ES2622366T3 - Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada - Google Patents
Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada Download PDFInfo
- Publication number
- ES2622366T3 ES2622366T3 ES10771093.1T ES10771093T ES2622366T3 ES 2622366 T3 ES2622366 T3 ES 2622366T3 ES 10771093 T ES10771093 T ES 10771093T ES 2622366 T3 ES2622366 T3 ES 2622366T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- cells
- culture
- glucose
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 92
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 175
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 124
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 120
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 71
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 70
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 27
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 20
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 20
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 12
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 12
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 11
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 6
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 2-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=CC=N1 ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- KFEUJDWYNGMDBV-JLHPUFKKSA-N N-[(3R,4R,5S,6R)-2,4-Dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[(2R,3S,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O[C@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]2O)[C@@H]1O KFEUJDWYNGMDBV-JLHPUFKKSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007946 glucose deprivation Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007967 glucose restriction Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000052623 human IL6R Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N m-aminophenylboronic acid Chemical compound NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina, que comprende a) cultivar una célula eucariota que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor constante inferior a un 80 % y superior a un 20 % de la cantidad que se podría utilizar como máximo por las células en el medio de cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante está disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentación de glucosa limitada, y b) recuperar la inmunoglobulina del cultivo.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina glucosilada
En el presente documento se informa de un procedimiento en el campo de la produccion de inmunoglobulinas en celulas, por el que se puede modificar el patron de glucosilacion de la inmunoglobulina producida basandose en las condiciones de cultivo.
Antecedentes de la invencion
En los ultimos anos ha aumentado continuamente la produccion de inmunoglobulinas y es probable que las inmunoglobulinas lleguen a ser el mayor grupo de tratamientos disponible para el tratamiento de diversas enfermedades en el futuro cercano. El impacto de las inmunoglobulinas surge de su especificidad, que comprende su funcion de reconocimiento y union a dianas especfficas, ademas de la activacion de efectos especfficos simultaneamente con o despues de la union de antfgeno/receptor Fc.
El reconocimiento y union a dianas especfficas esta mediado por la region variable de la inmunoglobulina. Otras partes de la molecula de inmunoglobulina, de las que se originan los efectos, son modificaciones postraduccionales, tales como el patron de glucosilacion. Las modificaciones postraduccionales tienen una influencia sobre la eficacia, estabilidad, potencial inmunogenico, union, etc., de una inmunoglobulina. A proposito de esto, tienen que tratarse la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la induccion de la apoptosis.
Se ha informado que el patron de glucosilacion de inmunoglobulinas, es decir, la composicion de sacarido y el numero de glucoestructuras unidas, tiene una fuerte influencia sobre las propiedades biologicas (vease, por ejemplo, Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16). Las inmunoglobulinas producidas por celulas de mamffero contienen un 2-3 % en masa de carbohidratos (Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557). Esto es equivalente, por ejemplo, en una inmunoglobulina de clase G (IgG) a 2,3 restos de oligosacarido en una IgG de origen de raton (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) y a 2,8 restos de oligosacarido en una IgG de origen humano (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457), de los que generalmente dos se localizan en la region Fc y los restantes en la region variable (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31).
En la region Fc de una inmunoglobulina de clase G, se pueden introducir restos de oligosacarido a traves de N- glucosilacion en el resto de aminoacido 297, que es un resto de asparagina (indicado como Asn297). Youings et al. han mostrado que existe otro sitio de N-glucosilacion en un 15 % a un 20 % de las moleculas de IgG policlonal en la region Fab (Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630; vease tambien, por ejemplo, Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940). Debido al procesamiento de oligosacaridos no homogeneos, es decir, asimetricos, existen multiples isoformas de una inmunoglobulina con diferente patron de glucosilacion (Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845; Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748). Simultaneamente, la estructura y distribucion de los oligosacaridos es tanto altamente reproducible (es decir, no aleatoria) como especffica de sitio (Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292).
Algunas caracterfsticas de una inmunoglobulina estan directamente asociadas a la glucosilacion de la region Fc (vease por ejemplo Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292; Lund, J., et al., J. Immunol. 157 (1996) 49634969; Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Wright, A. y Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402), tales como, por ejemplo, estabilidad termica y solubilidad (West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20), antigenicidad (Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339), inmunogenicidad (Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351; Feizi, T. y Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1-11; Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72), tasa de eliminacion/semivida en la circulacion (Ashwell, G. y Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554; McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135; Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391; Chan, V.T. y Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62; Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355; Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182; Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908) y actividad especffica biologica (Jefferis, R. y Lund, J., en Antibody Engineering, ed. por Capra, J.D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128).
Se han investigado los factores que influyen en el patron de glucosilacion, tales como, por ejemplo, la presencia de suero de ternero fetal en el medio de fermentacion (Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131), condiciones de tamponamiento (Muthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334), concentracion de oxfgeno disuelto (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31; Kunkel, J.P., et al., J. Biotechnol. 62 (1998) 5571; Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350), posicion y conformacion del oligosacarido, ademas del tipo de celula huesped y estado de crecimiento celular (Hahn, T.J. y Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987; Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981), metabolismo de azucares de nucleotidos celulares (Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251), limitaciones de nutrientes (Gawlitzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544; Hayter, P.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335), especialmente restriccion de glucosa (Tachibana, H., et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157) y pH extracelular (Borys, M.C., et al., Bio/Technology 11 (1993) 720-724).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se han observado estructuras de oligomanosa elevadas, ademas de estructuras de oligosacarido truncadas, por la expresion recombinante de inmunoglobulinas, por ejemplo, en celulas NS0 de mieloma (Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735). En condiciones de privacion de glucosa, se han observado variaciones en la glucosilacion, tales como la union de oligosacaridos precursores mas pequenos o la ausencia completa de restos de oligosacarido, en celulas CHO, celulas 3T3 murinas, celulas de hepatoma de rata, celulas de rinon de rata y celulas de mieloma murino (Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261; Davidson, S.K. y Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468; Gershman, H. y Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780; Baumann, H. y Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949; Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771; Stark, N.J. y Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609). Se informo de una estrategia basada en bajas concentraciones de glutamina/glucosa por Wong, D.C.F., et al., Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177.
La solicitud de patente japonesa JP 62-258252 informa de un cultivo de celulas de mamffero por perfusion, mientras que el documento US 5.443.968 informa de un procedimiento de cultivo semicontinuo para celulas que secretan protefna. En el documento WO 98/41611 se informa de un procedimiento de cultivo de celulas eficaz para adaptar las celulas a un estado metabolico caracterizado por baja produccion de lactato. Se informa de un procedimiento para cultivar celulas para producir sustancias en el documento WO 2004/048556. Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534, informa que las celulas de mamffero, cuando se incuban en ausencia de glucosa, transfieren estructuras que contienen manosa-5 en lugar de estructuras que contienen manosa-9 a protefnas. Se informa de la dependencia de las influencias de pCO2 durante la limitacion de glucosa en el crecimiento, metabolismo y produccion de IgG de celulas CHO por Takuma, S., et al. en Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488.
En el documento US 2006/127975 se informa de un procedimiento de cultivo de celulas para producir sustancias. En el mismo, se cultiva una lfnea celular que produce sustancias mientras se alimenta un medio nutritivo de tal manera que se produce limitacion de glucosa en la solucion de cultivo. Se informa de manipulacion de la region Fc por Peipp, M., et al., en Handbook of Therapeutic Antibodies (Wiley-VCH, Weinheim, paginas 171-196). Venkiteshwarain, A., informo de Tocilizumab (MaBs 1 (2009) 432-438).
Sumario
Se ha encontrado que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion de un polipeptido producido por una celula eucariota se puede modificar basandose en la cantidad de glucosa proporcionada a la celula en el procedimiento de cultivo. Reduciendo la cantidad de glucosa disponible, por ejemplo, cambiando el valor de DGL de 1,0 a valores mas pequenos de, por ejemplo, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4 o 0,2, se puede obtener una modificacion en la cantidad de glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion. El valor de DGL o, respectivamente, la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo tiene que mantenerse constante y a un valor reducido definido por unidad de tiempo.
En el presente documento se informa de un procedimiento para la produccion de un polipeptido, en un modo de realizacion de una inmunoglobulina, en una celula eucariota, que comprende las siguientes etapas
a) proporcionar una celula eucariota que comprende un acido nucleico que codifica el polipeptido,
b) cultivar la celula en condiciones en las que el grado de limitacion de glucosa (DGL) se mantiene constante y en las que el DGL es inferior a 0,8, y
c) recuperar el polipeptido del cultivo,
en el que la fraccion del polipeptido con una glucoestructura de manosa-5 es de un 10 % o menos de la suma que comprende la cantidad del polipeptido con una glucoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) del polipeptido, la cantidad de la isoforma G(1) del polipeptido y la cantidad de la isoforma G(2) del polipeptido.
En un modo de realizacion, el DGL se mantiene constante en el intervalo de 0,8 a 0,2. En otro modo de realizacion, el DGL se mantiene constante en el intervalo de 0,6 a 0,4. En otro modo de realizacion, la fraccion del polipeptido con una glucoestructura de manosa-5 es de un 8 % o menos de la suma que comprende el polipeptido con una glucoestructura de manosa-5, la isoforma G(0) del polipeptido, la isoforma G(1) del polipeptido y la isoforma G(2) del polipeptido. En otro modo de realizacion adicional, el polipeptido es una inmunoglobulina, en un modo de realizacion una inmunoglobulina de clase G o E.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una celula de mamffero que comprende un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina,
b) cultivar la celula en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a menos de un 80 % y mas de un 20 % de la cantidad que se podna utilizar como maximo por las celulas en el medio de cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentacion de glucosa restringida, y
c) recuperar la inmunoglobulina de las celulas o el medio de cultivo.
En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor en el intervalo de un 60 % a un 40 %. En otro modo de realizacion, las celulas en el medio de cultivo son las celulas viables en el medio de cultivo.
En un modo de realizacion de los aspectos, como se informa en el presente documento, la celula eucariota se selecciona de celulas CHO, celulas NS0, celulas HEK, celulas BHK, celulas de hibridoma, celulas PER.C6®, celulas de insecto o celulas Sp2/0. En un modo de realizacion, la celula eucariota es una celula de ovario de hamster chino (CHO). En otro modo de realizacion de los aspectos, como se informa en el presente documento, el cultivo es a un valor de pH en el intervalo de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 7,2.
En otro modo de realizacion adicional de los aspectos, como se informa en el presente documento, el cultivo es un cultivo continuo o semicontinuo. Los procedimientos pueden comprender, en otro modo de realizacion, una etapa final de purificacion del polipeptido. En otro modo de realizacion adicional, la celula se cultiva durante seis a veinte dfas o durante seis a quince dfas. En otro modo de realizacion, la celula se cultiva durante seis a ocho dfas.
En el presente documento se informa de una composicion que comprende una inmunoglobulina, en la que la composicion se ha preparado con un procedimiento, como se informa en el presente documento.
En un modo de realizacion, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R. En otro modo de realizacion, el anticuerpo anti-IL-6R comprende Tocilizumab. En otro modo de realizacion, la glucoestructura de manosa-5 unida al anticuerpo anti-IL-6R es de un 8 % o menos. En otro un modo de realizacion adicional, la glucoestructura de manosa-5 es de un 6 % o menos. En otro modo de realizacion, la glucoestructura de manosa-5 es de un 4 % o menos. En otro modo de realizacion, la glucoestructura G(0) unida al anticuerpo anti-IL-6R esta en el intervalo de un 40 % a un 46 % y la glucoestructura G(2) unida al anticuerpo anti-IL-6R esta en el intervalo de un 9 % a un 11 %.
Descripcion detallada
En el presente documento se informa de un procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:
a) cultivar una celula de mairnfero que comprende un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo a un DGL constante inferior a 0,8 (es decir, la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo es constante y a un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo), y
b) recuperar la inmunoglobulina de las celulas o el medio de cultivo.
Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede obtener una inmunoglobulina en el que la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5 depende del valor de DGL ajustado, y en el que la cantidad es la fraccion de la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa- 5, y de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, y de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina, y de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina. En un modo de realizacion, el DGL es de 0,8 a 0,2. En este modo de realizacion, la fraccion es de un 10 % o menos. En otro modo de realizacion, el DGL es de 0,6 a 0,4. En este modo de realizacion, la fraccion es de un 6 % o menos. Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede obtener una inmunoglobulina en la que la fraccion de la inmunoglobulina que tiene una glucoestructura de manosa-5 es de un 10 % o menos de la suma que comprende la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la cantidad de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina. En otro modo de realizacion, la fraccion es la fraccion en % de area determinada en un procedimiento de cromatograffa de lfquidos. En un modo de realizacion, el DGL se mantiene en el intervalo de 0,8 a 0,2. En otro modo de realizacion, el DGL se mantiene en el intervalo de 0,6 a 0,2. En otro modo de realizacion adicional, el DGL se mantiene en el intervalo de 0,6 a 0,4. En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo es la cantidad promedio de glucosa que se utiliza en un cultivo en el que todos los compuestos estan disponibles en exceso, es decir, ningun compuesto es limitante del crecimiento de la celula, determinado basandose en al menos cinco cultivos. En un modo de realizacion, la fraccion se determina en el dfa siete de cultivo.
Se describen procedimientos y tecnicas conocidos para un experto en la tecnica, que son utiles para llevar a cabo la presente invencion, por ejemplo, en Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumenes I a III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Glover, N.D. (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (1985); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1986); Miller, J.H. y Calos, M.P. (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Segunda Edicion, N.Y., W.H. Freeman and Co (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J. (ed.), Cell Biology, Segunda Edicion, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Segunda Edicion, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987).
El uso de tecnologfa de ADN recombinante permite la produccion de numerosos derivados de un polipeptido. Dichos derivados se pueden modificar, por ejemplo, en posiciones de aminoacidos individuales o varias posiciones de aminoacidos por sustitucion, alteracion o intercambio. La derivatizacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de mutagenesis dirigida al sitio. Dichas variaciones se pueden llevar a cabo facilmente por un experto en la tecnica (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, EE. UU. (2001); Hames, B.D. y Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra).
La expresion "acido nucleico" indica una molecula de acido nucleico que existe de forma natural o que existe parcial o completamente de forma no natural que codifica un polipeptido. El acido nucleico puede estar constituido por fragmentos de ADN que se afslan o sintetizan por medios qufmicos. El acido nucleico se puede integrar en otro acido nucleico, por ejemplo, en un plasmido de expresion o el genoma/cromosoma de una celula eucariota. El termino "plasmido" incluye plasmidos lanzadera y de expresion. Tfpicamente, el plasmido tambien comprendera una unidad de propagacion procariota que comprende un origen de replicacion (por ejemplo, origen de replicacion CoIE1) y un marcador de seleccion (por ejemplo, gen de resistencia a ampicilina o tetraciclina), para la replicacion y seleccion, respectivamente, del plasmido en celulas procariotas. Para un experto en la tecnica, son muy conocidos los procedimientos para convertir una secuencia de aminoacidos, por ejemplo, de un polipeptido, en un acido nucleico correspondiente que codifica la secuencia de aminoacidos respectiva. Por tanto, un acido nucleico se caracteriza por su secuencia de acido nucleico que consiste en nucleotidos individuales y, asimismo, por la secuencia de aminoacidos de un polipeptido codificada por la misma.
La expresion "casete de expresion" indica un acido nucleico que contiene los elementos necesarios para la expresion y, opcionalmente, para la secrecion de al menos el gen estructural contenido en/de una celula, tal como un promotor, sitio de poliadenilacion y regiones no traducidas 3' y 5'.
El termino "gen" indica, por ejemplo, un segmento en un cromosoma o en un plasmido, que es necesario para la expresion de un polipeptido. Ademas de la region codificante, un gen comprende otros elementos funcionales que incluyen un promotor, intrones y uno o mas terminadores de la transcripcion. Un "gen estructural" indica la region codificante de un gen sin una secuencia senal.
El termino "expresion" indica la transcripcion y la traduccion de un gen estructural dentro de una celula. El nivel de transcripcion de un gen estructural en una celula se puede determinar basandose en la cantidad de ARNm correspondiente que esta presente en la celula. Por ejemplo, el ARNm transcrito de un acido nucleico seleccionado se puede cuantificar por PCR o por hibridacion de Northern (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (anteriormente)). Un polipeptido codificado por un acido nucleico se puede cuantificar por diversos procedimientos, por ejemplo, por ELISA, determinando la actividad biologica del polipeptido o empleando procedimientos que son independientes de dicha actividad, tal como transferencia de Western o radioinmunoensayo, usando anticuerpos que reconocen y se unen al polipeptido (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (anteriormente)).
El termino "celula" indica una celula en la que se ha introducido un acido nucleico que codifica un polipeptido, en un modo de realizacion un polipeptido heterologo. El termino "celula" incluye tanto celulas procariotas usadas para la propagacion de plasmidos/vectores como celulas eucariotas usadas para la expresion del gen estructural. En un modo de realizacion, una celula eucariota para la expresion de una inmunoglobulina es una celula de mamffero. En otro modo de realizacion, la celula de mamffero se selecciona de celulas CHO, celulas NS0, celulas Sp2/0, celulas COS, celulas HEK, celulas BHK, celulas PER.C6® y celulas de hibridoma. Una celula eucariota se puede seleccionar ademas de celulas de insecto, tales como celulas de oruga (Spodoptera frugiperda, celulas sf), celulas de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), celulas de mosquito (Aedes aegypti, Aedes albopictus) y celulas de gusano de seda (Bombyx mori) y similares.
El termino "polipeptido" indica un polfmero de restos de aminoacido unidos por enlaces peptfdicos, tanto si se producen de forma natural como sintetica. Los polipeptidos de menos de aproximadamente 20 restos de aminoacido se pueden denominar "peptidos". Los polipeptidos de mas de 100 restos de aminoacido o agregados covalentes y no covalentes que comprenden mas de un polipeptido se pueden denominar "protefnas". Los polipeptidos pueden comprender componentes que no son aminoacidos, tales como grupos carbohidrato. Los componentes que no son aminoacidos se pueden anadir al polipeptido por la celula en la que se produce el polipeptido, y pueden variar con el tipo de celula. Los polipeptidos se definen en el presente documento en terminos de su secuencia de aminoacidos en la direccion del extremo N al C. Las adiciones a estos, tales como los grupos carbohidrato, generalmente no se especifican, pero sin embargo puede estar presentes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La expresion "ADN heterologo" o "polipeptido heterologo" indica una molecula de ADN o un polipeptido, o una poblacion de moleculas de ADN o una poblacion de polipeptidos, que no existen de forma natural dentro de una celula dada. Las moleculas de ADN heterologas para una celula particular pueden contener ADN derivado de la especie de la celula (es decir, ADN endogeno) siempre que el ADN se combine con el ADN que no es del huesped (es decir, ADN exogeno). Por ejemplo, una molecula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es de la celula, por ejemplo, que codifica un polipeptido, enlazado de forma funcional a un segmento de ADN de la celula, por ejemplo, que comprende un promotor, se considera que es una molecula de ADN heterologo. Asimismo, una molecula de ADN heterologo puede comprender un gen estructural endogeno enlazado de forma funcional a un promotor exogeno. Un polipeptido codificado por una molecula de ADN heterologo es un polipeptido "heterologo".
La expresion "plasmido de expresion" indica un acido nucleico que comprende al menos un gen estructural que codifica un polipeptido que se va a expresar. Tfpicamente, un plasmido de expresion comprende una unidad de propagacion de plasmido procariota, que incluye un origen de replicacion y un marcador de seleccion, por ejemplo, para E. coli, un marcador de seleccion eucariota y uno o mas casetes de expresion para la expresion del (de los) gen(es) estructural(es) de interes, que comprende cada uno, a su vez, un promotor, al menos un gen estructural y un terminador de la transcripcion que incluye una senal de poliadenilacion. La expresion genica se pone normalmente bajo el control de un promotor, y dicho gen estructural debe estar "enlazado de forma funcional a" el promotor. Similarmente, un elemento regulador y un promotor central estan enlazados de forma funcional si el elemento regulador modula la actividad del promotor central.
La expresion "polipeptido aislado" indica un polipeptido que esta esencialmente libre de componentes celulares asociados, tales como carbohidratos, lfpidos u otras impurezas protefnicas o no protefnicas, que no estan asociadas covalentemente al polipeptido. Tfpicamente, una preparacion de un polipeptido aislado contiene en, ciertos modos de realizacion, el polipeptido en una forma altamente purificada, es decir, al menos aproximadamente un 80 % pura, al menos aproximadamente un 90 % pura, al menos aproximadamente un 95 % pura, superior a un 95 % pura o superior a un 99 % pura. Una forma de mostrar que una preparacion de protefna particular contiene un polipeptido aislado es por la aparicion de una unica banda despues de electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio- poliacrilamida (SDS-page) de la preparacion y tincion con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el termino "aislado" no excluye la presencia del mismo polipeptido en formas ffsicas alternativas, tales como dfmeros o, de forma alternativa, formas glucosiladas o derivatizadas.
Las inmunoglobulinas, en general, estan asignadas a cinco clases diferentes: IgA (inmunoglobulina de clase A), IgD, IgE, IgG e IgM. Entre estas clases, las inmunoglobulinas se diferencian en su estructura y/o secuencia de aminoacidos global, pero tienen los mismos elementos estructurales. Las inmunoglobulinas completas estan constituidas por dos pares de cadenas de polipeptido, que comprende, cada una, una cadena de polipeptido ligera de inmunoglobulina (abreviado: cadena ligera) y una cadena de polipeptido pesada de inmunoglobulina (abreviado: cadena pesada). A su vez, las cadenas comprenden una region variable y una region constante. En una cadena ligera ambas regiones consisten en un dominio, mientras que en una cadena pesada la region variable consiste en un dominio y la region constante comprende hasta cinco dominios (en la direccion del extremo N al C): el dominio Ch1, opcionalmente el dominio de region bisagra, el dominio Ch2, el dominio Ch3 y opcionalmente el dominio Ch4. Una inmunoglobulina se puede diseccionar en una region Fab y una Fc. La cadena ligera entera, el dominio variable de la cadena pesada y el dominio Ch1 se denominan region Fab (region de union al antfgeno del fragmento). La region Fc comprende el dominio Ch2, Ch3 y opcionalmente Ch4.
Como se usa en el presente documento, el termino "inmunoglobulina" indica una protefna que consiste en uno o mas polipeptidos. Los genes de inmunoglobulina codificantes incluyen los diferentes genes de la region constante, ademas de los innumerables genes de la region variable de inmunoglobulina. El termino "inmunoglobulina" comprende, en un modo de realizacion, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, tales como una cadena pesada aislada o una region constante de la cadena pesada, ademas de polipeptidos de fusion que comprenden al menos un dominio Ch2 de la cadena pesada de inmunoglobulina. En un modo de realizacion del procedimiento, como se informa en el presente documento, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina completa, en otro modo de realizacion la inmunoglobulina es una region Fc de una inmunoglobulina completa. En otro modo de realizacion, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina.
La expresion "fragmento de inmunoglobulina" indica un polipeptido que comprende al menos el dominio Ch2 de una cadena pesada delta, epsilon o alfa de inmunoglobulina y/o el dominio Ch3 de una cadena pesada epsilon o delta de inmunoglobulina. Tambien estan englobados derivados y variantes de los mismos en los que el motivo de N- glucosilacion Asn-Xaa-Ser/Thr en el dominio Ch2 o Ch3 no esta cambiado.
