KR100654645B1 - 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체를 항원성 챌린지에 대한 응답반응으로 생성하도록 수사되어 있으나, 그 내인성 좌는 작용할 수 없는 돌연변이 동물에게 상기 항원을 투여하여 생성할 수 있는 완전 인간 항체에 관한 것이다. 항체 자체나 그 유사체를 수득하기 위해 다양한 연속 조작법을 수행할 수 있다.

Description

면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체

본 발명은 면역학 분야, 특히 항체 생산에 관한 것이다. 구체적으로는, 요구되는 항체에 대한 항원으로 돌연변이 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 방법으로 상기 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 돌연변이 동물은 내인성 항체와는 반대로 인간 항체를 생성하도록 변형된 것이다.

본원에 참고문헌으로 포함되는 1994년 2월 3일 공개된 PCT 출원 WO 94/02602호에는 항원 투여에 대한 응답 반응으로 내인성 항체 보다는 완전한 인간 항체를 생성하도록 변형된 인간을 제외한 돌연변이 동물의 생성 방법을 상세히 기술하고 있다. 개략해 보면, 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 암호하는 내인성 좌는 돌연변이 숙주내에서는 작용할 수 없고 인간의 중쇄와 경쇄 단백질을 암호하는 유전자 좌가 게놈내에 삽입되어 있다. 일반적으로, 목적하는 모든 변형을 포함하는 동물은 변형체의 완전한 보체보다 적은 수를 함유하는 교잡 육종한 중간체 동물에 의해 얻어진다. 이 문헌에 기재된 인간을 제외한 동물의 바람직한 양태는 마우스이다. 구체적으로는, 면역원을 투여했을 때 이 항원에 면역특이적인 쥐의 항체보다는 오히려 완전한 인간 항체를 비롯한 인간 가변부를 가진 항체를 생산하는 마우스를 기재하고 있다.

이러한 돌연변이 동물의 사용가능성은 완전한 인간 항체의 생성 방법에 대한 새로운 시도를 가능하게 해 준 것이다. 다양한 면역특이성을 가진 항체는 치료용 및 진단용으로 바람직하다. 특히, 인간 치료용 및 생체내 진단용으로 필요한 항체는, 이러한 항체들에 대한 종래 기술의 공급물들이 비인간 숙주에 의해 생성되는 항체의 특징적인 구조를 가진 면역글로불린을 생성하기 때문에 문제가 되어 왔다. 이러한 항체는 인간에게 사용될 때 면역원 유발성인 경향이 있다.

전술한 WO 94/02602호에 기재된 인간을 제외한 면역원 응답성 돌연변이 동물의 사용가능성은 인간을 숙주로 이용하지 않아도 인간의 항체를 편리하게 생성할 수 있게 한 것이다.

도 1은 yH1C 인간 중쇄 YAC 작제의 모식도.

도 2는 yK2 인간 카파 경쇄 YAC 작제의 모식도.

도 3은 인간 IL-6으로 면역화된 XenoMouse^TM로부터 유래한 항-IL-6 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.

도 4는 인간 TNF-α로 면역화된 XenoMouse^TM로부터 유래한 항-TNFα 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.

도 5는 인간 CD4로 면역화된 XenoMouse^TM로부터 유래한 항-CD4 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.

도 6은 표면에서 L-셀렉틴을 발현하는 300.19 세포로 면역화된 XenoMouse^TM의 혈청 역가를 도시한 것이다. 사용된 ELISA 분석에서 이 항체들은 인간 μ 불변부 중쇄를 갖고 있기만 하다면 검출될 수 있다.

도 7은 표면에서 L-셀렉틴을 발현하는 300.19 세포로 면역화된 XenoMouse^TM의 혈청 역가를 도시한 것이다. 사용된 ELISA 분석에서 이 항체들은 인간 κ 경쇄를 갖고 있기만 하다면 검출할 수 있다.

도 8은 인간 L-셀렉틴으로 면역화된 XenoMouse^TM로부터 채취한 혈청과 함께 항온처리하고 인간 경쇄 κ 영역과 면역반응성인 항체로 표지된 인간 호중구를 FACS 분석한 결과를 도시한 것이다.

도 9는 인간 단백질 gp39의 생성이 유효하도록 포유류 세포를 형질감염시키는데 사용된 플라스미드의 모식도이다.

도 10은 인간 gp39를 발현하는 CHO 세포로 면역화된 마우스의 혈청 역가측정 곡선을 도시한 것이다. 이 ELISA에서 검출된 항체는 gp39와 면역반응성이고 인간 κ 경쇄의 인간 중쇄 μ 불변부를 함유해야만 한다.

도 11은 하이브리도마 클론 D5.1에 의해 분비된 모노클로널 항체에 대한 적정 곡선이다. 이 클론은 파상풍 독소 C(TTC)로 면역화된 XenoMouse^TM로부터 얻은 것으로, 중쇄중에 인간 μ 불변부와 인간 κ 경쇄를 함유한다.

도 12는 항파상풍 독소 모노클로널 항체 D5.1.4(D5.1의 서브클론)의 중쇄의 DNA 서열을 도시한 것이며, 배선을 구성하는 돌연변이는 박스로 표시되어 있다.

도 13은 항파상풍 독소 모노클로널 항체 D5.1.4의 카파 경쇄의 DNA 서열을 도시한 것이며, 배선을 구성하는 돌연변이는 박스로 표시되어 있다.

도 14는 인간 IL-8로 면역화된 XenoMouse^TM의 항-IL-8 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.

도 15는 모노클로널 항-인간-IL-8 항체가 나타내는 인간 호중구에 대한 IL-8 결합 억제율을 도시한 것이다.

도 16A내지 16H는 항-IL-8 항체 D1.1(16A-B), K2.2(16C-D), K4.2(16E-F), 및 K4.3(16G-H)의 중쇄와 카파 경쇄의 DNA 서열을 도시한 것이다.

발명의 실시 양태

개괄적으로, 본 발명의 방법은 내인성이 아닌 인간 항체를 생성할 수 있도록 유전자적으로 변형시킨 인간을 제외한 돌연변이 동물에게, 면역특이적인 시약의 인간 형태가 요구되는 항원을 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 동물은 그 게놈에 있는 내인성 중쇄 및/또는 카파 경쇄좌가 작용할 수 없도록 변형되어, 이러한 내인성 좌는 항원에 대한 응답으로 면역글로불린을 암호하는 유전자를 생성하는데 필요한 재배열을 할 수 없다. 또한, 동물은 그 게놈내에 1종 이상의 인간 중쇄좌와 1종 이상의 인간 경쇄좌를 갖고 있어, 투여된 항원에 대한 응답으로 인간좌는 재배열하여 항원에 면역특이적인 인간 가변부를 암호하는 유전자를 제공할 수 있다.

이와 같은 본 발명의 방법에 유용한 동물을 작제하는데 대한 상세한 설명은 상기 문헌 PCT 출원 WO94/02602호에 기재되어 있다. 본 발명의 YAC들에 대한 예는 예컨대, 문헌[Green et al. Nature Genetics 7:13-21(1994)]에 개시되어 있다. XenoMouse^TM의 바람직한 양태에서는 인간 중쇄 YAC, yH1C(1020 kb) 및 인간 경쇄 YAC, yK2(880 kb)를 사용한다. yH1C는 인간 가변부, 전체 D 및 J_H 영역, 인간 μ, δ, r2 불변부 및 마우스 3' 인헨서의 870kb로 구성된다. yK2는 인간 카파쇄 근접 가변부(V _κ ), 전체 J _κ 영역 및 C _κ 와 그 인접 서열에 카파 결실 인자( _κ de)를 함유하는 650kb로 구성된다. 또한, 두 YAC들은 그 YAC 벡터 아암에 인간 HPRT 선택성 마커를 함유한다. yH1C 및 yK2의 작제는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 수행하였다. 간략히 요약하면, 인간 면역글로불린 좌의 단편을 함유하는 YAC 클론은 YAC 라이브러리(Calbertsen et al, PNAS 87:4256(1990))를 선별하여 확인하였다. 중첩 클론은 표준 재조합 기법에 따라 결합시켰다(Mendez et al., Genomics 26:294-307(1995)). yH1C 및 yK2를 조립하는 도식의 상세한 설명은 각각 도 1과 도 2에 기재한다.

yK2는, 예컨대 문헌[Burke et al., Science 236:806-812(1987), Brownstein et al., Science 244:1348-1351(1989) 및 Burke et al., Methods in Enzymology 194:251-270(1991)]에 개시된 올손 라이브러리에서 선택한 클론 A80-C7, A210-F10 및 A203-C6로부터 작제하였다.

목적 항체를 생성하는데 있어서, 제1 단계는 항원을 투여하는 것이다. 이러한 투여 기법은 통상적인 것으로, 항원 자체의 성질에 따라 달라지는 적합한 면역 프로토콜과 제제를 포함한다. 또한, 면역원성을 향상시키고(또는) 보조제를 함유하는 제제를 포함하며(또는) 복수 주입액을 투여하고(또는) 면역 경로를 변화시키는 등의 이유로 담체와 함께 항원을 제공하는 것이 필요할 수도 있다. 이러한 기법은 일반적인 것으로, 이 기법의 최적화는 요구되는 면역특이적 시약에 대한 특정 항원의 특징에 따라 달라질 것이다.

본원에 사용된, "면역특이적 시약"이란 용어는 면역글로불린과 그 유사체를 포함한다. "유사체"란 용어는 본원에서 특정한 의미를 갖고 있다. 이것은 면역특이성을 나타내는 완전한 인간 유래의 면역글로불린 부를 포함하는 성분을 의미한다. 특히, 적절한 입체적 형태를 산출하기 위해 프레임워크(Fr)의 충분한 부위와 함께 상보성 결정 영역(CDR)이 필요하다. 항체의 전형적인 면역특이적 유사체로는 F(ab")₂, Fab', 및 Fab 영역을 포함한다. 예컨대, 적절한 면역특이성을 가진 1본쇄 F_v 유사체를 얻기 위한 가변부의 변형된 형태는 공지되어 있다. 이러한 F_v 작제에 대한 설명은 예컨대, 문헌[Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-63(1991)]에 기재되어 있다. 또한, 제1 항체의 가변부와 제2 항체의 가변부를 결합시켜 다중 면역특이성을 가진 항체 유사체를 작제하는 것도 가능하다.

