcttct accctgaaaa ccggtgttcc gtctcgtttc tctggttctg gttctggtac 3540 cgagttcacc ctgaccatct ctggtctgca gttcgacgac ttcgctacct accactgcca 3600 gcactacgct ggttactctg ctaccttcgg tcagggtacc cgtgttgaaa tcaaacgtac 3660 cgttgctgct ccgtctgttt tcatcttccc gccgtctgac gaacagctga aatctggtac 3720 cgcttctgtt gtttgcctgc tgaacaactt ctacccgcgt gaagctaaag ttcagtggaa 3780 agttgacaac gctctgcagt ctggtaactc tcaggaatct gttaccgaac aggactctaa 3840 agactctacc tactctctgt cttctaccct gaccctgtct aaagctgact acgaaaagca 3900 caaagtttac gcttgcgaag ttacccacca gggtctgtct tctccggtta ccaaatcttt 3960 caaccgtggt gaatgctaat taattaataa ggaggatata attatgaaaa agacagctat 4020 cgcgattgca gtggcactgg ctggtttcgc taccgtagcc taggcggccg cagaagttca 4080 gctggttgaa tctggtggtg gtctggttaa agctggtggt tctctgatcc tgtcttgcgg 4140 tgtttctaac ttccgtatct ctgctcacac catgaactgg gttcgtcgtg ttccgggtgg 4200 tggtctggaa tgggttgctt ctatctctac ctcttctacc taccgtgact acgctgacgc 4260 tgttaaaggt cgtttcaccg tttctcgtga cgacctggaa gacttcgttt acctgcagat 4320 gcataaaatg cgtgttgaag acaccgctat ctactactgc gctcgtaaag gttctgaccg 4380 tctgtctgac aacgacccgt tcgacgcttg gggtccgggt accgttgtta ccgtttctcc 4440 ggcgtcgacc aaaggtccgt ctgttttccc gctggctccg tcttctaaat ctacctctgg 4500 tggtaccgct gctctgggtt gcctggttaa agactacttc ccggaaccgg ttaccgtttc 4560 ttggaactct ggtgctctga cctctggtgt tcacaccttc ccggctgttc tgcagtcttc 4620 tggtctgtac tctctgtctt ctgttgttac cgttccgtct tcttctctgg gtacccagac 4680 ctacatctgc aacgttaacc acaaaccgtc taacaccaaa gttgacaaga aagttgaacc 4740 gaaatcttgc ctgcgatcgc ggccaggccg gccgcaccat caccatcacc atggcgcata 4800 cccgtacgac gttccggact acgcttctac tagttaggag ggtggtggct ctgagggtgg 4860 cggttctgag ggtggcggct ctgagggagg cggttccggt ggtggctctg gttccggtga 4920 ttttgattat gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct atgaccgaaa atgccgatga 4980 aaacgcgcta cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct gtcgctactg attacggtgc 5040 tgctatcgat ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct aatggtaatg gtgctactgg 5100 tgattttgct ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt gacggtgata attcaccttt 5160

- 292 027835

aatgaataat ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa tcggttgaat gtcgcccttt 5220 tgtctttggc gctggtaaac catatgaatt ttctattgat tgtgacaaaa taaacttatt 5280 ccgtggtgtc tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt atgtatgtat tttctacgtt 5340 tgctaacata ctgcgtaata aggagtctta agctagctaa cgatcgccct tcccaacagt 5400 tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 5460 tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 5520 ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg 5580 ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt 5640 agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt 5700 tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta 5760 tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa 5820 atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt 5880 ag 5882

<210> 395

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 30D8

<400> 395

Gin 1

Ser

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ala

Ser

Ser

Val 10

Ser

Val

Ala

Pro

Gly 15

Gin

Thr

Ala

Arg

lie

Thr

Cys

Gly

Ala

Asn

Asn

lie

Gly

Ser

Gin

Asn

Val

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Val

Leu

Val

Val

Tyr

35

40

45

Asp

Asp

Arg

Asp

Arg

Pro

Ser

Gly

lie

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Gly

65

70

75

80

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Val

Trp

Asp

Ser

Ser

Arg

Asp

Gin

85

90

95

Ala

Val

lie

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Gin

Pro

100

105

110

Lys

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Thr

Leu

Phe

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Glu

Leu

115

120

125

Gin

Ala

Asn

Lys

Ala

Thr

Leu

Val

Cys

Leu

lie

Ser

Asp

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Ala

Trp

Lys

Ala

Asp

Ser

Ser

Pro

Val

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Val

Glu

Thr

Thr

Thr

Pro

Ser

Lys

Gin

Ser

Asn

Asn

Lys

Tyr

Ala

165

170

175

Ala

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Trp

Lys

Ser

His

Arg

180

185

190

Ser

Tyr

Ser

Cys

Gin

Val

Thr

His

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Glu

Lys

Thr

195

200

205

lie

Ala

Pro

Thr

Glu

Cys

210

<210> 396

<211> 224

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 30D8

<400> 396

- 293 027835

Glu 1

Val

Gin

Leu

Leu 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

lie

Ser

Cys

Lys

Thr

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

His

20

25

30

Thr

lie

Ala

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Val

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Asn

Thr

Glu

Tyr

Ala

Gin

Lys

lie

50

55

60

Gin

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Met

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Ser

Asp

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Trp

Leu

Val

Met

Gly

Gly

Phe

Ala

Phe

Asp

His

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

115

120

125

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

130

135

140

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

145

150

155

160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

165

170

175

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

180

185

190

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

195

200

205

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

210

215

220

<210> 397 <211> 214 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Легкая цепь 104E5
<400> 397
Asp lie Gin Met Thr	Gin Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn lie Lys Thr Tyr
20	25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin	Gin Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu lie
35	40 45
Ser Ala Val Ser Asn	Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50	55 60
Thr Gly Ser Gly Thr	Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65	70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr	Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Phe Ser lie Pro Leu
85	90 95
Thr Phe Gly Gly Gly	Ala Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala
100	105 110
Pro Ser Val Phe lie	Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115	120 125
Thr Ala Ser Val Val	Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130	135 140
Lys Val Gin Trp Lys	Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145	150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu	Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165	170 175
Ser Thr Leu Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr
180	185 190
Ala Cys Glu Val Thr	His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

