BRPI0818674B1

BRPI0818674B1 - Métodos para produção de um anticorpo inteiro ou de um fragmento do mesmo e para preparação de fármacos, bem como vetor recombinante

Info

Publication number: BRPI0818674B1
Application number: BRPI0818674-0A
Authority: BR
Inventors: Yoshiki Yamada; Tatsuya Kiyasu; Kazuyuki Tabata; Akihiro Kuzumaki; Mai Yamashiro
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2007-10-15
Filing date: 2008-10-14
Publication date: 2023-01-17
Also published as: ES2499391T5; EP2202307A1; US20100291627A1; JP2017079794A; US9683027B2; SI2202307T2; JP5788830B2; JP4976502B2; CN106244651A; EP2202307B1; TWI463010B; WO2009051108A1; AU2008312937B2; CN103540632A; US20170275351A1; KR20100074184A; IL205051A; JP2012143246A; JPWO2009051108A1; SI2202307T1

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a um método de produção de um anticorpo recombinante, de maneira eficiente e com baixo custo. É descrito um método de produção de um anticorpo, ou um fragmento do mesmo, compreendendo permitir que uma célula produza o anticorpo ou o fragmento, no qual a célula contém um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo do que o número de cópias contida na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. A presente invenção também fornece um vetor recombinante compreendendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeira pesada, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo; e um transformante.

Description

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um método de produção de um anticorpo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Na produção de anticorpos recombinantes úteis como fármacos, por uso de tecnologia recombinante genética, o uso de células animais permite a modificação pós-traducional complicada e dobramento, que células procarióticas são incapazes de realizar. Portanto, células animais têm sido frequentemente usadas como células hospedeiras para produção de anticorpos recombinantes.

Recentemente, um grande número de fármacos biológicos, tais como anticorpos e proteínas fisiologicamente ativas, foram produzidos. Em particular, em preparações de anticorpo, em que doses são usualmente da ordem do miligrama (mg) por administração, quantidades consideráveis de anticorpos são necessárias como ingredientes ativos. Tecnologias que permitam a produção eficiente de anticorpos recombinantes por células animais conduzirão à redução de custos de preparações de anticorpos e prometem o suprimento estável aos pacientes. Portanto, métodos mais eficientes de produção de anticorpos re- combinantes são desejados.

Na preparação de uma célula hospedeira para a produção de um anticorpo recombinante, uma cópia de um DNA que codifica a cadeia pesada do anticorpo e uma cópia de um DNA que codifica a cadeia curta do anticorpo são usualmente transferidas para a célula hospedeira (documentos de Não- Patente N°s 1 e 2). [Documento de Não-Patente N° 1] Reff ME, Carner K, Chambers KS, Chinn PC, Leonard JE, Raab R et al. Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 15 de janeiro de

O'Connor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, et al. Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Res. 15 de outubro de 1997; 57(20):4593-9.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA PARA SOLUÇÃO PELA INVENÇÃO

Por outro lado, não se sabe, até agora, se uma célula de expressão estável transformada contribui ou não para o aperfeiçoamento da produção de um anticorpo recombinante desejado, quando uma cópia de um DNA que codifica a cadeia pesada do anticorpo e duas ou mais cópias de um DNA que codificam a cadeia curta do anticorpo tiverem sido transferidos para ela.

É um objetivo da presente invenção fornecer um método para produção elevada de um anticorpo.

MEIOS PARA SOLUCIONAR Q PROBLEMA

Como um resultado de pesquisas intensivas e extensivas em direção à solução, os presentes inventores tornaram possível aumentar os rendimentos em anticorpos por uso de uma célula contendo um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta de um anticorpo de interesse, que o número de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada do anticorpo que ela contenha. Portanto, a presente invenção foi alcançada.

A presente invenção refere-se ao seguinte. (1) Um método de produção de um anticorpo ou de um fragmento do mesmo, compreendendo permitir que uma célula produza o anticorpo ou o fragmento, em que a célula contém um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo do que o número de cópias que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. (2) O método, de acordo com (1) acima, em que a célula contendo um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a ca deia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo do que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento dela, do anticorpo é uma célula, na qual tenha sido introduzido um vetor compreendendo uma cópia de um DNA que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento dela, do anticorpo e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento dela, do anticorpo. (3) O método, de acordo com (2) acima, em que a célula é uma célula animal. (4) O método, de acordo com (3) acima, em que a célula é célula de ovário de hamster chinês. (5) O método, de acordo com qualquer um de (1) a (4) acima, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. (6) O método, de acordo com qualquer um de (1) a (5) acima, em que o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpo receptor de anti-IL-6, anticorpo anti-IL-6, anticorpo antiglipicano-3, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-GPIIb/llla, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-Her2/neu, anticorpo anti-RSV, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD52, anticorpo anti-lgE, anticorpo anti-CD11a, anticorpo anti-VEGF e anticorpo anti-VLA4. (7) Um método de preparação de fármacos compreendendo o anticorpo, ou fragmento do mesmo, preparado pelo método de acordo com qualquer um de (1) a (6) acima. (8) Um vetor recombinante compreendendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou fragmento da mesma, do anticorpo. (9) Uma célula, na qual foi introduzido o vetor de acordo com (8) acima. (10) Uma célula cultivada contendo um numero maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo do que o número de cópias contidas na célula de um

DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. (11) Um método de produção de um anticorpo, ou um fragmento do mesmo, compreendendo permitir uma célula para produzir o anticorpo, ou fragmento do mesmo, a célula expressando a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo em rendimento mais elevado do que a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. (12) O método, de acordo com qualquer um de (1) a (7) e (11) acima, em que a célula está expressando de maneira estável o anticorpo ou o fragmento do mesmo. (13) A célula, de acordo com (9) ou (10) acima, que está expressando de maneira estável o anticorpo ou o fragmento do mesmo.

EFEITO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, tornou-se possível produzir um anticorpo recombinante desejado em baixo custo.

A presente invenção engloba os conteúdos descritos no relatório descritivo e/ou desenhos do Pedido de Patente Japonesa N° 2008-103308, com base no qual o presente pedido de patente reivindica prioridade. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra "plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L" phGC33CAG N° 1 abrigando uma cópia de unidade de expressão de cadeia curta e uma cópia de unidade de expressão de cadeia pesada por plasmídeo, e "plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L" phGC33CAG1 abrigando duas cópias de unidade de expressão de cadeia curta e uma cópia de unidade de expressão de cadeia pesada por plasmídeo.

A Figura 2 é um gráfico mostrando a produtividade do anticorpo (anticorpo glipicano-3 anti-humano humanizado) pelo(s) clone(s) de célula transferida com "plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L" e o(s) clo- ne(s) de célula transferida com "plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L".

A Figura 3 mostra "plasmídeo de expressão de 1 cópia de ca- deia L" compreendendo uma cópia da cadeia pesada de gene de anticorpo IL-6R anti-humano humanizado e uma cópia da cadeia curta do gene, e "plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L” compreendendo uma cópia da cadeia pesada e duas cópias da cadeia curta.

A Figura 4 é um gráfico mostrando a produtividade do anticorpo (anticorpo IL-6R anti-humano humanizado) pelo(s) clone(s) de célula transferida com "plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L" e o(s) clone(s) de célula transferida com "plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L". MELHOR MODO PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Aqui, nas partes que se seguem, concretizações da presente invenção serão descritas em detalhes.