또한, 완전한 인간 특성을 가진 가변부는 독성, 생물학적 작용성, 다른 결합 특이성 등을 제공할 수 있는 다양한 부가 물질에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 완전한 인간 가변부를 함유하는 부는 1본쇄 융합 단백질, 펩티드 결합과 관련된 분자 이외에 다른 공유 방법으로 결합된 분자 및 응집 분자를 포함한다. 부가 분자에 공유 또는 비공유적으로 결합된 가변부를 포함하는 유사체의 예로는 다음과 같은 것들을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 문헌[Traunecker, A. et al. Int.J.Cancer Supp(1992) Supp 7:51-52]은 CD3에 대해 유도된 F_v 영역이 가용성 CD4나 다른 리간드, 예컨대 OVCA 및 IL-7에 결합되어 있는 이중특이적 시약인 야누신(janusin)에 대해 개시하고 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 방법으로 생성된 완전한 인간 가변부는 F_v 분자내에 작제할 수 있고 인용 문헌에 예시된 바와 같은 대안적인 리간드에 결합시킬 수 있다. 문헌[Higgins, P.J. et al, J.Infect Disease(1992) 166:198-202]은 GP120의 V3 영역내의 특정 서열에 대해 유도된 항체에 가교된 OKT3으로 구성된 이종접합체 항체를 기재하고 있다. 또한, 이러한 이종접합체 항체는 본 발명의 방법에 의해 생성된 면역글로불린내에 함유되어 있는 최소한의 인간 가변부를 사용하여 작제할 수 있다. 이중특이성 항체의 또 다른 예는 문헌[Fanger, M.W. et al., Cancer Treat Res(1993) 68:181-194] 및 [Fanger, M.W. et al. Crit Rev Immunol(1992) 12:101-124]에 기재된 것을 포함한다. 통상적인 항체를 포함하는 면역독소인 접합체는 당해 기술분야에 널리 개시되어 있다. 독소는 통상적인 결합 기법으로 항체에 결합시킬 수 있거나 단백질 독소부를 함유하는 면역독소를 융합 단백질로서 생성할 수 있다. 본 발명의 유사체는 이러한 면역독소를 수득하기 위한 해당 방법에 사용할 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 [Byers, B.S. et al. Seminars Cell Biol(1991) 2:59-70 및 Fanger, M.W. et al. Immnuol Today(1991) 12:51-54]에 기재된 것이다.

또한, 본 발명의 면역글로불린과 유사체 중 일부는 항원이 신호 도입 기능을 수행하는 경우에 있어서 면역특이적인 항원에 대해 작동물질의 활성을 갖는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된, 예컨대 세포 표면 수용체에 대해 면역특이성인 항체나 유사체의 아군은 천연 리간드에 의해 유인된 것에 상응하는 상기 수용체를 함유하는 세포로부터 응답반응으로 유인할 수 있을 것이다. 더우기, 화학 반응의 전이 상태를 모방하는 물질에 대해 면역특이적인 항체 또는 유사체도 촉매 활성을 가질 것이다. 그러므로, 본 발명의 항체 및 유사체의 아군은 촉매 항체로서 작용할 것이다.

간단히 말하면, 본 발명의 돌연변이 동물에 의해 생성되는 면역글로불린을 암호하는 유전자를 검색할 수 있고 완전한 인간 가변부를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 공지의 기법에 따라 조작하여 전술한 것과 같은 다양한 유사체를 제공할 수 있다. 또한, 인간 가변부를 함유하는 면역글로불린 자체를 표준 결합 기법으로 변형시켜 면역특이적 영역을 보유하는 접합체를 제공할 수 있다.

따라서, 면역글로불린 "유사체"는 인간 특성과 그 면역특이성을 보유하는 본 발명의 항체의 일부를 함유하는 부를 의미한다. 즉, 유사체는 바람직한 특이성을 제공하기에 충분한 인간 가변부를 보유할 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 모두 돌연변이 동물에게 적절한 항원을 투여하는 것을 포함한다. 항체 자체의 생성이나 회수는 각종 방법으로 실시할 수 있다.

먼저, 가장 간단한 방법으로서, 동물에 의해 생성되어 혈류로 분비되는 폴리클로널 항체를 공지 기법으로 회수할 수 있다. 이러한 항체의 정제 형태는 물론 표준 정제 기법, 바람직하게는 단백질 A, 항면역글로불린 또는 항원 그 자체와의 친화성 크로마토그래피등으로 용이하게 제조할 수 있다. 면역화의 성공을 모니터하기 위해서는 어떤 경우든지 혈청내의 항원에 대한 항체량을 ELISA, RIA등과 같은 표준 기법을 사용하여 모니터하면 된다.

일부 용도에서는 항체의 가변부만이 필요하다. Fab', Fab 또는 F(ab")₂ 부를 생성하기 위한 적합한 시약으로 폴리클로날 항혈청을 처리하면 완전한 인간 특징을 보유하는 조성물이 생성된다. 이러한 단편들은 예컨대, 방사성동위원소와 같은 검출 시약에 면역글로불린의 면역특이적 부를 결합시키는 것을 포함하는 면역진단절차에 사용하기에 충분한 것이다.

대안적으로, 바람직한 특징을 가진 면역글로불린과 유사체는 본 발명의 방법에 사용된 돌연변이 동물에서 유래된 무한증식성 B 세포나 면역화에 대한 응답반응으로 상기 동물에 의해 제공된 재배열 유전자로부터 생성할 수 있다.

따라서, 동물로부터 항체를 직접 회수할 수 있는 대안 방법으로서, 먼저, B 세포를 일반적으로 비장, 바람직하다면 말초 혈액 림프구나 림프절로부터 채취하고, 각종 다양한 기법, 가장 일반적으로는 문헌[Kohler and Milstein Nature 245:495(1975)]에 기재된 융합 방법을 사용하여 무한증식시킬 수 있다. 그 다음 생성되는 하이브리도마(또는 무한 증식성 B 세포)를 단일 콜로니로서 배양하고 목적 특이성을 가진 항체 분비에 대하여 선별한다. 전술한 바와 같이, 선별은 또한 항체가 완전한 인간 특성을 갖고 있는지에 대한 확인을 포함한다. 예컨대, 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 하이브리도마 상청액 중의 모노클로널을 항원과 항인간 불변부에 모두 결합하고 있는 샌드위치 ELISA를 사용할 수 있다. 적절한 하이브리도마를 선택한 후, 목적 항체를 또한 통상의 기법으로 수거할 수 있다. 이것은 통상의 방법을 사용하여 무한증식성 B 세포를 시험관내에서 또는 생체내에서 배양하여 복수액을 생성하므로써 정량적으로 제조할 수 있다. 이와 같이 생성되는 모노클로널 항체 제조물의 정제는 각각의 무한증식성 콜로니가 1종류의 항체만을 분비하기 때문에 혈청을 사용하는 경우보다도 용이하다. 어떤 경우에도 배양액 중의 기타 다른 단백질로부터 항체를 분리하는 표준 정제 기법을 사용할 수 있다.

동물 유래의 무한증식성 B 세포 배양물로부터 인간 면역글로불린을 직접 얻는 대안적인 방법으로서, 무한증식성 세포를 잇따른 발현 및/또는 유전자 조작의 재배열된 중쇄 및 경쇄 좌의 공급원으로서 사용할 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사시켜 cDNA를 생성할 수 있다. 필요한 경우, 중쇄 불변부는 다른 아이소타입의 것과 교환하거나 함께 제거할 수 있다. 이 가변부는 1본쇄 F_v 영역을 암호하도록 결합시킬 수 있다. 또한 1개 이상의 표적 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 복합체에 대해 결합성을 부여하기 위해 다수의 F_v 영역을 결합시킬 수 있다. 일단 유전자 물질이 이용가능하면, 목적 표적에 결합하는 성질과 인간 특징을 모두 보유하는 전술한 바와 같은 유사체의 디자인은 간단하다.

또한, 적절한 유전자 물질을 수득하고, 필요한 경우 유사체를 암호하도록 변형시키면, 최소한 인간 중쇄와 경쇄의 가변부를 암호하는 서열을 비롯한 암호 서열을, 표준 재조합 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있는 벡터상에 함유된 발현계에 삽입시킬 수 있다. 하기 기술되는 바와 같이, 이러한 숙주 세포로서 각종 숙주 세포를 사용할 수 있는데, 효과적인 프로세싱을 위해서는 포유류 세포가 바람직하다. 이러한 목적에 유용한 통상적인 포유류 세포주로는 CHO 세포, 293 세포 또는 NSO 세포가 있다.

그 다음 항체 또는 유사체의 제조는 숙주 세포의 성장과 암호 서열의 발현에 적당한 배양 조건하에 변형된 재조합 숙주를 배양하여 수행한다. 그 다음 배양물로부터 항체를 회수한다. 이와 같이 생성되는 항체가 배지로 분비되도록 발현계가 신호 펩티드를 포함하도록 고안하는 것이 바람직하나, 또한 세포내 생산도 가능하다.

또한, 유사체를 생성하기 위해 면역글로불린 유전자의 변형된 형태를 디자인하는데에는 목적 항원에 대해 다양한 친화성을 가진 일군의 항체를 함유하는 라이브러리를 제공하는 파아지 디스플레이 기법을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 일군을 생성하기 위하여 면역화된 동물 유래의 B 세포를 무한증식시키는 것은 불필요하며, 오히려 DNA 공급원으로서 1차 B 세포를 사용할 수 있다. 예컨대, 비장 유래의 B 세포로부터 얻은 cDNA의 혼합물을 사용하여 발현 라이브러리, 예컨대 이.콜리로 형질감염된 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조한다. 이와 같이 생성되는 세포를 목적 항원에 대한 면역반응성에 대해 시험한다. 이러한 라이브러리로부터 높은 친화성의 인간 항체를 동정하는 기법은 문헌[Griffiths, A.D. et al., EMBO J(1994) 13:3245-3260; Nissim, A., et al., 동문헌, 692-698 및 Griffiths, A.D., et al., 동문헌, 12:725-734]에 기재되어 있다. 궁극적으로, 상기 항원에 대해 바람직한 크기의 결합 친화성을 생성하는 라이브러리중의 클론을 확인하고, 이러한 결합에 주요 역할을 하는 생성물을 암호하는 DNA를 검색하여 표준 재조합 발현 기법으로 조작한다. 또한, 이와 같이 조작된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 파아지 디스플레이 라이브러리를 작제하고 유사 방식으로 선별할 수 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 암호하는 cDNA는 각각 공급하거나, 함께 결합시켜 파아지 라이브러리중에서 생성되는 F_v 유사체를 형성할 수 있다.