La expresion "conjugado de inmunoglobulina" indica un polipeptido que comprende al menos el dominio Ch2 de una cadena pesada delta, epsilon o alfa de inmunoglobulina y/o el dominio Ch3 de una cadena pesada epsilon o delta de inmunoglobulina fusionado con un polipeptido que no es de inmunoglobulina. En el mismo, el motivo de N- glucosilacion Asn-Xaa-Ser/Thr en el dominio Ch2 o Ch3 no esta cambiado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los oligosacaridos unidos a Asn297 (IgG, IgE) o Asn263 (IgA) de un dominio Ch2 y/o a Asn394, Asn445 o Asn496 (IgE, IgD) de un dominio Ch3 de una cadena pesada de inmunoglobulina tienen una estructura biantenaria (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394), es decir, consisten en una estructura central de
Man(a1 -4)GlcNAc(pi-4)GlcNAc^Asn
con un enlace Fuc(a1-6) opcional en el resto GlcNAc terminal. Dos brazos externos estan conectados a la manosa terminal de la estructura central que tiene la formula
Gal(p1-4)GlcNAc(p1-2)Man(a1-6)^Man, y Gal(p1-4)GlcNAc(p1-2)Man(a1-3)^Man,
en la que los restos de galactosa terminales son opcionales (Man = manosa, GlcNAc = N-acetil-glucosa, Gal = galactosa; Fuc = fucosa).
Tabla 1: Sitios de glucosilacion de inmunoglobulinas.
- clase de inmunoglobulina
- resto al que se puede unir una glucoestructura
- IgG
- Asn 297
- IgE
- Asn 255, Asn 297, Asn 361, Asn 371, Asn 394
- IgA
- Asn 263, Asn 459
- IgD
- Asn 445, Asn 496
- IgM
- Asn 395
La expresion "la cantidad de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la cantidad de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina" indica la suma de las cantidades de los diferentes oligosacaridos biantenarios heterogeneos N-unidos a una asparagina (Asn) de una inmunoglobulina. La isoforma G(2) tiene un resto de galactosa terminal en cada uno de los brazos externos de la estructura de oligosacarido, la isoforma G(1) posee solo un resto de galactosa en cualquiera del brazo externo unido (a1-6) o (a1- 3) y la isoforma G(0) no posee resto de galactosa en ninguno de los brazos externos.
La expresion "glucoestructura de manosa-5" indica una estructura de oligomanosa unida a un resto de Asn de un polipeptido que comprende o que consiste en cinco restos de manosa y dos restos centrales de N-acetilglucosa, que forman una estructura triantenaria.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:
a) cultivar una celula eucariota, preferentemente una celula de mamffero, que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican la inmunoglobulina en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor inferior a un 80 % y superior a un 20 % de la cantidad que se podrfa ser utilizar como maximo por las celulas eucariotas en el cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentacion de glucosa limitada, y
b) recuperar la inmunoglobulina de la celula o el medio de cultivo y producir de ese modo una inmunoglobulina.
Con este procedimiento se obtiene una inmunoglobulina que comprende como maximo un 10 % de una inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5. El 10 % se calcula basandose en la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5, la cantidad de la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la cantidad de la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la cantidad de la isoforma G(2) de la inmunoglobulina.
Las expresiones "grado de limitacion de glucosa" y su abreviatura "DGL", que se pueden usar indistintamente en el presente documento, indican la proporcion de la tasa de consumo de glucosa especffica existente de una celula individual en un cultivo con respecto a la tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida de la celula individual o una celula individual del mismo tipo. El grado de limitacion de glucosa se define como
qGIc
DGL =...................
qGlCmji
con qGlc = tasa de consumo de glucosa especffica existente de una celula individual;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
qGlOmax = tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida para esta celula individual o una celula individual del mismo tipo.
El DGL puede variar entre DGLmantenimiento y 1 por lo que DGLmantenimiento (< 1 y > 0) indica limitacion del crecimiento completa y 1 indica ausencia de limitacion o exceso de glucosa completo.
La introduccion de glucoestructuras en polipeptidos, por ejemplo, inmunoglobulinas, es una modificacion postraduccional. Debido a la incompletitud del procedimiento de glucosilacion de la celula respectiva, cada polipeptido expresado se obtiene con un patron de glucosilacion que comprende diferentes glucoestructuras. Por tanto, un polipeptido se obtiene de una celula que lo expresa en forma de una composicion que comprende formas glucosiladas de forma diferente del polipeptido, es decir, con la misma secuencia de aminoacidos. La suma de las glucoestructuras individuales se indica como el patron de glucosilacion que comprende, por ejemplo, polipeptidos con glucoestructuras completamente ausentes, glucoestructuras procesadas de forma diferente y/o glucoestructuras compuestas de forma diferente.
Una glucoestructura es la glucoestructura de manosa-5 (tambien indicada como de alta manosa, Man5, M5 u oligo- manosa). Se ha informado que la fraccion de polipeptidos producidos de forma recombinante con la glucoestructura de manosa-5 aumenta con tiempo de cultivo prolongado o en condiciones de privacion de glucosa (Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735; Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534).
Se ha encontrado que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion de un polipeptido producido por una celula eucariota se puede modificar basandose en la cantidad de glucosa proporcionada a la celula en el procedimiento de cultivo. Se ha encontrado que reduciendo la cantidad de glucosa, es decir, cambiando el valor de DGL de 1,0 a valores mas pequenos de, por ejemplo, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4 o 0,2, se puede lograr una modificacion en la cantidad de glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion. En un modo de realizacion, el valor de DGL se mantiene constante a un valor dentro de un intervalo, tal como de 0,8 a 0,2, o de 0,6 a 0,4. Es decir, la produccion de un polipeptido, en un modo de realizacion de una inmunoglobulina, se puede realizar en condiciones en las que esta disponible una cantidad de glucosa limitada para la celula cultivada para obtener el polipeptido con una cantidad definida de la glucoestructura de manosa-5 en el patron de glucosilacion. Se ha encontrado que un cultivo con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo de un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede ser utiliza como maximo por las celulas por unidad de tiempo, en un modo de realizacion cultivando exponencialmente las celulas, es decir, con un DGL de 0,8 o menos, proporciona un polipeptido con un patron de glucosilacion en el que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 esta cambiada en comparacion con un cultivo con un DGL de 1,0. En un modo de realizacion, la densidad celular es la densidad de celulas viables. Adicionalmente, se aumenta el rendimiento de polipeptido obtenido.
La expresion "la cantidad de glucosa que se puede ser utiliza como maximo por la celula por unidad de tiempo" indica la cantidad de glucosa que se consume o utiliza o metaboliza como maximo por unidad de tiempo por una celula individual en condiciones de crecimiento optimas en la fase de crecimiento exponencial en un cultivo sin ninguna limitacion de nutrientes. Por tanto, la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo se puede determinar determinando la cantidad de glucosa que se metaboliza por unidad de tiempo por una celula en condiciones de crecimiento optimas en la fase de crecimiento exponencial en un cultivo sin ninguna limitacion de nutrientes. Un aumento adicional de la cantidad disponible de glucosa no aumentara adicionalmente, es decir, cambiara, la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo. Esta cantidad define el nivel maximo de consumo de glucosa de una celula individual. Esto no indica que una version modificada geneticamente de la celula no pueda tener un nivel maximo, incluso mas alto, de consumo de glucosa. De forma alternativa, la cantidad de glucosa que se puede ser utiliza como maximo por la celula por unidad de tiempo se puede determinar basandose en los cultivos previos y los datos sometidos a control.
El procedimiento, como se informa en el presente documento, es particularmente simple de llevar a cabo, asociado a un esfuerzo mfnimo de medicion y control, y particularmente economico.
Sin restricciones, por ejemplo, suministro de nutrientes insuficiente, las celulas cultivadas crecen y consumen nutrientes a tasas maximas de una manera poco rentable. Uno de los nutrientes de medio de cultivo consumido es la glucosa, que se metaboliza por las celulas cultivadas para producir energfa y elementos estructurales para el metabolismo de las celulas. En presencia de un exceso de glucosa, el metabolismo de la celula esta funcionando a la maxima tasa de recambio para la glucosa. La cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo se puede determinar, por ejemplo, a partir del consumo de glucosa de celulas en crecimiento exponencial en presencia de un exceso de glucosa cultivadas con o en las mismas condiciones de cultivo que tambien se usaran en el cultivo con glucosa limitada, es decir, con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo que es mas pequena que la que se puede utilizar por la celula. Esta cantidad maxima se puede calcular facilmente determinando la densidad celular y la concentracion de glucosa al principio y al final de un intervalo de tiempo fijo. El valor normalmente esta en un intervalo de 0,006 a 190 mmol/hora/109 celulas (Baker, K.N., et al., Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 188-202; documento WO 98/41611; Muthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334; documento WO 2004/048556). En un modo de realizacion, la qGlcmax es aproximadamente 0,142 mmol/hora/109 celulas en condiciones de procedimiento estandar a pH 7,0.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El procedimiento, como se informa en el presente documento, se realiza en condiciones en las que la cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo se mantiene constante y a un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo (0,8 > DGL > 0), en un modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante y a un 60 % o menos (0,6 > DGL > 0), en otro modo de realizacion a un 50 % o menos (0,5 > DGL > 0) y en otro modo de realizacion adicional a aproximadamente un 40 %. El termino "aproximadamente", como se usa dentro de la presente solicitud, indica que el valor no es un valor exacto, es simplemente el punto central de un intervalo en el que el valor puede variar hasta un 10 %, es decir, la expresion "aproximadamente un 40 %" indica un intervalo de un 44 % a un 36 % (DGL = 0,44 - 0,36).
En un modo de realizacion, el cultivo es con una cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo que se mantiene constante en un intervalo entre un 80 % y un 10 % de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula por unidad de tiempo (0,8 > DGL > 0,1). En otro modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre un 60 % y un 10 % (0,6 > DGL > 0,1). En otro modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre un 50 % y un 10 % (0,5 > DGL > 0,1). En otro modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene constante en un intervalo entre un 45 % y un 20 % (0,45 > DGL > 0,2). En tambien un modo de realizacion, la cantidad de glucosa disponible se mantiene entre un 80 % y un 60 % (0,8 > DGL > 0,6).
En un modo de realizacion, el procedimiento comprende la etapa de cultivar la celula en condiciones en las que el DGL se mantiene constante y a un valor de aproximadamente 0,4, por lo que el cultivo comprende empezar con un DGL entre 1,0 y 0,5, reducir el DGL a un valor de aproximadamente 0,4, y mantener el DGL constante despues de esto. En un modo de realizacion, reducir el DGL esta dentro de un periodo de tiempo de 100 horas. La expresion "mantener el DGL constante" y equivalentes gramaticales de la misma indican que el valor de DGL se mantiene durante un periodo de tiempo, es decir, la variacion del valor de DGL esta dentro de un 10 % del valor (vease, por ejemplo, la figura 2).
La inmunoglobulina se recupera despues de la produccion, directamente o despues de la disgregacion de la celula. La inmunoglobulina recuperada se purifica, en un modo de realizacion, con un procedimiento conocido para un experto en la tecnica. Diferentes procedimientos estan bien establecidos y se usan de forma generalizada para la purificacion de protefnas, tales como cromatograffa de afinidad con protefnas microbianas (por ejemplo, cromatograffa de afinidad con protefna A o protefna G), cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, intercambio cationico (resinas de carboximetilo), intercambio anionico (resinas de aminoetilo) e intercambio en modo mixto), adsorcion tiofila (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatograffa de interaccion hidrofoba o de adsorcion aromatica (por ejemplo, con fenil-Sepharose, resinas aza-arenofilas, o acido m- aminofenilboronico), cromatograffa de afinidad por quelatos metalicos (por ejemplo, con material de afinidad por Ni(II) y Cu(II)), cromatograffa de exclusion por tamano y procedimientos electroforeticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
Por ejemplo, un procedimiento de purificacion para las inmunoglobulinas, en general, comprende una parte cromatografica de multiples etapas. En la primera etapa, los polipeptidos que no son inmunoglobulina se separan de la fraccion de inmunoglobulina por una cromatograffa de afinidad, por ejemplo, con protefna A o G. Despues de esto, por ejemplo, se puede realizar cromatograffa de intercambio ionico para separar las clases de inmunoglobulina individuales y para eliminar las trazas de protefna A, que ha coeluido de la primera columna. Finalmente, se emplea una etapa cromatografica para separar monomeros de inmunoglobulina de multfmeros y fragmentos de la misma clase.