A presente invenção fornece um método de produção de um anticorpo ou de um fragmento do mesmo, compreendendo permitir que uma célula produza o anticorpo ou o fragmento, sendo que a célula contém um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta do anticorpo, ou um fragmento do mesmo, do que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo.

No método da presente invenção, uma célula que contenha um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, do que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo pode ser, por exemplo, uma célula transformada, na qual tenham sido introduzidas uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo re- combinante desejado, e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo recombinante desejado, e que seja capaz de produzir o anticorpo recombinante desejado ou um fragmento do mesmo.

No método da presente invenção, o anticorpo recombinante desejado não está particularmente limitado e pode ser um anticorpo recombinante em relação a qualquer antígeno, por exemplo, anticorpo de receptor anti-IL-6, anticorpo anti-IL-6, anticorpo antiglipicano-3, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-GPIIb/llla, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-Her2/neu, anticorpo anti- RSV, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD52, anticorpo anti-lgE, anticorpo anti-CD11a, anticorpo anti-VEGF, anticorpo anti-VLA4 ou similares. O anticorpo inclui não somente anticorpos monoclonais derivados a partir de animais, tais como seres humanos, camundongos, ratos, hamsters, coelhos e macacos, mas, também, anticorpos recombinantes de genes modificados artificialmente, tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos biespecíficos ou similares. O anticorpo recombinante pode estar quimicamente modificado, por exemplo, pode estar ligado a várias moléculas, tais como polietileno glicol. A classe do anticorpo não está particularmente limitada. A classe de imunoglobulina do anticorpo não está particularmente limitada, e pode ser IgG (tal como lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4), IgA, IgD, IgE, IgM ou similares. Quando o anticorpo deve ser usado como um fármaco, IgG ou IgM são preferíveis.

Um DNA, que codifica a cadeia curta de um anticorpo e um DNA, que codifica a cadeia pesada do anticorpo podem ser preparados conforme descrito abaixo. De maneira breve, mRNA é extraído a partir um hibri- doma, célula, fago, ribossoma ou similares, que tenham um gene, que codifica o anticorpo. A partir do mRNA resultante, cDNA é preparado por transcrição reversa usando transcriptase reversa. O gene de cadeia curta ou o gene de cadeia pesada é amplificado por PCR usando o cDNA e iniciadores tendo uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene cadeia curta ou de cadeia pesada. Cada gene é obtido por ligação do produto de PCR em um plasmídeo de clonagem.

No método da presente invenção, exemplos específicos de fragmentos desejáveis de anticorpos recombinantes incluem Fab, F(ab')2 e Fv.

Um DNA, que codifica um fragmento de cadeia curta de um anticorpo, e um DNA, que codifica um fragmento de cadeia pesada do anticorpo, podem ser preparados como descrito abaixo. De maneira breve, mRNA é extraído a partir de um hibridoma, célula, fago, ribossoma ou similares, que tenham um gene que codifica o anticorpo. A partir do mRNA resultante, cD- NA é preparado por transcrição reversa usando transcriptase reversa. O gene de fragmento de cadeia curta ou o gene de fragmento de cadeia pesada é amplificado por PCR usando o cDNA e iniciadores tendo uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene de fragmento de cadeia curta ou de fragmento de cadeia pesada. Cada gene de fragmento é obtido por ligação do produto de PCR em um plasmídeo de clonagem.

Os presentes inventores constataram que o uso de uma célula transformada, na qual tenham sido introduzidas uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, aumenta o rendimento de um anticorpo recombinante desejado de maneiras definitiva e significativa, comparado às células transformadas convencionalmente usadas, nas quais tenham sido introduzidas uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, e uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia curta.

O polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia curta de uma molécula de anticorpo forma uma montagem com o suporte de BiP (proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina) e, então, se dobram para, por meio disso, alcançarem uma estrutura de anticorpo completa. Esse método de montagem é dependente do polipeptídeo de cadeia curta (Molecular Biology of the Cell, 1999, 10, 2209). Portanto, pode-se a- creditar que, por aumento da razão do número do gene de cadeia curta para, por meio disso, elevar a razão do polipeptídeo de cadeia curta, a montagem de polipeptídeos de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia curta será promovida e, como um resultado, o rendimento em anticorpo será aumentado.

Entretanto, particularmente em transformantes estáveis, que estejam expressando anticorpos recombinantes em sistemas de expressão estáveis, o nível de expressão de cadeia pesada está diminuído em relação ao nível de expressão em sistemas de expressão transientes; portanto, é sugerido que o nível de expressão de cadeia pesada é mais importante aqui (Biotechnol. Prog., 2005, 21, 122). Portanto, é completamente desconhecido como controlar a razão de níveis de expressão da cadeia pesada e da cadeia curta de um anticorpo de interesse, a fim de aumentar o rendimento em anticorpo em sistemas de expressão estáveis.

A razão do número de cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo recombinante em relação ao número de cópias de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento do mesmo, do anticorpo, pode ser de 1 ou mais, de preferência, dentro de uma faixa desde 1,1 a 5, muitíssimo de preferência, 2.

Como exemplos da célula contendo um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, do que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo, as seguintes células podem ser dadas: uma célula, na qual tenham sido introduzidos um vetor (digamos, um em número) compreendendo um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, e outros vetores (digamos, dois ou mais em número) compreendendo um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma; uma célula, na qual tenham sido introduzidos um vetor compreendendo tanto uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, quanto uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, e um ou mais outros vetores compreendendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma; ou uma célula, na qual tenha sido introduzido um vetor compreendendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma. É preferível uma célula, na qual tenha sido introduzido um vetor compreendendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma.

Quando uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, e duas ou mais cópias de um DNA, que codifi ca a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, forem usados e pelo menos uma destas cópias for codificada em um vetor separado, diferente do vetor que codifica as cópias restantes, a ordem de introdução de vetores não está particularmente limitada. Tais vetores podem ser introduzidos de maneira separada ou simultânea.

A célula, que for usada na presente invenção para expressar um anticorpo de interesse, não está particularmente limitada e qualquer célula pode ser usada; por exemplo, uma célula eucariótica, tal como célula animal, célula vegetal ou levedura, ou uma célula procariótica, tal como Escherichia coli ou Bacillus subtilis. Exemplos preferíveis incluem, mas não estão limitados a, tais células animais como célula de CHO, célula de COS, célula 3t3, célula de mieloma, célula de BHK, célula de HeLa e célula de Vero. É especialmente preferível célula de CHO. Além disso, a fim de produzir um anticorpo desejado, prefere-se que a célula seja célula dhfrde CHO ou as similares, que é adequada para introdução de um gene desejado. Por exemplo, é possível cultivar uma célula de COS ou de CHO, na qual tenha sido integrado um gene, que codifica um anticorpo desejado, por operações de engenharia genética.