그 다음, 파아지 라이브러리중에서 적절한 클론으로부터 회수된 유전자 물질과 항원에 대해 최고의 친화성을 가진 항체를 선별한다. 추가의 선별 작업은 분리된 본래의 항체가 가진 친화성을 증가시킬 수 있다. 그 다음 항체의 재조합 생성이나 목적 유사체를 형성하기 위한 변형법에 대해 전술한 조작법을 사용할 수 있다.

XenoMouse^TM 와 파아지 디스플레이 기법의 조합법은 종래 사용된 파아지 디스플레이 용도시보다 상당한 이점을 제공한다. 전형적으로, 파아지 디스플레이에 의해 높은 인간 항체를 생성하기 위하여, 문헌[Burton,D.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991) 88:10134-10137]에 기재된 바와 같이 인간 골수나 말초 혈액 림프구로부터 유래된 순열조합적 항체 라이브러리를 제조한다. 이와 같은 방법을 사용하여 인간 병원균에 대해 높은 친화성을 가진 항체를 감염 개체, 즉 문헌[Burton, D.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991) 88:10134-10137, Zebedee,S.L., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992) 89:3175-3179 및 Barbas III, C.F. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991) 89:10164-20168]에 기재된 바와 같은 "면역화된" 개체로부터 분리하는 것이 가능하였다. 그러나, 인간 항원과 반응성인 항체를 생성하기 위해서는 합성 라이브러리를 생성하거나(Barbas III C.F.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1991) 89:4457-4461, Crameri, A. et al., BioTechniques(1995) 88:194-196), 자가면역 환자 유래의 라이브러리를 제조하거나(Rapoport, B., et al., Immunol. Today(1995) 16:43-49, Portoland, S., et al., J.Immunol(1993) 151:2839-2851 및 Vogel,M.,et al., Eur.J.Immunol.(1994) 24:1200-1207) 또는 정상 개체 유래의 라이브러리, 즉 천연 라이브러리를 제조해야 한다 (Griffiths, A.D., et al. EMBO J.(1994) 13:3245-3260, Griffiths, A.D.,et al, EMBO J.(1993) 12:725-734, Persson, M.A.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991) 88:2432-2436, Griffiths, A.D., Curr.Opin.Immunol.(1993) 5:263-267, Hoogenboom, H.R., et al., J.Mol.Biol(1992) 227:381-388, Lerner, R.A., et al., Science(1992) 258:1313-1314, 및 Nissim A., et al., EMBO J.(1994) 13:692-698). 그러나, 일반적으로 인간 단백질에 대해 높은 친화성을 가진 항체는 이러한 방식으로 분리하는 것이 매우 어려운 것으로 입증되었다. 공지된 바와 같이, 친화성 성숙은 체세포 돌연변이이고, 즉 체세포 돌연변이는 항원에 의해 유도된다. XenoMouse의 경우에, 인간 단백질로 반복 면역화시키면 체세포 돌연변이를 유도할 수 있고, 결과적으로 높은 친화성 항체를 유도할 수 있다. 이러한 항체를 암호하는 유전자는 문헌[Marks, J.D., et al., J.Mol.Biol.(1991) 581-596]에 기재된 바와 같이 PCR로 용이하게 증폭할 수 있고, 면역특이적 항체는 표준 패닝(panning) 기법으로 분리할 수 있다[Winter, G. et al., Annu.Rev.Immunol.(1994) 12:433-55 및 Barbas III, C.F., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1991) 88:7978-7982].

상기와 같이, 변형되거나 변형되지 않은 재배열된 좌는 바람직한 숙주 세포, 예컨대 통상적으로 중국 햄스터 난소 세포중에서 작동할 수 있는 발현계를 작제하여 표준 재조합 기법으로 조작하고, 바람직한 면역글로불린이나 유사체는 표준 재조합 발현 기법을 사용하여 생성하고 통상적인 방법을 사용하여 회수 및 정제한다.

항체 생산에 대한 전술한 방법을 사용하면, 종래까지 사용이 용이하지 않았던 인간 항체에 대한 항원을 가진 면역특이적 시약을 제조할 수 있다. 전술한 방법으로 생성되는 면역글로불린과 이로부터 제조가능한 유사체는 분석, 진단, 연구 및 치료에 사용할 수 있는 신규 조성물을 제공한다. 물론 특정 용도는 제조된 면역글로불린이나 유사체에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 동일한 항원에 대해 유도된 비인간 항체에 기인하는 것과 유사한 유용성을 갖고 있을 것이다. 이러한 유용성으로는 예를 들면, 정제용 친화성 리간드, 면역분석법중의 시약, 면역접합체의 성분 및 적절한 증상에 대한 치료제로서의 용도를 포함한다.

특히, 생체내에서 사용하기 위한 치료제 또는 진단제인 경우에, 완전한 인간 특성을 가진 항체 또는 이의 유사체를 이용하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 시약은 인간 이외의 종에서 유래한 특징을 가진 항체나 유사체가 일으키는 바람직하지 않은 면역반응을 나타내지는 않는다. 항체를 "인간화"하기 위한 다른 시도들로는 완전한 인간 특성을 가진 시약을 만들 수 없다. 예를 들면, 쥐의 가변부와 인간의 불변부를 가진 키메라 항체는 쉽게 만들어지지만, 물론 가변부에 쥐의 특성을 보유하게 된다. 또한, 일반적으로 비인간 기원의 CDR들은 면역특이성을 파괴시키지 않고는 조작할 수 없기 때문에 프레임워크 영역을 형성하는 아미노산 서열을 암호하는 유전자를 조작하여 가변부를 "인간화"하는 훨씬 어려운 절차를 통해서라도 바람직한 결과를 얻을 수는 없다.

따라서, 본 발명의 방법은, 우선 완전한 인간 특성을 가진 면역특이적 영역을 함유하는, 완전한 인간 유래의 면역글로불린이나 유사체를 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있는 인간 항체 및 그 유사체에 대한 항원에는 다수의 종류가 있다. 그 예로는 다음을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

백혈구 마커, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a,b,c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27 및 이의 리간드, CD28과 이의 리간드, B7.1, B7.2, B7.3, CD29 및 이의 리간드, CD30 및 이의 리간드, CD40 및 이의 리간드 gp39, CD44, CD45 및 이소형태, Cdw52(캠패스 항원), CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA-4, LFA-1 및 TCR;

조직적합성 항원, 예컨대 MHC 제I군 또는 제II군, 루이스 Y 항원, Slex, Sley, Slea 및 Sleb;

VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, LFA-1, Mac-1, αVβ3, 및 p150, 95와 같은 인테그린을 함유하는 유착 분자;

셀렉틴, 예컨대 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과 이들의 대응 수용체 VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 및 LFA-3;

인터루킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 및 IL-15;

인터루킨 수용체, 예컨대 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R 및 IL-15R;

케모킨, 예컨대 PF4, RANTES, MIP1α, MCP1, IP-10, ENA-78, NAP-2, Groα, Groβ 및 IL-8;

성장 인자, 예컨대 TNFα, TGFβ, TSH, VEGF/VPF, PTHrP, EGF군, FGF, PDGF군, 엔도텔린, 피브로신(F_sF_-1), 라미닌 및 가스트린 방출 펩티드(GRP);

성장 인자 수용체, 예컨대 TNFαR, RGFβR, TSHR, VEGFR/VPFR, FGFR, EGFR, PTHrPR, PDGFR군, EPO-R, GCSF-R 및 다른 조혈 수용체;

인터페론 수용체, 예컨대 IFNαR, IFNβR 및 IFNrR;

Ig 및 그 수용체, 예컨대 IgE, FceRI 및 FceRII;

종양 항원, 예컨대 her2-neu, 뮤신, CEA 및 엔도시알린;

알레르기성 물질, 예컨대 집먼지진드기 항원, lol p1(목초) 항원, 및 우루시올;

바이러스 단백질, 예컨대 CMV 당단백질 B, H 및 gCIII, HIV-1 엔벨로프 당단백질, RSV 엔벨로프 당단백질, HSV 엔벨로프 당단백질, EBV 엔벨로프 당단백질, VZV 엔벨로프 당단백질, HPV 엔벨로프 당단백질, 간염류의 표면 항원;

독소, 예컨대 슈도모나스 내독소 및 오스테오폰틴/유로폰틴, 뱀독, 거미독 및 벌독;

혈액인자, 예컨대 보체 C3b, 보체 C5a, 보체 C5b-9, Rh 인자, 피브리노겐, 피브린, 및 미엘린 결합된 성장 억제제;

효소, 예컨대 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질, 막결합된 기질 메탈로프로테아제 및 글루탐산 탈탄산효소(GAD); 및

미셀형 항원, 예컨대 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, LMP1, LMP2, 호산구 주요 염기성 단백질, PTHrp, 호산구 양이온 단백질, pANCA, 아마도리 단백질, 제IV형 콜라겐, 당화된 지질, r-인터페론, A7, P-당단백질, Fas(AFO-1) 및 산화된-LDL.