Los procedimientos cromatograficos generales y su uso son conocidos para un experto en la tecnica. Veanse, por ejemplo, Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5.a edicion, Parte A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, Pafses Bajos, (1998); Poole, C. F. y Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); o Ausubel, F. M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1990).
En un modo de realizacion, la inmunoglobulina recuperada se caracteriza por la cantidad de la inmunoglobulina que tiene una glucoestructura de manosa-5 con respecto a la cantidad de una poblacion, que es la suma de la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5, la isoforma G(0) de la inmunoglobulina, la isoforma G(1) de la inmunoglobulina y la isoforma G(2) de la inmunoglobulina. Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, la cantidad de la inmunoglobulina con una glucoestructura de manosa-5 es, en un modo de realizacion, un 10 % o menos de la poblacion, en otro modo de realizacion, un 8 % o menos de la poblacion, y en otro modo de realizacion, un 6 % o menos de la poblacion.
El procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede realizar, en ciertos modos de realizacion, como cultivo continuo, como cultivo semicontinuo o como combinacion de los mismos, por ejemplo, empezando
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
como cultivo semicontinuo con paso posterior a un cultivo continuo. Adicionalmente, el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede realizar de diferentes formas. Por ejemplo, en un modo de realizacion, antes del cultivo en condiciones con un valor de DGL inferior a 1,0, es decir, por ejemplo, en condiciones en las que la cantidad disponible de glucosa es de un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por la celula en el cultivo por unidad de tiempo, el cultivo es con un exceso de glucosa, es decir, un valor de DGL de 1,0. En otro modo de realizacion, el cultivo se inicia con una cantidad de glucosa igual a la contenida en medios de cultivo estandar, por ejemplo, entre 1 y 10 g/l de medio de cultivo, por ejemplo, para obtener una densidad celular predeterminada, por ejemplo, en un modo de realizacion, de 105 celulas/ml. En otro modo de realizacion, el inicio del cultivo es en presencia de una cantidad en exceso de glucosa, es decir, un DGL de 1,0, y se anade una cantidad de glucosa por unidad de tiempo, que es de un 80 % o menos de la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por unidad de tiempo por las celulas en el cultivo. En otro modo de realizacion, la alimentacion empieza una vez la cantidad de glucosa presente en el medio de cultivo ha disminuido a o por debajo de un valor prefijado en el cultivo. En los dos ultimos casos, la cantidad de glucosa disponible en el cultivo se reduce por el metabolismo de las celulas en el cultivo.
En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa que esta disponible o se anade por unidad de tiempo y que es inferior a la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo, se mantiene al mismo valor, es decir, constante, en el procedimiento, como se informa en el presente documento. Por ejemplo, si esta disponible una cantidad de un 50 % de la cantidad de glucosa que se puede ser utilizar como maximo por unidad de tiempo, esta cantidad esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza una alimentacion de glucosa limitada. Tiene que senalarse que este valor es un valor relativo. Sin embargo, segun cambia la densidad de celulas viables durante el cultivo (es decir, aumenta al principio, alcanza un maximo y disminuye despues de esto otra vez), cambia en consecuencia la cantidad absoluta de glucosa disponible, ya que es un valor relativo que depende de la densidad de celulas viables absoluta. Como el valor relativo se mantiene constante (es decir, por ejemplo, a un 80 %), pero cambia el valor de referencia absoluto (es decir, por ejemplo, aumentando la densidad de celulas viables), tambien cambia el valor absoluto relativo (es decir, tambien esta aumentando el 80 % de un valor creciente).
La expresion "por unidad de tiempo" indica un intervalo fijo de tiempo, tal como 1 minuto, 1 hora, 6 horas, 12 horas o 24 horas. En un modo de realizacion, la unidad de tiempo es 12 horas o 24 horas. La expresion "cantidad de glucosa disponible por unidad de tiempo", como se usa dentro de la presente solicitud, indica la suma de 1) la cantidad de glucosa contenida en el medio de cultivo de un cultivo al principio de un intervalo de tiempo fijo y 2) la cantidad de glucosa anadida, es decir, alimentada, durante la unidad de tiempo. Por tanto, se anade una cantidad de glucosa al medio de cultivo celular, por ejemplo, al recipiente de cultivo, lo que aumenta la cantidad de glucosa en el medio de cultivo al principio del intervalo de tiempo fijo a la cantidad predeterminada. Esta cantidad de glucosa se puede anadir, por ejemplo, como un solido, disuelta en agua, disuelta en un tampon o disuelta en un medio nutritivo, por lo que el agua y el tampon no deben contener glucosa. La cantidad de glucosa que va a anadirse se corresponde con la cantidad de glucosa que va a estar disponible reducida por la cantidad de glucosa presente en el medio en el recipiente de cultivo. El procedimiento de anadir la cantidad de glucosa se puede realizar como una unica adicion y tambien como una adicion multiple de pequenas fracciones iguales, o como una adicion continua durante una unidad de tiempo como se describe anteriormente.
El procedimiento, como se informa en el presente documento, es adecuado para cualquier tipo de cultivo y cualquier escala de cultivo. Por ejemplo, en un modo de realizacion, el procedimiento se usa para procedimientos continuos o semicontinuos; en otro modo de realizacion, el volumen de cultivo es de 100 ml a 50.000 l, en otro modo de realizacion de 100 l a 10.000 l. El procedimiento, como se informa en el presente documento, es util para la produccion de inmunoglobulinas con un 10 % o menos, o un 8 % o menos, o un 6 % o menos de la inmunoglobulina que tiene una glucoestructura de manosa-5. En un modo de realizacion, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina G o E. El procedimiento, como se informa en el presente documento, comprende una celula eucariota, en la que la celula comprende, a su vez, un acido nucleico que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma y un acido nucleico que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. La celula eucariota se selecciona, en un modo de realizacion, de celulas CHO, celulas NS0, celulas BHK, celulas de hibridoma, celulas PER.C6®, celulas Sp2/0, celulas HEK y celulas de insecto.
Un experto en la tecnica esta familiarizado con composiciones y componentes de medios, ademas de con concentraciones de nutrientes requeridas por diferentes celulas para el crecimiento optimo, ademas de la cantidad de glucosa, y elegira un medio apropiado para el cultivo de la celula (vease, por ejemplo, Mather, J.P., et al., en Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2 (1999) 777-785).
En un modo de realizacion, la cantidad de glucosa que tiene que estar disponible para las celulas en un cultivo de acuerdo con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se calcula multiplicando la densidad de celulas viables, que se puede lograr normalmente en el recipiente de cultivo en un cierto momento temporal del cultivo, con el volumen del recipiente de cultivo y la cantidad de glucosa que se puede utilizar como maximo por las celulas en crecimiento exponencial por unidad de tiempo y por el DGL previsto. En mas detalle, del transcurso de la concentracion de glucosa en el cultivo y el transcurso de la densidad celular en el cultivo antes del momento temporal exacto se predice el transcurso futuro de la concentracion de glucosa y la densidad celular. Con esta
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
prediccion se calcula la cantidad de glucosa que tiene que anadirse al cultivo para lograr el DGL previsto, con la siguiente formula:
(glucosa que se va a anadir [pg de glucosa/ml/h]) =
(densidad celular existente [celulas/ml]) x
(tasa maxima de consumo de glucosa de la celula [pg de glucosa/celula/h]) x (valor de DGL) -
cantidad de glucosa presente en el medio en el recipiente de cultivo.
En un modo de realizacion, el valor de pH del cultivo esta entre pH 6,5 y pH 7,8. En otro modo de realizacion, el valor de pH esta entre pH 6,9 y pH 7,3. En otro modo de realizacion, el valor de pH esta entre pH 7,0 y 7,2. Se ha encontrado, como se expone brevemente en el ejemplo 1 que, en combinacion con una alimentacion de glucosa limitada con un valor de pH de 7,0 en el procedimiento de alimentacion constante, el contenido de M5 se puede regular de manera eficaz a valores definidos, es decir, inferiores a un 8 %, en comparacion con un valor de pH de 7,2. En los cultivos en el procedimiento semicontinuo a valores de pH de 7,0 o 7,2, respectivamente, se encontro que con el procedimiento de control de DGL el contenido de M5 podrfa regularse para ser inferior a un 5,5 %. Se ha encontrado que con una reduccion del valor de pH del cultivo se puede recorrer un aumento de la cantidad de M5 debido a la reduccion del valor de DGL.
El cultivo se realiza, en un modo de realizacion, a una temperatura entre 27 °C y 39 °C, en otro modo de realizacion, entre 35 °C y 37,5 °C.
Con el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede producir cualquier polipeptido que contiene una glucoestructura, tal como inmunoglobulinas, interferones, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, activador de plasminogeno, eritropoyetina y similares.
El cultivo en el procedimiento, como se informa en el presente documento, se puede realizar usando cualquier dispositivo de cultivo agitado o removido para el cultivo de celulas de mamffero, por ejemplo, un dispositivo de cultivo en tanque de tipo fermentador, un dispositivo de cultivo de tipo columna de aire, un dispositivo de cultivo de tipo matraz de cultivo, un dispositivo de cultivo de tipo matraz de agitacion, un dispositivo de cultivo de tipo microportador, un dispositivo de cultivo de tipo lecho fluidizado, un dispositivo de cultivo de tipo fibra hueca, un dispositivo de cultivo de tipo botella rotatoria o un dispositivo de cultivo de tipo lecho compacto.
El procedimiento, como se informa en el presente documento, se realiza, en un modo de realizacion, durante hasta 15 dfas. En otro modo de realizacion, el cultivo es durante 6 a 15 dfas. En un modo de realizacion, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.
El procedimiento, como se informa en el presente documento, se ejemplifica con un anticuerpo contra el receptor de interleucina-6 humana como se informa, por ejemplo, en los documentos EP 0 409 607, EP 0 628 639, US 5.670.373 o US 5.795.965 (incorporados por la presente por referencia en su totalidad) ya que este anticuerpo y la lfnea celular que lo expresa estaban disponibles en una cantidad suficiente en el laboratorio de los presentes inventores en el momento de la invencion. Esto no pretende limitar el alcance de la invencion.
Los siguientes ejemplos y figuras estan disponibles para ayudar en el entendimiento de la presente invencion, cuyo alcance verdadero se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Descripcion de las figuras
Figura 1 Densidad de celulas viables (a) y perfiles de viabilidad celular (b) en el modo semicontinuo usando el control de DGL; cfrculo blanco: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo relleno: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado blanco: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml.
Figura 2 Transcursos de tiempo de DGL en el modo semicontinuo en la produccion de inmunoglobulina; cfrculo: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml.
Figura 3 Perfiles de alimentacion basados en DGL por el modo semicontinuo en la produccion de inmunoglobulina; cfrculos: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml.
Figura 4 Perfiles de produccion de inmunoglobulina por el modo semicontinuo en el control de DGL; cfrculos blancos: densidad celular inicial de 8 x 105 celulas/ml; triangulo relleno: densidad celular inicial de 10 x 105 celulas/ml; cuadrado blanco: densidad celular inicial de 12 x 105 celulas/ml; cfrculo pequeno relleno: procedimiento de alimentacion constante: FR = 0,02 g de glucosa/h (control)
Figura 5 Transcurso de tiempo de DGL durante un cultivo semicontinuo de una celula: rombo: alimentacion diaria de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
alimentacion unica, cuadrado: alimentacion diaria de alimentacion doble; triangulo: alimentacion de perfil de alimentacion unica; X: alimentacion de perfil de alimentacion doble.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Linea celular:
Una linea celular CHO a modo de ejemplo en la que la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 de una inmunoglobulina producida de forma recombinante se puede modificar es una linea celular CHO que comprende un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de acuerdo con los documentos EP 0 409 607 y US 5.795.965. Para el cultivo de la celula CHO recombinante se puede usar cualquier medio de cultivo, siempre que se pueda realizar la suplementacion de glucosa de acuerdo con el procedimiento de la invencion. Los medios de cultivo a modo de ejemplo son IMDM, DMEM o medio F12 de Ham o combinaciones de los mismos, que se han adaptado al procedimiento, como se informa en el presente documento, en la medida en que se adopten las proporciones de masa de los componentes del medio de cultivo con respecto a la glucosa. Asimismo, es posible excluir la glucosa del medio de cultivo y anadirla al cultivo por separado.