A respeito de vetores, que podem ser usados no método da presente invenção, quando a célula hospedeira for E. coli, o vetor, de preferência, tem ori que permite amplificação em grande escala em E. coli (por e- xemplo, JM109, DH5α, HB101 e XL1-Blue) e marcadores seletivos para células de E. coli transformadas (por exemplo, genes de resistência a drogas capazes de selecionar transformantes com drogas, tais como ampicilina, tetraciclina, kanamicina ou cloranfenicol). Exemplos específicos de vetores incluem, mas, não estão limitados a, vetor M13, vetor pUC, pBR322, pBlues- cript e pCR-Script. Além disso, quando forem pretendidas subclonagem e excisão de cDNA, pGEM-T, pDIRECT, pT7 e os similares são também enumerados em adição aos vetores listados acima. Quando o vetor for usado para a finalidade de produção do anticorpo da presente invenção, ou de um fragmento do mesmo, vetores de expressão são particularmente úteis. Quando o anticorpo da presente invenção deve ser expresso em E. coli, pre- fere-se que o vetor de expressão tenha a característica descrita acima para permitir a amplificação em E. coli. Além disso, quando o hospedeiro for E. coli, tais como JM109, DH5α, HB101 ou XL1-Blue, prefere-se que o vetor de expressão tenha um promotor que permita expressão eficiente em E. coli, por exemplo, promotor lacZ (Ward et al, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041 a 1043) ou promotor T7. Exemplos específicos de tal vetor incluem, em adição àqueles listados acima, pGEX-5X-1 (Pharmacia), sistema QIAexpress (Qiagen) pEGFP ou pET (nesse caso, a célula hospedeira é, de preferência, BL21 que esteja expressando T7 RNA polimerase).

O vetor pode compreender uma sequência de sinal para secreção de polipeptídeo. Como para a sequência de sinal para secreção de poli- peptídeo, a sequência de sinal pelB (Lei, S. P. et al, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada quando o anticorpo a ser produzido no periplasma de E. coli. A introdução do vetor em células hospedeiras pode ser realizada pelo método de cloreto de cálcio, eletroporação, etc..

Quando a célula hospedeira não for E. coli, o vetor que pode ser usado na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão derivados de mamíferos, tais como pcDNA3 (Invitrogen), pEGF- BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p. 5322), pEF, pCDM8 e INPEP4 (Biogen-IDEC)\ vetrores de expressão derivados de células de insetos, tais como sistema de expressão de baculovírus Bac-to-BAC (GIBCO BRL) e pBacPAK8; vetores de expressão derivados de plantas, tais como pMH1 e pMN2; vetores de expressão derivados de vírus de animais, tais como pHSV, pMV e pAdexLcw; vetores de expressão derivados de retrovirus, tais como pZIpneo; vetores de expressão derivados de leveduras, tais como Pi- chia Expression Kit (Invitrogen), pNV11 e SP-Q01) e vetores de expressão derivados de B. subtilis, tais como pPL608 e pKTH50.

Quando a expressão de um anticorpo em uma célula animal (tal como célula de CHO, célula de COS ou célula de NIH3T3) for pretendida, o vetor, de preferência, tem um promotor necessário para a expressão intracelular do anticorpo; por exemplo, promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), promotor MMLV-LTR, promotor EF1a (Mizushima et aí, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), promotor CMV (Niwa et aí, Gene. (1991) 108, 193), promotor de β globina de camundongo (mBGP), etc.. Mais preferivelmente, o vetor tem genes para selecionar transformação em células (por exemplo, genes de resistência a drogas, capazes de seleção com drogas, tais como neomicina ou G418). Exemplos de vetores com tais características incluem, mas não estão limitados a, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK- CMV, pOPRSV e pOP13. Sabe-se que mRNA com polyA é estável dentro das células. Portanto, o vetor, de preferência, tem um sinal de polyA necessário para adicionar polyA a um gene de interesse, por exemplo, sinal de polyA de β globina de camundongo, sinal de polyA de hormônio de crescimento bovino, sinal de polyA de SV40, etc.

A célula da presente invenção pode estar expressando o anticorpo, ou um fragmento do mesmo, ou em um sistema de expressão transiente, ou em um sistema de expressão estável. De preferência, o anticorpo é expresso em um sistema de expressão estável.

O "sistema de expressão transiente" significa um método, no qual plasmídeos circulares são introduzidos em células pelo método de fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, etc, para a finalidade de expressão de gene. Uma vez que plasmídeos circulares são inseridos em cromossomos com baixa eficiência, o gene de interesse frequentemente permanece do lado de fora de cromossomos. Portanto, é difícil reter a expressão do gene de interesse a partir de plasmídeos circulares durante um longo tempo.

O "sistema de expressão estável" significa um método, em que plasmídeos lineares preparados por tratamento com enzimas de restrição ou similares, são introduzidos em células pelo método do fosfato de cálcio, ele-troporação, lipofecção, etc., para a finalidade de expressão de gene. Uma vez que plasmídeos lineares são com eficiência mais elevada do que plasmídeos circulares, o gene de interesse é mantido em cromossomos com eficiência mais elevada. Portanto, é possível reter a expressão desse gene durante um longo tempo. Além disso, a introdução de genes de resistência a drogas em plasmídeos permite a seleção com drogas. Portanto, torna-se possível selecionar, de maneira eficiente, aquelas células mantendo o gene de interesse em seus cromossomos. Já que células animais usadas em um sistema de expressão estável, célula de CHO, célula de NSO, célula de SP2/0 e as similares podem ser enumeradas. De preferência, é usada célula de CHO.

Além disso, quando expressão estável do gene de interesse e amplificação intracelular do número de cópias do gene forem pretendidas, um método pode ser dado, no qual é usada uma célula de CHO deficiente através de síntese de ácidos nucléicos. De maneira breve, um vetor compreendendo um gene DHFR complementando a deficiência (por exemplo, pCHOl) é introduzido na célula, seguido por amplificação do gene de interesse com metotrexato (MTX). Quando a expressão transiente de um gene de interesse for pretendida, um método pode ser dado, no qual uma célula de COS tendo um gene expressando antígeno de SV40 T em seu cromossoma é transformada com um vetor tendo uma origem de replicação para SV40 (por exemplo, pcD). Como a origem de replicação, aquelas derivadas de poliomavírus, adenovirus, papilomavírus bovino (BPV) e similares podem ser usados. Além disso, para amplificação do número de cópias do gene de interesse em sistemas de células hospedeiras, vetores de expressão podem compreender os seguintes como marcadores seletivos: gene de aminoglico- sídeo transferase (APH), gene de timidina quinase (TK), gene de xantina- guanina fosfo-ribosil transferase de E. coli (Ecogpt), gene de di-hidrofolato redutase (dhfr), etc.

A presente invenção também fornece um vetor recombinante compreendendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, e de um anticorpo e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo.

O vetor da presente invenção é útil em reter um DNA, que codifica um anticorpo recombinante de interesse, ou um fragmento do mesmo, ou que expresse o anticorpo recombinante, ou o fragmento do mesmo, em uma célula hospedeira. Por introdução na célula hospedeira de uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticor- po recombinante e duas ou mais cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo recombinante, é promovida a montagem do polipeptídeo de cadeia pesada em um anticorpo. Portanto, a produção do anticorpo recombinante de interesse, ou de um fragmento do mesmo, pela célula hospedeira pode ser aumentada.

A presente invenção também fornece uma célula hospedeira, na qual o vetor da presente invenção tenha sido introduzido. A célula hospedeira, na qual o vetor da presente invenção deva ser introduzido não está particularmente limitada. Por exemplo, E. coli ou várias células animais podem ser usadas. A célula hospedeira da presente invenção pode ser usada como um sistema de produção para preparação ou expressão do anticorpo da presente invenção, ou de um fragmento do mesmo. Como um sistema de produção para polipeptídeos, um sistema de produção in vitro ou in vivo pode ser usado. Exemplos de sistemas de produção in vitro incluem aqueles u- sando células eucarióticas e aqueles usando células procarióticas.