특히 바람직한 면역글로불린과 유사체는 인간 IL-6, 인간 IL-8, 인간 TNFα, 인간 CD4, 인간 L-셀렉틴, 인간 PTHrp 및 인간 gp39에 대해 면역특이적인 것이다. 인간 TNFα 및 인간 IL-6와 면역반응성인 항체와 유사체는 자가면역 질환과 악액질 및 패혈증 쇼크를 치료하는데 유용하다. GP39 또는 L-셀렉틴과 면역 반응성인 항체와 유사체는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적인다. 또한, 항 gp-39는 이식편 대 숙주 질환을 치료하고, 기관 이식 거부반응을 방지하며, 사구체신염을 치료하는데 도움을 준다. L-셀렉틴에 대한 항체와 유사체는 재관류 손상과 관련된 허혈증을 치료하는데 유용하다. PTHrp에 대한 항체는 뼈 질환과 전이성 암의 치료에 유용하다. 특정 양태로서, IL-8에 대한 인간 항체는 IL-8과 관련된 질환이나 병리 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환으로는, 종양 전이, 재관류 손상, 폐수종, 천식, 심근경색과 같은 허혈성 질환, 염증성 장질환(예컨대, 크론병과 울혈성 대장염), 뇌염, 포도막염, 자가면역 질환(예컨대, 류마티스양 관절염, 쇼그렌 증후군, 맥관염), 골관절염, 통풍성 관절염, 신염, 신부전, 피부질환 (예컨데, 염증성 피부염, 건선, 맥관성 담마진 및 알레르기성 혈관염), 신포도막염, 결막염, 신경 질환 (예컨대 발작, 다발성 경화증 및 수막염), 급성 폐손상, 성인 호흡곤란증(ARDS), 패혈증 쇼크, 세균 폐렴, 백혈구 누출성 출혈과 관련된 질환, CNS 염증 질환, 다발성 기관 손상, 알콜성 간염, 항원-항체 복합체 매개 질환, 폐 염증(예컨대, 흉막염, 폐포염(aveolitis), 맥관염, 폐렴, 만성 기관지염, 기관지확장증, 낭포성 섬유증), 베세트 질환, 베게너 육아종증 및 맥관염 증후군을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

전술한 항체와 유사체를 사용하여 치료할 수 있는 일반적인 자가면역 질환으로는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스양 관절염, 건선, 쇼그렌 공피증, 복합 결합 조직 질환, 피부근염, 다발성근염, 라이터 증후군, 베세트 질환, 당뇨병 제1형, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 다발성 경화증, 중증근무력증 및 천포창을 포함한다.

치료 용도로서, 항체는 약학적 허용성 투여량 형태로 투여할 수 있다. 이 항체는 활성제를 목적하는 작용 부위에 도달시키는 모든 수단으로 투여할 수 있으며, 예컨대, 환괴로서 또는 소정 시간 동안 연속 주입하여 정맥내 투여하거나, 근육내 투여, 경피 투여, 관절내 투여, 활액낭내 투여, 초내 투여, 경구 투여, 국소 투여 또는 흡입 경로가 있다. 항체는 단독 투여량이나 연속 치료로서 투여할 수 있다.

비경구 투여시, 항체는 약학적 허용성 비경구 부형제와 함께 용액, 현탁액, 유탁액 또는 동결 건조 분말로서 조제할 수 있다. 항체가 경구 투여에 적합한 경우라면, 그 제제는 예컨대, 전분, 셀룰로스, 실리카, 각종 당류, 탄산 마그네슘 또는 인산 칼슘과 같은 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 적합한 부형제로는 당해 기술분야의 표준 서적인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최근판에 기재되어 있다.

질환 예방이나 치료시, 항체의 적절한 투여량은 특정 항체의 약동학적 특성, 그 투여 방식과 투여 경로, 수용체의 연령, 체중 및 건강, 치료할 질환의 종류, 그 질환의 정도와 과정, 치료 횟수, 동시 치료 및 목적하는 생리학적 효과와 같은 공지의 인자들에 따라 달라질 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것이다.

본 실시예에서는, 1차 면역화에 XenoMouse^TM라고 하는 마우스를 사용하고 있다. XenoMouse^TM의 상세한 설명은 상기 언급한 PCT 출원 WO 94/02602호에 기재되어 있다. 각 항원에 적합한 면역화 프로토콜은 하기 구체적인 실시예들에 기재한다. 면역화된 XenoMouse^TM(또는 무한증식성 B 세포의 상청액)의 혈청은 각 경우마다 표준 ELISA 방식을 사용하여 항원 특이적 인간 항체에 대해 역가측정하였다. 이 방법에서, 면역화에 사용된 항원은 미량역가 평판의 웰 상에 고정시켜 두었다. 이 평판을 세척하고 차단시킨 뒤 혈청(또는 상청액)을 일련의 희석물로서 첨가하여 1 내지 2시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 이것을 세정한 후, 인간 특성을 가진 결합된 항체를, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 결합된 항인간 κ쇄, μ쇄, 또는 r쇄 항체를 1시간 동안 첨가하여 검측하였다. 이것을 다시 세정한 후, 발색 시약인 o-페닐렌 디아민(OPD) 기질과 과산화 수소를 첨가한 뒤, 30분 후에 미량역가 판독기를 사용하여 492nm 에서 평판을 판독하였다.

별다른 표시가 없는 한, 항원은 평판 코팅 완충액(0.1M 탄산염 완충액, pH 9.6)을 사용하여 피복하였고; 사용된 분석 차단 완충액은 PBS중의 0.5% BSA, 0.1% Tween 20 및 0.01% 티메로살이며; 발색에 사용된 기질 완충액은 구연산 7.14g/l; 이염기성 인산 나트륨 17.96g/l이고; 발색 용액(사용 직전 즉시 제조됨)은 10ml의 기질 완충액; 10mg OPD + 5ml 과산화수소이며; 종지 용액(발색 종지에 사용됨)은 2M 황산이다. 세정 용액은 PBS 중의 0.05% Tween 20이다.

발명의 개요

본 발명은 인간을 제외한 돌연변이 동물을 목적 항원으로 면역화하는 단계를 1단계 이상 포함하는 방법에 의해 인간 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 변형된 동물은 내인성 항체는 생성하지 못하지만 그 대신에 완전한 인간 면역글로불린을 분비하는 B-세포를 생성한다. 생성된 항체는 동물로부터 직접 얻거나 동물 유래의 무한증식성 B-세포로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 인간의 가변부를 가진 면역글로불린을 암호하는 유전자를 찾아서, 이것을 발현시키므로써 항체를 직접 얻거나 항체를 변형시켜, 예컨대 1본쇄 F_v 분자와 같은 항체의 유사체를 얻을 수 있다.

따라서, 일 양태로서 본 발명은 면역 반응을 자극하는 조건하에서 특정 항원으로 인간을 제외한 동물을 면역화하는 것을 포함하는 방법으로 특정 항원에 대한 완전한 인간 면역글로불린을 생성하거나 이 면역글로불린의 유사체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 인간을 제외한 동물은 내인성의 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄를 실질적으로 생성할 수 없으나 인간의 가변부와 불변부를 가진 면역글로불린은 생성할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 생성되는 면역반응에서 이 동물은 상기 항원에 특이적이고 완전한 인간 유래의 것인 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성한다. 바람직한 특이성을 가진 인간의 면역글로불린은, 예컨대 혈청으로부터 동물에게서 직접 회수하거나 동물로부터 1차 B 세포를 얻어 무한증식시킬 수 있다. 무한증식성의 B 세포는 인간 항체원으로서 직접 사용하거나, 대안적으로 항체를 암호하는 유전자를 무한증식성의 B 세포나 면역화된 동물의 혈액이나 림프양 조직(비장, 편도선, 림프절, 골수)의 1차 B 세포로부터 제조하여 변형시키거나 변형시키지 않고 재조합 숙주내에서 발현시켜 면역글로불린이나 그 유사체를 생성할 수 있다. 또한, 면역화된 동물이 생성한 면역글로불린들을 암호하는 유전자를 사용하여 면역글로불린의 라이브러리를 만들어 목적하는 친화성을 제공하는 가변부를 선별할 수 있다. 그 다음 라이브러리중에서 선별된 바람직한 특성을 가진 클론을 필요한 가변부를 암호하는 뉴클레오티드 서열원으로서 사용하여 표준 재조합 기법으로 이러한 특성을 가진 항체 또는 유사체를 생성하는 추가 조작을 할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 동물로부터 유래된 무한증식성의 비인간 B 세포주에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 목적하는 특이성을 가진 인간 면역글로불린이나 이와 동일한 특이성을 나타내는 그 유사체를 암호하는 유전자를 함유하도록 변이된 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 방법으로 제조한 항체 또는 항체 유사체 및 이들을 생산하기 위한 재조합 재료에 관한 것이다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 특정 항원에 대해 면역특이성인 항체 및 이와 유사한 면역특이성이 있는 유사체, 뿐만 아니라 이러한 항체 생산에 유용한 재조합 재료에 관한 것이다.

실시예 1

인간 IL-6에 대한 인간 항체

8 내지 20 주령의 XenoMouse^TM 3 내지 5 마리를 연령별로 모아서, 1차 면역시에는 불완전 프로인트 보조액중에 유화시키고 이후 주입시에는 완전 프로인트 보조액중에 유화시킨 인간 IL-6 50 ㎍을 복강내로 투여하여 면역화시켰다. 2 내지 3주 간격으로 6회의 주사액을 마우스에게 투여하였다. 2차 투여후와 그 이후의 각 투여후 혈청 역가를 측정하였다. 주사한 지 6 내지 7일 후 안구후 신경총으로부터 채혈하였다. 이 혈액을 실온에서 약 2시간 동안 응괴시키고 그 다음 4℃에서 2시간 이상동안 항온처리한 후 혈청을 분리하여 수거하였다.

ELISA는 피복 완충액 중에 2 ㎍/㎖의 재조합 인간 IL-6 100 ㎕/웰을 첨가하여 전술한 바와 같이 수행하였다. 그 다음 평판을 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하거나 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 다음 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 그 다음 차단 완충액 100 ㎕/웰을 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 추가 3회 세정하였다.

그 다음, 평판에 희석된 혈청 시료(및 양성 대조군과 음성 대조군) 50 ㎕/웰을 첨가하였다. 그 다음 평판을 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 다시 3회 세정하였다.

세정한 후, 차단 완충액중에 1/2,000로 희석한 HRP에 결합된 마우스 항인간 μ쇄 항체 또는 1/2,000로 희석한 HRP에 접합된 마우스 항인간 κ쇄 항체를 100 ㎕/웰를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 평판을 3회 세정하고 OPD 기질로 10 내지 25분간 발색시켰다. 그 다음 종지 용액 50 ㎕/웰을 첨가하고 ELISA 평판 판독기로 492nm에서 그 결과를 판독하였다. 6회 주사후 XenoMouse^TM 혈청의 역가를 측정하여 제작한 희석 곡선을 도 3에 도시하였다. 도 3의 데이터는 항인간 κ 및 항인간 μ와 면역반응성인 항-IL-6의 생성이 1:1,000이상의 혈청 희석율에서도 검출된다는 것을 나타내고 있다.

실시예 2

인간 TNF α 에 대한 인간 항체

인간 IL-6 대신에 인간 재조합 TNFα(주사 1회당 5 ㎍)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역화 및 혈청 제조를 수행하였다. ELISA는 이 ELISA 평판의 초기 피복에, 피복 완충액중 1 ㎍/㎖의 재조합 인간 TNFα 100 ㎕/웰을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

6회 유도후 XenoMouse^TM 로부터 채취한 혈청의 희석 곡선을 도 4에 도시하였다. 또한, 인간 항-TNFα 결합의 상당한 역가가 관찰되었다.