Cultivo:
Se cultivaron celulas CHO que expresan un anticuerpo anti-IL-6R en un recipiente de fermentacion de 1 l o 2 l. El medio de alimentacion contenfa de 15 a 40 g/l de glucosa. La glucosa se podrfa alimentar con una solucion concentrada separada que contiene, por ejemplo, 400 g/l de glucosa. El cultivo se realizo a un valor de pH en el intervalo de pH 7,0 a pH 7,2.
Determinacion de la glucoestructura:
Para el analisis del patron de glucosilacion de IgG se uso un procedimiento de acuerdo con Kondo et al. (Kondo, A., et al., Agric. Biol. Chem. 54 (1990) 2169-2170). La IgG se purifico del sobrenadante centrifugado del medio de cultivo usando una columna de protefna A a pequena escala. El oligosacarido de la IgG purificada se libero usando N-glucosidasa F (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se marco con 2-aminopiridina en el extremo reductor. El oligosacarido marcado se analizo por cromatograffa de fase inversa (HPLC). Cada pico se asigno tanto por espectrometrfa de masas como por estandares para los oligosacaridos.
Determinacion de glucosa:
La concentracion de glucosa se determino usando un analizador YSI 2700 SELECT™ (YSI, Yellow Springs, OH, EE. UU.) con un procedimiento de acuerdo con el manual del fabricante.
Determinacion de la densidad de celulas viables:
Se determino la densidad de celulas viables usando un sistema automatico de procesamiento y analisis de imagenes (CEDEX®; Innovatis, Alemania) y el procedimiento de exclusion con colorante azul de tripano.
Ejemplo 1
Efectos del control de DGL y el pH sobre la produccion de anticuerpos y el contenido de glucoestructura de manosa-5 (M5)
Se realizo una prueba usando una cepa de celulas CHO que produce anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 humana (Tocilizumab, RoACTEMRA®), que se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 2 de referencia de la publicacion de patente sin examinar japonesa n.° 99902/1996 usando el promotor del factor de elongacion humano la, como se informa en el ejemplo 10 de la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759 (correspondiente a los documentos US 5.795.965, US 5.817.790 y US 7.479.543).
En el procedimiento de alimentacion de cantidad absoluta constante, se observaron los efectos de control del pH sobre la produccion de inmunoglobulina. La tabla 2 muestra los efectos de control del pH sobre la produccion de oligosacaridos de anticuerpo y el contenido de M5 en el modo de alimentacion constante.
Tabla 2: Efectos de control del pH en el modo de ^ alimentacion de cantidad absoluta constante.
- N.°
- Muestra en [el dfa] Punto establecido de pH DGL Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%]
- 1
- 7 7,0 0,80-0,45 90,1 3,6
- 2
- 7 7,0 0,49-0,21 100 5,4
5
10
15
20
25
30
35
- N.°
- Muestra en Punto establecido de pH DGL Concentracion relativa de Contenido de M5
- [el dfa]
- anticuerpo [%] [%]
- 3
- 7 7,2 0,73-0,35 135,1 11,7
- 4
- 7 7,2 0,69-0,30 120 10,8
- 5
- 7 7,2 0,35-0,29 127 25,2
- 6
- 7 7,2 0,64-0,25 122,5 8,7
A pH 7,0, la cantidad de la glucoestructura de manosa-5 (M5) se regulo a menos de un 5,5 %. El valor de DGL disminuyo de 0,80 a 0,21 debido al cambio de densidad celular. Por otra parte, a pH 7,2, la cantidad de M5 fluctuo entre un 8,7 % y un 25,2 % y fue superior que a pH 7,0. El valor de DGL a pH 7,2 vario de 0,73 a 0,25. Ademas, en este caso, la produccion de inmunoglobulina a pH 7,2 fue superior a un 120 % (valor relativo en comparacion con pH 7,0). Una produccion mas alta de inmunoglobulina en el procedimiento de alimentacion de cantidad absoluta constante induce un contenido de M5 mas alto de mas de un 8 %. Por tanto, con un control de pH 7,0 en el procedimiento de alimentacion de cantidad absoluta constante, el contenido de M5 se podrfa regular de forma eficaz a valores mas bajos, es decir, inferiores a un 8 %, en comparacion con el procedimiento de control a pH 7,2.
El procedimiento de control de DGL (= procedimiento de alimentacion de cantidad relativa constante) tambien se uso para la produccion de inmunoglobulina por modo semicontinuo a diversos valores de pH, y se analizo el contenido de M5. La tabla 3 muestra los efectos del control de DGL despues del inicio de la alimentacion en el dfa 2-3 y del pH sobre la produccion de inmunoglobulina y el contenido de M5.
Tabla 3: Efectos del control de DGL y del pH en el modo semicontinuo.
- N.°
- Muestra en [el dfa] Punto establecido de pH DGL Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%]
- 1
- 7 7,0 0,8 102,7 2,9
- 2
- 7 7,0 0,6 96,2 2,7
- 3
- 7 7,0 0,4 100,0 3,3
- 4
- 7 7,0 0,3 91,1 3,9
- 5
- 7 7,0 0,2 83,0 4,0
- 6
- 7 7,2 0,6 100,9 4,4
- 7
- 7
- 7,2 0,4 90,1 5,3
A pH 7,0, se aplico el procedimiento de control de DGL en el intervalo de un DGL de 0,2 a 0,8. Como resultado, el contenido de M5 se regulo para ser igual o inferior a un 4,0 %. Por otra parte, a pH 7,2, el valor de DGL funciono en el intervalo de 0,4 a 0,6. En esta ocasion, el contenido de M5 se podrfa controlar para ser inferior a un 5,5 %.
Ejemplo 2
Cultivo con diferentes valores de DGL
Se realizo el cultivo de una celula CHO que comprende un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6R con diferentes valores de DGL. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 4.
Tabla 4: Efectos del valor de control DGL sobre la produccion de inmunoglobulina y el contenido de M5.
- N.°
- Muestra en [el dfa] DGL Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%] Contenido de G(0) [%] Contenido de G(1) [%] Contenido de G(2) [%]
- 1
- 7 0,6-0,5 107,3 3,5 38,4 46,7 11,4
- 2
- 7 0,4 111,0 3,5 38,8 46,9 10,8
- 3
- 7 0,2 111,5 4,5 40,1 45,2 10,1
- 4
- 8 alimentacion constante 100,0 5,9 43,8 42,0 8,3
En comparacion con una alimentacion constante, la estrategia de DGL controlado con un valor de DGL de 0,4 a 0,6 muestra un contenido de manosa-5 reducido.
Ejemplo 3
Cultivo con diferentes estrategias de alimentacion
El cultivo de una celula CHO que comprende un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6R se realizo con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
un valor de DGL, pero con diferentes estrategias de alimentacion. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 5.
Tabla 5: Efectos de la estrategia de alimentacion sobre la viabilidad y densidad de celulas viables.
- N.°
- Muestra despues de [h] DGL Alimentacion Ajuste Viabilidad [%] Densidad de celulas viables [x 106 celulas/ml]
- 1
- 112 0,4 unica diario 71 5,1
- 2
- 115 0,4 doble diario 75 5,8
- 3
- 115 0,4 unica perfil 73 4,9
- 4
- 115 0,4 doble perfil 70 5,1
En los experimentos de alimentacion unica se uso una unica alimentacion que contenfa todos los nutrientes y glucosa. En los experimentos de alimentacion doble se usaron dos alimentaciones: la primera alimentacion contiene todos los nutrientes y glucosa a una baja concentracion de 15 g/l y la segunda alimentacion contiene una alta concentracion de glucosa. Estos experimentos de alimentacion diferentes se realizaron en un conjunto con un ajuste diario de la tasa de alimentacion y en otro conjunto siguiendo un perfil predeterminado basado en el registro del desarrollo de densidad de celulas viables en cultivos anteriores. Como se puede apreciar de la tabla 5, la viabilidad y la densidad de celulas viables son comparables independientemente de la estrategia de alimentacion empleada.
Ejemplo 4
Control del grado de limitacion de glucosa (DGL) para la produccion de inmunoglobulina por el modo semicontinuo
Se inocularon celulas CHO (8,0 - 12 x 105 celulas/ml) en medio de cultivo libre de suero como se describe anteriormente. Las celulas se cultivaron a 37 °C, 98 % de humedad relativa y 10 % de atmosfera de CO2. En el cultivo semicontinuo, el medio de alimentacion que contenfa glucosa se empezo a alimentar al fermentador principal en el 2.° y 3.° dfa desde el inicio del cultivo. La estrategia de alimentacion siguio el procedimiento para controlar el grado de limitacion de glucosa (DGL) de acuerdo con la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2006/0127975 A1. El DGL se puede definir como la proporcion de la tasa de consumo de glucosa especffica observada con respecto a la tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida cuando la glucosa esta disponible libremente para estas celulas (DGL = Q(glc)/Q(glc)max, en el que Q(glc) = tasa de consumo de glucosa especffica existente observada; Q(glc)max = tasa maxima de consumo de glucosa especffica conocida para estas celulas).
La figura 1 muestra la densidad de celulas viables y los perfiles de viabilidad celular del cultivo. El DGL se controlo para estar a un valor de 0,4 - 0,5 en diversas densidades celulares como se muestra en la figura 2. Las tasas de alimentacion se cambiaron una vez o dos veces al dfa dependiendo de la densidad celular en ese momento. La figura 3 muestra los perfiles de alimentacion basados en el DGL por el modo semicontinuo. La tasa de alimentacion se cambio entre 0,8 y 1,6 ml/h dependiendo de la densidad celular. Con esta estrategia de alimentacion aplicada, se obtuvo un perfil de produccion de inmunoglobulinas como se muestra en la figura 4. Usando el tamano de inoculacion de 10 x 105 celulas/ml y 12 x 105 celulas/ml, la produccion de inmunoglobulina fue casi la misma y superior a un 120 % de la produccion de inmunoglobulina en el procedimiento de alimentacion constante en el dfa siete como se muestra en la tabla 6 (tasa de alimentacion de 0,02 g de glucosa/h). A pesar de la diferencia de un 20 % en las densidades celulares iniciales, con el procedimiento de control de DGL fue posible obtener un tftulo de inmunoglobulina aproximadamente equivalente. Ademas, cuando el tamano de inoculacion se fijo a 8,0 x 105 celulas/ml, a pesar del retardo de 20 horas desde el momento del inicio de la alimentacion, la inmunoglobulina obtenida fue superior a un 110 % (valor relativo) en el dfa siete. En estos resultados, el procedimiento de control de DGL podrfa alcanzar una produccion de inmunoglobulina estable a diversos tamanos de inoculacion.
Ejemplo 5
Los efectos del control de DGL sobre la glucoestructura de manosa-5 y la galactosilacion de oligosacaridos
De la inmunoglobulina producida por cultivo semicontinuo usando el control de DGL, se analizo el patron de glucosilacion. La tabla 6 muestra el resultado del analisis de oligosacaridos para la inmunoglobulina obtenida del cultivo semicontinuo controlado por DGL en comparacion con el procedimiento de alimentacion constante (tasa de alimentacion: 0,02 g de glucosa/h). Al tamano de inoculacion de 8,0 x 105 celulas/ml, el contenido de glucoestructura de manosa-5 (M5) fue de un 2,8 %. Al tamano de inoculacion de 10 x 105 celulas/ml y 12 x 105 celulas/ml, el contenido de M5 fue de un 4,1 % y 3,8 %, respectivamente. A todas las condiciones de cultivo, el procedimiento de control de DGL fue capaz de regular el contenido de M5 a menos de un 5,0 %.