Quando deverem ser usadas células eucarióticas, células animais, células vegetais ou células fúngicas podem ser usadas como o hospedeiro. Exemplos específicos de células animais incluem, mas não estão limitadas a, células de mamíferos, tais como CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, mieloma, BHK (rim de hamster bebê), células de HeLa e de Vero; células de anfíbios, tais como oócito de Xenopus (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358 a 340) e células de insetos, tais como Sf9, Sf21 e Tn5. Com respeito às células de CHO, uma célula de CHO carecendo de gene DHFR (dhfr-CHO) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77, 4216 a 4220) ou célula de CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1968) 60, 1275) podem ser usadas de maneira conveniente. Quando a expressão de massa for pretendida em células animais, células de CHO são particularmente preferíveis. A introdução do vetor na célula hospedeira pode ser realizada pelo método de fosfato de cálcio, o método de DEAE dextrana, um método usando um ribossoma cati- ônico DOTAP (Boehringer Mannheim), eletroporação, lipofecção, etc..

A respeito das células vegetais, uma célula derivada de Nicotia- na tabacum é conhecida como um sistema de produção de polipeptídeo e esta pode ser cultivada como calo. A respeito das células fúngicas, leveduras, tais como Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) e fungos filamentosos, tais como Aspergillus (por exemplo, Aspergillus niger) são conhecidas.

Quando células procarióticas devem ser usadas, sistemas de produção usando células bacterianas podem ser usados. Exemplos conhecidos de tais células bacterianas incluem E. coli (por exemplo, JM109, DH5a e HB101) e B. subtilis.

Por transformação dessas células com um gene de interesse e cultivo dos transformantes resultantes in vitro, um polipeptídeo codificado pelo gene de interesse pode ser obtido. Por exemplo, como um caldo de cultura para células animais, podem ser usados DMEM, MEM, RPMI1640 ou IMDM. Durante essa cultura, um suplemente de soro, tal como soro de bezerro fetal (FCS) pode ser usado conjuntamente. Alternativamente, a cultura pode ser cultura livre de soro. O pH durante a cultura é, de preferência, de cerca de 6 a 8. Usualmente, a cultura é realizada em cerca de 30 a 40°C, durante cerca de 15 a 200 horas. O meio de cultura pode ser trocado, aera- do ou agitado, se necessário.

Por cultivo de uma célula contendo um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo de interesse do que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento dela, do anticorpo, é possível permitir a esta célula expressar o anticorpo, ou um fragmento do mesmo, do anticorpo, em rendimento mais elevado do que em métodos convencionais. Para cultivar a célula descrita acima, meios u- sados em culturas de células convencionais (de preferência, células animais) podem ser usados. Usualmente, esses meios contêm aminoácidos, vitaminas, fatores de lipídeo, fontes de energia, reguladores osmóticos, fontes de ferro e tampões de pH. As quantidades desses componentes no meio de cultura são usualmente de 0,05 a 1.500 mg/L para aminoácidos, 0,001 a 10 mg/L para vitaminas, 0 a 200 mg/L para fatores de lipídeo, 1 a 20 g/L para fontes de energia, 0,1 a 10.000 mg/L para reguladores osmóticos, 0,1 a 500 mg/L para fontes de ferro, 1 a 10.000 mg/L para tampões de pH, 0,00001 a 200 mg/L para elementos de metal traço, 0 a 5.000 mg/L para tensoativos, 0,05 a 10.000 μg/L para cofatores de crescimento e 0,001 a 50 mg/L para nucleosídeos. Entretanto, suas quantidades não estão limitadas a essas faixas e podem ser determinadas de maneira apropriada, dependendo de fatores tais, como o tipo da célula a ser cultivada e do tipo do anticorpo desejado, ou de um fragmento dele.

Em adição aos componentes listados acima, elementos de metal traço, tensoativos, cofatores de crescimento e nucleosídeos, também podem ser adicionados ao meio.

De maneira específica, meios de cultura contendo os seguintes componentes podem ser adicionados: aminoácidos, tais como L-alanina, L- arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L- metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L- triptofano, L-tirosina, e L-valina, de preferência, L-alanina, L-arginina, L- asparagina, ácido L-aspártico, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenil-alanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina; vitaminas, tais como i-inositol, biotina, ácido fólico, ácido lipóico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p-aminobenzóico, pantotenato de cálcio, cloridrato de piri- doxal, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12, e ácido ascórbico, de preferência, biotina, ácido fólico, ácido lipóico, amida de ácido nicotínico, pantotenato de cálcio, cloridrato de piridoxal, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12, e ácido ascórbico; fatores de lipídeo, tais como cloreto de colina, tartarato de colina, ácido linoléico, ácido oléico, e colesterol, de preferência, cloreto de colina; fontes de energia, tais como glicose, galactose, manose e frutose, de preferência, glicose; reguladores os- móticos, tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, e nitrato de potássio, de preferência, cloreto de sódio; fontes de ferro, tais como EDTA de ferro, citrato férrico, cloreto ferroso, cloreto férrico, sulfato ferroso, sulfato férri- co, e nitrato férrico, de preferência, cloreto férrico, EDTA de ferro, e citrato férrico; e tampões de pH, tais como hidrogeno carbonato de sódio, cloreto de cálcio, hidrogeno fosfato de sódio, HEPES, e MOPS, de preferência, di- hidrogeno carbonato de sódio.

Além dos componentes listados acima, podem ser adicionados elementos de metal traço, tais como sulfato de cobre, sulfato de manganês, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, cloreto de níquel, cloreto de estanho, cloreto de magnésio e subsilicato de sódio, de preferência, sulfato de cobre, sulfato de zinco e sulfato de magnésio; tensoativos, tais como Tween 80 e Pluronic F68; cofatores de crescimento, tais como insulina recombinante, IGF-1 recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante, PDGF recombinante, TGF-a recombinante, cloridrato de etanolamina, selenito de sódio, ácido retinóico, e cloridrato de putrescina, de preferência, selenito de sódio, cloridrato de etanolamina, IGF-1 recombinante e cloridrato de putrescina; e nucleosídeos, tais como deoxiadenosina, deoxicitidina, deoxiguanosina, a- denosina, citidina, guanosina e uridina. Em exemplos preferidos do meio a- cima, podem estar contidos antibióticos, tais como estreptomicina, penicilina- G potássica e gentamicina e indicadores de pH, tal como vermelho de fenol.

O pH do meio difere com a célula a ser cultivada, mas, uma faixa adequada é, em geral, de pH 6,8 a 7,6, mais frequentemente, pH 7,0 a 7,4.

Alternativamente, meios de cultura comercialmente disponíveis para células animais também podem ser usados. Por exemplo, podem ser enumerados D-MEM (Meio Eagle Modificado por Dulbecco), Mistura D- MEM/F-12 1:1 (Meio Eagle Modificado por Dulbecco: Mistura Nutriente F- 12), RPMI1640, CHO-S-SFM II (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX- CELL 301 (JRH Biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific) e PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich). O meio pode ser um meio livre de soro.