- 294 027835

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 398

<211> 228

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 104E5

<400> 398

Gin 1

Val

Gin

Leu

Glu 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ser

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Pro

Ser

Gly

Gly

Thr

Phe

Asp

Thr

Tyr

20

25

30

Thr

He

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

Glu

Trp

Leu

35

40

45

Gly

Arg

lie

He

Pro

Ser

Leu

Gly

Glu

Thr

Asn

Tyr

Ala

His

Lys

Leu

50

55

60

Gin

Gly

Arg

Val

Thr

He

Thr

Ala

Asp

Lys

Ala

Thr

Ser

Val

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Asp

Leu

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ala

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Phe

Arg

He

Thr

Gly

Pro

Val

Asp

Trp

Val

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Ser

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Ser

115

120

125

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

130

135

140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145

150

155

160

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165

170

175

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

180

185

190

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

He

Cys

195

200

205

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

210

215

220

Pro

Lys

Ser

Cys

225

<210> 399

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 38F10

<400> 399

Asp 1

He

Gin

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Pro

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Ser

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

He

Ser

Asn

Trp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

He

35

40

45

Gin

Lys

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Thr

Ala

50

55

60

Ser

Gly

Phe

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

He

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

- 295 027835

65

70

75

80

Asp

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asn

Ser

Tyr

Ser

Gly

85

90

95

Leu

Ser

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

100

105

110

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

115

120

125

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

130

135

140

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

145

150

155

160

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

165

170

175

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

180

185

190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

195

200

205

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

<210> 400 <211> 227 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь Fab 38F10
<400> 400
Glu Val Gin Leu Leu	Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gin Pro Gly Lys
1 5	10 15
Ser Leu Arg Leu Ser	Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser lie Thr Asp Phe
20	25 30
Gly lie His Trp Val	Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35	40 45
Ala Leu lie Ser Tyr	Asn Glu Val Asn lie His Tyr Gly Glu Ser Val
50	55 60
Arg Gly Arg Phe Thr	lie Ser Arg Asp lie Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65	70 75 80
Leu Gin Met Asn Gly	Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85	90 95
Ala Arg Asp Val Trp	Glu Asp Ser Trp Leu Ser Leu Ala Cys Phe Gin
100	105 110
Glu Trp Gly Gin Gly	Ser Leu Val Val Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115	120 125
Gly Pro Ser Val Phe	Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130	135 140
Gly Thr Ala Ala Leu	Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145	150 155 160
Val Thr Val Ser Trp	Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165	170 175
Phe Pro Ala Val Leu	Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180	185 190
Val Thr Val Pro Ser	Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn
195	200 205
Val Asn His Lys Pro	Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210	215 220