Mientras tanto, en cada condicion, la isoforma G(0) de la inmunoglobulina y la isoforma G(2) de la inmunoglobulina se controlaron al intervalo de un 40 % a un 46 % y de un 9,0 % a un 11 %, respectivamente.
Tabla 6: Efectos del valor de control de DGL sobre la produccion de inmunoglobulina y el patron de glucosilacion.
- N.°
- Muestra en [el dfa] DGL Densidad celular de inoculacion [x 105 celulas/ml] Concentracion relativa de anticuerpo [%] Contenido de M5 [%] Contenido de G(0) [%] Contenido de G(1) [%] Contenido de G(2) [%]
- 1
- 7 alimentacion constante 10 100,0 3,5 45,7 41,5 9,2
- 2
- 7 0,4 8 112,5 2,8 41,7 44,7 10,8
- 3
- 7 0,4 10 122,6 4,1 42,9 43,1 9,8
- 4
- 7 0,4 12 127,1 3,8 45,5 41,5 9,1
Claims (11)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la produccion de una inmunoglobulina, que comprendea) cultivar una celula eucariota que comprende un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina en un medio de cultivo en el que la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo por unidad de tiempo se mantiene constante y limitada a un valor constante inferior a un 80 % y superior a un 20 % de la cantidad que se podrfa utilizar como maximo por las celulas en el medio de cultivo por unidad de tiempo, por el que esta cantidad constante esta disponible en todas las unidades de tiempo del procedimiento en el que se realiza esta alimentacion de glucosa limitada, yb) recuperar la inmunoglobulina del cultivo.
- 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el cultivo es un cultivo semicontinuo.
- 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado por que el cultivo es un cultivo semicontinuo en el que la alimentacion empieza en el dfa 2 o dfa 3 del cultivo.
- 4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el cultivo es a un valor de pH de pH 6,5 a 7,5.
- 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado por que el cultivo es a un valor de pH de pH 6,9 a 7,3.
- 6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado por que el cultivo es a un valor de pH de pH 6,95 a pH 7,05 o a un valor de pH de pH 7,15 a pH 7,25.
- 7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de clase G o clase E.
- 8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la celula huesped eucariota se selecciona del grupo que comprende celulas CHO, celulas NS0, celulas HEK, celulas BHK, celulas de hibridoma, celulas PER.C6®, celulas de insecto y celulas Sp2/0.
- 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, caracterizado por que la celula eucariota es una celula de ovario de hamster chino (CHO).
- 10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el cultivo de la celula huesped se realiza durante seis a veinte dfas.
- 11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-IL-6R.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09013455 | 2009-10-26 | ||
| EP09013455 | 2009-10-26 | ||
| PCT/EP2010/066073 WO2011051231A1 (en) | 2009-10-26 | 2010-10-25 | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2622366T3 true ES2622366T3 (es) | 2017-07-06 |
Family
ID=42060615
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10771093.1T Active ES2622366T3 (es) | 2009-10-26 | 2010-10-25 | Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada |
| ES17155939T Active ES2981683T3 (es) | 2009-10-26 | 2010-10-25 | Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES17155939T Active ES2981683T3 (es) | 2009-10-26 | 2010-10-25 | Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (8) | US20110117087A1 (es) |
| EP (3) | EP3202785B1 (es) |
| JP (7) | JP5711751B2 (es) |
| KR (8) | KR102223417B1 (es) |
| CN (2) | CN104928336B (es) |
| AU (1) | AU2010311567B2 (es) |
| BR (2) | BR112012009828B8 (es) |
| CA (1) | CA2773522C (es) |
| DK (1) | DK2493922T3 (es) |
| ES (2) | ES2622366T3 (es) |
| HR (1) | HRP20240920T1 (es) |
| HU (2) | HUE067718T2 (es) |
| IL (2) | IL218997A0 (es) |
| MX (2) | MX2012004682A (es) |
| PL (2) | PL3202785T3 (es) |
| SG (2) | SG10201510640QA (es) |
| SI (2) | SI2493922T1 (es) |
| TW (8) | TWI795722B (es) |
| WO (1) | WO2011051231A1 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2011514T3 (da) | 1997-03-21 | 2012-03-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Forebyggende eller terapeutisk middel til sensibiliserede-T-celle-medierede sygdomme omfattende IL-6-antagonist som en aktiv bestanddel |
| UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
| DE60334678D1 (de) * | 2002-02-14 | 2010-12-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antikörper enthaltende pharmazeutische lösungen |
| GB2401040A (en) * | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
| JPWO2005090405A1 (ja) | 2004-03-24 | 2008-04-17 | 中外製薬株式会社 | インターロイキン−６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ |
| PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
| ES2622366T3 (es) * | 2009-10-26 | 2017-07-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada |
| RU2013126477A (ru) | 2010-11-08 | 2014-12-20 | Дженентек, Инк. | Вводимые подкожно антитела против рецептора il-6 |
| US20150299313A1 (en) * | 2011-10-05 | 2015-10-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule for promoting clearance from plasma of antigen comprising suger chain receptor-binding domain |
| WO2014159831A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Adapted lepidopteran insect cells for the production of recombinant proteins |
| CA2913687C (en) | 2013-07-04 | 2022-12-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples |
| PT3926051T (pt) * | 2014-06-04 | 2024-06-20 | Amgen Inc | Métodos de colheita de culturas de células de mamíferos |
| AR104050A1 (es) * | 2015-03-26 | 2017-06-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Proceso de producción con iones de cobre controlados |
| WO2017038986A1 (ja) * | 2015-09-03 | 2017-03-09 | 持田製薬株式会社 | 組換えタンパク質の製造方法 |
| WO2017147169A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Ohio State Innovation Foundation | Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites |
| WO2018170405A1 (en) | 2017-03-17 | 2018-09-20 | Ohio State Innovation Foundation | Nanoparticles for delivery of chemopreventive agents |
| JP2022527972A (ja) | 2019-04-02 | 2022-06-07 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 前悪性病変を有する患者において癌を予測及び予防する方法 |
| US20230323422A1 (en) * | 2020-08-14 | 2023-10-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of making protein |
| KR102682350B1 (ko) | 2024-03-15 | 2024-07-05 | 주식회사 가미코스메틱 | 저자극성 친환경 샴푸 조성물 및 이의 제조 방법 |
Family Cites Families (188)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3926723A (en) | 1974-08-08 | 1975-12-16 | Massachusetts Inst Technology | Method of controllably releasing glucose to a cell culture medium |
| US4657863A (en) * | 1982-07-02 | 1987-04-14 | Celanese Corporation | Stabilization of a mutant microorganism population |
| JPS63502716A (ja) | 1986-03-07 | 1988-10-13 | マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー | 糖タンパク安定性の強化方法 |
| JPS62258252A (ja) | 1986-04-30 | 1987-11-10 | Koyo Seiko Co Ltd | ベルト用オ−トテンシヨナ |
| JPH066054B2 (ja) | 1987-10-15 | 1994-01-26 | 帝人株式会社 | 動物細胞の培養方法 |
| US5204244A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5202238A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US6238891B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-05-29 | Cetus Oncology Corporation | Method of increasing product expression through solute stress |
| CA1312030C (en) | 1987-11-18 | 1992-12-29 | Brian Maiorella | Method to increase antibody titer |
| US6428979B1 (en) | 1988-01-22 | 2002-08-06 | Tadamitsu Kishimoto | Receptor protein for human B cell stimulatory factor-2 |
| CA1341152C (en) | 1988-01-22 | 2000-12-12 | Tadamitsu Kishimoto | Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2 |
| US5670373A (en) | 1988-01-22 | 1997-09-23 | Kishimoto; Tadamitsu | Antibody to human interleukin-6 receptor |
| KR0132666B1 (en) | 1989-03-14 | 1998-04-14 | Hitachi Kk | Method for controlling cultivation conditions for animal cells |
| JP2998976B2 (ja) | 1989-07-20 | 2000-01-17 | 忠三 岸本 | ヒトインタ―ロイキン―６レセプターに対する抗体 |
| HUT60768A (en) | 1990-03-16 | 1992-10-28 | Sandoz Ag | Process for producing cd25 fixing molecules |
| EP0527760B1 (en) | 1990-04-03 | 1995-07-19 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for vaccination against hiv |
| US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
| GB9022545D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| DE4037325A1 (de) | 1990-11-23 | 1992-05-27 | Karl Mueller U Co Kg | Verfahren zur erzeugung von zellmasse und/oder fermentierungsprodukten unter sterilen bedingungen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| JPH05227970A (ja) | 1992-02-19 | 1993-09-07 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 |
| US5795965A (en) | 1991-04-25 | 1998-08-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reshaped human to human interleukin-6 receptor |
| DE69232535D1 (de) | 1991-06-24 | 2002-05-08 | Pacific Biomedical Res Inc | In langzeitkultur gehaltene hormon-absondernde pankreatische zellen |
| US5821121A (en) | 1991-06-24 | 1998-10-13 | Pacific Biomedical Research, Inc. | Hormone-secreting cells maintained in long-term culture |
| US5610297A (en) | 1991-12-27 | 1997-03-11 | Georgia Tech Research Corp. | Peptides ketoamides |
| US5252216A (en) * | 1992-03-24 | 1993-10-12 | Smithkline Beecham Corporation | Protein purification |
| JPH08508875A (ja) | 1992-05-01 | 1996-09-24 | 帝人株式会社 | 蛋白分泌細胞の流加回分培養法 |
| EP0567738A3 (en) | 1992-05-01 | 1995-09-06 | American Cyanamid Co | Controlling perfusion rates in continuous bioreactor culture of animal cells |
| PT752248E (pt) | 1992-11-13 | 2001-01-31 | Idec Pharma Corp | Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b |
| JPH06292592A (ja) * | 1993-02-09 | 1994-10-21 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 糖蛋白質の生産方法 |
| WO1994026087A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-11-24 | Connor Kim C O | Recombinant protein production and insect cell culture and process |
| US5888510A (en) | 1993-07-21 | 1999-03-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component |
| USH1532H (en) | 1993-11-03 | 1996-05-07 | Genetics Institute, Inc. | Adaption of mammalian cell lines to high cell densities |
| AU698975B2 (en) | 1993-11-23 | 1998-11-12 | Genentech Inc. | Kinase receptor activation assay |
| US20030108545A1 (en) | 1994-02-10 | 2003-06-12 | Patricia Rockwell | Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist |
| DE69508572T2 (de) | 1994-02-18 | 1999-07-15 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Kumamoto | Methode zur kultivierung von tierzellen |
| US5856179A (en) | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
| ATE204300T1 (de) | 1994-05-13 | 2001-09-15 | Biovation Ltd | Zielzellen-bindende chimäre peptide |
| US8017121B2 (en) * | 1994-06-30 | 2011-09-13 | Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha | Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component |
| JP3630453B2 (ja) | 1994-09-30 | 2005-03-16 | 中外製薬株式会社 | Ｉｌ−６レセプター抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞治療剤 |
| CA2203182C (en) | 1994-10-21 | 2009-11-24 | Asao Katsume | Remedy for diseases caused by il-6 production |