XenoMouse^TM 를 1회 및 2회 면역화한 후 hr, hμ, 및 hκ에 대한 혈청 역가는 표 1에 제시되어 있다. TNF-α로 챌린지했을 때, XenoMouse^TM 는 1차 면역화시에 주요 IgM 응답 반응에서부터 2차 면역화시에 다량의 IgG 성분에 의한 면역 응답 반응으로 아이소타입을 전환시켰다.

실시예 3

인간 CD4에 대한 인간 항체

인간 CD4 항원은 다음과 같이 형질감염된 재조합 세포상에서 인간 CD4ζ를 사용하여 표면 단백질로서 제조하였다. 인간 CD4ζ는 CD3 복합체의 성숙 ζ 쇄의 CD4의 세포외 도메인, CD4의 경막 도메인, 및 잔기 31 내지 142에 상응하는 세포질 도메인으로 이루어져 있다. 문헌[Roberts et al., Blood(1994) 84:2878]에 기재된 바와 같은 인간 CD4 제타(F15 LTR)는 문헌[Finer et al., Blood(1994) 83:43]에 기재된 바와 같은 Kat 고효율 형질도입 처리를 사용하여 문헌[Callan, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90:10454]에 기재된 바와 같은 래트 호염기구 백혈병 세포주 RBL-2H3내로 도입시켰다. 간략히 요약하면, 10⁶ 세포/웰의 RBL-2H3 세포를 DMEM^low 750 ㎕ + 20% FBS(Gibco) 및 폴리브렌 16 ㎍/㎖중에서 동등 부피의 프로바이러스 상청액과 37℃, 5% CO₂ 하에 2시간 동안 배양하였다. 이 배지 1ml를 취하고, 감염 배지 750 ㎕와 레트로바이러스 상청액을 각 웰에 첨가하고 배양물을 하룻밤동안 항온배양하였다. 이 세포를 세정하고, 이 세포의 분류가 용이해질 정도의 충분한 세포가 얻어질 때까지 DMEM^low + 10% FBS중에서 증식시켰다. CD4 제타 형질도입된 RBL-2H3 세포는 FACSTAR 플러스(Becton Dickinson)를 사용하여 분류하였다. 이 세포를 마우스 항인간 CD4 PE 항체를 사용하여 인간 CD4에 대해 염색하고 최상의 2 내지 3%의 발현 세포를 선별하였다.

면역화는 1차 주사를 목의 기저부를 통해 경피적으로 투여한다는 것을 제외하고는 마우스당 1 x 10⁷ 세포를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 마우스에게 6회의 주입액을 2 내지 3주 간격으로 투여하였다. 혈청을 제조하고, 피복 완충액중 2 ㎍/㎖의 재조합 가용성 CD4를 100 ㎕/웰로 이용하여 ELISA 평판을 처음 피복하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA로 분석하였다. 6회 주사 후 XenoMouse^TM에서 얻은 혈청의 역가 측정 곡선은 도 5에 도시되어 있다. 인간 항-CD4 반응성의 역가는 1:1,000 희석율보다 높은 농도에서 나타났다.

실시예 4

인간 L-셀렉틴에 대한 인간 항체

항원은 마우스 프리-B 세포 300.19를 LAM-1 cDNA로 형질감염시키거나(LAM-1은 L-셀렉틴을 암호하는 유전자임)(Tedder, et al., J.Immunol(1990) 144:532), 또는 유사하게 형질감염된 CHO 세포로 형질감염시켜 유도된 발현율이 높은 클론인 C51 세포중에서 표면에 나타나는 단백질로서 제조하였다. 이와 같이 형질감염된 세포를 표식으로서 항-Leu-8 항체를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류기로 분류하였다.

C51 및 형질감염된 CHO 세포는 100 mm 접시중에 10% FCS와 G418 1mg/ml와 함께 글루코스 4.5 g/l을 함유하는 DME 중에서 증식시켰다. 음성 대조군 세포, 3T3-P317(몰로니 바이러스의 gag/pol/env 유전자로 형질감염됨)은 G418을 함유하지 않은 동일 배지중에서 증식시켰다.

1차 면역화는 목의 기저부를 통해 경피적으로 주사하여 실시하고; 그 다음에는 복강내 주사하여 실시하였다. 주사액당 70∼100 x 10⁶ C51 또는 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 총 5회의 주사를 2 내지 3주 간격으로 주사하였다.

혈청을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수집하여 실시예 1에 기재된 것과 유사한 프로토콜의 ELISA로 분석하였다.

ELISA를 위해, 형질감염된 세포는 96 웰 평판에서 평판배양하고 세포 단층을 세포수에 따라 1 내지 2일동안 증식시킨 뒤, 전면성장시 ELISA에 이용하였다. 이 세포를 저온의 1xPBS로 1차 세정하여 고정시키고 그 다음 고정 용액(5% 빙초산, 95% 에탄올)을 첨가하였다. 이 평판을 -25℃에서 5분동안 항온처리하고, 이것을 평판 밀봉제로 밀봉한다면 이 온도에서 보관할 수 있다.

이 평판을 실온에 꺼내어 고정 용액을 털어없애고 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지를 200 ㎕/웰로 사용하여 5회 세정하므로써 ELISA를 시작하였다.

이 웰을 여러 혈청 희석물이나 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 처리하였다. 양성 대조군 웰은 인간 L-셀렉틴에 대한 쥐의 IgG1 모노클로날 항체를 함유하였다.

이 웰을 45분동안 항온 처리하고 현미경으로 단층의 보전성을 검사하였다. 그 다음 이 웰을 실시예 1에 기재된 바와 같은 HRP가 결합된 항인간 κ쇄 항체 또는 항인간 μ쇄 항체 결합체와 항온처리하였다. 이 평판을 1% BSA/PBS로 세정하고 다시 PBS로 세정한 후 단층의 보전성을 검사하였다. 이 평판을 전술한 바와 같이 발색한 뒤, 발색 종지시킨 다음 판독하였다. XenoMouse^TM에서 얻은 혈청에 대한 결과는 도 6 및 도 7에 도시하였다; L-셀렉틴과 대조군인 3T3 세포에 대한 인간 항체를 얻었다. 그러나, 혈청 역가는 모세포인 3T3 세포에 비해 L-셀렉틴-발현 세포에서 더 높게 나타났다. 이 결과는 XenoMouse^TM가 인간 μ 중쇄 영역과 인간 κ 경쇄와 함께 L-셀렉틴에 특이적인 항체를 생성한다는 것을 나타낸다.

또한, 면역화된 XenoMouse^TM에서 수득한 항혈청을, L-셀렉틴을 발현하는 인간 호중구의 염색에 대해 시험하였다. 인간 호중구는 다음과 같이 제조하였다: 말초 혈액을 100 단위/ml의 헤파린으로 정상인 지원자로부터 채취하였다. 약 3.5ml의 혈액을 동등 부피의 One-step Polymorph Gradient(뉴욕 웨스트베리에 소재하는 어큐레이트 케미칼)상에 층적하고 20℃하에 450 x g로 30분동안 회전시켰다. 호중구 분획을 분리하고 DPBS/2% FBS로 2회 세정하였다.

그 다음 호중구를 (1) C51 세포(L-셀렉틴 발현)로 면역화된 XenoMouse^TM에서 채취한 항혈청; (2) 음성 대조군으로서 인간 gp39를 발현하는 세포로 면역화된 XenoMouse^TM에서 채취한 항혈청으로 염색시켰다.

염색한 뒤 세정한 호중구를 FACS로 분석하였다. XenoMouse^TM에서 채취한 항혈청에 대한 결과는 도 8에 도시하였다.

이 결과는 L-셀렉틴과 면역반응성인 완전한 인간 경쇄를 함유하는 면역화된 XenoMouse^TM 혈청중의 항체의 존재를 나타내고 있다. 음성 대조군인 gp39로 면역화된 마우스에서 채취한 항혈청은 인간 호중구에 대해 반응성인 항체를 함유하지 않는다.

실시예 5

인간 gp39에 대한 인간 항체

gp39(CD40에 대한 리간드)는 활성화된 인간 CD4 T 세포에서 발현된다. 본 실시예에 따른 재조합 gp39로 면역화된 XenoMouse^TM 의 혈청은 gp39에 대해 면역특이적인 완전한 인간 항체를 함유하고 있었다.

항원은 도 9에 도시한 바와 같은 포유류 발현 벡터 P1K1.HUgp39/IRES NEO내로 클로닝된 gp39 cDNA를 발현하는 CHO 세포 또는 300.19 세포의 안정한 형질감염체로 구성된다. CHO 세포는 형질감염시키기 전에, 글리신, 히포크산틴 및 티미딘이 추가 보강된 4.5g/l 글루코스, 10% PBS, 2 mM 글루타민, MEM, NEAA를 함유하는 DMEM중에 1:10으로 분할하였다. 이 세포를 칼슘 포스페이트 형질감염법을 사용하여 9 ㎍/평판10㎝(6×10⁵세포)의 gp39 벡터 및 1 ㎍/평판 10cm의 DHFR 발현 벡터 pSV2DHFR (Subranani et al., Mol Cell Biol(1981) 9:854)로 동시형질감염시켰다. 24시간 후 이 세포를, G418 0.6mg/ml를 함유하는 모배지에 1:10으로 분할하였다. gp39를 생성하는 세포는 항-gp39 항체를 사용하여 FACS로 분류하였다.

실시예 1에 기재된 바와 같이 그룹화한 마우스를 목의 기저부를 통해 경피적으로 1차 면역화하고 2차 복강내 주입액은 2 내지 3주 간격으로 투여하여 gp39를 발현하는 300.19 세포로 면역화하였다. ELISA 분석을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 혈청을 수집하였다. ELISA 절차는 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다: 4.5g/l 글루코스, 10% FCS, 4 mM 글루타민 및 MEM에 대한 비필수 아미노산(NEAA) 용액(100X)으로 이루어진 DMEM 배지를 함유하는 100mm 접시중에서 증식시킨 gp39를 발현하는 CHO 세포로 미량역가 평판을 피복하였다. ELISA 분석을 하기 이전 날에, 세포를 트립신 처리하고 웰 여과 평판에 10⁵ 세포/200 ㎕웰을 평판배양하고 37℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 양성 대조군은 마우스 항인간 gp39이고; 음성 대조군은 gp39이외의 다른 항원으로 면역화된 마우스로부터 채취한 항혈청이다. 각 분석에 시료 50 ㎕를 사용하였다. 이 분석에 있어서 나머지 단계들은 실시예 1에서와 같이 실시하였다.