Quando a célula hospedeira for uma célula de CHO, a célula pode ser cultivada por métodos conhecidos pelos técnicos especializados no assunto. Por exemplo, a célula de CHO pode ser cultivada sob uma atmosfera com uma concentração de CO2 de 0 a 40%, de preferência, de 2 a 10%, à 30 a 39°C, de preferência, de cerca de 37°C.

O período apropriado de cultura da célula para produzir um anticorpo recombinante desejado, ou um fragmento do mesmo, é, usualmente, desde um dia a três meses, de preferência, desde um dia a dois meses, e mais preferivelmente, desde um dia a um mês.

A cultura pode ser realizada usando vários dispositivos de cultura para cultura de células animais, por exemplo, um dispositivo de cultura em tanque do tipo fermentador, um dispositivo de cultura do tipo elevador de ar, um dispositivo de cultura do tipo de frasco de cultura, um dispositivo de cultura do tipo frasco spinner, um dispositivo de cultura do tipo microveículo, um dispositivo de cultura do tipo leito fluidizado, um dispositivo de cultura do tipo fibra oca, um dispositivo de cultura do tipo frasco rolante e um dispositivo de cultura do tipo leito empacotado.

A cultura pode ser realizada por qualquer método, tal como cultura em batelada, cultura em batelada alimentada, cultura contínua ou similares. É preferível cultura em batelada alimentada ou cultura contínua, e cultura em batelada alimentada é mais preferível.

No que diz respeito a sistemas in vivo para produção de anticorpos, ou de fragmentos do mesmo, sistemas de produção usando um animal ou uma planta podem ser dados. Um gene de interesse é introduzido no a- nimal ou na planta. Então, o animal ou a planta é deixada produzir um poli- peptídeo de interesse em seu corpo, seguido por recuperação do polipeptí- deo. O termo "hospedeiro", usado na presente invenção, inclui tais animais ou plantas.

Quando um animal está para ser usado, sistemas de produção são disponíveis usando um mamífero ou um inseto. Exemplos de mamíferos, que podem ser usados na presente invenção, incluem, mas, não estão limitados a, cabras, porcos, ovelhas, camundongos e bovinos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Quando um animal deva ser usado, um animal transgênico pode ser empregado.

Métodos de preparação de animais transgênicos são conhecidos. Por exemplo, um animal transgênico pode ser obtido de acordo com o método descrito em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:7380 a 7384 (1980). De maneira específica, um gene de interesse é introduzido em células totipoten- tes de um mamífero. Essas células são deixadas se desenvolverem em indivíduos. Aqueles indivíduos, nos quais o gene introduzido tenha sido integrado a células somáticas e a células germinativas, são selecionados a partir dos indivíduos resultantes. Portanto, o animal transgênico de interesse pode ser preparado. Como células totipotentes, nas quais um gene de interesse deva ser introduzido, não somente ovos fertilizados e embriões prematuros, mas, também, células cultivadas, tais como célula de ES tendo multipotên- cia, podem ser mencionadas. Por exemplo, um gene de interesse (na presente invenção, um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, e um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo) pode ser preparado como um gene de fusão, por sua fusão com um gene, que codifica um polipeptídeo, tal como caseína de β caseína, especificamente, produzida no leite. Fragmentos de DNA compreendendo esse gene de fusão são injetados em embriões de cabra, que são, então, transplantados em cabras fêmeas. O polipeptídeo de interesse (na presente invenção, um anticorpo, ou um fragmento do mesmo) pode ser recuperado a partir de leite produzido pelas cabras transformadas (nascidas a partir das cabras que tinham recebido os embriões modificados) ou por sua prole. A fim de aumentar a quantidade de leite contendo o polipeptídeo produzido pelas cabras transgênicas, hormônios apropriados podem ser administrados nas mesmas (Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12, 699 a 702).

Altemativamente, insetos, tais como lagartas da seda, podem ser usados. Um gene, que codifica um polipeptídeo de interesse (na presente invenção, um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, e um DNA, que codifica a cadeia curta, ou de um fragmento da mesma, do anticorpo) inserido em baculovírus pode ser usado para transfectar lagartas de seda, e o polipeptídeo de interesse pode ser recuperado a partir do fluido corporal das lagartas da seda (Susumu et al., Nature (1985) 315, 592 a 594).

Se a planta deve ser usada, pode ser empregado tabaco. Quan- do o tabaco for usado, um gene, que codifica um polipeptídeo de interesse (na presente invenção, um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, e um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo), pode ser inserido em um vetor de expressão de planta, tal como pMON 530, que é introduzido em uma bactéria, tal como Agrobacterium tumefaciens. Então, essa bactéria é usado para transfectar uma planta de tabaco, tal como Nicotiana tabacum, e o polipeptídeo de interesse (na presente invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo) é recuperado a partir de suas folhas (Julian et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

A presente invenção também fornece uma célula cultivada contendo um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, do que o número de cópias contidas na célula, de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. A célula cultivada é como descrita acima.

Além disso, a presente invenção fornece um método de produção de um anticorpo, ou de um fragmento do mesmo, compreendendo permitir uma célula para produzir o anticorpo ou o fragmento, a célula expressando a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo em rendimento mais elevado do que a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. Como um exemplo da célula expressando a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo, em rendimento mais elevado, do que a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpos, uma célula pode ser mencionada, que contenha um número maior de cópias de um DNA exógeno, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo, do que o número de cópias contidas na célula de um DNA exógeno, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo. Uma tal célula é como descrita acima. Por cultivo de uma célula que expressa a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, de um anticorpo em rendi-mento mais elevado, do que a cadeia pesada, ou fragmento da mesma, do anticorpo, é possível permitir à célula produzir o anticorpo, ou um fragmento do mesmo. O meio de cultura e as condições de cultura são como descritos acima.

O anticorpo, produzido pelo método de produção da presente invenção, inclui não somente anticorpos monoclonais derivados a partir de animais, tais como seres humanos, camundongos, ratos, hamsters, coelho e macacos, mas, também, anticorpos recombinantes de genes modificados artificialmente, tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos biespecíficos. A classe do anticorpo não está particularmente limitada. A classe imunoglobulina do anticorpo não está particularmente limitada, e pode ser IgG (tais como lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4), IgA, IgD, IgE, IgM ou similares. Quando o anticorpo deve ser usado como um fármaco, IgG ou IgM é preferível. Além disso, o anticorpo da presente invenção inclui não somente anticorpos integrais, mas, também, fragmentos de anticorpos, tais como Fv, Fab, F(ab)2, etc..

O anticorpo, produzido pelo método da presente invenção, pode estar adicionalmente ligado a várias moléculas, tais como polietileno glicol (PEG), e usado como um anticorpo modificado. Um tal anticorpo modificado pode ser obtido por modificação química do anticorpo modificado. Métodos para tal modificação já foram estabelecidos na técnica.

O anticorpo descrito acima da presente invenção pode ser preparado por métodos bem-conhecidos por aqueles técnicos versados na técnica.

