JP2998976B2 - ヒトインタ―ロイキン―6レセプターに対する抗体 - Google Patents
ヒトインタ―ロイキン―6レセプターに対する抗体Info
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Description
体、及びその製造方法に関するものである。
の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化に関与し
ているタンパク質である。さらにIL−6の異常産生が種
々の自己免疫疾患の病因因子である可能性が報告されて
いる(岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,1988年参
照)。
ーは、田賀らにより解析され、各細胞上の数、IL−6と
の結合定数が報告されている(J.Exp.Med.,196,p967,19
87年参照)。さらにヒトIL−6レセプターのcDNAが山崎
らにより単離され、1次構造が報告されている(Scienc
e,241,p825,1988年参照)。これらの成果をもとに遺伝
子工学的に作製された、細胞表層より離脱したIL−6レ
セプターは、各種免疫疾患の治療薬、診断薬として期待
されている。
製するためには、IL−6レセプターを迅速に同定する手
段として、あるいは精製する手段として、IL−6レセプ
ターの抗体の開発が望まれる。
るモノクローナル抗体は公に知られていない。
イプの抗体を提供しようとするものである。
ロイキン−6レセプターと特異的に結合し得る抗ヒトイ
ンターロイキン−6レセプター抗体;前記の性質を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ;ヒト
インターロイキン−6レセプター抗原により哺乳類を感
作し、該哺乳類から免疫細胞を採取し、該免疫細胞をミ
エローマ細胞株と融合せしめ、そして該融合株からヒト
インターロイキン−6レセプターを認識する株をクロー
ニングすることを特徴とするハイブリドーマの製造方
法;前記のハイブリドーマを培養し、該培養物からヒト
インターロイキン−6レセプターを認識するモノクロー
ナル抗体を採取することを特徴とする抗−ヒトインター
ロイキン−6レセプター抗体の製造方法;並びにヒトイ
ンターロイキン−6レセプター抗原により哺乳類動物を
免疫感作し、該動物からヒトインターロイキン−6レセ
プターを認識するポリクローナル抗体を採取することを
特徴とする抗−ヒトインターロイキン−6レセプターポ
リクローナル抗体の製造方法を提供する。
識するものであり、これにはモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体に
は、ヒトIL−6とヒトIL−6レセプターとの結合を競合
的に阻害するものと、これを競合的に阻害しないものと
が含まれる。前者の例としては、本発明のハイブリドー
マPM1により産生されるPM1モノクローナル抗体が挙げら
れ、後者の側としてはハイブリドーマMT18により産生さ
れるMT18モノクローナル抗体が挙げられる。
は、ヒトIL−6レセプターを細胞表面に発現している動
物細胞を用いることができる。この様な細胞としてはヒ
トIL−6レセプターを産生するヒト由来細胞株、例えば
ヒトミエローマ細胞株U266、又はヒトIL−6レセプター
をコードするDNAにより形質転換された宿主細胞、例え
ばそのような動物細胞株が挙げられ、その例としてヒト
IL−6レセプターをコードするcDNAを含有するプラスミ
ドにより形質転換されたマウスT細胞が挙げられる。し
かしながら、この様な細胞株は、細胞表面に発現してい
るIL−6レセプターの量が少ない等のため効率的な免疫
原とは言い難い。
も、一旦ヒトIL−6レセプターに対する抗体を手にすれ
ば、これを用いてより効率的な免疫原を調製し、これを
用いてさらに多様な抗体を製造することができる。例え
ば、ヒトIL−6レセプターに対する抗体を適当な固体担
体に結合させ、他方、ヒトIL−6レセプターを産生する
細胞、例えば前記の細胞を培養して細胞溶解し、この細
胞溶解物を、前記の抗−ヒトIL−6レセプター抗体を結
合した固体担体と接触せしめることにより細胞溶解物中
のヒトIL−6レセプターを担体上に吸着・濃縮して、こ
れを免疫原として使用することができる。固体担体につ
いては抗体を結合できるもので、免疫する動物の生育に