CHO 세포에서 발현시킨 gp39로 면역화된 마우스로부터 4회 주사후에 얻은 혈청에 대한 희석 곡선은 도 10에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 이 혈청은 HRP에 결합된 항-인간 κ 및 항-인간 μ쇄의 항체로 검출할 수 있는 항인간 gp39 면역특이성을 함유하고 있었다.

실시예 6

파상풍 독소에 대한 인간 Mab 제조

본 실시예에서 제조한 항체는 파상풍 독소로 면역화된 제노마우스 유래의 무한증식성 B 세포로 얻은 하이브리도마에 의해 분비되었다. 면역화 프로토콜은 실시예 1에 기재된 바와 유사하나, 복강내 1차 면역화를 위해 완전 프로인트 보조제중에 유탁화시킨 50 ㎍ 파상풍 독소를 사용한 다음, 그 이후의 복강내 주사액에는 불완전 프로인트 보조제중에 함유된 항원을 사용하였다. 이 마우스에게 총 4회의 주사액을 2 내지 3주 간격으로 투여하였다.

항파상풍 독소 C(항-TTC)의 유효 혈청 역가를 얻은 후, PBS 중에 항원의 최종 면역화 투여량을, 동물을 죽이기 4일전에 투여하고, 융합에 사용하기 위해 비장을 회수하였다.

이 비장 세포를 문헌[Galfre, G. and Milstein, C. Methods in Enzymology(1981) 73:3-46]에 기재된 바와 같이 골수종 세포 P3X63-Ag8.653과 융합시켰다.

융합 후, 세포를 배양하기 위해, 글루타민, pen/strep을 보강한 HAT를 함유하는 15% FCS로 이루어진 DMEM 중에 재현탁시켜 37℃ 및 10% CO₂ 하에 처리하였다. 이 세포를 미량역가 평판에서 평판 배양하고 HAT-보강 배지중에서 2주 동안 유지시킨 다음, HAT-보강 배지로 옮겼다. 하이브리도마를 함유하는 웰로부터 얻은 하이브리도마를 수거하여 ELISA를 사용하여 1차 선별하였다.

ELISA는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였고, 항원 코팅물은 피복 완충액중에 함유된 2 ㎍/ml의 파상풍 독소 C(TTC) 단백질 100 ㎕/웰로 구성되며 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하거나 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 1차 ELISA에는 실시예 1에 기재된 바와 같이 HRP-결합된 마우스 항인간 IgM을 사용하였다. ELISA 분석에 따라 항-TTC를 분비하는 2개의 하이브리도마, 클론 D5.1 및 클론 K4.1을 사용하여 추가 분석하였다.

도 11에 도시된 바와 같이, 클론 D5.1은 HRP-결합된 항인간 μ쇄 항체 및 HRP-결합된 항인간 κ쇄 항체를 사용하여 검출가능한 완전한 인간 항-TTC를 분비한다. 이것은 도 11에서 확인된다.

D5.1에 의해 분비되는 항체는, 양성 대조군(각각 TNFα, IL-6 및 IL-8로 면역화된 제노마우스 유래의 혈청)이 양성 ELISA 결과를 나타내는 조건하에서 고정화된 항원인 TNFα, IL-6 또는 IL-8을 사용한 ELISA중에서는 면역반응하지 않았다.

모노클로날의 중쇄 및 경쇄를 암호하는 cDNA들의 완전한 뉴클레오티드 서열은 도 12 및 도 13에 도시한 바와 같이 결정되었다. 폴리A mRNA는 약 10⁶ 하이브리도마 세포로부터 분리하고 프라이머로서 랜덤 6량체를 사용하여 cDNA를 생성하는데 이용하였다. 생성물의 일부는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.

이 세포주는 인간 κ 경쇄를 제공하는 것으로 나타났다; 경쇄를 암호하는 cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머는 불변부 말단을 개시시키는데 사용된 HKP1(5'-CTCTGTGACACTCTCCTGGGAGTT-3') 및 가변 분절로부터 개시하는데 동량으로 사용된 2개의 올리고, 즉 B3(5'-GAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC-3')이다.

D5.1 유래의 항체(인간 μ 불변부를 함유함)의 중쇄를 증폭시키기 위해, 가변부로부터 개시하는데에는 MG-24VI를 사용하였고 불변부 말단으로부터 개시하는데에는 μP1(5'-TTTTCTTTGTTGCCGTTGGGGTGC-3')를 사용하였다.

클론 D5.1에 의해 분비되는 항체의 중쇄 서열을 기재하고 있는 도 12는, 중쇄가 인간 가변부 단편 VH6, 인간 다변성 영역 DN1과 인간 μ 불변부에 연결된 인간 결합 분절 JH4로 구성되어 있음을 보여주고 있다. 배선(germline) 서열 유래의 가변부내 서열에는 2개의 염기쌍 돌연변이가 나타났으며, 둘다 CDR내에 존재하였다.

2개의 추가 돌연변이는 D 분절에 있었고 D_b-J_b 결합부에서는 비배선 유래의 6개의 뉴클레오티드의 첨가가 나타났다.

마지막으로, D5.1에 의해 분비되는 항체의 경쇄를 나타내는 도 13에서는 인간 κ 가변부 B3과 인간 κ 결합부 JK3을 도시하고 있다. 배선 서열과는 9개의 염기쌍의 차이가 있고, 3개는 CDR1에 포함되어 있다.

실시예 7

PTHrp에 대한 인간 항체

XenoMouse^TM-2의 군들을, BTG가 결합된 PTHrp(1-34)[Ratcliffe et al., J. Immunol. Methods 127:109(1990)에 기재되어 있음] 또는 4개의 분지를 가진 MAP(다중 항원성 펩티드 계)로서 합성된 PTHrp(1-34)를 복강내로 투여하여 면역화시켰다. 이 항원들을 CFA(완전 프로인트 보조제)중에 유탁시키고 동물마다 25 ㎍의 투여량을 2주 간격으로 주사한 뒤, 2회 주사후 채혈하였다. 이러한 채혈로 얻은 혈청은 전술한 바와 같이 ELISA로 분석하였다.

XenoMouse^TM을 1회 면역화한 후 얻은 hr, hμ 및 hκ의 혈청 역가는 표 2에 제시되어 있다. PTHrp로 면역화했을 때, XenoMouse^TM은 1차 채혈시 7마리의 마우스중 5마리에서 낮은 혈청 역가를 나타냈으나, PTHrp-MAP로 면역화했을 때에는 1차 채혈시 7마리의 마우스중 7마리에서 높은 혈청 역가를 나타냈다.

실시예 8

인간 IL-8에 대한 인간 항체

면역원으로서 인간 재조합 IL-8을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역화 및 혈청 제조를 실시하였다.

또한, 피복 완충액중에 0.5 mg/ml의 재조합 인간 IL-8을 100 ㎕/웰 사용하여 ELISA 평판을 1차 피복한다는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 똑같이 회수한 혈청에 대해 ELISA 분석을 수행하였다. 6회 주사후 XenoMouse^TM에서 얻은 여러 혈청 희석물에 대해 얻은 결과는 도 14에 도시하였다.

또한, 인간 항-IL-8 결합성은 1:1,000 희석율에서 나타나는 것보다 더 높은 농도를 가진 혈청 희석율에서 나타났다.

실시예 9

인간 IL-8에 대한 고친화성 인간 모노클로널 항체의 제조

면역화 및 하이브리도마 생성에 8 내지 10주령의 4 내지 6마리의 XenoMouse^TM 군을 사용하였다. 이 XenoMouse^TM은 1차 면역시에 완전 프로인트 보조액(CFA, 시그마)중에 유탁시킨 인간 재조합-IL-8(미국 캘리포니아에 소재하는 바이오소스 인터내쇼날) 25 ㎍을 복강내 투여하여 면역화시켰다. 그 이후의 주사시에는 모두 불완전 프로인트 보조액(IFA, 시그마)중에 함유된 항원을 사용하였다. 하이브리도마를 생성하기 위한 비장 공여체로서 사용한 동물에게는 융합하기 4일 전에 인산염 완충 식염수(PBS)중 최종 항원 투여량을 제공하였다. 면역화된 XenoMouse^TM의 혈청 역가는 항원의 2차 투여량을 투여한 후 1차 분석하고, 그 후 매 항원 투여시마다 분석하였다. 시험 채혈은 주사 후 6 내지 7일 정도에 안구 후 신경총으로부터 채혈하여 수행하였다. 혈액을 실온에서 약 2시간 동안 응괴시킨 다음 4℃에서 2시간 이상동안 항온처리한 뒤 혈청을 분리 수거하였다.

하이브리도마의 생성

항원으로 미리 면역화시킨 XenoMouse^TM에서 얻은 비장 세포를 문헌[Galfre G, et al., Methods in Enzymology 73, 3-46(1981)]에 기재된 바와 같이 bcl-2로 형질감염시킨 비분비형 NSO 골수종 세포(NSO-bcl2)와 융합시켰다. 간략히 설명하면, 세정된 비장 세포와 골수종 세포를 5:1의 비율로 혼합하고 이들을 800 x g로 원심분리하여 부드럽게 펠릿화하여 융합을 수행하였다. 상청액을 완전히 제거한 후 세포에 50% PEG/DMSO(폴리에틸렌 글리콜 MW 1500, 10% DMSO, 시그마)를 1분 이상동안 첨가하여 처리한 후, 이 혼합물을 추가 1분동안 항온처리하고, 그 다음 2분에 걸쳐 DMEM 2ml로 점차로 희석한 뒤, 3분에 걸쳐 DMEM 8ml로 추가 희석하였다. 이 공정은 지속적인 완만한 교반하에 37℃에서 수행하였다. 융합 후, HAT를 함유하고 L-글루타민, pen/strep으로 보강된 15% FCS로 이루어진 DMEM 중에 세포를 재현탁시켜 37℃ 및 공기중의 10% CO₂하에 배양하였다. 세포를 평면 바닥의 96웰 미량역가 평판에서 평판배양하였다. 이 배양물은 HT 보강 배지로 옮기기 전에 2주 동안 HAT 보강 배지중에서 유지시켰다. 이 배양물을 하이브리드 세포 성장에 대해 규칙적으로 조사하고, 하이브리도마를 함유하는 웰로부터 수거한 상청액은 전술한 바와 같은 항원 특이적인 ELISA로 인간 μ, 인간 감마 2 및 인간 카파쇄의 존재에 대해 1차 선별 분석하였다. 양성 배양물은 48웰의 평판으로 옮기고 전면 성장하면 24웰의 평판으로 옮겼다. 그 상청액을 인간 μ, 인간 r2 및 인간 κ 쇄의 존재에 대해 항원 특이적인 ELISA 로 시험하였다.