Lys Ser Cys 225

<210> 401 <211> 220

- 296 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 14G3

<400> 401

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gin

Thr

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Ser

Val

Thr

Pro 15

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

lie

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

20

25

30

Asp

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

35

40

45

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

lie

Tyr

Thr

Leu

Ser

Tyr

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

50

55

60

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

65

70

75

80

lie

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Asp

Asp

Val

Gly

lie

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

85

90

95

Arg

Met

Glu

Phe

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Asp

lie

100

105

110

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

115

120

125

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

130

135

140

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

145

150

155

160

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

165

170

175

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

180

185

190

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

195

200

205

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

220

<210> 402

<211> 228

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 14G3

<400> 402

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Ser 15

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Ala

Ser

lie

Ser

Ser

Asp

20

25

30

Asn

His

Tyr

Trp

Ser

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

Trp

lie

Ala

Ser

lie

Tyr

Tyr

Thr

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Ala

Leu

Ser

lie

Asp

Thr

Ser

Gly

Asp

Gin

Phe

65

70

75

80

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Val

Arg

Gly

Leu

Phe

Phe

lie

Thr

Ala

Arg

Pro

Tyr

Trp

Tyr

Phe

100

105

110

Asp

Leu

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Leu

Val

Ala

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

130

135

140

- 297 027835

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

145

150

155

160

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

165

170

175

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

180

185

190

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

195

200

205

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

210

215

220

Pro

Lys

Ser

Cys

225

<210> 403

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 90D3

<400> 403

Ala 1

lie

Arg

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Ser

lie

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

lie

Ser

Asn

Phe

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Arg

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

35

40

45

Ser

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Gly

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Thr

Tyr

lie

Ser

Leu

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lie

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210> 404

<211> 226

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 90D3

<400> 404

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

- 298 027835

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Val

Gly

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Leu

Lys 30

Asn

Tyr

Glu

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Gin

Tyr

lie

35

40

45

Ser

Tyr

lie

Ser

Ser

Ser

Gly

Asn

Val

Val

Lys

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Gin

Gly

Arg

Phe

Thr

lie

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Gly

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Asn

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Val

Arg

Gly

Phe

Ser

lie

Asp

Lys

Tyr

Asp

Ser

Ser

Val

Asp

Glu

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gin

Gly

lie

Ala

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

115

120

125

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

130

135

140

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

145

150

155

160

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

165

170

175

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

180

185

190

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

195

200

205

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

210 215 220

Ser Cys 225

<210> 405

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 30D8

<400> 405

Gly Phe Thr Phe Ser Gly His Thr lie Ala 15 10

<210> 406

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH 30D8

<400> 406

Trp Val	Ser Thr Asn Asn Gly Asn	Thr Glu Tyr Ala	Gin Lys lie Gin
1	5	10	15
Gly

<210>	407
<211>	12
<212>	Белок
<213>	Искусственная последовательность
<220>

- 299 027835

<223> CDR3 VH 30D8

<400> 407

Glu Trp Leu Val Met Gly Gly Phe Ala Phe Asp His 15 10

<210> 408

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL 30D8

<400> 408

Gly Ala Asn Asn lie Gly Ser Gin Asn Val His 15 10

<210> 409

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL 30D8

<400> 409

Asp Asp Arg Asp Arg Pro Ser 1 5

<210> 410

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL 30D8

<400> 410

Gin Val Trp Asp Ser Ser Arg Asp Gin Ala Val lie

10

<210> 411

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 104E5

<400> 411

Gly Gly Thr Phe Asp Thr Tyr Thr lie Ser

10

<210> 412

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 300 027835

- 301 027835

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 38F10

<400> 417

Gly Phe Ser lie Thr Asp Phe Gly lie His 15 10

<210> 418

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH 38F10

<400> 418

Leu lie Ser Tyr Asn Glu Val Asn lie His Tyr Gly Glu Ser Val Arg

1

Gly

10

15

<210> 419 <211> 15 <212> Белок

:2i;

Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH 38F10

<400> 419

Asp Val Trp Glu Asp Ser Trp Leu Ser Leu Ala Cys Phe Gin Glu

10

15

<210> 420

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL 38F10

<400> 420

Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Trp Leu Ala 15 10

<210> 421

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL 38F10

<400> 421

Lys Ala Ser Asn Leu Glu Asp 1 5

- 302 027835

<210> 422

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL 38F10

<400> 422

Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Ser Gly Leu Ser 1 5 10

<210> 423

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 14G3

<400> 423

Gly Ala Ser lie Ser Ser Asp Asn His Tyr Trp Ser

10

<210> 424

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH 14G3

<400> 424

Ser lie Tyr Tyr Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

10

15

<210> 425

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH 14G3

<400> 425

Gly Leu Phe Phe lie Thr Ala Arg Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu

10

15

<210> 426

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL 14G3

<400> 426

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu 15 10 15

- 303 027835

- 304 027835

- 305 027835

- 306 027835

<220>

<223> CDR1 VH 90D3

<400> 441

Asn Tyr Glu Met Asn 1 5

<210> 442

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 30D8

<400> 442

cagtctgtgc tgacgcaggc atcctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccagaatt 60

acctgtgggg caaacaacat tggaagtcaa aatgttcact ggtaccagca gaagccaggc 120

caggcccctg ttttggtcgt ctatgatgat cgcgaccggc cctcagggat ccctgaccga 180

ttctctggct ccaactctgg gaatacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240

gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagtc gtgatcaggc cgtaattttt 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 360

ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420

gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 480

ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 540

ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600

gaagggagca ccgtggagaa gacaattgcc cctacagaat gctca 645

<210> 443

<211> 672

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 30D8

<400> 443

gaggtgcagc tgttgcagtc tggagcagag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaagatc 60

tcctgcaaga cttctggttt cacctttagc ggtcatacta tcgcctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggctgg gtcagcacta ataatggaaa cacagagtat 180

gcacagaaga tccagggcag agtcaccatg actatggaca catcaacgag cacagtctac 240

atggagttga ggagcctgac atctgacgac acggccgtgt atttctgtgc gagagagtgg 300

ctggtcatgg ggggcttcgc ctttgaccac tggggccagg gaaccctgct caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660

cccaaatctt gt 672

<210> 444

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 104E5

<400> 444

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgcctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gaacattaag acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggagagccc ctaaactcct gatctctgct gtgtccaatt tacaaagtgg ggtcccgtca 180

- 307 027835

aggttcagtg gcaccggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag agtttcagta ttccgctcac tttcggcgga 300

ggggccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa ctctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gctaa 645

<210> 445

<211> 684

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 104E5

<400> 445

caggtccaat tggaacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagc cttctggagg caccttcgac acatacacta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaac gtcttgagtg gctgggaagg atcatccctt cacttggtga aacaaactat 180

gcacacaaac tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aagccacgag tgtcgtctat 240

atggacctga gcgacctgac atccgaggac gcggccgtct attactgtgc atttcgtata 300

actggacctg tcgactgggt ctgggactat gggatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcagcgtct cgtcagcctc cagcaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420

aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600

ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagagagttg agcccaaatc ttgt 684