Hibridomas que produzem anticorpos monoclonais podem ser preparados por uso de técnicas conhecidas, conforme descrito abaixo. De maneira breve, um antígeno desejado ou uma célula que expressa o antíge- no desejado, é usado como um antígeno sensibilizador, seguido por imunização de células, de acordo com procedimentos convencionais. Os imunóci- tos resultantes são, então, fundidos às células parentais conhecidas usando procedimentos convencionais, para fusão de células, seguido por seleção de células produtoras de anticorpos monoclonais (hibridomas), através de procedimentos de seleção convencionais. A preparação de hibridomas pode ser realizada de acordo com, por exemplo, o método de Milstein et al. (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73:3 a 46). Quando a imunogeni- cidade do antígeno usado for baixa, o antígeno pode estar conjugado com uma macromolécula imunogênica (por exemplo, albumina) antes de usar em imunização.

Além disso, os genes de anticorpos são clonados a partir de hi- bridomas, integrados em vetores apropriados, e, então, transferidos para hospedeiros para, por meio disso, obter anticorpos recombinantes de gene, produzidos com tecnologia de recombinação de gene (vide, por exemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). De maneira específica, cDNA do domínio variável (domínio V) de um anticorpo de interesse é sintetizado a partir de mRNA de hibridoma, usando transcriptase reversa. Uma vez que um DNA, que codifica o domínio V do anticorpo de interesse, seja obtido, o DNA é ligado a um DNA, que codifica o domínio constante (domínio C) do anticorpo, e integrado a um vetor de expressão. De maneira alternativa, o DNA, que codifica o domínio V de anticorpo pode ser integrado em um vetor de expressão, que veicule o DNA, que codifica o domínio C de anticorpo. O construto de DNA é integrado em um vetor de expressão, de modo que o DNA seja expresso sob o controle de regiões reguladoras de expressão, por exemplo, um intensificador ou um promotor. Células hospedeiras são, então, transformadas com esse vetor de expressão para expressão de anticorpos.

Na presente invenção, é possível usar anticorpos recombinantes de genes (por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados), que sejam modificados artificialmente de maneira típica, para a finalidade de reduzir antigenicidade heteróloga contra seres humanos. Esses anticorpos modificados podem ser preparados por métodos conhecidos. Um anticorpo quimérico é composto por domínios variáveis de cadeias pesada e leve a partir de um anticorpo de mamífero não humano (por exemplo, camundongo), e domínios constantes de cadeias pesada e leve a partir de um anticorpo humano. Anticorpos quiméricos podem ser obtidos por ligação de DNAs, que codificam domínios variáveis de anticorpo de camundongo a DNAs, que codifiquem domínios constantes de anticorpos humanos, integração do construto de DNA resultante em um vetor de expressão, e transformação do vetor em um hospedeiro para a produção de anticorpos.

Anticorpos humanizados são também anticorpos humanos re-formatados e obtidos por enxerto das regiões determinantes de complemen- tariedade (CDRs) de um anticorpo a partir de um mamífero não humano, tal como camundongo, nas regiões determinantes de complementariedade de um anticorpo humano. Técnicas gerais de recombinação de genes para prepará-los são também conhecidos. De maneira específica, uma sequência de DNA, projetada para permitir a ligação das CDRs de um anticorpo de camundongo as regiões de grade (FRs)de um anticorpo humano, é sintetizada por PCR a partir de vários oligonucleotídeos preparados para ter seções que se sobrepõem uma às outras nas extremidades. O DNA resultante está ligado a um DNA, que codifica os domínios constantes de anticorpos humanos e integrado a um vetor de expressão, seguido por transformação em um hospedeiro para produção de anticorpos (vide a Publicação de Patente Europeia n° EP 239400 e a Publicação de Patente Internacional n° WO 96/02576). As FRs do anticorpo humano, ligadas através das CDRs, são selecionadas de uma maneira tal que as regiões determinantes de complementariedade formem um sítio de ligação ao antígeno apropriado. Se necessário, anticorpos humanizados reformatados podem ter algumas mudanças de aminoácidos nas regiões de grade das regiões variáveis, de modo que as regiões determinantes de complementariedade formem um sítio de ligação de antígeno apropriado (Sato, K. etal., Cancer Res. (1993) 53, 851 a 856).

Procedimentos para obtenção de anticorpos humanos são também conhecidos. Por exemplo, linfócitos humanos são sensibilizados in vitro com um antígeno desejado ou com uma célula que expresse o antígeno desejado, e os linfócitos sensibilizados são, então, fundidos a células de mie- loma humanas (por exemplo, U266), para se obter um anticorpo humano desejado tendo atividade de ligação ao antígeno (vide a Publicação de Patente Japonesa n° 01-59878). Alternativamente, um animal transgênico tendo o repertório completo de genes de anticorpos humanos podem ser imuni- zado com um antígeno, para se obter um anticorpo humano (vide as Publicações Internacionais n° WO 93/12227, n° WO 92/03918, n° WO 94/02602, n° WO 94/25585, n° WO 96/34096 e n° WO 96/33735). Métodos para obtenção de um anticorpo humano por panning com uma biblioteca de anticorpos humanos são também conhecidos. Por exemplo, ligação de fagos a um antígeno pode ser selecionada por expressão das regiões variáveis de um anticorpo humano como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv) sobre superfícies de fagos por um método de exibição de fago. Por análise dos genes dos fagos selecionados, é possível determinar as sequências de dNA, que codificam as regiões variáveis da ligação de anticorpo humano ao antígeno. Uma vez que as sequências de DNA da ligação de fragmentos de scFv ao antígeno sejam determinadas, é possível preparar um vetor de expressão apropriado compreendendo a sequência de DNA e obter um anticorpo humano. Esses métodos já são bem-conhecidos e podem ser encontrados nos documentos n° WO 92/01047, n° WO 92/20791, n° WO 93/06213, n° WO 93/11236, n° WO 93/19172, n° WO 95/01438 e n° WO 95/15388.

O anticorpo ou um fragmento dele, obtido conforme descrito a- cima, pode ser purificado até a homogeneidade. O isolamento e a purificação do anticorpo, ou um fragmento do mesmo, podem ser realizadas por métodos de isolamento / purificação usados para polipeptídeos convencionais. Por exemplo, o anticorpo pode ser isolado e purificado por seleção e combinação, de maneira apropriada, de colunas de cromatografia (tais como cromatografia por afinidade), filtros, ultrafiltração, relargagem, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS, focalização isoelétrica, etc (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), mas não estão limitados àqueles listados acima. A concentração do anticorpo assim obtido pode ser determinada por medição de absorbân- cia ou por ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA).

Como colunas a serem usadas em cromatografia por afinidade, podem ser mencionadas coluna de proteína A e coluna de proteína G. E- xemplos de colunas de proteína A incluem Hyper D, POROS e Sepharose F. F. (Pharmacia).

Cromatografias diferentes de cromatografia por afinidade incluem, por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia por absorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Essas cromatografias podem ser realizadas na forma de cromatografia líquida, tais como HPLC ou FPLC.

É também possível tratar o polipeptídeo produzido com uma enzima modificadora de polipeptídeo apropriada antes ou depois que o mesmo seja purificado, para, por meio disso, adicionar uma modificação desejada ou para remover um peptídeo parcialmente. Enzimas modificadoras de polipeptídeo incluem tripsina, quimotripsina, lisil endopeptidase, proteína quinase, glicosidase, etc..

Quando o anticorpo ou um fragmento do mesmo, produzido pelo método da presente invenção, tiver uma atividade biológica aplicável como fármaco, é possível preparar fármacos por mistura e formulação do polipeptídeo com veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis.