| ATE214602T1 (de) | 1994-12-29 | 2002-04-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Verstärker eines anti-tumoragens beinhaltend einen il-6 antagonisten |
| EP0811384B1 (en) | 1995-02-13 | 2006-06-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Muscle protein decomposition inhibitor containing il-6 receptor antibody |
| GB9506249D0 (en) * | 1995-03-27 | 1995-05-17 | Karobio Ab | Media for insect cell cultures |
| US5705364A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
| JP3596108B2 (ja) | 1995-08-30 | 2004-12-02 | 株式会社デンソー | 車両用空調装置 |
| US6087129A (en) | 1996-01-19 | 2000-07-11 | Betagene, Inc. | Recombinant expression of proteins from secretory cell lines |
| AU3276297A (en) | 1996-06-27 | 1998-01-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for myeloma to be used together with nitrogen mustard antitumor agents |
| US7147851B1 (en) | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
| EP0852951A1 (de) | 1996-11-19 | 1998-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern |
| WO1998041611A1 (en) | 1997-03-20 | 1998-09-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Process for the continuous culture of cells |
| DK2011514T3 (da) | 1997-03-21 | 2012-03-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Forebyggende eller terapeutisk middel til sensibiliserede-T-celle-medierede sygdomme omfattende IL-6-antagonist som en aktiv bestanddel |
| JP3707583B2 (ja) | 1997-06-06 | 2005-10-19 | 株式会社ブリヂストン | 金属線用ガイド |
| US20020187150A1 (en) | 1997-08-15 | 2002-12-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient |
| ES2299241T3 (es) | 1998-03-17 | 2008-05-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventivos o remedios para enfermedades intestinales inflamatorias que contienen anticuerpos antagonistas del receptor il-6. |
| DK1068241T3 (da) | 1998-04-02 | 2008-02-04 | Genentech Inc | Antistofvarianter og fragmenter deraf |
| PT1071700E (pt) | 1998-04-20 | 2010-04-23 | Glycart Biotechnology Ag | Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos |
| US6537782B1 (en) | 1998-06-01 | 2003-03-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Media for culturing animal cells and process for producing protein by using the same |
| US6406909B1 (en) * | 1998-07-10 | 2002-06-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Serum-free medium for culturing animal cells |
| EP1108435B1 (en) * | 1998-08-24 | 2007-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventives or remedies for pancreatitis containing anti-il-6 receptor antibodies as the active ingredient |
| WO2000061739A1 (fr) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Methode de regulation de l'activite d'une molecule immunologiquement fonctionnelle |
| JP2002543214A (ja) | 1999-05-04 | 2002-12-17 | エクシコン エ／エス | Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体 |
| US6338964B1 (en) | 1999-05-07 | 2002-01-15 | Bayer Corporation | Process and medium for mammalian cell culture under low dissolved carbon dioxide concentration |
| EP1212422B1 (en) | 1999-08-24 | 2007-02-21 | Medarex, Inc. | Human ctla-4 antibodies and their uses |
| US6284453B1 (en) | 1999-09-29 | 2001-09-04 | Steven Anthony Siano | Method for controlling fermentation growth and metabolism |
| JP2001101882A (ja) | 1999-09-29 | 2001-04-13 | Sony Corp | 不揮発性半導体記憶装置 |
| WO2001077140A2 (en) | 1999-10-19 | 2001-10-18 | Srienc Friederich | Measurement of nutrient uptake in cells and methods based thereon |
| GB0001448D0 (en) | 2000-01-21 | 2000-03-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
| NZ523459A (en) | 2000-05-30 | 2004-08-27 | Lactascan Aps | Method for producing lactic acid |
| US20030165502A1 (en) | 2000-06-13 | 2003-09-04 | City Of Hope | Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth |
| US20030170813A1 (en) | 2000-07-05 | 2003-09-11 | Kenichi Suga | Process for producing glycoprotein |
| JP4812228B2 (ja) | 2000-08-10 | 2011-11-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有溶液の凝集物生成または白濁抑制方法 |
| EP2311492B1 (en) * | 2000-08-11 | 2017-10-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody-containing stabilized preparations |
| GB0020685D0 (en) | 2000-08-22 | 2000-10-11 | Novartis Ag | Organic compounds |
| EP1333032A4 (en) | 2000-10-06 | 2005-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | PROCESS FOR PURIFYING ANTIBODY |
| US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
| US8703126B2 (en) | 2000-10-12 | 2014-04-22 | Genentech, Inc. | Reduced-viscosity concentrated protein formulations |
| ES2332402T5 (es) * | 2000-10-12 | 2018-05-14 | Genentech, Inc. | Formulaciones de proteína concentradas de viscosidad reducida |
| EP2351838A1 (en) | 2000-10-20 | 2011-08-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Crosslinking agonistic antibodies |
| JP4399158B2 (ja) | 2000-10-20 | 2010-01-13 | バイオニアー エイ／エス | 乳酸菌における異種遺伝子産物の製造のための改良発酵法 |
| US7320792B2 (en) * | 2000-10-25 | 2008-01-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventives or remedies for psoriasis containing as the active ingredient IL-6 antagonist |
| AU2000279625A1 (en) | 2000-10-27 | 2002-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Blood mmp-3 level-lowering agent containing il-6 antgonist as the active ingredient |
| AU2000279624A1 (en) * | 2000-10-27 | 2002-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Blooe vegf level-lowering agent containing il-6 antagonist as the active ingredient |
| DE60138127D1 (de) | 2000-11-03 | 2009-05-07 | Genentech Inc | Stoffwechseländerungen in gärungen zur produktion rekombinanter proteine |
| CA2430270A1 (en) | 2000-11-22 | 2002-05-30 | Cargill Dow Polymers, Llc | Methods and materials for the synthesis of organic products |
| MA26040A1 (fr) | 2001-01-05 | 2004-04-01 | Pfizer | Des anticorps pour recepteur i de facteur de croissance insulinique |
| CA2434626A1 (en) | 2001-01-19 | 2002-08-08 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
| JP4391086B2 (ja) | 2001-03-09 | 2009-12-24 | 中外製薬株式会社 | タンパク質精製方法 |
| EP1373547A4 (en) | 2001-03-27 | 2006-01-18 | Smithkline Beecham Corp | CONTROL OF GLYCOFORMS IN IGG |
| UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
| EP1382964A4 (en) | 2001-04-17 | 2009-06-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR TENSID QUANTIFICATION |
| KR20020088848A (ko) | 2001-05-21 | 2002-11-29 | (주)코아바이오텍 | 세포배양관 및 이를 이용한 대량 세포배양기 |
| EP1404813A4 (en) | 2001-06-13 | 2004-11-24 | Genentech Inc | METHOD FOR CULTIVATING ANIMAL CELLS AND POLYPEPTIDE PRODUCTION IN ANIMAL CELLS |
| US6750045B2 (en) | 2001-07-23 | 2004-06-15 | Zymogenetics, Inc. | Fermentation medium and method |
| EP1798242B1 (fr) | 2002-01-18 | 2013-01-23 | Pierre Fabre Medicament | Anticorps anti-IGF-IR et leurs applications |
| US7241444B2 (en) | 2002-01-18 | 2007-07-10 | Pierre Fabre Medicament | Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof |
| US7553485B2 (en) | 2002-01-18 | 2009-06-30 | Pierre Fabre Medicament | Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof |
| ES2358991T3 (es) | 2002-02-08 | 2011-05-17 | Genencor International, Inc. | Procedimientos para producir productos finales a partir de sustratos de carbono. |
| DE60334678D1 (de) | 2002-02-14 | 2010-12-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antikörper enthaltende pharmazeutische lösungen |
| CA2417689C (en) | 2002-03-05 | 2006-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved methods for growing mammalian cells in vitro |
| JP3958089B2 (ja) | 2002-03-26 | 2007-08-15 | 有限会社新世紀発酵研究所 | 嫌気性菌の連続培養法 |
| JP3822137B2 (ja) | 2002-05-20 | 2006-09-13 | 中外製薬株式会社 | 動物細胞培養用培地の添加剤およびそれを用いたタンパク質の製造方法 |
| EP2316921B1 (en) | 2002-05-24 | 2014-05-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Neutralizing human anti-IGFR antibody |
| US8142810B2 (en) | 2002-05-30 | 2012-03-27 | The Procter & Gamble Company | Dietary method for modulating glucose metabolism and associated conditions and increasing longevity |
| US7538195B2 (en) | 2002-06-14 | 2009-05-26 | Immunogen Inc. | Anti-IGF-I receptor antibody |
| JP2005531326A (ja) | 2002-07-03 | 2005-10-20 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | パントテン酸の高生産のための微生物及び方法 |
| EP1660667A4 (en) | 2002-07-03 | 2011-01-05 | Basf Se | MICRO-ORGANISMS AND PROCESSES FOR IMPROVED PRODUCTION OF PANTOTHENATE |
| CN1470632A (zh) | 2002-07-25 | 2004-01-28 | 谢良志 | 一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法 |
| KR101119448B1 (ko) | 2002-09-11 | 2012-03-15 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 단백질 정제 방법 |
| US20040209930A1 (en) | 2002-10-02 | 2004-10-21 | Carboni Joan M. | Synergistic methods and compositions for treating cancer |
| US7550262B2 (en) | 2002-11-05 | 2009-06-23 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | PTPN11 (SHP-2) mutations and cancer |
| DE10255508A1 (de) * | 2002-11-27 | 2004-06-17 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Kultivierung von Zellen zur Produktion von Substanzen |
| PL222220B1 (pl) | 2003-01-22 | 2016-07-29 | Glycart Biotechnology Ag | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
| EP1596885A2 (en) | 2003-02-13 | 2005-11-23 | Pfizer Products Inc. | Uses of anti-insulin-like growth factor i receptor antibodies |
| HRP20050837A2 (en) | 2003-02-24 | 2005-12-31 | Keio University Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedy for spinal injury containing interleukin-6 antagonists |
| CA2518980A1 (en) | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Pharmacia Corporation | Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers |
| US7378503B2 (en) | 2003-04-02 | 2008-05-27 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof |
| US20050158303A1 (en) | 2003-04-04 | 2005-07-21 | Genentech, Inc. | Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations |
| HRP20050934B1 (hr) | 2003-04-04 | 2014-09-26 | Genentech, Inc. | Formulacije s visokom koncentracijom antitijela i proteina |
| GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
| JP2007535895A (ja) | 2003-05-01 | 2007-12-13 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | ヒトインシュリン様成長因子−１受容体に対する完全ヒト抗体 |
| EP1623019B2 (en) * | 2003-05-15 | 2017-01-25 | Wyeth LLC | Restricted glucose feed for animal cell culture |
| AR046071A1 (es) | 2003-07-10 | 2005-11-23 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos |
| JP4638870B2 (ja) | 2003-08-13 | 2011-02-23 | ファイザー・プロダクツ・インク | 修飾ヒトｉｇｆ−１ｒ抗体 |
| GB0321100D0 (en) | 2003-09-09 | 2003-10-08 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
| AR045614A1 (es) | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos contra el recepctor de la interleuquina- 1 y los usos de los mismos |
| BRPI0415505A (pt) | 2003-10-17 | 2006-12-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | agente terapêutico para mesotelioma |
| FR2861080B1 (fr) | 2003-10-20 | 2006-02-17 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps presentant un taux de fucose et de galactose optimise |
| WO2005058967A2 (en) | 2003-12-16 | 2005-06-30 | Pierre Fabre Medicament | Novel anti-insulin/igf-i hybrid receptor or anti-insulin/igf-i hybrid receptor and igf-ir antibodies and uses thereof |
| AR048210A1 (es) | 2003-12-19 | 2006-04-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Un agente preventivo para la vasculitis. |