<210> 446

<211> 684

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 38F10

<400> 446

ccggccatgg ccgccggtga catccagttg acccagtctc cccccaccct gtctgcgtct 60

gtgggagaca gagtctccat gacttgccgg gccagtcaga gtattagtaa ctggttggcc 120

tggtatcagc aaaaaccagg gaaagcccct aaactcctca tccagaaggc gtccaattta 180

gaagatggcg tcccctcacg gttcaccgcc agtggatttg ggacagaatt cactctcacc 240

atcagcagcc tacagcctga tgatttcgca acttattact gtcaacagta taatagttac 300

tcaggcctca gtttcggcgg agggaccaag gtggacatca aacgaactgt ggctgcacca 360

tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 420

tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 480

ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 540

agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 600

tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 660

tgctaattaa ttaataagga ggat 684

<210> 447

<211> 726

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 38F10

<400> 447

gcggccgcag aggtgcagct gttggagtct gggggagacg tggtccagcc tgggaagtcc 60 ctgagactct cctgcacagc ctctggattc agcatcactg actttggcat ccactgggtc 120

- 308 027835

cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg gtggccctta tttcatataa cgaagtaaat 180

atacactatg gcgagtccgt gaggggccgc ttcaccatct ccagagacat tgccaagaac 240

acagtatatc tgcagatgaa tggcctgaga cctgaagaca cgggtgtgta tttttgtgcg 300

agggatgtct gggaggactc gtggctgtca cttgcgtgct tccaggaatg gggccagggc 360

tccctggtcg tcgtctcatc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 420

tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 480

cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 540

ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 600

agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 660

gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt ggtcggccag gccggccgca ccatcaccat 720

caccat 726

<210> 448

<211> 663

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 14G3

<400> 448

gatgttgtga tgacccagac tccactctcc ctgtccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcttg gatagtgatg atggaaacac ctatttggac 120

tggtacctgc agaagccagg gcagtctcca cagctcctga tctatacact ttcctatcgg 180

gcctctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa 240

atcagcaggg tggaggctga cgatgttgga atttattact gcatgcaacg tatggagttt 300

cccttcacct tcggccaagg gacacgactg gacattaaac gaactgtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgc 660

taa 663

<210> 449

<211> 684

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь Fab 14G3

<400> 449

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgc ctccatcagc agtgataatc actactggag ttggattcga 120

cagccccccg ggaagggcct ggagtggatt gcttccatct attacactgg tggcaccaac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgactcgcc ttatcaatag acacgtccgg ggaccagttc 240

tccttgaagc tgagctctgt gactgccgca gacacggccg tctattactg tgtcaggggc 300

ttgtttttca taacagctcg tccctactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg 360

gtcgctgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420

aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600

ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagagagttg agcccaaatc ttgt 684

<210> 450

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 90D3

- 309 027835

<400> 450

gccatccggt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcagc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagtattagc aactttttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggagagccc cgaaactcct gatctctgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180

agattcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag acttacattt ccctgtacac ctttggccag 300

gggaccaaac tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

<210> 451

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь Fab 90D3

<400> 451

gcggccgcac aggtgcagct ggtggagtcg gggggaggcc tggtaaagcc tggagggtcc 60

ctgagactct cgtgtgtagg ctctggattc accctcaaga attatgagat gaattgggtc 120

cgccaggctc cagggcaggg gctacaatat atttcataca tcagtagcag tggcaatgtc 180

gttaagtacg tagactctgt gcagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccgggaat 240

tcgctgtatc tccaaatgaa caacctgagg gccgaggaca cggccactta ttactgtgtg 300

agaggttttt cgatcgataa gtatgatagc agtgttgatg aatactgggg ccagggaatc 360

gcggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtggt cggccaggcc ggccgcacca tcaccatcac 720