重大な影響を及ぼさないものであれば特別の制限はな
い。例えば、本発明の実施例で説明される様なセファロ
ース等を基材とした固体担体は、簡便な操作で抗体を結
合でき、かつ、動物の生育に影響を与えない、等、本発
明における固体担体として好適である。さらには、遺伝
子工学的方法により、例えば特願平1−9774号明細書に
記載されている方法によりヒトIL−6レセプターを調製
し、これを免疫原として使用することもできる。また、
ヒトIL−6レセプターの一部分を構成するペプチドを調
製し、これを適当な高分子キャリヤー、例えばオバルブ
ミンに結合して免疫原として使用することもできる。さ
らには、感染後にヒトIL−6レセプターが発現するよう
にされたワクチニアウイルスを使用することもできる。
これらの免疫原はいずれも、ポリクローナル抗体を製造
するための免疫原として、及びハイブリドーマを調製す
るための免疫原として使用することができる。
上記のいずれかの免疫原によりマウス、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ等を免疫感作することによって行うことができ
る。
る。例えば前記の免疫原のいずれかによりマウス等の哺
乳類を免疫し、この動物から脾臓細胞を得、これを樹立
されたミエローマ細胞と融合せしめる。次に、目的とす
る反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマをクローニングする。
てクローニングされたハイブリドーマを培養し、培養上
清からモノクローナル抗体を採取する。あるいは、前記
ハイブリドーマを動物の腹腔内に接種し、腹水を得、こ
れからモノクローナル抗体を単離することもできる。ハ
イブリドーマ細胞上清中の抗体又は腹水中の抗体は、常
法に従って、例えば硫酸アンモニウム塩析により濃縮す
ることができ、さらにアフィニティークロマトグラフィ
ー、例えばIL−6レセプターを固定化した担体を用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより精製すること
ができる。
マの作製方法、モノクローナル抗体の調製方法、抗体の
回収・精製方法は、いずれもそれ自体当業界によりよく
知られている方法により行うことができる。
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
ローナル抗体の製造 ヒトIL−6レセプターに対するマウスモノクローナル
抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−6レセ
プターを膜面に発現しているマウスT細胞株を以下の方
法で作製した。すなわち、特願平1−9774号明細書に記
載されているpBSF2R.236及びpSV2neoをマウスT細胞株C
TLL−2(ATCC,TIB214)に常法で導入し、G−418を用
いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的にIL−6
レセプターを細胞あたり約30,000個発現している株を樹
立し、これをCTBC3と名づけた。
法で培養後、PBSバッファーで4回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス1匹あたり1×107細胞個、1週間に1回で
計6回、腹腔内に免疫した。
ミエローマ細胞系P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
ー陰性のヒトT細胞株JURKAT(ATCC,CRL8163)に、pBSF
2R.236とpSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、IL−6レセプターを細胞あたり約100,000個発現し
ている株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可
溶化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認
識しない抗体を産生しているハイブリドーマが1クロー
ン単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイブ
リドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT18