| US8617550B2 (en) | 2003-12-19 | 2013-12-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist |
| ES2368741T3 (es) | 2004-02-25 | 2011-11-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Inhibidores del receptor 1 del factor de crecimiento de tipo insulina para inhibir el crecimiento de células tumorales. |
| AR048335A1 (es) * | 2004-03-24 | 2006-04-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo |
| JPWO2005090405A1 (ja) | 2004-03-24 | 2008-04-17 | 中外製薬株式会社 | インターロイキン−６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ |
| EP1742660A2 (en) | 2004-04-16 | 2007-01-17 | Genentech, Inc. | Treatment of disorders |
| MX2007000610A (es) | 2004-07-16 | 2007-03-07 | Pfizer Prod Inc | Tratamiento de combinacion para enfermedades malignas no hematologicas usando un anti-cuerpo de receptor de factor i de crecimiento de tipo anti-insulina. |
| FR2873699B1 (fr) | 2004-07-29 | 2009-08-21 | Pierre Fabre Medicament Sa | Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations |
| US7432359B2 (en) | 2004-09-06 | 2008-10-07 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | Anti-A33 antibody |
| JP4818936B2 (ja) | 2005-01-05 | 2011-11-16 | 中外製薬株式会社 | 細胞の培養方法およびその利用 |
| WO2007043641A1 (ja) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Fukuoka University | 膵島移植における移植膵島障害抑制剤 |
| KR20080068089A (ko) | 2005-10-21 | 2008-07-22 | 지티씨바이오쎄라퓨틱스,인크. | 항체 의존성 세포 독성 활성이 증강된 항체, 그 생산 및사용 방법 |
| AU2006305119B2 (en) | 2005-10-21 | 2012-12-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agents for treating cardiopathy |
| AR057582A1 (es) | 2005-11-15 | 2007-12-05 | Nat Hospital Organization | Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos |
| CA2629147A1 (en) | 2005-11-17 | 2007-05-31 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with .alpha.4.beta.7 integrin |
| US20090269335A1 (en) | 2005-11-25 | 2009-10-29 | Keio University | Therapeutic agent for prostate cancer |
| US9084777B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-07-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilized antibody-containing formulations |
| US20070190057A1 (en) | 2006-01-23 | 2007-08-16 | Jian Wu | Methods for modulating mannose content of recombinant proteins |
| CA2637917C (en) | 2006-01-27 | 2015-11-24 | Keio University | Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization |
| KR101047207B1 (ko) | 2006-03-09 | 2011-07-06 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항-약물 항체 분석 |
| BRPI0709843A2 (pt) | 2006-03-28 | 2011-07-26 | Biogen Idec Inc | anticorpos de anti-igf-1r e usos dos mesmos |
| JP5754875B2 (ja) | 2006-04-07 | 2015-07-29 | 国立大学法人大阪大学 | 筋再生促進剤 |
| US20080014203A1 (en) | 2006-04-11 | 2008-01-17 | Silke Hansen | Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof |
| US7846724B2 (en) | 2006-04-11 | 2010-12-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies |
| PL2374818T3 (pl) * | 2006-06-02 | 2013-05-31 | Regeneron Pharma | Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6 |
| JP5330829B2 (ja) | 2006-08-04 | 2013-10-30 | 憲弘 西本 | 関節リウマチ患者の治療予後予測方法 |
| WO2008036600A2 (en) | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Genentech, Inc. | Methods of protein production |
| JP4355743B2 (ja) * | 2006-12-04 | 2009-11-04 | 株式会社神戸製鋼所 | Ｃｕ合金配線膜とそのＣｕ合金配線膜を用いたフラットパネルディスプレイ用ＴＦＴ素子、及びそのＣｕ合金配線膜を作製するためのＣｕ合金スパッタリングターゲット |
| JP2010095445A (ja) | 2006-12-27 | 2010-04-30 | Tokyo Medical & Dental Univ | Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする炎症性筋疾患治療剤 |
| ES2564392T3 (es) | 2007-01-23 | 2016-03-22 | Shinshu University | Inhibidores de IL-6 para el tratamiento de rechazo crónico |
| TWI617576B (zh) * | 2007-05-21 | 2018-03-11 | 艾爾德生物控股有限責任公司 | 介白素-６（ｉｌ-６）的抗體及其等之用途 |
| EP3246045B1 (en) | 2007-07-26 | 2025-09-03 | Osaka University | Therapeutic agents for ocular inflammatory disease comprising interleukin 6 receptor inhibitor as active ingredient |
| AU2008304756B8 (en) * | 2007-09-26 | 2015-02-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-IL-6 receptor antibody |
| MX2010003139A (es) | 2007-10-02 | 2010-04-07 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para la enfermedad de injerto contra hospedero que comprenden un inhibidor del receptor de interleucina 6 como ingrediente activo. |
| JP2009092508A (ja) | 2007-10-09 | 2009-04-30 | Norihiro Nishimoto | リウマチ治療剤の効果の予測方法 |
| CN101802192A (zh) | 2007-10-15 | 2010-08-11 | 中外制药株式会社 | 抗体的制备方法 |
| GB2453939A (en) | 2007-10-22 | 2009-04-29 | Ubidyne Inc | Clockless analogue band-pass delta-sigma modulator |
| US8227195B2 (en) * | 2007-12-15 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Distinguishing assay |
| PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
| EP2271669A1 (en) | 2008-03-11 | 2011-01-12 | Genentech, Inc. | Antibodies with enhanced adcc function |
| DE102008013899A1 (de) | 2008-03-12 | 2009-09-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine bei konstantem Gehalt von pCO2 im Medium |
| US10717781B2 (en) * | 2008-06-05 | 2020-07-21 | National Cancer Center | Neuroinvasion inhibitor |
| TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
| US8323649B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-04 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to IL-6 and use thereof |
| SG178190A1 (en) | 2009-07-31 | 2012-03-29 | Shin Maeda | Cancer metastasis inhibitor |
| WO2011019622A1 (en) * | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Genentech, Inc. | Cell culture methods to make antibodies with enhanced adcc function |
| ES2622366T3 (es) | 2009-10-26 | 2017-07-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada |
| TWI505838B (zh) | 2010-01-20 | 2015-11-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Stabilized antibody solution containing |
| WO2011128096A1 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| US20130149302A1 (en) | 2010-05-28 | 2013-06-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agents for pancreatic cancer |
| ES2932398T3 (es) | 2010-05-28 | 2023-01-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Potenciador de la respuesta de las células T antitumorales |
| CN103119176A (zh) * | 2010-06-07 | 2013-05-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于预测对白介素-6受体抑制性单克隆抗体药物治疗的响应的基因表达标记 |
| WO2012059495A1 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Optimized method for antibody capturing by mixed mode chromatography |
| RU2013126477A (ru) | 2010-11-08 | 2014-12-20 | Дженентек, Инк. | Вводимые подкожно антитела против рецептора il-6 |
| JP6363017B2 (ja) | 2011-09-01 | 2018-07-25 | 中外製薬株式会社 | 限外ろ過によって高度に濃縮された抗体を含む組成物を調製するための方法 |
| AR095863A1 (es) | 2013-04-16 | 2015-11-18 | Genentech Inc | Variantes de pertuzumab, su evaluación, método de tratamiento, método de preparación y artículo de fabricación |
| CA2913687C (en) | 2013-07-04 | 2022-12-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples |
| BR112017014067B1 (pt) | 2015-02-27 | 2021-01-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6 |
| AR104050A1 (es) | 2015-03-26 | 2017-06-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Proceso de producción con iones de cobre controlados |
-
2010
- 2010-10-25 ES ES10771093.1T patent/ES2622366T3/es active Active
- 2010-10-25 US US12/911,300 patent/US20110117087A1/en not_active Abandoned
- 2010-10-25 CN CN201510397344.5A patent/CN104928336B/zh active Active
- 2010-10-25 JP JP2012535769A patent/JP5711751B2/ja active Active
- 2010-10-25 HU HUE17155939A patent/HUE067718T2/hu unknown
- 2010-10-25 KR KR1020197014924A patent/KR102223417B1/ko active Active
- 2010-10-25 WO PCT/EP2010/066073 patent/WO2011051231A1/en not_active Ceased
- 2010-10-25 SI SI201031446A patent/SI2493922T1/sl unknown
- 2010-10-25 KR KR1020167017791A patent/KR20160084500A/ko not_active Ceased
- 2010-10-25 EP EP17155939.6A patent/EP3202785B1/en active Active
- 2010-10-25 KR KR1020147016933A patent/KR101860175B1/ko active Active
- 2010-10-25 DK DK10771093.1T patent/DK2493922T3/en active
- 2010-10-25 PL PL17155939.6T patent/PL3202785T3/pl unknown
- 2010-10-25 PL PL10771093T patent/PL2493922T3/pl unknown
- 2010-10-25 KR KR1020187002776A patent/KR101985153B1/ko active Active
- 2010-10-25 EP EP24154516.9A patent/EP4406615A3/en active Pending
- 2010-10-25 KR KR1020217005775A patent/KR102319842B1/ko active Active
- 2010-10-25 SI SI201032146T patent/SI3202785T1/sl unknown
- 2010-10-25 KR KR1020197007706A patent/KR102071834B1/ko active Active
- 2010-10-25 ES ES17155939T patent/ES2981683T3/es active Active
- 2010-10-25 HR HRP20240920TT patent/HRP20240920T1/hr unknown
- 2010-10-25 HU HUE10771093A patent/HUE033758T2/en unknown
- 2010-10-25 MX MX2012004682A patent/MX2012004682A/es active IP Right Grant
- 2010-10-25 KR KR1020127013424A patent/KR101436219B1/ko active Active
- 2010-10-25 SG SG10201510640QA patent/SG10201510640QA/en unknown
- 2010-10-25 BR BR112012009828A patent/BR112012009828B8/pt active IP Right Grant
- 2010-10-25 CA CA2773522A patent/CA2773522C/en active Active
- 2010-10-25 KR KR1020177026485A patent/KR101961254B1/ko active Active
- 2010-10-25 CN CN201080048412.2A patent/CN102596995B/zh active Active
- 2010-10-25 AU AU2010311567A patent/AU2010311567B2/en active Active
- 2010-10-25 EP EP10771093.1A patent/EP2493922B1/en not_active Revoked
- 2010-10-25 BR BR122022001178-0A patent/BR122022001178B1/pt active IP Right Grant
- 2010-10-25 SG SG10201913329XA patent/SG10201913329XA/en unknown
- 2010-10-26 TW TW110102740A patent/TWI795722B/zh active
- 2010-10-26 TW TW113103122A patent/TW202444753A/zh unknown
- 2010-10-26 TW TW106123837A patent/TWI675104B/zh active
- 2010-10-26 TW TW105106225A patent/TWI670375B/zh active
- 2010-10-26 TW TW108123618A patent/TWI724448B/zh active
- 2010-10-26 TW TW111139056A patent/TWI832492B/zh active
- 2010-10-26 TW TW104124637A patent/TW201540837A/zh unknown
- 2010-10-26 TW TW099136580A patent/TWI534264B/zh active
-
2012
- 2012-04-02 IL IL218997A patent/IL218997A0/en unknown
- 2012-04-20 MX MX2019000097A patent/MX2019000097A/es unknown
-
2015
- 2015-02-26 JP JP2015036676A patent/JP5982024B2/ja active Active
- 2015-09-03 US US14/844,570 patent/US10501769B2/en active Active
-
2016
- 2016-07-27 JP JP2016147229A patent/JP6385988B2/ja active Active
-
2018
- 2018-08-07 JP JP2018148327A patent/JP2019001796A/ja active Pending
- 2018-12-20 IL IL263849A patent/IL263849A/en unknown
-
2019
- 2019-11-13 US US16/682,401 patent/US20200080125A1/en not_active Abandoned
- 2019-12-20 JP JP2019230063A patent/JP7083802B2/ja active Active
-
2020
- 2020-02-13 US US16/790,177 patent/US11021728B2/en active Active
-
2021
- 2021-04-28 US US17/243,309 patent/US11136610B2/en active Active
- 2021-08-20 US US17/407,758 patent/US11377678B2/en active Active
-
2022
- 2022-05-24 US US17/752,074 patent/US20220282298A1/en not_active Abandoned
- 2022-06-01 JP JP2022089545A patent/JP2022116264A/ja active Pending
- 2022-08-04 US US17/881,156 patent/US20220380827A1/en not_active Abandoned
-
2024
- 2024-06-28 JP JP2024104650A patent/JP2024125388A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2622366T3 (es) | Procedimiento para la producción de una inmunoglobulina glucosilada | |
| AU2015203309B2 (en) | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin | |
| AU2018203733B2 (en) | Method for the production of a glycosylated immunoglobulin |