Esses veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, água, solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, colágeno, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, polímero de carboxil-vinila, carboximetil celulose de sódio, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dex- trana solúvel em água, carboximetil amido de sódio, pectina, metil celulose, etil celulose, goma xantana, goma arábica, caseína, ágar, polietileno glicol, diglicerol, glicerol, propileno glicol, petrolato, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina de soro humano (HSA), manitol, sorbitol, lactose e tensoativos farmaceuticamente aceitáveis.

Os veículos ou aditivos podem ser selecionados isoladamente ou em uma combinação adequada a partir das substâncias listadas acima, dependendo da forma de dosagem do fármaco da presente invenção. Pode se presumir que os veículos ou aditivos não estejam limitados àqueles listados acima. Por exemplo, quando o polipeptídeo da presente invenção for usado como uma preparação para injeção, o polipeptídeo purificado pode ser dissolvido em um solvente (tal como salina fisiológica, tampão ou solução de glicose), seguido por adição à solução de um agente de inibição de absorção, tais como TweenδO, Tween20, gelatina ou albumina de soro humana. Alternativamente, o polipeptídeo da presente invenção pode ser liofili- zado para dar uma forma de dosagem que possa ser dissolvida para reconstituição antes de usar. Como excipientes para liofilização, álcoois de açúcar, tais como manitol e glicose, podem ser usados.

A dose eficaz do anticorpo, ou de um fragmento do mesmo, é selecionada, de maneira apropriada, dependendo do tipo do anticorpo, ou de um fragmento do mesmo, do tipo de uma doença a ser tratada ou prevenida, da idade do paciente, da severidade da doença, etc. Por exemplo, quando o anticorpo for anticorpo antiglipicano-3 e usado como um agente anticâncer, a dose eficaz do anticorpo é selecionada dentro da faixa desde 0,001 a 1.000 mg/kg em peso corporal por administração. Alternativamente, uma dose de 0,01 a 100.000 mg/kg em peso corporal pode ser selecionada. Entretanto, a dose não está limitada a esses níveis.

A administração do anticorpo, ou de um fragmento do mesmo, pode ser ou oral ou parenteral, mas, a administração parenteral é preferível. De maneira específica, injeção (administração sistêmica ou local por injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea), administração nasal, administração pulmonar, administração transdérmica ou similares podem ser enumeradas.

EXEMPLOS

Nas partes que se seguem, a presente invenção será descrita especificamente com referência aos Exemplos. Deve ser observado que esses Exemplos são fornecidos somente para explicar a presente invenção e, de maneira alguma, limitam o escopo da presente invenção.

[EXEMPLO 1] - Preparação de Plasmídeo de Expressão de Anticorpo Anti- qlipicano-3 Humano Humanizado

Primeiro, o gene de cadeia pesada de anticorpo antiglipicano-3 humano humanizado foi preparada conforme descrito abaixo. Um fragmento de glipicano-3 (obtido por expressão de um gene de proteína de fusão de GST por PCR) foi usado para imunizar camundongos (MRL/lpr, Charles River Japan). Células de hibridoma foram preparadas usando esplenócitos a partir desses camundongos. Células de hibridoma foram selecionadas por ELISA usando glipicano-3 como antígeno para, por meio disso, selecionar aqueles clones que produziram anticorpos de ligação a glipicano-3. mRNA foi extraído a partir das células de hibridoma, e cDNA foi preparado por transcrição reversa com transcriptase reversa. Gene de domínio variável de cadeia pesada de antiglipicano-3 de camundongo foi amplificado por PCR usando o cDNA e um iniciador (CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATG) (SEQ ID NO: 1), tendo uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene de domínio variável de cadeia pesada de camundongo, e obtido por ligação a pGEM-T easy (Promega). Gene de domínio variável de cadeia pesada de anticorpo humano, tendo homologia às regiões de grade de gene de domínio variável de cadeia pesada de antiglipicano-3 de camundongo, foi procurado e identificado usando banco de dados Kabat. A sequência de nucleotídeos de um gene de domínio variável de cadeia pesada de antiglipicano-3 humanizado, no qual cada porção de grade do gene de domínio variável de cadeia pesada de anticorpo humano foi ligada a cada porção de CDR de domínio variável de cadeia pesada de antiglipicano-3 de camundongo, foi projetado e sintetizado por PCR. O gene de domínio variável de cadeia pesada antiglipicano-3 humanizado foi ligado ao gene de domínio constante de lgG1 humano, seguido por otimização através de substituição de aminoáci- dos. Portanto, gene de cadeia pesada antiglipicano-3 humanizado foi preparado (vide o documento n° W006/06693). O gene de cadeia pesada de anticorpo antiglipicano-3 humano humanizado foi ligado à jusante de promotor de CAG, e sinal de polyA de β globina de camundongo foi ligado a jusante deste gene de cadeia pesada, para, por meio disso, preparar uma unidade de expressão de cadeia pesada. É possível excisar a unidade de expressão de cadeia pesada utilizando os sítios de restrição de BamHI e de Hindlll à montante da unidade de expressão e o sítio de restrição de Xhol a jusante da unidade de expressão.

Subsequentemente, o gene de cadeia curta de anticorpo antigli- picano-3 humano humanizado foi preparado conforme descrito abaixo. De maneira breve, camundongos foram imunizados com um fragmento de glipi- cano-3. Células de hibridoma foram preparadas usando esplenócitos a partir destes camundongos. Células de hibridoma foram selecionadas por ELISA usando glipicano-3 como antígeno, para, por meio disso, selecionar aqueles clones, que produziam anticorpos de ligação de glipicano-3. mRNA foi extraído a partir das células de hibridoma, e cDNA foi preparado por transcrição reversa com transcriptase reversa. Gene de domínio variável de cadeia curta de antiglipicano-3 de camundongo foi ampliado por PCR usando o cDNA e um iniciador (GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG) (SEQ ID NO: 2), tendo uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene de domínio variável de cadeia curta de camundongo, e obtido por ligação em pGEM-T Easy (Promega). Gene de domínio variável de cadeia curta de anticorpo humano tendo homologia às regiões de grade de gene de domínio variável de cadeia curta de antiglipicano-3 de camundongo foi procurado e identificado usando banco de dados Kabat. A sequência de nucleotídeos de um gene de domínio variável de cadeia curta de antiglipicano-3 humanizado, no qual cada porção de quadro de leitura do gene de domínio variável de cadeia curta de anticorpo humano identificada foi ligada a cada porção de CDR de domínio variável de cadeia curta de antiglipicano-3 de camundongo, foi projetado e sintetizado por PCR. O gene de domínio variável de cadeia curta de antiglipicano-3 humanizado foi ligado ao gene de domínio constante de IgG K humano, seguido por otimização através de substituição de aminoácidos. Portanto, o gene de cadeia curta de antiglipicano-3 humanizado foi preparado (vide o documento n° W006/06693). O gene de cadeia curta de anticorpo antiglipicano-3 humano humanizado foi ligado à jusante de promotor CAG, e sinal de polyA de β globina de camundongo foi ligado à jusante deste gene de cadeia curta, para, por meio disto, preparar uma unidade de expressão de cadeia curta. É possível excisar a unidade de expressão de cadeia curta com Hin- dlll.