cat 723

<210> 452

<211> 227

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь 56E11

<400> 452

Glu 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Ser 15

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Val

Ser

Gly

Val

Ser

lie

Asn

Ser

Asn

20

25

30

Asn

Tyr

Phe

Trp

Ala

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

Trp

lie

Gly

Asn

lie

Tyr

Tyr

Gly

Gly

Ser

Thr

His

Tyr

Asn

Ala

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Ser

Arg

Val

Thr

lie

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Ser

Gin

Phe

65

70

75

80

Ser

Leu

Lys

Leu

Asn

Ser

Val

Thr

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Ala

Ser

Glu

Ser

lie

Phe

Trp

Asp

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

Leu

Asp

100

105

110

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

115

120

125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

130

135

140

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

- 310 027835

145 150 155 160

Val

Thr

Val

Ser

Trp 165

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu 170

Thr

Ser

Gly

Val

His 175

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

180

185

190

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

195

200

205

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

210 215 220

Lys Ser Cys 225

<210> 453

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 56E11

<400> 453

Gin 1

Ala

Val

Leu

Thr 5

Gin

Pro

Pro

Ser

Ala 10

Ser

Gly

Ser

Pro

Gly 15

Gin

Ser

Val

Thr

lie

Ser

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

Ser

Asp

Val

Gly

Gly

Tyr

20

25

30

Asn

Tyr

Val

Ser

Trp

Tyr

Gin

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

35

40

45

lie

lie

Ser

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Pro

Ser

Gly

Val

Pro

Gly

Arg

Phe

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Lys

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Ser

Leu

Thr

Val

Ser

Gly

Leu

65

70

75

80

Gin

Ala

Glu

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys

Ser

Ser

Tyr

Ala

Gly

Ser

85

90

95

Arg

His

Val

Val

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Gin

100

105

110

Pro

Lys

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Thr

Leu

Phe

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Glu

115

120

125

Leu

Gin

Ala

Asn

Lys

Ala

Thr

Leu

Val

Cys

Leu

lie

Ser

Asp

Phe

Tyr

130

135

140

Pro

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Ala

Trp

Lys

Ala

Asp

Ser

Ser

Pro

Val

Lys

145

150

155

160

Ala

Gly

Val

Glu

Thr

Thr

Thr

Pro

Ser

Lys

Gin

Ser

Asn

Asn

Lys

Tyr

165

170

175

Ala

Ala

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Trp

Lys

Ser

His

180

185

190

Arg

Ser

Tyr

Ser

Cys

Gin

Val

Thr

His

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Glu

Lys

195

200

205

Thr

lie

Ala

Pro

Ala

Glu

Cys

Ser

210 215

<210> 454

<211> 236

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь 17C9

<400> 454

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Trp

Gly

Ala

Gly

Leu

Val

Arg

Pro

Ser

Glu

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ala

Val

Tyr

Gly

Asp

Ser

Phe

Asn

Asp

Tyr

- 311 027835

20

25

30

Phe

Trp

Thr

Trp

lie

Arg

Gin

Thr

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

lie

35

40

45

Gly

Glu

lie

Ser

His

Ser

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Val

Thr

lie

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

65

70

75

80

Lys

Leu

Ser

Ala

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Thr

Val

Tyr

Phe

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Pro

Pro

Pro

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

100

105

110

Pro

Pro

Tyr

Tyr

His

Tyr

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

115

120

125

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

130

135

140

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

145

150

155

160

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

165

170

175

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

180

185

190

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

195

200

205

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

210

215

220

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

225

230

235

<210> 455 <211> 214 <212> Белок <213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Легкая цепь 17C9
<400> 455
Glu lie Val Leu Thr	Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5	10 15
Asp Arg Val Thr lie	Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn lie Asn Thr Trp
20	25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin	Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35	40 45
Tyr Ala Ala Ser Phe	Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50	55 60
Ser Gly Ser Gly Thr	Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Leu Gin Pro
65	70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr	Tyr Phe Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Arg
85	90 95
Thr Phe Gly Gin Gly	Thr Lys Val Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100	105 110
Pro Ser Val Phe lie	Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115	120 125
Thr Ala Ser Val Val	Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130	135 140
Lys Val Gin Trp Lys	Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145	150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu	Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165	170 175
Ser Thr Leu Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180	185 190
Ala Cys Glu Val Thr	His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195	200 205

- 312 027835

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 456

<211> 221

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь 69F6

<400> 456

Gin 1

Met

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Arg

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

lie

Ala

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Trp

lie

Ala

Trp

Val

Arg

Gin

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

35

40

45

Gly

lie

lie

Phe

Pro

Asn

Asp

Ser

Asp

Ala

Thr

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gin

Gly

Gin

Val

Thr

Met

Ser

Val

Asp

Lys

Ser

lie

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Trp

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gin

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ser

Phe

Glu

Ser

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

115

120

125

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

130

135

140

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

170

175

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

195

200

205

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

210

215

220

<210> 457

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 69F6

<400> 457

Glu 1

lie

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

Ser

Cys

Gin

Ala

Ser

Gin

Asp

lie

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

lie

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asp

Asp

Leu

Arg

Gly

85

90

95

- 313 027835

Gly

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

Thr

Val

100

105

110

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lie

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

115

120

125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

130

135

140

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

145

150

155

160

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

165

170

175

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

180

185

190

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

195

200

205

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

<210> 458

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 56E11

<400> 458

Gly Val Ser lie Asn Ser Asn Asn Tyr Phe Trp Ala 15 10

<210> 459

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH 56E11

<400> 459

Asn lie Tyr Tyr Gly Gly Ser Thr His Tyr Asn Ala Ser Leu Gin Ser

10

15

<210> 460

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH 56E11

<400> 460

Ser Glu Ser lie Phe Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

10

<210>	461
<211>	14
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	CDR1 VL 56E11

- 314 027835

<400> 461

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 15 10

<210> 462

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL 56E11

<400> 462

Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser

<210> 463

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL 56E11

<400> 463

Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Arg His Val Val 15 10

<210> 464

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 17C9

<400> 464

Gly Asp Ser Phe Asn Asp Tyr Phe Trp Thr 15 10

<210> 465

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH 17C9

<400> 465

Glu lie Ser His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser

10

15

<210>	466
<211>	25
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>

- 315 027835

<223> CDR3 VH 17C9

<400> 466

Gly	Val	Arg	Ser	Arg	Pro	Pro	Pro	Ser	Tyr Arg Gly Ser	Gly Ser Pro
1				5					10	15
Pro	Tyr	Tyr	His	Tyr	Gly	Met	Asp	Val
			20					25

<210> 467

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL 17C9

<400> 467

Arg Ala Ser Gin Asn lie Asn Thr Trp Leu Ala 15 10

<210> 468

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL 17C9

<400> 468

Ala Ala Ser Phe Leu Gin Ser

<210> 469

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL 17C9

<400> 469

Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Arg Thr 1 5

<210> 470

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 69F6

<400> 470

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp lie Ala 15 10

<210> 471 <211> 17 <212> Белок

- 316 027835

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH 69F6

<400> 471

Не Не Phe Pro Asn Asp Ser Asp Ala Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15