抗体と称する。前記のハイブリドーマMT18は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2999号(FERM B
P−2999)として寄託されている。第6図のデータはMT1
8抗体がIL−6レセプターを特異的に認識することを示
している。この図中Aは、フルオレッセインイソシアネ
ートで標識されたMT18抗体によりJURKAT細胞を染色した
場合に螢光染色された細胞の分布を示し、Bは前記NJBC
8細胞を同様に処理した場合の結果を示す。
体の作製 IL−6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体
を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−6レセプタ
ーを以下の方法で抽出した。
胞)3×109を1mlの1%ジギトニン(和光純薬)、10mM
トリエタノールアミンバッファー(pH7.4),0.15M NaC
l,1mM pAPMSF(和光純薬)で可溶化した。一方、ブロム
シアンで活性化したセファロース4B(ファルマシア社)
に、抗IL−6レセプター抗体であるMT18抗体(実施例
1)を常法どおり結合させた。これと前述の可溶化した
細胞の上清を混合し、樹脂上のMT18抗体に可溶化したIL
−6レセプターを結合させた。非特異的結合物を前述の
1%ジギトニン溶液で洗い流した後、MT18抗体を介して
セファロース4Bに結合したIL−6レセプターを1回の免
疫原として用いた。
た。前述の免疫原を1週間に1回計4回、Balb/cマウス
の腹部に免疫した。次にマウスからの脾細胞を、親株と
してのミエローマ細胞株P3U1と、ポリエチレングリコー
ルを用いる通常の方法に従って融合せしめた。
リドーマの培養上清と0.01mlのプロテインGセファロー
ス(ファルマシア)を混合し、上清中のイムノグロブリ
ンを樹脂に吸着せしめた。一方、35Sメチオニンで内部
標識したU266細胞107個を可溶化後、前述のMT18抗体結
合セファロース4BでIL−6レセプターをアフィニティー
精製した。これを前述のプロテインGセファロースで通
常の方法で免疫沈降させ、SDS/PAGEで解析した。この結
果、IL−6レセプターと特異的に結合する抗体を産生し
ているハイブリドーマが1クローン単離され、これをPM
1と命名した。又、このハイブリドーマによって生産さ
れるモノクローナル抗体をPM1抗体と称する。
所に微工研条寄第2998号(FERM BP−2998)として寄託
されている。
抗体MT18のIL−6レセプターに対する反応性を示す。IL
−6レセプターを発現していないT細胞株Jurkat(第1
図中、a及びc)及びIL−6レセプターcDNAが導入され
ており持続的にIL−6レセプターを発現しているJurkat
(第1図中、b及びd)のそれぞれと、MT18の培養上清
(第1図中、a及びbの実線)及びPM1の培養上清(第
1図中、c及びdの実線)のそれぞれとを反応せしめ、
これらを螢光色素を結合したヤギ由来抗マウスイムノグ
ロブリン抗体と反応せしめた後螢光強度に対する螢光染
色された細胞の分布を調べた。比較のため対応する細胞
をMT18の培養上清及びPM1培養上清のいずれかによって
も処理しなかった場合の結果を第1図中a,b,c及びdに
点線で示した。
セプターに結合することが確認された。
体の作製 IL−6レセプターに対するポリクローナル抗体を作製
する目的で、免疫原として、IL−6レセプターの細胞内
領域の一部に相当するペプチドにシステイン残基を付加
したもの(KTSMHPPYSLGQLVPC)を常法により合成した
(Kはリジン、Tはトレニオン、Sはセリン、Mはメチ
オニン、Hはヒスチジン、Fはフェニルアラニン、Pは
プロリン、Yはチロシン、Lはロイシン、Gはグリシ
ン、Qはグルタミン、Vはバリン、Cはシステイン残基
を示す)。
SA,84,p228,1987年参照)により、オバルブミンと結合
させた。これをウサギに1週間に1回0.2mg計5回免疫
したのち全血清を採取した。さらに、免疫した合成ペプ
チドを結合させたセファロース4Bでアフィニティー精製
した。
ローナル抗体が、IL−6レセプターを特異的に認識する
ことを示す。すなわち、内部標識されたU266細胞(IL−
6レセプター産生細胞)をディタージェントで可溶化
し、この細胞溶解物を、MT18抗体(レーン1)、PM1抗