표 3에 도시한 바와 같이, 인간 IL-8에 대해 특이성을 가진 완전한 인간 모노클로널 항체를 분비하는 여러 하이브리도마는 대표적인 융합체들중에서 생성되었다. 이러한 모든 인간 모노클로널 항체들에서 인간 감마-2 중쇄는 인간 카파 경쇄와 회합되어 있다.

XenoMouse ^TM 하이브리도마의 동력학 상수 평가

이들 항체들의 동력학 매개변수, 구체적으로 항체들의 개시 속도(on rate) 및 중지 속도(off rate)와 해리 상수(KD)를 측정하기 위해, BIAcore 기구(파마시아)를 사용하여 분석하였다. BIAcore 기구는 항원-피복된 골드 칩에 대한 항체의 결합을 측정하기 위해 플라스몬 공명을 이용한다.

BIAcore 시약과 기구 사용:

BIAcore 기구, CM5 센서 칩, 계면활성제 P20 및 N-히드록시숙신이미드(NHS), N-에틸-N'-(3-디에틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 에탄올아민을 함유하는 아민 결합 키트는 파마시아 바이오센서로부터 구입하였다. 센서 표면에 대한 인간 재조합 IL-8의 고정화는 표면에 고정된 저농도의 항원 밀도에서 제조업자가 개략한 일반적 절차에 따라 수행하였다. 간략히 요약하면, 기구를 HEPES 완충액(HBS; 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)으로 세정 및 평형화한 후, 표면을 활성화시키고 이어서 결합성과 동력학을 연구하기 위해 IL-8을 고정시켰다. 센서 표면은 활성화용 표면을 따라 10 ㎕/분로 주입되는 동등 부피의 NHS(0.1M)와 EDC(0.1M)의 혼합물 5 ㎕를 사용하여 활성화시키고, 그 다음 활성화된 표면을 따라 5 mM 말리에이트 완충액, pH 6.0중 12 ㎍/ml의 리간드(인간 재조합 IL-8) 5 ㎕를 주입하고, 마지막으로 결합되지 않은 활성 부위는 1M 에탄올아민 35 ㎕를 주사하여 차단시켰다. 비공유적으로 결합된 리간드를 제거하기 위해 표면에 0.1M HCl 5 ㎕를 주입하여 표면을 세정하였다. 모든 고정화 절차는 10 ㎕/분의 HBS 연속류로 수행하였다. 따라서, 약 100 공명 단위(RU)의 리간드(별도의 실험에서 82 및 139 RU)가 센서쉽(sensorship)상에 고정되었다(제조업자에 따르면, 1,000 RU는 고정화된 단백질 약 1ng/㎟에 상응한다).

이러한 리간드 피복된 표면을 사용하여 리간드에 대한 특이적인 결합과 동력학 연구를 위해 하이브리도마 상청액을 분석하였다. 이러한 센서쉽중에서 리간드로부터 피분석물을 해리시키기 위한 최상의 재생 조건은 수회의 결합과 재생 사이클 후에도 상당한 결합 손실이 관찰되지 않는 100 mM HCl 10 ㎕를 주사하는 것이었다.

IL-8에 특이적인 완전한 인간 모노클로널 항체의 해리 동력학, 결합 동력학 및 겉보기 친화도 상수의 측정

센서 표면상에 반응물중의 하나가 고정되어 있는 BIAcore를 사용한 동력학 측정의 분석은 문헌[Karlsson et al. "Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interaction with a new biosensor based analytical system." J.Immunol.Methods(19910 145, 229)]에 기재되어 있고 제조업자가 제안한 방법에 따라 수행하였다. 간략히 요약하면, 2개의 분자 A와 B간의 단일 부위 상호작용은 다음과 같은 수학식 1로 나타낸다.

d[AB]/dt = ka[A][B] - kd[AB]

이 식중에서 B는 표면에 고정된 것이고, A는 일정 농도 C로 주사된다. 반응은 복합체[AB]의 농도의 척도이며, 모든 농도는 다음과 같은 수학식 2 에서 BIAcore의 응답 반응 단위(RU)로서 표기할 수 있다:

dR/dt - kaC(Rmax - R) - kdR

이 때, dR/dt는 시그널의 변화 동력학이고 C는 분석물의 농도이며, R_max는 최대 분석물 결합력(RU)이고, R은 시간 t에서의 시그널(RU)이다. 이 분석법에서 ka 및 kd의 값은 센서의 표면에 고정된 리간드의 농도와는 무관하다. 해리 동력학(kd)와 결합 동력학(ka)는 제조업자 BIA 평가 기준 2.1에 제공된 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 해리 동력학 상수는 고정화된 IL-8을 함유하는 표면상에 하이브리도마 상청액의 주사를 완료한 후, 해리 단계가 45 ㎕/분의 일정한 완충액 유속에서 10분동안 지속되었는 해리 단계동안 측정한다. 결합 단계는 45 ㎕/분의 유속으로 1.25분 이상동안 지속되었고, 이 데이터를 이전에 측정된 kd값을 사용하는 모델에 적용하였다. 다른 농도의 고정화 리간드를 가진 2개 이상의 표면을 사용하여 여러 농도의 항IL-8 하이브리도마 상청액을 결합성에 대해 시험하고 동력학 데이터를 분석하였다. 이러한 2개의 표면상에서 측정한 동력학 상수는 표 4에 나타내었다. 친화도는 7 x 10^-11 내지 2 x 10^-9 M 범위로 매우 다양한 것으로 측정되었다. 이것은 정상 마우스에서 유래된 쥐의 모노클로널 항체의 친화도와 상이한 것으로 바람직한 것이다.

인간 호중구의 분리 방법과 항체 활성 분석법

IL-8의 기본적인 생체내 기능은 호중구를 유인하여 활성화시키는 것이다. 호중구는 그 표면상에 IL-8에 대한 A 수용체 및 B 수용체라고 하는 2개의 독특한 수용체를 발현한다. 완전한 인간 항체가 IL-8의 활성을 중화시킬 수 있는 지를 측정하기 위해, 2가지 다른 시험관내 분석법을 인간 호중구를 사용하여 수행하였다. 제1 분석법으로서, 호중구 IL-8 수용체에 대한 방사능표지된 IL-8의 결합을 차단하는 항체의 성질을 시험하였다. 제2 분석법으로서, IL-8-유도된 호중구 반응을 차단하는 성질, 즉 호중구 표면에 대한 인테그린 Mac-1의 상승조절에 대해 시험하였다. Mac-1은 2개의 폴리펩티드쇄, CD11b 및 CD18로 구성되어 있다. 그 검출을 위해, 일반적으로 항-CD11b 항체를 사용한다.

호중구 분리:

새로 채혈한 혈액이나 연층(buffy coat)로부터 인간 호중구를 분리한다. 인간 혈액은 정맥천자하여 EDTA를 함유하는 멸균관에 수집한다. 연층은 스탠포드 블러드 뱅크에서 입수한다. 이것은 항응고된 혈액(400ml 까지)을 플라스틱 백중에서 20℃하에 2600 x g로 10분동안 브레이크 없이 원심분리하므로써 제조한다. 이 백으로부터 혈장 상청액을 흡출해내고 연층, 즉 상부 세포층(40∼50 ml/백)을 수집한다. 연층(40∼50 ml/백) 1 단위를 Ca²⁺, Mg²⁺를 제거한 PBS로 최종 부피가 120ml가 되게 희석하였다. 혈액이나 희석된 연층 30ml를 Ficoll-Paque Plus(파마시아 바이오테크) 20ml 층 상부에서 50ml 원심분리 관내로 옮긴다. 이 관을 20℃하에 500 x g로 20분동안 브레이크 없이 원심분리한다. 상청액, 계면에서의 단핵 세포 및 펠렛 위의 층을 조심스럽게 수거한다. 단핵세포를 완전하게 제거하기 위해, 호중구 및 적혈구를 함유하는 세포 펠릿을 PBS 5ml로 재현탁하고 깨끗한 50ml 관으로 이전한다. 이 세포를 Ca²⁺, Mg²⁺를 제거한 PBS로 세정한다(4℃에서 300 x g로 5분동안). 그 다음 적혈구를 염화암모늄으로 용해시킨다. 이 세포를 155 mM NH₄Cl과 10 nM EDTA, pH 7.2 내지 7.4를 함유하는 빙냉 용액 40ml 중에 재현탁시킨다. 이 관을 때로 혼합하면서 10분 동안 얼음위에 방치하고 그 다음 4℃하에 300 x g로 5분동안 원심분리하였다. 펠릿을 PBS중에 재현탁하고 1회 세정한다(4℃ 하에 300 x g에서 5분). 적혈구 용해가 불안전한 것으로 나타나면 염화 암모늄으로의 처리를 반복한다. 호중구를 다시 세정하고 마지막으로 분석배지(10% 태내 송아지 혈청, 2 mM L-글루타민, 5 x 10^-5 2-머캅토에탄올, 1 x 비필수 아미노산, 1 mM 소듐 피루베이트 및 10 mM Hepes가 보강된 RPMI-1640)중에 3 x 10⁷ 세포/ml의 밀도로 현탁시키거나 또는 결합 완충액(0.1% 소혈청 알부민과 0.02% NaN₃를 함유하는 PBS)중에 6 x 10⁶ 세포/ml의 밀도로 현탁시킨다.