Gly

<210> 472

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH 69F6

<400> 472

Gin Tyr Tyr Leu Gly Ser Phe Glu Ser 1 5

<210> 473

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL 69F6

<400> 473

Gin Ala Ser Asp He Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10

<210> 474

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL 69F6

<400> 474

Asp Ala Ser Tyr Leu Asp Thr 1 5

<210> 475

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL 69F6

<400> 475

Gin Gin Tyr Asp Asp Leu Arg Gly Gly Phe Thr 15 10

- 317 027835

<210> 476

<211> 648

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 56E11

<400> 476

caggctgtgc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120

caccccggga aagcccccag actcataatt tctgaagtca ctaagcggcc ctcaggggtc 180

cctggtcgct tctccggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc agctcatatg caggcagcag gcatgtggtt 300

ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtcctc ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacaatt gcccctgcag aatgctca 648

<210> 477

<211> 681

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь 56E11

<400> 477

gaggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcagtg tctctggtgt ctccatcaac agcaacaatt atttctgggc ctggatccgc 120

cagcccccag gcaaggggct ggagtggatt gggaatatct attatggtgg gagcacccac 180

tacaatgcgt ccctgcagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gagccagttc 240

tccctgaagc tgaactctgt gacctccgcc gacacggctg tgtattactg tgcggcttcc 300

gagtctatct tttgggacta ctactacggc ctggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ctgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

aaagttgagc ccaaatcttg t 681

<210> 478

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 17C9

<400> 478

gaaattgtgt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gaatattaat acctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcctttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cttgcagcct 240

gaagattttg caacttactt ttgtcaacag gctaacagtt tccctcggac cttcggccag 300

gggaccaagg tggaagtcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

318 027835

<210> 479

<211> 708

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь 17C9

<400> 479

caggtacagc tgcagcagtg gggcgcagga ctggtgaggc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtga ctccttcaat gattacttct ggacgtggat ccgccagacc 120

ccaggaaagg ggctggagtg gattggggaa atcagtcata gtggaagcac caactacagc 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aaactcagcg ctgtgaccgc cgcggacacg actgtgtatt tctgtgcgag aggtgtccgc 300

tcccgacccc ctccgagtta ccgtggctcg ggctcccccc cttactacca ttacggtatg 360

gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg 420

gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540

agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600

gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660

aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgt 708

<210> 480

<211> 648

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь 69F6

<400> 480

gaaattgtgt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60

atctcttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca acagaaacca 120

gggaaagccc ctaggctcct gatctacgat gcatcctatt tggacacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctacagcct 240

gaagattttg caacatatta ctgtcaacaa tatgatgatc tccggggggg gttcactttc 300

ggccctggga ccaaagtgga cgtcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgc 648

<210> 481

<211> 663

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь 69F6

<400> 481

cagatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgagaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60

gcctgtaagg gttccggata cagttttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggaatg gctggggatc atctttccta atgactctga tgccacatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagtcgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctgcagtgga acagcctgaa ggcctcggac accgccgtgt atttttgtgc gagacagtat 300

tatcttggct cgtttgaatc ctggggccaa ggaaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgt 663