Plasmídeo INPEP4 (IDEC) digerido com BamHI e Xhol e a unidade de expressão de cadeia pesada foram ligados, para, por meio disto, preparar plNP-GC33-H1. plNP-GC33-H1, digerido com Hindlll, e a unidade de expressão de cadeia curta, excisada com Hindlll, foram ligados. Por essas operações, os seguintes dois plasmídeos foram preparados: plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L phGC33CAG N° 1 retendo uma cópia de unidade de expressão de cadeia curta e uma cópia de unidade de expressão de cadeia pesada por plasmídeo, e plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L phGC33CAG1 retendo duas cópias de unidade de expressão de cadeia curta e uma cópia de unidade de expressão de cadeia pesada por plasmídeo (Figura 1). [EXEMPLO 21 - Preparação de Clones de Células de Expressão Estável de Anticorpos Antiglipicano-3 Humano Humanizados phGC33CAG N° 1 ou phGC33CAG1 foi introduzido em cepa DXB11 de célula de CHO por eletroporação. Aqueles clones de células, que compreendiam o plasmídeo de expressão introduzido nos mesmos, foram selecionados por cultivo das células na presença de 400 μg/mL de G418. Os clones selecionados foram ulteriormente cultivados na presença de MTX 10- 100 nM para a finalidade de amplificação de gene do plasmídeo de expressão.

Clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L (N = 4) e clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L (N = 5) foram obtidos. Esses clones foram comparados por cultura em batelada em frascos de 125 mL. A cultura foi realizada sob as seguintes condições: volume de caldo de cultura: 50 mL; densidade de células inicial: 2 x 105 células/mL; temperatura de cultura: 37°C e velocidade de agitação: 110 rpm. Nos dias 3, 5, 6 e 7 de cultura, foram medidas e comparadas as concentrações de anticorpo no caldo de cultura. O rendimento em anticorpos no dia 7 era de cerca de 60 a 260 μ- g/mL em clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L (N = 5). O rendimento em anticorpo de clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L era maior do que duas vezes mais alto do que aquele de clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L (Figura 2).

A partir dos resultados acima, foi confirmado que o rendimento em anticorpo pode ser intensificado por introdução, em uma célula hospedeira, dos genes de cadeia pesada e de cadeia curta, em uma razão gene de cadeia pesada: gene de cadeia curta de 1:2, em oposição à razão de 1:1 usada em métodos convencionais. EXEMPLO 31 - Preparação de Clones de Célula de Expressão Estável de Anticorpo Anti-IL-6R Humano Humanizado

Promotores CAG foram ligados à montante de gene de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-6R humano humanizado e de gene de cadeia curta de anticorpo anti-IL-6R humano humanizado (ambos descritos no documento n° WO92/019759), respectiva mente. Subsequentemente, sinais de polyA de β globina de camundongo foram ligados à jusante dos dois genes, respectivamente. Portanto, foram preparadas uma unidade de expressão de cadeia pesada e uma unidade de expressão de cadeia curta. A unidade de expressão de cadeia pesada e a unidade de expressão de cadeia curta foram ligadas a gene de resistência à neomicina que integra pBluescript e dhfr, como um resultado, um plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L, composto de uma cópia da cadeia pesada de gene de anticorpo anti-IL-6R humano humanizado e uma cópia da cadeia curta e um plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L, composto de uma cópia da cadeia pesada e duas cópias da cadeia curta foram preparados (Figura 3). Esses plasmídeos foram introduzidos em cepa DXB11 de células CHO por eletroporação. Aqueles clones de células, que compreendiam o plasmídeo de expressão neles introduzido, foram selecionados por cultivo subsequente das células na presença de 400 μg/mL de G418.

Clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L (N = 176) e clones de células transformadas com plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L (N = 176) foram obtidos. Esses clones foram comparados por cultura em batelada em placas de 24 cavidades. A cultura foi realizada sob as seguintes condições: volume de caldo de cultura: 0,7 mL; temperatura de cultura: 37°C e velocidade de agitação: 160 rpm. No dia 12 de cultura, as concentrações de anticorpo no cal- do de cultura foram medidas. Depois que os clones foram dispostos por ren-dimento em anticorpo, os dois grupos de clones foram comparados (Figura 4). Em geral, o rendimento em anticorpo de células transformadas com plasmídeo de expressão de 2 cópias de cadeia L era maior do que aquele de células transformadas com plasmídeo de expressão de 1 cópia de cadeia L.

A partir dos resultados acima, foi confirmado que o rendimento em anticorpo pode ser intensificado por introdução, em uma célula hospedei-ra, dos genes de cadeia pesada e de cadeia curta, em uma razão de gene de cadeia pesada : gene de cadeia curta de 1:2, em oposição à razão de 1:1 usada em métodos convencionais.

A presente invenção é aplicável a todas as células que produzam anticorpos. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados por referência em sua totalidade. APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente invenção é aplicável à produção de anticorpos.

TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<SEQ ID NO: 1> SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de um iniciador tendo uma sequência de nucleotídeos complementar ao gene de domínio variável de cadeia pesada de camundongo. SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de um iniciador tendo uma sequência de nucleotídeos complementar de gene de domínio variável de cadeia curta de camundongo.

Claims

1. Método de produção de um anticorpo inteiro ou de um frag-mento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir um vetor em uma célula para produzir o anticorpo ou o fragmento, em que o vetor compreende duas cópias de um DNA exógeno que codifica a cadeia curta do anticorpo inteiro ou do fragmento do mesmo e uma cópia de um DNA exógeno que codifica a cadeia pesada do anticorpo inteiro ou do fragmento do mesmo; e em que o referido vetor compreende duas ou mais unidades de expressão compreendendo um promotor, o DNA exógeno codificando a ca-deia leve do anticorpo completo ou um fragmento e um sinal poliA, e o vetor compreende uma unidade de expressão compreendendo um promotor, o DNA exógeno codificando a cadeia pesada do anticorpo completo ou um fragmento e um sinal poliA.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula, na qual foi introduzido um vetor compreen-dendo uma cópia de um DNA, que codifica a cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, do anticorpo e duas cópias de um DNA, que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula animal.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula é célula de ovário de hamster chinês.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo humano.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpo receptor de anti-IL-6, anticorpo anti-IL-6, anticorpo antiglipicano-3, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti- GPIIb/IIIa, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-EGFR, an-ticorpo anti-Her2/neu, anticorpo anti-RSV, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti CD52, anticorpo anti-IgE, anticorpo anti-CD11a, anticorpo anti-VEGF e anti-corpo anti-VLA4.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cópia(s) do DNA codificando a cadeia leve ou pesada de um anti- 5 corpo inteiro ou fragmento do mesmo é(são) introduzidos pelo vetor como definido na reivindicação 1 que compreende um promotor, o DNA codificando cadeia leve ou pesada de um anticorpo inteiro ou fragmento do mesmo e um sinal PoliA.

8. Método de preparação de fármacos, caracterizado pelo fato de 10 que compreende misturar e formular um polipeptídeo com veículos ou ativos farmaceuticamente aceitáveis, em que o polipeptídeo é constituído pelo anti-corpo, ou o fragmento do mesmo, preparado pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compre- 15 ende uma cópia de um DNA que codifica a cadeia pesada, ou fragmento da mesma, de um anticorpo, e duas cópias de um DNA que codifica a cadeia curta, ou um fragmento da mesma, do anticorpo.