体(レーン2)、ウサギのイムノグロブリン(レーン
3)、又は実施例により調製した抗ペプチドポリクロー
ナル抗体(レーン4)により免疫沈降し、SPS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた後、オートラジオグ
ラフィーを行った。この結果、MT18モノクローナル抗
体、PM1モノクローナル抗体及び実施例3により調製し
た抗ペプチドポリクローナル抗体はいずれもIL−6レセ
プターを特異的に認識することが確認された。
PM1抗体による競合阻害 IL−6の標識、及び細胞上のIL−6レセプターへのIL
−6の結合の同定はT.Tagaらの方法(J.Exp.Med.,166,p
967,1987年参照)に従った。125I−IL−6(14,000cp
m)と、4×105個のU266細胞(IL−6レセプター産生細
胞)とを室温で60分間反応させた。このとき、分子数で
100倍過剰の非標識IL−6,MT18の培養上清(70%容
量)、又はPM1の培養上清(70%容量)をそれぞれ存在
せしめた。FCS上に重層し、遠心後、細胞の放射能を測
定した。比較のため細胞を接種していない培地も同様に
処理した。
ターの結合を競合阻害しないのに対し、PM1抗体が競合
阻害することを示している。
中、aはU266細胞をIL−6の存在下(破線)又は非存在
下(実線)でMT18の培養上清と反応せしめた後螢光標識
された抗マウスイムノグロブリンで染色した場合の螢光
染色強度に対する細胞数の分布を示しており、bはU266
細胞をIL−6の存在した(破線)又は非存在下(実線)
でPM1の培養液と反応せしめ、その後aの場合と同様に
処理した場合の結果であり、a及びbにおける点線はU2
66細胞にIL−6のみを結合せしめた後同様に処理した場
合の結果である。MT18抗体はIL−6の存在、非存在に拘
らずU266細胞と結合するのに対して、PM1抗体はIL−6
の非存在下ではU266細胞と結合するが過剰のIL−6の存
在下ではU266細胞と結合せず、従ってPM1抗体がIL−6
と競合することが確認された。
の確認 IL−6依存性のヒトT細胞白血病株KT3をS.Simizuら
の方法(Blood,72,p1826,1988年参照)に従って培養し
た後、種々の濃度のIL−6を、25%容量のハイブリドー
マの培養上清の存在下又は非存在下で加え、市販の96穴
プレートに1ウエルあたり5×103細胞/100μで培養
した。60時間後、1ウエルあたり0.75μCiのトリチウム
標識されたチミヂンを加え、6時間後細胞を集め、そし
て取り込まれた放射能を測定した。
害しないのに対し、PM1抗体がIL−6の生物作用を阻害
することを示している。
ル抗体の作製 実施例3.で使用したIL−6の細胞内領域の一部に相当
するペプチドにシステインを付加したもの(KTSMHPPYSL
GQLVPC)(オバルブミンとの結合体)を、1週間に1
回、計4回、Balb/cマウスの腹部に免疫した。次にマウ
スからの脾細胞をポリエチレングリコールを用いる通常
の方法に従い、ミエローマ細胞P3U1と融合せしめた。
ブリドーマの培養上清と0.01mlのプロテインGセファロ
ース(ファルマシア)を混合し、上清中のイムノグロブ
リンを樹脂に吸着せしめた。一方、35Sメチオニンで内
部標識したU266細胞107個を可溶化後、前述のプロテイ
ンGセファロースを用いる通常の方法で免疫沈降させ、
SDS/PAGEで解析してIL−6レセプターのバンドが検出さ
れ、更にこのバンドが免疫沈降の際にマウスに免疫した
ペプチド(KTSMHPPYSLGQLVPC)を添加することにより消
失することを確認した。その結果、IL−6レセプターの
細胞内領域の一部を特異的に認識する抗体を産生してい
るハイブリドーマが1クローン単離された。
するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、診
断薬及び治療薬として期待されるIL−6レセプター活性
を有する種々のタンパク質を大量に生産し、そして精製
するために有益である。
自然状態では極めて微量にしか生産されないIL−6レセ
プターの諸性質を解析することが可能になる。このこと
は固体発生及び免疫機構の研究、さらにはそれらの成果
に基づく治療薬診断薬等の開発等に大きな意義をもつ。
する抗体は、IL−6の異常産生が病因因子であると考え
られている種々の自己免疫疾患の治療薬としての応用開