- 319 027835

<210> 482

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 56E11

<400> 482

Ser Asn Asn Tyr Phe Trp Ala 1 5

<210> 483

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 17C9

<400> 483

Asp Tyr Phe Trp Thr 1 5

<210> 484

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH 69F6

<400> 484

Ser Tyr Trp lie Ala 1 5

<210> 485

<211> 574

<212> Белок

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<220>

<223> Белок F

<400> 485

Met 1

Glu

Leu

Leu

He 5

Leu

Lys

Ala

Asn

Ala 10

He

Thr

Thr

He

Leu 15

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

Cys

Phe

Ala

Ser

Gly

Gin

Asn

He

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

lie

Thr

He

Glu

Leu

Ser

Asn

He

50

55

60

Lys

Lys

Asn

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ala

Lys

Ala

Lys

Leu

He

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Ser

Thr

Gin

Ala

Thr

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Leu

Pro

100

105

110

Arg

Phe

Met

Asn

Tyr

Thr

Leu

Asn

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Asn

Val

Thr

- 320 027835

115

120

125

Leu

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

Gly

Ser

Ala

lie

Ala

Ser

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

Leu

145

150

155

160

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

lie

Lys

Ser

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

165

170

175

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Asn

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Val

180

185

190

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

lie

Asp

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

lie

Val

Asn

195

200

205

Lys

Gin

Ser

Cys

Ser

lie

Ser

Asn

lie

Glu

Thr

Val

lie

Glu

Phe

Gin

210

215

220

Gin

Lys

Asn

Asn

Arg

Leu

Leu

Glu

lie

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Val

Asn

225

230

235

240

Ala

Gly

Val

Thr

Thr

Pro

Val

Ser

Thr

Tyr

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

Glu

245

250

255

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Asn

Asp

Met

Pro

lie

Thr

Asn

Asp

Gin

Lys

Lys

260

265

270

Leu

Met

Ser

Asn

Asn

Val

Gin

lie

Val

Arg

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

lie

275

280

285

Met

Ser

lie

lie

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Val

Gin

Leu

Pro

290

295

300

Leu

Tyr

Gly

Val

lie

Asp

Thr

Pro

Cys

Trp

Lys

Leu

His

Thr

Ser

Pro

305

310

315

320

Leu

Cys

Thr

Thr

Asn

Thr

Lys

Glu

Gly

Ser

Asn

lie

Cys

Leu

Thr

Arg

325

330

335

Thr

Asp

Arg

Gly

Trp

Tyr

Cys

Asp

Asn

Ala

Gly

Ser

Val

Ser

Phe

Phe

340

345

350

Pro

Gin

Ala

Glu

Thr

Cys

Lys

Val

Gin

Ser

Asn

Arg

Val

Phe

Cys

Asp

355

360

365

Thr

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

Val

Asn

Leu

Cys

Asn

Val

370

375

380

Asp

lie

Phe

Asn

Pro

Lys

Tyr

Asp

Cys

Lys

lie

Met

Thr

Ser

Lys

Thr

385

390

395

400

Asp

Val

Ser

Ser

Ser

Val

lie

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

lie

Val

Ser

Cys

405

410

415

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

lie

lie

420

425

430

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Val

Asp

435

440

445

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

Gly

450

455

460

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

lie

lie

Asn

Phe

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

Leu

Val

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

lie

Ser

Gin

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

lie

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

lie

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn

Val

lie

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

lie

Met

lie

Thr

515

520

525

Thr

lie

lie

lie

Val

lie

lie

Val

lie

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Ala

Val

530

535

540

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Arg

Ser

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser

Gly

lie

Asn

Asn

lie

Ala

Phe

Ser

Asn

565

570

<210> 486

<211> 574

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

- 321 027835

<220>

<223> Белок F MARM мотавизумаба

<400> 486

Met 1

Glu

Leu

Leu

lie 5

Leu

Lys

Ala

Asn

Ala 10

He

Thr

Thr

He

Leu 15

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

Cys

Phe

Ala

Ser

Gly

Gin

Asn

He

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

He

Thr

He

Glu

Leu

Ser

Asn

He

50

55

60

Lys

Lys

Asn

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ala

Lys

Ala

Lys

Leu

He

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Ser

Thr

Gin

Ala

Thr

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Leu

Pro

100

105

110

Arg

Phe

Met

Asn

Tyr

Thr

Leu

Asn

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Asn

Val

Thr

115

120

125

Leu

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

Gly

Ser

Ala

lie

Ala

Ser

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

Leu

145

150

155

160

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

lie

Lys

Ser

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

165

170

175

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Asn

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Val

180

185

190

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

lie

Asp

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

He

Val

Asn

195

200

205

Lys

Gin

Ser

Cys

Ser

lie

Ser

Asn

lie

Glu

Thr

Val

He

Glu

Phe

Gin

210

215

220

Gin

Lys

Asn

Asn

Arg

Leu

Leu

Glu

He

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Val

Asn

225

230

235

240

Ala

Gly

Val

Thr

Thr

Pro

Val

Ser

Thr

Tyr

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

Glu

245

250

255

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Asn

Asp

Met

Pro

He

Thr

Asn

Asp

Gin

Lys

Glu

260

265

270

Leu

Met

Ser

Asn

Asn

Val

Gin

lie

Val

Arg

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

He

275

280

285

Met

Ser

lie

lie

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Val

Gin

Leu

Pro

290

295

300

Leu

Tyr

Gly

Val

lie

Asp

Thr

Pro

Cys

Trp

Lys

Leu

His

Thr

Ser

Pro

305

310

315

320

Leu

Cys

Thr

Thr

Asn

Thr

Lys

Glu

Gly

Ser

Asn

He

Cys

Leu

Thr

Arg

325

330

335

Thr

Asp

Arg

Gly

Trp

Tyr

Cys

Asp

Asn

Ala

Gly

Ser

Val

Ser

Phe

Phe

340

345

350

Pro

Gin

Ala

Glu

Thr

Cys

Lys

Val

Gin

Ser

Asn

Arg

Val

Phe

Cys

Asp

355

360

365

Thr

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

Val

Asn

Leu

Cys

Asn

Val

370

375

380

Asp

lie

Phe

Asn

Pro

Lys

Tyr

Asp

Cys

Lys

He

Met

Thr

Ser

Lys

Thr

385

390

395

400

Asp

Val

Ser

Ser

Ser

Val

lie

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

He

Val

Ser

Cys

405

410

415

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

He

He

420

425

430

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Val

Asp

435

440

445

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

Gly

450

455

460

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

He

He

Asn

Phe

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

- 322 027835

Leu

Val

Phe

Pro

Ser 485

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala 490

Ser

lie

Ser

Gin

Val 495

Asn

Glu

Lys

lie

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

lie

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn

Val

lie

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

lie

Met

lie

Thr

515

520

525

Thr

lie

lie

lie

Val

lie

lie

Val

lie

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Ala

Val

530

535

540

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Arg

Ser

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser

Gly

lie

Asn

Asn

lie

Ala

Phe

Ser

Asn

565 570

<210> 487

<211> 574

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок F 58C5 MARM

<400> 487

Met 1

Glu

Leu

Leu

lie 5

Leu

Lys

Ala

Asn

Ala 10

lie

Thr

Thr

lie

Leu 15

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

Cys

Phe

Ala

Ser

Gly

Gin

Asn

lie

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

lie

Thr

lie

Glu

Leu

Ser

Lys

lie

50

55

60

Lys

Lys

Asn

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ala

Lys

Ala

Lys

Leu

lie

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Ser

Thr

Gin

Ala

Thr

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Leu

Pro

100

105

110

Arg

Phe

Lys

Asn

Tyr

Thr

Leu

Asn

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Asn

Val

Thr

115

120

125

Leu

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

Gly

Ser

Ala

lie

Ala

Ser

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

Leu

145

150

155

160

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

lie

Lys

Ser

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

165

170

175

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Asn

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Val

180

185

190

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

lie

Asp

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

lie

Val

Asn

195

200

205

Lys

Gin

Ser

Cys

Ser

lie

Ser

Asn

lie

Glu

Thr

Val

lie

Glu

Phe

Gin

210

215

220

Gin

Lys

Asn

Asn

Arg

Leu

Leu

Glu

lie

Thr

Arg

Glu

Phe

Ser

Val

Asn

225

230

235

240

Ala

Gly

Val

Thr

Thr

Pro

Val

Ser

Thr

Tyr

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

Glu

245

250

255

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Asn

Asp

Met

Pro

lie

Thr

Asn

Asp

Gin

Lys

Lys

260

265

270

Leu

Met

Ser

Asn

Asn

Val

Gin

lie

Val

Arg

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

lie

275

280

285

Met

Ser

lie

lie

Lys

Glu

Gly

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Val

Gin

Leu

Pro

290

295

300

Leu

Tyr

Gly

Val

lie

Asp

Thr

Pro

Cys

Trp

Lys

Leu

His

Thr

Ser

Pro

305

310

315

320

Leu

Cys

Thr

Thr

Asn

Thr

Lys

Glu

Gly

Ser

Asn

lie

Cys

Leu

Thr

Arg

- 323 027835

325

330

335

Thr

Asp

Arg

Gly

Trp

Tyr

Cys

Asp

Asn

Ala

Gly

Ser

Val

Ser

Phe

Phe

340

345

350

Pro

Gin

Ala

Glu

Thr

Cys

Lys

Val

Gin

Ser

Asn

Arg

Val

Phe

Cys

Asp

355

360

365

Thr

Met

Asn

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

Val

Asn

Leu

Cys

Asn

Val

370

375

380

Asp

lie

Phe

Asn

Pro

Lys

Tyr

Asp

Cys

Lys

lie

Met

Thr

Ser

Lys

Thr

385

390

395

400

Asp

Val

Ser

Ser

Ser

Val

lie

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

lie

Val

Ser

Cys

405

410

415

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

lie

lie

420

425

430

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Val

Asp

435

440

445

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

Gly

450

455

460

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

lie

lie

Asn

Phe

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

Leu

Val

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

lie

Ser

Gin

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

lie

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

lie

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn

Val

lie

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

lie

Met

lie

Thr

515

520

525

Thr

lie

lie

lie

Val

lie

lie

Val

lie

Leu

Leu

Ser

Leu

lie

Ala

Val

530

535

540

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Arg

Ser

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser

Gly

lie

Asn

Asn

lie

Ala

Phe

Ser

Asn

565

570

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело против респираторно-синцитиального вируса (PCB) или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат

   вариабельную область тяжелой цепи, включающую V_H CDR1, содержащую последовательность аминокислотных остатков, указанную в SEQ ID NO: 405 или 437, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 405 или 437; VH CDR2, содержащую последовательность аминокислотных остатков, указанную в SEQ ID NO: 406, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 406; и V_H CDR3, содержащую последовательность аминокислотных остатков, указанную в SEQ ID NO: 407, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 407; и

   вариабельную область легкой цепи, включающую V_L CDR1, содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 408, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 408; V_L CDR2, содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 409, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 409; и V_L CDR3, содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 410, или последовательность аминокислот, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности с SEQ ID NO: 410; и

   антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с белком слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (PCB) и/или нейтрализуют PCB.
2. 2. Антитело к PCB или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащие

   домен V_H, где аминокислотная последовательность домена V_H указана в аминокислотах 1-121 SEQ

   ID NO: 396 или по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-121 SEQ ID NO: 396; и

   домен V_L, где аминокислотная последовательность домена V_L указана в аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395 или по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, указанной в аминокислотах 1-110 SEQ ID NO: 395.
3. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где EC₅₀ антитела или антигенсвязывающего фрагмента для нейтрализации PCB в анализе подавления бляшкообразования in vitro составляет

   - 324 027835

   менее чем 2 нМ или аффинность антитела или антигенсвязывающего фрагмента к выделенному белку F PCB или к вирусу PCB составляет по меньшей мере 10⁸ М^-1.
4. 4. Поливалентное антитело против а) PCB, или b) PCB и вируса парагриппа (PIV), или с) PCB и вируса парагриппа (PIV), содержащее

   первую антигенсвязывающую часть, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, конъюгированные с доменом мультимеризации; и

   вторую антигенсвязывающую часть, содержащую антигенсвязывающий фрагмент противовирусного антитела, выбранного из группы, состоящей из антитела против PCB, PIV или hMPV, конъюгированный со вторым доменом мультимеризации, где

   первый домен мультимеризации и второй домен мультимеризации являются комплементарными или одинаковыми, вследствие чего первая антигенсвязывающая часть и вторая антигенсвязывающая часть формируют поливалентное антитело.
5. 5. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, или поливалентное антитело по п.4 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
6. 6. Способ лечения или подавления одного или более симптомов инфекции PCB у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или 2.
7. 7. Способ предотвращения инфекции PCB у индивидуума, включающий введение индивидууму профилактически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или 2.
8. 8. Способ детекции инфекции PCB, включающий:

   (a) анализ уровня антигена PCB в образце жидкостей, клеток или тканей с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или 2;

   (b) сравнение анализируемого уровня антигена PCB с контрольным уровнем, где увеличение анализируемого уровня антигена PCB по сравнению с контрольным уровнем антигена PCB является показателем инфекции PCB.
9. 9. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2.
10. 10. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по пп.1 или 2 для приготовления лекарственного средства для лечения или подавления одного или более симптомов инфекции PCB или предотвращения инфекции PCB.