IL-8 수용체 결합 분석법:

다중선별 필터 판(96-웰, 밀리포어, MADV N6550)을 0.1% 소혈청 알부민과 0.02% NaN₃을 함유하는 PBS 결합 완충액으로 25℃에서 2시간 동안 예비처리하였다. PBS 결합 완충액을 구성하는 다양한 농도의 항체와 4 x 10⁵ 호중구, 0.23 nM [¹²⁵I]-인간-IL-8(아머샴, IM-249)을 함유하는 최종 150 ㎕의 용액을 각 웰에 첨가하고 이 평판을 4℃에서 90분동안 항온처리하였다. 이 세포를 빙냉 PBS 200 ㎕로 5회 세정한뒤, 흡입 제거하였다. 필터를 공기건조하고, 신틸레이션액 3.5ml를 첨가한 뒤(Beckman Ready Safe), 베크만 LS6000IC 계수기를 사용하여 필터를 분석하였다. 얻은 데이터는 [I¹²⁵]-IL-8 특이적 결합율%로 나타내며, 이 값은 (항체 존재시의 cpm / PBS 결합 완충액 단독 존재시의 cpm) x 100으로 계산한다(도15). 시험된 모두 6개의 인간 항-IL-8 모노클로널들은 인간 호중구에 대한 IL-8의 결합을 차단하였다.

호중구 CD11b(Mac-1) 발현 분석법:

10 nM의 최종 농도에서 만든 인간 IL-8을 다양한 농도의 모노클로널 항체와 4℃에서 30분간, 그리고 37℃에서 추가 30분동안 예비항온처리하였다. 호중구(4 x 10⁵/웰)를 항체의 존재 또는 부재하에 4℃에서 90분동안 IL-8에 노출시키고, PE-결합된 마우스-항-인간 CD11b(Becton Dickinson)과 4℃에서 45분동안 항온처리하였다. 세포를 2% 태아 송아지 혈청을 함유하는 빙냉 PBS로 세정하였다. Becton Dickinson FACscan 세포 분석기로 형광성을 측정하였다. R&D 시스템, 인코오포레이티드에서 입수한 인간 CD11b에 대한 마우스 모노클로널 항체는 양성 대조군으로서 사용하고, 정제한 골수종 인간 IgG2(Calbiochem)는 음성대조군으로 실험에 사용하였다. 호중구에 대한 CD11b의 발현량을 측정하여 평균 형광성 채널로서 나타내었다. 음성 대조군 항체에서 유도된 평균 형광성 채널은 실험 시료의 값에서 뺀 값이다.

억제율% = [(IL-8 단독 존재하의 평균 형광성 - 항체 존재하의 평균 형광성) / (IL-8 단독 존재하의 평균 형광성) - (인간 IgG2 존재하의 평균 형광성)] x 100

표 5에 도시한 바와 같이, 6가지 항체중 5가지는 CD11b의 상승조절을 어느 정도로 차단하였고, 그 5가지중 3가지 항체는 완전한 차단을 산출하였다.

CD11b 발현의 기준치는 670(평균 형광성)인 반면 10 nM의 인간 IL-8의 존재하에 CD11b의 발현은 771이다.

항-hIL-8 하이브리도마 유래의 면역글로불린 전사체의 서열 분석

인간 V_H 및 인간 V _κ 계 특이적 프라이머(Marks et al. 1991; Euro J. Immunol 21; 985-991) 및 인간 감마 2 불변부(MG-40d; 5'GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGACTGT-3') 또는 인간 카파 불변부(HKP2; Green et al 1994; Nature Genetics 7:13-21)에 특이적인 프라이머를 사용하여 하이브리도마 D1.1, K2.2, K4.2 및 K4.3으로부터 제조된 RNA의 RT-PCR 반응에서 생성된 PCR 단편들의 직접적인 서열결정으로 모든 서열을 분석하였다. 도 16A 내지 16H는 4개의 클론의 양 가닥을 서열결정하고 분석하여 완전한 서열을 만든 것이다. 모든 서열의 분석은 문헌[Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK]에 기재된 "V BASE sequence directory"와 정렬 비교하여 분석하였다. 가변부와 결합부는 괄호 [ ]로 표시하였다. "N"을 함유하는 뉴클레오티드는 생성된 서열이 불확실함을 나타내는 것이다.

V-염기 데이터베이스에서 찾은 서열과 정렬하여 서열을 관찰해 볼 때, 하이브리도마 D1.1 유래의 중쇄 전사체는 인간 V_H4-21(DP-63) 가변부(배선 서열과 비교할 때 7개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 21-10rc D 분절, 인간 J_H3 결합 영역과 인간 감마 2 불변부로 구성된다는 것을 발견했다. 도 16A를 참조하라.

하이브리도마 D1.1 유래의 카파 경쇄 전사체는 Vκ08/018과 상동성을 가진 인간 카파 가변부 (DPK1)(배선 서열과 비교해 볼 때 16개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 Jκ3 결합 영역 및 인간 카파 불변부로 구성된다. 도 16B를 참조하라.

V-염기 데이터베이스에서 찾은 서열과 정렬하여 서열을 관찰해 볼 때, 하이브리도마 K2.2 유래의 중쇄 전사체는 인간 V_H3-30 가변부(배선 서열과 비교할 때 3개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 IR3rc D 분절, 인간 J_H4 결합 영역과 인간 감마 2 불변부로 구성된다. 도 16C를 참조하라.

하이브리도마 K2.2 유래의 카파 경쇄 전사체는 VκIV와 상동성을 가진 인간 카파 가변부 (B3; DPK24)(배선 서열과 비교해 볼 때 9개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 Jκ3 결합 영역 및 인간 카파 불변부를 갖고 있다. 도 16D를 참조하라.

V-염기 데이터베이스에서 찾은 서열과 정렬하여 서열을 관찰해 볼 때, 하이브리도마 K4.2 유래의 중쇄 전사체는 인간 V_H4-34 가변부(배선 서열과 비교할 때 8개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 K1 D 분절, 인간 J_H4 결합 영역과 인간 감마 2 불변부로 구성된다. 도 16E를 참조하라.

하이브리도마 K4.2 유래의 카파 경쇄 전사체는 Vκ08/018와 상동성을 가진 인간 카파 가변부 (DPK1)(배선 서열과 비교해 볼 때 6개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 Jκ4 결합 영역 및 인간 카파 불변부로 구성된다. 도 16F를 참조하라.

V-염기 데이터베이스에서 찾은 서열과 정렬하여 서열을 관찰해 볼 때, 하이브리도마 K4.3 유래의 중쇄 전사체는 인간 V_H5-51(DP-73) 가변부, 인간 M5-a/M5-b D 분절, 인간 J_H4 결합 영역과 인간 감마 2 불변부로 구성된다. 도 16G를 참조하라.

하이브리도마 K4.3 유래의 카파 경쇄 전사체는 Vκ02/012와 상동성을 가진 인간 카파 가변부 (DPK9)(배선 서열과 비교해 볼 때 9개의 점 돌연변이가 관찰됨), 인간 Jκ4 결합 영역 및 인간 카파 불변부를 갖고 있다. 도 16H를 참조하라.

본원에 인용된 모든 공보 및 특허 명세서는 그 개개의 공보와 출원명세서가 각각 참고적으로 포함되는 것으로 나타냈지만 모두 본원의 참고문헌에 속하는 것이다.

상기 본 발명은 이해를 명료하게 하기 위한 목적으로 양태와 실시예로서 일부 상세하게 기재하였지만, 첨부되는 청구의 범위의 취지와 영역을 벗어나지 않는 한 어떤 변형과 수정도 본 발명의 교시면에서 당업자에 의해 가능하다는 것은 자명한 것이다.

생물 기탁

에스. 세레비지에에 함유된 yH1C는 1996년 4월 26일에 미국 매사츄세츠 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소("ATCC")에 기탁되었다. 이 YAC의 기탁은 단지 예시적인 용도이며, 이러한 기탁은 본 발명의 주요 구성의 사용가능성에 필수적인 사항이라는 본 출원인의 인정으로 이해되어서는 안된다.

이러한 조처가 가능하고 지정국법하에서 법적으로 허용되는 한 모든 지정국에서는 기탁 미생물 시료를 관련 특허 법규, 예컨대, EPC 규칙 28(4), 영국 특허 규칙 1982 조항 17(3), 오스트레일리아 법규 3.25(3) 및 다른 지정국에서 일부 변경된 유사 조항에 따라서 독자적인 전문인에게 요구에 의해서만 입수용이하다.

Claims (16)

1. IL-8에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서,

   중쇄는 도 16A, 도 16C, 도 16E, 도 16G에 제시된 서열과 도 16A, 도 16C, 도 16E 또는 도 16G에 제시된 서열의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 도 16A, 도 16C, 도 16E 또는 도 16G에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하고,

   경쇄는 도 16B, 도 16D, 도 16F, 도 16H에 제시된 서열과 도 16B, 도 16D, 도 16F 또는 도 16H에 제시된 서열의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 도 16B, 도 16D, 도 16F 또는 도 16H에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것인 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
2. (a) 중쇄가 도 16A에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하고 경쇄가 도 16B에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분:

   (b) 중쇄가 도 16C에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하고 경쇄가 도 16D에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분:

   (c) 중쇄가 도 16E에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하고 경쇄가 도 16F에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분: 및

   (d) 중쇄가 도 16G에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하고 경쇄가 도 16H에 제시된 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분

   으로 이루어진 군에서 선택된, IL-8에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 호중구에 대한 IL-8의 결합을 감소시키는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
4. 제3항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 부분은 호중구 상에서 IL-8 유도된 MAC-1(CD11b) 발현을 감소시키는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
5. 제3항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 부분은 K_D 2 x 10^-9 M으로 IL-8과 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
6. 제3항에 있어서, IL-8은 인간 IL-8인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
7. IL-8을 제3항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하는, IL-8의 호중구에의 결합을 감소시키는 방법.
8. IL-8에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 중쇄는 4-21, 4-34, 3-30 및 5-51로 구성된 군에서 선택된 인간 V_H 유전자로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 인간 V _K 02/012 유전자로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
9. 제8항에 있어서, V_H 유전자는 5-51인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
10. 제9항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열은 인간 M5-a/M5-b D 유전자 및 인간 J_H4 유전자로부터 유도된 아미노산 서열을 더 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
11. 제1항, 제2항, 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 항원 결합 부분을 생성하는 세포.
12. 제11항에 있어서, 상기 세포는 IL-8로 면역화된 인간 이외의 포유류로부터 유도된 것이며, 상기 포유류는 관심 항원에 대한 완전 인간 항체를 생성할 수 있는 것인 세포.
13. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 cDNA를 발현하는 것인 세포.
14. 제11항의 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 항원 결합 부분을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항, 제2항, 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생성하는 방법.
15. 도 16A 내지 도 16H에 제시된 서열 중 어느 하나의 서열을 가지는 핵산 분자.
16. 제15항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.

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