発も考えられる。
Jurkat(a,c)又はIL−6レセプターcDNA含有ベクター
が導入されており持続的にIL−6レセプターを発現して
いるJurkat(b,d)と、MT18の培養上清(a,bの実線)又
はPM1の培養上清(c及びdの実線)との反応性を示
す。点線は培養上清で処理しなかった細胞についての結
果を示す。 第2図は、内部標識されたU266細胞を可溶化した後、MT
18モノクローナル抗体(レーン1)、PM1モノクローナ
ル抗体(レーン2)、ウサギのイムノグロブリン(レー
ン3)又は実施例3の抗ペプチドポリクローナル抗体
(レーン4)により免疫沈降せしめ、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行
った結果を示す。 第3図は、実施例3におけるIL−6レセプターへのIL−
6の結合に対するPM1抗体及びMT18抗体の阻害効果を示
すグラフである。 第4図は、IL−6の存在下(破線)又は非存在下(実
線)での、U266細胞へのMT18抗体(a)又はPM1抗体
(b)の結合を比較した結果であり、破線はIL−6のみ
で処理したU266細胞についての結果を示す。 第5図は、MT18の培養上清存在下、PM1の培養上清存在
下あるいは非存在下で、種々の濃度のIL−6を添加して
培養した時の、KT3細胞によるトリチウム標識チミヂン
の取り込みを示す。 第6図は、MT18抗体がIL−6レセプター産生細胞のみに
結合することを示す細胞分布図である。
Claims (11)
- 【請求項1】ヒトインターロイキン−6レセプターと特
異的に結合することができ、且つヒトインターロイキン
−6レセプターとの結合についてヒトインターロイキン
−6と競合する、抗−ヒトインターロイキン−6レセプ
ター抗体。 - 【請求項2】モノクローナル抗体である請求項1に記載
の抗体。 - 【請求項3】ハイブリドーマPM1(FERM BP−2998)によ
り生産されるPM1抗体である請求項2に記載の抗体。 - 【請求項4】ポリクローナル抗体である、請求項1に記
載の抗体。 - 【請求項5】次の配列: (N末端)KTSMHPPYSLGQLVPC(C末端) (ただし配列中のアルファベットはアミノ酸の一文字表
示法に従ったアミノ酸を示す。) で現されるヒトインターロイキン−6レセプター部分を
認識する抗体。 - 【請求項6】請求項2に記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ。 - 【請求項7】ヒトインターロイキン−6レセプター抗原
により哺乳類を感作し、該哺乳類から免疫細胞を採取
し、該免疫細胞をミエローマ細胞株と融合せしめ、そし
て該融合株からヒトインターロイキン−6レセプターを
認識する株をクローニングすることを特徴とする、請求
項2に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの製造方法。 - 【請求項8】前記ヒトインターロイキン−6レセプター
抗原が、固体キャリヤーに結合されたヒトインターロイ
キン−6レセプター、又は高分子キャリヤーに結合した
ペプチド(KTSMHPPYSLGQLVPC)である、請求項7に記載
の方法。 - 【請求項9】前記ハイブリドーマが、ハイブリドーマPM
1(FERM BP−2998)である、請求項7に記載の方法。 - 【請求項10】請求項6に記載のハイブリドーマ、又は
請求項7,8もしくは9に記載の方法により製造されたハ
イブリドーマを培養し、該培養物からヒトインターロイ
キン−6レセプターを認識するモノクローナル抗体を採
取することを特徴とする抗−ヒトインターロイキン−6
レセプター抗体の製造方法。 - 【請求項11】ヒトインターロイキン−6レセプター抗
原により哺乳類動物を免疫感作し、該動物からヒトイン
ターロイキン−6レセプターを認識するポリクローナル
抗体を採取することを含んで成る抗−ヒトインターロイ
キン−6レセプターポリクローナル抗体の製造方法にお
いて、前記ヒトインターロイキン−6レセプター抗原が
次の配列: (N末端)KTSMHPPYSLGQLVPC(C末端) (ただし配列中のアルファベットはアミノ酸の一文字表
示法に従ったアミノ酸を示す。) を有するペプチドを高分子キャリヤーに結合した複合体
であることを特徴とする方法。
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